KR20090033841A - 상피 성장인자 수용체 길항체로 소아 환자에서의 종양의 치료 - Google Patents

Abstract

EGFR 길항체와 화학요법제를 투여하여 소아 종양을 치료하는 복합 요법을 개시한다. 이 방법은 또한 난치성 소아 종양의 치료를 포함한다.

상피 성장인자, 수용체, 길항체, EGFR, 항체

Description

상피 성장인자 수용체 길항체로 소아 환자에서의 종양의 치료{TREATMENT OF TUMORS IN PEDIATRIC PATIENTS WITH EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTAGONISTS}

본 출원은 2006년 7월 27일에 출원한 미합중국 가(provisional) 특허출원 제60/833,487호의 이익을 주장하며, 상기 가출원의 내용 전체는 본 출원에서 참조로서 포함된다.

본 출원은 EGFR 길항체(antagonist) 및 화학요법제의 조합을 투여함으로써, 소아 환자에 있어서의 종양을 치료하는 것에 관한 것이다.

2001년 미국에서는 11,900 명의 20세 미만 어린이 및 청소년이 암으로 진단받았으며 이 질병으로 약 2,200 명이 사망했다. 고형암은 소아암의 약 30%를 차지한다. 침윤성 뇌 및 신경계 암은 모든 소아암의 17%를 차지하며, 이는 급성 임파구성 백혈병 바로 다음이다. 뇌 종양으로 진단된 경우의 약 절반이 악성이다. 다른 일반적인 소아암으로는 유잉육종(Ewing's sarcoma), 백혈병, 신경아세포종(neuroblastoma), 골육종(osteosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 및 빌름스 종양(Wilm's tumors)을 포함한다.

어린이에 있어 뇌 종양을 치료함에 있어 주요 걸림돌 중 하나는, 뇌가 여전 히 빠른 성장을 겪고 있으며, 따라서 방사선 또는 화학요법과 같은 치료로부터의 독성에 매우 취약하다는 것이다. 다른 종류의 소아암을 치료함에 있어서도 또한 장해물들이 있다. 따라서, 소아 환자에 있어 종양을 치료하기 위한 새로운 요법이 필요하다.

상피 성장인자 수용체군(EGFR: epidermal grwoth factor receptor family)은 다양한 암에서 발현하거나 과발현하며, 종양 형성에 널리 관여한다. EGFR 군은 EGF 수용체(erbB-1/HER1으로도 알려진 EGFR), HER2(c-neu/erB-2로도 알려진), erbB-3/HER3, 및 erbB4-/HER4를 포함한다. 예를 들어, EGFR 및 HER2가 종양 세포의 성장 및 생존을 조절하는 과정에서 절대적인 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. 특히, EGFR은 어팝토시스(apoptosis), 탈분화(dedifferentiation), 및 전이(metastasis)(세포 이동 및 침윤을 포함하는)로부터의 보호 및 생존에 영향을 미치는 여러 경로들과 밀접하게 연관되어 왔다. EGFR을 발현하는 암 중 일부는, 머리 및 목, 결장(colorectal), 췌장(pancreatic), 난소(ovarian), 신장세포(renal cell), 비-소세포폐(non-small cell lung), 및 신경교종(glioma)을 포함하는, 가장 빈번하게 발생하는 암들이다. 이들 암 중 다수에 대한 예후는, 초기에 진단받은 것이 아니라면, 매우 좋지 않으며, 따라서 진행된 질병에 대한 치료에는 한계가 있다.

이들 암 중 일부를 치료하기 위해 현재 임상학적 시도에 있는 다양한 EGFR 억제제들이 있다. 그런 예 중 하나가 ERBITUX®(cetuximab: 세툭시맙)(ImClone Systems Inc., 에서 제조됨)으로, 이것은 EGFR에 결합하는 리간드를 블로킹하고, 수용체의 활성화를 억제하며, 또한 배양액 내 세포의 성장을 억제하는 키메릭 (인간/마우스) 모노클로날 항체이다. 또다른 예로 ABX-EGF가 있는데, 이는 EGFR에 결합하는 것으로 알려진 두 가지 리간드인 변형성장인자 알파(TGF-α: transforming growth factor-α) 및 상피 성장인자(EGF)의 결합을 방해하는 것으로 보고된 EGFR에 특이적인 전체 인간 모노클로날 항체이다. HERCEPTIN®(trastuzumab)은 HER2 양성 전이성 유방암의 치료에 대해 허가 받은 인간화된 항체인데, 이것은 HER2 단백질의 과발현 작용을 타겟팅하여 블로킹하도록 설계된 것이다.

또한, 다양한 소분자 EGFR 억제제들에 대한 임상 시도들도 현재 수행되고 있다. 티로신 키나제 억제제 중 한 예는 IRESSA^TM인데, 이는 EGFR 티로신 키나제 활성을 억제하는 것으로 알려진 소분자 EGFR 티로신 키나제 억제제이며, 또한 기능적 EGFR을 발현하는 인간 암 세포들에 대한 세포독성을 가지며, 또한 p27의 상향-조절(up-regulation)을 통해 종양 세포의 증식을 억제할 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명은 EGFR 길항체 및 화학요법제의 유효량으로 소아 환자를 치료함으로써, 소아 환자에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, EGFR 길항체는 EGFR의 세포외 영역 및 그의 중화된 활성에 특이적으로 결합하는 EGFR 항체이다. 한 바람직한 양태에서, 화학요법제는 이리노테칸(irinotecan)이다.

본 발명은 EGFR 길항체 및 화학요법제의 유효량으로 소아 환자를 치료함으로써, 소아 환자에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 소화암 화자들은, 출생시로부터 18 세까지의 환자들이다. 치료는 다음과 같은 것들을 포함한다: (1) 해당 질병으로 미리 진단받았으나 아직 그 질병의 증상을 경험하거나 나타내지 않는 환자들에 있어서는 상기 질병의 발생을 예방하는 것; 즉, 임상적 증상 발발의 예방; (2) 종양 성장을 억제하는 것, 즉, 그것의 발전을 저지하는 것; 또는 (3)종양의 구제, 즉, 상기 종양 증상의 퇴행을 일으키는 것. 종양 성장을 억제하는 것은 성장 속도를 느리게 하거나 또는 성장을 중지시키는 것, 그리고 종양의 퇴행을 유도하는 것을 포함한다. 질병의 치료를 위한 유효량이란, 필요로 하는 환자에게 투여되었을 때, 상기 정의한 바와 같은 질병의 치료에 영향을 미치기에 충분한 양을 의미한다.

본 발명에 따라 치료되는 종양은 EGFR을 발현하는 임의의 종양이다. 그러한 종양으로는, 간아세포종(hepatoblastomas) 및 신경아세포종(neuroblastomas)를 포함하는 아세포종(blastomas); 선암(adenocarcinoma)을 비롯한 암종(carcinoma); 상의세포종(ependimomas), 성상세포종(astrocytomas), 핍지교종(oligodendrogliomas) 및 혼합 신경교종(gliomas)을 포함한 신경교종(gliomas); 횡문근육종(rhabdomyosarcomas), 아데노사르코마(adenosarcomas), 및 뇌하수체선종(adenomas)을 포함한 육종(sarcomas)이 있다. 이들 종양은 실질적으로 신체의 모든 부분, 예를 들어, 가슴, 심장, 폐, 식도, 소장, 결장, 직장, 위, 비장, 신장, 방광, 머리와 목, 후두, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 목, 또는 간을 포함한 모든 부분에서 발생할 수 있다. 바람직한 양태에서, 종양은 신경교종 및 신경아세포종과 같은 신경계의 종양이다. 치료될 종양은 일차 및 전이성 종양, 그리고 난치성 종양을 포함한다. "난치성 종양(Refractory tumors)"은 화학용법제 단독, 항체 단독, 방사선 단독 또는 이들의 조합에 의한 치료에 반응하지 않거나 또는 내성을 가지는 종양을 포함한다. 난치성 종양은 또한 그러한 치료제에 의한 치료에 의해 억제되는 것처럼 보이지만 치료를 중단한 후 5년 이내, 또는 때로 10년 또는 그 이상이 지난 후에 재발하는 종양도 포함한다.

본 발명에 따른 EGFR 길항체는 세포외 길항체 또는 세포내 길항체일 수 있으며, 하나 이상의 길항체가 사용될 수도 있다. 세포외 길항체는 단백질 또는 EGFR에 결합하는 다른 생물학적 분자를 포함하며, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 양태에서는, 세포외 길항체가 EGFR의 세포외 영역에 결합하여 EGFR이 하나 또는 그 이상의 그의 리간드에 결합하는 것을 억제하고/하거나, 리간드-유도된 EGFR의 활성화를 중화한다. EGFR의 리간드로는, EGF, TFG-α, 암피레귤린amphiregulin), 헤파린-결합성 EGFR(HB-EGF) 및 베타셀룰린(betacellulin)이 포함된다. 세포외 EGFR 길항체는 또한 다른 EGFR 수용체 서브유닛과의 EGFR의 이량체화(즉, EGFR 호모다이머)를 또는 다른 성장인자 수용체(예컨대, HER2)와의 헤테로이량체화를 억제하는 물질들을 포함할 수도 있다.

바람직한 한 양태에서, EGFR 길항체는 EGFR에 결합하여 리간드 결합을 막는 항체이다. EGFR 항체의 한 예는 세툭시맙(IMC-C225)(GenBank Accession No. 1NQLA)이며, 이것은 키메릭 (인간/마우스) IgG 모노클로날 항체이다. 모두 참고 자료로서 본 출원에 포함되는 미국특허 제4,943,533(Mendelsohn 일동); 미국특허 제6,217,866(Schlessinger 일동); 미국특허출원 제08/973,065(Goldstein 일동) 및 제09/635,974(Teufe); WO99/60023(Waksal 일동) 및 WO00/69459호를 참조하라. 세툭시맙은 EGFR에 특이적으로 결합하여 EFG와 같은 리간드의 결합을 막는다. 세툭시맙 Fab는 세툭시맙의 Fab 단편, 즉, 생쥐 항체 M225의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(본 출원에 참고 문헌으로 통합된 미합중국 특허출원 제2004/0006212호) 및 인간 IgG1 CH1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. (세툭시맙은 총 세 개의 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다.) 세툭시맙의 중쇄 CDR 영역은 다음 서열들을 가진다: NYGVH(서열번호 1)의 서열을 가지는 CDR1 영역; VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호 2)의 서열을 가지는 CDR2 영역, 및 ALTYYDYEFAY(서열번호 3)의 서열을 가지는 CDR3 영역. 세툭시맙의 경쇄 CDR 영역은 다음 서열들을 가진다: RASQSIGTNIH(서열번호 4)의 서열을 가지는 CDR1 영역; YASESIS(서열번호 5)의 서열을 가지는 CDR2 영역; 및 QQNNNWPTT(서열번호 6)의 서열을 가지는 CDR3 영역.

EGFR 항체의 또다른 예는 ABX-EGF인데, 이것은 EGFR에 특이적인 완전 인간 IgG2 모노클로날 항체이다. ABX-EGF는 높은 특이도로 EGFR에 결합하며, EGFR이 그의 리간드인 EGF 및 TGF-α에 결합하는 것을 막는다. 예로서, Figlin 등의 2001년 5월 캘리포니아 12-15, 샌프란시스코의 ASCO 제37차 Annual Meeting에서 소개된 Abstract 1101를 참고하라. 이전에 클론 E7.6.3으로 알려졌던 ABX-EGF의 서열 및 특성은 미국 특허 제6,235,883호(Abgenix, Inc.)의 칼럼 28, 제62행부터 칼럼 29의 제36행까지 및 제9-34도에 개시되어 있으며, 이들은 본 출원에 참고 자료로서 포함된다(또한, 본 출원에 참고 자료로서 포함되는 Yang 일동의 Critical Rev. Oncol./Hematol., 38(1): 17-23, 2001을 참조하라.)

EGFR 항체의 또다른 예는 HERCEPTIN®(trastuzumab)인데, 이것은 세포 기반 검정에서 인간 EGFR2 단백질, HER2의 세포외 영역에 높은 친화도(5nM의 Kd)로써 선택적으로 결합하는 재조합 DNA-유도된 인간화 모노클로날 항체이다. 이 항체는 HER2에 결합하는 생쥐 항체의 상보성 결정 영역(4D5)과 인간 골격(framework) 영역을 함유하는 IgG1 카파이다. 본 출원에 참고 자료로서 포함되는 국제특허출원 제 WO01/89566(Mass)을 참고하라.

다른 EGFR 항체로는, 생취 항-EGFR 모노클로날 항체 EMD 55900의 인간화 항체인 EMD 72000(Merck KGaA); 인간화 항-EGFR 모노클로날 항체인 h-R3 (TheraCIM); 생쥐 모노클로날 항체이며 인간 EGFRvIII 변이체의 생쥐 유사체에 대해 생성시킨 Y10; 및 MDX-447(Medarex) 등이 있다. 본 출원에 참고자료로서 포함되는 미국 특허 제5,558,864(Bendig 일동), 5,884,093 (Kettleborough 일동), 및 5,891,996 (Mateo de Acosta del Rio 일동)을 참조하라.

세포내 EGFR 길항체는 생물학적 분자일 수 있으나, EGFR-중재된 신호 전달을 방해하기 위해 EGFR의 세포질 영역 상에 직접 작용하는 합성 키나제 억제제들과 같이 대개 소분자들이다. 소분자 EGFR 길항체의 한 예는 IRESSA ^TM(ZD1939)인데, 이것은 EGFR을 억제하기 위한 ATP-미메틱(mimetic)으로서 작용하는 퀴노잘린 유도체이다. 미국 특허 제5,616,582(Zeneca Limited); WO96/33980(Zeneca Limited) 제4쪽을 참조하라. 또한, Rowinsky 일동의, 2001년 5월 캘리포니아 12-15, 샌프란시스코의 ASCO 제37차 Annual Meeting에서 소개된 Abstract 5; Anido 일동의 캘리포니아 12-15, 샌프란시스코의 ASCO 제37차 Annual Meeting에서 소개된 Abstract 1712를 참고하라. 소분자 EGFR 길항체의 또다른 예는 TARCEVA®(OSI-774)인데, 이것은 4-(치환된페닐아미노)퀴노잘린 유도체[6,7-비스(2-메톡시-에톡시)-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐-페닐)아민 히드로클로라이드]EGFR 억제제이다. WO96/30347(Pfizer Inc.)의, 예를 들어, 제2쪽, 제12행 내지 제4쪽, 제34행 및 제19쪽, 제14-17행을 참조하라. 또한, Moyer 일동의 Cancer Res., 57:4838-48(1997); Pollack 일동의 J.Pharmaceol., 291: 739-48(1999)를 참조하라. TARCEVA®는 EGFR 및 그 하류에 있는 PI3/Akt 및 MAP(미토겐 활성화된 단백질) 키나제 신호 전달 경로의 인산화(phosphorylation)를 억제하여 결과 p27-중재된 세포-사이클 억류를 야기함으로써 작용할 수 있다. Hidalgo 일동의 캘리포니아 12-15, 샌프란시스코의 ASCO 제37차 Annual Meeting에서 소개된 Abstract 281을 참고하라.

다른 소분자들이 또한 EGFR을 억제하는 것으로 보고되었으며, 이들 중 많은 것은 EGFR의 티로신 키나제 영역에 특이적인 것으로 생각된다. 그러한 소분자 EGFR 길항체의 일부 예가 WO91/116051, WO96/30347, WO96/33980, WO97/27199(Zeneca Limited), WO97/30034(Zeneca Limited), WO97/42187(Zeneca Limited), WO97/49688(Pfizer Inc.), WO98/33798(Warner Lambert Company), WO00/18761(American Cyanamid Company), 그리고 WO00/31048(Warner Lambert Company)에 기술되어 있다. 특정 소분자 EGFR 길항체의 예로는, 티로신 키나제, 특히 EGFR의 퀴노잘린)N-[4(3-클로로-4-플루오로-페닐아미노)-7-(3-모폴린-4-일-ㅍ프로폭시)-퀴나졸린-6-일]-아크릴아미드) 억제제이며 WO00/31048의 제8쪽, 제22-6행에 기술되어 있는 Cl-1033(Pfizer); EGFR의 피롤로피리미딘 억제제이고 WO97/27199의 제10-12쪽에 기술된 PKI166(Novartis); EGFR 및 HER2의 억제제인 GW2016(GlaxoSimthKline); in vitro 및 in vivo에서 EGFR 또는 HER2를 과발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 것으로 보고된 EKB569(Wyeth); EGFR 및 erbB-2 모두로부터의 신호전달을 억제하는 퀴나졸린 소분자인 AG-1478(Tryphostin); 단백질 키나제 CK2도 억제하는 두기질(bisubstrate) 억제제인 AG-1478(Sugen); EGFR 키나제 활성 및 종양 성장을 억제하며 배양물 내 세포에서의 어팝토시스를 유도하고 세포독성 화학요법제의 세포독성을 증대시키는 것으로 보고된 PD153035(Parke-Davis); 전립선암의 치료를 위해 표적화되는 티로신 키나제 억제제인 SPM-924(Schwarz Pharma); 고형 종양의 치료를 위한 혈관생성의 억제제로서 보고된 CP-546,989(OSI Pharmaceuticals); 암 치료를 위해 표적화되는 EGFR 키나제 억제제인 ADL-681; 생쥐에서의 A4431 이종이식의 종양 성장 속도를 억제하는 것으로 보고되는 피리도피리미딘인 PD 158780; 생쥐에서의 HN5 이종이식에서의 자가인산화를 억제하는 것으로 보고되는 퀸졸린인 CP-358,774; 외음부(vulva), NSCLC, 전립선, 난소, 및 결장암을 포함한, 생쥐 이종이식 모델에서의 항종양 활성을 가지는 것으로 보고되는 퀸졸린인 ZD1839; 생쥐에서의 EGFR-양성 이종이식의 성장을 억제하는 것으로 보고되는 피롤로피리미딘인 CGP 59326A; PD 165557 (Pfizer); 디아닐로프탈이미드인 CGP54211 및 CGP53353 (Novartis) 등이 있다. 천연적으로 유도된 EGFR 티로신 키나제 억제제로는 제니스테인(genistein), 허비마이신 A(herbimycin A), 퀘르세틴(quercetin), 및 에르브스타틴(erbstatin)이 있다.

EGFR을 억제하는 것으로 보고되며, 따라서 본 발명의 범위에 속하는 또다른 소분자로는 미국 특허 제5,679,683호에 기술된 화합물과 같은 트리시클릭 화합물; 미국 특허 제5,616,582호에 기술된 유도체들과 같은 퀴나졸린 유도체; 및 미국 특허 제5,196,446호에 기술된 화합물과 같은 인돌 화합물들이 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 유용한 소분자들이 EGFR의 억제제이나, 이들이 완전히 EGFR에 특이적일 필요는 없다는 것을 알 수 있을 것이다.

바람직한 한 양태에서, EGFR 길항체는 하나 또는 그 이상의 다음과 같은 성질을 나타내는 항-EGFR 항체이다:

1) 그 항체는 EGFR의 외부 영역에 결합하며 리간드 결합을 억제한다. 억제는, 예를 들어, 정제되거나 또는 막 결합된 수용체를 사용하는 직접 결합 검정에 의해 측정될 수 있다. 이 양태에서, 본 발명의 상기 항체 또는 그의 단편은, 바람직하게, EGFR의 천연 리간드(EGF, TFG-α)만큼 강하게 EGFR에 결합한다.

2) 그 항체는 EGFR을 중화한다. EGFR의 외부, 세포외 영역에의 리간의 결합은 티로신 키나제 활성 및 수용체 인산화, 및/또는 다양한 신호 경로에 관여하는 다른 단백질들의 인산화를 자극한다. EGFR의 중화는 신호 전달과 관련된 일반적인 활성들 중 하나 또는 그 이상을 억제, 약화, 불활성화 및/또는 파괴하는 것을 포함한다. 중화는, 예를 들어, 조직, 배양세포, 또는 정제된 세포성 성분을 사용하여 in vivo, ex vivo, 또는 in vitro 에서 결정될 수 있다.

EGFR 중화의 한 측정은 수용체의 티로신 키나제 활성의 억제이다. 티로신 키나제 억제는 잘 알려진 방법, 예를 들어, 재조합 키나제 수용체의 자가인산화 수준 및/또는 천연 또는 합성 기질의 인산화 수준을 측정함으로써 결정할 수 있다. 따라서, 인산화 검정은 본 발명에서 항체 중화를 결정하는데 유용하다. 인산화는, 예를 들어, ELISA 검정 또는 웨스턴 블랏 상에서의 인산화티로신에 특이적인 항체를 사용하여 측정할 수 있다. 티로신 키나제 활성에 대한 일부 검정은 Panek 일동의 J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433-44(1997) 및 Batley 일동의 Life Sci. 62: 143-50(1998) 등에 기술되어 있다. 본 발명의 항체는 리간드에 반응하는 세포에서, EGFR의 티로신 인산화를 적어도 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 감소시킨다.

EGFR 중화의 또다른 측정은 EGFR의 하류 기질의 인산화의 억제이다. 따라서, MEK 및 ERK의 인산화 수준을 측정할 수 있다. 인산화의 감소는 적어도 약 40%이며, 적어도 약 50% 또는 적어도 약 80%일 수 있다.

또한, 단백질 발현의 검출 방법이 EGFR 중화를 측정하는데 이용될 수 있는데, 여기서, 측정되는 상기 단백질들은 EGFR 티로신 키나제 활성에 의해 조절되는 것이다. 이들 방법은 단백질 발현을 검출하는 이뮤노히스토케미스트리(IHC: immunohistochemistry), 유전자 증폭을 검출하기 위한 형광 인 시츄 혼성화(FISH: fluorescence in situ hybridization), 경쟁적 방사성표지된 리간드 결합 어세이, 노던 및 서던 블랏과 같은 고형 매트릭스 블라팅 기술, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 및 ELISA 등이 있다. Grandis 일동의 Cancer, 78:1284-92(1996); Shimizu 일동의 Japan J. Cancer Res., 85: 567-71(1994); Sauter 일동의 Am . J. Path., 148: 1047-53(1996); Collins의 Glia 15: 289-96(1995); Radinsky 일동의 Clin. Cancer Res. 1: 19-31 (1995); Petrides 일동의 Cancer Res. 50: 3934-39 (1990); Hoffmann 일동의 Anticancer Res. 17: 4419-26 (1997); Wikstrand 일동의 Cancer Res. 55: 3140-48 (1995)를 참조하라.

Ex vivo 검정 또한 EGFR 중화를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 수용체 티로신 키나제 억제는 억제제의 존재 하 또는 부재 하에서 수용체 리간드에 의해 자극된 세포주를 사용하는 미토게닉(mitogenic) 검정에 의해 관찰될 수 있다. 그러한 미토게닉 검정의 한 예는 3T3 세포 미토게닉 검정(3T3 (American Type Culture Collection (Manassas, VA)으로부터의 클론 A31-714 세포)이다. 또다른 방법은 EGFR-발현 종양 세포 또는 EGFR을 발현하도록 트랜스펙션된 세포의 성장 억제에 대한 테스트와 관련된다. 억제는 또한 종양 모델, 예를 들어, 마우스에 접종된 인간 종양 세포를 이용하여 관찰할 수도 있다.

본 발명의 항체는 EGFR 중화의 여하한 특정 기작에 의해서도 제한되지 않는다. 본 발명의 항-EGFR 항체는 EGFR 세포 표면 수용체에 외부에서 결합하고, 리간드의 결합 및 연속하여 수용체-관련된 티로신 키나제를 통해 중재되는 신호 전달을 막으며, 그리고 EGFR 및 신호전달 케스케이드(cascade)에 있는 하류의 다른 단백질들의 인산화를 억제할 수 있다.

3) 그 항체는 EGFR을 하향 조절한다. 세포 표면에 존재하는 EGFR의 양은 수용체 단백질 생산, 내재화(internalization), 및 분해에 의존한다. 세포 표면에 존재하는 EGFR의 양은 수용체에 결합하는 분자 또는 수용체의 내재화를 검출함으로써, 간접적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 수용체 내재화는 EGFR을 발현하는 세포를 표지된 항체와 접촉시켜 측정할 수 있다. 그 후, 막-결합 항체를 분리, 수집 및 계수한다. 내재화된 항체는 세포를 파쇄하여 세포 용해물 내 표지를 검출하여 측정한다.

다른 방법은, 항-EGFR 항체 또는 다른 기질로 처리한 후 세포에 존재하는 수용체의 양을 직접적으로 측정하는 것으로, 예를 들어, EGFR의 표면 발현에 대해 염색된 세포의 형광-활성화된 세포-분석 검정에 의한 것이다. 염색된 세포는 37℃에서 배양한 후 시간에 따른 형광 강도를 측정한다. 대조군으로서, 염색된 세포의 일부를 4℃(수용체 내재화가 정지되는 조건)에서 배양할 수 있다.

하향-조절의 또다른 측정은 세포 내에 존재하는 전체 수용체 단백질의 감소인데, 이는 내부 수용체의 분해를 반영한다. 따라서, 본 발명의 항체를 세포(특히 암 세포)에 처리하는 것은 전체 세포성 EGFR의 감소를 야기한다. 바람직한 한 양태에서, 상기 감소는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 90%이다.

인간 환자의 치료를 위하여, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게 인간 항체이다. 대안적으로, 상기 항체는 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물로부터 유래하거나, 또는 인간화 또는 키메릭 항체일 수 있다.

본 발명에 따른 항체 단편은 전체 항체를 절단하거나, 또는 상기 단편을 암호화하는 DNA를 발현함으로써 생산할 수 있다. 항체의 단편은 Lamoyi 일동의 J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983) 및 Parham의 J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983)에 의해 기술된 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 단편은 하나 또는 두개 모두의 Fab 단편들 또는 F(ab')₂ 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 또한 단쇄 단편 가변 영역 항체, 즉, scFv, 이량체(divodies), 또는 다른 항체 단편들을 포함할 수 있다. 이러한 기능적 균등물을 제조하는 방법은 PCT 출원 WO93/21319, 유럽특허출원 EP239400; PCT 출원 WO89/09622; 유럽특허출원 EP338745; 및 유럽특허출원 EP332424 에 기술되어 있다.

본 발명 항체의 발현 및 벡터 트랜스포메이션용의 바람직한 숙주세포는 포유동물 세포, 예를 들어, COS-7 세포, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 및 림포마, 미엘로마(예를 들어 NSO), 또는 하이브리도마 세포와 같은 림프구 유래의 세포주이다. 효모와 같은 다른 진핵 숙주가 대안적으로 사용될 수 있다.

트랜스폼된 숙주 세포는 탄소(글루코스 또는 락토스와 같은 탄화수소), 질소(아미노산, 펩티드, 단백질 또는 펩톤, 암모늄염 등과 같은 이들의 분해 산물), 및 무기염(황, 인 및/또는 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 카르보네이트)의 동화성 급원을 함유하는 액체 배양액 내에서 당해 기술 분야에서 알려진 방법으로 배양한다.

본 발명에 따른 고친화성 항-EGFR 항체는 인간 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자로부터 구축된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 가변영역은 재배열된 가변영역 유전자를 함유하는 말초혈액 림프구로부터 얻어질 수 있다. 대안적으로, CDR 및 FW 영역과 같은 가변영역 부분은 상이한 기원으로부터 얻어져서 재조합될 수 있다. 또한, 가변영역의 부분들(예를 들어 FW 영역들)은 합성 공통 서열(consensus sequence)일 수 있다.

본 발명의 항체 및 항체 단편들은, 예를 들어, 천연적으로 발생하는 항체들, 또는 Fab 또는 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 얻을 수 있다. V_H와 V_L 영역을 포함하는 항체로부터 하나의 영역을 포함하는 항체를 만들기 위하여, 결합, 발현 또는 용해도를 증가시키기 위해 CDRs 외의 특정 아미노산 치환이 바람직할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, V_H-V_L 경계면에 묻혀 있을 수 있는 아미노산 잔기들을 변형하는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체 및 항체 단편들은 인간 이뮤노글로불린 감마 중쇄 및 카파 경쇄를 생산하는 트랜스제닉 마이스(예를 들어, Medarex, San Jose, Calif로부터 얻을 수 있는 KM 마이스)를 이용하여 표준 하이브리도마 기술(본 출원에 참고 자료로서 포함되는, Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213(1998)에 의해 얻을 수 있다. 바람직한 한 양태에서, 게놈을 생산하는 인간 항체의 대부분을 생쥐의 게놈에 삽입하여, 내생적인 생쥐 항체의 생산에 있어서 결함이 발생하도록 한다. 그러한 생쥐는 PDGFR(일반적으로 완전 프룬트(Freund's) 어쥬번트 내)로 피하(s.c.) 면역화될 수 있다. 면역화 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 항체는 완전한 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린의 항원 결합 단편, 및 이뮤노글로불린의 항원 결합 영역을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 이뮤노글로불린의 항원 결합 단편은, 예를 들어, Fab, Fab', 및 F(ab')₂를 포함한다. 결합 특이성은 유지하되, 예를 들어, 이특이성(bispecificity), 다면성(multivalence)(2 이상의 결합 위치), 작은 크기(즉, 결합영역으로만 이루어진 것) 등의 바람직할 수 있는 다른 특성을 가지는 다른 항체 형태들이 개발되어 왔다.

단쇄 항체들은 그것이 유래된 전체 항체의 불변여역의 일부 또는 전체가 결여되어 있다. 따라서, 그들은 전체 항체의 사용과 관련된 문제들의 일부를 극복할 수 있다. 예를 들어, 단쇄 항체는 중쇄 불변영역과 다른 생물학적 분자들 사이의 특정의 바람직하지 않은 상호간섭에서 자유로운 경향이 있다. 또한, 단쇄 항체들은 전체 항체에 비해 훨씬 작으며, 따라서, 전체 항체보다 큰 침투성을 가질 수 있어, 단쇄 항체의 국지화 및 항원-결합 위치를 보다 효율적으로 타겟화하기 위해 결합할 수 있게 한다. 또한, 상대적으로 작은 크기인 단쇄 항체들은 전체 항체보다 수혜자에게 있어 바람직하지 않은 면역 반응을 덜 일으키게 한다.

각각의 단쇄가 제 1 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결된 하나의 V_H 및 하나의 V_L 영역을 가지는, 다중 단쇄 항체들은 적어도 하나 또는 그 이상의 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결되어 다면적 단쇄 항체를 형성할 수 있는데, 이는 단일특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다면적 단쇄 항체의 각 쇄는 가변성 경쇄 단편 및 가변성 중쇄 단편을 포함하며, 펩티드 링커에 의해 적어도 하나의 다른 쇄에 연결된다. 펩티드 링커는 적어도 15 개 아미노산 잔기로 구성된다. 아미노산 잔기의 최대 수는 약 100 개이다.

두 개의 단쇄 항체는 이가 이량체(divalent dimer)라고도 알려진 하나의 이중체(diabody)를 형성하도록 결합될 수 있다 이중체는 두 개의 쇄와 두 개의 결합 부위를 가지며, 따라서 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 이중체의 각 쇄는 V_L 영역에 연결된 V_H 영역을 포함한다. 상기 영역들은, 같은 쇄 상의 영역 사이의 결합을 방지할 수 있고, 따라서 다른 쇄들 상의 상보성 영역 사이의 결합을 유도하여 두 개의 항원-결합 부위를 창조할 수 있을 정도로 충분히 짧은 링커들에 의해 연결된다.

세 개의 단쇄 항체들은 삼가 삼량체(trivalent trimers)라고도 알려진 삼중체(triabodies)를형성하도록 결합될 수 있다. 삼중체는 V_L 또는 V_H 영역의 카르복실 말단에 직접, 즉, 어떠한 링커 서열도 없이, 혼성화된 V_L 또는 V_H 영역의 아미노산 말단으로 이루어진다. 삼중체는 고리형, 즉, 머리-꼬리 형태로 배열된 폴리펩티드를 가지는 세 개의 Fv 머리부를 가진다. 상기 삼중체의 가능한 구조는 서로 120도의 각도로 평면 상에 위치한 세 개의 결합 부위를 가지는 평면형이다. 삼중체는 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적일 수 있다.

따라서, 본 발명의 항체들 및 이들의 단편은 천연적으로 발생하는 항체, (Fab')2와 같은 이가(divalent) 단편, Fab와 같은 일가(monovalent) 단편, 단쇄 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단일 영역 항체, 다가성 단쇄 항체, 이중체, 삼중체 등의 항원에 특이적으로 결합하는 항체들을 포함하며, 이들에 제한되지 않는다.

본 발명에 따르면, EGFR 길항체는 하나 또는 그 이상의 항-신생물질제(anti-neoplastic agents)와 조합하여 투여된다. 여기 채용된 바와 같이, 용어 "항-신생물질제"는, 달리 특정하지 않는한, EGFR 길항체를 배제한다. 임의의 적절한 항-신생물질제가 사용될 수 있는데, 예를 들어, 화학요법제, 방사선 또는 이들의 조합일 수 있다. 항-신생물질제는 알킬화제 또는 항-대사산물(anti-metabolite)일 수 있다. 알킬화제의 예로는 시스플라틴, 시클로포스파미드, 멜팔란, 및 다카르바진을 들 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다. 항-대사물질의 예로는 독소루비신, 두노루비신, 파클리탁셀 및 젬시타빈을 들 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.

바람직한 한 양태에서, 항-신생물질제는 화학요법제이다. 바람직한 화학요법제는 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소 머스터드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 독소루비신 리포(독실), 젬시타빈(gemzar), 다우노루비신, 다우노루비신 리포(다우녹솜), 프로카르바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소테르), 알데스루킨, 아스파라기나제, 부설판, 카르보플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT-11,10-히드록시-7-에틸-캄프토테신 (SN38), 다카르바진, 플록수리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이다루비신, 멘사, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 이리노테칸, 마이톡산트론, 토포테칸, 루프롤리드, 메제스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 플리카마이신, 마이토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 스트렙토조신, 타목시펜, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스터드, 비노렐빈, 클로로암부실 및 이들의 조합을 포함한다. 보다 바람직한 양태에서, 상기 화학요법제는 이리노테칸이다.

화학요법제 및/또는 항-대사물질을 포함한 항-신생물질제는 패키지 지침 및/또는 환자의 임상 반응에 따른 투여량 및 스케쥴에 따라 투여된다. 그러한 투여량은 통상의 지식을 가진 기술자에게 자명할 것이며, 이는 과중한 실험을 요하지 않는다. 예를 들어, 이로노테칸은, 환자의 임상적 반응에 따라 보다 높거나 낮은 투여량일 수도 있으나, 바람직하게 약 50 내지 350 mg/㎡ 의 권장 투여량 범위로써 투여된다. 다른 치료제는 투여 및/또는 치료 레짐에 따라 약 1 내지 1,000 mg/㎡ 의 투여량을 가진다. 방사선 치료는 적절한 임상학적 처치 프로토콜 및/또는 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자의 임상학적 경험에 기초하여 투여된다.

복합 요법에 있어서, EGFR 길항체는 다른 치료제로써의 치료 시작 전, 중간 중, 또는 후에 투여되며, 또한 이들의 임의의 조합, 즉, 항-신생물질 치료제 요법을 시작하기 이전 및 중간, 이전 및 후, 중간 및 후, 또는 이전, 중간 및 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, EGFR 항체는 방사선 요법의 시작 전 1 내지 30일 사이, 바람직하게는 3 내지 20 일 사이, 더욱 바람직하게는 5 내지 12일 사이에 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 한 양태에서, 화학요법은 항체 요법과 동시에, 또는 보다 바람직하게, 항체 요법에 뒤이어 투여된다.

본 발명에서, 선택적으로 다른 수용체의 길항체 및/또는 항-신생물질제를 공-투여하기 위하여, 본 발명의 길항체를 투여하기 위해 임의의 적합한 방법 또는 경로가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 항-신생물질제의 레지멘(regimens)은 환자의 종양의 치료에 최상으로 적합할 것으로 믿어지는 임의의 레지멘을 포함한다. 상이한 종양들은 특정 항-종양 항체 및 특정 항-신생물질제의 사용을 요구할 수 있으며, 이는 개개 환자에 따라 결정될 수 있을 것이다. 투여 경로로는, 예를 들어, 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근육내 투여를 포함한다. 투여되는 길항체의 투여량은, 예를 들어, 길항체의 종류, 치료할 종양의 종류 및 심각한 정도, 및 길항체의 투여 경로를 포함하는 다양한 인자들에 의존한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 투여 경로나 방법에 제한되는 것이 아니라는 점이 강조되어야만 한다.

당해 기술 분야의 기술자는 치료의 투여량 및 빈도는 각 환자의 내성 및 사용되는 블로킹 또는 억제제의 약제학적 및 약물동력학적 특성에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 이상적으로는, 사용되는 약물에 대해 포화가능한 약물동력학을 달성하기를 원한다. 항-EGFR 항체에 대한 부하 투여량(loading dose)은, 예를 들어, 약 10 내지 약 1000 mg/㎡, 바람직하게는 약 200 내지 약 400 mg/㎡ 이다. 이후 여러 번의 추가의 일일 또는 주간 투여량 범위, 예를 들어, 약 200 내지 400 mg/㎡ 사이의 범위로 될 수 있다. 부작용에 대해 환자를 모니터링하고, 그러한 부작용이 심할 경우, 치료를 중단한다.

당해 기술 분야의 기술자는 효과적인 투여량을 결정하기 위한 처치의 과정을 모니터하는 방법 또한 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 그러한 하나의 방법은 MRI, CT 또는 다른 뇌 스캔 등을 모니터하는 것이다.

실시예 1: 이하의 실시예는 이리노테칸 및 EGFR 항체의 조합물을 투여함으로써 난치성 고형 종양을 치료하는 방법을 개시한다.

2005년 8월부터 2006년 3월까지, 난치성 고형 종양을 가지며 기대 수명이 적어도 8주인 20 명의 소아 환자들에게 이리노테칸 및 다른 투여량 수준의 세툭시맙을 투여하였다. 환자는 다음과 같은 종양 타입을 가지는 두 그룹(1-12세=Arm A, 및 13-18세= Arm B)으로 나누었다: 브레인스텀 신경교종(brainsterm glioma)/별아교세포종(10), 헤파토블라스토마, 골육종(1), 상의세포종(1), 신경아세포종(1), 횡문근육종(1) 및 기타(5). 이리노테칸은 20 mg/㎡/day의 투여량으로 2 주간 5일 동안, 매 21일 마다 60분 주입으로 투여하였다. 투여 스케쥴 및 투여량-한계 독성(DLTs: dose-limiting toxicities)을 나타내는 환자의 수를 표 1에 나타내었다.

표 1

Arm	투여수준	세툭시맙 (mg/㎡/day, 1,8,15 일째)	이리노테칸 (mg/㎡/day, 1-5일 및 8-12일)	환자수	DLT(투여량-한계 독성)을 가진 환자수
A	1	75	20	6	1(등급 3 설사)
A	2	150	20	6	2(등급 4 호중구감소증, 등급 3 설사)
B	1	75	20	8	1(등급 3 설사)

Arm A에서 여섯 명의 환자 중 두 명이 투여 수준 2에서 경험한 DLTs로 인하여(이는 이리노테칸에 관련된 것으로 짐작된다), 이리노테칸을 16 mg/㎡ 까지 감소 시켰다.

Arm B 에서는 한 사람의 환자가 수준 3 주입 반응을 경험했으며, 치료를 중단하였다. 다른 관찰된 독성은 등급 1의 성급함을 포함한다.

EGFR-음성 고급 신경교종(A 그룹 투여 레벨 1)을 가지는 한 환자는 부분적인 반응에 도달했으며, 따라서, 현재 13 주기에 있다. 신경아세포종(neuroblastomas)을 가지는 환자 한 명(A 그룹 투여 레벨 1)은 경미한 반응을 경험했으며, 현재 9 주기째 투여 중이다. 일곱 명의 환자는 평균 3.4 개월 동안(2-7+mo 범위에서) 안정적인 질병에 대한 최상의 반응을 보였다.

결론적으로, 세툭시맙과 이리노테칸의 조합물은 소아 고형 종양에 있어 유요한 항암 활성을 보인다.

지금까지의 기술 및 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 그로써 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 상기 기술된 각 측면 및 양태들은 개별적으로 또는 본 발명의 다른 측면, 양태 및 변형과 조합하여 고려될 수 있다. 또한, 본 발명 양태의 특정 특징들은 오직 특정한 형태로 보여질 수도 있는데, 그런 특징들은 본 발명의 범위 내에 있는 다른 형태들에서 보여지는 다른 양태들에 통합될 수도 있다. 나아가, 달리 특정되지 않는한, 본 발명의 방법들의 단계 중 어떤 것도 어떠한 특정 수행 순서로 한정되지 않는다. 당해 기술 분야의 기술자들은 본 발명의 정신 및 물질을 통합하여 개시된 양태들을 변경할 수 있을 것이며, 그러한 변경은 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 여기 언급된 모든 참고 문헌들은 그 전체로서 참고 자료로 포함된다.

<110> IMCLONE SYSTEMS, INC. <120> TREATMENT OF TUMORS IN PEDIATRIC PATIENTS WITH EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTAGONISTS <130> IPP20081190US <150> US60/833487 <151> 2006-07-27 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

Claims (14)

1. 소아 환자에 있어 종양의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 소아 환자에게 유효량의 상피 성장인자 수용체(EGFR) 길항체 및 화학요법제를 처리하는 것을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 종양은 난치성 종양인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 종양은 신경교종인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 종양은 신경아세포종인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 길항체는 항체 또는 그의 단편인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 EGFR의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 EGFR 리간드가 EGFR에 결합하는 것을 억제하고 그의 활성을 중화하는 것인 방법.
8. 제5항에 있어서, 상기 항체는 세툭시맙인 방법.
9. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 모노클로날인 방법.
10. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 케메릭인 방법.
11. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 인간화된 것인 방법.
12. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 인간 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 화학요법제는 이리노테칸인 방법.
14. 제1항에 있어서, 소아 환자에게 방사선을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.