KR20080078279A

KR20080078279A - 생체고분자와 생체세라믹의 이종복합체 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20080078279A
Application number: KR1020070018155A
Authority: KR
Inventors: 김홍성
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2007-02-23
Publication date: 2008-08-27
Also published as: KR100889593B1

Abstract

본 발명은 생체고분자와 생체세라믹의 이종복합체 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 생체에 적합하면서 생분해성을 갖는 키틴, 키토산 또는 그 유도체에 의한 글루코사민 및 아세틸글루코사민을 주요성분으로 하는 생체고분자, 견 피브로인 및 생리활성을 가지는 생체 세라믹이 결합되어 있는 생분해성 이종복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 생분해성 이종복합체는 골세포의 부착 및 증식에 유리하고, 생리활성 물질의 공급 및 삼출물의 이동에 효과적일 뿐만 아니라 생체 활성, 생분해성 및 생체 적합성이 우수하여 기존의 고가 의료용 생체 재료의 시장을 대체하고, 그 기능성을 향상시킬 수 있다.

생체고분자, 키토산, 피브로인, 수산화인회석, 이종복합체

Description

생체고분자와 생체세라믹의 이종복합체 및 그 제조 방법{Hybrid Composite of Biopolymers and Bioceramics, and Method for Preparing the Same}

도 1은 본 발명에 따른 다공성 이종복합체의 등방성 공극구조를 나타낸 주사식 전자현미경 사진이다 ((A): 생체고분자/생체세라믹의 중량비 100/0로 함유된 실험군 1(×200), (B): 생체고분자/생체세라믹의 중량비 70/30로 함유된 실험군 4 (×200), (C): 생체고분자/수산화인회석 중량비가 50/50인 실험군 6(×200), (D): 실험군 6의 이종 복합체 구조를 1000배 배율로 촬영한 사진, (E): 실험군 6의 이종 복합체 구조를 5,000배 배율로 촬영한 사진, 및 (F): 생체고분자/수산화인회석의 중량비가 30/70인 실험군 8의 공극의 벽면을 2,000배 배율로 촬영한 전자현미경 사진).

도 2는 본 발명에 따른 다공성 이종복합체의 비등방성 다층 구조를 나타낸 주사식 전자현미경 사진이다 ((A): 실험군 1, (B): 실험군 3, (C): 실험군 6, (D): 실험군 4, (E): 실험군 7의 복합체의 용매가 승화되는 방향에 대한 표면과 이면의 비교 사진: 윗 사진이 표면(×70), 아랫 사진이 이면(×30), 및 (F): 실험군 8의 횡단면 (×200)).

도 3은 본 발명에 따른 압착된 미세접착 막 구조의 다중 막을 나타낸 주사식 전자현미경 사진이다.

발명의 분야

본 발명은 생체고분자와 생체세라믹의 이종복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 생체에 적합하면서 생분해성을 갖는 키틴, 키토산 또는 그 유도체에 의한 글루코사민 및 아세틸글루코사민을 주요성분으로 하는 생체고분자, 견 피브로인 및 생리활성을 가지는 생체 세라믹이 결합되어 있는 생분해성 이종복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

발명의 배경

현대 의학에서 각광받고 있는 조직공학은 생명공학, 의학, 공학의 기술을 바탕으로 생체 조직의 대용품을 제작하여 이식함으로써 생체의 기능을 유지, 향상 또는 복원을 목표로 하는 응용학문으로, 손상된 조직이나 장기를 복원, 재건, 재생 또는 대체하여 정상적인 기능을 하게 하는데 그 목적이 있다.

이러한 조직공학에 있어서, 생체재료의 주된 역할은 세포가 조직 또는 장기로 성장하는 동안 일정한 공간을 제공하여 주고, 세포의 증식과 분화를 물리?화학적으로 제어할 수 있는 신호를 제공해 주는 것으로, 이에 적절한 지지체 설계의 중 요성이 커지고 있다. 지지체의 소재는 새로운 조직의 형성을 유도하고 촉진시키며 체내에 흡수될 수 있는 생체 모방형 재료들로 천연 또는 합성소재들이 검토되고 있다.

그러나 지금까지의 합성 생체재료들은 대부분 비분해성인 금속, 세라믹, 고분자 재료로 생체 적합성과 생체 기능성이 낮아 단순 인체대용 재료에 불가하며, 천연 생체재료는 인체 또는 동물에서 추출한 소재로서 용도에 따른 성형성과 공급량이 매우 저조하여 이용에 제한적이다. 또한, 최근에는 생분해성 합성고분자 재료가 개발되고 있으나, 부기전의 발생 등으로 생체 적합성이 부족하고, 기존 생체재료의 가공기술이 타재료에 비해 낮기 때문에 그 기능성이 저해되는 어려움이 있다. 이에, 생체 적합성과 기능성이 향상된 생체모방형 소재와 생체재료의 정밀한 가공기술이 절실히 필요한 실정이다.

한편, 키토산은 생체 적합성, 항미생물성, 재흡수성 등 우수한 기능을 가지고 있다는 것이 알려지면서, 조직공학에서 생체제료로서의 이에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그러나 이들이 우수한 기능을 보유하고 있음에도 불구하고, 이로부터 제조된 세포지지체(scaffold)와 생체 막 등은 생체재료로써 물성적 또는 구조적 문제점을 가지고 있기 때문에, 이를 해결하기 위하여 키토산과 다른 고분자와의 혼합에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

생체재료로서 고분자 복합체가 응용된 것은 1960년대부터이다. 고분자 복합체의 특징으로는 물과 전해질에 의하여 가소화되어 습윤시 유연성을 가지며 이온 흡착성, 이온교환성, 전해질과 수용성 저분자 물질에 대해 높은 투과성을 나타낸 다. 이러한 성질들을 이용하여 고분자 복합체 막은 인공신장의 혈액 투석막, 인공폐의 막으로서 높이 평가되고 있으며, 각막 이식재료 또는 콘택트렌즈 재료, 조직적합성 및 혈액적합성 재료 등 의학적으로 활발히 연구되고 있다. 종래에 키토산과 고분자 복합체를 형성하기 위하여 음이온성 고분자로 카르복실메틸 셀룰로오즈, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 폴리비닐 알콜 설페이트, 카르복실 에틸 덱스트란, 헤파린, 콜라겐 등이 사용되고 있으나, 이러한 고분자를 키토산과 혼합시킬 경우, 합성고분자는 세포적합성이 떨어지고 생분해성이 저하되며, 천연고분자는 제조비용이 높고 성형성에 한계를 가지는 문제점이 있다.

또한, 실크 피브로인(fibroin)은 17개의 아미노산으로 구성된 선형 단백질이며, 그 주성분이 알라닌(alanine)과 글리신(glycine)으로 간단한 비극성 분자이기 때문에 펼쳐진 분자사슬(β-시트)상의 구조를 가지므로, 피브로인은 역학적 물성이 우수한 효소 고정 기질로서의 역할을 하며 혈액적합성과 습식상태에서의 용존산소 투과성을 가진다. 따라서 근래 인공피부나 인공혈관에서부터 포유동물세포의 배양을 위한 배지 등 다양한 응용분야에서 생체재료로 고려되고 있다.

또한, 수산화인회석(hydroxyapatite)은 자연적인 뼈의 주된 성분이며, 생체 활성, 동화성, 그리고 골조직 유도성으로 주변의 경조직과 직접적인 화학결합을 할 수 있으며, 무독성, 무염증성 및 무면역성으로 뼈 재생 소재와 생체의학용 이식제품으로 사용되고 있다. 이러한 기존 생체재료로 이용되고 있는 수산화인회석은 동물의 공조직에서 추출한 것으로 그 가격이 높아 생물학적 유용성에도 불구하고 그 응용이 매우 제한적인 실정이다. 이에 비하여 패각으로부터 얻어지는 수산화인회석 은 생산비용이 비교적 저렴하고 마이크로 크기로부터 나노 크기까지 광범위하게 응용될 수 있으나 본질적으로 부서지기 쉽고, 낮은 생분해 속도를 가짐으로써 조직공학용 지지체로 이용하기 어렵다. 또한, 미립자 상태의 수산화인회석은 입자들이 체내에서 생리액이나 혈액과 섞일 때 불안정하여 이식된 부위로부터 주변조직으로 이동되어 건강한 조직에 해를 입히는 단점이 있다.

한편, 골조직 재생은 인체내 기관이나 골조직이 기능을 잃거나 유실 시에 골세포 지지체 등을 제공하여 효과적으로 조직을 재생시키는 것으로, 이때 지지체는 이식 부위에서 물리적으로 안정하고 재생 효능을 조절할 수 있는 생리활성을 갖으며, 또한 새로운 조직을 형성한 후에는 생체 내에서 분해되어야 한다. 이러한 골조직 재생용 지지체로 종래 기술에서는 일정한 강도와 형태를 갖는 고분자와 생체세라믹을 이용한 다공성 지지체가 사용되고 있으나, 천연고분자의 경우 콜라겐이 이용되어 생체세라믹과의 접착성이 낮고 그 제조가격이 매우 높아 일반적으로 사용되지 못하며, 합성고분자의 경우에는 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate) 등 비분해성 고분자에 의한 생체세라믹의 접착과 성형을 위한 목적으로 이용되어 조직격리 등 생물학적 문제점이 크다. 최근 폴리락트산(polylactide)을 비롯한 생분해성 합성고분자를 이용한 복합체가 개발되고 있으나 이들 역시 분해물에 의한 부기전이 상당부분 문제시 되고 있다. 따라서 골조직 재생을 위해 높은 공극율과 적절한 공극의 크기를 가지는 3차원 구조로 제조할 수 있으며, 우수한 생체적합성과 생체활성 및 생분해성을 갖는 생체모방형 소재 및 생체재료의 개발이 절실히 요구되고 있다.

관련된 종래 기술로, 대한민국공개특허 2003-0097691는 “생분해성 생체고분자 재료, 그 제조방법 및 이 고분자재료로 이루어지는 기능성 소재”에 관한 것으로, 견 피브로인 단독, 또는 가잠 또는 야잠 유래의 견 피브로인과 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 키토산 유도체, 양모 케라틴 그리고 폴리비닐알코올에서 선택된 제2물질의 복합체로의 이루어진 기능성 소재에 관한 것이고, 대한민국공개특허 2003-0022425는 “생체활성 및 생분해성을 갖는 유·무기 복합체의 제조방법”에 관한 것으로, 특정 생분해성 고분자와 커플링제를 일정비율로 반응시켜 커플링된 생분해성 고분자를 제조하고, 상기 커플링된 생분해성 고분자에 다시 가수분해가 가능한 세라믹 전구체와 수용성 칼슘염을 첨가한 후 졸-겔 반응을 통하여 유·무기상이 상 분리없이 결합된 복합체를 제조하는 방법이 있다.

이에 본 발명자는 생체에 적합하면서, 생체 활성 및 생분해성을 갖는 골세포를 위한 생체재료용 복합체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 세포외기질 유사 성분인 천연유래 키토산을 주요성분으로 하는 생체고분자의 생체적합성과 피브로인 단백질의 상대적인 빠른 분해가 생체세라믹인 수산화인회석이 골조직에 동화시키는 기회를 증대시켜 새로운 조직의 형성을 촉진하게 함으로써, 상기 세 가지 성분을 함유한 이종복합체의 골조직 지지체로서의 유용성을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 주된 목적은, 생분해성 및 생체 활성을 갖고, 키토산을 주요 성분으로 하는 생체고분자, 피브로인 및 생체세라믹인 수산화인회석을 함유한 생분해성 이종복합체 및 그 제조 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 키틴, 키토산 또는 그 유도체에 의한 글루코사민 및 아세틸글루코사민을 주요성분으로 하는 생체고분자; (ii) 가잠 또는 야잠 유래 견 피브로인; 및 (iii) 생리활성을 가지는 생체세라믹이 결합되어 있는 생분해성 이종복합체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 생리활성을 가지는 생체세라믹은 수산화인회석(하이드록시 아파타이트)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생체고분자 100중량부에 대하여, 피브로인 및 생체 세라믹의 함량은 각각 5~100중량부 및 1~300중량부인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생분해성 이종복합체는 다공체 형상, 막 형상, 겔 형상, 및 섬유 형상으로 구성된 군에서 선택되는 형태를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 생분해성 이종복합 수용액 제조방법을 제공한다:

(a) 생리활성을 가지는 생체세라믹이 분산된 산성 수용액에 키틴, 키토산 또는 그 유도체에 의한 글루코사민 및 아세틸글루코사민을 주요 성분으로 하는 생체고분자를 첨가하여 생체고분자-생체세라믹 복합 수용액을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 생체고분자-생체세라믹 복합 수용액에 견 피브로인 수용액을 첨가한 다음, 기계적 교반에 의해 발포시켜 액체-기체 (거품) 콜로이드상을 가지는 이종복합 수용액을 수득하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 이종복합 수용액을 열유도 상분리 및 용매 승화시키는 것을 특징으로 하는 규칙적인 비등방성 공극을 가지는 다공성 생분해성 이종복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 다공성 이종복합체를 부분적으로 용해시켜 표면 또는 어느 일정 부분에 불균일한 등방성 공극을 형성시키고, 동시에 내면과 배면 또는 그 반대 부분에 규칙적인 비등방성 공극구조를 형성시키는 것을 특징으로 하는 이중 공극구조의 다공성 생분해성 이종복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 수득된 생분해성 이종복합체를 아세틸화 처리하여 아세틸화도를 1~100%로 조절하는 것을 특징으로 하는 아세틸화 처리된 생분해성 이종복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 생분해성 이종복합체를 압착하여 여러 겹으로 된 미세접착 다중 막과 그것을 형성시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 다공성 생분해성 이종복합체가 여러겹으로 압착된 미세접착 막 구조의 다중막을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 생분해성 이종복합 수용액으로부 터 기포 제거한 다음, 전기 방사하여 나노섬유로 구성된 막을 형성시키는 것을 특징으로 하는 나노섬유 막의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 생분해성 이종복합체를 유효성분으로 함유하는 조직공학용 지지체 (스케폴드)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 생분해성 이종복합체를 유효성분으로 함유하는 골 또는 치공 충진용 의료재료를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 생분해성 이종복합체를 유효성분으로 함유하는 조직재생 유도용 또는 차폐용 막을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 생분해성 이종복합체는 게 등 갑각류의 껍질에서 추출된 키틴, 키토산 또는 그 유도체에 의한 글루코사민 및 아세틸글루코사민을 주요성분으로 하는 다당류, 및 가잠 또는 야잠의 견에서 추출된 피브로인, 및 패각에서 추출한 수산화인회석을 사용하였다.

본 발명에 따른 키토산은 생체적합성, 재흡수성, 지혈성, 항전염성, 유연성 및 접착성에 기인하여 생체 기질과 생체 세라믹에 대한 접착제 역할을 위하여 사용한 것으로, 글루코사민과 아세틸글루코사민이 90중량부 이상 함유된 것을 사용하고, 글루코사민 및 아세틸글루코사민이 함유된 키토산 유도체도 사용 가능하다. 본 발명에 따른 키토산의 함량은 복합체에 대하여 20 ~ 95중량%로 할 수 있다. 키토산을 용해시킬 산성 용매는 초산, 포름산, 락트산, 염산 중에서 선택하며, 바람직하 게는 초산을 사용한다. 그러나 이에 국한하지 않고 상황에 따라 적절한 산성 용매를 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 피브로인은 역학적 물성이 우수한 효소 고정기질로서 역할을 하며 혈액적합성과 습식 상태에서의 용존 산소 투과성을 가진다. 본 발명에서의 피브로인은 가잠 또는 야잠 견에서 추출한 피브로인을 사용할 수 있고, 견 이외에도, 가잠이나 야잠에서 유래하는 부산물, 견섬유, 견섬유 제품 및 견섬유 복합체도 이용할 수 있다. 피브로인의 수용액은 염화칼슘, 질산칼슘, 브롬화리튬, 티오시안리튬 등의 농후한 중성염 수용액에 견사를 넣고 가열함으로서 수행된다. 이때 용해온도는 25~70℃정도, 바람직하게는 50~60℃ 정도이며, 용해온도가 70℃를 초과하는 고온이 되면, 피브로인 단백질의 분자량이 저하되고, 재료의 고분자성이 상실되며, 그 결과 성형성이 저하된다. 용해시간은 3 ~ 24시간 정도로 설정하는 것이 바람직하며, 투석후 피브로인 수용액의 농도는 1 ~ 5중량%인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 수산화인회석은 패각에서 추출된 것으로, 복합체의 골세포 동화성을 목적으로, 이종복합체의 전체중량에 대하여 1 ~ 70중량%이고, 바람직하게는 20 ~ 60중량%이다.

한편, 본 발명의 생분해성 이종복합체는 먼저, 산성용액에 수산화인회석을 균일하게 분산시키고, 글루코사민계 다당류를 첨가하여 용해시킨 다음, 피브로인 수용액을 혼합하여 제조한다.

상기 방법으로 제조된 이종복합 수용액은 열유도 상분리 및 용매 승화 방법으로 규칙적인 비등방성 공극을 가지는 다공성 이종복합체를 제조할 수 있고, 표면 용해에 의해 표면에 불균일한 등방성 공극, 내면 및 배면에 규칙적인 비등방성 공극 구조를 동시에 형성시켜 이중 공극구조의 생분해성 이종복합체를 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 이종복합체의 이중 공극구조는 표면이 불균일한 등방성 공극 구조와 내부에 규칙적인 비등방성 다층 공극구조를 갖는 것으로, 연속하는 두 개의 다른 공극구조로 이루어진다. 이 다공성 이종복합체를 압착에 의해 여러 미세 겹을 가지는 다중 막을 형성시킬 수 있다.

상기 다공성 이종복합체의 다층 공극구조는 특정 조건에서 고분자 용액의 상분리에 의해 형성되는 것으로, 즉, 상기 고분자 용액의 온도가 용매의 빙점보다 낮아질 때 용매 결정화가 일어나고, 고분자 상은 용매 결정의 전면으로 밀려난다. 예를 들어, 키토산을 용해시키는 대표적인 용매로 초산을 들 수 있으나, 본 발명에서 이에 한정되는 것은 아니며, 그 빙점은 용매의 종류와 특히 사용 농도에 따라 달라진다. 용매결정으로부터 추출된 고분자는 응집에 의해 연속적인 고분자가 풍부한 상이 형성되며, 용매결정이 승화된 후에는 용매결정 형태와 유사한 반복적인 틈 간격을 갖는 다층 공극구조가 형성된다. 이 반복적인 틈 간격은 냉각속도와 고분자 농도에 따라 변화하고, 동결된 복합체에서 열전달 방향에 따른 온도 균배는 동결건조 용기 내부에서 진공과정 전에 유지되는 시간에 따라 결정되므로, 용매가 승화되기 전에 이종복합체 외측의 용매결정이 녹아 이종복합체 표면 또는 일부 영역에서 상 분리가 붕괴되는 결과를 가져온다. 그 결과, 유지시간 및 온도에 따라 이종복합체 전체 또는 열전달 방향으로의 표면을 비롯한 일부분이 불균일한 등방성 공극 구조를 형성하게 되거나, 이종복합체 전체 또는 열전달 방향으로의 내부를 비롯한 일 부분이 규칙적인 비등방성 다층 구조를 형성하게 된다.

따라서, 상기 이종복합체는 제조 조건에 따라 전체적으로 불균일한 등방성 단일 공극구조, 또는 규칙적인 비등방성 다층형태의 단일 공극구조, 또는 이들 두 공극구조가 한 방향의 표면과 그 반대 방향의 내면에 동시에 형성되는 이중 공극구조로 형성시킬 수 있다.

본 발명에 따른 이종복합체는 조성의 함량과 각 성분의 농도, 그리고 온도, 시간 등 처리 조건에 따라 이종복합체의 밀도, 공극의 크기와 형태, 그리고 공극 구조를 제어할 수 있다.

본 발명에 따른 이종복합체를 아세틸화 처리할 수 있으며, 이 처리로 폴리사카라이드(키토산)의 글리코사민이 아세틸글리코사민으로 변화되며, 여기서, 폴리사카라이드에서 아세틸글리코사민의 비율을 아세틸화도라 한다. 본 발명에서 아세틸화도는 0.0025N polyvinyl sulfate potassium salt와 toluidine blue-O를 이용한 콜로이드 적정법으로 구하였다.

생체 내에서 글리코사민과 아세틸글리코사민의 생물학적 영향이 서로 달라서, 예를 들면, 글리코사민의 함량이 높으면 세포접착성, 흡수성, 항균성, 반응성 등이 증가하는 반면에 조직적합성, 생분해성, 재흡수성 등이 떨어지며, 아세틸글루코사민의 함량이 증가하면 그 반대의 효과가 나타난다. 따라서, 특정 용도에 가장 적합한 생체재료를 설계하기 위해서는 해당 용도에 적합한 아세틸화도를 고려하여야 한다. 다만, 하기 실시예에서 97% 글루코사민의 키토산을 사용하여 이종복합체를 제조한 후에 아세틸화한 것은 아세틸글루코사민의 함량이 커질수록 원하는 형태 로 성형이 되지 않기 때문이다.

한편, 본 발명은 글루코사민계 다당류, 피브로인 및 수산화인회석이 균일하게 분산된 이종복합 수용액에서 기포를 제거시키고, 전기방사하여 나노섬유로 구성된 막을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 생분해성 이종복합체는 인체 내 기관이나 조직이 기능을 상실하거나 유실시에 효과적으로 조직을 재생하기 위한 것으로, 세포부착에 유용한 다공성 이종복합체를 제조하고, 상기 다공성 이종복합체는 조직공학용 지지체, 조직재생 유도용 및 차폐용 막재료, 서방성 담체, 생체세포 증식기재 등에 적용할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 생체고분자와 생체세라믹의 이종복합체의 제조

생체세라믹의 대표적인 예로, 평균입자크기가 약 2㎛이고, 칼슘/인의 비(이온몰비)가 1.55인 수산화인회석(Hydroxyapatite) 분말을 2중량%의 초산 수용액에 하기 표 1에 나타난 중량부 함량비로 분산시킨 후, 수산화인회석 입자를 균일하게 분산시키기 위하여 20분 동안 초음파 분쇄처리하였다.

상기 초음파 처리되어 균일하게 분산된 이종복합수용액에 중량평균분자량이 400,000이고, 탈아세틸화도가 97%인 정제된 키토산을 2중량%가 되도록 녹인 후 5시간 동안 교반하였다. 또한, 피브로인은 키토산에 대해 20중량%로 수산화인회석이 분산된 키토산 용액에 수용액 상태로 균일하게 혼합하였다.

상기와 같이 제조된 키토산과 피브로인에 의한 생체고분자 및 수산화인회석의 이종복합 수용액을 격렬하게 교반하여, 역학적으로 유도된 액체-기체 콜로이드(거품용액)를 형성시키고, 이를 폴리에틸렌테렐프탈레이트의 틀에 넣고 액체-액체 또는 고체-액체 상분리를 유도하기 위하여 -98℃의 냉동기에 옮겨 충분히 동결시키고, 이어 상온의 진공동결 건조기 내로 옮겨 5분 ~ 30분 사이의 일정시간 경과 후 동결건조시켰다. 이렇게 고화된 이종복합체는 60℃ 및 0.5mmHg 압력에서 2일 동안 감압 건조하여 잔존하는 용매를 제거하였다.

이와 같이 제조된 다공성 이종복합체들의 밀도과 공극율을 표 1에 나타내었다.

실험군	생체고분자/수산화인회석 비율(중량부/중량부)	밀도 (g/cm³)	공극율(%)
1	100/0	0.81	98.0
2	90/10	0.89	98.2
3	80/20	0.93	97.6
4	70/30	0.95	97.3
5	60/40	0.98	96.5
6	50/50	1.03	95.7
7	40/60	1.11	95.4
8	30/70	1.20	95.4

실시예 2: 본 발명에 따른 이종복합체의 형상 분석

조직공학에서 세포지지체(scaffold)는 세포의 정착과 증식을 유도하고 각종 영양분과 세포활성물질들을 전달하기 위해서 높은 다공도와 열린 형태의 공극을 가져야 하며, 이는 이식된 세포가 생존하고 3차원적으로 성장하는데 직접적인 영향을 미친다.

상기 실시예 1에서 제조된 실험군 1-8의 복합체들을 백금으로 표면도금하여 주사식 전자현미경(SEM; Hitachi S-3500N, Japan)으로 복합체의 표면 형상과 그 다공 형태를 조사하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, (A), (B) 및 (C)는 생체고분자/수산화인회석 중량비가 각각 100/0, 70/30 및 50/50인 실험군 1, 4 및 6의 이종복합체의 형태를 나타낸 200배의 전자현미경 사진이다. 또한, (D)는 상기 실험군 6의 이종복합체 구조를 1000배 배율로 촬영한 사진이며, (E)는 상기 실험군 6의 이종복합체 구조를 5,000배 배율로 촬영한 사진이다. (F)는 생체고분자/수산화인회석의 중량비가 30/70인 실험군 8로, 공극의 벽면을 2,000배 배율로 촬영한 전자현미경 사진이다. 상기 사진상에 나타난 바와 같이, 다공성 이종복합체는 열린 형태의 공극을 가지며, 그 크기는 200 ㎛ 이하의 다양한 공극을 형성하였으며, 0.5 ~ 2㎛ 크기의 수산화인회석 미립자는 고분자용액의 높은 점도로 인하여 공극 벽에 잘 분산되어 있는 것으로 나타났다. 수산화인회석의 함량이 낮을 경우에는 수산화인회석 입자가 공극의 엷은 고체 벽의 표면에 균일하게 퍼져 있었고, 수산화인회석의 함량이 증가할수록 고분자상이 수산화인회석 입자를 둘러싸 부분적으로 교착된 덩어리를 만들었다.

또한, 도 2에서 (A), (B), (C) 및 (D)는 생체고분자/수산화인회석 중량비가 각각 100/0, 80/20, 50/50 및 70/30인 복합체의 구조를 나타낸 사진이고, (E)는 생체고분자/수산화인회석 중량비가 40/60인 실험군 7로 윗사진은 용매가 승화되어 빠져나가는 방향의 표면의 등방성 공극구조를 나타낸 것이며, 아랫사진은 그 이면의 비등방성 다층 공극구조를 나타낸 것이며, (F)는 생체고분자/수산화인회석 중량비가 30/70인 실험군 8의 횡단면의 사진이다. 상기 도 2에 나타난 것처럼, 실시예 1에서 제시된 제조 조건에 따라 본 발명의 이종복합체는 불균일한 등방성 공극구조와 규칙적인 비등방성 다층 공극구조를 형성하였다.

실시예 3: 모의체액에 의한 본 발명의 이종복합체의 흡수율과 중량감소율 측정

(1) 모의체액의 제조

모의체액(SBF; Synthetic Body Fluids)은 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO₃), 염화칼륨(KCl), 인산일수소칼륨삼수화물(K₂HPO₄·3H₂O), 염화마그네슘육수화물(MgCl₂·6H₂O), 염화칼슘(CaCl₂) 및 무수황산나트륨(Na₂SO₄)을 체액의 이온성분 함량에 기준하여 하기 표 2에 나타난 함량으로 탈이온수에 용해하여 준비하였고, 모의체액의 수소 이온농도는 7.4로 트리하이드록시메틸아미노메탄(trishydroxymethylaminomethane) 및 1M의 염산으로 36.5℃에서 완충되었다. 하기 표 2는 실험에 사용된 모의체액의 이온농도와 인간 혈장의 이온농도를 비교한 것으로, 실험에 사용된 모의체액은 인간 혈장과 유사한 이온농도를 가진다.

구분	농도(mM)
구분	Na⁺	K⁺	Ca² ⁺	Mg² ⁺	HCO^- ₃	Cl^-	HPO₄ ² ^-	SO₄ ² ^-
혈장	142.0	5.0	2.5	1.5	27.0	103.0	1.0	0.5
모의체액	142.0	5.0	2.5	1.5	27.0	125.0	1.0	0.5

(2) 상기 모의체액을 이용한 이종복합체의 체액흡수성 및 삼투에 따른 안정성 실험

세포지지체의 체액 흡수에 따른 팽윤은 3차원 구조에 있어서 공극 크기를 증가시킴으로써 세포의 부착과 성장에 유리하며, 체액 중에서의 안정성은 조직공학용 재료의 실질적 사용에 중요한 요소이다.

본 발명에 따른 이종복합체들의 체액 흡수성과 삼투에 따른 안정성을 조사하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 이종복합체들을 37℃에서 모의체액에 침지하여 시간에 따른 흡수율을 측정하였다.

모의체액의 흡수율은 생체고분자에 대한 생체고분자/수산화인회석 함량비가 80/20인 실험군 3에서 최대가 되었으며, 상기 실험군 3의 이종복합체는 수분 내에 자중의 약 25배의 최대 흡수율로 팽윤되었으며, 그 이후 급속히 감소하여 3시간 이후에는 최대 흡수율의 약 60%인 15배를 유지하였으며, 2일 이후에는 다시 서서히 증가하기 시작하여 일주일 후에는 최대흡수율의 약 70%인 18배를 안정하게 유지하였다. 이러한 시간에 따른 흡수율의 변화는 상기 모든 이종복합체들에서 유사한 경향을 보였다. 그리고 일주일 후의 중량감소율은 약 3중량%였으며 그 이후 4주 동안 중량감소 없이 유지되었다.

생체고분자/수산화인회석의 함량비가 100/0, 90/10 및 80/20의 비율로 제조된 이종복합체들인 실험군 1 내지 실험군 3까지는 수산화인회석의 함량이 증가함에 따라, 1시간동안 수산화인회석이 복합되지 않은 실험군 1은 10배의 흡수율을 나타낸 것에 비해, 실험군 2 및 3은 20배의 흡수율까지 증가하였으나, 그 이상으로 함유된 70/30, 60/40, 50/50, 40/60 및 30/70의 실험군 4 내지 8에서는 복합체들의 공극율 저하와 수화고분자 함량의 감소로 인해 흡수율이 다시 낮아졌다. 특히, 실험군 6 내지 8에서는 X-선 결정분석 및 SEM 형상분석 결과, 비결정성 고분자상과 고결정성 수산화인회석의 교착물이 형성되기 시작하여 실험군 1의 흡수율 전후의 흡수율을 보였다.

실시예 4: 본 발명에 따른 이종복합체의 인장강도 측정

세포 성장을 위해 높은 다공도를 가진 세포지지체는 조직이 재생되는 기간 동안 그 틀을 유지할 수 있을 정도의 충분한 역학적 강도를 가져야 하므로, 상기 역학적 강도를 측정하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조된 실험군 1-8의 수산화인회석 함량에 따른 복합체들에 대한 인장강도를 5kg의 로드셀이 장착된 만능재료 시험기(United SSTM-1, USA)로 측정하였다.

측정결과, 수산화인회석이 함유되지 않은 실험군 1의 인장강도는 2.7 gf/mm²이었고, 수산화인회석의 함량비가 증가함에 따라 인장강도도 서서히 증가하여, 생체고분자/수산화인회석의 함량비가 60/40로 제조된 이종복합체인 실험군 5의 경우 최고 4.5 gf/mm²을 나타내었으며, 그 보다 더 많은 수산화인회석이 함유된 실험군 6의 경우 인장강도의 값이 현저히 감소되었다. 일반적으로, 보강물과 복합체 사이의 응력 전달은 보강된 고분자의 역학적 물성을 좌우하는 것으로, 따라서, 복합체의 역학적 물성을 증진시키는데 있어서, 생체고분자에 대한 수산화인회석을 50/50 미만으로 첨가하는 것이 이종복합체의 인장 강도를 높이는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 이종복합체는 생체재료로 사용하기에 적합하였다.

실시예 5: 본 발명에 따른 이종복합체의 단백질 투과도 시험

세포의 정착과 생존은 그 지지체에 세포외기질 성분과 혈청 단백질의 지속적인 공급에 의해 조절되므로, 지지체의 기능에 있어서 단백질 투과성은 매우 중요한 요소이다.

본 발명에 따른 이종복합체의 단백질 투과도는, 50mm²의 확산면적을 가진 시료 거치대를 중앙에 설치하고, 양쪽으로 병렬 연결된 확산 셀 장치에서 측정되었다. 이 장치에서 공급측 셀은 1mg/ml의 모의단백질인 형광아이소시아네이트-소 혈청 알부민 화합물이 녹아있는 3ml의 모의체액을 채워 사용하였으며, 맞은편 수용측 셀은 3ml의 모의체액으로만 채워졌다. 각 셀 내의 용액들은 교반되면서, 37℃의 인큐베이터에 설치되었다. 일정 시간마다 수용측 셀의 전 모의체액을 채취하여, UV 분광기를 이용하여 형광아이소시아네이트 여기파장인 495nm로 흡광도로 단백질 투과도를 측정하였다.

그 결과, 단백질 투과도는 시간의 경과에 따라 거의 선형적으로 증가하였다. 생체고분자/수산화인회석 함량비가 50/50의 이종복합체인 실험군 6의 경우, 1일 기준의 누적투과도가 12 ㎍/㎟이며, 7일 기준의 누적투과도가 약 30 ㎍/㎟으로, 다른 실험군들의 1일 기준 1 ~ 5 ㎍/㎟ 와 비교하여, 투과성이 월등히 증가하였으며, 이에 비해 실시예 3에서 가장 큰 흡수성을 보였던 생체고분자/수산화인회석 함량비가 80/20의 이종복합체인 실험군 3의 단백질 투과도는 1일 기준 1.5 ㎍/㎟으로 나타나, 이종복합체에 있어서 단백질의 투과는 체액흡수성의 증가에 의해 오히려 방해받으며, 그 공극구조에 효과적으로 더 큰 영향을 받는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 이종복합체는 단백질 투과성에 있어서 생체재료로 사용하기에 충분하였다.

실시예 6: 본 발명에 따른 이종 복합체의 아세틸화 처리

인체의 세포외기질과 세포벽을 구성하는 주성분인 프로테오글리칸은 단백질 주사슬에 다수의 글루코사미노글리칸 가지로 구성되며, 각각의 글루코사미노글리칸은 아세틸글루코사민기를 가지는 반복적인 이당류(disaccharide)의 긴 사슬로 형성되어 있는데, 실시예 1에서 제조된 실험군 1-8의 복합체들은 97%의 글루코사민기를 가지는 이당류를 단량체로 하는 생체고분자 복합체로써, 이들의 용도와 특성에 따라 다음과 같은 처리방법으로 글루코사민을 아세틸글루코사민으로 전체 또는 일부를 변환시킬 수 있었다.

무수물/글루코사민의 몰비(1/1)에 따른 분량의 무수초산을 100중량부의 1,2-프로판디올 수용액에 용해시킨 용액에, 상기 실시예 1에서 제조된 이종복합체 중 실험군 4의 이종복합체를 넣어 24시간동안 천천히 교반하면서 아세틸화 처리를 하였다. 처리된 아세틸화 복합체는 수회 탈이온수및 에틸알코올로 세척한 후 건조시켰다. 상기와 같이 처리된 이종복합체는 그 형태를 유지하면서 아세틸화도를 약 50%로 조절할 수 있었다.

실시예 7: 본 발명에 따른 이종복합체를 이용한 다중 막의 제조

실시예 1에서 제조된 실험군 1-8의 비등방성 다층구조를 갖는 복합체를 탈이온수를 흡수시켜 팽윤시킨 다음, 이를 다층이 차례로 겹치는 일정한 방향으로 가압롤러를 이용하여 5 ~ 25 kg/㎟ 압력으로 탈수와 동시에 압착시킨 후, 이를 일정 응력하에서 서서히 건조시켜 도 3과 같은 형태를 가지는 여러 겹의 압착된 미세접착 막 구조의 다중 막을 제조하였다.

실시예 8: 본 발명에 따른 이종복합체를 이용한 나노섬유막의 제조

실시예 1에서 제조된 실험군 4의 복합체를 제조하기 위한 각각의 생체고분자 수용액을 농축 혼합하여 약 800 poise 점도의 복합 수용액을 준비하고, 이를 감압시켜 기포를 제거하였다. 상기 복합수용액을 지름 100 ㎛의 복수의 노즐을 통하여 25 kV 전압으로 15 ㎝ 방사거리에서 전기 방사하여 직경 평균 200 nm의 섬유로 구성된 나노 섬유 막을 제조할 수 있었다.

점도 100 ~ 2000poise, 전압 10 ~ 60kV, 방사거리 5 ~ 20cm, 노즐의 굵기, 방사시간 등 여러 실험 조건을 변경하여 시험한 결과, 상기 제조된 나노섬유막을 형성하는 섬유 형태와 굵기는 복합 수용액의 점도와 노즐의 굵기에 주로 영향을 받았으며, 막의 두께와 공극율은 방사시간에 비례하였다. 그 외에 전압의 세기, 전류량, 방사거리 등도 일정 범위내에서 막의 형성 조건에 영향을 미쳤다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 생체 적합하면서, 생분해성 및 생체 활성이 우수한 생체고분자, 피브로인 및 생체세라믹을 함유한 생분해성 이종복합체를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 골세포의 부착 및 증식에 유리하고, 생리활성 물질의 공급 및 삼출물의 이동에 효과적일 뿐만 아니라 생체 활성, 생분해성 및 생체적합성이 우수하여 기존의 고가 의료용 생체 재료의 시장을 대체하고, 그 기능성을 향상시킬 수 있다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 3 성분이 결합되어 있는 생분해성 이종복합체:

(i) 키틴, 키토산 또는 그 유도체에 의한 글루코사민 및 아세틸글루코사민을 주요성분으로 하는 생체고분자;

(ii) 가잠 또는 야잠 유래 견 피브로인; 및

(iii) 생리활성을 가지는 생체세라믹.
제1항에 있어서, 생리활성을 가지는 생체세라믹은 수산화인회석(하이드록시 아파타이트)인 것을 특징으로 하는 생분해성 이종복합체.
제1항에 있어서, 상기 생체고분자 100중량부에 대하여, 피브로인 및 생체 세라믹의 함량은 각각 5~100중량부 및 1~300중량부인 것을 특징으로 하는 생분해성 이종복합체.
제1항에 있어서, 다공체 형상, 막 형상, 겔 형상, 및 섬유 형상으로 구성된 군에서 선택되는 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 생분해성 이종복합체.
다음 단계를 포함하는 생분해성 이종복합 수용액 제조방법:

(a) 생리활성을 가지는 생체세라믹이 분산된 산성 수용액에 키틴, 키토산 또는 그 유도체에 의한 글루코사민 및 아세틸글루코사민을 주요 성분으로 하는 생체고분자를 첨가하여 생체고분자-생체세라믹 복합 수용액을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 생체고분자-생체세라믹 복합 수용액에 피브로인 수용액을 첨가한 다음, 기계적 교반에 의해 발포시켜 액체-기체 콜로이드(거품)상을 가지는 생분해성 이종복합 수용액을 수득하는 단계.
제5항의 방법에 의해 제조된 생분해성 이종복합 수용액을 열유도 상분리 및 용매 승화시키는 것을 특징으로 하는 규칙적인 비등방성 공극을 가지는 다공성 생분해성 이종복합체의 제조방법.
제6항의 방법에 의해 제조된 생분해성 이종복합체를 부분적으로 용해시켜 표면 또는 어느 일정 부분에 불균일한 등방성 공극을 형성시키고, 동시에 내면과 배면 또는 그 반대 부분에 규칙적인 비등방성 공극구조를 형성시키는 것을 특징으로 하는 이중 공극구조의 다공성 생분해성 이종복합체의 제조방법.
제6항 또는 제7항의 방법에 의해 수득된 생분해성 이종복합체를 아세틸화 처리하여 아세틸화도를 1~100%로 조절하는 것을 특징으로 하는 아세틸화 처리된 생분해성 이종복합체의 제조방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 생분해성 이종복합체를 압착하여 여러 겹으로 된 미세 접착 막을 형성시키는 것을 특징으로 하는 다중 막의 제조방법.
제9항의 방법에 의해 제조되고, 생분해성 이종복합체를 압착하여 여러 겹으로 압착된 미세 접착 막 구조의 다중 막.
제5항의 방법에 의해 제조된 생분해성 이종복합체의 수용액으로부터 기포 제거한 다음, 전기 방사하여 나노 섬유로 구성된 막을 형성시키는 것을 특징으로 하는 나노 섬유 막의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생분해성 이종복합체를 유효성분으로 함유하는 조직공학용 지지체 (스케폴드).
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생분해성 이종복합체를 유효성분으로 함유하는 골 또는 치공 충진용 의료재료.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생분해성 이종복합체를 유효성분으로 함유하는 조직재생 유도용 또는 차폐용 막.