KR20080054166A - Method of producing smallpox vaccine using cell culture and the smallpox vaccine produced by the method - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 NYCBOH 바이러스, Lister/Elstree 바이러스, WR strain의 crmB 지놈 (genome) PCR을 수행한 결과(좌)와 crmB 지놈(genome) PCR 산물을 NlaIII 제한효소로 처리 후 분석결과(우)를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the results of performing the crmB genome PCR of the NYCBOH virus, Lister / Elstree virus, WR strain (left) and the analysis results (right) after treatment of the crmB genome PCR product with NlaIII restriction enzyme .
도 2는 두창 백신용 바이러스를 MRC-5 세포주에 다양한 농도의 M.O.I (multiplicity of infection)로 감염시킨 뒤, 바이러스 생산량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 2 is a diagram showing the results of measuring virus production after infecting a vaccine for head vaccine with M.O.I (multiplicity of infection) at various concentrations.
도 3은 두창 백신용 바이러스를 MRC-5 세포주에 0.01 M.O.I로 감염시킨 뒤, 배양시간에 따른 바이러스 생산량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.3 is a diagram showing the result of measuring the virus production according to the culture time after infecting the virus for the head vaccine with MRC-5 cell line 0.01 M.O.I.
도 4는 6개의 후보 안정제의 바이러스 역가 유지 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 4 shows the results of measuring the degree of virus titer retention of six candidate stabilizers.
도 5는 두창 백신 생산 공정도를 도식화한 도면이다.5 is a schematic diagram of a vaccine production process for the vaccine.
본 발명은 세포배양을 이용하여 NYCBOH(New York City Board of Health Strain) 백시니아 바이러스(vaccinia virus)로부터 두창 백신을 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 생산된 두창 백신에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a vaccine against the vaccine from New York City Board of Health Strain vaccinia virus (NYCBOH) using cell culture, and to a vaccine produced by the method.
두창은 바이러스에 의한 급성 전염병으로서 7일 ~ 17일간의 잠복기(평균 12일)를 거쳐 반점 구진상 발진이 나타난 후, 수포 농포 등의 순서로 진전되고 30%이상의 치사율을 가지며 생존자들에겐 안면 흉터를 남긴다. 두창의 병원균인 베리올라 바이러스(variola virus)는 원숭이 천연두(monkeypox), 우두(cowpox), 및 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 함께 오르토폭스바이러스 속(Orthopoxvirus genus)에 속한다. 오르토폭스바이러스 바이러스들은 상호 간에 강한 교차면역을 유도하는 특징을 가지고 있어, 베리올라 바이러스에 비해 병원성이 약한 백시니아 바이러스로부터 제조된 백신이 두창 근절을 위한 세계적 프로그램에 이용되어 왔으며, 이는 1980년 세계보건기구(WHO) 두창이 완전히 사라짐을 선언함으로써 그 효과를 입증하였다 (WHO. Declaration of global eradication of smallpox. Wkly Epideminol Rec 1980:55:148).Acute infectious disease caused by a virus is a papule rash after 7 to 17 days of incubation period (average 12 days), followed by blister pustules, and more than 30% mortality. Leave The bacillus pathogen, variola virus, belongs to the Orthopoxvirus genus, along with monkeypox, cowpox, and vaccinia virus. Orthopox virus viruses are characterized by inducing strong cross-immunity with each other, so vaccines made from vaccinia virus, which is less pathogenic than that of the berryola virus, have been used in the global program for eradicating cramps. The WHO proves its effectiveness by declaring its complete disappearance (WHO. Declaration of global eradication of smallpox. Wkly Epideminol Rec 1980: 55: 148).
두창의 병원균인 베리올라 바이러스는 1) 에어로졸 상태에서 안정하고 2) 대량생산이 용이하며 3) 미량으로 감염이 가능하고 4) 사람간 높은 전염성이 알려져 있고 5) 긴 (7일 ~ 17일) 잠복기를 가지며 6) 높은 치사율을 가지는 등 생물무기로 개발되기 쉬운 특징들을 가지고 있어 유출 시 위험성에 대해서 항상 우려가 있어 왔다. Veriola virus, a pathogenic bacterium, is 1) stable in aerosol conditions, 2) easy to mass-produce, 3) capable of infecting in trace amounts, 4) highly contagious among humans, and 5) long (7 to 17 days) incubation period. 6) It has characteristics that are easy to be developed as biological weapons, such as high mortality, and there has always been a concern about the risk of spillage.
두창 근절에 대한 불확실성 및 생물 테러 무기로의 위험성으로 인해 각 국에 서는 비상시의 사용을 위하여 두창 백신을 비축하고 있다. 미국의 경우 소에서 생산한 1세대 두창백신을 일부 위험군에 접종하고 있으며, 일본을 비롯한 일부 선진국들도 자국의 소모량을 공급하기 위해 자체적으로 백신을 개발하거나 1세대 두창백신을 구매하는 등의 자구적인 대책을 마련하고 있는 것으로 알려져 있다.Uncertainty about the eradication of poisons and the dangers of biological terrorist weapons have led to stockpiling of vaccines in countries for emergency use. In the US, some generations of cows are inoculated with cows from the first generation of vaccines. Some developed countries, including Japan, also develop their own vaccines or purchase first-generation vaccines. It is known that measures are taken.
두창 박멸 프로그램에 사용된 1세대 두창 백신은 백시니아 바이러스를 소나 토끼, 양과 같은 동물의 피부에서 생산된 백신이었다. 살아있는 동물 피부를 이용한 이와 같은 방법은 백신 생산에는 효과적이었으나 미생물 오염 등 품질에 대한 우려가 존재했다. 또한, 제한된 공급과 현재 보유하고 있는 1세대 백신의 유효기간의 만기 등의 사유로 인해 MRC-5, Vero 세포 등을 이용하여 백신을 생산하는 2세대 두창백신 개발이 시급한 상황이다. The first generation of vaccines used in the WP eradication program was vaccinia virus produced from the skin of animals such as cattle, rabbits and sheep. This method using live animal skin was effective in vaccine production, but there were concerns about quality, including microbial contamination. In addition, due to limited supply and the expiration date of the current 1st generation vaccine, it is urgent to develop a 2nd generation vaccine for vaccines using MRC-5 and Vero cells.
이에, 본 발명자들은 세포배양에 의해 생산되는 순도 높고 안전한 두창 백신을 개발하기 위해 1세대 백신 DRYVAXR의 원바이러스주와 동일한 바이러스주인 NYCBOH(New York City Board of Health)를 MRC-5 세포주에서 배양 및 정제하는 기술을 개발하였다. 본 발명자들이 개발한 제조공정을 거쳐 생산된 백신은 전임상 시험 결과 안전하고 유효함이 밝혀졌으며, 전임상 결과를 바탕으로 현재 임상시험을 진행 중이다. Accordingly, the present inventors cultured and cultivated the New York City Board of Health (NYCBOH), the same virus strain as the original virus strain of the first generation vaccine DRYVAX R , in an MRC-5 cell line, in order to develop a high purity and safe vaccine against the vaccine produced by cell culture. The technology to purify was developed. Vaccines produced through the manufacturing process developed by the present inventors have been found to be safe and effective as a result of preclinical studies, and are currently undergoing clinical trials based on preclinical results.
본 발명의 목적은 세포배양을 이용하여 NYCBOH 바이러스 균주로부터 두창 백신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for producing a vaccine against the NYCBOH virus strain using cell culture.
본 발명의 또 다른 목적은 세포배양을 이용하여 NYCBOH 바이러스 균주로부터 생산된 두창 백신을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a vaccine for vaccines produced from NYCBOH virus strains using cell culture.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인간 유래 세포주에 백시니아 바이러스 NYCBOH 스트레인을 접종하고 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 약독화된 백시니아 바이러스를 회수하는 단계를 포함하는, 약독화된 백시니아 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of inoculating and culturing vaccinia virus NYCBOH strain in human-derived cell line; And recovering the attenuated vaccinia virus from the culture.
본 발명의 약독화된 백시니아 바이러스를 생산하는 방법은 인간 유래 세포주에 백시니아 바이러스 NYCBOH 스트레인을 접종하고 배양하는 단계를 포함한다.The method for producing attenuated vaccinia virus of the present invention comprises inoculating and culturing vaccinia virus NYCBOH strain in a human derived cell line.
본 발명에 있어서, 상기 인간 유래 세포주는 인간 태아 폐조직의 이배체 섬유아세포의 세포주인 MRC-5 세포주일 수 있다.In the present invention, the human-derived cell line may be an MRC-5 cell line which is a cell line of diploid fibroblasts of human fetal lung tissue.
본 발명에 있어서, 상기 인간 유래 세포주는 10%의 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 2 내지 3일간 배양하여 100% 합류(confluency)까지 배양된 것일 수 있다. In the present invention, the human-derived cell line may be cultured for 2 days to 3 days at 37 ° C., 5% CO 2 incubator with DMEM medium containing 10% serum, and then cultured to 100% confluency.
본 발명에 있어서, 상기 백시니아 바이러스 NYCBOH 스트레인은 ATCC xxxx 또는 CJ-MVB-SPX인 것일 수 있다. 상기 CJ-MVB-SPX는 ATCC로부터 입수한 NYCBOH 바이러스주(ATCC VR-118)를 MRC-5 세포주에서 4회 계대배양하여 제조된 NYCBOH 마스터 바이러스 뱅크이다. In the present invention, the vaccinia virus NYCBOH strain may be one of ATCC xxxx or CJ-MVB-SPX. The CJ-MVB-SPX is a NYCBOH master virus bank prepared by passage four times the NYCBOH virus line (ATCC VR-118) obtained from ATCC in MRC-5 cell line.
NYCBOH(New York City Board of Health strain)바이러스주는 폭스바이러스 과에 속하는 백시니아 바이러스이며 Lederle-Chorioallantoic strain이라고도 알려져 있다. 원 유래는 사람이며 CE, RabK, HaK, KB, WI-38, LLC-MK2 및 베로 세포(vero cell) 등에서 잘 자란다고도 알려져 있다. ATCC에서 제공하는 바이러스의 특성 정보에 따르면 NYCBOH는 소, 토끼, 사람 그리고 CE 등에서 번갈아 가며 배양된 계대 이력(passage history)를 가진다. The New York City Board of Health strain (NYCBOH) virus is a vaccinia virus belonging to the poxvirus family, also known as the Lederle-Chorioallantoic strain. It is known to be derived from humans and grows well in CE, RabK, HaK, KB, WI-38, LLC-MK2, and vero cells. According to the virus characteristics provided by the ATCC, NYCBOH has a passage history of alternating culture in cattle, rabbits, humans and CE.
본 발명의 MRC-5 세포를 감염시키는 백시니아 바이러스는 CJ-MVB-SPX 마스터 바이러스 뱅크로부터 유래할 수 있다. The vaccinia virus infecting MRC-5 cells of the invention can be derived from the CJ-MVB-SPX master virus bank.
본 발명에서 MRC-5 세포는 백시니아 바이러스를 0.001 내지 0.1 M.O.I(Multiplicity of Infection)로 접종하여 감염시킬 수 있다. 바람직하게는, 배양된 MRC-5 세포를 0.001 내지 0.01 M.O.I의 백시니아 바이러스로 감염시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 0.01 M.O.I의 백시니아 바이러스로 감염시킬 수 있다. In the present invention, MRC-5 cells can be infected by inoculating vaccinia virus at 0.001 to 0.1 M.O.I (Multiplicity of Infection). Preferably, the cultured MRC-5 cells can be infected with vaccinia virus of 0.001 to 0.01 M.O.I, more preferably 0.01 M.O.I vaccinia virus.
본 발명의 약독화된 백시니아 바이러스를 생산하는 방법은 NYCBOH 바이러스주로부터 유래한 백시니아 바이러스로 감염된 MRC-5 세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.The method for producing attenuated vaccinia virus of the present invention may comprise culturing MRC-5 cells infected with vaccinia virus derived from NYCBOH virus strain in serum-free medium.
본 발명에서, 상기 무혈청 배지는 DMEM일 수 있다. In the present invention, the serum-free medium may be DMEM.
본 발명에서 백시니아 바이러스로 감염된 MRC-5 세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계는 40 시간 내지 50 시간 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는 MRC-5 세포의 배양은 46 시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있다. In the present invention, the step of culturing the MRC-5 cells infected with vaccinia virus in a serum-free medium may be performed for 40 hours to 50 hours. Preferably, the culture of MRC-5 cells may be performed for 46 hours to 48 hours.
본 발명의 약독화된 백시니아 바이러스를 생산하는 방법은 100% 합류까지 배양된 인체 유래 MRC-5 세포주에 CJ-MVB-SPX으로부터 유래된 약독화된 NYCBOH 스트 레인을 0.01 M.O.I로 접종하여 감염시키고 상기 감염된 세포를 무혈청 배지에서 48시간 배양하는 단계를 포함할 수 있다.The method for producing the attenuated vaccinia virus of the present invention is inoculated with 0.01 MOI of an attenuated NYCBOH strain derived from CJ-MVB-SPX to a human-derived MRC-5 cell line cultured to 100% confluence and infected with the above. The infected cells may be incubated for 48 hours in serum-free medium.
본 발명의 약독화된 백시니아 바이러스를 생산하는 방법은 백시니아 바이러스로 감염된 MRC-5 세포를 배양하여 수득된 배양물로부터 약독화된 백시니아 바이러스를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. The method for producing attenuated vaccinia virus of the present invention may comprise recovering the attenuated vaccinia virus from a culture obtained by culturing MRC-5 cells infected with vaccinia virus.
본 발명에서, 생산된 약독화된 백시니아 바이러스를 회수하는 단계는 상기 배양물에서 회수된 감염된 세포들로부터 동결 및 해동을 통하여 바이러스를 방출시켜 수행될 수 있다. 이와 같은 바이러스를 방출시키기 위한 동결 및 해동은 3회 내지 5회 반복될 수 있다. 바람직하게는 동결 및 해동 단계는 3회 수행되며, 동결 및 해동 단계의 반복 후에 초음파 처리가 이어질 수 있다. In the present invention, recovering the attenuated vaccinia virus produced may be performed by releasing the virus through freezing and thawing from the infected cells recovered in the culture. Freezing and thawing to release such viruses can be repeated three to five times. Preferably the freezing and thawing step is performed three times, followed by sonication after repeated freezing and thawing steps.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 생산된 약독화된 백시니아 바이러스를 제공한다.The invention also provides an attenuated vaccinia virus produced by the method.
본 발명의 방법에 의해 생산된 약독화된 백시니아 바이러스는 CJ-50300(KCCM 10797)의 바이러스일 수 있다. The attenuated vaccinia virus produced by the method of the invention may be a virus of CJ-50300 (KCCM 10797).
본 발명의 약독화된 백시니아 바이러스는 NYCBOH 또는 NYCBOH에서 유래한 기존의 Nancy Vaxinia Berna(Beran Biotech Ltd., Beran)와 실질적으로 동등하거나 향상된 면역원성 및 안정성을 갖는다. The attenuated vaccinia virus of the present invention has a substantially equivalent or improved immunogenicity and stability to NYCBOH or existing Nancy Vaxinia Berna (Beran Biotech Ltd., Beran) derived from NYCBOH.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 생산된 약독화된 백시니아 바이러스 및 안정제를 포함하는, 두창 예방 또는 치료용 면역원성 조성물을 제공한다. The present invention also provides an immunogenic composition for the prevention or treatment of head pain, comprising the attenuated vaccinia virus produced by the method and a stabilizer.
세포배양을 통해 생산된 두창 백신은 약독화된 생바이러스 백신이므로 생체 에 무해하면서 바이러스를 장기간 보존할 수 있어야 하며 WHO 지침에 따라 동결건조 후 37℃ 보관 시 1 개월간 시작 역가 대비 10 배 이하의 바이러스 소실을 보장하며 pH 및 함습도가 안정되게 유지되는 기본조건 들을 충족시켜야 한다. 따라서, 두창 백신을 안정적으로 유지시킬 수 있는 안정제에 현탁하고 동결건조하여 보관할 수 있다. Since the vaccine produced by cell culture is an attenuated live virus vaccine, it should be harmless to the living body and can be preserved for a long time. According to the WHO guidelines, the virus is less than 10 times of the starting titer for 1 month when stored at 37 ℃ after freeze-drying. It must ensure that the basic conditions are maintained to ensure that the pH and moisture content remain stable. Therefore, the vaccine can be suspended and lyophilized and stored in a stabilizer capable of stably maintaining the vaccine.
본 발명에서, 두창 예방 또는 치료용 면역원성 조성물은 하기와 같은 조성을 갖는 안정제를 포함할 수 있다:In the present invention, the immunogenic composition for preventing or treating apox may include a stabilizer having the following composition:
NaCl 6.0-7.0 gNaCl 6.0-7.0 g
KCl 0.1-0.2 gKCl 0.1-0.2 g
Na2HPO4·12H2O 2.0-3.0 gNa 2 HPO 4 12H 2 O 2.0-3.0 g
KH2PO4 0.1-0.2 gKH 2 PO 4 0.1-0.2 g
수크로오스 40-60 gSucrose 40-60 g
소디움 L-글루타메이트 0.1-2.0 gSodium L-Glutamate 0.1-2.0 g
젤라틴 1.0-3.0 g1.0-3.0 g of gelatin
가수분해된 젤라틴 20-30 g20-30 g of hydrolyzed gelatin
EDTA 삼나트륨염 0.01-0.2 gEDTA trisodium salt 0.01-0.2 g
증류수 1,000ml가 되도록 하는 양.Amount to be 1,000 ml of distilled water.
바람직하게는, 본 발명에서 안정제는 NaCl 6.4g; KCl 0.16g; Na2HPO4·12H2O 2.3g; KH2PO4 0.16g; 수크로오스 50g;소디움 L-글루타메이트 1.0g; 젤라틴 2.0g; 가 수분해된 젤라틴 25g; EDTA 삼나트륨염(Trisodium salt of EDTA) 0.1g; 증류수 1,000ml로 맞추는 양의 조성을 가질 수 있다. Preferably, the stabilizer in the present invention is 6.4g NaCl; KCl 0.16 g; 2.3 g Na 2 HPO 4 .12H 2 O; 0.16 g KH 2 PO 4 ; 50 g sucrose; 1.0 g sodium L-glutamate; 2.0 g of gelatin; 25 g of hydrolyzed gelatin; 0.1 g of EDTA trisodium salt of EDTA; The composition may have an amount of 1,000 ml of distilled water.
이하에서, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이 실시예들은 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이 실시예들에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these embodiments are intended to illustrate the present invention by way of example, but the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
실시예Example
실시예Example 1. One. 바이러스주의Viralism 확인 Confirm
DryvaxR 는 미국식품의약국(FDA)에서 승인된 백시니아 백신으로 NYCBOH(New York City Board of Health) 바이러스주로부터 유도된 것으로, 1982년까지 송아지 림프방법(bovine calf lymph method)에 의해 위쓰레넬 (Wyeth-Lederle, ATCC 기탁번호 VR-325)에 의해 생산되었다. DryvaxR 는 살아있는, 약독화 백시니아 바이러스로 구성되며, 세포 배양물 산물로는 존재하지 않는다. 본 발명자들은 두창 박멸 캠페인에 사용되었던 백시니아 바이러스 중 가장 약독화된 바이러스주였으며 세포배양 및 강한 교차 면역 유도가 가능하며, 입수가 가능한 NYCBOH 바이러스주을 두창백신 생산 바이러스주로 선정하였다. Dryvax R is a vaccinia vaccine approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) derived from the New York City Board of Health (NYCBOH) virus strain, which was used by the bovine calf lymph method until 1982. (Wyeth-Lederle, ATCC Accession No. VR-325). Dryvax r Consists of live, attenuated vaccinia virus and does not exist as a cell culture product. The inventors were the most attenuated virus line among the vaccinia virus used in the WP eradication campaign, and it was able to induce cell culture and strong cross immunity, and select the available NYCBOH virus line as the WP vaccine production virus line.
본 발명자들은 미국균주센터 (ATCC; American Type Culture Collection)로부터 바이러스주 이용권리에 대한 계약을 체결하여 NYCBOH을 백신 개발에 이용하게 되었다. The present inventors signed a contract for the use of viral strains from the American Type Culture Collection (ATCC) to use NYCBOH for vaccine development.
ATCC에서 입수한 NYCBOH 바이러스주를 MRC-5 세포주에서 4회 계대배양하여 마스터 바이러스 뱅크를 제조하고 이를 CJ-MVB-SPX라 명명하였다. The NYCBOH virus line obtained from ATCC was passaged four times in MRC-5 cell line to prepare a master virus bank, which was named CJ-MVB-SPX.
CJ-MVB-SPX 바이러스를 유전자 수준에서 확인하기 위해 본 바이러스가 속한 오르토폭스 바이러스(orthopoxvirus) 계열의 바이러스를 검출하고 구별하기 위한 신속하고 정확한 방법이며 WHO collaborating center(Atlanta, Ga.)가 통상의 검출방법으로 채택하여 사용하고 있는 crmB 유전자의 PCR-RFLP 분석방법을 사용하였다 (Vladimir N. Journal of Clinical Microbiology, 2001; 39:94~100). DNA 분리는 KOMA Biotech Inc 제조사의 EzWay Genomic DNA Mini Kit V (Virus)을 사용하였으며, 바이러스 원액에서 바로 분리하였다. 250 μL의 바이러스 원액에서 최종 40 μL 으로 분리된 DNA 20 μL 을 주형으로 하여 바이오니아 (Bioneer)사의 프리믹스 (PCR-premix) 키트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 혼합액의 조성은 DNA 용액 20 μL, 증류수에 현탁한 PCR-premix 28 μL, 10pmol/μL의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 각각 1 μL씩 총 2 μL을 혼합하였고, 그 용량은 총 50μL였다. 상기 반응 혼합액을 변성 (94℃, 1 분), 결합 (55℃, 1 분), 및 연장 (72℃, 1 분)을 총 30회 반복하는 프로그램 과정을 거치게 하여 증폭된 PCR 산물을 수득했다. 증폭된 유전자는 퀴아젠 (QIAGEN)사의 QIAquick PCR purification 키트을 이용하여 DNA을 추출하였으며, 추출된 DNA는 1% 아가로스 겔 상에서 분리하여 그 크기를 확인하였다. A rapid and accurate method for detecting and distinguishing the virus of the orthopoxvirus family to which the virus belongs, to identify the CJ-MVB-SPX virus at the genetic level, and the WHO collaborating center (Atlanta, Ga.) PCR-RFLP analysis of the crmB gene was adopted and used (Vladimir N. Journal of Clinical Microbiology, 2001; 39: 94-100). DNA isolation was performed using EzWay Genomic DNA Mini Kit V (Virus) from KOMA Biotech Inc., and was directly isolated from virus stock. PCR was performed using Biioner's PCR-premix kit with 20 μL of DNA isolated from the final 40 μL in 250 μL of viral stock as a template. The composition of the reaction mixture was 20 μL of DNA solution, 28 μL of PCR-premix suspended in distilled water, and 2 μL of 1 μL of the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 of 10 pmol / μL, respectively, and the total volume was 50 μL. It was. The reaction mixture was subjected to a program procedure in which denaturation (94 ° C., 1 minute), binding (55 ° C., 1 minute), and extension (72 ° C., 1 minute) were repeated a total of 30 times to obtain an amplified PCR product. The amplified gene was extracted with DNA using QIAGEN's QIAquick PCR purification kit, and the extracted DNA was separated on a 1% agarose gel to confirm its size.
오르토폭스(orthopoxvirus) 계열의 바이러스 종들은 각각 다른 지놈크기의 crmB 유전자 PCR 산물을 갖는다. 이 중, 백시니아 바이러스는 1210bp의 크기를 가진다. 종간 특이성을 가지는 crmB 유전자의 PCR 산물 (fragment)의 크기는 도 1의 사진에 나타난 바와 같이 CJ-MVB-SPX, Lister/Elstree, WR 바이러스가 모두 1210bp로, 동일한 crmB 유전자를 가지는 것으로 보인다. 그러나, crmB 유전자의 PCR 산물을 제한효소 NlaIII로 처리하면 NYCBOH 바이러스는 표 1에 표시된 바와 같은 크기의 DNA 단편들을 가지게 되어 Lister/Elstree 바이러스와 유사하며, WR strain과는 구별되는 DNA 특성을 보여준다. 이에 의해, crmB 유전자에 대한 NlaIII-RFLP 패턴분석 방법을 이용하여 CJ-MVB-SPX의 지놈 DNA는 백시니아 바이러스 중 리스터 바이러스(Lister virus)와 유사한 제한효소 절편 길이 다형성(RFLP)을 보여줌을 확인할 수 있었다. Virus species of the orthopoxvirus family have different genome-size crmB gene PCR products. Among these, vaccinia virus has a size of 1210 bp. The PCR fragment size of the crmB gene having cross-specificity was 1210 bp in all of the CJ-MVB-SPX, Lister / Elstree, and WR viruses, as shown in the photograph of FIG. However, when the PCR product of the crmB gene was treated with restriction enzyme NlaIII, NYCBOH virus had DNA fragments of the size shown in Table 1, similar to Lister / Elstree virus, showing DNA characteristics distinct from WR strain. By using the NlaIII-RFLP pattern analysis method for the crmB gene, the genome DNA of CJ-MVB-SPX showed restriction fragment length polymorphism (RFLP) similar to Lister virus among vaccinia virus. there was.
표 1. crmB 유전자의 PCR-RFLP 분석Table 1. PCR-RFLP Analysis of the crmB Gene
실시예Example 2. 백신 제조 공정의 확립: 공정단계 조건시험 2. Establishment of Vaccine Manufacturing Process: Process Step Conditional Test
두창 백신 생산을 위한 세포주로 MRC-5 세포를 선정하여 이용하였다. 바이러스의 최적 배양 및 정제 조건을 확인하는 연구를 통해 가장 최적의 두창 백신 생산 조건은 표 2에서와 명시하듯이 10%의 혈청을 포함한 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 2 내지 3일간 100% 합류(confluency)까지 배양된 MRC-5 세포에 실시예 1에서 준비된 CJ-MVP-SPX로부터 유래된 백시니아 바이러스를 0.01 M.O.I(Multiplicity of Infection: 감염다중도)로 감염시킨 후 무혈청 DMEM 배지(serum free media)로 배지를 바꾸어 주어 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하는 조건임을 확인하였다. 최적의 상태로 배양된 바이러스는 3회의 동결/해동 반복 후 매회 20초씩 4회의 초음파 처리를 통해 방출되었다. 원심분리로 세포 찌꺼기를 제거한 백신 원액 내의 바이러스는 전형적인 벽돌모양을 나타냄을 전자현미경 사진으로서 확인하였다. 수득된 백신 원액의 바이러스 역가도 WHO 규격인 >1 x 108 PFU/ml를 만족시켰다. MRC-5 cells were selected and used as a cell line for the production of vaccine. The most optimal vaccine production conditions through studies confirming the optimal culture and purification conditions of the virus were 2 to 3 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator with DMEM medium containing 10% serum, as indicated in Table 2. Serum-free DMEM medium after infecting MRC-5 cells cultured to 100% confluency with 0.01 MOI (Multiplicity of Infection) derived from CJ-MVP-SPX prepared in Example 1 (serum free media) by changing the medium was confirmed that the conditions for 48 hours in 37 ℃, 5% CO 2 incubator. Viruses cultured in optimal condition were released via four sonications, 20 seconds each time after three freeze / thaw cycles. Virus micrographs confirmed that the virus in the vaccine stock removed cell debris by centrifugation showed a typical brick shape. The viral titer of the obtained vaccine stock satisfies the WHO specification> 1 × 10 8 PFU / ml.
상기와 같이, NYCBOH를 계대배양하여 제조한 마스터 바이러스 뱅크인 CJ-MVB-SPX로부터 유래한 바이러스를 MRC-5 세포주에 감염시켜 세포 배양에 의해 두창 백신을 생산하는 최적 배양 조건 및 정제 조건을 확립하였다. 이를 바탕으로, 실제 규모의 1/6 규모로 전임상 시료를 생산하여 하기와 같이 마우스에서 안전성 평가시험 및 유효성 평가시험을 수행하고 그 결과에 따라 KGMP 시설에서의 제조를 시작하였다. 또한 KGMP시설에서 제조된 두창백신은 원숭이에서의 안전성 및 유효성 시험에 이용하였다.As described above, the virus derived from CJ-MVB-SPX, a master virus bank prepared by subcultured with NYCBOH, was infected with MRC-5 cell line to establish optimal culture conditions and purification conditions for producing a vaccine by cell culture. . Based on this, preclinical samples were produced on a scale of 1/6 of the actual scale, and a safety test and an efficacy test were performed in mice as follows, and manufacturing was started in a KGMP facility according to the results. In addition, changchang vaccine prepared in KGMP facility was used for the safety and efficacy test in monkeys.
표 2. 두창 백신 생산을 위한 최적 세포배양 조건 Table 2. Optimal Cell Culture Conditions for Poison Vaccine Production
2.1 최적 M.O.I. 결정2.1 Optimal M.O.I. decision
MRC-5 세포가 100% 합류까지 배양된 T185 플라스크(7 X 106 세포/T185 플라스크)로부터 배지를 제거하고 무혈청 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium) 배지에 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 M.O.I로 희석시킨 바이러스를 접종하였다. 접종 후 배양 시간은 2시간으로, 접종 후 30분 간격으로 플라스크를 흔들어 바이러스 용액이 세포와 접촉하게 하였다. 바이러스 감염이 끝나면 흡입기(aspirator)로 바이러스 액을 제거한 뒤, 37℃, CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양한 감염 세포는 배양 배지를 제거한 후, 스크레퍼(Scraper)를 이용하여 회수하였다. 회수된 감염세포는 원심분리용 보틀에 옮긴 뒤, 3,500rpm으로 10분간 4℃에서 원심 분리하여 상등액을 제거한 후, 3회의 동결/해동을 반복하여 파쇄시켰다. 세포 파쇄물을 간접적으로 초음파 처리(Sonication)한 후 3,000rpm으로 15분간 4℃에서 원심분리하여, 상등액을 제거하였다. 이에 의해 얻은 두창 백신 원액을 역가를 측정하기 위해 플라크 시험을 실시하였다. 플라크 시험을 위해, 먼저, Vero 세포를 6웰 플레이트에 0.8 X 106 세포/웰의 농도로 접종한 다음, 37℃, CO2 배양기에서 100%의 합류(confluency)시까지 약 24~30시간 동안 배양하였다. 각 웰로부터 배지를 제거하고 무혈청 DMEM로 1회 세척한 후, 바이러스 희석액 (10-2~10-7)을 웰 당 200 μL씩 첨가하고 37℃, CO2 배양기에서 2시간 동안 감염시켰다. 2시간의 감염시 30분에 한번씩 세포가 마르지 않고 바이러스 액이 골고루 분산되도록 조심스럽게 흔들어 주었다. 감염이 끝난 후, 바이러스 감염액을 제거하고, 2% LMT (Low melting temperature) 아가로즈 용액과 2X Medium 199을 1:1 부피로 혼합한 오버레이(overlay) 배지를 각 웰에 3mL씩 첨가했다. 상온에서 20~30분간 방치하여 겔이 굳으면, 37℃, CO2 배양기에 옮겨 3일간 배양했다. 고정용액(염수 중의 5% 포르말린 용액)을 각 웰에 넣고 상온에서 3시간 동안 방치한 후, 아가로즈 겔을 분리하여 물로 세척하고 염색용액(5% 포르말린, 1% 크리스탈 비올렛, 20% 염수중의 에탄올)을 웰의 바닥이 잠길 정도로 넣고 5분간 염색한 뒤, 물로 세척하였다. 남은 액을 잘 제거하고 건조시킨 후, 플라크(plaque) 수를 계수하였다.Remove the medium from T185 flasks (7 × 10 6 cells / T185 flasks) in which MRC-5 cells were cultured to 100% confluence and place 0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 MOI in serum-free Dulbeccos Modification of Eagles Medium (DMEM) medium. Inoculated with virus diluted. Incubation time after inoculation was 2 hours, and the flask was shaken every 30 minutes after inoculation to allow the virus solution to come into contact with the cells. After the viral infection, remove the virus solution into the inhaler (aspirator) behind, 37 ℃, CO 2 Incubated for 48 hours in the incubator. Infected cells were cultured and removed using a scraper after removing the culture medium. The recovered infected cells were transferred to a centrifuge bottle, centrifuged at 3,500 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant, and then crushed three times by freezing / thawing. Cell lysates were indirectly sonicated (Sonication) and then centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes at 4 ℃, the supernatant was removed. The plaque vaccine stock thus obtained was subjected to a plaque test to determine the titer. For plaque testing, first, Vero cells were seeded in 6-well plates at a concentration of 0.8 × 10 6 cells / well, followed by 37 ° C., CO 2 The incubator was incubated for about 24-30 hours until 100% confluency. Remove the medium from each well and wash once with serum-free DMEM, then add 200 μL of virus dilution (10 -2-10 -7 ) per well and press 37 ° C, CO 2 Infected for 2 hours in the incubator. Every two minutes, the cells were gently shaken every 30 minutes to spread the virus fluid evenly. After the infection was completed, the virus infection solution was removed, and 3 mL of overlay medium containing 1% volume of 2% LMT (Low melting temperature) agarose solution and 2X Medium 199 was added to each well. If the gel is hardened by standing at room temperature for 20 ~ 30 minutes, 37 ℃, CO 2 Transfer to the incubator and incubated for 3 days. A fixed solution (5% formalin solution in saline) was added to each well and left at room temperature for 3 hours, and then the agarose gel was separated and washed with water and stained solution (5% formalin, 1% crystal violet, 20% saline solution). Ethanol) was added to the bottom of the well soaked for 5 minutes and washed with water. After the remaining solution was removed well and dried, the number of plaques was counted.
도 2는 바이러스 감염농도 별 역가를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 0.01 M.O.I의 농도로 감염시 높은 생산성을 나타내었다.2 is a diagram showing the titer of virus infection concentration. As shown in Figure 2, it showed high productivity upon infection with a concentration of 0.01 M.O.I.
2.2 최적 바이러스 배양시간 결정2.2 Determining optimal virus incubation time
MRC-5 세포가 100% 합류까지 배양된 T185 플라스크(7 X 106 세포/T185 플라스크)로부터 배지를 제거하고 무혈청 DMEM 배지로 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 M.O.I로 희석시킨 바이러스를 접종하였다. 접종 후 배양 시간은 2시간으로, 접종 후 30분 간격으로 플라스크를 흔들어 바이러스 용액이 세포와 접촉하게 하였다. 바이러스 감염이 끝나면 흡입기(aspirator)로 바이러스 액을 제거한 뒤, 37℃, CO2 배양기에서 각각 0, 24, 30, 48, 72시간 동안 배양하였다. 배양한 감염 세포는 배양 배지를 제거한 후, 스크레퍼(Scraper)를 이용하여 회수하였다. 회수된 감염세포는 원심분리용 보틀에 옮긴 뒤, 3,500rpm으로 10분간 4℃에서 원심 분리하여 상등액을 제거한 후, 3회의 동결/해동을 반복하여 파쇄시켰다. 세포 파쇄물을 간접적으로 초 음파 처리(Sonication)한 후 3,000rpm으로 15분간 4℃에서 원심분리하여, 상등액을 제거하였다. 상기 2.1에서와 같이, 플라크 시험을 통해 이에 의해 수득된 두창 백신 원액의 역가를 측정하였다. Medium was removed from T185 flasks (7 × 10 6 cells / T185 flasks) in which MRC-5 cells were cultured to 100% confluence and inoculated with virus diluted with 0.001, 0.01, 0.1, 1 and 10 MOI in serum free DMEM medium. . Incubation time after inoculation was 2 hours, and the flask was shaken every 30 minutes after inoculation to allow the virus solution to come into contact with the cells. After the viral infection, remove the virus solution into the inhaler (aspirator) behind, 37 ℃, CO 2 Incubators were incubated for 0, 24, 30, 48 and 72 hours, respectively. Infected cells were cultured and removed using a scraper after removing the culture medium. The recovered infected cells were transferred to a centrifuge bottle, centrifuged at 3,500 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant, and then crushed three times by freezing / thawing. The cell lysate was indirectly sonicated and then centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant. As in 2.1 above, the titer of the stock vaccine vaccine obtained thereby was determined via a plaque test.
도 3는 바이러스 감염 후 배양시간별 역가를 나타내는 도면이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 0.01 M.O.I의 농도로 감염 후, 48시간 배양시 높은 생산성을 나타내었다.3 is a diagram showing the titer of each culture time after viral infection. As shown in FIG. 3, after infection at a concentration of 0.01 M.O.I, high productivity was observed at 48 hours of incubation.
2.3 최적 바이러스 방출 조건 결정 2.3 Determine optimal virus release conditions
바이러스를 방출하기 위해 수거한 세포를 -70℃ 초저온 냉동고(deep freezer)에서 3시간 동안의 동결 과정과 25℃ 수조(water bath)에서 15분 내지 20분간의 해동 과정을 3회 반복한 후 4회 초음파 처리하였다. 동결/해동의 반복 공정 후 초음파 처리에 의한 바이러스의 방출은 두창 백신 생산에서 세균 오염 가능성이 낮고 수율이 양호했다. 따라서, 이를 최적의 바이러스 방출조건으로 결정했다.The cells harvested to release the virus were repeated three times in a -70 ° C deep freezer for three hours and three times in a 25 ° C water bath for 15 to 20 minutes. Ultrasonicated. The release of the virus by sonication after the repeated freeze / thaw process showed a low likelihood of bacterial contamination in the vaccine production and good yield. Therefore, this was determined as the optimal virus release condition.
실시예Example 3. 최적의 안정제 선정 3. Selection of the best stabilizer
세포 배양에 의해 생산되는 두창 백신은 약독화 생바이러스 백신이므로 생체에 무해하면서 바이러스를 장기간 보존할 수 있어야 하며 WHO 지침에 따라 동결건조 후 37℃ 보관 시 1개월간 1 x log1010 이하의 바이러스 소실을 보장하며 pH 및 함습도가 안정되게 유지되는 기본조건들을 충족시켜야 한다. Since the vaccine produced by cell culture is attenuated live virus vaccine, it should be harmless to the living body and can be preserved for a long time. According to the WHO guidelines, it guarantees the loss of 1 x log10 10 or less for 1 month when stored at 37 ℃ after lyophilization according to WHO guidelines. It must meet the basic conditions for keeping pH and moisture content stable.
특허와 관련 문헌들을 통해 생바이러스 백신의 안정제로 사용할 수 있다고 알려진 6개의 안정제를 제조하여 비교 실험을 수행하였다. 6개의 안정제 조성은 표 3과 같다. Comparative experiments were carried out by preparing six stabilizers known to be used as stabilizers for live virus vaccines through patents and related documents. The six stabilizer compositions are shown in Table 3.
MRC-5 세포가 100% 합류까지(1.78 x 107/플라스크) 배양된 14개의 T185 플라스크에 NYCBOH 백시니아 바이러스, CJ-MVB-SPX를 0.01 M.O.I가 되도록 희석하여 접종한 후 2시간 동안 배양하였다. 접종한 바이러스 용액을 제거한 후 40ml의 1% NEAA(non essential amino acid)을 포함한 DMEM를 넣고 48시 간 동안 5% CO2, 37℃ 배양기에서 바이러스를 증식시켰다. 상등액을 제거한 후, 세포를 0.2% 젤라틴을 포함한 PBS(pH7.2)로 2회 세척 후, 사용된 완충용액(buffer)은 얼음에 보관된 튜브에 모아두었다. 바이러스에 감염된 세포를 분리하기 위해 0.2% 젤라틴을 포함한 PBS(pH7.2)를 T185 플라스크 당 3ml씩 넣어주고 30분 간격으로 흔들어 주며 3시간 동안 5% CO2, 37℃ 배양기에서 반응시켰다. 반응 후 분리된 감염세포를 포함하는 액과 세척시 사용된 완충용액을 함께 모아 6개의 튜브에 분주한 후, 냉각 상태(4℃)에서 2,000rpm으로 10분간 원심분리 하여 상등액은 제거하고 감염 세포만 회수하였다. 회수된 감염 세포를 3.2ml의 6개의 제조된 후보안정제 용액에 현탁시켰다. 세포로부터 증폭된 바이러스를 방출시키기 위해 3회의 동결/해동을 반복한 후, 초음파 처리(ultrasonic treatment)를 수행하였다. 냉각 상태(4℃)에서 1,000rpm으로 10분간 원심 분리하여 두창 백신 원액을 수득하였다. 수득된 두창 백신 원액을 바이알 당 0.4ml씩 분주하여 동결건조시켰다. 동결 건조된 백신 바이러스는 37℃에 보관하면서 1주일 간격으로 바이알을 하나씩 꺼내어 0.55ml의 PBS에 녹여 Vero 세포를 이용한 플라크 분석(plaque assay)을 통해 바이러스 역가 유지 여부를 확인하 였다. Fourteen T185 flasks in which MRC-5 cells were cultured to 100% confluence (1.78 × 10 7 / flask) were inoculated with dilutions of NYCBOH vaccinia virus, CJ-MVB-SPX to 0.01 MOI, followed by incubation for 2 hours. After removing the inoculated virus solution, 40ml of DMEM containing 1% NEAA (non essential amino acid) was added and the virus was propagated in 5% CO 2 , 37 ° C incubator for 48 hours. After removing the supernatant, the cells were washed twice with PBS (pH 7.2) containing 0.2% gelatin, and the buffers used were collected in tubes kept on ice. To isolate virus infected cells, PBS containing 0.2% gelatin (pH7.2) was added 3 ml per T185 flask, shaken every 30 minutes, and reacted in a 5% CO 2 , 37 ° C. incubator for 3 hours. After the reaction, the solution containing the isolated infected cells and the buffer solution used for washing are collected and dispensed into 6 tubes. The supernatant is removed by centrifugation at 2,000 rpm for 10 minutes under cooling (4 ° C). Recovered. The recovered infected cells were suspended in 3.2 ml of 6 prepared post-security tablet solutions. Three freeze / thaw cycles were performed to release the amplified virus from the cells, followed by ultrasonic treatment. Centrifuged at 1,000 rpm for 10 minutes in a cold state (4 ° C) to obtain a stock vaccine vaccine. 0.4 ml per vial was dispensed from the obtained vaccine for vaccine for dialysis and lyophilized. The lyophilized vaccine virus was stored at 37 ° C., and the vials were taken out at weekly intervals and dissolved in 0.55 ml of PBS to confirm virus titer through plaque assay using Vero cells.
표 4에 표시된 바와 같이, 안정제 1번과 6번이 높은 안정성을 보였다. 안정제 6번의 경우 솔비톨의 과량 함유에 따른 높은 수분 흡수율로 인해 37℃에서 1주일 보관시 동결건조된 백신용 바이러스가 찌그러지는 현상을 보여 제외시키고, 최종적으로 1번 안정제를 최적의 안정제로 선정하였다. As shown in Table 4,
표 3. 후보 안정제의 조성Table 3. Composition of candidate stabilizers
표 4. 최적 안정제의 결정Table 4. Determination of Optimum Stabilizers
선정된 안정제가 함습도 및 pH측면에서도 안정성을 가지는지 여부를 확인하기 위해 바이러스가 들어있지 않은 안정제를 동결건조시켰다. 동결건조된 안정제를 4℃(장기안정성), 25℃(가속조건), 37℃(가혹조건)에서 보관하며 4주간 pH와 함습도를 측정하였다. 그 결과 표 5 및 표 6에 표시된 바와 같이, 선정된 안정제는 pH 나 함습도가 가속 및 가혹조건에서도 안정되게 유지됨을 확인할 수 있었다. To check whether the selected stabilizer is stable in terms of humidity and pH, the free virus-free stabilizer was lyophilized. The lyophilized stabilizer was stored at 4 ° C. (long-term stability), 25 ° C. (acceleration condition), and 37 ° C. (severe condition), and pH and humidity were measured for 4 weeks. As a result, as shown in Table 5 and Table 6, the selected stabilizer was confirmed that the pH or the humidity is kept stable even under accelerated and harsh conditions.
표 5. 안정제의 함습도 안정성 시험 결과Table 5. Moisture stability test results of stabilizers
표 6. 안정제의 pH 안정성 시험 결과Table 6. pH stability test results of stabilizers
실시예Example 4. 최종 제조공정 4. Final manufacturing process
세포 및 바이러스의 최적 배양조건을 확인하는 실험들을 통해 최적의 두창 백신 생산 조건은 100% 합류까지 배양된 세포에 0.01 M.O.I로 백신용 바이러스를 감염시킨 후 무혈청배지로 교체하여 48시간 배양하는 조건임을 확인하였다. 최적의 조건으로 배양된 백신용 바이러스는 3회의 동결/해동 반복 후, 초음파 처리를 수행하여 세포로부터 방출시켜, 약독화된 백시니아 바이러스 CJ-50300을 제조하였다. Through experiments to confirm the optimal culture conditions of cells and viruses, the optimal vaccine production condition is that the cells were cultured to 100% confluence and infected with the virus for 0.01 MOI and replaced with serum-free medium for 48 hours. Confirmed. Vaccine virus cultured under optimal conditions was released from cells by sonication after three freeze / thaw cycles to prepare attenuated vaccinia virus CJ-50300.
도 5는 본 발명자들에 의해 확립된 세포배양에 의한 두창 백신 생산의 개략적인 공정도이다. CJ-50300의 최적배양 및 정제 조건을 확립한 후 실제 생산 규모의 1/6 규모로 전임상 시료를 생산하여 마우스에서의 안전성 평가시험 및 유효성 평가시험을 수행하였고 그 결과에 따라 KGMP 시설에서의 제조를 시작하였다. 또한 KGMP시설에서 제조된 두창 백신은 원숭이에서의 안전성 및 유효성 시험에 이용하였다.Figure 5 is a schematic process diagram of the vaccine production by the vaccine by the cell culture established by the inventors. After establishing the optimum culture and purification conditions for CJ-50300, preclinical samples were produced at 1 / 6th the actual production scale, and safety and efficacy tests were performed in mice. Started. In addition, the vaccine was prepared in the KGMP facility for safety and efficacy tests in monkeys.
실시예Example 5. 5. 두창pock 백신의 유효성 테스트 Validity test of the vaccine
실시예 4의 제조 공정을 통해 제조된 두창 백신의 유효성을 평가하는 면역반응 확인을 위해 소 동물로 마우스를 이용하여 IgG ELISA, 중화항체가 확인시험, 마우스 비장의 림프구를 이용한 알파-IFN을 생산하는 세포 분석을 위한 ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay) 및 FACS 분석(fluorescence activated cell sorting assay)를 수행하였고, 치명적 비강내 백시니아 공격 모델(lethal intranasal vaccinia (strain WR) challenge model)을 이용한 감염방어시험들을 수행하였다. 대 동물로는 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)를 이용하여 항체가 및 중화항체가를 측정하여 유효성을 평가하였다. 하기의 표 7에 세부 평가 항목들 및 결과를 요약하였다. 하기 시험에서 양성 대조군으로 사용되는 Lancy Vaxinia Berna는 오르토폭스 바이러스 계열에 속하나, NYCBOH와는 상이한 종류이며, 영국에서 공 식적으로 허가받아 백신박멸 프로그램에 사용되었던 1세대 두창 백신이다. In order to confirm the immune response for evaluating the effectiveness of the vaccine prepared in Example 4, IgG ELISA using a mouse as a bovine animal, a neutralizing antibody test, and production of alpha-IFN using lymphocytes of the mouse spleen Enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) and fluorescence activated cell sorting assay (FACS) were performed for cell analysis and infection defense tests using the lethal intranasal vaccinia (strain WR) challenge model. Was performed. As a large animal, the cyanomolgus monkey was used to measure the antibody titer and neutralizing antibody titer. Detailed evaluation items and results are summarized in Table 7 below. Lancy Vaxinia Berna, used as a positive control in the following tests, belongs to the orthopox virus family, but is different from NYCBOH, and is the first generation of vaccines that were officially licensed in the UK and used in the vaccine eradication program.
표 7. 유효성 평가 요약표Table 7. Validation Summary Table
실시예Example 6. 6. 두창pock 백신의 안전성 테스트 Safety test of the vaccine
상기 제조 공정을 통해 제조된 두창백신의 안전성을 확인하기 위하여 마우스 에서 단회독성, 반복독성, 신경독성 여부를 측정하였으며, 원숭이에서 단회독성시험, 기니어피그에서 면역독성과 유전독성을 측정하였다. 표 8에 상세항목 및 결과를 요약하였다. In order to confirm the safety of the vaccine prepared by the above manufacturing process was measured whether single toxicity, repeat toxicity, neurotoxicity in mice, single toxicity test in monkeys, immunotoxicity and genotoxicity in guinea pig. Table 8 summarizes the details and the results.
표 8. 두창백신 생산 바이러스주의 생물학적 안전성 요약표Table 8. Summary Table of Biological Safety of Poison Vaccine Producing Virus Lines
본 발명의 두창 백신 생산 방법에 의하면, 세포배양을 통해 안전하고 품질이 우수한 두창 백신을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 두창 백신 및 안정제를 포함하는 두창 면역원성 조성물은 장기간 보관시에도 면역원성의 약화 및 변성없이 안정적으로 유지될 수 있다. According to the vaccine production method of the present invention, it is possible to produce a safe and high quality vaccine by cell culture. The head immunogenic composition comprising the head vaccine and stabilizer produced by the method of the present invention can be stably maintained even after prolonged storage without weakening and denaturing immunogenicity.
<110> CJ Corporation <120> Method of producing smallpox vaccine using cell culture and the smallpox vaccine produced by the method <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for crmB <400> 1 acatgcatgc caggac 16 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for crmB <400> 2 accattacaa acattatcc 19 <110> CJ Corporation <120> Method of producing smallpox vaccine using cell culture and the smallpox vaccine produced by the method <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for crmB <400> 1 acatgcatgc caggac 16 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for crmB <400> 2 accattacaa acattatcc 19
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