KR20080112817A - Bio-marker composition for diagnosing diabetic nephropathy - Google Patents
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Abstract
Description
도 1a와 1b는 정상 환자, 제2형 당뇨병 환자, 미세단백뇨를 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자의 혈액에 있는 대사산물들에 대한 PLS-DA 모델이고,1A and 1B are PLS-DA models of metabolites in the blood of normal patients,
도 2a 내지 도 2c는 정상 환자, 제2형 당뇨병 환자, 미세단백뇨를 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자의 혈액의 500 MHz 1H-핵자기공명 스펙트럼이고,2a to 2c are 500 MHz 1 H-nuclear magnetic resonance spectra of blood of normal patients,
도 3은 제2형 당뇨병 환자의 혈액에서 보다 미세단백뇨를 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 증가한 대사산물의 상대적인 강도를 나타낸 결과이다.Figure 3 shows the relative strength of the increased metabolites in the blood of
본 발명은 당뇨병 환자가 당뇨병에서 당뇨병성 합병증의 일종인 당뇨병성 신증의 조기진단 및 중증으로의 진행 때 바이오마커로 사용 될 수 있는 대사산물 개발에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 합병증이 없는 당뇨병 환자의 혈액에서보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 더 많이 검출되는 바이오 마커 대사산물과 이를 이 용한 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 미리 예측 및 판단하는 진단키트에 관한 것이다.The present invention relates to the development of a metabolite that can be used as a biomarker when diabetic patients progress from diabetic to diabetic nephropathy, a type of diabetic nephropathy, and progress to severe, and more particularly, without complications. The present invention relates to a biomarker metabolite which is detected more in the blood of diabetic nephropathy than in the blood and a diagnostic kit that predicts and predicts the early diagnosis and progression of diabetic nephropathy using the same.
당뇨병은 혈중 포도당 농도가 비정상적으로 상승된 상태로 장기간 지속되는 것을 특징으로 하는 일련의 대사이상을 지칭하는 것으로, 혈중 포도당 농도를 조절하는 가장 중요한 호르몬인 인슐린의 절대적 또는 상대적 생산 결핍의 결과이거나 인슐린이 작용하는 표적장기에서의 인슐린의 작용저하(인슐린 저항성)의 결과에 의한 것이다. 인슐린이라는 호르몬은 췌장의 베타세포에서 생성되어 탄수화물이 소화 흡수되어 만들어지는 포도당의 대사에 중추적인 역할을 수행하며, 고혈당이 되지 않도록 포도당 농도를 일정범위 내로 유지시켜 준다. 이러한 중요한 역할을 하는 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린이 부족하거나, 인슐린이 분비된다고 해도 효과적으로 기능을 수행할 수 없다면, 혈당은 지속적인 상승 상태를 보이고 체내의 포도당 대사를 포함한 신진대사 기능이 원활하게 이루어 질 수 없게 된다. 이러한 일련의 병적인 변화를 일컬어 당뇨병이라고 한다.Diabetes refers to a series of metabolic disorders characterized by prolonged periods with abnormally elevated blood glucose levels, either as a result of an absolute or relative lack of production of insulin, the most important hormone that controls blood glucose levels, It is a result of the action of insulin (insulin resistance) in the target organ acting. A hormone called insulin is produced in the beta cells of the pancreas and plays a pivotal role in the metabolism of glucose produced by the digestion and absorption of carbohydrates, and maintains the glucose concentration within a certain range to prevent hyperglycemia. If the insulin-secreting pancreatic beta cells are destroyed and insulin is secreted or cannot function effectively even when insulin is secreted, then blood glucose remains elevated and metabolic functions including glucose metabolism in the body This cannot be done smoothly. This series of pathological changes is called diabetes.
현재 당뇨병의 분류체계에는 여러 가지가 있고, 당뇨병에는 다양한 유형이 있지만, 주로 당뇨병의 발병 기전에 중점을 두고 제 1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병으로 분류된다. 제 1형 당뇨병이란 과거의 인슐린 의존형 당뇨병에 해당하는 것으로 췌장의 베타세포가 파괴되면서 발생한 인슐린의 절대적인 결핍으로 말미암아 당뇨병이 생기는 것이고, 제2형 당뇨병이란 과거의 인슐린 비의존형 당뇨병에 해당하는 것으로 인슐린 저항성, 다시 말해서 인슐린이 분비되나 그 작용에 저항이 많아서 당뇨병이 생긴 것을 말한다.Currently, there are various classification systems of diabetes, and there are various types of diabetes, but mainly classified into
대다수의 당뇨병 환자들은 혈당이 적절히 조절되지 않더라도 특별한 증상을 느끼지 못하는 경우가 많이 있으며, 당장 심각한 증상이 나타나지 않으므로 당뇨병에 의한 합병증의 심각성을 잘 인지하지 못할 때가 많다. 당뇨병에 의한 합병증은 크게 미세혈관 합병증, 대혈관 합병증 및 기타 합병증으로 나누어 볼 수가 있으며 이중 신증(신장)은 미세혈관 합병증으로 대표적인 당뇨병성 합병증으로 들 수 있다. The majority of diabetics do not feel any special symptoms even if blood sugar is not properly controlled, and often do not recognize the seriousness of the complications caused by diabetes because the symptoms are not present immediately. Diabetes complications can be classified into microvascular complications, macrovascular complications and other complications. Among these, nephropathy (kidney) is a microvascular complication and is a representative diabetic complication.
당뇨병이 지속되면 전신의 혈관들이 손상을 입으며 이 과정에서 신장의 혈관들도 침범을 받게된다. 손상된 혈관은 신장의 주기능인 혈액여과에 나쁜 영향을 미쳐서, 체내에 과다한 수분 및 독성 물질을 축적시키게 된다. 뿐만 아니라 소변을 통해 단백질 등 영양분의 소실을 일으키기도 한다. 이러한 신장기능의 장애를 “당뇨병성 신증" 이라고 하고 결국 고혈당에 의해 신장기능의 장애가 발생게 되며, 고혈압도 신증의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. If diabetes persists, the blood vessels in the body are damaged and in the process, the blood vessels in the kidneys are affected. Damaged blood vessels have a bad effect on blood filtration, the main function of the kidneys, causing excess water and toxic substances to accumulate in the body. In addition, urine can cause protein and other nutrients to be lost. This disorder of renal function is called "diabetic nephropathy" and eventually hyperglycemia causes renal dysfunction, and hypertension is known to play an important role in the development of nephropathy.
당뇨병성 신증의 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았으나, 신장 내의 혈역학적인 변화(intrarenal hemodynamic alterations), 사구체 단백의 포도당화(glycosylation of glomerular proteins), sorbitol의 축적 등 복합적 요인들이 당뇨병성 신증의 병인과 관련이 있는 것으로 여겨진다. 구심성 세동맥 저항(afferent arteriolar resistance)으로 인한 신장내의 혈역학적인 변화 그로 인한 혈압과 과여과는 당뇨병성 신증의 시작 및 진행에 중요한 역할을 하게 된다. 선택적인 구심성 혈관확장은 고혈당, 인슐린 부족, 지나친 단백섭취, 체액팽창, 내인성 혈관확장인자(예: angiotensin Ⅱ, endothelin)의 상승작용, 사구체 비후, 그리 고 그 외에 다른 밝혀지지 않은 요인들로 인해 야기될 수 있다. 또한 고혈당으로 인한 단백질의 포도당화가 일어날 수 있는데, 교원질(collagen), 사구체기저막(glomerular basement membrane) 등과 같은 단백질의 경우 AGEs(advanced glycosylated end-products)로 알려진 비가역적인 부가물을 형성한다. AGEs는 조직에 축적되어 단백질간의 교차결합 및 당뇨병성 합병증의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그리고 포도당은 aldose 환원효소에 의해서 sorbitol로 전환되는데 고혈당이 지속되면 지나친 sorbitol의 축적이 야기될 수 있다. Sorbitol은 polyol dehydrogenase에 의해 과당(fructose)으로 산화되는데, 이 sorbitol과 과당의 세포내 축적으로 인해서 myoinositol의 고갈을 일으킨다. Aldose 환원효소에 의한 sorbitol의 축적 외에도 protein kinase C의 활성의 증가 등도 나타나는데, 이러한 polyol pathway 내의 생화학적 이상으로 인하여 당뇨병성 신증이 야기될 수 있다. The pathogenesis of diabetic nephropathy has not yet been accurately determined, but a combination of factors, such as intrarenal hemodynamic alterations in the kidneys, glycosylation of glomerular proteins, and accumulation of sorbitol, is associated with the pathogenesis of diabetic nephropathy. It seems to be there. Hemodynamic changes in the kidney due to afferent arteriolar resistance, resulting in blood pressure and overfiltration play an important role in the onset and progression of diabetic nephropathy. Selective afferent vasodilation may be due to hyperglycemia, lack of insulin, excessive protein intake, fluid expansion, synergism of endogenous vasodilation factors (eg angiotensin II, endothelin), glomerular thickening, and other unknown factors. May be caused. In addition, hyperglycemia may cause glycation of proteins. For proteins such as collagen and glomerular basement membrane, they form irreversible adducts known as advanced glycosylated end-products (AGEs). AGEs accumulate in tissues and are known to be involved in the cross-linking of proteins and the development of diabetic complications. Glucose is converted to sorbitol by aldose reductase, which can cause excessive accumulation of sorbitol if hyperglycemia persists. Sorbitol is oxidized to fructose by polyol dehydrogenase, which causes depletion of myoinositol due to the intracellular accumulation of sorbitol and fructose. In addition to the accumulation of sorbitol by aldose reductase, an increase in the activity of protein kinase C is also observed, which can lead to diabetic nephropathy.
당뇨병성 신증에서는 신기능이상 뿐만 아니라 세포 외 기질(ECM: extracellular matrix)의 축적도 중요한 역할을 한다. 경화증전의(presclerotic) cytokine인 transforming growth factor(TGF)-β은 당(glucose), AGE, 혈관작용성 호르몬(예: angiotensin Ⅱ, endothelin) 등에 의해서 자극되는 것으로 나타났는데, 이 TGF-β가 당뇨병성 신증의 발달에 주축적인 역할을 한다. TGF-β는 신증을 일으키는 대사성 인자와 혈역학적 인자 사이의 상호작용을 매개함으로써 당뇨병성 신증에서 ECM의 축적을 야기시키는 것으로 나타났다. TGF-β 외에도 다른 cytokine(예: vascular endothelial growth factor)들이 신증을 일으키는 역할에 대한 연구가 진행중이다. 제1형 당뇨병 환자의 경우 약 40%가 말기신질환(ESRD : end-stage renal disease)으로 진행되는 심각한 신증증세를 나타낸다. 당뇨병성 신증으로 진단된 당시에 신장이 비대하거나, 사구체여과율(GFR)이 상승되어 있는 경우가 있으며, 과여과(hyperfiltration)가 나타나는 경우 예후가 나쁘나 인슐린으로 치료하면 GFR과 신장의 크기는 정상화된다.In diabetic nephropathy, not only renal dysfunction but also the accumulation of extracellular matrix (ECM) plays an important role. The transforming growth factor (TGF) -β, a presclerotic cytokine, has been shown to be stimulated by glucose, AGE, and vascular hormones (eg, angiotensin II, endothelin). Plays a pivotal role in the development of nephropathy. TGF-β has been shown to cause the accumulation of ECM in diabetic nephropathy by mediating the interaction between metabolic and hemodynamic factors causing nephropathy. In addition to TGF-β, other cytokines, such as vascular endothelial growth factors, are being investigated for their role in nephropathy. About 40% of people with
당뇨병성 신증 발병 후 5∼10년 내에 미세알부민뇨(microalbuminuria)가 나타난다. 미세알부민뇨는 뇨 중에 1일 30∼300 ㎎의 알부민이 배출되는 상태로써 제1형 당뇨병 환자의 신증의 민감한 지표가 된다. 뇨 중의 알부민양은 시간이 지남에 따라 증가하게 되고, 몇 년 후에는 뇨 중에 1일 300 ㎎ 이상의 알부민이 배출되는 명백한 알부민뇨(overt albuminuria)가 나타나게 된다. 미세알부민뇨 시기 동안에 혈압이 상승되고, 때로는 고혈압으로 진행되게 된다. 명백한 알부민뇨가 나타나는 동안 GFR은 대략 1 ㎖/min/month의 속도로 점점 감소하며, 일단 명백한 알부민뇨가 나타나면 당뇨병성 신증은 비가역적이 되며, 약 50%의 환자가 7년 내에 투석을 필요로 하게 되는 말기신부전증이 나타나게 된다. 제2형 당뇨병 환자의 경우 신증은 서서히 발현되고, 임상 경과는 제1형 당뇨병 환자와 비슷하게 진행된다. 제1형 당뇨병에서는 약 50%의 환자에서, 제2형 당뇨병에서는 약 30%의 환자에서 당뇨병성 신증에 의한 신기능의 소실을 가져올 수 있다. 그러나 전체 당뇨병 환자로 볼 때 제2형이 제1형 당뇨병 환자보다 훨씬 많기 때문에 신증의 발생빈도는 제2형 당뇨병에서 더 높다고 볼 수 있다.Microalbuminuria appears within 5-10 years after the onset of diabetic nephropathy. Microalbuminuria is a state in which 30 to 300 mg of albumin is excreted in urine a day, which is a sensitive indicator of nephropathy in patients with
당뇨에 의한 신장 합병증의 진행정도를 판단하는 바이오마커들은 한정적이다. 정기적이고 반복적으로 임상적인 증상, 환자의 병력을 통하여 당뇨병성 신증의 진단이 이루어진다. 오랜 기간의 당뇨병력을 가진 환자가 신증범위의 단백뇨(nephrotic-range proteinuria), 망막병증(retinopathy)이 있으면서 신질환의 명확한 다른 원인이 없으면 당뇨병성 신증으로 진단된다. 또한 소변내의 미세 알부민을 검사하여 미세 알부민뇨를 보이는 환자를 조기에 진단한 뒤 집중적인 혈당 치료 및 고혈압에 대한 철저한 치료 등 적절한 처치를 통해 당뇨병성 신증의 진행에 의한 말기신부전으로의 진행을 완화시키는 것이 중요하다. 현재 당뇨병성 신증의 진행정도를 판단하는 바이오마커로서는 대표적인 것이 단백뇨 및 크레아틴이 있다. 그러나 단백뇨는 당뇨병성 신증 이외의 고혈압 및 심혈관 질환 발생을 의미하는 지표이기도하는 등 다른 질병 표지자와의 연관성이 높아 직접적인 당뇨병성 신증의 진행정도를 판정하기가 어려운 상태이다. 따라서, 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 신규진단 마커를 개발할 경우, 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 미리 예측 할 수 있는 형태의 키트 개발을 도모할 수 있다.Biomarkers that determine the progression of renal complications due to diabetes are limited. Diabetes nephropathy is diagnosed periodically and repeatedly through clinical symptoms and patient history. Patients with long-term diabetic history are diagnosed as diabetic nephropathy with nephrotic-range proteinuria, retinopathy and no other obvious cause of renal disease. In addition, early diagnosis of patients with microalbuminuria by examining microalbumin in the urine may be performed to alleviate the progression to end-stage renal failure due to the progression of diabetic nephropathy through proper treatment such as intensive blood sugar treatment and thorough treatment for hypertension. It is important. Currently, biomarkers for determining the progression of diabetic nephropathy include proteinuria and creatine. However, proteinuria is associated with other disease markers such as high blood pressure and cardiovascular disease in addition to diabetic nephropathy, so it is difficult to determine the progression of diabetic nephropathy. Therefore, when developing a new diagnostic marker with high specificity and sensitivity, it is possible to develop a kit that can predict the early diagnosis and progression of diabetic nephropathy in advance.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 1H-핵자기공명분광법을 이용하여 당뇨병 개체의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증초기 혈액에서 증가하는 바이오 마커 대사산물들을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made diligent research efforts to overcome the problems of the prior arts, using 1 H-nuclear magnetic resonance spectroscopy to identify biomarker metabolites that are increased in diabetic nephrotic early blood than in the blood of diabetic subjects. The present invention has been completed.
본 발명의 주된 목적은 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 효과적으로 진단할 수 있는 새로운 바이오 마커 대사산물을 제공하는 데 있다.The main object of the present invention is to provide a new biomarker metabolite that can effectively diagnose the early diagnosis and progression of diabetic nephropathy in diabetes.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 마커 대사산물을 이용한 진단키트를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit using the biomarker metabolite.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 정상 또는 당뇨병 환자의 혈액에서 보다 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 증가하는, 아세테이트(Acetate), 아르기닌(Arginine), 아스파테이트(Aspartate), 크레아티닌(Creatinine), 에탄올(Ethanol), 이소부티레이트(Isobutyrate), 메틸구아니딘(Methylguanidine), 메틸숙시네이트(Methylsuccinate), 페닐알라닌(Phenylalanine), 프롤린(Proline), 세린(Serine), 타우린(Taurine), 트레오닌(Threonine), 발린(Valine), 및 미오-이노시톨(myo-Inositol)로 구성된 군에서 선택된 대사산물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention increases in the blood of diabetic nephropathy patients than in the blood of normal or diabetic patients, Acetate, Arginine, Aspartate, Creatinine , Ethanol, Isobutyrate, Methylguanidine, Methylsuccinate, Methylsuccinate, Phenylalanine, Proline, Serine, Taurine, Threonine, Threonine, It provides a biomarker for diagnosing diabetic nephropathy comprising a metabolite selected from the group consisting of valine, and myo-inositol as an active ingredient.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 대사산물은 메틸구아니딘(Methylguanidine)인 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다. 상기 메틸구아니딘(Methylguanidine)은 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 정상 환자에 비해 14배 정도, 당뇨병 환자에 비해 3배 정도가 증가되었다.In the present invention, preferably the metabolite is methylguanidine (Methylguanidine) provides a biomarker composition for diagnosing diabetic nephropathy. The methylguanidine (Methylguanidine) was increased about 14 times in the blood of diabetic nephropathy patients compared to normal patients, about three times compared to diabetic patients.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오마커인 대사산물에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증 진단제를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a diabetic nephropathy diagnostic agent comprising an antibody that specifically binds to the metabolite that is a biomarker of the present invention.
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있으나, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오 마커인 대사산물을 소혈청 알부민(BSA)와 같은 캐리어 단백질과 결합한후 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody. Polyclonal antibodies can be prepared by incorporating a metabolite, an immunogenic biomarker, with a carrier protein, such as bovine serum albumin (BSA), and then injecting it into an external host according to conventional methods known to those skilled in the art. External hosts include mammals such as mice, rats, sheep, rabbits. Immunogens are injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection and are usually administered with an adjuvant to increase antigenicity. Blood is collected periodically from external hosts to collect serum that shows improved titers and specificity for the antigen or to separate and purify antibodies therefrom.
모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495))에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 대사물질을 BSA와 같은 캐리어 단백질과 결합한후 Balb/C 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 엘라이져(ELISA)방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다.Monoclonal antibodies can be prepared by techniques of generation of immortalized cell lines by fusions known to those skilled in the art (Koeher and Milstein (1975) Nature, 256: 495). The manufacturing method is briefly described as follows. Metabolites are first combined with carrier proteins such as BSA and then immunized with Balb / C mice. Thereafter, antigen-producing lymphocytes isolated from mice are fused with myeloma in humans or mice to produce immortalized hybridomas, and only hybridoma cells that produce the desired monoclonal antibody using ELISA method. After selection and propagation, monoclonal antibodies are isolated and purified from the culture.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 개체의 혈액에서 본 발명의 바이오 마커 대사물질의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 개체의 당뇨병성 신증 진행 정도에 대한 진단 방법을 제공한다.To achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for diagnosing the progression of diabetic nephropathy in a subject, comprising detecting the presence of the biomarker metabolite of the invention in the blood of the subject.
본 발명의 진단 방법에서, 상기 검출 단계는 개체의 혈액으로부터 NMR이나 HPLC 등을 통하여 바이오마커 대사산물의 존재를 직접 검출하거나, 혈액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 바이오 마커 대사산물의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 항원항체반응으로서 현재 널리 알려진 immunoassay 법 은 효소면역측정법 (ELISA, Coated tube), 항체결합 magnetic particle을 tube에 결합시킨 다음 antigen-tracer와 난분해성 오염물질을 서로 경쟁적으로 반응시켜 효소반응을 유발시켜 정량 하는 magnetic particle법, 항체결합 latex particle을 이용한 latex particle법 등이 있다. In the diagnostic method of the present invention, the detecting step directly detects the presence of the biomarker metabolite from the blood of the individual through NMR or HPLC, or the biomarker metabolite through antigen antibody reaction by contacting the blood with the antibody of the present invention. Indirectly checking for the presence of Currently known immunoassay as an antigen antibody reaction, enzyme immunoassay (ELISA, Coated tube), antibody-bound magnetic particles are bound to a tube, and then antigen-tracer and refractory contaminants are reacted competitively to induce enzymatic reaction. Magnetic particle method, latex particle method using antibody bound latex particle.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오 마커인 대사산물에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 진단 키트를 제공한다.In order to achieve the another object of the present invention, the present invention provides a diagnostic kit for diabetic nephropathy comprising an antibody that specifically binds to the metabolite that is a biomarker of the present invention as an active ingredient.
본 발명의 진단키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함한다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes)등에 의해 표지화될 수 있다.Diagnostic kits of the present invention are prepared by conventional methods known to those skilled in the art, and typically include lyophilized antibodies, buffers, stabilizers, inactive proteins and the like. The antibody can be labeled by radionuclides, fluorescors, enzymes and the like.
본 발명의 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 당뇨병성 합병증 검출 스펙트럼을 갖는 단백질칩 개발에도 이용될 수 있다.Monoclonal antibodies of the present invention can be used in a variety of immunoassay kits (ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor), as well as various diabetic through the development of antibodies showing higher specificity and sensitivity It can also be used to develop protein chips with a complication detection spectrum.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1: 시료준비 (Sample preparation)Example 1: Sample preparation
고려대학교 구로 병원에서 제공한 건강인, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 신증 환자의 혈청 미세알부민뇨 수치를 기준으로 나누어서 실험을 하였다. 정상 환자(healthy control)의 수는 13명이며, 제2형 당뇨병 환자(normoalbuminuric patients)와 미세단백뇨를 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자(microalbuminuric patients)의 수는 각각 10명이다. The experiments were divided based on serum microalbuminuria levels in healthy patients,
병원에서 얻은 혈청은 4℃, 4,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액 400 ㎕를 취하여 초여과를 행한다. 초여과는 Nanosep 3K omega membrane(Pall Corp., MI, USA)를 사용하였으며, 4℃, 20,000 × g에서 1시간 동안 실시한다. 얻어진 혈청 용액에서 275 ㎕를 취하여 5 mM DSS와 100 mM 이미다졸을 포함하는 D2O 용액 31 ㎕를 첨가하며, 이후 핵자기공명 분석을 위하여 10% D2O를 포함하는 증류수를 200 ㎕ 첨가한다. 이후 pH를 6.8로 조정하여 1H-핵자기공명 분석을 한다.The serum obtained in the hospital is centrifuged at 4,000 x g for 10 minutes at 4 ° C, and then 400 µl of the supernatant is filtered. Ultrafiltration was performed using Nanosep 3K omega membrane (Pall Corp., MI, USA), it is carried out at 4 ℃, 20,000 × g for 1 hour. Take 275 μl of the obtained serum solution, add 31 μl of a D 2 O solution containing 5 mM DSS and 100 mM imidazole, and then add 200 μl of distilled water containing 10% D 2 O for nuclear magnetic resonance analysis. . The pH is then adjusted to 6.8 for 1 H-nuclear magnetic resonance analysis.
실시예 2: Example 2: 1One H-핵자기공명 분석H-nuclear magnetic resonance analysis
각 준비된 혈청 시료들은 Bruker Avance 500 MHz 핵자기공명 장치(Bruker Biospin, Karlsruhe, Germany)를 이용하여 noesypresat으로 분석을 행한다.Each prepared serum sample is analyzed by noesypresat using a Bruker Avance 500 MHz nuclear magnetic resonance apparatus (Bruker Biospin, Karlsruhe, Germany).
실시예 3: PLS-DA 분석Example 3: PLS-DA Analysis
1H-핵자기공명분광법을 통해 얻어진 자료는 ChenomX NMR suite 4.6으로 각 혈청 내의 대사산물을 정량하며, SIMCA-P+ 프로그램(Umetrics, Sweden)으로 PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysi) 분석을 실행한다. 도 1a와 1b는 정상 환자, 제2형 당뇨병 환자, 미세단백뇨를 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자의 혈액에 있는 대사산물들에 대한 PLS-DA 모델이다.Data obtained through 1 H-nuclear magnetic resonance spectroscopy were used to quantify metabolites in each serum with ChenomX NMR suite 4.6, and perform partial Least Squares Discriminant Analysi (PLS-DA) analysis with the SIMCA-P + program (Umetrics, Sweden). . 1A and 1B are PLS-DA models of metabolites in the blood of normal patients,
상기와 같이 1H-핵자기공명분광법을 수행한 결과, 다음과 같이 제2형 당뇨병 환자에서 보다 미세단백뇨를 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자에서의 혈청에서 양이 증가하는 대사산물들이 동정되었다. 도 2a 내지 도 2c는 정상 환자, 제2형 당뇨병 환자, 미세단백뇨를 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자의 혈액의 500 MHz 1H-핵자기공명 스펙트럼이다. 상기 스펙트럼에 기초하여, 각종 아미노산 및 유기산 등 총 46개의 저분자량 화합물들이 동정되었다. 이들 중에서, 당뇨병 환자와 당뇨병성 신증 환자사이에 상당한 차이를 보이는 15개의 대사산물들이 당뇨병성 신증의 바이오 마커로 선택되었다. 도 3은 제2형 당뇨병 환자의 혈액에서 보다 미세단백뇨를 가지고 있는 제2형 당뇨병성 신증 환자의 혈액에서 증가한 대사산물의 상대적인 강도를 나타낸 결과이다. 가장 흥미있는 대사산물은 질병의 진행에 따라 급격한 증가를 나타내는 메틸구아니딘(methylguanidine)이었다. 상기 메틸구아니딘은 정상환자에 비하여 제2형 당뇨병 환자군에서 약 5배의 증가와 제2형 당뇨병성 신증 환자군에서 약 14배의 증가를 보여주었다.As a result of performing the 1 H-nuclear magnetic resonance spectroscopy, metabolites whose amounts were increased in serum in patients with
제2형 당뇨병 환자군와 미세단백뇨를 가진 제2형 당뇨병성 신증 환자군을 대상으로 1H-핵자기공명분광법을 수행한 결과 15개의 농도가 증가한 대사산물을 찾을 수 있었다(도 3). 각 대사산물의 증가량은 아래 표 1과 같다. 표 1에서 Vol. 증가는 정상환자와 비교하여 증가된 비율을 나타낸 것이다.As a result of performing 1 H-nuclear magnetic resonance spectroscopy on the
[표 1]TABLE 1
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 결과로 얻어진 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행에 의해 농도가 증가한 대사산물 15개는 당뇨병성 신증의 조기진단 및 질병의 정도를 판단할 수 있는 바이오마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 바이오 마커 대사산물은 당뇨병성 신증환자의 혈액에서 측정할 수 있으며, 당뇨병에서 당뇨병성 신증으로의 진행을 미리 예견하고 파악할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오마커 대사산물을 기초로 제조된 진단키트에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 바이오 칩 개발에 이용될 수도 있다.As described above, the fifteen metabolites whose concentration is increased by the early diagnosis and progression of diabetic nephropathy in the diabetes obtained as a result of the present invention can be used as a biomarker to determine the early diagnosis and degree of disease of diabetic nephropathy. Can be. The biomarker metabolite of the present invention can be measured in the blood of diabetic nephropathy and can predict and identify the progression from diabetes to diabetic nephropathy in advance. In addition, it can be used not only for the diagnostic kit prepared based on the biomarker metabolite of the present invention, but also for the development of a biochip exhibiting higher specificity and sensitivity.
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