KR20080066252A

KR20080066252A - 유두갑상선암의 새로운 진단마커 및 진단방법

Info

Publication number: KR20080066252A
Application number: KR1020070003463A
Authority: KR
Inventors: 김현기; 김진우
Original assignee: 김현기
Priority date: 2007-01-11
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2008-07-16
Also published as: WO2008085007A1; KR100886670B1

Abstract

본 발명은 미니염색체 유지 단백질 3(minichromosome maintenance protein 3, MCM3)의 유두 갑상선 암(papillary thyroid carcinoma, PTC) 진단마커로서의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 MCM3으로 이루어진 유두갑상선 암 진단마커, MCM3에 특이적인 항체를 포함하는 유두갑상선 암 진단용 키트, 및 MCM3에 특이적인 항체를 사용하여 유두 갑상선 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

유두 갑상선 암, 미니염색체 유지 단백질 3, 항체, 진단마커, 진단키트

Description

유두갑상선암의 새로운 진단마커 및 진단방법{NOVEL PROLIFERATION MARKER IN PAPILLARY THYROID CARCINOMA AND NOVEL METHOD OF DIAGNOSIS DETECTING THE MARKER}

도 1A는 PTC의 고유한 특성과 PTC 내 MCM3의 면역반응성을 보여주는 결과 사진으로서, 왼쪽 사진은 PTC의 특징적인 섬유혈관 심지를 갖는 유두엽 형상을 보여주는 것이고(100배), 오른쪽 사진은 정상 갑상샘 소포 세포(thyroid follicular cells)에 대한 음성 염색 결과를 보여주는 것이며(200배),

도 1B는 PTC 내 MCM3의 면역반응성을 보여주는 도면으로서, MCM3에 대한 면역조직화학 염색결과 PTC 세포내 핵 염색 패턴을 보여주는 사진이며(100배),

도 2는 증식중인 림프구내 MCM3에 대한 면역염색 결과를 보여주는 도면으로서, 유두갑상선 종양 근처 림프구 집합체내 증식중인 림프구들에서 MCM3 면역염색이 나타난 사진이며(200배),

도 3은 인간 갑상선 조직내 MCM3 단백질의 발현수준에 대한 웨스턴 블롯 분 석 결과를 보여주는 도면으로서, 인간 PTC 조직내 MCM3 단백질의 발현수준(C)을 각각에 대응하는 정상 조직내 MCM3 단백질의 발현수준(N)과 비교한 결과이며, 동일한 시료의 블롯들에 대해 MCM3에 대한 항체와 β-액틴에 대한 항체를 프로브로 사용한 결과를 각각 나타낸 것이다.

전세계적으로, 갑상선암은 내분비 기관의 악성 종양 중 가장 보편적인 형태이며, 유두갑상선암(PTC)은갑상선암의 가장 일반적인 형태이다. 또한, PTC는 여러가지 암들 중 발병률의 증가속도가 가장 빠른 암으로서, 1991년 10만명당 7.5명으로부터 2004년 8.4명으로 현저히 증가해왔으며, 특히 중년 여성에게서 가장 높은 증가율을 보여주고 있다[보건복지부, 한국중앙암등록 연례보고서, 서울, 2004]. 그리하여, 상기 갑상선암에 대한 종양 발생(tumorigenesis) 및 예후(prognosis)에 대한 관심이 높아져왔다.

나아가, PTC는 보편화된 증식 마커인 Ki-67 및 PCNA와 같은 현저한 증식 마커를 가지지 않은 암이다. 종양 세포의 증식능력은 성장중인 모든 종양에 전형적인 특징이다. 수많은 병리학자들과 임상의들이 세포 증식을 측정하여 예후 정보로 사용해왔다. Ki-67의 면역활성이 폐암, 연부조직 육종(soft tissue sarcoma), 뇌 수막염(meningioma), 전립선암, 비호지킨성 림프종(non-Hodgkin's lymphoma) 등의 몇몇 인간종양에 대한 보편적인 증식표지로서 널리 사용되어왔다[얀센 알엘(Jansen RL) 등, "MIB-1 labelling index is an independent prognostic marker in primary breast cancer", Br J Cancer 1998, 78:460-465 페리 에이(Perry A) 등, "The prognostic significance of MIB-1, p53, and DNA flow cytometry in completely resected primary meningiomas", Cancer (Phila.) 1998, 82:2262-2269; 마샬 알디(Mashal RD), 등 "Expression of cell cycle-regulated proteins in prostate cancer", Cancer Res 1996, 56:4159-4163; 및 달렌바흐 에프(Dallenbach F) 등, "Growth fractions in malignant non-Hodgkin's lymphomas (NHL) as determined in situ with the monoclonal antibody Ki-67", Hematol Oncol 1984, 2:365-371]. Ki-67의 이러한 유용성에도불구하고, 몇몇 보고서를 통해 세포주기에 직접 관련이 있다기보다는 세포 증식기 리보솜 생합성에 있어서 어떤 역할을 하는 것일 수도 있다는 보고가 있었으나, 아직까지 Ki-67의 기능에 대해 명백하게 알려지지 않은 상태이다[맥캘럼 디이(MacCallum DE), 등, "The location of pKi67 in the outer dense fibrillary compartment of the nucleolus points to a role in ribosome biogenesis during the cell division cycle", J Pathol 2000, 190:537-544]. 특히, PTC에 대해서는, Ki-67이 신뢰할만한 증식표지인지 여부에 대해서는 의문시 되고 있다[에릭슨 엘에이(Erickson LA) 등, "Expression of p27kip1 and Ki-67 in benign and malignant thyroid tumors", Mod Pathol 1998, 11:169-174; 및 카토 알(Katoh R) 등, "Growth activity in hyperplastic and neoplastic human thyroid determined by an immunohistochemical staining procedure using monoclonal antibody MIB-1", Hum Pathol 1995, 26:139-146]. 따라서, PTC의 증식 활성을 보다 정확히 가늠하기 위해 DNA 복제에 직접적인 관련이 있는 또 다른 증식 표지가 필요로 되고 있다.

한편, 여섯 개 단백질로 구성된 MCM 단백질 군(MCM2 내지 7)은 DNA-결합 단백질들 중 가장 잘 보존된 그룹이고 진핵세포내 DNA 복제에 필요한 단백질로서 알려져있다[타이 비케이(Tye BK), "MCM proteins in DNA replication" Annu Rev Biochem 1999, 68:649-686]. MCM 단백질은 DNA 복제의 개시와 조절에 관련이 있다. MCM 단백질은 DNA 복제 기원에 결합하고 그에 뒤이어 기원 인식 복합체(origin recognition complex, ORC)와 Cdc 6 단백질과 상호작용을 함으로써 복제전 복합체(prereplicative complex)를 형성한다. S-상을 개시하는 때에, Cdc6 단백질이 복제전 복합체로부터 방출되어 DNA 합성을 조절함으로써 DNA가 각 세포주기동안 단 한번만 복제되도록 한다[쉐발리에 에스(Chevalier S) 등, "Cell cycle control of replication initiation in eukaryotes" Curr Opin Cell Biol 1996, 8:815-821]. MCM 단백질들은 세포주기내내 모든 세포에서 발현되며, 휴지상태의 세포와 분화중인 세포에서는 MCM 단백질 발현이 나타나지 않는 것으로 보고되어 있다[매다인 엠에이(Madine MA) 등, "The roles of the MCM, ORC, and Cdc6 proteins in determining the replication competence of chromatin in quiescent cells" J Struct Biol 2000, 129:198-210.]. 비종양성 증식 및 종양성 이상 모두에서 증식 구획을 한정하는데 MCM 단백질에 대한 항체를 사용할 수 있다. 대부분의 연구에서 상기 여섯 개 MCM 단백질들 모두가 유사한 면역염색(immunostaining) 결과를 갖는 것으로 보고되었다[히라이와 에이(Hiraiwa A) 등, "Immunolocalization of hCDC47 protein in normal and neoplastic human tissues and its relation to growth" Int J Cancer 1997, 74:180-184; 및 프리만 에이(Freeman A) 등, "Minichromosome maintenance proteins as biological markers of dysplasia and malignancy" Clin Cancer Res 1999, 5:2121-2132.].

그러나, 다양한 종양내 MCM 단백질 발현에 대한 대부분의 연구는 MCM2와 MCM5에 대해 이루어진 것이 모두이다[램나스 엔(Ramnath N) 등, "MCM2 is an independent predictor of survival in patients with nonsmall-cell lung cancer", J Clin Oncol 2001, 19:4259-4266; 스퇴버 케이(Stoeber K) 등, "Diagnosis of genito-urinary tract cancer by detection of minichromosome maintenance 5 protein in urine sediments" J Natl Cancer Inst (Bethesda) 2002, 94:1071-1079; 곤잘레스 엠에이(Gonzalez MA) 등, "Minichromosome maintenance protein 2 is a strong independent prognostic marker in breast cancer" J Clin Oncol 2003, 21:4306-4313; 및 가토 에이치(Kato H) 등, "A new proliferation marker, minichromosome maintenance protein 2, is associated with tumor aggressiveness in esophageal squamous cell carcinoma" J Surg Oncol 2003, 84:24-30]. 많은 연구에서 MCM 단백질 면역반응성이 증식중인 세포의 표지 로서 사용될 수 있음이 제안되었다[가토 에이치 등, "A new proliferation marker, minichromosome maintenance protein 2, is associated with tumor aggressiveness in esophageal squamous cell carcinoma" J Surg Oncol 2003, 84:24-30; 및 하 에스에이(Ha SA) 등, "Cancer-associated expression of minichromosome maintenance 3 gene in several human cancers and its involvement in tumorigenesis" Clin Cancer Res 2004, 10:8386-8395]. 선행연구에서 사체조직들을 이용한 세포주기진입의 평가에서 MCM2가 Ki-67 보다 훌륭한 표지일 수 있음이 보고된 바 있다[로딘스 케이(Rodins K) 등, "Minichromosome maintenance protein 2 expression in normal kidney and renal cell carcinomas: relationship to tumor dormancy and potential clinical utility" Clin Cancer Res 2002, 8:1075-1081]. 그러나, MCM3에 대한 유용성에 대해서는 아직까지 보고된바 없으며, 특히, MCM 단백질 발현수준과 PTC와의 관계에 대해서 밝혀진 바 없다. 본 발명에서는 PTC에 대한 새롭고 신뢰할만한 진단 마커로서의 MCM3의 유용성을 평가하여 PTC 진단을 위한 효과적인 진단마커의 요구에 부응하고자 한다.

본 발명의 목적은 유두 갑상선 암에 대한 효과적인 진단 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 미니염색체 유지 단백질 3(MCM3)의 유두 갑상선 암의 진단마커로서의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 MCM3에 특이적인 항체를 사용하여 유두 갑상선 암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 MCM3에 특이적인 항체를 포함하는 유두 갑상선 암 진단용 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 유두 갑상선 암(PTC)에 대한 새롭고 효과적인 진단마커를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 미니염색체 유지 단백질 3(MCM3)과 PTC의 임상병리학적 파라미터들과의 관련성을 밝히고 상기 단백질을 PTC에 대한 진단마커로서 제공한다.

본 발명자는 상기 MCM3 단백질의 발현양이 유두 갑상선 암의 조직내에서 현저히높고 정상의 갑상선 조직에서 현저히 낮거나 거의 없는 것으로 확인하였다. 따라서, MCM3 단백질의 발현양을 검출하면 유두 갑상선 암의 진단이 가능하다.

본 발명의 진단방법은 a) 개체로부터 얻은 조직시료를 제공하고, b) 상기 시료를 MCM3와 특이적 결합을 형성하는 진단시약과 접촉시킨 다음, c) (b)에서 형성된 MCM3와 이에 대한 진단시약 간의 복합체 형성을 확인하여 유두 갑상선 암(PTC)를 진단하는 것으로 이루어진다.

상기 진단방법에 사용되는 진단시약은 MCM3와 특이적인 결합을 형성할 수 있는 단백질, 항원 등으로부터 선택되는 하나를 함유할 수 있고, 바람직하게는 상기 진단시약은 MCM3에 특이적인 항체를 함유하며, 상기 항체는 모노클로날또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한, 상기 진단시약은 상기 항체의 일부 절편 또는 MCM3와의 결합을 위한 도메인을 필수로 포함하는 절편을 성분으로 할 수 있다.

MCM3에 특이적인 항체는 당해 기술분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서든 제작될 수 있다. 예들 들면, 윤승규 등, "The human cervical cancer oncogene protein is a biomarker for human hepatocellular carcinoma" Cancer Research , 2004; 64: 5434-5441에 기재된 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 경우 토끼에서 생성한 모노클로날 항체를 사용할 수 있으며, 이에 나아가 이와 다른 종 유래의 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체도 사용될 수 있다 .

MCM3와 이에 특이적인 항체와의 복합체의 형성은 검출 표지를 사용하여 확인될 수 있다. 검출 표지로서 염색원, 형광물, 효소, 리간드, 발광물, 방사선동위원소를 비롯하여 당업자에게 알려져 있는 모든 검출표지가 사용될 수 있다. 본 발명의 구체예에서는 MCM3와의 복합체 형성을 확인하기 위해 비오틴이 표지된 항-마우스 면역글로불린(Ig) G를 2차 항체로 사용하고, 3,3-디아미노벤지딘-히드로겐 퍼옥 시드를 염색원(chromogen)으로 사용하였다.

본 발명의 진단방법은 상기한 항체를 사용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 면역조직화학 분석법, 효소 면역측정법(ELISA), 방사선면역측정법(RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔 상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 개체의 시료 중 MCM3 단백질의 발현량을 확인함으로써 PTC를 진단할 수 있다.

본 발명의 진단키트는 MCM3에 특이적인 항체 및 검출 표지를 포함한다. 본 발명의 진단키트는 2차 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 항체 및 검출 표지는 위에서 상술한 바와 같으며, 상기 2차 항체는 바람직하게는 면역글로불린 G(Ig G)이다.

본 발명의 MCM3의 PTC에 대한 다양한 임상변리학적 파라미터와의 관련성을 통해 MCM3 단백질이 PTC 진단 마커로서의 갖는 유용성을 확인하기 위해서, PTC 조직의 MCM3에 대한 면역조직화학적(immunohistochemical) 분석, 및 PTC 환자의 조직과 정상조직간 MCM3 발현수준 비교를 위한 웨스턴 블롯 분석을 수행할 수 있다.

면역조직화학적 분석 결과, MCM3 발현수준은 PTC 환자들에게서 매우 높게 나타났으며, 특히 MCM3 단백질 수준은 종양크기 및 피막외 확장과 현저한 관련성을 보였다. 따라서, MCM3 발현정도가 세포군의 빠른 증식 구획을 검출하는데 있어서 보다 민감하고 신뢰할만한 마커가 될 수 있음을 알 수 있다.

항-MCM 항체의 PTC에서 유도된 악성종양 세포에 대한 증식 마커로서의 유용성을 파라핀에 잠긴 섹션상에 친화도-정제 폴리클로날 항체로 확인할 수 있는데, PTC 조직에 대해서 특징적인 섬유혈관 심지를 가진 유두엽(papillary fronds) 형상을 나타내는(도 1A, 왼쪽) 반면, 정상적인 갑상선 조직은 항-MCM3 항체와 양성 반응도 보이지 않는다(도 1A, 오른쪽). 항-MCM3 항체의 면역반응성에 의존한 염색 결과 주로 암 소(nest)의 둘레로 MCM3 단백질의 핵내 분포에 일치하는 염색 패턴을 보인다(도 1B). 또한, PTC 주변의 림프구 집합체에서도 증식중인 림프구내에서는 MCM3의 과발현이 확인된다(도 2).

MCM3 단백질 발현수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과 모든 PTC 환자의 조직시료에서 MCM3 단백질이 과발현되었음을 확인하였다(도 3 참조). 대조적으로 모든 정상 조직에서는 MCM3의 발현수준이 매우 낮거나 거의 없었다.

결론적으로, PTC의 진단에 있어서 MCM3 단백질은 신뢰할 만한 표지가 될 수 있다. 특히, MCM3 단백질은 PTC 환자에게서 종양의 성장을 측정하고 종양 침투 및 예후 인자를 평가하는데 유용하다. 따라서, MCM3은 PTC의 종양성장성 및 종양침투성의 진단에 유용한 증식 마커라고 할 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: PTC 환자 조직시료 수집

총 30명의 유두 갑상선 암(PTC) 환자들로부터 채취된 조직 시료와 임상기록자료를 분석하여 표 1에 나타내었다. 상기 임상기록은 연령, 성별 및 종양 크기를 포함한다. 이들 환자의 평균연령은 45세였다(20 내지 67세의 범위).

림프절 전이, 림프구 침투, 피막외 확장, 근육침투, 종양 다양성 등을 비롯한 조직병리학적 인자들을 통상 인정되는 진단 표준을 사용해서 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 섹션(H-E)에서 평가했다. 상기 30명 중 16명은 초기환자(I기)이고, 14명은 후기환자였다.

PTC 환자 30명의 MCM3 수준, Ki-67 수준 및임상병리학적 특징

No	나이	성별	종양크기 (cm)	종양다양성	피막외 확장	림프절 전이	림프절 침투	근육 침투	MCM3¹ ⁾	MCM3 등급	Ki-67¹⁾
1	64	F	1.5	+	+	-	-	-	30	2	2
2	18	M	1.5	+	+	+	+	-	30	2	5
3	45	F	1.6	+	-	-	-	-	40	2	5
4	43	F	2.5	-	+	+	+	-	80	4	5
5	30	F	0.7	-	-	-	-	-	60	3	1
6	38	F	0.4	-	-	-	-	-	10	1	2
7	51	F	1.5	-	+	-	-	-	60	3	5
8	44	F	0.7	-	+	-		-	10	1	1
9	55	M	3	-	+	+	+	+	70	3	3
10	37	F	0.8	-	-	-	-	-	80	4	1
11	63	F	2.5	+	+	-	-	+	70	3	3
12	53	F	1.5	+	+	-	-	+	50	2	3
13	55	F	1.2	-	+	-	-	-	80	4	3
14	45	F	1.5	-	-	-	-	-	80	4	3
15	40	F	1.8	-	-	-	-	-	10	1	1
16	64	M	1.8	-	+	-	-	-	20	1	2
17	56	F	0.6	-	-	-	-	-	10	1	1
18	28	F	0.8	-	+	-	-	-	10	1	3
19	33	M	4	-	+	-	-	-	80	4	3
20	56	M	1	-	-	-	+	-	20	1	2
21	54	M	4	-	+	-	-	+	20	1	5
22	55	F	1	-	-	-	+	-	70	3	2
23	64	M	2.8	-	+	+	+	+	30	2	3
24	45	F	2.5	+	+	-	+	+	40	2	1
25	50	F	1	-	+	-	-	-	5	1	2
26	47	F	1	-	+	-	-	+	40	2	3
27	47	F	1	-	+	-	-	+	30	2	1
28	24	F	1.3	-	+	-	-	-	30	2	1
29	67	F	0.8	-	-	-	-	-	10	1	10
30	57	F	1.8	+	+	-	-	-	10	1	2

¹⁾ 총 100개 악성종양 세포들에대해 산출된 양성 종양 세포의 비율.

실시예 2: MCM3 단백질에 대한 항체 생산

MCM3 유전자 생성물에 대한 래빗(rabbit) 폴리클로날 항체를 형성하였다. MCM3의 PCR 생성물을 pBAD/TOPO 발현벡터(pBAD/TOPO 티오퓨전 발현키트, 인비트로젠 사, 미국)에 붙여 6x 히스티딘 태그와 융합된 전체 MCM3를 발현하는 플라스미드를 제작하였다. 이렇게 제작된 플라스미드를 E.Coli에 도입하고 아라비노스로 상기 E.Coli를 유도하여 융합단백질을생성하고, Ni-니트릴로테트라아세트산-아가로스 칼럼(ProBond 정제시스템, 인비트로젠 사, 미국)을 사용하여 정제하였다. 뉴질랜드 화이트 래빗(New Zealand White rabbits)에서 상기 정제된 단백질에 대한 항체를 생성했다. 결과 얻어진 토끼의 혈청을 CNBr-활성화 세파로스 비드(Amersham Biosciences사, 미국)에 교차공유결합된 MCM3 단백질과의 친화도를 이용하여 정제했다.

실시예 3: 면역조직화학 염색

스트렙타비딘-비오틴 복합체 면역과산화효소 방법(Dako사, 덴마크)을 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 항원 복구를 위해 마이크로파 전처리를 10mM 농도의 시트레이트(citrate) 완충액 내에서 9분간 수행하였다. 내생(endogenous) 과산화효소의 활성은 메탄올 내 0.3% H2O2를 사용하여 30분간 차단하였다. MCM3에 대한 항체(Dako 사, 덴마크)를 1:50의 비율로 희석하여 PTC 환자로부터 얻은 조직시료와 정상인의 갑상선 조직 시료에 각각 적용한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이트하였다. 비오틴이 표지된 항-마우스 면역글로불린(Ig) G를 2차 항체로 사용하고, 3,3-디아미노벤지딘-히드로겐 퍼옥시드를 염색원(chromogen)으로 사용하였다. 구획들이 헤마톡실린으로 대비 염색된 후, 탈수시키고, 정화시킨 다음 고정하였다. 트리스 완충 식염수로 1차 항체를 대체한 음성대조군을 준비했다.

비교예: Ki-67 항체를 사용한 면역조직화학 염색

스트렙타비딘-비오틴 복합체 면역과산화효소 방법(Dako사, 덴마크)을 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 항원 복구를 위해 마이크로파 전처리를 10mM 농도의 시트레이트(citrate) 완충액 내에서 9분간 수행하였다. 내생(endogenous) 과산화효소의 활성은 메탄올 내 0.3% H2O2를 사용하여 30분간 차단하였다. Ki-67에 대한 항체(Dako 사, 덴마크)를 1:100의 비율로 희석하여 적용한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이트하였다. 비오틴이 표지된 항-마우스 면역글로불린(Ig) G를 2차 항체로 사용하고, 3,3-디아미노벤지딘-히드로겐 퍼옥시드를 염색원(chromogen)으로 사용하였다. 구획들이 헤마톡실린으로 대비 염색된 후, 탈수시키고, 정화시킨 다음 고정하였다. 트리스 완충 식염수로 1차 항체를 대체한 음성대조군을 준비했다.

결과분석

실시예 3 및 비교예에서 얻은 면역조직화학 염색 결과에 대해 분석을 수행하였다. 구획들은 고해상도(400배)로 관찰되었다. 뚜렷한 핵 염색 상태를 보여야 양성으로 인정되었다. MCM3 및 Ki-67 라벨 인덱스를 대부분의 활성영역 내에 있는 1,000개의 종양세포에 대한 퍼센티지로 평가되었다. 종양의 라벨인덱스(MCM3 및 Ki-67에 대한 양성 종양 세포들의 퍼센티지)를 1군(0-25%), 2군(26-50%), 3군(51-75%) 및 4군(76-100%)의 네 개의 등급으로 분류하였다(표 1; MCM3 등급).

PTC의 항-MCM3 항체 반응 및 면역염색 결과 특징적인 섬유혈관 심지를 가진 유두엽(papillary fronds) 형상을 관찰하였다(도 1A, 왼쪽). 항-MCM3 항체의 면역반응성에 대해서는, 이러한 유두상(papillary) 구조의 종양세포는 주로 암의 소(nest)의 둘레로 핵 염색 패턴을 보였는데, 이는 MCM3 단백질의 핵내 분포에 일치하는 것이다(도 1B). 그러나, PTC에 대조적으로, 정상적인 갑상선 조직에서는 염색결과 항-MCM3 항체와의 어떠한 양성 반응도 보이지 않았다(도 1A, 오른쪽). 이는 MCM3 발현이 PTC와 강한 견련성이 있음을 보여주는 것이다. 도 2는 또한 PTC 주변의 림프구 집합체에서 증식중인 림프구내MCM3를 면역염색한 결과를 보여주고 있다.

한편, MCM3와 Ki-67 발현과, 환자의 변수(clinical variables) (나이, 성별, 종양크기) 및 임상적인 지표(histopathologic parameters)(림프절 전이, 림프절 침투, 피막외 침습, 근육 침투, 종양의 다중성)와의 상관관계를 분산분석방법으로 결정하였다. 단순회귀분석방법(simple regression analysis)을 사용하여 MCM3 및 Ki-67 라벨 지수간의 상관관계를 분석하였다.

표 2에 30명의 PTC 환자들에서 얻은 조직들의 임상병리학적 파라미터들과 MCM3 및 Ki-67 라벨 지수들간의 관계를 정리하였다.

MCM3 및 Ki-67 라벨 인덱스와 임상병리학적 인자들과의 상관관계

파라미터	환자수	MCM3 LI P-값	Ki-67 LI P-값
성별
남자 여자	7 23	0.939	0.454
나이
> 45 <45	20 10	0.776	0.265
종양크기
<1.0cm 1.0-2.0cm 2.0-4.0cm >4.0cm	7 16 5 2	0.031	0.271
종양다양성
존재 부존재	7 23	0.071	0.759
림프절 전이
존재 부존재	4 26	0.702	0.184
피막외 확장
존재 부존재	20 10	0.037	1.000
림프구 침투
존재 부존재	7 23	0.590	0.759
근육 침투
존재 부존재	8 22	0.134	0.933

상기 표 2는 면역조직화학적 분석에 있어서, 대조군으로서 당해기술분야에서 보편적으로 종양의 마커로 사용되고 있는 Ki-67에 대한 면역조직화학적 분석을 함께 수행하여 MCM3에 대한 분석결과와 비교한결과이다. 이러한 분석 결과를 보면, MCM3 라벨인덱스(LI)는 종양크기(P=0.031) 및 피막외 확장(P=0.037)에 대해 현저한 통계적 관련성을 보인반면, Ki-67 LI는 실험대상 PCT 환자들 30명에서 8가지의 임상병리학적 파라미터들과 통계학적으로 중요한 관련성을 보이지 않았다. 그러므로, Ki-67은 PTC 증식을 검사하는데 좋은 지표는 아닌 것으로 여겨진다.

일차종양에서, MCM3와Ki-67라벨지수 사이에현저한 상호관련성이 관찰되지는 않았으나, MCM3 LI는 상당히 더 높았다.

MCM3과 Ki-67 단백질의 PTC에서의 발현수준을 조사한 결과, Ki-67 LI가 PTC에서 낮게 나타남을 확인했다. 이러한 조사 결과와 일치하게, 대부분의 연구들에서 잘 분화된 갑상선 암종 내 낮은 Ki-67 LI 값을 확인하고 있다[티믈러 디(Timler D) 등, "Expression of proteins: D1 cyclin and Ki-67 in papillary thyroid carcinomas" Folia Histochem Cytobiol 2001, 39:201-202 크젤만 피(Kjellman P) 등, "MIB-1 index in thyroid tumors: a predictor of the clinical course in papillary thyroid carcinoma" Thyroid 2003, 13:371-380 시이로넨 피(Siironen P) 등, "Prognostic factors in papillary thyroid cancer: an evaluation of 601 consecutive patients" Tumour Biol 2005, 26:57-64.]. 본 발명자들에 의해서 Ki-67 LI 값이 종양의 임상병리학적 파라미터들과 상당한 관련성을 갖지 아니한다는 사실이 명백해졌다.

위와 같이, MCM3 LI가 Ki-67 LI보다 상당히 높다는 사실은 Ki-67이 MCM3 보다 짧은 세포주기 간격 동안 발현될 수 있음을 보여주는 것이다. 구체적으로, MCM3은 세포주기 전체에 걸쳐 존재하다가, MCM3의 mRNA 수준은 G1-S의 경계면에서 극적으로 증가한다. Ki-67이 S, G2 그리고 M기에서 주로 발현됨에 반해, MCM3는 정상 세포와 신생중인 세포에서도 G1 초기에 발현이 이루어지는데, Ki-67은 이 시기에 검출되지 않는다.

또한, 임상병리학적 특징들간의 상호관계를 분석해보면, 표 2의 8가지 임상병리학적 특징들 중, 연령과 종양의 다중도는 다른 파라미터들과 유의할만한 관계를 보이지 않았다. 반면, 종양의 크기는 피막외 확장과 상당한 관련이 있었다(P=0.016). 본 발명자들은 또한 피막외 확장과 근육 침투 사이에 상당한 관련성을 확인했다(P=0.019). 부가하여, 림프절 침투와 국소 림프절 전이 사이의 상관관계 역시 상당했다(P=0.000). 최종적으로, 성별(남자)은 종양 크기(P=0.015), 림프절 전이(P=0.007), 그리고 림프절 침투(P=0.015)와 상당히 상관관계를 가지고 있었다.

실시예 4: 웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯 분석을 위해, 조직시료를 프로테아제저해제 혼합물(Sigma사, 미국)을 함유한 라이시스 완충액(lysis buffer)[20mM 트리스(pH7.4), 1% NP40, 5mM EDTA, 10% 글리콜, 0.1% SDS, 및 150mM NaCl] 내에서 호모게나이즈 시켰다. 상기 호모게나이즈된 시료를5,000G에서 10분간 원심분리하여 맑게 하였다. 총 단백질 중 20㎍을 함유하는 세포 라이세이트를 동일한 부피로 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다. 그 후 단백질 샘플을 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 상기 블롯들을 폴리클로날 항-MCM3 혈청과 함께 인큐베이션하고 개량된 화학발광 검출 키트(Pierce 사, 미국)로 현상하였다.

6개 PTC와 정상 갑상선 조직의 MCM3 발현수준을 비교한 결과를 도 3에 나타냈다. 도 1 및 도 2에서와 같이, MCM3 단백질은 정상조직에서보다 PTC에서 높은 수준으로 검출되었고, 정상 갑상선 조직에서 MCM3 단백질 수준은 매우 낮거나 거의 없었다.

본 발명은 유두갑상선암에 대한 새롭고 효과적인 진단마커로서 MCM3 단백질을 제공한다. 본 발명에 따르면 유두갑상선암에 대한 정확한 조기진단이 가능할 것이다.

Claims

a) 개체로부터 얻은 조직시료를 제공하는 단계, b) 상기 시료를 MCM3에 대한 특이적 결합을 형성하는 진단시약과 접촉시키는 단계, c) 단계 (b)에서 형성된 MCM3와 이에 대한 진단시약 간의 복합체 형성을 확인하여 유두 갑상선 암(PTC)를 진단하는 단계를 포함하는 PTC의 진단방법.
제1항에 있어서, 진단시약은 MCM3와 특이적인 결합을 형성할 수 있는 단백질 또는 항원으로부터 선택되는 하나를 포함하는 PTC의 진단방법.
제2항에 있어서, 상기 진단시약은 MCM3에 특이적인 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 PTC의 진단방법.
제3항에 있어서, 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 MCM3와의 결합을 위한 도메인을 필수로 포함하는 항체의 일부 절편인 것을 특징으로 하는 PTC의 진단방법.
제1항 있어서, (c) 단계의 복합체 형성의 확인은 염색원, 형광물, 효소, 리간드, 발광물 및 방사선동위원소로부터 선택되는 어느 하나의 검출표지에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 PTC의 진단방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 복합체 형성의 확인은 면역조직화학 분석법, 효소 면역측정법(ELISA), 방사선면역측정법(RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔 상의 웨스턴 블롯 및 면역 블롯 분석방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 PTC의 진단방법.
MCM3와 특이적인 결합을 하는 진단시약 및 검출표지를 포함하는 PTC 진단용 키트.
제7항에 있어서, 상기 진단시약은 MCM3에 특이적인 항체를 포함하는 PTC 진단용 키트.
제8항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 MCM3와의 결합을 위한 도메인을 필수로 포함하는 항체의 일부 절편인 것을 특징으로 하는 PTC 진단용 키트.
제7항에 있어서, 상기 검출표지는 염색원, 형광물, 효소, 리간드, 발광물 및 방사선동위원소로부터 선택되는 어느 하나인 PTC 진단키트.
제7항에 있어서, 2차 항체를 더 포함하는 PTC 진단키트.
제11항에 있어서, 2차 항체는 면역글로불린 G인 PTC 진단키트.
MCM3로 구성되는 유두 갑상선 암의 진단마커.