KR20080109415A - 생체 성장 호르몬의 주사형 서방출 제형 제조용 수화젤 및 이로부터 얻어진 주사형 서방출 제형 - Google Patents

생체 성장 호르몬의 주사형 서방출 제형 제조용 수화젤 및 이로부터 얻어진 주사형 서방출 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 성장호르몬과 결합력을 가진 생체활성 다당류 기반 수화젤, 및 이를 이용하여 얻어진 주사형 서방형 약물전달제제에 관한 것으로, 인간 또는 동물의 성장 호르몬을 생물학적 활성이 유지된 상태로 지속적이고 균일하게 방출시킬 수 있도록 해 주고, 이러한 서방형 제제로 인하여 주사 부위에 최소의 손상을 주면서, 국소적 약물 전달을 가능케 할 뿐 아니라 약물의 초기 방출을 현저히 감소시킬 수 있는 수화젤 (hydrogel)을 제공할 수 있다.
의료용 고분자, 다당류, 서방형 약물전달제제, 성장호르몬, 수화젤

Description

생체성장호르몬과 결합하는 다당류 기반 수화젤, 및 이를 이용하여 얻어진 서방형 약물전달제제 {Polysaccharides-Based Hydrogel Interacting with Growth Hormones and its Application as an Injectable Sustained Release System}
도 1은 헤파린기반 수화젤 및 PEG기반 수화젤의 이상적인 망상 구조를 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 유변특성측정장치 (Rheometer)를 통하여 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 (Polyethylene glycol, PEG) 기반의 수화젤의 농도에 따른 탄성계수를 비교하여 나타낸 그래프이고, (a)는 시간대비, (b)는 주파수대비 강도 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 RasMol 소프트웨어를 이용하여 hGH 구조를 모델링한 사진으로서, (a) 는 hGH의 기본 아미노산 잔기 (8개의 리신, 10개의 아르기닌 그리고 3개의 히스티딘 잔기)이고, (b)는 표면-노출된 전하를 띤 잔기이다.
도 4는 헤파린 컬럼을 사용하여 소혈청알부민 (BSA), 라이소자임 (lysozyme) 그리고 인간 성장 호르몬 (hGH)이 헤파린과의 친화도를 헤파린 컬럼을 이용하여 측정한 것을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 인간 성장 호르몬과 전구체 총량과의 다양한 질량비 (hGH:polymer=1:10, 1:5, 1:2.5)에 따른 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤로부터 방출되는 모델 단백질인 인간 성장 호르몬의 누적 방출량(%)을 비교한 그래프이고,
도 5b는 헤파린의 카르복실기 (COOH)가 싸이올기 (SH)로 변형된 정도 (heparin thiolation 20, 30, 40, 50%)에 따른 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤로부터 방출되는 모델 단백질인 인간 성장 호르몬의 누적 방출량(%)을 비교한 그래프이다.
도 6은 크기배제컬럼 (size exclusion column)을 사용하여 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤로부터 방출되는 인간 성장 호르몬의 안정성을 단량체 형태 (monomeric form)의 보존 정도에 따라 비교한 그래프이다.
본 발명은 생체 성장호르몬를 둘러쌀 수 있는 다당류 기반 수화젤, 및 이를 이용하여 얻어진 서방형 약물전달제제에 관한 것으로, 생분해성이면서 생체적합성인 고분자를 사용하여 생체 내에서 성장 호르몬이 생물학적 활성을 유지하면서, 지속적이고 균일하게 체내로 방출될 수 있도록 캡슐화된 서방형 약물전달제제에 관한 것이다.
신규한 수화젤 기반 운반 시스템들이 제어된 약제 운반 및 조직 공학을 포함 하여 많은 생물 의학적 적용처에 유용하다. 이 중에서, 주사형 수화젤 배합은 외과 수술 시간을 줄이고, 근육 수축의 손상을 최소화하고, 상처와 수술 후 고통을 저감시켜 비용 효율적인 방법으로 신속한 회복을 가능케 한다. 치료학적 단백질/펩티드와 같은 생체 거대분자와 세포를 운반하기 위하여, 주사형 배합물에 사용되는 화학적 혹은 물리적 겔화는 생체 분자의 존재 하에서 형성될 수 있는 방법을 사용한다.
이러한 치료학적 단백질의 서방성 시스템의 개발에 있어서 주된 문제점중의 하나는 단백질 약물이 그 원형을 보존하도록 하는 것으로, 이는 일반적으로 단백질 분해/가수분해 감퇴로 인한 단백질 약제의 불안정성에 의해서 생체 내 ( in vivo) 반감기가 짧다. 또한, 신장을 통한 신속한 clearance를 가지게 되므로 치료학적 활성 농도를 유지하기 위해서는 여러 번의 주사 (환자 적응성을 저감시킬 수 있음) 혹은 투여량 증가 (국부 독성을 유도하여 심각한 대사 면역 반응을 일으킬 수 있음)를 필요로 하게 된다. 적은 분자량 소수성 약제와는 반대로, 단백질의 3차원 구조는 전달체 제조시 접촉된 외부 저항 (예를 들어, 온도, pH 혹은 유기 용매)에 의해서 쉽게 망가져 단백질의 탈아미드화, 산화, 변성 혹은 응집을 일으키게 되고, 이는 차례로 단백질의 생화학적 불활성, 나아가 면역 반응을 일으킬 수도 있다. 예를 들어, 폴리락타이드-글라이콜라이드 공중합체 poly(lactide-co-glicolide) (PLGA) 미세입자는 적은 분자량의 소수성 약제의 서방출 시스템으로 널리 사용되어 오고 있지만, 상기와 같은 단백질 약물에 적용되었을 때에는 단백질 약물의 변형으 로 인한 많은 문제점을 보여주고 있다.
한편, 인간 성장 호르몬 (hGH)은 분자량이 대략 22 kDa인 191 아미노산으로 이루어진 단백질로서 뼈 성장을 촉진하고, 단백질, 지질 및 탄수화물 대사 규제에 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 상기 hGH는성장 호르몬 결핍, Turner 증후군 혹은 만성 신장병에 의해 야기되는 발육이 늦은 아이들을 치료하는데 사용되었으며, 또한 성인에게는 성장 호르몬 대체 요법으로 적용되고 있다. 기존의 hGH 투여는 수년간 매일 혹은 일주일에 3회 간격으로 피하 주사하므로, 반감기가 짧고, 신장 독성을 유발하거나 반복 주사를 요하는 등 많은 문제점을 갖고 있다. 따라서, hGH는 서방성 약물 전달체의 개발에 있어 주된 타겟이 되어 왔다. 서방성 약물 전달체를 만들기 위한 기존 접근 방법으로는 hGH를 PEG로 직접 개질시켜 clearance의 비율을 감소시키거나 생분해성 미세 입자에 포집하여 hGH의 점진적인 방출을 가능케 한다. 후자의 경우 PLGA 혹은 poloxamer-관련 시스템을 사용하여 구형 혹은 수화젤 타입으로 물리적으로 만들어진 전달체내로 hGH를 캡슐화하는데 초점이 맞춰지므로 hGH의 서방성은 전달체 기질과의 상호작용이 아닌 생분해성 기질로부터 확산/분해에 의해 달성되게 된다. 그러나, 이 같은 시스템은 의학적 요구에 완전히 부합하지 못하고 있다. 특히, 이중 에멀젼 방법에 의해 제조된 PLGA 미세입자로부터 단백질을 방출하는 경우는, 방출패턴이 초기방출이 매우 크고, 그 후로 불완전한 방출로 이어지게 된다. 또한, 공정 중 생성되는 수성/유기 계면에서 더해진 단백질의 변성 및 응집이 일어나게 된다. 최근, PLGA 미세 입자를 이용한 전달체 (Nutropin Depot ⓡ)는 hGH 결핍 아이들을 치료하기 위해 US FDA로부터 승인을 받았다. 그러나, 임상 연구에서 이를 이용하여 치료받은 아이들로부터 매일 hGH 주사치료를 받은 아이들보다 성장 속도가 늦고 증가된 항-hGH 항체 반응을 보이는 것이 관찰되었는데, 이는 아마도 높은 초기 방출뿐만 아니라 사용된 생분해성 재료로부터 유도된 염증에 기인한 것으로 여겨진다.
관련 종래 기술로서 대한민국 특허출원 10-2001-0042196호 (발명의 명칭:인간성장호르몬의 지속적인 방출이 가능한 생분해성 약학적 조성물 및 미립구 제형)에는 인간 성장 호르몬의 서방출을 위해서 생분해성 고분자 미립구 제형, 미세 입자 제형, 수화젤 제형들이 담체 내에서 확산과 담체의 분해 혹은 용해에 의해서 방출하는 내용이 개시되어 있다. 그러나 초기 과다한 방출의 문제를 해결하지 못하는 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 종래의 성장 호르몬의 전달체가 가지는 기술적 문제점들을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 생체고분자와 성장 호르몬사이에 작용하는 인력을 이용하여, 수화젤을 성장 호르몬의 서방형 전달시스템으로 개발함으로써, 이 단백질 약물(성장 호르몬)의 안정화를 효과적으로 이룰 뿐 아니라 초기 방출을 줄이고, 단백질 약물의 서방출을 유도하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 이식 부위에 손상은 최소화하면서 손쉽게 체내에 주사할 수 있고 단백질 약물의 안정성 및 서방출에도 효과가 뛰어난 다당류 기능화된 수화젤을 제공하려는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 수화젤 내에 둘러싸여 초기 방출을 크게 줄일 수 있는 캡슐화된 서방성 약물전달제제를 제공하려는데 있다.
본 발명의 제1견지에 의하면,
(1) Michael-type 첨가 반응이 가능한 작용기를 가지고 있고, (2) 다당류(Polysaccharides)를 기반으로 단백질 약물을 서방출시킬 수 있는 생체활성 다당류 기반 수화젤이 제공된다.
본 발명의 제2견지에 의하면,
(1) Michael-type 첨가 반응이 가능한 작용기를 가지고 있고, (2) 생체적합성 고분자와 다당류(Polysaccharides)를 기반으로 단백질 약물을 서방출시킬 수 있는 생체활성 다당류 기반 수화젤이 제공된다.
본 발명의 제3견지에 의하면,
상기 제1 또는 제2 견지에 의한 다당류 기반 수화젤; 및 유효량의 생체 성장 호르몬을 포함하는 서방형 약물전달시스템으로서,
상기 생체 성장 호르몬은 상기 수화젤에 잡힌(entrap) 형태를 갖고, 수화젤 구성물질과의 결합력에 의해서 서방출되는 것을 특징으로 하는 주사형 서방형 약물전달제제가 제공된다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명에서는 (1) Michael-type 첨가 반응이 가능한 작용기를 가지고 있고, (2) 다당류 (Polysaccharides)를 기반으로 단백질 약물을 서방출시킬 수 있는 수화젤을 제공한다.
상기 수화젤은 생체 성장호르몬과 결합력을 갖는 생체활성 다당류를 포함하여 이루어진다.
본 발명에서 천연 다당류는 성장 호르몬과 상호작용을 하며, 이를 통해 성장 호르몬의 3차원 구조를 유지하고 생물학적 활성을 증가시키며 가수분해를 저해하여 호르몬을 안정화시키는 역할을 하는 모든 다당류가 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용가능 한 다당류의 대표적인 예에는, 아래 화학식 1의 싸이올 작용기를 가지는 헤파린, 히아루론산, 키토산, 알지네이트 또는 이들이 조합이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 그 중에서도 본 발명의 모델 단백질인 인간 성장호르몬과 약한 결합력을 가지며 또한 생체 내 독성이 없는 것으로 미국 FDA가 승인한 음이온성 다당류인 헤파린을 사용하는 것이 바람직하다.
Figure 112007042730658-PAT00001
본 발명에서 이용가능한 생체활성 다당류는 헤파린 (Heparin), 히아루론산 (Hyaluronic acid), 키토산 (Chitosan), 덱스트란 (Dextran), 알지네이트 (Alginate), 콘드로이틴 설페이트 (Chondroitin Sulfate) 등의 천연 다당류에서 선택된 1종 이상의 물질을 기반으로 수화젤을 형성한다.
보다 구체적으로는 선택된 1종 이상의 다당류들은 아크릴레이트 (Acrylates), 다이아크릴레이트 (Diacrylates), 올리고아크릴레이트 (Oligoacrylates) 등에서 선택된 작용기;와 멀티싸이올 (multi-thiol) 작용기;로 각각 기능화되며, 상기 작용기들 간 Michael-type 첨가 반응에 의해 수화젤이 형성되어 생체 성장 호르몬을 서방출시키게 된다.
특히, 헤파린 기반으로 제조하게 되면 인간 성장 호르몬과 약한 결합 능력을 지니고 약물에 대하여 변성이나 비가역적 응집 현상이 없이 그들의 활성 구조를 유지시키면서 초기 약물방출을 크게 줄여 서방출을 증진하게 된다.
이때 생체 성장 호르몬은 이에 한정하는 것은 아니나, 인간 성장 호르몬 또 는 동물 성장 호르몬을 포함하는 의미이다.
또한, 본 발명에서는 (1) Michael-type 첨가 반응이 가능한 작용기를 가지고 있고, (2) 생체적합성 고분자와 다당류(Polysaccharides)를 기반으로 단백질 약물을 서방출시킬 수 있는 생체활성 다당류 기반 수화젤을 제공한다.
상기 수화젤은 (1) 아크릴레이트 (Acrylates), 다이아크릴레이트 (Diacrylates), 올리고아크릴레이트 (Oligoacrylates) 등에서 선택된 작용기와 멀티싸이올 (multi-thiol) 작용기를 갖는 두 가지 이상의 구성성분으로 이루어진다.
상기 구성성분은 천연 다당류와 생체적합성을 갖는 합성 고분자 물질로 이루어진다. 구체적으로 천연 다당류는 이에 한정하는 것은 아니나, 상술한 바와 같이, 헤파린 (Heparin), 히아루론산 (Hyaluronic acid), 키토산 (Chitosan), 덱스트란 (Dextran), 알지네이트 (Alginate), 콘드로이틴 설페이트 (Chondroitin Sulfate) 등에서 선택가능하다.
특히, 헤파린 기반으로 제조하게 되면 인간 성장 호르몬과 약한 결합 능력을 지니고 약물에 대하여 변성이나 비가역적 응집 현상이 없이 그들의 활성 구조를 유지시키면서 초기 약물방출을 크게 줄여 서방출을 증진하게 된다.
또한, 본 발명에 있어서, "생체적합성 고분자"는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 (Tissue compatibility) 및 항응혈성 (Blood compatibility)을 갖추고 있는 고분자를 의미한다.
본 발명에서 사용가능 한 생체적합성 고분자이며, Michael-type 첨가 반응을 통해서 가교가 가능한 작용기를 가지고 있는 고분자의 대표적인 예에는 화학식2의 다이아크릴레이트 폴리에틸렌 글라이콜 (Diacrylated polyethylene glycol) (이하, ‘PEGDA’）을 이용하였으나, 이에 한정되지 않는다.
Figure 112007042730658-PAT00002
본 발명에서 이용가능한 생체적합성을 갖는 합성 고분자 물질로는 폴리에틸렌 글라이콜 (Polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드 (Polyethylene oxide), 폴리비닐 알코올 (Polyvinyl alcohol) 혹은 생체적합성을 가지는 다른 합성 고분자중에서 선택된 1종 이상,으로 이루어지는 것으로, 특히 주변의 단백질과 반응하지 않는 종류를 사용하는 것이 바람직하다.
상술한 천연 다당류와 생체적합성을 갖는 합성 고분자 물질 등의 구성성분들은 상술한 작용기로 각각 기능화 시켜 Michael-type 첨가 반응에 의해 수화젤을 제조하여 생체 성장 호르몬의 서방출을 제공하게 된다.
좀더 구체적으로는, (1) 아크릴레이트 (Acrylates), 다이아크릴레이트 (Diacrylates), 올리고아크릴레이트 (Oligoacrylates) 등의 작용기를 가지는 물질과 멀티싸이올 (multi-thiol) 작용기를 가지고 있는 물질과의 반응에 의해서 젤화가 형성되고, (2) 헤파린 (Heparin), 히아루론산 (Hyaluronic acid), 키토산 (Chitosan), 덱스트란 (Dextran), 알지네이트 (Alginate), 콘드로이틴 설페이트 (Chondroitin Sulfate) 등의 다당류에서 선택된 하나 이상의 물질을 기반으로 수화젤을 형성하고, 가교 링커(crosslinker)로서는 이러한 다당류외에, 폴리에틸렌 글라이콜 (Polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드 (Polyethylene oxide), 폴리비닐 알코올 (Polyvinyl alcohol) 혹은 생체적합성을 가지는 다른 합성 고분자중에서 하나 이상을 기능화 시켜서 수화젤을 제조하여 인간 혹은 동물 성장 호르몬의 서방출을 제공한다.
이때 생체 성장 호르몬은 이에 한정하는 것은 아니나, 인간 성장 호르몬 또는 동물 성장 호르몬을 포함하는 의미이다.
한편, 본 발명에서 사용된 "결합 능력"은 본 발명에 따른 단백질 약물 및 다당류 간에만 특이적으로 결합하여 생체조건에서 상대적으로 안정한 상태의 복합체를 형성하는 물리적 결합을 의미한다. 특히, 단백질의 3차원 구조를 유지하고 생물학적 활성을 증가시키며 가수분해를 저해하여 단백질을 안정화시키는 다당류-단백질 간의 상호작용을 포함하는 개념이다.
나아가, 본 발명에 따르면, 이 같이 제조된 다당류 기반 수화젤과 유효량의 생체 성장 호르몬을 포함하는 서방형 약물전달시스템을 제공할 수 있다.
이때 상기 생체 성장 호르몬은 상기 수화젤과 화학적 결합을 하지 않고 수화젤로 잡힌(entrap) 형태를 갖는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 상기 생체 성장 호르몬은 인간의 재조합 성장 호르몬 또는 동물의 재조합 성장 호르몬을 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 서방성 제제에 따르면, 주사형으로 주입할 수 있어 이식 부위에 손상은 최소화하면서 손쉽게 체내에 이식할 수 있고 단백질 약물의 안정성 및 서방출에도 효과가 뛰어나며 특히 약물의 초기방출을 크게 줄일 수 있는 이점을 갖는다. 또한, 이 같은 서방성 제제는 활성이 유지되는 단백질 약물 충진법 개발과 지속성 단백질 약물 전달 시스템 개발에도 유용하게 응용될 수 있는 것이다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니다.
참고로, 하기 실시예에서 사용하는 물질들에 대한 구체적인 정보는 다음과 같다.
헤파린 (돼지의 장 점막으로부터 나트륨염, Mw 12 kDa)은 Cellsus사 (Cincinnati, Ohio, US)로부터 구입하였다. 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEG-DA, Mw 3.4 및 6 kDa, 98%) 및 4작용성 폴리(에틸렌 글리콜)　(PEG-SH4 Mw 10 kDa)은 SunBio사 (Anyang City, Korea)로부터 구입하였다.
포타슘 포스페이트 일염기성, 소디움 포스페이트 이염기성, 소디움 아자이드 및 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄은 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 소디움 클로라이드와 포타슘 클로라이드는 Merk사 (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다.
0.05 % NaN3를 갖는 PBS (포스페이트 완충 염수, 0.138 mol/L NaCl 및 0.0027 mol/L KCl를 갖는 0.1 mol/L PBS 용액, pH = 7.4)는 포타슘 포스페이트 일염기성과 소디움 포스페이트 이염기성으로 제조하였다. 리소좀은 Sigma사로부터 획득하였고, 소 혈청 알부민은 AMRESCO사 (Solon, Ohio, USA)로부터 획득하였다. 인간 성장 호르몬(hGH)은 LG Biotech사(Seoul, Korea)로부터 기증받았다.
모든 화학품들은 추가 정제없이 사용하였다. 멸균 실린지 필터는 Whatmanⓡ（Florham Park, New Jersey, USA） 0.2 μm 제품을 사용하였다.
실시예
실시예 1: 헤파린 기반의 수화젤 제조
도 1에 도식적으로 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조된 수화젤은 모두 Michael-type 첨가 반응에 의해서 형성되었다. 먼저 다이아크릴레이트 폴리에틸렌 글라이콜 (이하, 'PEGDA' 분자량 6 kDa)을 포스페이트 버퍼 살린 (Phosphate buffer saline) 용액에 충분히 녹였다. 그리고 각각의 작용기들 (아크릴레이트 작용기와 싸이올 작용기)이 1:1 몰 비율로 가교되게 하기 위해서 싸이올 작용기를 가지고 있는 헤파린 (Thiol-functionalized heparin) (이하, 'Hep-SH', 싸이올화 정도: 40%, 분자량 12 kDa)에 이미 녹여져 있는 다이아크릴레이트 폴리에틸렌 글라이콜 반응 용액을 첨가하여 함께 녹였다. 이렇게 제조된 최종 반응 용액의 농도는 10.0, 15.0%(w/v)였고 pH는 7.4를 나타내었으며 반응 용액은 37℃ 조건 하에서 10분 이내에 수화젤을 형성하였다.
비교예 1: 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤 제조
실시예 1에서 제조된 헤파린 기반의 수화젤의 구조적인 특징, 즉 가교된 사슬의 평균 분자량이 비슷한 수화젤을 제조하기 위해서 다이아크릴레이트 폴리에틸렌 글라이콜(이하, 'PEGDA' 분자량 3.4 kDa)과 테트라썰프하이드릴 폴리에틸렌 글라이콜 (Tetra-functional polyethylene glycol) (이하, 'PEG-SH4', 분자량 10 kDa)이 선택되었다. 헤파린 기반의 수화젤 제조방법과 같은 방법에 의해서 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤을 제조하였다.
실시예 2: 모델 단백질 인간 성장 호르몬이 충진 된 헤파린 기반의 수화젤 제조
다이아크릴레이트 폴리에틸렌 글라이콜과 싸이올 작용기를 지닌 헤파린을 섞어 최종 농도가 10.0, 15.0 %(w/v)가 된 최종 반응 용액에 모델 단백질 인간 성장 호르몬과 전구체 질량비가 1:10이 되도록 인간 성장 호르몬 1mg을 충진하고 부드럽게 섞어준 후 37℃ 조건 하에 놓아두면 10분 이내에 인간 성장 호르몬이 충진 된 헤파린 기반의 수화젤을 제조할 수 있었다.
비교예 2: 모델 단백질 인간 성장 호르몬이 충진 된 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤 제조
실시예 2에서 인간 성장 호르몬을 충진하는 같은 방법으로 인간 성장 호르몬이 충진 된 폴리에틸렌 글라이콜 수화젤을 제조하였다.
실험예 1: 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의수화젤의 탄성계수 비교 측정
유변특성측정장치(Rheometer; Gemini, Malvern Instrument, England)를 사용하여 10.0, 15.0%(w/v) 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤의 탄성계수를 측정하였다. 실시예 1, 비교예 1에서 제조된, 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤의 최종 반응 용액 100㎕를 샌드블라스트 평형플레이트(Sandblast parallel plate; 직경 15mm) 위에 올려 놓고, 37℃, 500㎛ 갭(Gap), 프리퀀시(Frequency) 1rad/s 에서 0.1%의 변형(Strain)을 가하여 수화젤의 탄성계수(Elastic modulus, G'(Pa))의 변화를 비교하였다.
도 2(a)에서 나타낸 바와 같이, 같은 농도의 수화젤인 경우 탄성계수가 거의 비슷하였으며, 이 실험 결과를 바탕으로 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤의 미세 구조적 특성, 즉 유효한 망사크기 (mesh size)가 거의 비슷하다는 것을 확인하였다.
한편, RasMol 소프트웨어를 이용하여 hGH 구조를 모델링한 사진을 도 3에 나타내었다. 도 3(a) 는 hGH의 기본 아미노산 잔기 (8개의 리신, 10개의 아르기닌 그리고 3개의 히스티딘 잔기)이고, 도 3(b)는 표면-노출된 전하를 띤 잔기를 나타낸다.
실험예 2: 다양한 단백질에 대한 헤파린과의친화도 비교 측정
헤파린 친화도 크로마토그래피 (Heparin affinity chromatography)는 헤파린과 친화도가 큰 라이소자임(Lysozyme)과 헤파린과 친화도가 전혀 없는 소혈청알부민 (BSA)과 비교해서 인간 성장 호르몬이 헤파린과 친화도가 있는지를 확인하기 위해서 활용되어졌다. 250㎍/mL의 농도를 가지는 소혈청알부민, 헤파린, 라이소자임은 헤파린이 충진되어 있는 컬럼 (AFpak AHR-894 affinity column; 8.0 mmID 〉50 mmL, Shoko, Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 헤파린과의 친화도 정도를 측정하였다. 이동상으로서, 이동상 A로는 멸균되고 이온이 제거된 물 (sterilized de-ionized water)이 사용되었고 이동상 B로는 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) with 300 mM NaCl이 사용되었다. 이동상은 시간 프로그램에 의해서 단계별로 점진적으로 salt의 농도를 증가시킬 수 있었으며 (10 분 후 10 % B, 20.00 분 후 20 % B, 30 분 후 50 % B, 그리고 40 분 후 100 % B), 0.2 mL/min의 유속으로 40분 동안 샘플들을 220 nm의 파장영역에서 측정하였다.
도 4는 이러한 헤파린 친화도 실험의 결과로서 보유시간 (Retention time)이 길수록 헤파린과의 친화도가 크다는 것을 나타낸 그래프이다. 이미 헤파린과 친화도가 크다는 것이 잘 알려져 있는 라이소자임 경우 예상대로 보유시간이 가장 길었다. 그리고 도 4에서 주목할 만한 점은 소혈청알부민과 인간 성장 호르몬을 비교했을 때 인간 성장 호르몬이 소혈청알부민 보다 더 늦게 검출되는 것을 확인할 수 있었으며, 이것으로부터 인간 성장 호르몬이 헤파린과 약한 결합력을 가지고 있어 헤파린 기반의 수화젤이 인간 성장 호르몬의 서방출에 기여할 수 있다는 것을 확인하였다.
실험예 3: 수화젤로부터 방출되는 인간 성장 호르몬의 누적 방출량(%) 비교 측정
상기 실시예 2, 비교예 2에서 제조된 인간 성장 호르몬이 충진된 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤에 대해서 단백질 약물의 서방출 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같은 시험관 내(in vitro) 조건으로 방출양상을 비교 측정하였다.
인간 성장 호르몬이 충진 된 최종 반응용액을 15mL centrifuge tube에 주사 한 후, 완전한 수화젤을 형성시키기 위해 37℃에서 2시간 동안 보관하고, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4, with 0.05 % NaN3) 용액을 이용하여 방출된 인간 성장 호르몬을 회수하고 그 양을 Micro BCA 단백질 정량법을 이용하여 정량 하였다. 인간 성장 호르몬 회수에 사용되는 PBS 용액은 회수 시마다 새로운 PBS 용액으로 교체되었고 단백질 정량 시까지 샘플은 ―80℃에서 보관되었다.
도5a는 인간 성장 호르몬과 전구체 총량과의 다양한 질량비 (hGH:polymer=1:10, 1:5, 1:2.5)에 따른 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤로부터 방출되는 인간 성장 호르몬의 누적 방출량(%)을 비교한 그래프이다. 도5a에서 나타낸 바와 같이, 질량비 1:5, 10.0%(w/v)로 조제된 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤의 경우, 일주일 이내에 인간 성장 호르몬 충진량의 거의 100%가 방출되었다. 반면, 10.0%(w/v) 헤파린 기반의 수화젤은 질량비에 상관없이 20일 이후까지 방출이 진행되었다. 여기서 주목할 만한 점은 인간 성장 호르몬의 충진량이 전구체 총량에 비해 많아 질수록, 즉 질량비가 1:10에서 1:2.5로 갈수록 인간 성장 호르몬의 용해도가 감소하게 된다. 따라서 수화젤을 통해 인간 성장 호르몬이 방출될 때 용해도가 낮아 녹지 않은 인간 성장 호르몬의 경우 수화젤에서 녹여진 후 방출되어야 하는, 즉 두 단계를 걸쳐 방출되기 때문에 1:10 질량비에 비해서 1:2.5 질량비로 조제된 헤파린 기반의 수화젤에서 좀 더 천천히 방출되는 것을 확인하였다.
도 5b는 헤파린의 카르복실기 (COOH)가 싸이올기 (SH)로 변형된 정도 (heparin thiolation 20, 30, 40, 50%)에 따른 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤로부터 방출되는 인간 성장 호르몬의 누적 방출량(%)을 비교한 그래프이다. 도 5b에서 나타낸 바와 같이, 질량비 1:10, 10.0%(w/v)로 조제된 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤의 경우, 일주일 이내에 인간 성장 호르몬 충진량의 거의 100%가 방출되었다. 반면, 10.0%(w/v) 헤파린 기반의 수화젤 모두는 20일 이후까지 방출이 진행되었다. 싸이올화 정도가 큰 헤파린을 사용하여 수화젤을 제조한 경우, 가교 정도가 크기 때문에 수화젤의 강도가 커지며 또한 수용액 환경에서 부풀어 오르는 능력이 감소하게 된다. 따라서 20%로 싸이올화된 헤파린을 사용하여 수화젤을 만드는 것보다 50%로 싸이올화된 헤파린을 사용할 경우, 인간 성장 호르몬의 방출이 좀 더 천천히 진행되는 것을 확인하였다.
실험예 4: 수화젤로부터 방출된 인간 성장 호르몬의 안정화 효과 관찰
실시예 2, 비교예 2에서 제조된 인간 성장 호르몬이 충진 된 수화젤로부터 방출된 인간 성장 호르몬의 안정화 효과를 다음과 같이 관찰하였다. 우선, 수화젤로부터 방출된 인간 성장 호르몬을 회수하였다. 회수된 인간 성장 호르몬은 수용액 크기배제컬럼 (Aqueous size exclusion PROTEIN KW-800 Series column (SEC, 8.0 mmID 〉300 mmL, Shoko, Co., Tokyo, Japan))을 통해서 인간 성장 호르몬의 구조적 보전성, 즉 안정화 효과에 대해 분석되었다. 이동상으로서 10mM 포스페이트 버퍼 (Phosphate buffer with 30mM of NaCl)가 사용되었고 1mL/min의 유속과 220nm 파장영역의 조건에서 방출된 인간 성장 호르몬이 분석되었다.
도 6은 이러한 안정화 효과에 관한 실험 결과로서 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤로부터 방출되는 인간 성장 호르몬의 안정성을 단량체 형태 (monomeric form)의 보전 정도에 따라서 비교한 그래프이다. 도 6에 나타낸 바와 같이 소혈청알부민 (BSA, 분자량66 kDa)보다 분자량이 작은 인간 성장 호르몬 (hGH, 분자량 22 kDa)이 좀 더 늦게 검출 되었다. 그리고 일부러 변형시킨 인간 성장 호르몬 (denatured hGH)과 본래의 인간 성장 호르몬 (native hGH)을 비교했을 때, 일부러 변형시킨 인간 성장 호르몬에서 이량체 이상의 형태 (dimeric form)가 확인되었다. 이것을 바탕으로 수화젤로부터 방출된 인간 성장 호르몬의 안정화 효과를 비교하였는데 헤파린 기반의 수화젤과 폴리에틸렌 글라이콜 기반의 수화젤로부터 방출된 인간 성장 호르몬 모두 이량체 형태의 발생 정도가 2% 미만인 것으로부터 충진된 단백질이 안정화됨을 확인하였다.
결론적으로, 본 발명에 의해 제공된 서방성 제제는 헤파린 기반의 수화젤 내에 충진 된 단백질이 그 활성을 유지하며 방출되었고, 헤파린과의 결합 능력은 대상 단백질 약물의 서방출을 유도하였음을 확인할 수 있다. 또한 이러한 서방성 제제는 생체 내에 최소의 손상을 주며 주사 가능한 것이다.
본 발명에 의한 서방성 제제에 따르면, 이식 부위에 손상은 최소화하면서 손쉽게 체내에 이식할 수 있고 단백질 약물의 안정성 및 서방출에도 효과가 뛰어나며 특히 약물의 초기방출을 크게 줄일 수 있는 이점을 갖는다. 또한, 이 같은 서방성 제제는 활성이 유지되는 단백질 약물 충진법 개발과 지속성 단백질 약물 전달 시스템 개발에도 유용하게 응용될 수 있다.

Claims (10)

  1. (1) Michael-type 첨가 반응이 가능한 작용기를 가지고 있고, (2) 다당류(Polysaccharides)를 기반으로 단백질 약물을 서방출시킬 수 있는 생체활성 다당류 기반 수화젤
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체활성 다당류 기반 수화젤은 생체 성장호르몬과 결합력을 갖는 생체활성 다당류를 포함하여 이루어지고,
    상기 생체활성 다당류는 헤파린 (Heparin), 히아루론산 (Hyaluronic acid), 키토산 (Chitosan), 덱스트란 (Dextran), 알지네이트 (Alginate), 콘드로이틴 설페이트 (Chondroitin Sulfate) 등의 천연 다당류에서 선택된 1종 이상의 물질을 기반으로 수화젤을 형성하며,
    이때 선택된 1종 이상의 다당류들은 아크릴레이트 (Acrylates), 다이아크릴레이트 (Diacrylates), 올리고아크릴레이트 (Oligoacrylates) 등에서 선택된 아크릴레이트 작용기;와 멀티싸이올 등의 싸이올 (thiol) 작용기;로 각각 기능화되며,
    상기 수화젤은 상기 작용기들 간 Michael-type 첨가 반응에 의해 형성되어 생체 성장 호르몬을 서방출시키는 것을 특징으로 하는 생체활성 다당류 기반 수화젤
  3. 제2항에 있어서, 상기 생체활성 다당류 중 1종으로는 헤파린을 선택하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 생체활성 다당류 기반 수화젤
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 의한 다당류 기반 수화젤; 및 유효량의 생체 성장 호르몬을 포함하는 서방형 약물전달시스템으로서,
    상기 생체 성장 호르몬은 상기 수화젤에 잡힌(entrap) 형태를 갖고, 수화젤 구성물질과의 결합력에 의해서 서방출되는 것을 특징으로 하는 주사형 서방형 약물전달제제
  5. 제4항에 있어서, 상기 생체 성장 호르몬은 인간 성장 호르몬 또는 동물 성장 호르몬을 포함하는 것을 특징으로 하는 서방형 약물전달제제
  6. (1) Michael-type 첨가 반응이 가능한 작용기를 가지고 있고, (2) 생체적합성 고분자와 다당류(Polysaccharides)를 기반으로 단백질 약물을 서방출시킬 수 있는 생체활성 다당류 기반 수화젤
  7. 제6항에 있어서, 상기 생체활성 다당류 기반 수화젤은
    (1) 아크릴레이트 (Acrylates), 다이아크릴레이트 (Diacrylates), 올리고아크릴레이트 (Oligoacrylates) 등에서 선택된 작용기와 멀티싸이올 (multi-thiol) 작용기를 갖는 두 가지 이상의 구성성분으로 이루어지고,
    (2) 상기 구성성분은
    헤파린 (Heparin), 히아루론산 (Hyaluronic acid), 키토산 (Chitosan), 덱스트란 (Dextran), 알지네이트 (Alginate), 콘드로이틴 설페이트 (Chondroitin Sulfate) 등의 천연 다당류에서 선택된 1종 이상의 물질과,
    가교링커로서 폴리에틸렌 글라이콜 (Polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드 (Polyethylene oxide), 폴리비닐 알코올 (Polyvinyl alcohol) 혹은 생체적합성을 가지는 다른 합성 고분자중에서 선택된 1종 이상,으로 이루어지며,
    상기 구성성분들은 상술한 작용기로 각각 기능화 시켜 Michael-type 첨가 반응에 의해 수화젤을 제조하여 생체 성장 호르몬의 서방출을 제공하는 것을 특징으로 하는 다당류 기반 수화젤
  8. 제7항에 있어서, 상기 생체활성 다당류로는 헤파린을 선택하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 생체활성 다당류 기반 수화젤
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 다당류 기반 수화젤; 및 유효량의 생체 성장 호르몬을 포함하는 서방형 약물전달시스템으로서,
    상기 생체 성장 호르몬은 상기 수화젤에 잡힌(entrap) 형태를 갖고, 수화젤 구성물질과의 결합력에 의해서 서방출되는 것을 특징으로 하는 주사형 서방형 약물전달제제
  10. 제9항에 있어서, 상기 생체 성장 호르몬은 인간 성장 호르몬 또는 동물 성장 호르몬을 포함하는 것을 특징으로 하는 서방형 약물전달제제
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