KR20090001043A - Ａｌｏｘ１２ 및 ａｌｏｘ１５ 다형성과 아스피린 유도성천식과의 연관성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ALOX12 및 ALOX15 다형성이 15-에피-리폭신 A4의 조절을 통해 AIA와 연관되는 것에 관한 것이다. 본 발명의 ALOX12와 ALOX15 다형성에 대한 정보는 아스피린 불내성을 진단하고 제어하는 새로운 방법의 개발에 유용할 수 있다.
Figure P1020070065107
아스피린, 천식, 다형성, ALOX12, ALOX15, 리폭신

Description

ＡＬＯＸ１２ 및 ＡＬＯＸ１５ 다형성과 아스피린 유도성 천식과의 연관성{Association of ALOX12 and ALOX15 polymorphorism with aspirin induced asthma}
도 1a는 염색체 17p13.1 상의 ALOX12 (14.6kb)의 유전자 지도로서 천식환자에서 각각의 SNP와 아스피린 불내성의 위험간의 연관성의 -LogP 값을 도시한 것이다. 폐곡원 (●), 개곡원 (○) 및 삼각형 (▼)은 각각 공동우성 (codominant), 우성 (dominant) 및 열성 (recessive) 모델의 P 값을 나타낸다.
도 1b는 ALOX12 유전자의 해플로타입을 나타낸 것이다.
도 1c는 ALOX12 유전자 다형성에 대한 LD 값을 나타낸다.
도 2a는 염색체 17p13.3 상의 ALOX15 (10.7kb)의 유전자 지도로서 천식환자에서 각각의 SNP와 아스피린 불내성의 위험간의 연관성의 -LogP 값을 도시한 것이다. 폐곡원 (●), 개곡원 (○) 및 삼각형 (▼)은 각각 공동우성 (codominant), 우성 (dominant) 및 열성 (recessive) 모델의 P 값을 나타낸다.
도 2b는 ALOX15 유전자의 해플로타입을 나타낸 것이다.
도 2c는 ALOX15 유전자 다형성에 대한 LD 값을 나타낸다.
도 3은 ALOX12 (A, B 및 C) 및 ALOX15 (D)의 각각의 해플로타입과 아스피린 자극 후 FEV1 감퇴율 (%)과의 연관성을 나타낸 것이다. P 값은 선형 회귀 분석에 의해 얻어지는데, 공변수로서 연령, 성별, 아토피 및 흡연 상태를 제어한다.
도 4는 아스피린 자극 후 FEV1 감퇴율 (%)에 대한 ALOX12 및 ALOX15 해플로타입의 유전자-유전자 상호 영향을 나타낸 것이다. P 값은 선형 회귀 분석에 의해 얻어지는데, 변수로서 나이, 성별, 아토피 및 흡연 상태를 제어한다.
도 5는 아스피린 유도성(A 및 C) 또는 아스피린 불내성 천식환자(B 및 D)에서 ASA 자극 시험 후 ATL(A 및 B) 및 LXA4(C 및 D)의 레벨의 증가를 나타낸다. 뇨중에서 LXA4 및 ATL 농도는 ELISA에 의해 한 쌍으로 측정되었고, 결과는 크레아티닌 (creatinine) 마이크로그램당 피코그램으로 표현된다. P 값은 짝 샘플 t-검정을 사용하여 얻었다.
도 6은 ALOX12 ht1 동형접합자 (N=13) 및 ht1이 하나이거나 없는 피검자 (N=37)에서 아스피린 자극 전후 ATL의 뇨중 농도를 나타낸다. 천식환자의 뇨중 ATL의 레벨은 아스피린 투여 전후 ELISA에 의해 측정되었다. 양은 크레아티닌의 마이크로그램당 피코그램으로 표현된다. P 값은 각 그룹(*)에서 아스피린 자극 전후 농도간의 비교를 위해 짝 샘플 t-검정을 사용하여 얻어졌고 두 그룹(†)간의 비교를 위해 독립적인 샘플 t-검정을 사용하여 얻어졌다.
도 7은 ALOX12 또는 ALOX15 유전자 내 SNPs 사이의 LD 값 (|D'| 및 r 2 )를 도시한 것이다.
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기술분야
본 발명은 질환과 관련된 유전자의 다형성에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 ALOX12 및 ALOX15 다형성이 15-에피-리폭신 A4의 조절을 통해 AIA와 연관되는 것에 관한 것이다.
종래기술
아스피린 유도성 천식 (AIA)이란 아스피린 또는 기타 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAIDs)의 섭취 후 천식환자에서 기관지수축이 발생하는 것을 의미한다. 이러한 증후군은 '아스피린 삼징후',즉 아스피린 과민성, 기관지 천식, 및 비 용종증 (nasal polyposis)을 특징으로 한다 [상기 문헌: 1]. 대부분의 임상 연구자들은 현재 아스피린 악화된 호흡기 질환 (AERD)의 4번째 특징으로서 만성 과형성 호산성 부비강염 (CHES)을 포함한다 [상기 문헌: 2].
AIA의 발병은 완전하게 규명되지는 않았지만 류코트리엔, 리폭신, 트롬복산 및 프로스타그란딘을 포함하는 아라키돈산의 물질대사에서 중요한 매개체의 과잉생산 또는 과소생산의 많은 점들은 아마도 ASA에 대한 민감성을 설명한다 [상기 문헌: 3]. 리폭신 형성 과정에서, LTA4는 효소 ALOX12 및 ALOX15에 의해 5S-H(p)ETE 로 물질대사하고 이 후 ALOX5에 의해 리폭신으로 물질대사한다. 아스피린 아세틸화는 전체적으로 COX-2의 그의 촉매화를 저해하지 않는데, 이것은 아라키돈산을 5(R)-하이드록시에이코사테트라에노산 (HETE)로 물질대사시킬 수 있다. 이 대사산물은 추가로 5-리폭시게나아제 (5-LO)를 통해 15(R)-에피리폭신 A4로 전환될 수 있는데, 이것은 "아스피린 자극성 리폭신"(ATL)으로서 알려져 있다 [상기 문헌: 4]. 리폭신 A4 (LXA4) 및 ATL은 신규한 항염증 특성을 갖는 내생적인 매개체로서 작용한다 [상기 문헌: 5, 6]. 따라서, 일부 프로스타그란딘, 류코트리엔 및 리폭신의 변화된 합성 및 이들의 개별적인 수용체의 발현 레벨은 AIA의 발병에 중요한 것으로 보이고 [상기 문헌: 7], 아라키도네이트 경로의 성분을 위한 유전자의 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)에 의해 영향 받을 수 있다.
류코트리엔 C4 신타아제 (LTC4S) [상기 문헌: 8], 5-리폭시게나아제 (ALOX5) [상기 문헌: 9, 10], 시스테이닐 류코트리엔 수용체 2 [상기 문헌: 11], 트롬복산 A2 수용체 [상기 문헌: 12], 시스테이닐 류코트리엔 수용체 1 [상기 문헌: 13] 및 프로스타그란딘 E2 수용체 서브타입 2 [상기 문헌: 14]와 같은 주요 합성 효소의 영향은 천식에서 보여지는 아스피린 과민성에서 단일 유전자 레벨에서 관련된다. 그러나, 리폭신 경로에서 후보 유전자의 분석은 지금까지 수행되지 않고 있다.
아라키돈산이 세포 활성화에 대응하여 시토솔 포스포라파아제 A2에 의해 유리된 후, 유리 아라키돈산은 사이클로옥시게나아제 (PTGS1, PTGS2) 및 리포옥시게나아제 (ALOX5, ALOX12, ALOX15)에 의해 산화된다. 리폭신은 ALOX12/15 (인간 단핵세포, 대식세포), ALOX5 (호중성 백혈구) 및 ALOX12 (혈소판)의 공동 작용 후 생 성된다. 아스피린의 존재 하에서, COX-2 및 ALOX5는 아라키돈산을 15(R)-에피리폭신 A4로 물질대사시키는데, 이것은 또한 "아스피린 자극성 리폭신"(ATL)로 알려져 있다 [상기 문헌: 4, 19]. LXA4 및 ATL 모두는 백혈구 트래피킹(trafficking)을 위한 정지 신호로서 작용하는데, 주화성, 접착, 회귀 및 슈퍼옥사이드 음이온 생성을 포함하는 다양한 호중성 기능을 억제함으로써 급성 항염증 대응의 해결을 용이하게 하고 [상기 문헌: 5, 6, 20]; 이들은 또한 생체내에서 류코트리엔 매개성 항염증 대응을 막고 LTD4-특이성 결합과 경쟁한다 [상기 문헌: 21]. 천식에서 LXA4의 잠재적인 역할은 LXA4의 안정한 유사체가 실험적인 천식동안 기도 과대응성 및 폐염증화 모두를 막는다는 발견에 의해 밝혀졌다 [상기 문헌: 22]. 리폭신의 과다생성은 천식환자의 기도에서 증명되었다 [상기 문헌: 23 내지 25]. 이러한 매개체의 생성의 조절장애는 아마도 천식환자의 ASA에 대한 민감성을 설명한다 [상기 문헌: 26]. 따라서, 본 발명자들의 견지에서 이러한 유전자의 다형성의 유전적 영향이 이전에 평가되지는 않았지만 ALOX12 및 ALOX15 유전자의 특이한 조절은 천식환자에서 아스피린 과민성의 결정인자일 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 AOLX12와 ALOX15의 40개의 SNP를 선택하고 총 67명의 AIA 환자와 280명의 ATA 환자에서 대립유전자 연관성에 대해 스크리닝하였다.
본 발명은 아스피린 불내성을 진단하는 새로운 방법의 개발에 유용한 ALOX12와 ALOX15 다형성을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 ALOX12 및 ALOX15 다형성을 이용하여 아스피린 불내성을 진 단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 목적은 ALOX12 및 ALOX15 다형성을 이용하여 아스피린 불내성을 진단하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 아스피린 유도성 천식에 있어서 아스피린 불내성을 진단하기 위한 다형성을 포함하는 ALOX12 유전자 및 ALOX15 유전자를 제공한다.
상기 다형성은 ALOX12 ht1 +/+ 또는 ht2 +/+, 및 ALOX15 ht2 -/-이고, 여기서 ALOX12 ht1은 ALOX12의 번역개시부위(+1)로부터 -822번째 염기가 G이고, -540번째 염기가 G이고, -216번째 염기가 G이고, +295번째 염기가 C이고, +640번째 염기가 G이고, +926번째 염기가 T이고, +1008번째 염기가 G이고, +1409번째 염기가 T이고, +2236번째 염기가 A이고, +2743번째 염기가 A이고, +3023번째 염기가 T이고, +3324번째 염기가 G이고, +3451번째 염기가 G이고, +4101번째 염기가 A이고, +4508번째 염기가 A이고, +5625번째 염기가 G이고, +5922번째 염기가 C이고, +6207번째 염기가 C이고, +7032번째 염기가 T이고, +7135번째 염기가 G이고, +7634번째 염기가 G이고, +8783번째 염기가 A이고, +10402번째 염기가 A이고, +10775번째 염기가 T이고, +14216번째 염기가 G이고, +14904번째 염기가 C이고, +15097번째 염기가 C인 해플로타입이고, ALOX12 ht2는 ALOX12의 번역개시부위(+1)로부터 -822번째 염기가 C이고, -540번째 염기가 G이고, -216번째 염기가 A이고, +295번째 염기가 C이고, +640번째 염기가 A이고, +926번째 염기가 C이고, +1008번째 염기가 T이고, +1409번째 염기가 C이고, +2236번째 염기가 G이고, +2743번째 염기가 A이고, +3023번째 염기가 T이고, +3324번째 염기가 A이고, +3451번째 염기가 A이고, +4101번째 염기가 G이고, +4508번째 염기가 G이고, +5625번째 염기가 T이고, +5922번째 염기가 C이고, +6207번째 염기가 T이고, +7032번째 염기가 T이고, +7135번째 염기가 C이고, +7634번째 염기가 A이고, +8783번째 염기가 A이고, +10402번째 염기가 A이고, +10775번째 염기가 T이고, +14216번째 염기가 G이고, +14904번째 염기가 C이고, +15097번째 염기가 C인 해플로타입이고, ALOX15 ht2는 ALOX15의 번역개시부위(+1)로부터 -272번째 염기가 G이고, -186번째 염기가 G이고, +1011번째 염기가 A이고, +2230번째 염기가 C이고, +3586번째 염기가 C이고, +3730번째 염기가 G이고, +3905번째 염기가 C이고, +4670번째 염기가 A이고, +5555번째 염기가 A이고, +8706번째 염기가 A이고, +9562번째 염기가 C이고, +10113번째 염기가 T이고, +11103번째 염기가 A인 해플로타입이며, 상기 ht1 +/+, ht2 +/+ 및 ht2 -/-에서 "+"는 해당 해플로타입이 염색체 상에 존재한다는 의미이고, "-"는 해당 해플로타입이 염색체 상에 존재하지 않고 그 외 다른 해플로타입이 염색체 상에 존재한다는 것을 의미한다.
일 구체예에서 본 발명은 (1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; (2) 단계 (1)에서 수득한 DNA에서 상기 다형성들을 검출하는 단계; 및 (3) 단계 (2)에서 검출된 다형성들을 확인하는 단계를 포함하는, 아스피린 유도성 천식에 있어서 아스피린 불내성을 진단하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서 본 발명은 상기 다형성들을 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함하는, 아스피린 유도성 천식에 있어서 아스피린 불내성을 진단용 키트를 제공한다. 여기서, 프라이머 세트가 서열번호: 1 내지 서열번호: 120으로 구성되며 이들 프라이머의 서열 정보는 표 4 및 표 5에 정리하였다.
본 발명에서, 본 발명자들은 P<0.05인 ALOX12 유전자의 1개의 센스 SNP 및 6개의 인트론성 SNP에 대한 아스피린 투여에 양성 반응과의 연관성을 설명한다 (도 1A). SNP간의 완전한 또는 절대적인 결합으로 인해, 0.05 초과의 빈도를 갖는 5개 미만의 해플로타입이 구성될 수 있었다. 이들 5개의 해플로타입중에서, ht1, ht2 및 ht4는 천식환자에서 아스피린 과민성과 강하게 연관되었다. AIA를 갖는 피검자는 ATA 피검자보다 ht1/ht1 (OR=2.22, P=0.022) 및 ht2/ht2 (OR=2.72, P=0.022)의 2배 높은 빈도를 가졌다 (표 2). 이러한 자료는 이들 해플로타입을 갖는 피검자들이 아스피린 과민성이기 쉽다는 것을 시사한다. ALOX12의 ht4는 아스피린 과민성에 대한 보호를 제안하는 반대 패턴을 보여주었다. ALOX15 유전자의 SNP가 천식환자에서 아스피린 과민성과의 연관성이 없음을 보여주었지만 AIA 피검자에서 ALOX15 유전자의 ht2의 빈도는 ATA 피검자에서의 2/3이었는데 (표 3), 이것은 이 해플로타입에 대한 보호 역할을 시사한다. 이러한 새로운 자료는 리폭신 합성 경로에서 2개의 유전자가 각각 또는 유전자-유전자 상호작용 동안 아스피린 투여에 대해 기도 대응성에 영향을 줄 수 있다는 것을 나타낸다.
아스피린 자극 후 FEV1 감퇴율이 AIA의 진단을 위한 가장 중요한 매개변수이기 때문에, 본 발명자들은 아스피린 투여 후 다중 선형 회귀 분석을 이러한 해플로 타입과 FEV1 감퇴율 (%)간의 관계에 적용하였다. 결과로서, ALOX12 및 ALOX15의 해플로타입은 FEV1 감퇴율에 대한 유전자 투여 효과가 우수한 것을 보여주었다 (도 3 및 4). 해플로타입중에서, 가장 중요한 연관성은 ALOX12의 ht1 및 ht2의 결합된 분석에 대해 관찰되었다. ht1 + /ht1 + 또는 ht2 + /ht2 +를 갖는 피검자는 가장 높은 FEV1 감퇴율을 보여주었다 (P=0.00007) (도 3의 C).
유전자-유전자 상호작용 분석에서, ALOX12 ht1 및 ht2의 FEV1 감퇴율과의 연관성은 쌍 분석이 ALOX15 ht2를 이용하여 수행된 경우 보다 명백하였다(도 4). ALOX12 ht1 +/+ 또는 ht2 +/+ 및 ALOX15 ht2 -/-를 갖는 천식환자들은 다른 피검자들보다 2배 이상 높은 FEV1 감퇴율을 보여주었다 (P=0.0000009). 이 분석은 본페로니의 보정(Bonferroni's correction)으로 수행되는 경우, 시험 SNP의 수에 따라 (n=761) 통계적 유의성은 보전되었다 (P=0.00068). 이러한 결과는 ALOX12 및 ALOX15 SNP가 천식환자에서 아스피린 과민성의 전개에 영향을 주기 위해 협력하여 작용하는 것을 강하게 시사한다.
아스피린 과민성을 갖는 ALOX12 및 ALOX15의 강한 연관성은 AIA에서 리폭신과 이들의 중간체의 역할을 강조한다. SNP의 위치 및 특성으로 인해, 본 발명자들은 ALOX12 및 ALOX15 SNP가 LXA4 및 ATL의 생체내 생성 레벨에 대한 유전적 영향을 미치는 것을 확인하였다. LXA4 및 ATL의 뇨중 농도는 9명의 AIA 피검자 및 41명의 ATA 피검자에서 측정되었다. 본 발명에서, ALOX12 해플로타입은 상승된 ATL 농도와 연관되었으나 LXA4와는 연관되지 않았다. ALOX12 ht1 동형접합자는 ht1 +/- 또 는 ht1 -/- 피검자에 비해 뇨중 ATL의 기준선 레벨의 약 50%를 가졌다 (P=0.041) (도 6). ATL의 항염증 및 항류코트리엔 영향을 고려할 때 [상기 문헌: 27], ATL의 낮은 생성은 아스피린 투여 후 더 높아진 FEV1 감퇴율에 의해 반영된 바와 같이 ALOX12 ht1 동형접합자를 아스피린 과민성이기 쉽게 만들 수 있다. 이러한 자료는 아스피린 유도성 기관지경련에서의 차이는 유전적 다형성으로 인해 ALOX12 및 ALOX15 유전자의 기능의 변화를 통해 ATL의 생성에 의존할 수 있다는 것을 시사한다. 하나의 주목되는 발견사항은 아스피린 투여 후 ALOX12 ht1 동형접합자에서 ATL의 감소된 생성이 ALOX12 ht1 +/- 또는 ht1 -/- 피검자에서 검출된 레벨로 증가한다는 것이다. 이러한 자료는 아스피린 치료가 ALOX12 ht1 동형접합자의 유전적 결함을 치료한다는 것을 나타내며, 이로 인해 ATL 레벨이 ht1 +/- 또는 ht1 -/- 피검자의 레벨로 복원된다. 임상적으로, 아스피린 탈민감화는 AERD를 갖는 환자를 치료하는 효과적인 수단으로서 사용되어 왔다. AERD를 갖는 대부분의 모든 환자들은 아스피린에 탈민감화될 수 있다 [상기 문헌: 28]. 매일 아스피린 섭취시 탈민감화되고 유지되는 경우, 환자들은 교차 반응하는 NSAIDs의 섭취하는 경우에도 급성 호흡 반응 없이 호흡 증상에서 개선을 보여준다 [상기 문헌: 29]. 아스피린 투여 후 ATL 레벨의 상승은 AIA 환자에서 아스피린 탈민감화의 기작을 나타낼 수 있다. LXA4의 감소된 생성은 코 폴립에서 보고되었고 [상기 문헌: 30], ATA 피검자에 비해 AIA 피검자들의 말초 피 백혈구를 활성화시켰다 [상기 문헌: 26, 31]. 본 발명에서, 뇨중 LXA4 및 ATL 레벨은 아스피린 투여 후 상당히 증가되었으나, 기준 및 투여 후 LXA4 및 ATL 레벨은 AIA 및 ATA 피검자들 사이에서 차이가 없었다 (도 5). 이러한 자료는 LXA4 및 ATL 생성에서 고유한 차이는 아스피린 과민성 표현형보다 ALOX12 다형성과 관련되는 것을 나타낸다. 그러나, 본 발명에서 뇨중 리폭신의 측정에서 AIA 피검자의 적은 수는 ALOX12 및 ALOX15 SNP의 아스피린 과민성과의 정확한 연관성을 정의하는데 제한이 될 수 있다.
리폭신의 생성에서 중간 대사산물은 5-HPETE, 12-HPETE, 15-HPETE 및 15(R)-HETE를 포함한다 [상기 문헌: 4, 19]. 12S-HPETE 및 15S-HPETE는 또한 각각 12/15-LO 또는 5-LO에 의해 헤폭실린으로 전환되거나 리폭신으로 산화된다 [상기 문헌: 19, 32]. 이러한 중간 대사산물은 강력한 염증-전 활성을 갖는다. 15-HETE를 흡인하면 천식환자에서 빠른 기관지압박 대응을 향상시킨다 [상기 문헌: 33]. 외인성 12/15-LO 생성물, 즉 12(S)-HETE 및 13(S)-HODE의 마이크로몰미만 농도에 의해 활성화되는 염증-전 경로는 기공 평활근 수축 및 염증화를 수반한다 [상기 문헌: 34-37]. 또한, 상승된 레벨의 15-HETE는 천식 환자들로부터 얻어진 기관지 조직에서 검출되었다 [상기 문헌: 38]. 천식환자에서 아스피린 과민성과 관련한 이들 매개체의 변화된 생성은 이전에 보고되었다. AIA 환자로부터의 아스피린 자극성 말초 피 세포 및 배양된 코 폴립 상피 세포는 ATA 환자와 비교할 때 15-HETE의 이들 생성을 상당히 증가시키는 것으로 보여진다 [상기 문헌: 31, 39]. 유사하게는, 15-LO mRNA 발현은 ATA 환자와 비교할 때 AIA 환자의 코 폴립에서 상당히 감소된 것으로 보여졌지만, 5-LO mRNA 발현은 ATA 환자에 비교할 때 AIA의 코 폴립에서 상당히 증가되는 것으로 보여진다 [상기 문헌: 30]. ALOX12의 주요 공급원은 혈소 판이다. ALOX12 및 ALOX15의 주요 공급원으로서, 상피 세포, 호산성 백혈구, 단핵세포 및 혈소판간의 세포 상호작용은 천식환자에서 아스피린 유도성 기관지경련의 유도에 중요할 수 있다. COX-2 발현 및 활성은 AIA 환자의 코 폴립에서 감소되는 것으로 알려져 있다[상기 문헌: 39-41]. COX-2 발현 및 활성은 유전자의 유전적 다형성에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 COX2 유전자의 아스피린 과민성과의 어떠한 연관성도 발견하지 못하였다 (자료 제시 안함). 따라서, ALOX12 또는 ALOX15 유전자 다형성은 천식환자에서 상이한 방식으로 15(S)- 및 15(R)-에피리폭신 A4의 생성을 변화시키는 경향이 있다. 비록 본 발명자들은 12-HETE 및 15-HETE와 같은 리폭신 경로 중간 대사산물을 측정하지는 않았지만, 지노타입에 따르는 이러한 매개체의 특이한 조절은 다른 설명을 제공할 수 있다.
지금까지, 여러 유전적 및 기능적 연구가 LTC4S [상기 문헌: 8], 5-리폭시게나아제 (ALOX5) [상기 문헌: 9, 10], CysTR2 [상기 문헌: 11], TXA2R [상기 문헌: 12], CystTR1 [상기 문헌: 13] 및 프로스타글란딘 E2 수용체 서브타입 2 [상기 문헌: 14]를 포함하는, 아라키도네이트 경로에 수반되는 기타 유전자의 다형성과 AIA의 연관성을 설명해왔다. 본 발명에서, 류코트리엔, 리폭신, 프로스타글란딘 및 트롬복산을 포함하는, 아라키돈산의 물질대사에 수반되는 25개의 유전자의 SNP가 연구되었다. 리폭신 경로에서, ALOX5AP, ALOX15B 및 FPRL1의 SNP는 천식에서 아스피린 과민성과 연관되지 않았다 (자료 제시 안함). 그러나, 아스피린 과민성과 ALOX5, CysTR2, TXA2R 및 CysTR1 SNP의 연관성은 본 발명자들 [상기 문헌: 9, 11, 12] 및 다른 연구자들 [상기 문헌: 10, 13]에 의해 이전에 보고된 바와 같이 연구 피검자에서 되풀이되었다 (자료 제시 안함).
요약하자면, 아라키돈산 대사의 매개체는 아스피린에 대한 과민성과 관련있으며, 이 중 리폭신은 항염증 활성을 가지고 있으며 ALOX5, ALOX12 및 ALOX15 유전자의 협동 작용에 의해 생성된다. 본 발명은 ALOX12 및 ALOX15의 다형성들과 천식에서 아스피린 과민성과의 연관성을 평가하기 위해, ALOX12의 27개 SNPs 및 ALOX15의 13개 SNPs를 67명의 아스피린 유도성 천식 환자와 280명의 아스피린 내성 환자에서 지노타이핑하였고, 뇨중 리폭신 A4 및 15-에피-리폭신 A4의 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과 7개의 ALOX12 SNPs는 AIA와 연관되어 있었고 (P=0.008-0.042), ALOX12 ht1 +/+ 및 ht2 +/+ 빈도는 ATA에서 보다 AIA에서 더 높았다 (P=0.022). ALOX15 ht2 빈도는 ATA에서 보다 AIA에서 더 낮았다 (P=0.017). ALOX12 ht1 및 ht2는 아스피린 유도성 기관지 경련과 연관되어 있음을 래트에서 FEV1 감퇴율 (%)을 통해 확인하였다 (각각, P=0.004 및 P=0.034). ht1 +/+ 또는 ht2 +/+를 가진 피검자는 다른 비검자 보다 더 높은 FEV1 감퇴율을 보였다 (P=0.00007). ALOX15의 경우, ht2를 가진 피검자는 ht2를 갖고 있지 않은 피검자들 보다 더 낮은 FEV1 감퇴율을 보였다 (P=0.002). 유전자-유전자 상호작용에 대한 실험에서, ALOX12 ht1 +/+ 또는 ALOX12 ht2 +/+ 및 ALOX15 ht2 -/-를 가진 피검자는 다른 피검자 보다 훨씬 더 높은 FEV1 감퇴율을 보였다 (P=0.0000009). ALOX12 ht1 동형접합자는 현저하게 더 낮은 뇨 15-에피-리폭신 A4 농도를 보였다 (P=0.041). 이러한 결과는 본 발명에 따른 ALOX12 및 ALOX15 다형성들이 15-에피-리폭신 A4의 조절을 통해 AIA와 연관되어 있음을 시사한다.
이와 같이, 본 발명자들은 인간 ALOX12 및 ALOX15 유전자 다형성을 지노타이핑하고 천식환자들에서 아스피린 불내성의 전개와 관련되는 이들 유전자의 해플로타입을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 이러한 연관성이 두 유전자의 해플로타입과 짝지을 때 더욱 현저해짐을 발견하였다. 중요한 리폭신 경로 유전자의 유전적 다형성에 관한 이러한 정보는 아스피린 불내성의 진단을 위한 새로운 방법 뿐만 아니라 아스피린 불내성의 제어를 위한 새로운 전략을 개발하는데 유용할 수 있다.
본 명세서에서 다형성 부위의 뉴클레오티드 위치는 ALOX12 유전자 및 ALOX15 유전자 각각의 번역 개시 부위를 +1로 계산한 것이다. 따라서 ALOX12 -822G>C는 ALOX12의 번역 개시 부위 (+1)로부터 -822번째 이고, G>C는 상기 다형성 부위에서 메이져 대립유전자 (major allele)는 G이고 마이너 대립유전자 (minor allele)는 C임을 나타낸다.
본 명세서에서 ALOX12 ht1 +/+, ALOX12 ht2 +/+, ALOX15 ht2 -/-와 같이 유전자명 다음에 해플로타입과 함께 표시한 "+", "-"에서 "+"는 예컨대 ht1이 염색체 상에 존재하는 것을 의미하고 "-"는 ht1이외의 다른 해플로타입이 염색체에 존재함을 의미한다. 예를 들어, ht1 +/+, +/-, -/-는 ht1/ht1, ht1/-, -/-로 표현될 수도 있으며 이것은 SNP, 예컨대 상기 ALOX12 -822G>C에서의 G/G, G/C, C/C와 같은 의미이다. 즉, "-"는 "ht1이 아닌 해플로타입 모두"를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대해 설명하면 다음과 같다.
ALOX5: 아라키도네이트 5-리폭시게나아제 (arachidonate 5-lipoxigenase)
ALOX12: 아라키도네이트 12-리폭시게나아제
ALOX15: 아라키도네이트 15-리폭시게나아제
SNP: 단일/단 염기 다형성 (single nucleotide polymorphism)
AIA: 아스피린 유도성 천식 (aspirin-induced asthma)
ATA: 아스피린 내성 천식 (aspirin-tolerant asthma)
FEV1: 1초간 노력성 호기량 (forced expiratory volume in one second)
NSAIDs: 비스테로이드성 항염증 약물 (non-steroidal anti-inflammatory drugs)
CHES: 만성 과형성 호산성 부비강염 (chronic hyperplastic eosinophilic sinusitis)
AERD: 아스피린 악화된 호흡기 질환 (aspirin-exacerbated respiratory disease)
ASA: 아스피린 (aspirin, acetylsalicylic acid)
LTA4: 류코트리엔 A4 (leukotriene A4)
HETE: 하이드록시에이코사테트라에노산 (hydroxyeicosatetraenoic acid)
ATL: 아스피린 자극성 리폭신 (aspirin-triggered lipoxin; 15-epi-lipoxin A4)
LXA4: 리폭신 A4 (lipoxin A4)
LTC4S: 류코트리엔 C4 신타아제 (leukotriene C4 synthase)
HWE: 하디-바인베르그 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium)
또한 ALOX12 유전자 및 ALOX15 유전자의 일반적인 정보는 하기 웹사이트에서 확인가능하다.
ALOX12:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=239&ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Gene.Gene_ResultsPanel.Gene_RVDocSum
ALOX15:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=246&ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Gene.Gene_ResultsPanel.Gene_RVDocSum
이하 실시예에 기초하여 본 발명을 기술하고, 통계분석 및 결과를 기술한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 피검자
본 발명에서 천식 피검자 (N = 347)를 순천향 대학교 부천병원 (대한민국), 서울병원 (대한민국), 충북대학교 병원 (대한민국) 및 충남대학교 병원 (대한민국) 에서 외래환자로부터 모집하였다. 모든 피검자는 한국인이었고, 사후 조사를 규칙적으로 수행하였다. 모든 환자들은 세계천식기구 (GINA) 가이드라인 [상기 문헌: E1]에 따라서 온화 내지 적당한 지속성 천식의 안정한 상태였다. 각 환자는 15% 이상의 1초간 노력성 호기량 (FEV1)의 흡입 기관지수축제-유도된 향상 및/또는 10 mg/ml 미만의 메타콜린 (methacholine)의 기도 과민성에 의해 기록된 바와 같이 기도 가역성을 보였다. 모든 환자들은 안정한 천식을 가졌고, 아무도 연구 전 6주간 호흡관 감염 또는 그의 악화를 겪지 않았다. 피부 단자 시험은 24명의 일반 공기알레르기원 (Bencard Co. Ltd., Brentford, UK)에 대해 수행하였다 [상기 문헌: 43]. 아토피는 피부 단자 시험으로부터 하나 이상의 양성 반응 (>3mm 직경)으로 정의하였다. 전체 IgE는 유니캡(UniCAP) 시스템을 사용하여 측정되었다 [Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden]. 연구 피검자들은 GINA 가이드라인에 따라 흡입된 스테로이드 단독으로 또는 장기간 작용하는 β2-작용제와 조합하여 처리하였다 [상기 문헌: 42]. 피검자들은 아스피린 투여 연구 전 6주간 항류코트리엔 약물, 항콜린작용제 또는 테오필린이 투여되지 않았고 이전에 기타 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAIDs)이 투여되지도 않았거나 아스피린에 탈민감되지도 않았다.
피검자들의 임상학적 특징들을 표 1에 요약하였다. 아스피린 유도성 천식환자 (AIA)와 아스피린 내성 (ATA) 천식환자 사이에는 평균 연령, 성별 분포, 흡연 유발 및 아토피 유발에서 현저한 차이가 없었다. FVC 및 PC20 값을 포함하는 폐 기능은 두 그룹에서 동일하였으나, FEV1%은 ATA에 비해 AIA에서 약간 감소하였다 (P=0.011). 아스피린 자극에 의해 야기된 FEV1 감퇴율 (%)은 모든 연구 피검자에서 -9% 내지 68% 범위였다.
표 1. 피검자들의 임상 프로파일 및 연구 발견사항
Figure 112007047691626-PAT00001
실시예 2: 경구 아스피린 투여 시험
경구 자극 시험은 이전에 기술된 문헌으로부터 약간 변형된 방법을 사용하여 증가된 투여량의 아스피린 (10-450mg Astrix; Mayne Pharma Ltd., Melbourne, Australia)으로 수행되었다 [상기 문헌: 15, 16]. 자극은 언제나 오전 8시와 9시 사이에 시작하였다. 항히스타민과 단기간 작용하는 2-작용제는 24시간동안 빼놓았다. 최종 아스피린 투여 후 FEV1에서의 변화는 5시간동안 일어났다. FEV1 비율에 의해 반영된 바와 같은 아스피린 유도성 기관지경련은 투여전 FEV1을 투여후 FEV1 을 뺀 값을 투여전 FEV1으로 나눈 값으로서 계산하였다. 피검자들이 기관지외 증상 없이 20% 이상 또는 피부 징후를 가지면서 15% 이상의 FEV1 감퇴율을 나타내는 경우 양성 응답자로서 표시하였다 (n=67). 기관지외 코 또는 피부 증상 없이 15% 이하의 FEV1 감퇴율을 나타내는 피검자는 음성 응답자로 간주되었다 (n=280). 모든 피검자들은 연구에 참가하는 동의서를 제출하였고, 프로토콜은 각 병원의 윤리 위원회에 의해 승인받았다.
실시예 3: 뇨 수거 및 리폭신 A4 및 15-에피-리폭신 A4의 측정
뇨 샘플은 방광에서 2시간동안 축적한 후, 양성 응답자에서 FEV1의 상당한 감소를 나타낸 후 2시간에서 및 음성 응답자에서 ASA의 최종 투여량의 투여 후 2시간에서 기준선에서 수거되었다. 뇨 샘플은 10분동안 500rpm에서 원심분리되었고, 상청액은 -80℃에서 보관되었다. 리폭신 A4 및 15-에피-리폭신 A4 농도는 ELISA (Oxford Biomedical Research, Inc., USA)를 사용하여 2회 측정되었고 pg/μg 크레아티닌으로 표현되었다. 검출의 최저 제한량은 20pg/ml이었고; 검출 제한치 이하의 레벨은 통계 계산을 위해 0pg/ml로 간주되었다. 평가 중간 및 평가내 편차는 15% 미만이었다.
실시예 4: SNP 선택 및 지노타이핑
본 발명자들은 dbSNP121과 류코트리엔, 리폭신, 프로스타그란딘 및 트롬복산 경로를 포함하는 아라키딘산의 물질대사에 관련된 25개의 유전자를 나타내는 국제 HapMap 프로젝트(International HapMap Project)로부터 총 647개의 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNPs)을 선택하였으며 본 발명에서는 ALOX12의 SNPs 27개 및 ALOX15의 SNPs 13개를 이용하였고 이들을 하기 표 2 및 표 3에 정리하였다. 지노타이핑은 일루미나 골든 게이트 (Illumina's Golden Gate) 지노타이핑 시스템을 사용하여 웰당 768개의 다양한 레벨의 SNP에서 수행되었고 [상기 문헌: 17], 자료 품질은 이중 DNA에 의해 평가하였다 (n=10). 보유 자료에 대한 지노타입 품질 스코어는 0.25로 설정하였다. 다음의 기준을 만족할 수 없는 SNP는 배제하였다: (i) 90%의 최소 호출율; (ii) 복제 오류 없음; (iii) P>0.001보다 큰 하디-바인베르그(Hardy-Weinberg) 평형. ALOX12 및 ALOX15 유전자 상의 40개의 SNP를 성공적으로 지노타이핑되었다. SNP 지노타이핑을 위해 사용한 프라이머 정보를 하기 표 4 및 표 5에 정리하였다.
표 2. 본 발명에서 지노타이핑된 ALOX12 유전자 및 SNPs의 상세 정보
Figure 112007047691626-PAT00002
표 3. 본 발명에서 지노타이핑된 ALOX15 유전자 및 SNPs의 상세 정보
Figure 112007047691626-PAT00003
표 4. ALOX12 SNPs 지노타이핑용 프라이머 서열
Figure 112007047691626-PAT00004
표 4 (계속)
Figure 112007047691626-PAT00005
표 4 (계속)
Figure 112007047691626-PAT00006
표 4 (계속)
Figure 112007047691626-PAT00007
표 4 (계속)
Figure 112007047691626-PAT00008
표 4 (계속)
Figure 112007047691626-PAT00009
표 5. ALOX15 SNPs 지노타이핑용 프라이머 서열
Figure 112007047691626-PAT00010
표 5 (계속)
Figure 112007047691626-PAT00011
표 5 (계속)
Figure 112007047691626-PAT00012
실시예 5: 통계학적 분석
모든 짝의 이대립유전자 좌위사이의 결합 불평형은 르원틴(Lewontin's)의 D'(｜D'｜) 및 r 2 을 사용하여 측정하였다 [상기 문헌: 18]. 개별 해플로타입은 EM 알고리즘을 사용하여 유추하였다. AIA와 ATA 사이의 SNP 지노타입과 해플로타입의 분포 및 지노타입 또는 해프로타입 사이의 아스피린 투여에 의해 유도된 FEV1 감퇴율 (%)의 차이는 논리 회귀 및 선형 회귀 모델로 분석되었고, 이것은 공변수로서 연령, 성별, 아토피 상태 및 흡연 상태에 대해 제어한다. 그룹간의 뇨중 LXA4 또는 ATL 레벨은 독립 t-검정을 사용하여 비교하였다. 아스피린 투여에 의해 야기되는 뇨중 LXA4 또는 ATL 레벨에서의 변화는 쌍 샘플 t-검정을 사용하여 비교하였다. 자료는 SAS ver.8.1 (SAS Inc., Cary, NC) 및 SPSS ver. 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) 소프트웨어 패키지를 사용하여 관리하고 분석하였다. 0.05 이하의 P 값을 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
결과
ALOX12 및 ALOX15 SNPs와 AIA의 위험과의 연관성
본 발명에서는 ALOX12의 27개의 SNP와 ALOX15의 13개의 SNP에 대한 자료를 수집하였으며 이들 SNP에 대한 희귀 대립유전자 빈도, 이형접합성 및 HWE는 상기 표 2 및 표 3에 나타내었다. 모든 좌위의 지노타입 분포는 하디-바인베르그 평형이었다 (P>0.001) (상기 표 2 및 표 3). ALOX12 SNP 사이의 결합 불평형 계수 (｜D'｜) 및 r 2 은 모든 연구 피검자에 대해 계산되었다 (도 1a 및 도 1c).각 유전자사이의 (｜D'｜) 및 r 2 와 지노타입의 빈도에 관한 정보는 도 7에 도시하였다. 절대 LD (r2
Figure 112007047691626-PAT00013
1)는 ALOX12 유전자에서 +926T>C, +1008G>T 및 +1409T>C사이, +3324G>A 및 +3451G>A사이, +7135G>C 및 +7634G>A사이, +7032T>G 및 +15097C>T사이 및 +8783A>G, +10402A>G, +10775T>G 및 +14904C>T사이에서 존재하였다. ALOX12의 4개의 해플로타입은 0.05보다 큰 빈도로 구성되었다 (도 1b). ALOX15 SNP 사이의 결합 불평형 계수 (｜D'｜) 및 r 2 값은 보여진다 (도 2a 및 도 2c). 절대 LD (r2
Figure 112007047691626-PAT00014
1)은 +3905A>C 및 +4670 G>A사이에서 존재하였다. ALOX15의 6개의 해플로타입은 0.05보다 큰 빈도로 구성되었다 (도 2b). 모든 유전자의 해플로타입 분포는 하디-바인베르그 평형이었다 (P>0.05).
모든 단일 SNP와 두 유전자의 10개의 해플로타입은 천식환자에 대한 다중 논리 회귀 모델을 사용하여 AIA의 위험과의 연관성에 대해 분석하였다. 논리 분석을 통해 7개의 ALOX12 SNP가 AIA와 연관되어 있음을 밝혀냈다 (P<0.05) (도 1a). ALOX12의 27개의 SNP 중에서, 인트론 중의 6개의 SNP (+640G>A, +2236G>A, +4508G>A, +5922C>T, +7135G>C, 및 +7634G>A)와 엑손 14 중의 하나의 동종이명 SNP (+14216G>A, L634L)는 천식에서 아스피린 과민성과 연관되었다 (P=0.008-0.042). AIA를 갖는 피검자는 열성 모드에서 ALOX12 +2236G>A(25.8% vs. 15.3%, OR=2.15 [1.11-4.18], P=0.024), ALOX12 +4508G>A(25.8% vs. 16.4%, OR=1.98 [1.02-3.82], P=0.042), ALOX12 +640G>A(16.7% vs. 6.3%, OR=2.80 [1.22-6.40], P=0.015), ALOX12 +7135G>C(16.7% vs. 7.5%, OR=2.37 [1.06-5.31], P=0.036), 및 ALOX12 +7634G>A(16.7% vs. 7.5%, OR=2.37 [1.06-5.30], P=0.036)의 희귀 대립유전자에 관하여 ATA를 갖는 피검자에 비해 상당히 높은 빈도를 가졌고, 공동우성 모드에서 ALOX12 +5922C>T (10.6% vs. 24.2%, OR=0.31 [0.13-0.73], P=0.008) 및 ALOX12 +14216G>A (15.2% vs. 24.9%, OR=0.42 [0.20-0.88], P=0.021)의 희귀 대립유전자에 관하여 상당히 낮은 빈도를 가졌다 (도 1a). 13개의 ALOX15 SNP 중에서, SNP의 희귀 대립유전자 빈도는 AIA와 ATA 그룹 사이에서 차이가 없었다 (도 2a).
ALOX12 및 ALOX15 SNP 해플로타입의 AIA 위험과의 연관성
ALOX12의 4개의 해플로타입(빈도>0.05)중에서, AIA를 갖는 피검자는 열성 모 드에서 ATA를 갖는 피검자보다 ht1 +/+(22.4% vs. 12.5%, OR=2.22 [1.12-4.50], P=0.022) 및 ht2 +/+ (14.9% vs. 5.7%, OR=2.72 [1.16-6.25], P=0.022)의 상당히 높은 빈도를 가졌다 (표 6 및 표 7). 반면에, ht4의 빈도는 우성 모드에서 ATA 피검자에서보다 AIA 피검자에서 상당히 낮았다 (10.4% vs. 22.8%, OR=0.32 [0.13-0.78], P=0.011) (표 6 및 표 7). 아스피린 투여에 의해 유도된 FEV1 감퇴율 (%)이 AIA의 진단을 위한 가장 중요한 매개변수이므로, 본 발명자들은 모든 피검자의 다중 선형 회귀 분석을 사용하여 이들 해플로타입과 FEV1 감퇴율 (%)간의 연관성을 조사하였다. ALOX12 ht1, ht2 및 h4t는 FEV1 감퇴율에 대한 유전자 투여 효과를 보여주었다 (도 3). ALOX12의 ht1 +/+ 또는 ht2 +/+를 갖는 피검자들은 ht1 + /ht1 - 및 ht1 - /ht1 - 를 갖는 피검자 또는 ht2 +/- 및 ht2 -/-(각각 13.77±2.61% vs. 8.27±0.71%, P=0.004 및 14.70±3.37% vs. 8.62±0.73%, P=0.034)를 갖는 피검자보다 높은 FEV1 감퇴율을 보여주었다 (도 3의 A 및 B). ht1 +/+ 또는 ht2 +/+를 갖는 피검자는 다른 피검자(13.93±1.87% vs. 7.89±0.64%, P=0.00007)보다 높은 FEV1 감퇴율을 보여주었다 (도 3의 C).
표 6. ALOX12 해플로타입과 아스피린 유도성 천식의 위험과의 연관성에 관한 논리 회귀 분석
Figure 112007047691626-PAT00015
ALOX15 유전자의 경우, ht2의 빈도는 우성 모드에서 ATA 피검자(22.4% vs. 37.1%, OR=0.46 (0.24-0.87), P=0.017)에서보다 AIA 피검자에서 상당히 낮았던 반면 (표 3), 다른 해플로타입은 AIA 및 ATA 그룹가운데 빈도의 차이를 보이지 않았다. ht2를 갖는 피검자는 우성 모드에서 ht2를 갖지 않는 피검자보다 상당히 낮은 FEV1 감퇴율을 보여주었다 (6.16±0.87% vs. 10.73±1.01%, P=0.002) (도 3D).
표 7. ALOX15 해플로타입과 아스피린 유도성 천식의 위험과의 연관성에 관한 논리 회귀 분석
Figure 112007047691626-PAT00016
ALOX12 및 ALOX15 해플로타입간의 상호작용이 천식환자에서 아스피린 자극에 의해 야기되는 FEV1 감퇴율에 미치는 영향
본 발명자들은 ALOX12 및 ALOX15 유전자 다형성간의 상호작용이 천식 환자에서 아스피린 유도성 기관지경련에 미치는 영향을 조사하였다. ALOX12 ht1과 FEV1 감퇴율 (%)과의 연관성은 쌍 분석이 ALOX12 ht2와 ALOX15 ht2를 사용하여 수행되는 경우 보다 명확해졌다 (도 4). ALOX12 ht1 +/+ 및 ALOX15 ht2 -/-를 갖는 천식환자들은 다른 피검자보다 명백하게 높은 FEV1 감퇴율을 보여주었다 (18.64±3.80 vs. 8.12±0.68, P=0.000012) (도 4의 A). ALOX12 ht1 +/+ 또는 ALOX12 ht2 +/+ 및 ALOX15 ht2 - /-를 갖는 천식환자들은 다른 모든 피검자와 비교할 때 FEV1 감퇴율에서 가장 큰 차이를 보였다 (17.29±2.78 vs. 7.62±0.66, P=0.0000009) (도 4의 B).
기준선에서 및 아스피린 투여 후 뇨중 LXA4 및 ATL 농도
ALOX12 및 ALOX15 해플로타입의 아라키도네이트 물질대사에 대한 유전 영향을 조사하기 위해, LXA4 및 ATL의 뇨중 농도는 기준선에서 및 아스피린 투여 후 9명의 AIA 및 41명의 ATA 환자에서 측정되었다.
아스피린 투여 후, LXA4 및 ATL의 레벨은 AIA 및 ATA 피검자 모두에서 상당히 증가되었다 (도 5). ALOX12 해플로타입은 뇨중에서 ATL의 기준 농도와는 연관되고 LXA4의 기준 농도와는 연관되지 않았다. ALOX12 ht1 동형접합자는 ht1 +/- 또는 ht1 -/-를 갖는 피검자보다 뇨중 ATL의 기준선 농도보다 상당히 낮음을 보여주었다 (4.11±1.31 vs. 8.86±1.28 pg/㎍ 크레아티닌, P=0.041) (도 6). 아스피린을 투여하면 ALOX12 ht1 동형접합자의 ATL 레벨에서 4배 이상의 증가를 유도한 반면 (4.11±1.31 vs. 21.94±2.77 pg/㎍ 크레아티닌, P<0.001), ht1 +/- 또는 ht1 -/-를 갖는 피검자들은 ATL에서 2배의 증가를 보여주었다 (8.86±1.28 vs. 20.99±1.24 pg/㎍ 크레아티닌, P<0.001) (도 6). 이전의 피검자들의 아스피린 투여 후 검출된 ATL의 양은 이후 피검자에서 검출된 양과 동일하였다. ALOX15 해플로타입은 LXA4 또는 ATL의 기준 뇨중 레벨과 연관되지 않았다 (자료 제시 안함).
이와 같이, ALOX12와 ALOX15 다형성은 아스피린 유도성 천식과 현저하게 연관되었다. 따라서, 본 발명은 중요한 리폭신 경로 유전자의 유전 다형성에 관한 정보가 아스피린 불내성을 진단 및 제어가 가능함을 제시하며, 장차 신약개발, 질병진단 및 치료분야에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> SNP Genetics,Inc. <120> Association of ALOX12 and ALOX15 polymorphorism with aspirin induced asthma <130> IPM-33425 <160> 120 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for -822G>C <400> 1 acttcgtcag taacggacgc tcttacgggg tgcatcactc ct 42 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for -822G>C <400> 2 gagtcgaggt catatcgtgc tcttacgggg tgcatcactc cc 42 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for -822G>C <400> 3 cattggtctt ggttaacctc cattggtccg cacttcaatc gcgtctgcct atagtgagtc 60 60 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for -540G>A <400> 4 acttcgtcag taacggacgt ggttgtgggt gacccacttg t 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for -540G>A <400> 5 gagtcgaggt catatcgtgt ggttgtgggt gacccacttg g 41 <210> 6 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for -540G>A <400> 6 caatgaggaa gtgaggatcc taaaagtcgc tttacggaga cacagggtct gcctatagtg 60 agtc 64 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal PCR Primer Type A for -216G>A <400> 7 acttcgtcag taacggacaa atatatgcgg ccttggaaca at 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for -216G>A <400> 8 gagtcgaggt catatcgtaa atatatgcgg ccttggaaca ac 42 <210> 9 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for -216G>A <400> 9 aaatctgtga agaagcgtaa aatctcgaaa taggcgactg cgaatcgtct gcctatagtg 60 agtc 64 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +295C>T <400> 10 acttcgtcag taacggacgg aaagagcttg gaccgctaga gtt 43 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +295C>T <400> 11 gagtcgaggt catatcgtgg aaagagcttg gaccgctaga gtc 43 <210> 12 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +295C>T <400> 12 gaaagaactc cgtggatatt caaaggggta cttatggtcg cacggtctgc ctatagtgag 60 tc 62 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +640G>A <400> 13 acttcgtcag taacggacga gaaattagaa acgctgccac tctt 44 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +640G>A <400> 14 gagtcgaggt catatcgtga gaaattagaa acgctgccac tctg 44 <210> 15 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +640G>A <400> 15 acatacattt tagaaagctg acttaagcag tcgcattcat taggacgagt ctgcctatag 60 tgagtc 66 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +926T>C <400> 16 acttcgtcag taacggacgc aaccaacgca aaaatggat 39 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +926T>C <400> 17 gagtcgaggt catatcgtgc aaccaacgca aaaatggac 39 <210> 18 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +926T>C <400> 18 attgagattg catcaagtta aaatactggc tacacttaac ggggcgtctg cctatagtga 60 gtc 63 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +1008G>T <400> 19 acttcgtcag taacggacgt gtatccccat ggcacctcag a 41 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +1008G>T <400> 20 gagtcgaggt catatcgtgt gtatccccat ggcacctcag g 41 <210> 21 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +1008G>T <400> 21 ctttcctaca ggttaacaac cttacgtcaa tctagtgagc gtcagggtct gcctatagtg 60 agtc 64 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +1409T>C <400> 22 acttcgtcag taacggacca tccttggtgg ttggcgga 38 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +1409T>C <400> 23 gagtcgaggt catatcgtca tccttggtgg ttggcggg 38 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +1409T>C <400> 24 cattaggcac ccaagagtac gacacattgc cgccagatgt ctgtctgcct atagtgagtc 60 60 <210> 25 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +2236G>A <400> 25 acttcgtcag taacggacgc attattatca aaattagcct gtagtccct 49 <210> 26 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +2236G>A <400> 26 gagtcgaggt catatcgtgc attattatca aaattagcct gtagtcccc 49 <210> 27 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +2236G>A <400> 27 actttgtgaa taaccaaatc cttgtaccag tgtttcgacg ggctagtctg cctatagtga 60 gtc 63 <210> 28 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +2743A>G <400> 28 acttcgtcag taacggacgt tcttgagaaa acttacctgt atcagaa 47 <210> 29 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +2743A>G <400> 29 gagtcgaggt catatcgtgt tcttgagaaa acttacctgt atcagag 47 <210> 30 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +2743A>G <400> 30 aataaagtgg tttagaaatt tagctgaact ttggcccaat cccgatttgg tctgcctata 60 gtgagtc 67 <210> 31 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +3023T>C <400> 31 acttcgtcag taacggacga ggaggttgct acaggaatcc aga 43 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +3023T>C <400> 32 gagtcgaggt catatcgtga ggaggttgct acaggaatcc agg 43 <210> 33 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +3023T>C <400> 33 gaaagataag gaaggtttgt gtgatggtca ccacgctttg cacgagtctg cctatagtga 60 gtc 63 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +3324G>A <400> 34 acttcgtcag taacggacgg gctggcagac aagaggcttc a 41 <210> 35 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +3324G>A <400> 35 gagtcgaggt catatcgtgg gctggcagac aagaggcttc g 41 <210> 36 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +3324G>A <400> 36 aagaaagcat ttactttaaa gacttgctcc cttacgcaac ggtcagtgtc tgcctatagt 60 gagtc 65 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +3451G>A <400> 37 acttcgtcag taacggacgg tggaataaag gttttttggg gaa 43 <210> 38 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +3451G>A <400> 38 gagtcgaggt catatcgtgg tggaataaag gttttttggg gag 43 <210> 39 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +3451G>A <400> 39 aaagagatag ataacaaaaa tagattcgga ggtatccctg ctgacgtgag tctgcctata 60 gtgagtc 67 <210> 40 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +4101A>G <400> 40 acttcgtcag taacggacgg catttgggac actatagtca aatcct 46 <210> 41 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +4101A>G <400> 41 gagtcgaggt catatcgtgg catttgggac actatagtca aatccc 46 <210> 42 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +4101A>G <400> 42 tccaataaaa ggtaactttt ccttaagtcg taccatacag agggcggtct gcctatagtg 60 agtc 64 <210> 43 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +4508G>A <400> 43 acttcgtcag taacggacgc accttgaaaa ttgaatgacc ctaa 44 <210> 44 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +4508G>A <400> 44 gagtcgaggt catatcgtgc accttgaaaa ttgaatgacc ctag 44 <210> 45 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +4508G>A <400> 45 tatggattta gtagttgtac ccattacgcg gggattctaa gaccgttgtc tgcctatagt 60 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tcatttttta tattgctata aataaaaacg tggatgtctg cccctatcgt ctgcctatag 60 tgagtc 66 <210> 52 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +6207C>T <400> 52 acttcgtcag taacggactt atgaggagcc tgagaataaa agca 44 <210> 53 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +6207C>T <400> 53 gagtcgaggt catatcgttt atgaggagcc tgagaataaa agcg 44 <210> 54 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +6207C>T <400> 54 agaatttgga gtttggagtc tttcgtcttt cggaggcaag catggtctgc ctatagtgag 60 tc 62 <210> 55 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +7032T>G <400> 55 acttcgtcag taacggacgg tcagcgccgc cgagcta 37 <210> 56 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +7032T>G <400> 56 gagtcgaggt catatcgtgg tcagcgccgc cgagctg 37 <210> 57 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +7032T>G <400> 57 gacacgtcat gacccggacc atgcgtaggt atcgggctag tctgcctata gtgagtc 57 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +7135G>C <400> 58 acttcgtcag taacggaccc accgagagct gatggaaagt 40 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +7135G>C <400> 59 gagtcgaggt catatcgtcc accgagagct gatggaaagc 40 <210> 60 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +7135G>C <400> 60 gtcctgacag catctgcttt gttggggcac gatcaatgcg atgtctgcct atagtgagtc 60 60 <210> 61 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +7634G>A <400> 61 acttcgtcag taacggacca aatacttaca gtggctaagg aagcaaa 47 <210> 62 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +7634G>A <400> 62 gagtcgaggt catatcgtca aatacttaca gtggctaagg aagcaag 47 <210> 63 <211> 64 <212> DNA 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Universial PCR Primer Type B for +14216G>A <400> 74 gagtcgaggt catatcgttt caaaagcacc ccttagagtc ctac 44 <210> 75 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +14216G>A <400> 75 gctaattgca aaccaccttt tatgccttgg gagacacgac gatgtctgcc tatagtgagt 60 c 61 <210> 76 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +14904C>T <400> 76 acttcgtcag taacggacgc actcttggtc atttgctttt caatata 47 <210> 77 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for 14904C>T <400> 77 gagtcgaggt catatcgtgc actcttggtc atttgctttt caatatg 47 <210> 78 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +14904C>T <400> 78 tttattggct acagaaaata cccgtaattc ggacttggtc cactgggtct gcctatagtg 60 agtc 64 <210> 79 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +15097C>T <400> 79 acttcgtcag taacggacgg aggaagaggt tgaagaagtg ctgaa 45 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Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +2230C>T <400> 91 acttcgtcag taacggactg tgctttgaat tagtaaacaa atgtca 46 <210> 92 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +2230C>T <400> 92 gagtcgaggt catatcgttg tgctttgaat tagtaaacaa atgtcc 46 <210> 93 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +2230C>T <400> 93 tcttctacag tacagaaaac tcatggcggc agctatccat tatcggggtc tgcctatagt 60 gagtc 65 <210> 94 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +3586C>T <400> 94 acttcgtcag taacggacgg gtgaggacaa gaaatcactt gaacat 46 <210> 95 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +3586C>T <400> 95 gagtcgaggt catatcgtgg gtgaggacaa gaaatcactt gaacac 46 <210> 96 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +3586C>T <400> 96 caaagagaaa agaatgaaga ggcgtagaaa tacctcgacg 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+3905A>C <400> 102 aacatgtctg cggataaaga ctatgcgctt actcaaggaa acgtactgtc tgcctatagt 60 gagtc 65 <210> 103 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +4670G>A <400> 103 acttcgtcag taacggacga gcagcgcctc cttcagctt 39 <210> 104 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +4670G>A <400> 104 gagtcgaggt catatcgtga gcagcgcctc cttcagctc 39 <210> 105 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +4670G>A <400> 105 cctcagacag caaagcctac catggtacgc caatctaatg gtgagtctgc ctatagtgag 60 tc 62 <210> 106 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +5555A>G <400> 106 acttcgtcag taacggacct tccatccata ctttgccaca aa 42 <210> 107 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +5555A>G <400> 107 gagtcgaggt catatcgtct tccatccata ctttgccaca ag 42 <210> 108 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +5555A>G <400> 108 gaaggaacat gagctttatt gttgttagca tcaggttcgt ctaagggtct gcctatagtg 60 agtc 64 <210> 109 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +8706A>G <400> 109 acttcgtcag taacggacgt gagggccaag agttcccat 39 <210> 110 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +8706A>G <400> 110 gagtcgaggt catatcgtgt gagggccaag agttcccac 39 <210> 111 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +8706A>G <400> 111 tgtcatagat atactcagtc tagccgttgc gtcaaagcta gggatcggtc tgcctatagt 60 gagtc 65 <210> 112 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type A for +9562C>T <400> 112 acttcgtcag taacggacgg acagagactg agaaagaaaa tcaggt 46 <210> 113 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer Type B for +9562C>T <400> 113 gagtcgaggt catatcgtgg acagagactg 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PCR Primer Type B for +11103A>T <400> 119 gagtcgaggt catatcgtgt tttactacca ttgataactg gccaatg 47 <210> 120 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universial PCR Primer 3' for +11103A>T <400> 120 tatcaaagta aatgctgcta tgtgccagta tgaatcgaga gtgcttgcgt ctgcctatag 60 tgagtc 66

Claims (4)

  1. 아스피린 유도성 천식에 있어서 아스피린 불내성을 진단하기 위한 다형성을 포함하는 ALOX12 유전자 및 ALOX15 유전자로서, 상기 다형성이 ALOX12 ht1 +/+ 또는 ht2 +/+, 및 ALOX15 ht2 -/-이고, 여기서 ALOX12 ht1은 ALOX12의 번역개시부위(+1)로부터 -822번째 염기가 G이고, -540번째 염기가 G이고, -216번째 염기가 G이고, +295번째 염기가 C이고, +640번째 염기가 G이고, +926번째 염기가 T이고, +1008번째 염기가 G이고, +1409번째 염기가 T이고, +2236번째 염기가 A이고, +2743번째 염기가 A이고, +3023번째 염기가 T이고, +3324번째 염기가 G이고, +3451번째 염기가 G이고, +4101번째 염기가 A이고, +4508번째 염기가 A이고, +5625번째 염기가 G이고, +5922번째 염기가 C이고, +6207번째 염기가 C이고, +7032번째 염기가 T이고, +7135번째 염기가 G이고, +7634번째 염기가 G이고, +8783번째 염기가 A이고, +10402번째 염기가 A이고, +10775번째 염기가 T이고, +14216번째 염기가 G이고, +14904번째 염기가 C이고, +15097번째 염기가 C인 해플로타입이고, ALOX12 ht2는 ALOX12의 번역개시부위(+1)로부터 -822번째 염기가 C이고, -540번째 염기가 G이고, -216번째 염기가 A이고, +295번째 염기가 C이고, +640번째 염기가 A이고, +926번째 염기가 C이고, +1008번째 염기가 T이고, +1409번째 염기가 C이고, +2236번째 염기가 G이고, +2743번째 염기가 A이고, +3023번째 염기가 T이고, +3324번째 염기가 A이고, +3451번째 염기가 A이고, +4101번째 염기가 G이고, +4508번째 염기가 G이고, +5625번째 염기가 T이고, +5922번째 염기가 C이고, +6207번째 염기가 T이고, +7032번째 염기가 T이고, +7135번째 염기가 C이고, +7634번째 염기가 A이고, +8783번째 염기가 A이고, +10402번째 염기가 A이고, +10775번째 염기가 T이고, +14216번째 염기가 G이고, +14904번째 염기가 C이고, +15097번째 염기가 C인 해플로타입이고, ALOX15 ht2는 ALOX15의 번역개시부위(+1)로부터 -272번째 염기가 G이고, -186번째 염기가 G이고, +1011번째 염기가 A이고, +2230번째 염기가 C이고, +3586번째 염기가 C이고, +3730번째 염기가 G이고, +3905번째 염기가 C이고, +4670번째 염기가 A이고, +5555번째 염기가 A이고, +8706번째 염기가 A이고, +9562번째 염기가 C이고, +10113번째 염기가 T이고, +11103번째 염기가 A인 해플로타입이며, 상기 ht1 +/+, ht2 +/+ 및 ht2 -/-에서 "+"는 해당 해플로타입이 염색체 상에 존재함을 의미하고, "-"는 해당 해플로타입이 염색체 상에 존재하지 않고 그 외 다른 해플로타입이 염색체 상에 존재함을 의미하는, ALOX12 유전자 및 ALOX15 유전자.
  2. (1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 수득한 DNA에서 제 1항의 다형성들을 검출하는 단계; 및
    (3) 단계 (2)에서 검출된 다형성들을 확인하는 단계를 포함하는, 아스피린 유도성 천식에 있어서 아스피린 불내성을 진단하는 방법.
  3. 제 1항의 다형성들을 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함하는, 아스피린 유 도성 천식에 있어서 아스피린 불내성을 진단용 키트.
  4. 제 3항에 있어서, 프라이머 세트가 서열번호: 1 내지 서열번호: 120으로 구성됨을 특징으로 하는 키트.
KR1020070065107A 2007-06-29 2007-06-29 Ａｌｏｘ１２ 및 ａｌｏｘ１５ 다형성과 아스피린 유도성천식과의 연관성 KR20090001043A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2742248C2 (ru) * 2015-11-02 2021-02-04 Сингх Биотекнолоджи, Ллк Однодоменные антитела, направленные против внутриклеточных антигенов

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RU2742248C2 (ru) * 2015-11-02 2021-02-04 Сингх Биотекнолоджи, Ллк Однодоменные антитела, направленные против внутриклеточных антигенов

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