KR20080081544A - Novel method of producing ginsenosides by biotransformation of ginseng through liquidl culture of phellinus linteus strain - Google Patents

Novel method of producing ginsenosides by biotransformation of ginseng through liquidl culture of phellinus linteus strain Download PDF

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KR20080081544A KR1020070021668A KR20070021668A KR20080081544A KR 20080081544 A KR20080081544 A KR 20080081544A KR 1020070021668 A KR1020070021668 A KR 1020070021668A KR 20070021668 A KR20070021668 A KR 20070021668A KR 20080081544 A KR20080081544 A KR 20080081544A
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이종진
이계관
이승우
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환인제약 주식회사
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Abstract

A method for producing ginsenosides is provided to mass-produce rare ginsenosides of Rd, Rg2 and Rh1 through liquid-culturing of Phellinus linteus mycelium within a short time. To produce a bio-converted ginsenoside, a Phellinus sp. strain such as Phellinus linteus KCTC 0912BP is liquid-cultured at a temperature of 20-35 deg.C for 1-10 day(s) with agitation, wherein the bio-converted ginsenoside includes Rd, Rg2 or Rh1 and consists of mannose. Further, the bio-converted ginsenoside is fresh ginseng, dried ginseng or tiny-sized ginseng.

Description

생물전환법을 이용한 펠리누스 린테우스 균사체 액체배양을 통한 인삼으로부터 신규한 진세노사이드 생산방법{Novel method of producing ginsenosides by biotransformation of ginseng through liquidl culture of Phellinus linteus strain}Novel method of producing ginsenosides by biotransformation of ginseng through liquidl culture of Phellinus linteus strain}

도 1은 본 발명에 따른 수삼의 진세노사이드 패턴을 나타낸 액체크로마토그람이다. 1 is a liquid chromatogram showing the ginsenoside pattern of fresh ginseng according to the present invention.

도 2는 본 발명 생물전환법에 의하여 생산된 진세노사이드 패턴을 나타낸 액체크로마토그람이다.Figure 2 is a liquid chromatogram showing the ginsenoside pattern produced by the bioconversion method of the present invention.

도 3은 본 발명에 따른 홍삼 다당체의 구성당의 패턴을 나타낸 기체크로마토그람이다. Figure 3 is a gas chromatogram showing the pattern of the constituent sugar of the red ginseng polysaccharide according to the present invention.

도 4는 본 발명 생물전환법에 의하여 생산된 상황버섯발효홍삼 다당체의 구성당의 패턴을 나타낸 기체크로마토그람이다..Figure 4 is a gas chromatogram showing the pattern of the constituent sugar of the situation mushroom fermented red ginseng polysaccharide produced by the bioconversion method of the present invention.

도 5는 본 발명 상황버섯발효홍삼의 면역증강효과를 나타낸 그림이다.Figure 5 is a diagram showing the immune enhancing effect of the present situation mushroom fermented red ginseng.

본 발명은 생물전환법을 이용한 펠리누스 린테우스 균사체 액체배양을 통한 인삼으로부터 신규한 진세노사이드 생산방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 약리학적 활성이 우수한 물질을 다량 함유하고 있는 인삼성분 중 상황버섯 균사체의 액체배양법을 통한 생물전환법을 이용하여 유용한 사포닌 성분을 단기간에 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a novel method for producing ginsenosides from ginseng through liquid culture of Felius linteus mycelium using a bioconversion method, and more particularly, a situation mushroom mycelium among ginseng components containing a large amount of a substance having excellent pharmacological activity. The present invention relates to a method for producing a large amount of useful saponin components in a short time using the bioconversion method through the liquid culture method.

'동양의 신비한 영약'으로 알려진 고려인삼은 인삼생육에 적합한 자연조건과 오랫동안 축적된 재배 및 가공기술 등에 힘입어 세계 최고의 품질로 인정받고 있으며 우리나라를 상징하는 대표적인 이미지 상품으로 각광을 받고 있다. 특히 고려인삼은 타 식물이 전혀 가지고 있지 않은 사포닌, 폴리페놀 등 생리활성 물질을 다량 함유하고 있으며 약리적 효능이 매우 뛰어나 오늘날까지 우수한 생약제로 알려져 있다. Known as 'the mysterious elixir of the East', Korean ginseng is recognized as the world's best quality thanks to natural conditions suitable for the growth of ginseng and long-term accumulated cultivation and processing technology, and it is recognized as a representative image product representing Korea. In particular, Korean ginseng contains a large amount of physiologically active substances such as saponins and polyphenols that other plants do not have at all, and it is known to be an excellent herbal medicine to date because of its excellent pharmacological effect.

최근의 과학적인 연구결과, 인삼은 진세노사이드(인삼사포닌), 폴리아세틸렌, 폴리페놀계 화합물, 유기산, 아미노산, 펩타이드, 다당류, 비타민류 등과 같은 다양한 생리활성물질을 포함하고 있으며 이 중 진세노사이드가 가장 우수한 생리활성 기능을 갖는 것으로 밝혀졌고 그 약리작용으로는 중추신경 억제작용, 단백질 합성 촉진작용, 면역기능 조절작용, 인슐린 유사작용, 해독작용, 항발암과 항암작용 등이 보고되었다. Recent scientific research shows that ginseng contains various bioactive substances such as ginsenosides (ginseng saponins), polyacetylenes, polyphenolic compounds, organic acids, amino acids, peptides, polysaccharides, vitamins, etc. Has been found to have the best physiological activity, and the pharmacological action has been reported to suppress the central nervous system, promote protein synthesis, regulate immune function, insulin-like action, detoxification, anti-cancer and anti-cancer activity.

사포닌은 당부분(glycone)과 비당부분(aglycone)으로 구성된 배당체로서 식물계에 널리 분포되어 있는데, 인삼사포닌은 비당부가 담마란(dammarane)계 트리터펜(triterpene)인 점이 특징적이고, 프로토파낙사디올(protopanaxdiol) 프로토파낙사트리올(protopanaxtriol)계로 분류되고 현재까지 38종의 진세노사이드 화학구조 가 밝혀졌다. Saponins are glycosides composed of glycosides and aglycones and are widely distributed in the plant family.Ginseng saponins are characterized by the fact that the non-sugar portion is a dammarane-based triterpene. (protopanaxdiol) It is classified as a protopanaxtriol family and to date, 38 ginsenoside chemical structures have been identified.

이 중 다섯 종의 major 진세노사이드(진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Re, Rg1)가 전체 진세노사이드의 80% 이상을 차지하는 것으로 알려져 있으며, 진세노사이드는 비당부에 글루코스, 람노스, 아라비노스, 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물로서 결합된 당들의 종류와 수 그리고 결합위치에 따라 약리 작용이 각각 다른 것으로 알려져 있다. 이들 진세노사이드 유도체들 중 특히 최근에는 인삼에 소량 존재하는 minor 진세노사이드의 생리활성기능에 대한 연구가 많이 이루어지고 있는데 이러한 minor 진세노사이드 즉 Rd, Rg3, Rh1 및 Ck가 상기 다섯 종의 major 진세노사이드에 비해 더욱 우수한 생리활성을 가지고 있는 것으로 개시된 바 있다(대한민국 공개특허 10-2006-0062083). Of these, five major ginsenosides (ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Re, and Rg1) account for over 80% of all ginsenosides. Ginsenosides contain glucose, rhamnose, It is known that pharmacological action is different depending on the type, number and location of the sugars to which the sugars such as arabinose and xylose bind. Among these ginsenoside derivatives, in particular, there have been many studies on the physiological activity of minor ginsenosides present in ginseng in small amounts. These minor ginsenosides, Rd, Rg3, Rh1 and Ck, are major It has been disclosed to have a better physiological activity than ginsenoside (Republic of Korea Patent Publication 10-2006-0062083).

따라서 최근에는 이처럼 주요 진세노사이드를 미량 진세노사이드로 전환하려는 시도가 활발히 이루어지고 있으며 그 방법으로는 열처리하는 방법 (대한민국특허공고 제1996-017670), 산과 알칼리를 처리하는 방법 (대한민국특허등록 10-0620107), 효소처리하는 방법 (대한민국특허공고 10-02304002) 등이 공지되고 있다. Therefore, in recent years, attempts have been actively made to convert major ginsenosides to trace ginsenosides, including methods of heat treatment (Korean Patent Publication No. 1996-017670), methods of treating acids and alkalis (Korea Patent Registration 10 -0620107), a method of enzymatic treatment (Korean Patent Publication 10-02304002) and the like are known.

그러나 상기 열 또는 산과 알칼리를 처리하는 방법은 다른 우수한 활성을 갖는 미량 존재하는 진세노사이드와 다당류들을 분해할 수 있으며 그 결과 인삼의 다른 생리활성이 소거되는 단점이 있다. 한편 효소처리하는 방법들은 기질의 양에 비 해 효소가 상당히 많이 소요되며 반응시간과 수율에 있어서 비효율적인 문제점이 있다. However, the method of treating heat or acid and alkali may decompose trace present ginsenosides and polysaccharides having other excellent activities, and as a result, other biological activities of ginseng may be eliminated. On the other hand, the enzyme treatment method requires a lot of enzyme compared to the amount of substrate, and there is an inefficient problem in reaction time and yield.

버섯류의 경우에도 다양한 연구를 통해 여러 가지 생리활성이 높은 소재로 인식되고 있다. 이중 상황버섯의 일종인 펠리누스 린테우스의 경우에는 항암 활성이 96.7%이며 펠리누스 린테우스 균사체의 단백다당체가 Sarcoma 180 복수암 및 고형암을 효과적으로 억제한다고 보고된 바 있다. 고등균류에 의한 진세노사이드의 전환 방법은 고등균류의 배양법에 따라 고체배양법과 액체배양법 두 가지로 나눌 수 있는데, 인삼을 기질로 고등균류를 배양할 경우 배양시간이 너무 길어서 생산효율이 떨어지기 때문에 생산성이 문제점으로 부각되고 있다. In the case of mushrooms, various studies have been recognized as a material with high physiological activity. Pelinus linteus, a type of situational mushroom, has an anticancer activity of 96.7%, and the polysaccharide of the pelinus linteus mycelium has been reported to effectively inhibit Sarcoma 180 ascites and solid cancer. The conversion of ginsenosides by higher fungi can be divided into solid culture method and liquid culture method according to the culture method of higher fungi. When cultivating higher fungi with ginseng as a substrate, the incubation time is too long and the production efficiency decreases. Productivity is emerging as a problem.

특히, 고등균류의 고체배양의 경우에는 생산 공간의 문제점, 인력소비형의 공정으로서 산업화 과정의 난관으로 작용할 수 있다. 이와 같은 고체배양에 관하여는 대한민국 공개특허 10-2006-0062083, 대한민국 특허등록 10-0496666, 대한민국 공개특허 10-2004-0108476가 공지된 바 있다. 상기 특허들에 의하면 고등균류를 포함한 인삼자체는 고체배지상에서 약 14일 내지 90일 간 발효를 통해 인삼제품을 제조하는 방법이 공지되어 있다.In particular, in the case of the solid culture of higher fungi, it can act as a problem of industrialization process as a production space problem, manpower consumption type process. Regarding such a solid culture, Republic of Korea Patent Publication 10-2006-0062083, Republic of Korea Patent Registration 10-0496666, Republic of Korea Patent Publication 10-2004-0108476 has been known. According to the above patents, ginseng itself including higher fungi is known to produce ginseng products through fermentation for about 14 days to 90 days on a solid medium.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 지금까지 보고된 바 없는 상황버섯 펠리누스 린테우스 균주의 균사체를 액체배양을 통하여 생물전환법을 이용한 수삼, 건삼 및 홍삼 등에 미량 존재하거나 존재하지 않는 진세노사이드 Rd, Rg2 및 Rh1 를 단기간에 대량생산할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.In view of the above, the present invention has not been reported to date Ginsenoside Rd, which is present or not present in trace ginseng, dried ginseng, and red ginseng using a biotransformation method through liquid culture of a mycelial mushroom of Felinus linteus. The aim is to provide a method for mass production of Rg2 and Rh1 in a short time.

본 발명의 상기 목적은 상황버섯 펠리누스 린테우스 KCTC 0912BP 균주를 종균배양하고 홍삼분말 배지를 제조하여 상기 종균을 접종한 후 대량배양하고 상황발효 인삼건조 분말을 취득하여 부탄올용액에서 환류냉각한 다음 잔류물을 건조하고 메탄올을 가하여 용해하고 여과한 후 HPLC 분석을 실시함으로써 달성하였다.The above object of the present invention is to culture the S. mushroom Felinus linteus KCTC 0912BP strain and to prepare a red ginseng powder medium to inoculate the seed, then incubate in bulk and obtain a situation-fermented ginseng dry powder to reflux in butanol solution and then residue Was achieved by drying, adding methanol, dissolving, filtration and performing HPLC analysis.

본 발명의 특징은 수삼, 건삼 및 홍삼 등에 미량 존재하거나 존재하지 않는 희귀한 진세노사이드 Rd, Rg2 및 Rh1를 펠리누스 린테우스 균주의 균사체 액체배양을 통하여 생물전환시켜 단기간에 대량생산 할 수 있는 생산방법을 제공함으로써 완성한 것이다.A feature of the present invention is a production method capable of mass production of rare ginsenosides Rd, Rg2, and Rh1, which are present in trace ginseng, dried ginseng, and red ginseng, in a short period of time by bioconversion through mycelium liquid culture of Felinus linteus strains. It is completed by providing.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명은 인삼 성분 중 진세노사이드의 생물전환 활성이 우수한 펠리누스 린테우스 균주 (Phellinus linteus, KCTC 0912BP)를 이용하여, 이 균주로의 액체배양을 통하여 생물전환된 신규하고 대량 생산 가능한 희귀한 진세노사이드 생산방법을 제공한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 진세노사이드의 생물전환 활성이 우수한 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus , KCTC 0912BP) 균주를 선택하고 상기 균주의 균사체의 액체배양에 의해 얻어지는 진세노사이드 Rd, Rg2 및 Rh1 뿐 아니라 상황버섯 균사체 유래의 특이 다당체의 구성성분이 만노즈로 구성되는 다당체의 생산방법을 제공한다. The present invention utilizes the Phellinus linteus strain ( Phellinus linteus, KCTC 0912BP) , which has excellent bioconversion activity of ginsenosides in ginseng components, and is novel and mass-produced rare ginsenovirus which is bioconverted through liquid culture to this strain. Provides a side production method. More specifically, the present invention is excellent in the bioconversion activity of ginsenosides Plinus linteus ( Phellinus) linteus , KCTC 0912BP) and a method for producing a polysaccharide comprising mannose composed of constituents of ginsenosides Rd, Rg2 and Rh1 obtained by liquid culture of the mycelium of the strain as well as the specific polysaccharide derived from the situation mushroom mycelium. to provide.

본 발명자들은 상기 펠리누스 린테우스 균주의 균사체를 감자 텍스트로즈 아가 (Potato dextrose agar, PDA) 고체 배지에 옮겨 순수 배양하는 단계와; PDA 고체 배지에서 배양된 균사체를 다시 각각 감자 덱스트로즈 브로스 (potato dextrose broth) 액체 배지에서 액체 배양하는 단계와; 수삼 500 g 을 흐르는 물로 수세한 후 5L 폐쇄된 용기에 넣어 가열된 수증기를 이용하여 5시간 동안 증삼하고, 상기 증삼된 것을 열풍건조기 50℃에서 1시간 건조 후 건조실에서 자연건조하여 수분이 15% 이하가 되도록 건조시켜 홍삼을 제조하여 생물전환용 재료를 제조하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 홍삼분말을 포함하는 액체배지에 상기 펠리누스 린테우스 균주 균사체와 함께 생물반응기에 넣고 멸균 후 인삼 진세노사이드를 대량 생산하는 단계와; 생물전환된 상황버섯 발효인삼으로부터 목적하는 희귀한 진세노사이드 Rd, Rg2 및 Rh1 과 구성당을 분석하는 단계와; 본 발명 상황발효인삼의 면역효과 및 독성시험 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of culturing the mycelium of the Pellinus linteus strain in a pure medium of Potato dextrose agar (PDA) solid medium; Liquid culturing the mycelium cultured in PDA solid medium in a potato dextrose broth liquid medium, respectively; After washing 500 g of fresh ginseng with running water, put it in a 5L closed container and steam it for 5 hours using heated steam.The steamed product was dried for 1 hour at 50 ℃ of a hot air dryer, and then dried in a drying room to be 15% or less of moisture. Drying to prepare red ginseng to prepare a bioconversion material; Putting ginseng ginsenoside into a liquid medium containing the red ginseng powder obtained in the above step into a bioreactor together with the mycelia of the Felinus linteus strain and sterilizing ginseng; Analyzing the rare ginsenosides Rd, Rg2 and Rh1 and constituent sugars from the bioconverted situation mushroom fermented ginseng; The present invention is composed of the immune effect and toxicity test step of the situation fermented ginseng.

본 발명의 다른 목적은 상기 상황버섯 균사체 액체배양법을 이용한 생물전환공정으로부터 단시간내에 얻어진 진세노사이드의 특징이 Rd, Rg2 및 Rh1을 포함하는 총사포닌을 제공하는 방법에 관한 것이다.Another object of the present invention relates to a method for providing total saponin, wherein the ginsenosides obtained in a short time from the bioconversion process using the situation mushroom mycelium liquid culture method include Rd, Rg2 and Rh1.

본 발명의 다른 특징은 상기 펠리누스 린테우스 균주 (Phellinus linteus KCTC 0912BP)를 액체배양법에 의해 생물전환된 진세노사이드 중 Rd, Rg2 및 Rh1이공존하는 것은 지금까지 전혀 개시된 바 없다는 것이다.Another feature of the present invention is the Felinus linteus strain ( Phellinus linteus The coexistence of Rd, Rg2 and Rh1 in ginsenosides bioconverted by KCTC 0912BP) by liquid culture has not been disclosed at all.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니고 당업자가 약간의 설계변경 또는 수치 및 공정의 변경을 시도하여 용이하게 우회발명을 실시할 수 있으나 이와 같은 발명들은 본 발명의 권리범위에 속한다 할 것이다.Hereinafter, the specific configuration of the present invention will be described in detail by way of examples, but the scope of the present invention is not limited only to these embodiments, and those skilled in the art will easily detour by attempting to make some design changes or changes in numerical values and processes. Although it can be carried out such inventions will belong to the scope of the present invention.

실시예Example 1  One 펠리누스Felinus 린테우스Linteus 균주 ( Strain ( PhellinusPhellinus linteuslinteus KCTCKCTC 0912 0912 BPBP )의 균사체 종균 배양Mycelium spawn culture

본 발명에서 사용한 펠리누스 린테우스 KCTC 0912BP 균주는 강원도 설악산에서 채집 선발한 것으로서 한국생명공학연구원 생물자원센타(KCTC)에서 특허균주로서 기탁되어 있는 균주를 분양한 것이다. 상기 균주는 본 발명자들의 연구결과 생물전환 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 균사체의 종배양의 배양조건은, 상기 종균을 감자 덱스트로즈 아가(PDA) 배지에서 25℃로 유지하여 7~10일간 배양한 후 크린벤치에서 균사조각을 약 0.5㎝크기로 잘라낸 다음 100 mL 감자 덱스트로즈 브로스(potato dextrose broth) 복합배지가 들어있는 500 mL 삼각플라스크에 넣어 다시 10일간 배양하였다. 10일간 충분히 배양된 상기 균주의 균사체를 분쇄기로 4,000rpm에서 1분간 분쇄하여 다시 200mL 내지 300mL의 WIM 멸균 배지 (표1)가 들어있는 1L 삼각플라스크에 종균으로 10%(v/v)를 접종한 후 10일간 액체배양하고 이 배양액을 10%(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 액체배양 균사체는 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 7L 용량의 상부형 발효기(Marubishi Co. Ltd.)에 5L의 WIM 배지가 포함되어 있는 용기에 접종하였다. 펠리누스 린테우스 KCTC 0912BP 균주의 균사체의 배양 환경은 공기주입속도를 0.1vvm내지 1vvm으로 조정하면서 공급하였다. 공기주입속도 1vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어 자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1vvm 이하로 조정하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일 내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 멸균기를 이용하여 121℃에서 20분간 살균하였다. Felinus linteus KCTC 0912BP strains used in the present invention were collected and collected in Seorak-san, Gangwon-do, and the strains deposited as patent strains at the Korea Research Institute of Biotechnology and Biotechnology Center (KCTC). The strain was found to have the best bioconversion activity as a result of our study. Cultivation conditions of mycelium seedlings were maintained at 25 ° C. in potato dextrose agar (PDA) medium for 7-10 days, and then the mycelium pieces were cut to approximately 0.5 cm in a cleanbench and then 100 mL potatoes. Into a 500 mL Erlenmeyer flask containing a dextrose broth complex medium was incubated for 10 days. The mycelium of the strain cultured sufficiently for 10 days was pulverized for 1 minute at 4,000 rpm with a grinder and inoculated with 10% (v / v) as a seed in a 1 L Erlenmeyer flask containing 200 mL to 300 mL of WIM sterilization medium (Table 1). After 10 days liquid culture and the culture was used as 10% (v / v) spawn. The liquid culture mycelium used as a seed was placed in a sterile blender and homogenized, and then inoculated into a container containing 5 L of WIM medium in a 7 L volume fermentor (Marubishi Co. Ltd.). The culture environment of the mycelium of Felinus linteus KCTC 0912BP strain was supplied while adjusting the air injection rate from 0.1vvm to 1vvm. At the air injection speed of 1vvm or more, mycelium tends to grow on the wall of the incubator due to the formation of a large amount of bubbles, so the air injection speed is adjusted to 1vvm or less. The culture temperature was installed in a culture chamber to adjust the room temperature to 20 ℃ to 35 ℃ incubated for 5 days to 10 days. The bioreactor was sterilized for 20 minutes at 121 ℃ using a sterilizer.

WIM 배지 조성WIM badge composition 배지 성분Badge Ingredient 배지 조성 (g/L)Medium composition (g / L) 글루코즈Glucose 2020 펩톤peptone 55 효모 추출물Yeast extract 66 KH2PO4 KH 2 PO 4 1One K2HPO4 K 2 HPO 4 0.50.5 MgSO4 7H2OMgSO 4 7H 2 O 22 pHpH 5.55.5

실시예 2 : 홍삼분말의 제조Example 2 Preparation of Red Ginseng Powder

뇌두를 제거한 수삼 4 kg 을 흐르는 물로 수세한 다음, 20 L 폐쇄된 용기에 넣고 가열된 수증기로 5시간 동안 증삼하였다. 상기 증삼을 열풍건조기에 넣고 50℃에서 1시간 건조시킨 후 건조실에 옮겨 수분함량 15% 이하가 되도록 자연건조하였다. 홍삼을 생물전환용 재료로 이용하기 위하여 사별기를 이용하여 약 20 ~ 30 메쉬 사이즈로 홍삼분말을 제조하였다.4 kg of fresh ginseng from which the brains were removed was washed with running water, and then placed in a 20 L closed container and steamed for 5 hours with heated steam. The steamed ginseng was put in a hot air dryer, dried at 50 ° C. for 1 hour, and then transferred to a drying chamber to naturally dry 15% or less of water. In order to use red ginseng as a bioconversion material, a red ginseng powder was prepared in a size of about 20 to 30 mesh using a separator.

실시예 3 : 본 발명 펠리누스 린테우스 균주의 균사체의 액체배양을 통한 생물전환시스템을 이용한 인삼 진세노사이드 대량 생산Example 3 Mass Production of Ginseng Ginsenosides Using a Bioconversion System Through Liquid Culture of Mycelium of the Felinus Linteus Strains of the Present Invention

상기 실시예 2에서 제조한 홍삼분말을 포함하는 WIM배지 36L를 제조하여 70L 생물반응기(in situ fermenter)로 옮긴 후 121℃에서 40분간 멸균공정을 수행하였다. 생물반응기 온도를 저온순환조를 이용하여 약 28℃까지 떨어뜨린 후 상기 실시예 1에서 배양한 펠리누스 린테우스 KCTC0912BP 균주 균사체 종균 4L를 70L 생물반응기에 통상적인 무균 접종방법을 이용하여 접종하고 배양하였다. 비교예로서, 원료를 수삼분말 또는 건삼분말을 사용하는 경우에는 상기 홍삼분말 대신 수삼분말 또는 건삼분말을 포함하는 WIM배지 36L를 제조하여 70L 생물반응기(in situ fermenter)로 옮긴 후 121℃에서 40분간 멸균공정을 수행하였다. 생물반응기 온도를 저온순환조를 이용하여 약 28℃까지 떨어뜨린 후 상기 실시예 1에서 배양한 펠리누스 린테우스 KCTC0912BP 균주 균사체 종균 4L를 70L 생물반응기에 통상적인 무균 접종방법을 이용하여 접종하고 배양하였다. 발효인삼 반응조건은 공기주입속도를 0.1vvm내지 1vvm으로 조정하면서 공급하였다. 공기주입속도 1vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어 자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1vvm 이하로 조정하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 1일 내지 10일간 배양하였다. 배양종료 후 발효인삼은 여과지로 여과하고 건조기에서 60℃, 8시간 동안 건조 후 상황발효인삼의 무게를 측정하여 건조중량으로 약 600 g/L를 얻었다. 세포외다당체 및 인삼발효추출성분이 함유되어있는 배양여액은 60브릭스로 농축한 후 상황발효인삼 건조물과 혼합한 후 건조기에서 60℃, 5시간 동안 건조하였다. 최종 건조물은 사별기를 이용하여 약 100메쉬 크기로 분말화하여 최종 1.6kg의 상황발효인삼분말을 수득하였다.36L of WIM medium containing the red ginseng powder prepared in Example 2 was prepared, transferred to a 70L bioreactor (in situ fermenter), and sterilization was performed at 121 ° C. for 40 minutes. After dropping the temperature of the bioreactor to about 28 ° C. using a low temperature circulation tank, 4L of the strains of the mycelium of Felinus linteus KCTC0912BP strain cultured in Example 1 were inoculated and cultured in a 70L bioreactor using a conventional aseptic inoculation method. As a comparative example, when using raw ginseng powder or dry ginseng powder, 36L of WIM medium containing fresh ginseng powder or dry ginseng powder instead of red ginseng powder was prepared and transferred to a 70L bioreactor (in situ fermenter), followed by 40 minutes at 121 ° C. A sterilization process was performed. After dropping the temperature of the bioreactor to about 28 ° C. using a low temperature circulation tank, 4L of the strains of the mycelium of Felinus linteus KCTC0912BP strain cultured in Example 1 were inoculated and cultured in a 70L bioreactor using a conventional aseptic inoculation method. Fermented ginseng reaction conditions were supplied while adjusting the air injection rate from 0.1vvm to 1vvm. At the air injection speed of 1vvm or more, mycelium tends to grow on the wall of the incubator due to the formation of a large amount of bubbles, so the air injection speed is adjusted to 1vvm or less. The cultivation temperature was installed in a culture chamber to adjust the room temperature to 20 ℃ to 35 ℃ incubated for 1 to 10 days. After the end of the culture, the fermented ginseng was filtered with filter paper and dried in a drier at 8O < 0 > C for 8 hours to determine the weight of the situation fermented ginseng to obtain about 600 g / L of dry weight. The culture filtrate containing the extracellular polysaccharide and the ginseng fermentation extract component was concentrated to 60 Brix, mixed with the dried fermented ginseng and then dried at 60 ℃ for 5 hours in a dryer. The final dried product was powdered to a size of about 100 mesh using a separator to obtain a final 1.6 kg of situation fermented ginseng powder.

실시예 4 : 생물전환된 인삼의 진세노사이드의 추출Example 4 Extraction of Ginsenosides of Bioconverted Ginseng

상기 실시예 3의 결과, 대량배양된 상황버섯발효인삼의 진세노사이드의 패턴을 분석하기 위하여는 건강기능식품법 인삼제품의 실시예 기준 및 시험법에 준하여 실시하였다. 즉, 100메쉬를 통과한 검체 5g을 칭량하여 250mL의 환류용 플라스크에 취하고 물포화 부탄올용액 50mL를 가한 다음 70℃~ 80℃의 수욕(Water Bath)에서 1시간 환류냉각한 후 식히고 여과한 후 250mL 분액여두에 옮겼다. 잔류물에 대하여 위의 조작을 2회 더 반복하였다. 분액여두에 증류수 50mL를 가한 후 격렬히 흔들어 물층과 부탄올층이 완전히 분리될 때까지 정치한다. 물층(하층)을 제거하고 부탄올층을 미리 항량으로 한 농축플라스크에 옮겨 수욕중에서 감압농축한 다음 그 잔류물에 에테르 50mL를 가하고 약 46℃의 수욕에서 30분간 환류냉각하고 에테르를 제거하였다. 잔류물은 항량이 될 때까지 건조하여 진세노사이드 본 발명에 따른 분석용 건조시료를 얻었다.As a result of Example 3, in order to analyze the pattern of ginsenoside of the situation culture fermented ginseng cultured in large quantities, it was carried out in accordance with the example standards and test methods of the health functional food method ginseng products. In other words, 5 g of the sample that passed through 100 mesh was weighed and placed in a 250 mL reflux flask, 50 mL of water-saturated butanol solution was added, and refluxed and cooled in a water bath at 70 ° C. to 80 ° C. for 1 hour, cooled, and filtered. Transfer to aliquot. The above operation was repeated two more times for the residue. 50 mL of distilled water is added to the separating funnel and shaken vigorously until the water layer and the butanol layer are completely separated. The water layer (lower layer) was removed, the butanol layer was transferred to a concentrated flask with a constant weight, concentrated under reduced pressure in a water bath, 50 mL of ether was added to the residue, and the mixture was cooled to reflux for 30 minutes in a water bath at about 46 ° C, and ether was removed. The residue was dried to a constant weight to obtain an analytical dry sample according to the present invention.

[실험예 1]Experimental Example 1

본 발명의 생물전환된 상황발효인삼 Bio-converted Strains of Ginseng 진세노사이드의Ginsenoside HPLCHPLC 분석 analysis

상기 실시예 4의 상황발효인삼 건조물(시료)에 메탄올을 가하여 완전히 용해한 다음 0.45㎛ Minisart RC-15(Satorius) 필터로 여과한 후 아래의 분석조건에 따라 HPLC에 주입, 인삼 진세노사이드 분석하여 피이크의 면적을 비교하였다. 컬럼은 Platinum C18 (100A, 1.5㎕, 33㎜ × 7㎜)을 사용하였으며 이동상으로는 물과 아세토나이트릴의 비율을 80 : 20으로 시작하여 처음 10분 동안에는 75 : 25, 그리고 후에 15분간은 50 : 50 의 비율로 물과 아세토나이트릴의 밀도 구배가 조절하였다. 이동상의 유속은 1.2 ㎖/min 이었으며 크로마토그램은 203 nm에서 얻었다 (도1, 도2). 원료를 수삼 본 발명으로는 건조분말을 사용하여 생물전환시킨 것과 비교할 때 상황발효인삼분말의 특징적인 진세노사이드 변화는 Rd, Rg2 및 Rh1에서 2.5배~10배의 현저한 증가 양상을 나타냈다 (표2). Methanol was added to the dried fermented ginseng (sample) of Example 4, completely dissolved, filtered through a 0.45 μm Minisart RC-15 (Satorius) filter, injected into HPLC according to the following analysis conditions, and analyzed by ginseng ginsenoside analysis. The area of was compared. The column used Platinum C18 (100 A, 1.5 μl, 33 mm × 7 mm), and the water phase acetonitrile ratio was 80: 20 for the mobile phase, 75: 25 for the first 10 minutes, and 50: 15 minutes afterwards. The density gradient of water and acetonitrile was adjusted at the ratio of 50. The flow rate of the mobile phase was 1.2 ml / min and the chromatogram was obtained at 203 nm (Fig. 1, Fig. 2). Raw ginseng ginseng In the present invention, the characteristic ginsenoside change of the situation-fermented ginseng powder showed a significant increase of 2.5 to 10 times in Rd, Rg2 and Rh1 compared to the bioconversion using dry powder (Table 2). ).

구분division 진세노사이드 (mg/g 총사포닌) Ginsenosides (mg / g total saponin) 사포닌 종류Saponin Type Rg1Rg1 ReRe RfRf Rb1Rb1 RcRc Rb2Rb2 Rg2Rg2 Rh1Rh1 RdRd 수삼Fresh ginseng 10.4810.48 41.1241.12 22.3322.33 3.013.01 12.5212.52 12.5112.51 6.766.76 0.940.94 3.213.21 상황발효인삼Situation Fermented Ginseng 3.613.61 10.4310.43 5.045.04 0.640.64 3.963.96 4.524.52 17.3317.33 10.9710.97 17.7817.78

[실험예 2]Experimental Example 2

본 발명의 생물전환된 상황발효인삼의 다당류 분석Analysis of Polysaccharide of Bio-Converted Sacral Fermented Ginseng of the Invention

상기 실시예 4에 따라 얻은 상황발효인삼으로부터 다당류를 추출하기 위하여In order to extract polysaccharides from the situation fermented ginseng obtained according to Example 4

상황발효인삼 건조분말(시료) 수삼분말과 홍삼분말 각 4g에 20배의 물 80ml을 가하고 3시간 동안 환류추출하였다. 추출액을 여과하여 95% 에탄올을 여과액의 4배의 양으로 첨가한 다음 4℃에서 12시간 정치시킨 후 원심분리하였다. 원심분리한 후 상등액을 제거하고 침전물을 건조하여 고분자 다당류를 얻었다. 고분자 다당류 중 상황균사체로부터 유래된 고유의 다당류는 다당류 중 포함된 Methyl α-D-mannopyranoside의 함량으로서 다음의 실험방법에 따라 측정하였다.Situation Fermented ginseng dry powder (sample) 80 g of water 20 times was added to 4 g of fresh ginseng powder and red ginseng powder and refluxed for 3 hours. The extract was filtered and 95% ethanol was added in 4 times the amount of the filtrate, then left at 4 ° C. for 12 hours, followed by centrifugation. After centrifugation, the supernatant was removed and the precipitate was dried to obtain a polymer polysaccharide. The intrinsic polysaccharide derived from the contextual mycelium in the polysaccharide was measured according to the following experimental method as the content of Methyl α-D-mannopyranoside contained in the polysaccharide.

검체 50mg을 정밀히 달아 20mL의 유리용기에 넣고 메탄올성 0.75N 염산시액 10mL을 넣어 질소충진한 후 80℃의 수욕(water bath)에서 24시간 반응시켰다. 이 반응액을 실온에서 냉각 후 감압증류용 100mL 플라스크에 옮기고 60℃에서 감압농축 시켰다. 감압 농축된 건조물에 메탄올 20mL을 넣어 완전히 용해하고 0.45㎛ 필터로 여과한 다음 여액 10mL 취하여 다시 60℃에서 감압농축시켰다. 잔사에 내부표준액 5mL을 넣어 Trimethylchlorosilane 0.5mL Hexamethyldisilazane 1mL을 넣고 3분간 격렬히 진탕한 후 여과하여 검액으로 하였다. 표준액은 특급시약 Methyl α-D-Mannopyranoside로 34.5㎎을 정밀히 청량 후 내부표준액을 가해 녹이고 정확히 50mL로 한 후 이 액 5mL을 취하고 TMCS 0.5mL 및 HMDS 1mL를 넣고 3분간 격렬히 진탕하여 조제하였다. 내부표준액은 Rhamnose 50mg을 정밀히 달아 무수피리딘을 가해 녹이고 정확히 100mL로 하여 조제하였다. 50 mg of the sample was precisely weighed and placed in a 20 mL glass container, and 10 mL of methanolic 0.75 N hydrochloric acid solution was charged with nitrogen, and then reacted in a water bath at 80 ° C. for 24 hours. The reaction solution was cooled to room temperature and then transferred to a 100 mL flask for distillation under reduced pressure, and concentrated under reduced pressure at 60 ° C. 20 mL of methanol was added to the dried product under reduced pressure, completely dissolved, filtered through a 0.45 μm filter, and then, 10 mL of the filtrate was concentrated under reduced pressure. 5mL of internal standard solution was added to the residue, followed by adding 1 mL of trimethylchlorosilane 0.5mL Hexamethyldisilazane and vigorously shaking for 3 minutes, followed by filtration to obtain a sample solution. After preparing 34.5 mg of the standard solution with the special reagent Methyl α-D-Mannopyranoside, precisely cool down, dissolve it by adding the internal standard solution, and make up to 50 mL. Then, 5 mL of this solution was added, 0.5 mL of TMCS and 1 mL of HMDS were prepared, and vigorously shaken for 3 minutes. The internal standard solution was prepared by precisely weighing 50 mg of Rhamnose, adding anhydrous pyridine to make exactly 100 mL.

상기와 같이 위와 같이 조제된 검액 및 표준액을 가지고 다음의 GC 분석법에 따라 시험하여 얻어지는 검액과 표준액의 면적으로 다당류 함량을 계산하였다. The polysaccharide content was calculated by the area of the sample solution and the standard solution obtained by testing according to the following GC analysis method with the sample solution and standard solution prepared as described above.

분석기기는 GC(Varian 3800)으로 하고 분석조건은 다음과 같이 하였다.The analyzer was GC (Varian 3800) and the analysis conditions were as follows.

Column : RTX-5 Capillary column (0.53mm x 30m)Column: RTX-5 Capillary column (0.53mm x 30m)

Detector : 수소불꽃 이온화 검출기(290℃)Detector: Hydrogen flame ionization detector (290 ℃)

Column Temp : 180℃에서 1분간 유지 후 분당 4℃씩 올려 220℃로 유지한다.Column Temp: After holding for 1 minute at 180 ℃, raise 4 ℃ by minute and keep at 220 ℃.

Injector Temp : 270℃Injector Temp: 270 ℃

Carrier gas : N2 80psi, H2 40psi, Air 60psiCarrier gas: N2 80psi, H2 40psi, Air 60psi

Injection volume : 1.0㎕Injection volume: 1.0µl

계산 방법은 하기와 같다.The calculation method is as follows.

검체 중 Methyl α-D-Mannopyranoside (%) = (Asi X AT X Ws)/(ATi X As X WT) X 100Methyl α-D-Mannopyranoside (%) = (Asi X AT X Ws) / (ATi X As X WT) X 100

As : 표준액의 Methyl α-D-Mannopyranoside 피크 면적As: Methyl α-D-Mannopyranoside peak area of standard solution

Asi : 표준액의 내부표준물질 피크면적Asi: Peak area of internal standard in standard solution

AT : 검액의 Methyl α-D-Mannopyranoside 피크 면적AT: Methyl α-D-Mannopyranoside peak area of the sample solution

ATi : 검액의 내부표준물질 피크면적ATi: Peak area of internal standard material

Ws : 표준품 채취량 (mg)Ws: standard sample (mg)

WT : 검체의 채취량 (mg)WT: Sample collection amount (mg)

분석결과, 상황발효홍삼분말 1g당 14mg의 mannose가 포함된 반면, 수삼 건삼 또는 홍삼에서는 mannose가 전혀 분석되지 않았다 (도3, 도4). 따라서 본 발명방법에 따른 상황발효인삼분말은 상황균사체로부터 유래된 다당류를 포함하고 있으며 수삼, 건삼 및 홍삼에서 얻어진 다당류와는 구성당의 종류 및 함량이 전혀 다름을 알 수 있었다.As a result, while 14g of mannose per 1g of situationally fermented red ginseng powder, mannose was not analyzed at all in ginseng dried ginseng or red ginseng (FIG. 3, 4). Therefore, the situation-fermented ginseng powder according to the present invention contains polysaccharides derived from situation mycelium, and it was found that the types and contents of constituent sugars are completely different from the polysaccharides obtained from fresh ginseng, dried ginseng, and red ginseng.

[실험예 3]Experimental Example 3

본 발명의Of the present invention 생물전환된 상황발효홍삼의 면역증강효과 조사Investigation of Immune Enhancing Effect of Bio-Converted Situation Fermented Red Ginseng

<배양 및 시험물질 투여><Culture and administration of test substance>

본 발명 상기 실시예 3에서 제조한 상황발효홍삼 분말을 이용하여 추출된 사포닌을 이용하여 대식세포에서 면역증강효과를 조사하였다. 대식세포의 활성도를 측정하기 위하여 일산화질소(NO) 생성량을 구하였다. 보통 일산화질소는 저분자의 라디칼로써 신경신호전달기능, 혈액응고 및 혈압조절기능 및 암세포에 대항하는 면역기능 등의 역할이 알려져 있다. 대식세포 계열의 Raw 264.7 세포주는 한국세포주 연구재단으로부터 분양받았으며, 10% FBS를 함유하는 DMEM을 세포배양액으로 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하고 일주일에 2번 계대배양하여 유지하였다. Raw 264.7 세포주를 10% FBS 함유하는 DMEM으로 5×105 cells/mL로 하여 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 적응화 시키고, FBS가 포함되지 않은 DMEM배지를 이용하여 시험물질을 녹여 처리하였다. 24시간 배양한 후 각 well의 배양액으로 유리된 NO양을 측정하였다. NO의 정량을 위해서 상층액 100ul 를 취하고 Griess 시약(Sigma;G4410) 동일 부피를 혼합하여 15분간 반응시킨 다음 ELISA 판독기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선을 작성하기 위하여 Sodium nitrite를 이용하였다. 시험물질 처리군 및 음성대조군등의 NO 농도는 Student t-test를 이용하여 분석하였으며. P<0.01 일 때 유의성을 인정하였다. The present invention investigated the immune-enhancing effect on macrophages using saponins extracted from the fermented red ginseng powder prepared in Example 3. In order to measure the activity of macrophages, the amount of nitric oxide (NO) produced was determined. Nitrogen monoxide is a radical of low molecular weight and is known for its role in neurotransmitter function, blood coagulation and blood pressure regulation, and immune function against cancer cells. Macrophage-based Raw 264.7 cell line was obtained from the Korea Cell Line Research Foundation. DMEM containing 10% FBS was incubated in a cell culture medium at 37 ° C and 5% CO2 incubator and passaged twice a week. Raw 264.7 cell lines were mixed into 96 well plates at 5 × 105 cells / mL with DMEM containing 10% FBS, and adapted for 24 hours. The test substance was dissolved and treated using DMEM medium without FBS. After culturing for 24 hours, the amount of free NO was measured as a culture of each well. To quantify NO, 100ul of the supernatant was taken, the same volume of Griess reagent (Sigma; G4410) was mixed and reacted for 15 minutes, and the absorbance was measured at 540 nm with an ELISA reader. Sodium nitrite was used to prepare a standard calibration curve. NO concentrations of test substance treatment group and negative control group were analyzed by Student t-test. Significance was recognized when P <0.01.

<면역증강효과 측정><Immune Boosting Effect Measurement>

본 실험은 마우스 유래 대식세포(Raw 264.7)에 상황발효홍삼등 4종의 시험물질을 처리하여 nitric oxide(NO) 생성량을 지표로 대식세포의 면역기능 강화 효과를 평가하기 위하여 실시하였다. 활성화된 대식세포에 의해 합성되는 NO는 면역계를 활성화하고 항바이러스 및 항암활성을 발휘하는 중요한 신호물질의 역할을 하는것으로 알려져 있다. 본 실험결과 시험물질 모두에서 NO 농도가 음성대조군에 비해 증가경향을 나타내었으며, 특히 상황발효홍삼 처리군의 경우, 기타시험물질 보다 월등히 높은 14.6 umol/L 의 NO 생성량을 나타내었다(도 5). 따라서 본 발명 상황발효홍삼의 경우 대식세포의 면역기능 조절 효과가 우수한 것으로 판단되었다. 즉, 음성대조군과 비교했을 때 모든 시험물질에서 통계학적으로 유의성(p<0.01)이 있음이 확인되었다.This study was conducted to evaluate the effect of enhancing macrophage immune function by treating nitric oxide (NO) production by treating four test substances such as situationally fermented red ginseng in mouse-derived macrophages (Raw 264.7). NO, synthesized by activated macrophages, is known to play an important role in activating the immune system and exerting antiviral and anticancer activity. As a result of this experiment, the concentration of NO was increased in all the test substances compared to the negative control group, especially in the case of the situation fermented red ginseng treatment group, 14.6 umol / L of NO production was much higher than in other test substances (Fig. 5). Therefore, in the case of the present invention fermented red ginseng, it was determined that the immune function control effect of macrophages is excellent. That is, it was confirmed that there was statistically significant (p <0.01) in all test substances compared to the negative control.

[실험예 4]Experimental Example 4

본 발명 생물전환된 Present invention bioconverted 발효홍삼의Fermented red ginseng 독성시험 Toxicity Test

<실험동물의 식이 및 시험물질 투여><Dietary diet and test substance administration>

본 발명 상기 실시예 3에서 제조된 상황발효홍삼 분말을 이용하여 ICR 계열의 마우스에서 단회 투여 독성 시험을 수행하였다. 마우스에 발효홍삼 산물을 일회 경구 투여한 후 14일동안 사망률, 임상증상 관찰, 체중측정, 사료 및 물 섭취량 측정, GOT/GPT 검사등을 실시하여 산물의 독성을 평가하였다. 실험동물은 ㈜대한바이오링크에서 생산된 4주령의 ICR 계열 마우스 총 40마리를 일주일간 동물사육실(22±2℃)에서 적응화 시킨 후 이용하였다. 각각의 그룹에는 5마리의 마우스를 선별하였으며, 시험기간동안 사용한 깔짚은 고압증기 멸균기로 121℃에서 15분간 멸균하고 물은 멸균수도물을 청결한 병에 넣어 실험동물에 자유로이 공급하였다.Single dose toxicity test was performed in ICR series mice using the situation fermented red ginseng powder prepared in Example 3. After oral administration of fermented red ginseng products to mice, mortality, clinical signs, body weight, feed and water intakes, and GOT / GPT tests were evaluated for 14 days. Experimental animals were used after adapting a total of 40 weeks-old ICR mice produced in Daehan Biolink Co., Ltd. in the animal breeding room (22 ± 2 ℃) for one week. Five mice were selected for each group, and the litter used during the test period was sterilized at 121 ° C. for 15 minutes using a high-pressure steam sterilizer, and water was freely supplied to experimental animals in clean bottles.

실험물질의 조제는 상황발효홍삼 산물을 열수추출물과 100메쉬를 통과한 분말로 나누어, 투여량별로 산별하여 생리식염수에 거품이 나지 않도록 조심스럽게 혼합하여 투여당일에 하였다. 투여용량은 아래의 표와 같이 하였다. 시험물질의 투여는 존데를 사용하여 경구투여하였으며, 투여량은 투여직전 체중에 따라 산출하였다.The preparation of the test substance was divided into fermented red ginseng products into hot water extract and powder that passed through 100 mesh, and carefully mixed so as not to foam in the physiological saline by the dosage. Dosage was as shown in the table below. The test substance was orally administered using sonde, and the dose was calculated according to the body weight immediately before administration.

<분석시료 채취 및 시료분석><Analysis Sample Collection and Sample Analysis>

모든 실험동물에 대하여 매일 1회 일정시간에 일반상태 변화, 중독증상 발현 및 사망유무를 관찰하였다. 체중측정과 사료 및 물 섭취량은 2일에 한번씩 측정하였으며, 체중은 시험물질 투여 전 및 부검 전일에도 측정하였다. 혈액생화학적 검사는 혈액을 냉장고에 2시간 정도 방치 한 후 원심 분리하여 혈청을 분리하여 GOT/GPT 검출키트(아산제약)를 이용하였다.All experimental animals were observed once a day at regular time for changes in general condition, toxic symptoms and death. Body weight measurements, feed and water intake were measured once every two days, and body weight was measured before administration of test substance and on the day before necropsy. For blood biochemical test, blood was left in the refrigerator for 2 hours and centrifuged to separate serum and GOT / GPT detection kit (Asan Pharmaceutical) was used.

실험결과 모든 실험군에서 사망한 동물은 나오지 않았으며, 별다른 임상증상도 관찰되지 않았다. 체중측정, 사료 및 물 섭취량 측정결과 암.수 투여군 모두에서 대조군과 비교하여 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다(표 3). 또한 혈액생화학적 검사에서도 대조군과 비교하여 관찰된 이상징후가 없었으며(표 4), 부검결과 조직장기의 특별한 이상 또한 나타나지 않았다.As a result, no animals died in all groups and no clinical symptoms were observed. As a result of weight measurement, feed and water intake, no significant change was observed in both the male and female groups compared with the control group (Table 3). In addition, there were no abnormal symptoms observed in the blood biochemical test compared to the control group (Table 4), and autopsy showed no specific abnormalities of the organ organs.

몸무게 변화율Weight change rate 성별gender 투여량 (mg/kg)Dose (mg / kg) 00 22 44 66 88 1010 1212 1414 경과일Elapsed date 수컷cock 00 23.7±0.923.7 ± 0.9 30.3±.1.130.3 ± .1.1 32.3±1.632.3 ± 1.6 33.7±1.533.7 ± 1.5 34.4±1.934.4 ± 1.9 36.9±2.036.9 ± 2.0 37.6±2.637.6 ± 2.6 38.7±2.338.7 ± 2.3 상황발효홍삼 열수추출 2000Situation Fermented Red Ginseng Hydrothermal Extract 2000 24.9±1.224.9 ± 1.2 30.2±0.930.2 ± 0.9 31.5±1.231.5 ± 1.2 33.6±1.833.6 ± 1.8 34.5±2.334.5 ± 2.3 36.7±1.936.7 ± 1.9 36.9±2.236.9 ± 2.2 38.6±2.338.6 ± 2.3 상황발효홍삼 분말 2000Situation Fermented Red Ginseng Powder 2000 23.7±0.923.7 ± 0.9 30.3±1.130.3 ± 1.1 32.3±1.232.3 ± 1.2 34.4±1.834.4 ± 1.8 35.1±1.835.1 ± 1.8 37.5±1.237.5 ± 1.2 37.9±2.037.9 ± 2.0 39.4±1.939.4 ± 1.9 암컷female 00 22.3±0.922.3 ± 0.9 26.2±0.926.2 ± 0.9 27.6±0.927.6 ± 0.9 27.9±0.827.9 ± 0.8 28.6±0.828.6 ± 0.8 29.4±1.029.4 ± 1.0 29.5±0.729.5 ± 0.7 30.7±1.230.7 ± 1.2 상황발효홍삼 열수추출 2000Situation Fermented Red Ginseng Hydrothermal Extract 2000 21.8±1.321.8 ± 1.3 25.6±1.125.6 ± 1.1 27.6±1.827.6 ± 1.8 28.4±2.028.4 ± 2.0 28.7±2.528.7 ± 2.5 30.5±2.630.5 ± 2.6 30.0±2.830.0 ± 2.8 31.4±3.231.4 ± 3.2 상황발효홍삼 분말 2000Situation Fermented Red Ginseng Powder 2000 21.2±0.621.2 ± 0.6 24.5±1.924.5 ± 1.9 27.1±1.327.1 ± 1.3 28.1±0.728.1 ± 0.7 28.3±1.328.3 ± 1.3 28.6±1.028.6 ± 1.0 29.7±1.529.7 ± 1.5 30.5±2.830.5 ± 2.8

혈청내 혈액생화학적 검사Serum blood biochemical test 수컷cock 투여량(mg/kg)Dose (mg / kg) 00 상황발효홍삼 열수추출물 2000Situation Fermented Red Ginseng Extract 상황발효홍삼 분말 2000Situation Fermented Red Ginseng Powder 2000 GOP(IU/L)GOP (IU / L) 34.1±0.734.1 ± 0.7 31.3±6.131.3 ± 6.1 32.8±2.932.8 ± 2.9 GOP(IU/L)GOP (IU / L) 10.2±1.010.2 ± 1.0 1.0.5±1.01.0.5 ± 1.0 9.6±0.89.6 ± 0.8 암컷female 투여량(mg/kg)Dose (mg / kg) 00 상황발효홍삼 열수추출물 2000Situation Fermented Red Ginseng Extract 상황발효홍삼 뷴말 2000Situation Fermented Red Ginseng GOP(IU/L)GOP (IU / L) 20.6±120.6 ± 1 23.6±1.823.6 ± 1.8 26.9±4.126.9 ± 4.1 GOP(IU/L)GOP (IU / L) 3.8±0.53.8 ± 0.5 4.6±0.64.6 ± 0.6 5.2±1.65.2 ± 1.6

*단위는 평균 ±표준편차(IU/L)로 나타내었다.* Units are expressed as mean ± standard deviation (IU / L).

이상의 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 수삼, 건삼 및 홍삼분말을 펠리누스 린테우스 KCTC 0912BP 균주의 균사체의 액체배양을 통하여 이 균주의 강력한 생물전환효소에 의해 수삼, 건삼 및 홍삼 성분 중에 미량 또는 존재하지 않는 희귀한 진세노사이드 Rd, Rg2 및 Rh1을 포함하는 총사포닌을 단기간에 대량 생산하는 효과가 있다. 또, 본 발명은 펠리누스 린테우스 균주 (Phellinus linteus KCTC 0912BP)를 액체배양법을 이용하여 생물전환된 인삼분말은 상기 희귀성 진세노사이드 뿐 아니라 상기 균주 유래의 특이 다당류 구성성분인 만노즈를 포함하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described in the above Examples and Experimental Examples, the present invention was carried out in the fresh ginseng, dried ginseng and red ginseng components by the powerful bioconversion enzyme of this strain through the liquid culture of the mycelia of the strain of Felinus linteus KCTC 0912BP. There is an effect of mass production of total saponin, including trace ginsenosides Rd, Rg2 and Rh1, which are traces or non-existent. In addition, the present invention is a Phellinus strain ( Phellinus) linteus KCTC 0912BP) bioconverted using liquid culture method is a very useful invention in the biopharmaceutical industry because it has an excellent effect including the rare ginsenoside as well as mannose which is a specific polysaccharide component derived from the strain.

Claims (6)

펠리누스속 균주의 액체배양으로부터 생성되는 생물전환 진세노사이드 제조방법.Method for producing a bioconversion ginsenoside produced from the liquid culture of the genus Felinus. 제1항의 펠리누스 속의 균주는 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus KCTC 0912BP) 인 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 1, wherein the strain of the genus Felinus is Phellinus linteus KCTC 0912BP. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상황버섯균사체 발효에 의해 생물전환된 진세노사이드가 Rd, Rg2 또는 Rh1 을 포함하고 다당체 구성성분이 만노즈로 이루어진 생물전환 인삼분말.The bioconverted ginseng powder according to claim 1 or 2, wherein the ginsenoside bioconverted by the situation mushroom mycelium fermentation comprises Rd, Rg2 or Rh1 and the polysaccharide component consists of mannose. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상황버섯균사체 발효에 의해 생물전환된 진세노사이드가 Rd, Rg2 또는 Rh1 을 포함하고 다당체 구성성분이 만노즈로 이루어진 생물전환 인삼분말 추출물.The bioconverted ginseng powder extract according to claim 1 or 2, wherein the ginsenoside bioconverted by the situation mushroom mycelium fermentation comprises Rd, Rg2 or Rh1 and the polysaccharide component consists of mannose. 제1항 또는 제2항 기재의 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus KCTC 0912BP) 균주의 액체배양 배지에 홍삼분말을 포함하여 멸균한 다음, 공기주입속도는 0.1vvm내지 1vvm, 교반속도는 50~500 rpm, 배양온도는 20℃ 내지 35℃에서 1일 내지 10일간 배양하는 상황버섯균주 액체배양 방법. Phellinus according to claim 1 or 2 linteus KCTC 0912BP) sterilized with red ginseng powder in the liquid culture medium of the strain, the air injection speed is 0.1vvm to 1vvm, the stirring speed is 50 ~ 500 rpm, the culture temperature is 20 ℃ to 35 ℃ for 1 to 10 days Situation of culture mushroom culture method. 제 5항에 있어서, 생물전환용 원료 인삼이 수삼, 건삼 또는 미삼을 포함하는 것이 특징인 방법.6. The method according to claim 5, wherein the raw material for bioconversion ginseng comprises fresh ginseng, dried ginseng or rice ginseng.
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