KR20090022879A - 고삼 및 사상자 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고삼 및 사상자 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 고삼 또는 사상자 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 약학적 조성물은 N. 캐니늄 감염증을 예방 또는 치료하는데 매우 유용하다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물은 마우스에서 N. 캐니늄 감염을 방어할 수 있으며 임신 염소에 있어서는 유산 발생율을 경감시킬 수 있다.

네오스포라 캐니늄, 고삼, 사상자

Description

고삼 및 사상자 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising T. japonica and S. flavescens extract or fraciton thereof for Neospora caninum infection}

본 발명은 고삼 및 사상자 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

네오스포라 캐니늄(Neospora caninum)은 분류학상 Apicomplexa 문, Coccidia 강, Sarcocystidae과에 속하는 원충으로 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)와 같이 원충(tachyzoite)과 조직낭(tissue cyst)의 두 가지 형태를 취하며, 종숙주의 분변을 통하여 난포낭(oocyst)을 배출하는 것으로 알려져 있다. 현재 상기 질병은 미국을 비롯하여 남아프리카, 네덜란드, 뉴질랜드, 덴마크, 멕시코, 스웨덴, 아일랜드, 영국, 오스트레일리아, 이스라엘, 일본, 짐바브웨, 캐나다 및 한국에서 발생하고 있어 거의 전 세계적으로 발생을 하고 있는 것으로 생각되어 진다. 소에 있 어서, N. 캐니늄에 의한 유산 발생을 살펴보면 미국의 캘리포니아에서는 여름이나 초가을 보다는 겨울에 다발하고, 네덜란드에서는 늦여름에서 초가을에 많이 발생하고 있다고 보고된 바 있다. 따라서 국가마다 다소간의 차이는 있으나 거의 연중 발생하고 있을 것으로 추정된다.

N. 캐니늄은 소에서 임신 3개월부터 분만 전까지 다양한 임신연령에서 유산을 일으키며, 대체로 임신중기에 가장 흔하게 발생한다. 상기 원충에 감염된 유산태아나 선천적으로 감염된 송아지에서는 괴사성 또는 비화농성 뇌척수염, 심근염, 근염 등의 병리조직학적 소견을 나타내는 경우가 흔하며, 드물게 간이나 신장에서 다발성 염증을 유발하기도 한다.

전 세계적으로 네오스포라 원충의 감염을 예방하기 위한 백신 개발에 주력하여 일부 실험적으로 개발되었다는 보고는 있으나 아직까지 뚜렷한 효과를 입증하고 있지는 못하다. 또한 본 질병의 치료를 위한 연구도 아직까지 세포배양법 또는 마우스를 이용한 실험결과만이 있을 뿐, 가장 경제적인 피해를 주고 있는 소나 종숙주에 해당하는 개에 대한 치료 결과는 매우 미흡한 실정이다.

이에 본 발명자들은 네오스포라 캐니늄 감염증의 치료제를 연구하던 중 고삼 또는 사상자 알코올 추출물의 HPLC 분리 분획이 항원충 효능을 가지고 있으므로 네오스포라 캐니늄으로 감염된 포유동물의 생존율을 향상시키고 뇌 병변을 감소시키며 유산 발생율을 감소시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 고삼(T. japonica) 또는 사상자(S. flavescens)의 저급알코올 추출물 또는 이들의 분획물을 포함하는 네오스포라 캐니늄(Neospora caninum) 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고삼(T. japonica) 또는 사상자(S. flavescens)의 저급알코올 추출물 또는 이들의 분획물을 포함하는 네오스포라 캐니늄(Neospora caninum) 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효성분인 고삼 또는 사상자의 저급알코올 추출물은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

먼저, 상기 고삼 또는 사상자는 자연에서 채취하거나 또는 상업적으로 한약재상 등에서 구입하여 사용할 수 있다. 본 발명의 추출물의 제조에 사용되는 고삼 또는 사상자는 뿌리, 줄기 및/또는 잎을 사용할 수 있으며, 이들을 건조시킨 건체를 사용하는 것이 바람직하다. 추출 효율의 증대를 위해 상기 고삼 또는 사상자는 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다. 상기 고삼 또는 사상자의 건조방법으로는 양건, 음건, 열풍건조, 동결건조 및 자연건조 방법을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 열풍건조 및 동결건조 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물은 원료를 일정 크기로 절단하고 추출용매로 추출, 여과, 농축하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다. 상기에서 추출용매로는 C₁∼C₄의 저급알코올이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 추출물을 제조하기 위한 추출용매로는 에탄올, 메탄올 및 부탄올을 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법으로 제조된 추출물은 진공 건조하여 분말 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 고삼 및 사상자의 건조된 뿌리, 줄기 및/또는 잎 30g을 건식 분쇄기를 이용하여 분쇄하고, 상기 분쇄물에 80% 에탄올 첨가한 다음 15℃에서 4시간 동안 추출하여 에탄올 추출물을 제조하였다. 그 다음 상기 에탄올 추출물을 여과하고 이를 동결건조하였다(실시예 <1-1> 참조).

한편, 고삼 및 사상자의 저급알코올 추출물 분획은 세미-프리퍼러티브 HPLC를 이용하여 수득할 수 있다. 이때 이동상으로는 아세토니트릴과 물의 혼합용매를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 Perkin Elmer LC 250 펌프, Perkin Elmer ISS200 오토-샘플러 및 220nm로 설정된 Perkin Elmer LC 90 UV 검출기로 이루어진 HPLC 시스템을 사용하고, 컬럼으로는 Rainin semipreparative Microsorb C 18 컬럼(1.2㎝ x 30㎝), 이동상은 아세토니트릴 : 물(3:1)을 사용하고 유속은 2㎖/min으로 하여 고삼 추출물로부터 5개의 분획을 수득하였으며, 사상자 추출물로부터는 4개의 분획을 수득하였다(실시예 <1-2> 및 도 1 참조).

바람직하게는, 상기 HPLC 분획이 고삼의 저급알코올 추출물의 TJ2 분획이거나 사상자의 저급알코올 추출물의 SF1 분획일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 고삼 또는 사상자 저급알코올 추출물의 HPLC 분획의 항원충 효능에 대해 시험관내 시험을 수행한 결과(실시예 2 참조), 고삼 추출물의 2개의 HPLC 분획 및 사상자 추출물의 4개의 분획이 N. 캐니늄으로 감염된 신장세포에서 N. 캐니늄의 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(표 2 참조). 또한, N. 캐니늄을 세포배양하고 원충 배양 배지에 사상자 및 고삼의 9개의 HPLC 분획을 단계희석하여 적용시킨 후 세포의 생존유무와 원충의 수를 측정하여 항원충 효능을 재평가한 결과, 특히 고삼의 1개의 분획 및 사상자의 3개의 분획이 N. 캐니늄 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(표 3 참조).

또한, N. 캐니늄으로 감염된 배양에서, 고삼 분획(TJ2)은 2.850 내지 0.356 ng/ml의 범위에서 N. 캐니늄 증식을 98.3, 95.5, 79.7 및 30.6% 억제하는 것으로 나타났고, 사상자의 4개의 분획(SF1-SF4)은 2.850 내지 0.036 ng/ml의 농도 범위에서 N. 캐니늄의 증식을 97.1-25.9, 94.8-35.5, 95.9-33.7 및 95.4-49.4% 억제하는 것으로 나타났다(표 4 및 표 5 참조).

상기 고삼 또는 사상자 추출물의 HPLC 분획 중 가장 우수한 항원충 효능을 나타낸 분획은 3개의 분획 및 1개의 분획이였며 이중에서 고삼의 TJ1 분획 및 사상자의 SF2 분획이 가장 우수하였다.

한편, 본 발명자들은 상기 항원충 효능을 지닌 고삼 또는 사상자 추출물의 HPLC 분획의 구성성분을 동정하기 위해 GC/MS 분석을 수행하였다(실시예 3 참조). 그 결과, 각 분획의 구성성분은 소포리단(2)(Sophoridane), 마트리딘-15-원(Matridin-15-one, CAS, 1), 푸로사도닌 A(Furosardonin A 1), 테트라이소프로필리덴-사이클로부탄니(Tetraisopropylidene-cyclobutanee), 5,17,베타-디하이드록시-드-A-에스트라-5,7,9,14-테트란(1)(5,17,beta-Dihydroxy-de-A-Estra -5,7,9,14-Tetraene (1), 푸라노디엔(1)(Furanodiene), 9,12-옥타데카디온산(Z,Z)-(CAS,1)(9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-(CAS, 1) 및 3개의 분석되지 않은 성분이였다(도 2 내지 도 11 참조).

사상자의 구성성분 중 특히 16개의 플라본, 3개의 플라놀 및 4개의 프테로카판(pterocarpan)은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), S. 에피더미디스(S. epidermidis) 및 피로피오니박테리움 아크네스(Proprionibacterium acnes)에 대한 항균활성이 가지고 있으며, 이항-안드로겐 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

고삼으로부터 유래된 세스퀴터르펜(sesquiterpene)인 트롤린(Torilin)은 약제내성 암 세포(KB-V1 및 MCF7/ADR)에 대한 아드리아마이신(adriamycin), 빈블라스틴(vinblastine), 택솔 콜치킨(taxol colchicines)의 세포독성을 더 강하게 한다. 트롤린은 종양 전이 억제, 혈관내피세포의 튜브 형성 감소능과 함께 강한 혈관신생억제능 및 종양세포의 신생혈관인자 발현의 감소를 통해 종양발생을 억제하는 활성을 가지고 있음이 보고된 바 있다(Kim et al., 1998a, Korean. J. Vet. Res., 38(4):853-858; Kim et al., 2000 Vet. Parasitol., 90:147-154).

피탄가 체리로 불리우는 Eugenia unifera L.로부터 분리된 에센샬 오일 중 하나인 푸라노디엔(Furanodiene)은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 성장을 강하게 억제하는 활성을 타나낸다(Ogunwanda et al., 2005 Int. J. Aromatherapy., 15:147-152).

푸로사도닌 A(Furosardonin A)는 고추맛 붉은 버섯 중 하나인 러시아 사도니아(Russia sardonia)에서 발견될 수 있다. 이는 유액 내 농축되어 달팽이, 곤충 및 다른 포식동물에 대해 방어작용을 제공한다(Andina et al., 1980 Phytochemistry, 19 : 93-97).

나아가, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 고삼 또는 사상자 추 출물의 HPLC 분획의 항원충 효능을 생체내(in vivo)에서 검증하였다. 즉, N. 캐니늄을 인공접종한 마우스, 임신 산양 및 개에 본 발명의 HPLC 분획을 투여한 다음 임상증상 발현여부, 폐사상황 및 유산 발생 여부를 관찰하였다. 또한, 실험동물 폐사축, 유산태아 및 안락사한 개체에 대하여 부검을 실시한 후 병변의 경증을 파악하기 위해 병리 조직학적 검사를 수행하였으며, 혈청검사 또는 면역조직화학 염색도 병행하여 수행하였다(실시예 4 내지 실시예 6 참조).

그 결과, N. 캐니늄을 면역이 억제된 BALB/c 마우스에 복강 접종한 경우 접종 후 14일부터 임상증상을 나타내어 17-25일 중에 전 두수 폐사하였으며, 뇌에서의 괴사성 병변 지수는 평균 8.15로 매우 심한 병변을 형성하고 있었다. 그러나, HPLC 분획을 투여한 경우 대조군에 비해 마우스의 생존율이 다소 향상되고 뇌의 병변 지수도 감소하는 경향을 나타냈다(표 6 및 표 7 참조).

또한, 임신 산양의 경우 고삼 및 사상자 HPLC 분획의 투여로 인해 평균 유산발생일이 감염 대조군에 비해 늦추어 지는 효과가 있었다(표 10 참조).

포유자견을 이용한 항원충 효능 시험 결과, 24두의 자견 중 대조군 1두에서만 N. 캐니늄 감염이 확인되어 항원충 효능을 평가하기에는 많은 무리가 따르고 있었다. 이로부터 본 발명에서 사용된 N. 캐니늄 국내 분리주는 개에서 병원성이 매우 낮은 것으로 판단되었다.

그러나, 결론적으로 본 발명의 고삼 또는 사상자 추출물 또는 이의 분획물은 마우스에서 N. 캐니늄 감염을 어느 정도 방어할 수 있으며 임신 염소에 있어서는 유산 발생율을 어느 정도 경감시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 고삼(T. japonica) 또는 사상자(S. flavescens)의 저급알코올 추출물을 포함하는 네오스포라 캐니늄(Neospora caninum) 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기에서 저급알코올은 직쇄 또는 분지상의 메탄올, 에탄올 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 고삼(T. japonica) 또는 사상자(S. flavescens)의 저급알코올 추출물을 이동상으로 아세토니트릴과 물의 혼합용매를 사용하여 세미-프리퍼러티브 HPLC로 분리함으로써 수득된 분획을 포함하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 상기 HPLC 분획은 소포리단(2)(Sophoridane), 마트리딘-15-원(Matridin-15-one, CAS, 1), 푸로사도닌 A(Furosardonin A 1), 테트라이소프로필리덴-사이클로부탄니(Tetraisopropylidene-cyclobutanee), 5,17,베타-디하이드록시-드-A-에스트라-5,7,9,14-테트란(1)(5,17,beta-Dihydroxy-de-A-Estra -5,7,9,14-Tetraene (1), 푸라노디엔(1)(Furanodiene) 및 9,12-옥타데카디온산(Z,Z)-(CAS,1)(9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-(CAS, 1)으로 이루어진 군 중에서 선택된 성분일 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 생약재 추출물 또는 분획물을 단독으 로 포함하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함함으로써 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 또한, 상기와 같이 제형화된 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 투여 경로를 통해 알레르기 질환을 예방 또는 치료하기 위한 목적으로 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로로는 경구, 점안, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 선택된 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 약학적 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화할 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성 성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리 돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화 할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우 본 발명의 생약재 추출물을 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리학적 염수 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액에 용해시킴으로써 제형화할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 약 0.001mg/체중kg/day∼10mg/체중kg/day이다. 그러나, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 포유동물이 마우스, 산양 및 개로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 고삼 또는 사상자 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 약학적 조성물은 N. 캐니늄 감염증을 예방 또는 치료하는데 매우 유용하다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물은 마우스에서 N. 캐니늄 감염을 방어할 수 있으며 임신 염소에 있어서는 유산 발생율을 경감시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

I. 고삼( T. japonica ) 및 사상자( S. flavescens ) 추출물 HPLC 분획의 네오스포라 캐니늄( Neospora caninum )에 대한 항- 네오스포라 효과에 대한 시험관내 시험

<실시예 1>

고삼 및 사상자 추출물 HPLC 분획의 제조

<1-1> 고삼 및 사상자 추출물의 제조

고삼 및 사상자의 건조된 뿌리, 줄기 및/또는 잎 30g을 건식 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다. 상기 분쇄물에 80% 에탄올 200㎖를 첨가한 다음 15℃에서 4시간 동안 추출하였다. 그 다음 상기 에탄올 추출물을 여과지를 사용하여 여과함으로써 침전물을 제거하고 여과액을 수득하였다. 상기 에탄올 추출물을 동결건조하였다.

<1-2> HPLC 분획의 제조

HPLC를 수행하기 위해, 상기 실시예 <1-2>의 고삼 또는 사상자의 에탄올 추출물을 메탄올로 희석하고(9:1), HPLC 시스템에 100 또는 200㎕씩 주입하였다. 상기 HPLC 시스템은 Perkin Elmer LC 250 펌프, Perkin Elmer ISS200 오토-샘플러 및 220nm로 설정된 Perkin Elmer LC 90 UV 검출기로 이루어져 있다. 컬럼으로는 Rainin semipreparative Microsorb C 18 컬럼(1.2㎝ x 30㎝)을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴 : 물(3:1)을 사용하였고 유속은 2㎖/min이였다.

분획은 1분 간격으로 수집하였고 2분 이상 분리되는 분획은 복수의 분획이 수집되었다. 그 결과, 고삼으로부터 5개의 주요 분획이 수집되었고, 사상자로 부터는 4개의 주요 분획이 수집되었다(도 1). 각 분획의 유의적인 양을 확보하기 위해, 4번의 시도를 통해 수집된 총양은 표 1에 나타낸 바와 같다.

고삼 및 사사장로부터 유래된 HPLC 분획의 총량(㎖)

		fraction 1	2	3	4	5
사상자	3rd trial	0.2	5.3	5.2	5.3
	4th trial	9.2	47.5	13.8	29
고삼	3rd trial	7.8	8.3	4.8	12.5	22
	4th trial	5.5	4	4.8	5.4	29

상기에서 수득된 HPLC 분획 중 아세토니트릴을 저온 및 질소 기체 하에서 증발시켰다. 각 분획에 잔존해 있는 물을 동결건조에 의해 제거하였다.

<실시예 2>

고삼 및 사상자의 HPLC 분획의 항원충 활성 평가

실시예 1에서 수득한 고삼 및 사상자 추출물로부터 유래된 9개의 HPLC 분획의 네오스포라 캐니늄에 대한 항원충 활성을 평가하였다.

<2-1> 네오스포라 캐니늄의 배양

N. 캐니늄(KBA-2, NVRQS, 국내분리주)의 원충을 원숭이 신장세포(Vero cell, CRL6318, ATCC, MD)로부터 회수하고 칼슘 및 마그네슘 무첨가 HBSS(Hanks' balanced salt solution)로 세척한 후 헤모사이토미터(hemocytometer)로 계수하였다. N. 캐니늄 원충은 10% 말 혈청(GIBCO BRL, USA), 4mM L-글루타민 MEM 비타민 용액(GIBCO BRL, USA), MEM 필수 아미노산 용액(GIBCO BRL, USA), MEM 비필수 아미노산 용액(GIBCO BRL, USA), 항생제-항진균제(100unit/㎖ 페니실린 G, 100㎕/㎖ 스트렙토마이신, 0.25㎍/㎖ 암포테신 B: GIBCO BRL) 및 7.5% 소디움 바이카보네이트를 함유한 최소 필수 배지(MEM; GIBCO BRL, USA)에서 유지시켰다. 상기에서 배양된 N. 캐니늄 원충을 말 피부 세포(ED; American Type Culture Collection, Rockville, MD)에서 유지시켰다. 말 피부 세포를 10% FBS, 100U 페니실린 G/ml 및 100ng 스트렙토마이신/ml이 첨가된 DMEM 180㎕가 포함된 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 역상 공초점 현미경을 이용하여 완전한 단층이 관찰될 때까지 말 피부 세포를 5% CO2 및 95% 공기를 포함한 대기에서 37℃로 24-28시간 동안 배양 플레이트에 부착하도록 하였다. 신장세포의 75%가 원충에 감염되었을때, 원충을 포함한 신장세포를 플라스틱 세포 스크레퍼를 이용하여 회수하였다. 상기 현탁액을 23-게이지 니들이 장착된 시린지를 통해 2번 통과시키고 멸균된 5㎛ 필터(GIBCO BRL, USA)로 여과하였다. 원충을 차가운 0.01M PBS로 원심분리(2,000rpm, 5분)하여 세척하고 헤모사이토미터로 계수하였다.

<2-2> HPLC 분획의 항원충 활성 평가

사상자 (T. japonica) 와 고삼 (S. flavescens)의 HPLC 분획에 대하여 세포내 배양된 N. 캐니늄(N. caninum)에 대한 항원충 효능을 평가하였다. 96 웰 마이크로플레이트에 N. 캐니늄(N. caninum)을 세포배양하여 HPLC 분획을 7단계 희석하여 적용시키고 중수소(³H)가 주성분인 우라실(uracil)을 처리한 후 일정기간 배양하였다. 대조군의 원충이 충분히 자라면 이것을 여과지에 수거하여 Wallac Microbeta workstation으로 방사선의 양을 측정하여 항원충 효능을 평가하였다.

보다 구체적으로, 항원충 효능은 다음과 같은 방법으로 평가하였다. N. 캐니늄 1.0 x 10⁵ (단일 농도) 또는 1.0 x 10³ 내지 1.0 x 10⁵ (일련의 희석 농도)의 N. 캐니늄과 희석된 HPLC 분획을 배양한 RPMI 1640 ED 세포(5 x 10⁴ cells/well)가 첨가된 배지에서 원충의 농도를 조정하였다. 실시예 1의 HPLC 분획을 상기 원충 배양 배지에 0, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 및 1:128로 연속적으로 희석하여 첨가하였다. 원충 접종량에 따라 2-5일간 배양한 후, ³H-우라실 1μCi를 각 웰에 첨가하고 추가로 24시간 동안 배양하였다. 회수한 원충 감염된 ED 세포를 96-웰 포맷 필터 매트에서 Wallac MicroBeta Workstation을 이용하여 혼합정도를 분석하였다. HPLC 분획의 항-N 캐니늄 활성은 감소율로부터 나타냈다. 고삼 및 사상자 처리 그룹에서 N. 캐니늄 복제의 감소율을 비교하였다. 모든 실험은 80% 에탄올 처리 대조군과 비교하였다.

실험 결과, 고삼의 2개의 분획 및 사상자의 4개의 분획이 N. 캐니늄으로 감염된 신장세포에서 N. 캐니늄의 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(표 2). 한편, HPLC 분획 TJ1 및 SF5는 다른 분획(TJ2, SF1-4)에 비해 N. 캐니늄에서 낮은 감소율을 나타냈고, 다른 분획들은 N. 캐니늄에 대한 항원충 활성이 매우 우수한 것으로 나타났다.

고삼 및 사상자의 HPLC 분획의 항원충 효과(사망률 %)

	Fractions	Time	Anti-neosporal effect of two fold dilution
			1	2	3	4	5	6	7	8
SF	1	3	CT	100	100	100	100	100	87	78
		4	CT	100	100	100	67	26	37	50
	2	3	CT	100	100	100	100	95	77	67
		4	CT	100	100	100	47	-21	-27	0
	3	3	CT	100	100	100	100	84	93	92
		4	CT	100	100	100	87	74	80	67
	4	3	CT	100	100	100	80	84	93	53
		4	CT	100	100	100	100	79	30	33
TJ	1	3	CT	100	100	100	100	100	100	100
		4	CT	100	100	100	100	100	93	29
	2	3	CT	100	100	100	100	93	57	44
		4	CT	100	92	67	50	54	50	16
	3	3	CT	100	100	100	100	100	100	86
		4	CT	100	100	72	41	57	23	41
	4	3	CT	100	100	100	100	100	100	100
		4	CT	100	71	67	73	54	47	-6
	5	3	CT	100	100	100	100	100	100	100
		4	CT	100	100	100	68	61	60	38
Con	80% EtOH	3	CT	2	4	9	15	19	30	36
		4	CT	10	24	18	22	28	30	34
	N. caninum	3	7	8	12	16	24	17	32	25
		4	31	34	32	29	24	26	38	34

CT: 세포독성으로 인한 세포 사멸(cell death due to cytotoxicity)

SF: S. flavescens, TJ: T. japonica, Con: control

N. 캐니늄에 대한 항원충 활성을 평가하기 위해 96 웰 마이크로플레이트에 N. 캐니늄을 세포배양하고 원충 배양 배지에서 사상자 및 고삼의 9개의 HPLC 분획을 단계희석하여 적용시킨 후 세포의 생존유무와 원충의 수를 측정하여 항원충 효능을 재평가하였다. 그 결과, 특히 고삼의 1개의 분획 및 사상자의 3개의 분획이 N. 캐니늄 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(표 3).

고삼 및 사상자의 HPLC 분획의 항원충 효과(%)

Herbs	Fractions	Anti-neosporal effect of two-fold dilution (death rate)
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
SF	1	CT	CT	100	100	86	88	84	79	76	60	50	44
	2	CT	CT	100	67	43	54	56	26	29	24	9	4
	3	CT	CT	67	44	43	46	41	42	43	31	27	27
	4	CT	CT	67	33	14	29	22	16	10	-5	-4	10
Con
	80% EtOH	CT	CT	6	9	14	24	32	38	42	42	44	48
	N. caninum	52	54	50	58	53	56	47	58	46	52	48	49
	1	CT	CT	100	100	53	54	42	44	48	44	31	26
TJ
	2	CT	CT	100	100	73	65	55	36	30	35	4	11
	3	CT	CT	100	90	67	54	52	44	26	33	24	21
	4	CT	CT	100	100	87	62	58	31	15	12	-6	-2
	5-1	CT	CT	100	90	47	54	39	28	20	17	4	2
Con
	5-2	CT	CT	57	30	13	38	16	35	28	35	22	19
	80% EtOH	CT	CT	7	10	15	26	31	39	46	52	49	53
	N. caninum	52	56	57	49	53	50	49	54	51	52	58	54

CT: cell death due to cytotoxicity

SF: S. flavescens, TJ: T. japonica, Con: control

한편, 시험관내 시스템에서 단일 희석에 의한 잠재적인 치우침을 억제하기 위해, 몇몇의 원충 희석을 사용하였다. 그 결과, 사상자의 3개의 HPLC 분획 및 고삼의 1개의 HPLC 분획이 N. 캐니늄의 모든 희석농도에서 항-원충 활성을 나타냈다. N. 캐니늄으로 감염된 배양에서, 고삼 분획(TJ2)은 2.850 내지 0.356 ng/ml의 범위에서 N. 캐니늄 증식을 98.3, 95.5, 79.7 및 30.6% 억제하는 것으로 나타났다. 사상자의 4개의 분획(SF1-SF4)은 2.850 내지 0.036 ng/ml의 농도 범위에서 N. 캐니늄의 증식을 97.1-25.9, 94.8-35.5, 95.9-33.7 및 95.4-49.4% 억제하는 것으로 나타났다(표 4 및 표 5).

고삼 및 사상자 HPLC 분획의 항-N.캐니늄 활성

Group	Reduction ratea (%) of parasites (ng/ml of herb extracts)
	2.850	1.425	0.713	0.356
Par +ve	58612 ± 24673
Par -ve	1112 ± 311
TJ1	94.5	93.7	50.1	27.5
TJ2	98.3	95.5	79.7	30.6
SF1	97.1	94.6	81.3	25.9
SF2	94.8	94.2	80.4	35.5
SF3	95.9	95.5	79.9	33.7
SF4	95.4	91.3	63.7	49.4
SF5	95.4	86.4	38.9	45.0
Sulfadiazine	99.0	93.6	18.1	64.6

Par +ve: 원충 및 80% 에탄올; Par -ve: 숙주세포 및 용매

TJ: T. japonica; SF: S. flavescens; equine dermal cells: 50,000 cells/well; tachyzoite of N. caninum: 100,000 cells/well.

감소율(%)=1-(한약재 추출물의 평균 cpm)/배지 대조군의 평균 cpm, 원충 미처리)× 100

고삼(TJ2) 및 사상자(SF1-SF3)의 HPLC 분획의 항-N. 캐니늄 활성

HPLC fractions	Number of parasites	Par +ve	Reduction rate (%) of parasites (ng/ml of herb extract)
			2.850	1.425	0.713	0.356
TJ2	100000	15065	93.6	84.3	33.9	66.5
	10000	175524	79.1	35.0	10.5	16.9
	1000	84566	92.0	71.3	41.6	18.9
SF1	100000	14026	92.4	47.6	21.0	20.2
	10000	271296	55.1	34.8	19.9	-0.9
	1000	92530	73.7	44.0	19.2	9.3
SF2	100000	12745	87.1	75.5	51.4	72.1
	10000	215233	42.3	27.0	32.7	14.6
	1000	97719	78.3	56.3	31.6	21.9
SF3	100000	14250	96.3	87.7	67.6	21.4
	10000	288373	65.3	58.6	19.6	1.6
	1000	100556	81.5	43.1	37.7	16.6

Par +ve: 원충 및 80% 에탄올

<실시예 3>

고삼 및 사상자 추출물의 HPLC 분획의 GC/MS 분석에 의한 구성성분 동정

HPLC 방법을 통해 고삼으로부터 2개의 분획(TJ1-2) 및 사상자로부터 5개의 분획(SF1-5)를 수득하였으며 상기 분획의 7개 분획의 구성성분을 GC/MS에 의해 동정하였다. 이때, 한 개의 분획에서 복수의 시료가 분리되어 총 10개를 GC/MS로 동정하였다.

GC/MS는 Agilent 5973 매스 스펙트로미터와 결합된 Agilent 6890 가스크로마토그래피 및 Agilent ChemStation 소프트웨어(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 분리를 위해 0.25㎛ 필름 및 5% 페닐메틸 실록산으로 코팅된 모세관 컬럼(30 m x 0.25 mm i.d.)을 사용하였다. 컬럼 온도는 100℃로 설정하였고 주입을 위해 5분간 유지한 후 5℃min-1의 속도로 145℃로 승온시킨 후 25분간 유지하고 5℃min-1의 속도로 200℃로 승온시킨 후 최종적으로 20℃min-1의 속도로 280℃까지 승온시켰다. 스플릿트 주입(Split injection (2 ㎕)은 10:1의 스플릿트 비율로 수행하였고, 캐리어 가스로 고순도 헬륨을 1.0ml min-1의 유속으로 사용하였다. 스펙트로미터는 EI(electron-impact) 모드에서 작동시켰고, 스캔 범위는 40-550 amu, 이온화 에너지는 70eV 및 스캔 비율은 0.34s/scan으로 하였다. 주입구 및 이온화 소스 온도는 각각 250 및 280℃였다.

실험 결과, 각 분획의 구성성분은 소포리단(2)(Sophoridane), 마트리딘-15-원(Matridin-15-one, CAS, 1), 푸로사도닌 A(Furosardonin A 1), 테트라이소프로필리덴-사이클로부탄니(Tetraisopropylidene-cyclobutanee), 5,17,베타-디하이드록시-드-A-에스트라-5,7,9,14-테트란(1)(5,17,beta-Dihydroxy-de-A-Estra -5,7,9,14-Tetraene (1), 푸라노디엔(1)(Furanodiene), 9,12-옥타데카디온산(Z,Z)-(CAS,1)(9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-(CAS, 1) 및 3개의 분석되지 않은 성분이였다(도 2 내지 도 11).

2. 마우스, 한국재래산양 및 개에서 고삼 및 사상자 HPLC 분획의 N . 캐니늄에 대한 항원충 효능

재료 및 실험방법

1) IFAT 항원 슬라이드

IFA의 항원으로서 N. 캐니늄(국내 분리주 KBA-2) 원충을 사용하였다. 표적 동물에 접종하기 위해 베로 세포(CRL6318, ATCC, MD)로부터 원충을 수거하고 칼슘 및 마그네슘 무첨가 HBSS로 세척한 다음 헤모사이토미터로 계수하였다. N. 캐니늄 원충을 10% 말 혈청(GIBCO BRL), 4mM L-글루타민 MEM 비타민 용액(GIBCO BRL), MEM 비필수 아미노산 용액(GIBCO BRL), 항생제-항진균제(100unit/㎖ 페니실린 G, 100㎕/㎖ 스트렙토마이신, 0.25㎍/㎖ 암포테신 B: GIBCO BRL) 및 7.,5% 소디움 바이카보네이트가 함유된 최소 필수 배지(MEM:GIBCO BRL USA)에서 유지하였다. 베로세포의 약 75%가 원충에 감염될 때 까지 5% CO₂ 및 95% 공기로 이루어진 대기 하에서 37℃로 24-28시간 동안 세포가 배양 플레이트에 부착되도록 하였다. 원충을 함유한 세포를 플라스틱 세포 스크래퍼를 이용하여 수거하였다. 그 다음 상기 현탁액을 26 게이지 니들이 장착된 시린지에 3회 통과시키고 멸균된 5㎛ 필터로 여과하였다. 상기 원충을 차가운 0.01M PBS로 원심분리하여(2,000rpm, 5분) 세척하였다. 원충 현탁액 50㎖를 30% 퍼콜 용액(Percoll solution, Pharmacia Biotech AB, Sweden)과 함께 플라스크 튜브(Greiner Laboratory, Austria)에 넣었다. 플라스크 튜브에 50% 및 80% 퍼콜 용액을 멸균된 긴 니들을 사용하여 넣고 상기 튜브를 2,200g, 4℃, 30간 원심분리하였다. 50% 및 80% 퍼콜 접합면에 위치한 원충을 수거하고 40ml 멸균된 차가운 0.01M PBS를 사용하여 원심분리(1,700rpm, 5분)로 세척하였다. 상층의 퍼콜 용액을 제거하고 남아있는 원충을 PBS에 현탁한 다음 헤마토사이토미터(혈구계산판)로 계수하였다. IFA 테스트 슬라이드를 위해 현탁액의 최종 부피가 1㎕당 300-400 원충이 포함되도록 조정하였다. 테플론 코팅된 12웰 슬라이드(Superior, USA)에 웰 당 원충 현탁액 10㎕를 떨어뜨리고, 실온에서 건조시킨 후 2% 파라포름알데히드를 함유한 PBS로 10분간 고정한 후 -80℃에서 보관하였다. 양성 및 음성 소 혈청을 이용하여 제작된 항원 슬라이드의 적합성을 검증하였다(Cho et al., 1998 Korean. J. Vet. Res., 38(3):595-599).

2) 혈청 검사

상기 IFAT를 혈청 내 N. 캐니늄 IgG 항체의 검출을 위해 사용하였다. 각 테스트 스팟에 3×10⁴ 세포 배양으로부터 유래된 N. 캐니늄 원충을 넣고 건조시킴으로써 10 스팟 IFAT 슬라이드(Erie Scientific, Portsmith, New Hampshire)를 제조하였다. 상기 슬라이드를 -20℃에서 보관하였다. FITC(Fluorescein isothiocyanate)-결합된 토끼 항-염소 항혈청(Cappel Durham, USA)를 1:200으로 희석하여 일차 항체의 검출에 사용하였다. 면역형광 항원 슬라이드를 해동하고 25℃에 두었다. 시험 혈청(한국재래산양 1:50, 개혈청 희석 1:800)을 테스트 스팍 위에 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 슬라이드를 PBS로 5분간 3회 세척하고 FITC-결합된 항체와 함께 30분간 배양한 다음 PBS로 5분간 3회 세척하였다. 25% 글리세롤 함유 PBS를 첨가하고 상기 슬라이드를 형광현미경으로 검경하였다. 양성 및 음성 대조군 혈청은 VMRD(Pullman, USA)로 부터 입수하였다. 원충의 전체 표면이 형광을 나타낼때의 반응을 양성으로 간주하였다(Hur et al., 1998 Korean. J. Vet. Res., 38(4):859-866).

3) 네오스포라 캐니늄 원충

표적 동물의 접종을 위한 N. 캐니늄(KBA-2) 원충은 베로세포(CRL6318, ATCC, MD)로부터 수거하고 칼슘 및 마그네슘 무첨가 HBSS로 세척한 후 헤마토사이토미터로 계수하였다. N. 캐니늄 원충은 10% 말혈청(GIBOC, BRL), 4mM L-글루타민 MEM 비타민 용액(GIBCO BRL), MEM 필수 아미노산 용액(GIBCO BRl), MEM 비필수 아미노산 용액(GIBCO BRL), 항생제-항진균제(100 unit/㎖ 페니실린 G, 100㎕/㎖ 스트렙토마이신, 0.25㎍/㎖ 암포테신 B: GIBCO BRL) 및 7.5% 소디움 바이카보네이트를 함유한 최소 필수 배지(MEM:GIBCO BRL USA)에서 유지하였다. 베로세포의 약 75%가 원충에 감염될 때 까지 5% CO₂ 및 95% 공기로 이루어진 대기 하에서 37℃로 24-28시간 동안 세포가 배양 플레이트에 부착되도록 하였다. 원충을 함유한 세포를 플라스틱 세포 스크래퍼를 이용하여 수거하였다. 상기 현탁액을 23-게이지 니들이 장착된 시린지에 2회 통과시키고 멸균된 5㎛ 필터로 여과하였다. 상기 원충을 차가운 0.01M PBS로 원심분리(2,000rpm, 5분)로 세척하고 헤마토사이토미커로 계수하였다. 현탁액의 최종 부피를 1.0ml에 1×10⁷ 원충이 함유되도록 조정하였다. 동물 접종은 원충 수건 2시간 후에 수행하였다(Kim et al., 1998b J. Vet . Res., 38(1):139-145).

4) 항네오스포라 효능

항네오스포라 효능을 분석하기 위해 동물에 N. 캐니늄 원충을 접종한지 2주 후에 사상자(SF1) 및 고삼(TJ2)의 HPLC 분획을 투여하였다. 실험 종결시점에서 표적 동물을 희생시킨 후 조직을 수거하였다. 건조된 추출물(SF1 및 TJ2)을 80% 에탄올 10㎖에 재현탁하고 표적 동물에 사상자의 경우 1:100, 고삼의 경우 1:1000으로 희석하여 주사하였다.

5) N . 캐니늄의 검출 및 분리

신선한 샘필 조직을 수득하기 위해, 표적 동물을 혼수상태 동안 희생시키고 사망 후 조직을 짧은 시간 내에 수거하였다. 부검시 대뇌, 간, 심장, 척수, 폐, 비장, 췌장, 부신 및 대퇴 근육의 샘플을 동물로부터 제거하였다. 조직을 10% 중성 완충된 포르말린 용액에서 24시간 동안 고정시키고 파라핀으로 포매하였다. 각 조직 샘플을 헤마토자일린 및 에오신으로 염색하고 조직해부학적 실험을 수행하였다(Kim et al.,1998b J. Vet . Res., 38(1):139-145).

6) 면역조직화학

모든 조직을 10% 중성 완충된 포르말린 용액에서 24시간 동안 고정시키고 파라핀으로 포매한 다음 4㎛ 절편으로 절단하였다. 각 조직 절편을 3% H₂O₂와 메탄올로 처리하고 1% 프로테인아제로 37℃에서 5 또는 10분간 반응시켰다. 그 다음 5% 정상 토끼 혈청으로 37℃에서 20분간 처리하여 비특이적 결합을 차단하였다. 상기 조직을 N. 캐니늄 과다면역 혈청(VMRD, USA)을 1:3000으로 희석하여 37℃에서 30분간 처리하고 10% 트립톤-X를 함유한 차가운 Tris 버퍼(TTBS-HS/Tx)로 3회 세척하였다. 상기 조직을 2차 항체(biotinylated anti-goat IgG (Vector Lab., USA))(1:200)로 37℃에서 20분간 처리하고 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrachloride) (Vector Lab., USA)로 발색시켰다. 상기 조직 절편을 해리스 헤마토자일린(Harris's hematoxylin)으로 대비염색하고 광학현미경으로 검경하였다(Kim et al., 1997 J. Vet. Res., 37(3):607-612).

7) 통계분석

마우스의 뇌 손상 점수 결과는 터키 스튜던트 범위 테스트(Tukey's Students range test)에 의해 분석하였다.

<실시예 4>

마우스에서 고삼 및 사상자 HPLC 분획의 N . 캐니늄에 대한 항원충 효능

<4-1> 실험 설계

BALB/C 품종을 NVRQS(Anyang, Republic of Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 총 60마리의 마우스를 사용하였고, 모든 마우스의 체중은 20-25g이였으며 암컷이였다. 각 그룹은 12마리로 구성하였다. N. 캐니늄으로 접종한 모든 마우스는 면역억제제인 MPA(methylprednisolone acetate) 4mg을 근육주사하고 1주일 뒤 원충을 접종하였다. 대조군(A 그룹)은 원충만 주사한 그룹으로 이루어져 있다. 원충은 헤마토사이토미터로 계수하였고, 용액의 부피는 HBSS를 사용하여 0.5ml 당 2×10⁵의 원충이 함유되도록 조정하였다. 각 그룹의 마우스는 플라스틱 케이지에서 온도 22±2℃, 습도 55±10%로 사육시켰다. 사료 및 물은 무제한으로 자유급식하였다. 모든 케이지 및 장비는 고온살균처리 후 사용하였다. 12마리의 마우스에 사상자 HPLC 분획 7.125ng/㎖(그룹 B) 또는 2.850ng/㎖(그룹 C)를 피하주사하고 12마리의 다른 마우스에 고삼의 HPLC 분획 7.125ng/㎖(그룹 D) 또는 2.850ng/㎖(그룹 E)를 피하주사하였다. 원충 및 HPLC 분획은 첫째날 및 네째날에 피하주사하였다. 임상증상을 평가하기 위해, 본 발명자들은 모든 그룹을 아침 저녁으로 관찰하였다. 한약재 추출물의 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 매일 임상증상 및 사망율 등을 평가하였다. 뇌 병변은 다음의 3가지 기준을 기초로 하여 수치화하였다. : (1) 염증 또는 괴사 병변의 수, 병변없음=1, 1-5개=2, 6-10개=3, >10개=4; (2) 병변 평균 크, 병변없음 = 1, ≤300㎛= 2, 300-600㎛= 3, ＞600㎛= 4; 및 (3) 병변의 정도, 병변없음 = 1, slight = grade 2, mild = grade 3, moderate = grade 4, 및 marked = grade 5 (Lindsay et al. 1995a J. Parasitol., 81(2):313-315; Kim et al.,1998a J. Vet. Res., 38(4):853-858).

<4-2> 임상증상 및 생존율

BALB/c 마우스를 면역억제 시킨 후 N. 캐니늄 KBA-1로 감염시킨 다음(2×10⁵), 고삼 및 사상자의 HPLC 분획을 투여하고 이들의 항원충 효능을 조사하였다.

대조군 마우스(HPLC 분획을 투여하지 않고 원충만 감염시킨 그룹)는 피모가 매우 거칠어 지고 운동성이 둔해지면서 점차 식욕감퇴가 일어났다(도 13). 심한 경우 혼수상태에 빠지고 케이지의 벽에 머리를 기대기도 하였다. 원충 접종 후 17-25일 사이에 모든 마우스가 폐사하였다(도 12).

사상자 또는 고삼의 HPLC 분획을 50㎕씩 투여한 그룹 B 및 D는 약 13-14일부터 거친 피부와 느린 행동을 나타냈다. 대조군과 유사하게 원충 접종 후 19-25일 및 17-28일에 9마리 및 7마리의 마우스가 각각 폐사하였다. 한편, 사상자 또는 고삼의 HPLC 분획을 20㎕씩 투여한 그룹 C 및 E는 각각 11마리 및 10마리의 마우스가 폐사하였다. N. 캐니늄으로 감염된 마우스의 HPLC 분획 처리에 따른 생존율은 사상자 7.125ng/㎖, 2.850ng/㎖, 고삼 7.125ng/㎖ 또는 2.850ng/㎖ 처리시 각각 25%, 8.3%, 41.7%, 및 16.7%였다(표 6).

N. 캐니늄으로 감염된 마우스에서 HPLC 분획의 효능

그룹	마우스 수	폐사한 수	폐사까지의 기한 (days after challenge)	평균 폐사 일수	생존율 (%)
A. 네오스포라만 투여	12	12	17(1*), 18(2), 19(2), 22(3), 23(2), 25(2)	21	0
B. 사상자 분획 7.125ng/㎖	12	9	19(2), 21(2), 23(2), 25(3)	22.3	25
C. 사상자 분획 2.850ng/㎖	12	11	17(2), 18(2), 19(2), 22(3), 26(2)	20.5	8.3
D. 고삼 분획 7.125ng/㎖	12	7	17(2), 20(2), 25(2), 27(1)	21.6	41.7
E. 고삼 분획 2.850ng/㎖	12	10	18(2), 19(2), 21(1), 22(1), 23(2), 26(2)	21.5	16.7

* 폐사한 마우스의 수

<4-3> 조직학적 특성

HPLC 분획을 투여하지 않고 원충만을 접종한 그룹 A의 대뇌, 소뇌 및 척수에서 정상적인 부위와 명확하게 구분되는 방사상의 괴사성 비화농성 뇌염 소견이 다수 산재하여 있었으며 부위에 따라 비화농성 뇌염 소견도 공존하고 있었다(도 14 및 15). 국소적인 소상 괴사소는 뇌실질 혈관 주위 또는 뇌실 주변의 뇌실질에서 다수 관찰되었으며, 일부 심한 병변부에서는 해면상의 형태로 나타나기도 하였다. 괴사 병변부 인근 뇌실질 또는 주위의 신경세포의 세포질에서 호염성으로 염색되는 초생달 모양의 원충이 단독 또는 집락을 형성하며 분포하고 있었으며, 면역염색시 강한 갈색의 양성반응을 확인할 수 있었다. 일부에서는 주위에 염증세포의 침윤을 동반하지 않은 상태로 다수의 원충 집락이 모여 있는 위낭종(pseudocysts)도 관찰되었다(도 16). 췌장 조직에서 다수의 국소적인 괴사성 췌장 염증이 관찰되었다(도 17). 림프구, 형질세포 및 거대 포식세포의 침윤이 실질 내에 함몰되어 있기 때문에, 췌장의 세엽을 둘러싸고 있는 상피세포는 위축 또는 괴사를 나타냈다. 비화농성 염증, 세포 침윤 및 소수의 원충이 폐, 간, 비장 및 위장관에 산재해 있었으며, 원충은 면역염색시 더욱 뚜렷하게 관찰할 수 있었다(도 16). 그룹 A에서, 폐사한 마우스의 평균 뇌 병변지수는 8.15로 나타나 실험군 중에서 가장 심한 뇌병변을 형성하고 있었다(표 7).

사상자 7.125ng/㎖ 및 고삼 7.125ng/㎖를 주입한 마우스의 평균 뇌병변 지수는 각각 6.34 및 5.92였다. 사상자 2.850ng/㎖ 및 고삼 2.850ng/㎖를 주입한 마우스의 평균 뇌병변 지수는 각각 7.82 및 7.35였다. 상기 병변 지수는 그룹 A에 비해 유의적으로 낮지 않았다(p<0.05).

사상자 또는 고삼의 HPLC 분획으로 처리한 BALB/c 마우스의 뇌 병변 지수

그룹	A. 네오스포라 만 접종	B. 사상자분획 7.125ng/㎖	C. 사상자분획 2.850ng/㎖	D. 고삼분획 7.125ng/㎖	E. 고삼분획 2.850ng/㎖
뇌 병변 지수 (평균±표준편차)	8.15±1.62	6.34±2.52	7.82±2.82	5.92±1.86	7.35±2.38

< 실시예 5>

한국재래산양에서 고삼 및 사상자 HPLC 분획의 N . 캐니늄에 대한 항원충 효능

<5-1> 실험 설계

12두의 한국재래산양을 상업적으로 구입하여 생약재 분획의 효능평가에 사용하였다. 산양은 임신 5-6개월령의 암컷을 사용하였고 2 또는 4두씩 동거사육하면서 물과 사료를 자유급식시켰다. 우측 경정맥으로부터 10ml의 혈청을 채취하고 N. 캐니늄에 대한 항체 소장 여부를 검사한 후 항체 음성인 개체만을 사용하였다. 한국재래산양에 원충 접종전 MPA를 근육주사하고 7일 후 N. 캐니늄을 접종하였다. 대조군(그룹 A)은 2두로 구성되어 있으며, 이들에게 HBSS를 이용하여 1㎖ 당 1×10⁸ 원충이 함유되도록 조정된 용액만을 피하주사하였다. 모든 산양의 우측 견갑골 인근 피하에 1×10⁸ 원충을 피하주사하였다. 4두의 산양에는 사상자의 HPLC 분획 142.5ng/kg(그룹 B) 또는 14.25ng/kg(그룹 C)를 피하주사하였고, 다른 4두의 산양에는 고삼의 HPLC 분획 142.5ng/kg(그룹 D) 및 14.25ng/kg(그룹 E)을 피하주사하였다. 2두의 한국산양(그룹 E)은 대조군으로 1㎖/kg 또는 0.1㎖/kg으로 80% 에탄올을 주사하였다. 각 주마다 체온을 측정하고 모든 산양 혈청을 수거하여 매주 N. 캐니늄 항체의 존재를 평가하였다. 접종 후, 본 발명자들은 하루에 두번 임상증상과 사망율을 매일 관찰하였다.

<5-2> 체온 및 항체 변화

임신한 한국재래산양 6두(임신일수 60-80일)를 면역억제시킨 후 N. 캐니늄 1×10⁸으로 감염시키고 고삼 및 사상자 HPLC 분획을 투여하고 이들의 항원충 효과를 조사하였다. 원충 접종시 임신 산양의 체중은 18.0-23.6kg 정도였으며, 스트레스를 가하지 않기 위하여 실험기간에 체중을 측정하지 않았다.

각각의 산양에 대해 체온을 측정한 결과 36.6℃ 내지 39.6℃로 나타났다(표 8). 대조군 그룹 A와 다른 그룹간의 체온 변화는 유의적인 차이가 없었다.

N. 캐니늄으로 감염된 임신 산양의 체온 변화

그룹	산양의 수	ID*	Weeks of post-inoculation (WPI)
			1W	2W	4W	6W	8W	10W
A. 네오스포라만 접종	2	11	37.9	39.3	38.3	NT	NT	NT
		14	38.9	37.8	38.4	36.7	38	37.1
B. 사상자 분획 142.5ng/㎏	2	1	38.4	38.8	38.1	38.3	37.8	36.8
		15	39.5	38.1	37.4	36.6	37.8	38.1
C. 사상자 분획 14.25ng/㎏	2	3	38.1	38.9	38	38.4	37.8	38.1
		4	38.1	38.8	38.4	38.4	38.3	38.3
D. 고삼 분획 142.5ng/㎏	2	5	38.8	38.3	37.9	38.3	38.5	37.1
		6	38.8	38.3	37.9	38.3	38.5	37.1
E. 고삼 분획 14.25ng/㎏	2	7	37.6	39.2	38.3	38	37.9	37.3
		16	38.7	38.2	38.8	38.3	38	37
F. 용매 대조군	2	9	38.6	38.3	39.6	38.3	38.1	38.8
		10	38.8	39.4	39.3	38.8	37.3	39.1

또한, 개체별로 2주간격으로 채혈을 실시하여 간접형광항체 검사를 통하여 항체의 생성여부를 조사하였다. 그 결과, 양성 대조군 그룹(그룹 A)는 1:3,200-1:6,400로 높은 항체 역가를 나타냈으나, 사상자 및 고삼 처리 그룹은 그룹 A에 비해 1:800-1:3,200 정도의 낮은 항체 역가를 나타냈다(표 9).

생약재 분획 투여한 임신산양의 IFA 테스트에 의해 결정된 N. 캐니늄에 대한 혈청 항체 수준

그룹	산양의 수	ID*	Titers in weeks of post-inoculation
			1W	2W	6W	10W
A. 네오스포라만 접종	2	11	N	800	NT	NT
		14	N	800	6,400	3,200
B. 사상자 분획 142.5ng/㎏	2	1	N	400	3,200	1,600
		15	N	400	1,600	1,600
C. 사상자 분획 14.25ng/㎏	2	3	N	800	3,200	3,200
		4	N	800	3,200	3,200
D. 고삼 분획 142.5ng/㎏	2	5	N	400	1,600	800
		6	N	800	1,600	1,600
E. 고삼 분획 14.25ng/㎏	2	7	N	800	3,200	3,200
		16	N	800	1,600	1,600
F. 용매 대조군	2	9	N	N	N	N
		10	N	N	N	N

* 산양의 ID, N= 음성, NT= 실험하지 않음

<5-3> 임상증상 및 유산 발생 현황

대조군 그룹에서, 2두의 산양(ID 11 및 14)이 각각 원충 접종 후 27일에 2두의 태아 및 1두의 태아를 유산하였다(도 18). 태아의 신장은 각각 12cm 및 15cm였다(표 10). 유산 후 10일에 1두의 산양(ID 11)이 목줄이 엉키는 사고로 폐사하였다.

N. 캐니늄으로 감염되고 생약재 분획을 처리한 산양의 임신 결과 및 이들 자손의 조직학적 뇌 병변

그룹	ID*	자손의 상태	유산일수	유산한 수	CR 길이	뇌 병변
A. 네오스포라 만 접종	11	유산	27	1	12 ㎝	괴사성 뇌염
	14	유산	27	1	15 ㎝	괴사성 뇌염
B. 사상자 분획 142.5ng/㎏	1	유산	51	2	16/17 ㎝	괴사성 뇌염
	15	week born	60	1	-	-
C. 사상자 분획 14.25ng/㎏	3	유산	45	2	18/18.5 ㎝	-
	4	임신하지 않음
D. 고삼 분획 142.5ng/㎏	5	유산	116	2	29/30 ㎝	괴사성 뇌염
	6	유산	41	2	16/15.5 ㎝	-
E. 고삼 분획 14.25ng/㎏	7	유산	50	1	17 ㎝	-
	16	유산	51	1	22 ㎝	괴사성 뇌염
F. 용매 대조군	9	Delivered 1 normal lambs
	10	임신하지 않음

* Animal ID of goat, CR length= crown and rump length

사상자 HPLC 분획 142.5ng/㎖를 투여한 그룹 B에서, 임신 산양 2두(ID 1 및 15) 중 1두(ID 1)는 원충 접종 51일 째 체장 16-17cm의 2두의 태아를 유산하였다. 나머지 1두 (ID 15)는 원충 접종 후 60일째에 1두의 태아를 분만하였으나 생후 2일째에 폐사하였다. 사상자의 HPLC 분획 14.25ng/㎖를 투여한 그룹 C에서, 산양 2두(ID 3, 4) 중 1두(ID 3)가 원충 접종 후 45일째에 2두의 태아를 유산하였으며 체장은 18-18.5cm였다. 1두(ID 4)는 실험이 종료되는 시점까지 분만이 이루어지지 않았다.

고삼의 HPLC 분획 142.5ng/㎖를 투여한 그룹 D에서 2두의 산양(ID 5, 6)은 각각 접종 116일째 및 41일째에 체장 29-30cm 및 15.5-16cm의 태아를 2두씩 유산하였다(도 19). 고삼의 HPLC 분획 14.25ng/㎖를 투여한 그룹 E에서, 2두의 산양(ID 7, 16)이 원충 접종 후 각각 50일 51일에 체장 17cm 및 22cm인 태아를 1두씩 유산하였다. 음성 대조군으로서 80% 에탄올을 투여한 그룹 E에서, 1두(ID 9)의 경우 정상적인 염소를 분만하였으나, 1두(ID 10)는 임신이 이루어지지 않았다(표 10).

<5-4> 조직학적 특성

임신 산양으로부터 유산된 12두의 태아 및 1두의 산양(ID 15)으로부터 분만된 자양 1두에 대하여 부검을 실시하고 조직학적 실험을 위해 각 조직을 회수하였다. 임신 중기 정도에 유산된 태아의 경우 전신 피부에 털이 형성되지 않았으며, 암갈색 피부발적이 관찰되었다(도 18). 대부분의 태아는 미약하거나 중증도의 사후변화가 동반되었으며, 일부의 태아는 체강(somatic cavity) 또는 다리의 일부가 손실되었다. 산양 (ID 5)에 의해 태어난 태아의 경우 체장이 약 30cm였고 정상적인 형태를 나타냈다(도 19).

유산태아 12두 중 6두에서 미약하거나 중증도의 괴사성 뇌염 병변이 관찰되었다. 원충만을 접종한 A 그룹의 유산태아 2두의 대뇌, 소뇌 및 척수에서 림프구, 소교세포 및 큰 포식세포 등이 침윤된 방사상의 괴사성 뇌염이 관찰되었다(도 20). 또한, 부위에 따라서는 위관성 원형세포 침윤(perivascular cuffing)이 관찰 되기도 하였다. 뇌막과 뇌실에서는 국소적으로 또는 광범위하게 단핵구세포 계통의 염증세포들이 침윤되어 거미막 또는 맥락막층이 확장되어 있었다. 면역조직화학염색을 수행한 결과 괴사소 인근 부위 뇌 실질에서 원충의 조직 낭종(tissue cysts)이 선명하게 나타나는 경우도 있었다(도 21). 중추신경계 이외의 병변으로는 심장과 골격근에서 경미하나마 림프구 및 큰 포식세포가 침윤되어 있는 국소적인 비화농성 심근염 또는 근염이 관찰되었다(도 22, 23). 그러나, 다른 장기에서는 사후변화로 인하여 병변의 관찰이 용이하지 않았다.

사상자 및 고삼의 HPLC 분획을 투여한 그룹에서 10두의 태아 중 4두(40%)에서 병리조직학적 병변이 관찰되었다. 주로, 대뇌 및 뇌줄기에서 경미한 국소 다발성 괴사성 뇌염 소견이 관찰되었으며, 일부 뇌혈관 주위로 비화농성 염증세포의 층판상 침윤이 나타나기도 하였다. 그러나 전반적인 병변 정도는 감염-무투약 A 그룹의 유산태아에 비하여 미약한 형태로 분포하고 있었다. 고삼 투여군의 모축 1두(ID 15)에서 태어나 폐사한 개체에는 내부장기의 특별한 병리조직학적 소견을 관찰할수 없었다.

<실시예 6>

개에서 고삼 및 사상자 HPLC 분획의 N . 캐니늄에 대한 항원충 효능

<6-1> 실험 설계

24두의 포유단계 자견을 가지며 다양한 연령의 5마리의 모견을 구입하여 사용하였다. 4-5두의 자견이 딸린 각각의 모축을 케이지에 사육하였다. IFAT에 의한 N. 캐니늄 항체를 시험하기 위해 각각의 개로부터 혈청을 수득하고 항체가 존재하지 않은 개를 실험에 사용하였다. 각 모축을 자견과 함께 사육하고 5주 후에 각 자견을 분리시켰다. 모든 개에게 표준 건조 개 사료 및 물을 자유급식하였다. 모든 개는 원충 접종 7일 전에 MPA를 근육주사하였다. 원충 접종 0일 및 5일에 한약재 추출물을 N. 캐니늄 원충과 함께 접종하였다. 대조군(A)은 4두의 자견으로 구성하였으며 원충만을 접종하였다. 이때 원충이 1ml 당 5×10⁶이 포함되도록 조정하였다. 모든 자견에게 5×10⁶/ml의 원충을 복강주사하였다. 5두의 개에게 사상자 HPLC 분획 142.5ng/kg(그룹 B) 또는 14.25ng/kg(그룹 C)를 피하주사하였고, 고삼 HPLC 분획 142.5ng/kg(그룹 D) 또는 14.25ng/kg(그룹 E)을 피하주사하였다. 각 그룹에서 2두의 자견을 원충 접종 후 35일 및 70일에 부검하였다. 5개 그룹 내에서 각 자견으로부터 뇌, 폐, 심장, 간, 비장, 췌장, 신장 및 대퇴 근육조직을 회수하였다. 각 그룹의 한 마리 자견은 본 연구가 종결될때까지 비정상적인 임상증상을 관찰하였다. 매일 체온을 측정하였고, 매주 혈청을 채취하였다. 접종후 하루에 두번 임상증상과 사망율을 평가하였다.

<6-2> 체온 및 항체가 변화

사상자 및 고삼의 HPLC 분획의 효능을 조사하기 위해, 24두의 포유자견(2주령)의 면역을 억제하고 N. 캐니늄 원충 5×10⁶을 접종하였다. 접종 후, 사상자 및 고삼의 HPLC 분획을 주사하고 상기 분획의 항원충 효능을 평가하였다.

정상 체온은 약 37.5±1.2℃이다. 본 실험 동안 그룹 A 및 분획 투여 그룹 의 체온 변화는 유의적인 차이를 나타내지 않았다. N. 캐니늄으로 감염된 자견으로부터 수득한 혈청에서 항-네오스포라 항체를 IFAT에 의해 측정하였다. 혈청 양성은 접종 후 2주째에 나타났다(역가 1:50 - 1:200). 대조군(그룹 A)은 접종 후 2주째에 1:400 정도의 높은 항체 역가를 나타냈다. 한편, 고삼 및 사상자의 HPLC 분획을 주사한 그룹은 약 1:100의 낮은 항체 역가를 나타냈다(표 11).

개에서 생약재 분획의 처리에 따른 N. 캐니늄에 대한 혈청 항체 수준을 IFA 테스트로 분석한 결과

그룹	개의 수	접종 후 역가
		1주	2주	4주	6주	8주	10주
A. 네오스포라만 접종	4	N	100 ～ 200	200 ～ 400	200 ～ 400	200	200
B. 사상자 분획 142.5ng/㎏	5	N	50	50～100	100	100	100
C. 사상자 분획 14.25ng/㎏	5	N	50～100	100	50～100	100	100
D. 고삼 분획 142.5ng/㎏	5	N	50	100	100	100	100
E. 고삼 분획 14.25ng/㎏	5	N	50～100	100 ～ 200	100 ～ 200	100	100

<6-3> 임상증상

원충 접종 24일부터 그룹 A의 4두의 자견 중 2두가 활성동이 떨어지고 의기소침하며 약간의 파행을 보이다가 점차 증상이 심하여져서 그 중 1두의 자견이 접종 29일째에 폐사하였다(도 24). 나머지 1두는 약간의 설사 증상이 동반되었으나 항생물질과 지사제의 투여로 증상이 회복되었다. 폐사된 자견을 부검하였다. N. 캐니늄 원충이 뇌에서 발견되었다. 각 그룹의 2두의 자견을 접종 35일 및 70일에 안락사시킨 후 병리학적 검사를 실시하였다. A 그룹을 제외한 모든 자견은 정상적인 임상증상을 보였다.

<6-4> 조직학적 특징

원충 접종 29일에 폐사한 자견은 대뇌, 소뇌 및 척수에서 다발성 괴사성 뇌염과 비화농성 뇌염이 관찰되었다(도 25, 26). 병변의 중심부와 주변부에 N.캐니늄의 원충 및 조직낭이 매몰되어 있었다(도 27). 골격근에서는 근육세포의 변성괴사와 함께 단핵구 세포가 침윤되어 있는 병변이 다수 분포하고 있었다. 원충 접종 35일 및 70일에 안락사시킨 모든 자견에서 국소적인 간질성 폐렴, 비화농성 간질성 신염 및 일부 개체의 소장에 콕시듐의 감염이 관찰되었다. 그러나, N. 캐니늄 원충 접종과 관련된 병변 및 원충 항원은 검출할 수 없었다.

도 1은 고삼(T. japonica) 및 사상자(S. flavescens)의 HPLC 분획을 나타낸 것이다(왼쪽: 고삼, 오른쪽: 사상자).

도 2는 G1-4-1 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과로 소포리단(Sophoridane)으로 동정되었다.

도 3은 G1-4-2 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과로 소포리단(Sophoridane)으로 동정되었다.

도 4는 G3-1 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과로 푸로사도닌 A(Furosardonin A)로 동정되었다.

도 5는 G3-5 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과로서 테트라이소프로필리덴-사이클로부탄(Tetraisopropylidene-cyclobutane)으로 동정되었다.

도 6은 G3-6-1 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과로서 5,17-베타-디하이드록시-드-에이-에스트라-5,7,9,14-테트란(5,17,beta-Dihydroxy-de-A-Estra-5,7,9,14 -Tetraene)으로 동정되었다.

도 7은 G4-6 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과로서 푸라노디엔(Furanodiene)으로 동정되었다.

도 8은 G5-2 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과로서 9,12-옥타데카디온산(Z,Z)-(CAS, 1)(9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-(CAS, 1)).

도 9는 G5-3-1 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과이다.

도 10은 G5-3-2 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과이다.

도 11은 G5-4-1 HPLC 분획의 GC/MS 분석 결과이다.

도 12는 네오스포라 캐니늄 KBA-1로 감염된 마우스에서 사상자 또는 고삼의 HPLC 분획 처리에 따른 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 13은 HPLC 분획을 투여하지 않고 원충만 감염시킨 대조군 마우스의 사진이다.

도 14는 네오스포라 캐니늄으로 감염된 마우스의 뇌에서 비화농성 뇌염 부위를 H&E 염색하고 현미경으로 관찰한 결과이다(X 200).

도 15는 네오스포라 캐니늄으로 감염된 마우스의 뇌에서 괴사성 뇌염 부위를 H&E 염색하고 현미경으로 관찰한 결과이다(X 200).

도 16은 네오스포라 캐니늄으로 감염된 마우스의 뇌에서 원충 및 위낭종의 양성반응을 현미경으로 관찰한 결과이다(X 200)

도 17은 네오스포라 캐니늄으로 감염된 마우스에서 췌장 염증 및 괴사를 현미경으로 관찰한 결과이다(X 200).

도 18은 N. 캐니늄에 감염된 산양 개체 11번(ID 11)으로부터 유산된 태아의사진이다.

도 19는 N. 캐니늄으로 감염시키고 고삼 분획을 투여한 산양으로부터 유산된 태아의 사진이다.

도 20은 N. 캐니늄으로 감염된 산양의 뇌에서 H&E 염색에 의해 중증도의 괴사성 뇌염 병변을 현미경으로 관찰한 사진이다(X 200).

도 21은 N. 캐니늄으로 감염된 산양의 뇌에서 원충의 양성 반응을 면역조직 화학염색법으로 확인한 결과이다(X 400).

도 22는 N. 캐니늄으로 감염된 산양의 심장에서 H&E 염색에 의해 비화농성 심근염을 현미경으로 관찰한 사진이다(X 200).

도 23은 N. 캐니늄으로 감염된 산양의 골격근에서 H&E 염색에 의해 비화농성 근염을 현미경으로 관찰한 사진이다(X 200).

도 24는 N. 캐니늄의 접종에 의해 폐사된 자견의 사진이다.

도 25는 N. 캐니늄으로 감염된 개의 뇌에서 혈관주위세포 침윤 및 신경교증을 H&E 염색에 의해 관찰한 결과이다(X 200).

도 26은 N. 캐니늄으로 감염된 개의 뇌에서 다발성 괴상성 뇌염을 H&E 염색에 의해 관찰한 결과이다(X 200).

도 27은 N. 캐니늄으로 감염된 개의 뇌에서 원충의 양성 반응을 관찰한 결과이다(X 400).

Claims (9)

1. 고삼(T. japonica) 또는 사상자(S. flavescens)의 저급알코올 추출물을 포함하는 네오스포라 캐니늄(Neospora caninum) 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 저급알코올이 직쇄 또는 분지상의 메탄올, 에탄올 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
3. 고삼(T. japonica) 또는 사상자(S. flavescens)의 저급알코올 추출물을 아세토니트릴과 물의 혼합용매를 이동상으로 사용하고 세미-프리퍼러티브 HPLC (High-Perfomance Liquid Chromatography)로 분리함으로써 수득된 분획물을 포함하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 저급알코올이 직쇄 또는 분지상의 메탄올, 에탄올 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 HPLC 분획물이 고삼의 저급알코올 추출물의 TJ2 분획인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제3항에 있어서, 상기 HPLC 분획물이 사상자의 저급알코올 추출물의 SF1 분획인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제3항에 있어서, 상기 HPLC 분획물이 소포리단(2)(Sophoridane), 마트리딘-15-원(Matridin-15-one, CAS, 1), 푸로사도닌 A(Furosardonin A 1), 테트라이소프로필리덴-사이클로부탄니(Tetraisopropylidene-cyclobutanee), 5,17,베타-디하이드록시-드-A-에스트라-5,7,9,14-테트란(1)(5,17,beta-Dihydroxy-de-A-Estra-5,7,9,14 -Tetraene (1), 푸라노디엔(1)(Furanodiene) 및 9,12-옥타데카디온산(Z,Z)-(CAS,1)(9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-(CAS, 1)으로 이루어진 군 중에서 선택된 성분으로 이루어진 것임을 특징으로 하는 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 네오스포라 캐니늄 감염증의 예방 또는 치료방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 포유동물은 쥐, 산양 및 개로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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