KR20090021786A - Method and kit for diagnosis of skin aging - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 피부 노화 진단 키트 및 피부 노화 진단 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 연령 증가에 따라 발현 패턴이 변화되는 유전자를 확인하여 피부의 노화 정도를 진단하기 위하여, 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브로서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드의 프라이머 쌍; 또는 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 하나 이상 포함하는 피부 노화 진단 키트 및 그를 이용하는 피부 노화 진단 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a skin aging diagnostic kit and a method for diagnosing skin aging, and specifically, in order to identify a gene whose expression pattern changes with age, and to diagnose the degree of aging of the skin, hybridizing with a polynucleotide of the gene sequence. One or more polynucleotides or complementary polynucleotides thereof as a probe; Primer pairs of polynucleotides of said gene sequence; Or it relates to a skin aging diagnostic kit comprising at least one monoclonal antibody to the polypeptide encoded by the gene and a skin aging diagnostic method using the same.
사람의 유전체는 3x109개의 염기쌍으로 구성되어 있고, 대략 5 만개의 유전자를 가지고 있는 것으로 추측되며, 하나의 세포에서 발현되는 기능성 유전자의 개수는 대략 10,000개 정도로 추정된다. 즉 하나의 세포는 50,000개의 유전자 중 약 10,000개의 단백질만을 선택적으로 만들어내고 있으며, 어떤 단백질을 만들어내느냐에 따라 그 세포의 기능적 특성이 결정된다. The human genome consists of 3x10 9 base pairs and is estimated to have approximately 50,000 genes, and the number of functional genes expressed in one cell is estimated to be approximately 10,000. That is, a cell selectively produces only about 10,000 proteins out of 50,000 genes, and the protein's functional characteristics are determined by which protein it produces.
세포의 유전자 발현 특성의 차이는 서로 다른 세포 간에 나타날 뿐만 아니라, 동일한 세포의 병적인 상황, 예를 들면 젊은 세포와 노화된 세포 간에도 나타난다. 종래의 생명과학은 이러한 유전자 발현의 변화를 일대일의 관계로부터 찾는 것이 관례였으나, 특정 단백질의 작용은 하나의 단백질에 국한되는 것이 아니고, 다양한 단백질의 발현에 관여하며, 세포의 특성은 특정 단백질 하나에 의하여 결정되는 것이 아니라 다양한 단백질들의 특성이 총체적으로 조화를 이룸으로써 결정된다고 판단되기 때문에 과거의 접근은 매우 제한적일 수밖에 없었다. 피부의 노화 과정 또한 다른 생리 현상과 마찬가지로, 외부 자극 (UV, ROS 등) 및 세포 내에 내재적으로 존재하는 인자 (유전자, 단백질)의 상호작용에 의해 결정되므로, 이런 여러 인자들을 아울러 관찰할 필요가 있지만, 지금까지 피부 노화에 대한 연구는 노화를 유도하는 외적 인자에 의한 세포/조직 내의 내재적 인자의 변화를 모니터링하는 것에 그쳤으므로, 연령 증가에 따른 내재적 인자 변화를 이해하는데 한계가 있었다. Differences in the gene expression properties of a cell not only appear between different cells, but also in the pathological situation of the same cell, for example between young and aged cells. Conventional life sciences have traditionally been looking for such changes in gene expression from a one-to-one relationship, but the action of a particular protein is not limited to one protein, but is involved in the expression of a variety of proteins, and the characteristics of a cell are linked to a specific protein. The past approach has been very limited, as it is determined not by the decision but by the overall harmony of the characteristics of various proteins. The aging process of the skin, like other physiological phenomena, is determined by the interaction of external stimuli (UV, ROS, etc.) and the factors (genes, proteins) inherent in the cell, so it is necessary to observe these factors as well. Until now, studies on skin aging have only limited the monitoring of intrinsic factor changes in cells / tissues by external factors that induce aging, and thus there is a limit in understanding the intrinsic factor changes with age.
지금까지 보고된 바에 의하면, 연령 증가에 따라 피부가 얇아지고 건조해지며 탄력이 떨어진다는 점, 조직 수준에서 세포외기질의 위축, 섬유아세포 수의 감소, 콜라겐 및 엘라스틴의 감소와 구조 이상이 관찰된다는 점, 구조 이상의 원인으로 타입 I, III 콜라겐 합성이 감소하고 분해가 증가된다는 점이 거론되고 있다. 또한 연령 증가에 따른 ROS의 증가, 고분자의 당화 증가, 단백질 변성 증가 및 분해 감소, DNA 손상 증가 및 DNA 수복(repair) 감소 등이 보고되었다. 그러나 상기와 같이 밝혀진 여러 현상과 노화 사이의 인과 관계가 명확하지 않기 때문에 효과 적인 노화 조절 방법이 개발되지 못하고 있는 실정이다. 노화 세포의 특성을 총체적으로 이해하기 위해 다양한 단백질들의 특성을 이해하려는 시도 또한 효능 물질 (RA, 진세노사이드 등) 또는 자극원 (UV, ROS)을 세포에 처리한 배양 시스템에서 의 연구에만 국한되어 그 한계를 가지고 있다.Reported to date, skin is thinner, dry and less elastic with increasing age, atrophy of extracellular matrix, decrease of fibroblast count, decrease of collagen and elastin and structural abnormality are observed at tissue level. It has been suggested that type I and III collagen synthesis is reduced and degradation is caused by structural abnormalities. In addition, ROS increased with age, increased glycosylation of polymers, increased protein denaturation and degradation, increased DNA damage, and reduced DNA repair. However, the causal relationship between the various phenomena and the above-described aging is not clear, so an effective aging control method has not been developed. Attempts to understand the properties of various proteins in order to understand the characteristics of senescent cells are also limited to studies in culture systems in which cells have been treated with agonists (RA, ginsenosides, etc.) or stimulators (UV, ROS). It has its limitations.
이에, 본 발명자들은 각 연령별 인체 피부 조직을 제공 받아 연령 증가에 따라 변화되는 유전자의 발현 패턴을 분석함으로써, 외부 자극이 최대한 배재된 상태에서 피부 내재적 노화 과정에 관련된 주요 유전자 발현 패턴을 추적하고, 이들 유전자의 발현을 조절하는 전사인자를 생물정보학 기법으로 추출한 결과, 이를 노화 진단 마커로 사용할 수 있다는 사실을 밝혀내었다. Accordingly, the present inventors are provided with human skin tissues for each age to analyze the expression patterns of genes that change with age, thereby tracking the major gene expression patterns related to the skin intrinsic aging process in the state where external stimuli are maximally excluded, and these Transcription factors that regulate gene expression were extracted by bioinformatics techniques and found that they can be used as diagnostic markers for aging.
따라서 본 발명은 연령 증가에 따라 발현이 증가 혹은 감소하는 유전자와 이를 조절하는 전사인자 유전자를 찾아내어, 이를 마커로 하는 피부 노화 정도 진단 키트 및 피부 노화 정도 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 시험 화합물이 상기 유전자로부터 코딩된 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하여 노화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to find a gene whose expression increases or decreases with age and a transcription factor gene that regulates the same, and to provide a skin aging diagnostic kit and a method for diagnosing skin aging. It is also an object of the present invention to provide a method for screening an aging inhibitor by checking whether a test compound promotes or inhibits the action of a protein encoded from the gene.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 피부 유래 각질형성세포에서 정상치보다 많으면 노화 피부로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention is BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A At least one polynucleotide selected from the group consisting of C16orf33 and LDHA, or at least one polynucleotide comprising at least 10 contiguous nucleotides, or a complementary polynucleotide thereof; And a solid support that binds the polynucleotide to the surface, and when the amount of the transcript hybridized to the polynucleotide is greater than the normal value in the skin-derived keratinocytes, the skin aging diagnostic kit is provided. do.
본 발명은 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 피부 유래 각질형성세포에서 정상치보다 적으면 노화 피부로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.The present invention consists of DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20L and RX39186 selected from the group RX391 One or more polynucleotides, or one or more polynucleotides comprising 10 or more consecutive nucleotides as fragments thereof, or complementary polynucleotides thereof; And a solid support that binds the polynucleotide to the surface, and when the amount of the transcript hybridized to the polynucleotide is less than the normal value in the skin-derived keratinocytes, the skin aging diagnostic kit is characterized by diagnosing aging skin. to provide.
본 발명은 PSMB7, EEF1A1 및 ABO으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 피부 유래 섬유아세포에서 정상치보다 많으면 노화 피부로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.One or more polynucleotides or fragments thereof comprising at least 10 consecutive nucleotides as one or more polynucleotides or fragments thereof selected from the group consisting of PSMB7, EEF1A1 and ABO; And a solid support that binds the polynucleotide to the surface, and when the amount of the transcript hybridized to the polynucleotide is greater than normal in skin-derived fibroblasts, the present invention provides a skin aging diagnostic kit, wherein the skin is diagnosed as aging skin. .
본 발명은 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레 오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 피부 유래 섬유아세포에서 정상치보다 적으면 노화 피부로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.The present invention is at least 10 polynucleotides or fragments thereof selected from the group consisting of RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B and CEBPZ. One or more polynucleotides comprising contiguous nucleotides, or complementary polynucleotides thereof; And a solid support that binds the polynucleotide to the surface, and when the amount of the transcript hybridized to the polynucleotide is less than the normal value in skin-derived fibroblasts, the skin aging diagnosis kit is provided. do.
또한 본 발명은 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 피부 유래 각질형성세포에서 정상치보다 많으면 노화 피부로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.The present invention also consists of BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, and C16orf33 At least one polynucleotide comprising 18-23 consecutive nucleotides as a fragment of a polynucleotide selected from; And one or more polynucleotides comprising 18-23 contiguous nucleotides as fragments of polynucleotides complementary to the polynucleotides selected from the group, wherein the amount of DNA amplified using the polynucleotides as a primer in the skin-derived keratinocytes. If more than the normal value provides a skin aging diagnostic kit, characterized in that the diagnosis of aging skin.
본 발명은 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 피부 유래 각질형성세포에서 정상치보다 적으면 노화 피부로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다. The present invention consists of DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20L and RX39186, COX7186 selected from the group One or more polynucleotides comprising 18-23 consecutive nucleotides as fragments of nucleotides; And one or more polynucleotides comprising 18-23 contiguous nucleotides as fragments of polynucleotides complementary to the polynucleotides selected from the group, wherein the amount of DNA amplified using the polynucleotides as a primer in the skin-derived keratinocytes. If less than the normal value provides a skin aging diagnostic kit, characterized in that the diagnosis of aging skin.
본 발명은 PSMB7, EEF1A1 및 ABO으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 피부 유래 섬유아세포에서 정상치보다 많으면 노화 피부로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다. The present invention provides a fragment of a polynucleotide selected from the group consisting of PSMB7, EEF1A1, and ABO, comprising one or more polynucleotides comprising 18-23 contiguous nucleotides; And at least one polynucleotide comprising 18-23 contiguous nucleotides as a fragment of a polynucleotide complementary to a polynucleotide selected from the group, wherein the amount of DNA amplified using the polynucleotides as a primer is normal in skin-derived fibroblasts. It provides a skin aging diagnostic kit, characterized in that the diagnosis more aging skin.
본 발명은 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 피부 유래 섬유아세포에서 정상치보다 적으면 노화 피부로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.The present invention relates to 18-23 contiguous nucleotides as fragments of polynucleotides selected from the group consisting of RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B and CEBPZ. One or more polynucleotides comprising; And at least one polynucleotide comprising 18-23 contiguous nucleotides as a fragment of a polynucleotide complementary to a polynucleotide selected from the group, wherein the amount of DNA amplified using the polynucleotides as a primer is normal in skin-derived fibroblasts. It provides a skin aging diagnostic kit, characterized in that less is diagnosed with aging skin.
또한 본 발명은 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩 되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 하나 이상 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양이 정상치보다 많으면 노화 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.The present invention also consists of BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, and C16orf33 It comprises at least one monoclonal antibody to the polypeptide encoded by the gene selected from, characterized in that if the amount of the antigen bound to the antibody in the skin-derived keratinocytes to be diagnosed more than the normal value is diagnosed as aging skin Provides skin aging diagnostic kit.
본 발명은 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가변영역으로 가지는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항체에 결합된 항원의 양이 피부 유래 각질형성세포에서 정상치보다 적으면 노화 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다. The present invention consists of DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20L and COX7186 selected from the group RX39A At least one monoclonal antibody having an amino acid sequence encoded by the variable region, wherein the amount of antigen bound to the antibody is less than normal in skin-derived keratinocytes, characterized in that it is diagnosed as aging skin. Provides skin aging diagnostic kit.
본 발명은 PSMB7, EEF1A1 및 ABO으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가변영역으로 가지는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항체에 결합된 항원의 양이 피부 유래 섬유아세포에서 정상치보다 많으면 노화 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다. The present invention includes at least one monoclonal antibody having a variable region of an amino acid sequence encoded by a gene selected from the group consisting of PSMB7, EEF1A1 and ABO, wherein the amount of antigen bound to the antibody is normal in skin-derived fibroblasts. It provides a skin aging diagnostic kit, characterized in that the diagnosis is more aging skin.
본 발명은 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가변영역으로 가지는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항체에 결합된 항원의 양이 피부 유래 섬유아세포에서 정상치보다 적으면 노화 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다. The present invention provides a variable region of an amino acid sequence encoded by a gene selected from the group consisting of RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B and CEBPZ. Eggplant includes one or more monoclonal antibodies, and if the amount of antigen bound to the antibody is less than normal in the skin-derived fibroblasts provides a skin aging diagnostic kit, characterized in that the diagnosis is aging skin.
또한 본 발명은 피부의 노화를 진단하는 방법으로서, 표피 중의 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량, 또는 진피 중의 PSMB7, EEF1A1 및 ABO 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량이 정상치보다 많으면 노화 피부인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 방법을 제공한다. In addition, the present invention is a method for diagnosing the aging of the skin, BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1 If the expression level of one or more genes selected from the group consisting of HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 and LDHA genes, or the expression level of one or more genes selected from the group consisting of PSMB7, EEF1A1 and ABO genes in the dermis It provides a method for diagnosing skin aging, characterized in that judging.
본 발명은 피부의 노화를 진단하는 방법으로서, 표피 중의 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량, 또는 진피 중의 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량이 정상치보다 적으면 노화 피부인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 방법을 제공한다. The present invention is a method for diagnosing skin aging, DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC350 Expression level of one or more genes selected from the group consisting of FLJ20186, COX7A2L and RPL39 genes, or RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, CSDC2 The present invention provides a method for diagnosing skin aging, wherein the expression level of one or more genes selected from the group consisting of PPP1R12B and CEBPZ genes is determined to be aging skin.
본 발명은 노화 억제제를 스크리닝하는 방법으로서, BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코딩되는 단백질, 또는 PSMB7, EEF1A1 및 ABO로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코딩되는 단백질에 시험 화합물을 결합시키는 단계; 및 상기 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention is a method for screening an aging inhibitor, BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, Binding a test compound to a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of C16orf33 and LDHA, or a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of PSMB7, EEF1A1 and ABO; And it provides a method for screening aging inhibitors comprising the step of determining whether the test compound inhibits the action of the protein.
본 발명은 노화 억제제를 스크리닝하는 방법으로서, DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코딩되는 단백질, 또는 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코딩되는 단백질에 시험 화합물을 결합시키는 단계; 및 상기 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 촉진하는지를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다. The present invention is a method for screening an aging inhibitor, DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC20 L97 And a protein encoded by one or more genes selected from the group consisting of RPL39, or RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B and CEBPZ Binding the test compound to a protein encoded by one or more genes selected from the group consisting of; And confirming whether the test compound promotes the action of the protein.
본 발명은 노화 억제제를 스크리닝하는 방법으로서, MEF-2, FOXD3 2, SREBP-1, CP2, Nkx2-5, c-Myb 4, CREB, CRE-BP1, NRF-2 3, Freac-4, GATA-1 및 NF-kB 3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 및 유니버설(universal) 프로모터를 포함하는 플라스미드, 및 상기 선택된 유전자에 의해 코딩되는 전사인자가 결합하는 DNA서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; 상기 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 시험 화합물이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다. The present invention is a method for screening an aging inhibitor, MEF-2, FOXD3 2, SREBP-1, CP2, Nkx2-5, c-
본 발명에 따르면 연령 증가에 따라 피부의 각질형성세포 및 섬유아세포에서 발현이 증가되거나 감소되는 유전자, 및 이를 조절하는 전사인자 유전자를 노화 진단 마커로 하여 피부에서의 노화 정도를 민감하고 빠르게 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 유전자로부터 코딩된 단백질 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하여 노화 억제제 후보 화합물의 효능을 스크리닝할 수 있다. According to the present invention, the genes whose expression is increased or decreased in keratinocytes and fibroblasts of the skin with age, and the transcription factor genes that control them can be diagnosed rapidly and sensibly in aging. have. In addition, the efficacy of the aging inhibitor candidate compound can be screened by confirming whether it promotes or inhibits the action of the encoded protein from the gene of the present invention.
이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서는 연령 증가에 따라 피부 유래 각질 형성세포에서 발현이 증가하는 20종의 유전자 및 피부 유래 섬유아세포에서 발현이 증가하는 3 종의 유전자를 발굴하였고, 또한 연령 증가에 따라 피부 유래 각질형성세포에서 발현이 감소하는 21종의 유전자 및 피부 유래 섬유아세포에서 발현이 감소하는 16종의 유전자를 발굴하였으며, 이들이 노화와 관련이 있다는 사실은 아직까지 보고되지 않았다. 하기 표 1은 각질형성세포에서 연령에 따라 발현이 증가한 유전자, 표 2는 각질형성세포에서 연령에 따라 발현이 감소한 유전자, 표 3은 섬유아세포에서 연령에 따라 발현이 증가한 유전자, 표 4는 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소한 유전자를 나열한 것이다. GBAcc는 NCBI의 genebank accession ID를 의미하고 UGID는 unigene DB의 ID를 의미한다. In the present invention, 20 genes with increased expression in skin-derived keratinocytes with age and three genes with increased expression in skin-derived fibroblasts were identified. Twenty-one genes with reduced expression and 16 genes with reduced expression in skin-derived fibroblasts have been identified, and the fact that they are associated with aging has not been reported. Table 1 shows the expression of genes increased with age in keratinocytes, Table 2 shows the expression decreased with age in keratinocytes, Table 3 shows the expression of genes increased with age in fibroblasts, Table 4 shows fibroblasts The genes whose expression decreased with increasing age are listed. GBAcc means NCBI genebank accession ID and UGID means unigene DB ID.
상기 연령 증가에 의해 발현 패턴이 변화하는 유전자들의 프로모터 염기 서열을 분석하여 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역(transcription factor response element)을 정리하면 하기 표 5 내지 표 8과 같다. 즉, 표 5a는 피부유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역 일부, 표 5b는 표 5a에서 p-value가 0.05이하인 TRE에 대해서만 프로모터 내 빈도를 기재한 것, 표 6a는 피부유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역 일부, 표 6b는 표 6a에서 p-value가 0.05이하인 TRE에 대해서만 프로모터 내 빈도를 기재한 것, 표 7a는 피부유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역 일부, 표 7b는 표 7a에서 p-value가 0.05이하인 TRE에 대해서만 프로모터 내 빈도를 기재한 것, 표 8a는 피부유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역 일부, 표 8b는 표 8a에서 p-value가 0.05이하인 TRE에 대해서만 프로모터 내 빈도를 기재한 것을 나타낸다.To summarize the transcription factor response elements that are excessively observed by analyzing promoter nucleotide sequences of genes whose expression patterns change with age, are shown in Tables 5 to 8. That is, Table 5a shows some transcription factor binding regions that are excessively observed in promoters of genes whose expression increases with age in skin-derived keratinocytes, and Table 5b shows the frequency in the promoter only for TREs with p-value less than 0.05 in Table 5a. Table 6a shows some transcription factor binding regions that are excessively observed in the promoters of genes whose expression decreases with age in skin-derived keratinocytes, and Table 6b shows only those TREs with a p-value of 0.05 or less in Table 6a. Table 7a lists the frequency within the promoter, part of the transcription factor binding region that is excessively observed in the promoter of genes whose expression increases with age in skin-derived fibroblasts, Table 7b shows TRE with p-value less than 0.05 in Table 7a For the frequency of promoters listed only for, Table 8a shows that overexpression in promoters of genes whose expression decreases with age increases in skin-derived fibroblasts. Some of the transcription factor binding regions discussed, Table 8b, show the in-promoter frequencies only for TREs with a p-value of 0.05 or less in Table 8a.
본 발명의 진단 키트에서 프로브로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 연령 증가에 따라 발현이 증가하거나 감소하는 노화 마커 유전자의 전장(full length) 또는 그의 단편을 포함한다. 단편의 길이는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직한데, 이는 프로브의 길이가 10bps이하이면 비특이적으로 결합되기 때문이다.Polynucleotides used as probes in diagnostic kits of the invention include full lengths or fragments of aging marker genes whose expression increases or decreases with age. The length of the fragment preferably includes 10 or more contiguous nucleotides, since non-specifically bound probes of 10 bps or less.
본 발명의 진단 키트에서 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 18-23개인 것이 바람직하다. 이는 프라이머의 길이가 18bps미만이면 비특이적으로 결합되고, 23bps를 초과하면 프라이머끼리 자체 결합하여 효율성이 떨어지며, 제작시에도 비용과 기술적인 면에서 비생산적이기 때문이다. The polynucleotide used as a primer in the diagnostic kit of the present invention is preferably 18-23 in length. This is because the primers are nonspecifically bound if the length is less than 18bps. If the primers are more than 23bps, the primers are self-bonded to each other, resulting in poor efficiency.
본 발명의 진단 키트에 포함된, 노화 마커 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체는 일반적인 모노클로날 항체 제조방법으로 제조된다.Monoclonal antibodies to the polypeptides encoded by the aging marker gene, included in the diagnostic kit of the present invention is prepared by a general monoclonal antibody production method.
또한 상기 발현 패턴이 변화하는 유전자들의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사인자인 MEF-2, FOXD3 2, SREBP-1, CP2, Nkx2-5, c-Myb 4, CREB, CRE-BP1, NRF-2 3, Freac-4, GATA-1 또는 NF-kB 3의 활성을 측정하여 노화 억제제를 스크리닝하는 리포터 유전자 분석(assay)법은 일반적인 분자생물학 기법에 의해 제조된 리포터 유전자 벡터를 이용한다. 구체적으로는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버설(universal) 프로모터에 MEF-2, FOXD3 2, SREBP-1, CP2, Nkx2-5, c-Myb 4, CREB, CRE-BP1, NRF-2 3, Freac-4, GATA-1 또는 NF-kB 3 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 1), 및 상기 전사인자들이 결합하여 전사를 활성화시킬 수 있는 DNA 서열인 TRE (Transcription Response Element)를 가지는 프로모터에 리포터 역할을 하는 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 2)를 사용한다. 플라스미드 2의 TRE 부분은, MatInspector (Quandt et al., 1995) 및 Transfac (Knuppel et al., 1994)과 같은, 모티프(motif)를 예측, 발견, 분석하는 프로그램에 상기 표 1 내지 4의 유전자들의 accession ID를 입력하여 TRE 서열을 검색한 후 검색된 서열에 따라 올리고뉴클레오타이드 합성법으로 합성하여 준비한다. 플라스미드 1의 전사인자 유전자 부분은, 미국 NCBI 데이터베이스에 저장된 cDNA 서열을 참고하여, 인간 cDNA 라이브러리로부터 PCR 기법으로 증폭하여 준비한다. COS7 세포에 상기 전사인자 유전자를 지닌 플라스미드 1과 해당 TRE 프로모터-리포터 플라스미드 2를 동시에 트랜스펙션시킨 후 24시간 경과 시점에 노화 억제제 후보 약물을 처리하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하면, 노화 억제제 후보 약물이 상기 전사인자의 활성에 미치는 영향을 확인할 수 있다. In addition, transcription factors MEF-2,
이하, 하기 구체예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 하기 구체예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고 한정하기 위한 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. The following examples are intended to illustrate the invention and not to limit it.
<실시예 1: 노화 마커 유전자 확인> Example 1 Identification of Aging Marker Genes
1.인체 세포의 획득1. Acquisition of human cells
8세에서 82세의 연령에 해당하는 사람의 둔부 피부에서 분리한 각질형성세포(NHEKs)를 1 ml 당 0.5 μg 하이드로코티손, 5 ng 표피성장인자, 5 μg 인슐린, 0.5% 우태아 뇌하수체 추출물을 함유한 무혈청 각질세포배양 배지 (Clonetics, Walkersville, MD)에서 배양하고, 섬유아세포 (NHF)는 10 % 우태아혈청을 포함한 DMEM 배지에서 배양한다. 실험에 사용된 모든 세포는 3~5차례 계대 배양된 것으로 한다. The keratinocytes (NHEKs) isolated from the buttocks of humans aged 8 to 82 years contain 0.5 μg hydrocortisone, 5 ng epidermal growth factor, 5 μg insulin, and 0.5% fetal pituitary gland extract per ml. One serum free keratinocyte culture medium (Clonetics, Walkersville, MD) and fibroblasts (NHF) are cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum. All cells used in the experiment should be passaged three to five times.
2.인체 세포로부터 RNA 채취2. RNA extraction from human cells
3~5차례 계대 배양한 상기 세포로부터 RNA를 정제하기 위해 트리졸(trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) )을 첨가해 세포를 분쇄시킨 후 클로로포름을 넣어 상층액의 RNA를 분리하였다. 얻어진 상층액의 RNA를 농축하기 위해 동량의 이소프로파놀을 넣고 원심분리하여 침전된 RNA를 얻고, 염기 제거를 위해 70% 에탄올로 침전된 RNA를 세척하였다. In order to purify RNA from the cells passaged 3-5 times, trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)) was added to crush the cells and chloroform was added to isolate the supernatant RNA. In order to concentrate the RNA of the obtained supernatant, an equal amount of isopropanol was added and centrifuged to obtain precipitated RNA, and the precipitated RNA was washed with 70% ethanol for base removal.
3.마이크로어레이 실험3.Microarray Experiment
14,000 개의 인간 전사체(transcripts)가 집적된 올리고마이크로어레이 (Gaiagene, seoul, Korea)를 사용하여, 연령 증가에 따라 발현에 변화가 나타나는 유전자를 선택하고 그 발현 패턴을 확인하였다. 이 마이크로어레이 상에는 13,376 유전자와 704 개의 대조군 유전자가 집적되어 있다. 아미노-알릴 cDNA 표지(labeling) 키트 (Ambion, Austin, Texas, USA)를 이용하여 RNA 20 μg 으로부터 형광 염색된 cDNA 프로브를 제작하였다. 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA 동량을 합친 후 Cy3로 표지하여 공통 대조군으로 활용하고, 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA를 각각 Cy5로 표지하여 실험군으로 사용하여, 16 시간 동안 55℃에서 혼성화(hybridization)을 수행하였다. 이미지 분석을 위해 ImaGene 4.2 (Biodiscovery, Los Angeles, CA, USA)와 MAAS (Gaiagene, Seoul, Korea)를 사용하였고, SAM을 이용하여 발현 양상에 있어서 통계적으로 유의미한 변화를 보이는 유전자를 선택하였다. 그리고 Cluster 프로그램을 이용하여 발현 패턴 별로 분류하였다 (Kim S et al., 2005). 유전자 발현 패턴 및 각 연령별 유전자 발현 값의 상관성 (Pearson correlation coefficients)은 도 1 내지 도 2에 히트 맵(heat maps)으로 표현되어 있다. 도 1은 피부 유래 각질형성세포에 대한 히트 맵, 도 2는 피부 유래 섬유아세포에 대한 히트 맵이다. Using oligomicroarrays (Gaiagene, seoul, Korea) in which 14,000 human transcripts were integrated, we selected genes whose expression changes with age and checked their expression patterns. On this microarray, 13,376 genes and 704 control genes are accumulated. Fluorescently stained cDNA probes from 20 μg of RNA were prepared using the amino-allyl cDNA labeling kit (Ambion, Austin, Texas, USA). RNAs from each age group were combined and labeled with Cy3 to be used as a common control group. RNAs from each age group were labeled with Cy5 and used as experimental groups, and hybridization was performed at 55 ° C. for 16 hours. . For image analysis, ImaGene 4.2 (Biodiscovery, Los Angeles, CA, USA) and MAAS (Gaiagene, Seoul, Korea) were used. SAM was used to select statistically significant gene expression patterns. The cluster program was used to classify expression patterns (Kim S et al., 2005). The correlation between gene expression patterns and gene expression values for each age (Pearson correlation coefficients) are represented by heat maps in FIGS. 1 is a heat map for skin-derived keratinocytes, and FIG. 2 is a heat map for skin-derived fibroblasts.
유전자 발현 값의 상관성을 기준으로 할 때, 표피(각질형성세포)에서의 노화 프로세스의 전환점은 30대 중반, 진피(섬유아세포)에서의 노화 프로세스의 전환점은 30대 중반과 50대 중반에 존재하는 것으로 확인되었다. 유전자 발현 패턴 및 각 연령별 유전자 발현 값의 상관성을 기준으로 노화를 진단하는 데 활용될 수 있는 유전자 마커를 추출하여 리스트 한 결과가 상기 표 1 내지 4에 나열된 유전자이다. On the basis of the correlation of gene expression values, the turning point of the aging process in the epidermis (keratinocytes) is in the mid 30s, and the turning point of the aging process in the dermis (fibroblasts) exists in the mid 30s and mid 50s. It was confirmed. Based on the correlation between the gene expression pattern and the gene expression value of each age, the result of extracting and listing the gene markers that can be used to diagnose aging is the genes listed in Tables 1 to 4 above.
4. Real-Time PCR 4. Real-Time PCR
상기 결과를 재확인하기 위하여, 8세에서 82세의 연령에 해당하는 사람의 둔부 피부로부터 채취한 RNA 1 ㎍을 50mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1M DTT, 10mM dNTP, 40유닛/μl RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25μl에 넣고, 0.5μg/μl 올리고(dT)16의 프라이머 및 200유닛 수퍼스크립트 II<SuperScript II, 집코비알엘(GiboBRL)>의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨다. 이후 역전사 반응 용액 2.5μl를 엠플리택(AmpliTaq)DNA 중합효소<0.04U, 퍼킨 엘멀, 쉘튼, 씨티(Perkin Elmer, Shelton, CT)>, 50mM 트리스(pH 8.3), 0.25mg/ml 우혈청알부민, 3mM MgCl2, 0.25mM dNTPs, SYBR 그린 I의 1/50,000 희석액<몰레큘라 프로브, 유진, 오알(Molecular Probes, Eugene, OR)>이 함유된 PCR 반응 완충액 50리터에 섞고, 상기 마이크로어레이 실험 결과 추출된 상기 표 1 내지 4의 유전자에 대한 프라이머 센스 및 안티센스(하기 표 9 참조)를 10μM의 첨가하여 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분인 사이클을 30사이클 수행하였다. 상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정함으로써 분석하여 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3은 피부 유래 각질형성세포에 대한 real-time PCR 결과를 도시한 그래프이고, 도 4는 피부 유래 섬유아세포에 대한 real-time PCR 결과를 도시한 그래프이다. 양성 대조군으로는 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA 동량을 합친 것을 사용하였으며, 각 유전자에 대하여 양성 대조군을 기준 1로 정한 후 각 연령별 시료의 상대적인 mRNA 레벨을 측정하였다. 각 연령별 시료는, 표피(각질형성세포)에서는 30대 중반을 기준으로 클래스 1 및 클래스 2로 나누어 클래스별 평균을 내었으며, 진피(섬유아세포)에서는 30대 중반 및 50대 중반을 기준으로 클래스 1, 클래스 2 및 클래스 3으로 나누어 클래스별 평균을 내었다. Real-time PCR 결과는 마이크로어레이 결과와 일치함을 알 수 있다. To reconfirm the above results, 1 μg of RNA collected from the hip skin of humans aged 8 to 82 years was measured using 50 mM Tris-HCl (Tris-HCl, pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 , 0.1 M 25 μl of reverse transcription reaction buffer containing DTT, 10 mM dNTP, 40 units / μl RNase inhibitor, and a primer of 0.5 μg / μl oligo (dT) 16 and 200 units of SuperScript II (SuperScript II, GiboBRL) Reverse transcription polymerase is added and reacted at 42 ° C for 1 hour. 2.5 μl of reverse transcription reaction solution was then added to AmpliTaq DNA polymerase <0.04U, Perkin Elmer, Shelton, CT>, 50 mM Tris (pH 8.3), 0.25 mg / ml bovine serum albumin, Mix in 50 liters of PCR reaction buffer containing 1 / 50,000 dilutions of 3 mM MgCl 2 , 0.25 mM dNTPs, SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, OR), and extract the results of the microarray experiment. 30 cycles were performed at 94 ° C. for 30 seconds, at 53 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 1 minute with the addition of 10 μM of the primer sense and antisense (see Table 9). Relative mRNA levels are shown in FIGS. 3 and 4 by analyzing SYBR Green I fluorescence changes using ICycler software. Figure 3 is a graph showing the real-time PCR results for skin-derived keratinocytes, Figure 4 is a graph showing the real-time PCR results for skin-derived fibroblasts. As a positive control, the same amount of RNA obtained from each age group was used. For each gene, the positive control group was set as
5. 프로모터 분석5. Promoter Analysis
NCBI Accession No 기준으로 상기 발현 패턴이 변화된 유전자의 프로모터 서열을 수집하였다. 업스트림(Upstream) 유전자 서열을 Ensembl 게놈 데이터베이스로부터 확보한 후 전사 개시 사이트(transcription start site)로부터 2000 bp 업스트림 영역을 포함하는 게놈 서열을 확보하였다. Promoter sequences of genes with altered expression patterns based on NCBI Accession No were collected. An upstream gene sequence was obtained from the Ensembl genomic database and then a genomic sequence comprising a 2000 bp upstream region from the transcription start site was obtained.
MatInspector (Quandt et al., 1995) 및 Transfac (Knuppel et al., 1994) 와 같이, 모티프(motif)를 예측, 발견, 분석하는 프로그램을 이용하여, 상기 프로모터 서열 중 전사인자 결합 부위 (transcription factor binding site, TFBS)를 검색한 후, 하이퍼지오메트리 통계 방법으로 과다출현 혹은 과소출현하는 전사인자 결합 부위를 선별하였다. 그 후, 상기 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용하여 전사인자를 추출하였다.Transcription factor binding in the promoter sequence using a program that predicts, finds, and analyzes motifs, such as MatInspector (Quandt et al., 1995) and Transfac (Knuppel et al., 1994). site, TFBS), and over- or under-expressing transcription factor binding sites were selected using hypergeometric statistical methods. Then, the transcription factor was extracted from the transcription factor binding site by using bioinformatics techniques.
도 5 내지 도 8은 피부 유래 각질형성세포 또는 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가 또는 감소하는 유전자와 그 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵) 및 네트워크를 도시한 그래프이다. 상기 도 5 내지 도 8에 의하면, 발현 변화를 보이는 상기 유전자 클러스터(세로 변)와 그 유전자 클러스터를 조절한 것으로 예측되는 전사인자(가로 변) 간의 조절 네트워크의 연결 고리를 확인할 수 있다. 5 to 8 are graphs showing correlation matrices (heat maps) and networks of genes whose expression increases or decreases with age in skin-derived keratinocytes or fibroblasts and transcription factors excessively observed in their promoters. to be. 5 to 8, the linkage of the regulatory network between the gene cluster (vertical side) showing the expression change and the transcription factor (horizontal side) predicted to control the gene cluster can be identified.
도 1은 피부 유래 각질형성세포에서의 연령 증가에 따른 유전자 발현 패턴 및 각 연령별 유전자 발현 값의 상관성 (Pearson correlation coefficients)을 도시한 히트 맵 (heat map)이다.FIG. 1 is a heat map showing the correlation between gene expression patterns and age-related gene expression values according to age in skin-derived keratinocytes.
도 2은 피부 유래 섬유아세포에서의 연령 증가에 따른 유전자 발현 패턴 및 각 연령별 유전자 발현 값의 상관성 (Pearson correlation coefficients)을 도시한 히트 맵이다.FIG. 2 is a heat map showing the correlation between gene expression patterns and gene expression values according to ages in skin-derived fibroblasts (Pearson correlation coefficients).
도 3a-h는 피부 유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현량이 변화된 노화 마커 유전자의 real-time PCR 결과를 도시한 그래프이다. 양성 대조군으로는 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA 동량을 합친 것을 사용하였으며, 각 유전자에 대하여 양성 대조군을 기준 1로 정한 후 각 연령별 시료의 상대적인 mRNA 레벨을 30대 중반을 기준으로 클래스 1 및 클래스 2로 나누어 클래스별 평균을 내어 연령 증가에 따라 발현량의 변화를 확인하였다. 3A-H are graphs showing real-time PCR results of aging marker genes whose expression levels change with age in skin-derived keratinocytes. The positive control group was the sum of RNAs obtained from patients of each age group.For each gene, the positive control group was set as
도 4a-c는 피부 유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현량이 변화된 노화 마커 유전자의 real-time PCR 결과를 도시한 그래프이다. 양성 대조군으로는 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA 동량을 합친 것을 사용하였으며, 각 유전자에 대하여 양성 대조군을 기준 1로 정한 후 각 연령별 시료의 상대적인 mRNA 레벨을 30대 중반 및 50대 중반을 기준으로 클래스 1, 클래스 2 및 클래스 3으로 나누어 클래스별 평균을 내어 연령 증가에 따라 발현량의 변화를 확인하였다. 4A-C are graphs showing real-time PCR results of aging marker genes whose expression levels change with age in skin-derived fibroblasts. As a positive control group, RNA amounts obtained from patients of each age were combined, and a positive control group was set as
도 5는 피부 유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가하는 유전 자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵)(도 5a) 및 네트워크를 도시한 그래프(도 5b)이다.FIG. 5 is a graph showing a correlation matrix (heat map) (FIG. 5A) and a network of genes whose expression increases with age in skin-derived keratinocytes and transcription factors excessively observed in the promoter (FIG. 5B) )to be.
도 6은 피부 유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵)(도 6a) 및 네트워크를 도시한 그래프(도 6b)이다.FIG. 6 is a graph showing a correlation matrix (heat map) (FIG. 6A) and a network of genes whose expression decreases with age in skin-derived keratinocytes and transcription factors excessively observed in their promoters (FIG. 6B). to be.
도 7은 피부 유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵)(도 7a) 및 네트워크를 도시한 그래프(도 7b)이다.FIG. 7 is a graph showing a correlation matrix (heat map) (FIG. 7A) and a network (FIG. 7B) between genes whose expression increases with age in skin-derived fibroblasts and transcription factors excessively observed in their promoters. .
도 8은 피부 유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵)(도 8a) 및 네트워크를 도시한 그래프(도 8b)이다.FIG. 8 is a graph (FIG. 8B) showing a correlation matrix (heat map) (FIG. 8A) and a network of genes whose expression decreases with age in skin-derived fibroblasts and transcription factors excessively observed in their promoters. .
<110> Amorepacific Corporation <120> Method and kit for diagnosis of skin aging <160> 90 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctctcgtttc gagggactga g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agggggttcc tagagttttc tt 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catcctcttc gagtgcaagt c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccactgccgg atcttcctc 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcggagttca cagctctata c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aaaaggcccc tacagttacc a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 acttcgacga acactacgag t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggacaccaag tctcctccac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> 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primer <400> 18 agcgagagct tatacctcag g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgtgcaaaac ccaagggtaa c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acatctgcct ctgatccaag a 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ccaccttttc agaacgcatt ttc 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gacgctttcc cttccaacac a 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tctgattttg atgcgtgtct ca 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 attttccctc aagcgggttg t 21 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tctgtttcac aagtcctcct acg 23 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggaaggtcct atttccggca t 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 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