KR20080032476A - Annexin fusion protein - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 Tat-아넥신 융합 단백질 발현 벡터의 개략도. Tat-아넥신 발현 벡터의 구조는 pET-15b 벡터를 기본으로 하였다. 합성 HIV Tat(aa 49-57) 올리고머가 pET-15b의 NdeⅠ, XhoⅠ 제한부위 내로 클론되고, 사람 아넥신 cDNA가 pET-15b의 XhoⅠ, BamHⅠ 제한부위 내로 클론되었다. 얻어진 벡터는 "pTat-ANX"로 명명하였다. 발현은 IPTG를 가하여 유도되었다.1 is a schematic representation of a Tat-annexin fusion protein expression vector. The structure of the Tat-annexin expression vector was based on the pET-15b vector. Synthetic HIV Tat (aa 49-57) oligomers were cloned into NdeI, XhoI restriction sites of pET-15b and human annexin cDNA was cloned into XhoI, BamHI restriction sites of pET-15b. The resulting vector was named "pTat-ANX". Expression was induced by addition of IPTG.
도 2는 Tat-아넥신 융합 단백질의 발현과 이콜라이 세포의 단백질 추출물에서의 정제를 나타내는 사진(A), 정제된 융합 단백질(B)은 12% 젤 상에서 SDS-PAGE로 분석하였다.Figure 2 shows the expression of Tat-annexin fusion protein and purification in protein extracts of E. coli cells (A), purified fusion protein (B) was analyzed by SDS-PAGE on a 12% gel.
도 3은 폐 H1299 세포 내로 Tat-아넥신 융합 단백질을 세포 도입한 사진(A) 및 매크로파아지(macrophage) RAW264.7 세포로 세포 도입한 사진(B). 1~5μM Tat-아넥신 융합 단백질을 배양 배지에 60분 동안 가하였다. 3μM Tat-아넥신 융합 단백질을 각각 10~60분 동안 배양 배지에 가하였다.Figure 3 is a photo of the cell introduced Tat-annexin fusion protein into lung H1299 cells (A) and the photo of the cell introduced into macrophage (26) macro26 (26) cells (B). 1-5 μM Tat-annexin fusion protein was added to the culture medium for 60 minutes. 3 μM Tat-annexin fusion protein was added to the culture medium for 10-60 minutes each.
도 4는 폐 H1299 세포로 도입된 Tat-아넥신 융합 단백질의 안정성을 실험한 결과이다. 3μM Tat-아넥신 융합 단백질을 다양한 시간 동안 세포에 처리하였다. Tat-아넥신 융합 단백질의 세포 도입은 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.4 shows the results of experiments on the stability of Tat-annexin fusion protein introduced into lung H1299 cells. 3 μM Tat-annexin fusion protein was treated with cells for various times. Cell introduction of Tat-annexin fusion protein was analyzed by western blotting.
도 5는 세포 도입된 Tat-아넥신 융합 단백질이 LPS-유도 NO 발현을 억제하는 것을 나타낸 사진. 폐 세포는 Tat-아넥신 융합 단백질이 있는 상태로 또는 없는 상태로 LPS에 노출되었다.5 is a photograph showing that the cell-introduced Tat-annexin fusion protein inhibits LPS-induced NO expression. Lung cells were exposed to LPS with or without Tat-annexin fusion protein.
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알러지(Allergy)는 대부분의 사람에게는 아무런 반응을 나타내지 않다가 외부에서 침입한 이 물질에 대해 인체의 면역 기전이 보통보다 지나치게 이상화 반응을 보이는 현상이다. 특히 현대인들에게 급증하고 있는 알러지 질환 중의 하나인 아토피 피부염(atopy dermatitis)은 심한 가려움증을 가지는 재발성 만성 염증성 피부염[1, 2]으로서 주로 유아기나 아동기에 시작되며, 성인기까지 지속되거나 성 인이 된 후 발병되기도 한다. 아토피 피부염은 소양증(pruritus), 일괄적이고 특징적인 조직학적 패턴을 갖는 만성적 재발성 습진(eczema)등의 특징[1-3]을 보이며, 만성기에는 lichenification, palules, excoriation에 의해 특징지어진다[1]. 아토피 피부염 환자 중의 일부는 알레르기성 비염, 천식, 호흡기 질환 등을 동반하기도 한다[1, 3].Allergy is a phenomenon in which most of the human body's immune mechanisms react abnormally to this substance which has not reacted to most people but has invaded from the outside. In particular, atopic dermatitis, one of the allergic diseases soaring in modern people, is a recurrent chronic inflammatory dermatitis [1, 2] with severe itching, which usually begins in infancy or childhood, and persists or becomes adult. It may develop later. Atopic dermatitis is characterized by pruritus, chronic recurrent eczema with a collective and characteristic histological pattern [1-3], and is characterized by lichenification, palules, and excoriation in the chronic phase [1]. . Some patients with atopic dermatitis may have allergic rhinitis, asthma and respiratory disease [1, 3].
천식(Asthma)은 기관지가 정상인보다 민감해서 조그마한 자극에도 쉽게 반응하기 때문에 생기는 호흡기 질환이다. 외인성 천식, 내인성 천식, 혼합형 천식, 아스피린 유발성 천식, 직업성 천식 등이 있다[4]. 천식의 원인으로는 알레르기, 감염, 자율신경계의 실조, 내분비계의 이상, β-수용체의 차단상태, 정신적인 요인, 유전적인 요인 등이 있다. 외인성 천식에서는 혈청 총 IgE가 증가하며 항원 특이적 IgE가 검출된다. 히스타민이나 메사콜린 혹은 원인 항원을 이용한 흡입 기관지 유발시험에 양성반응을 보이면 천식을 확진할 수 있다[5].Asthma is a respiratory disease that occurs because the bronchus is more sensitive than normal and responds easily to small stimuli. Exogenous asthma, endogenous asthma, mixed asthma, aspirin-induced asthma and occupational asthma [4]. Causes of asthma include allergies, infections, ataxia of the autonomic nervous system, abnormalities of the endocrine system, blocking of β-receptors, mental and genetic factors. In exogenous asthma, serum total IgE is increased and antigen specific IgE is detected. A positive response to an inhalation bronchial challenge test using histamine or mesacolin or the causative antigen can confirm asthma [5].
아넥신(Annexin)은 인지질 결합 단백질(phospholipid-binding proteins) 중 하나이며, 칼슘(Ca)에 독립적이다[6]. 아넥신은 아넥신 1(Annexin 1), 아넥신 2(Annexin 2), 아넥신 5(Annexin 5) 등으로 구성된다. 특히 아넥신 1은 염증진행(inflammation processes)과 세포-세포간 통신(cell-cell communication)에 중요한 역할을 하여 면역 및 염증반응에 대한 다양한 질환에서 치료제로의 가능성을 보여 주었다[7]. 또한 아넥신은 최근 ERK 신호전달(signaling pathway)에 관여하는 것으로 보고되어 많은 연구가 진행 중이다[8].Annexin is one of the phospholipid-binding proteins and is independent of calcium [6]. Annexin consists of Annexin 1, Annexin 2, Annexin 5, and the like. Annexin 1, in particular, plays an important role in inflammation processes and cell-cell communication, demonstrating its potential as a therapeutic agent in various diseases for immune and inflammatory responses [7]. Annexin has also recently been reported to be involved in the ERK signaling pathway and many studies are underway.
생체 내 고분자들 특히 천식 및 면역질환에서 아넥신을 치료목적으로 이용하 려는 관심이 매우 높아지고 있다. 현재 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료법이다. 그러나 유전자 치료법은 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 인위적으로 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 문제점을 갖고 있다[9].There is a great interest in using annexin for therapeutic purposes in vivo polymers, especially in asthma and immune diseases. At the moment the most attention is on gene therapy. However, gene therapy is not easy to transport genes, low expression in target cells, short duration of protein expression in cells, and very difficult to artificially control the amount of protein expressed in target cells. And many other problems [9].
치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시킴에 있어 세포막을 거쳐 목표 단백질을 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.In moving drugs or proteins for treatment into cells, a method of directly delivering a target protein through a cell membrane may be considered. However, proteins are difficult to cross through cell membranes due to their size and biochemical properties. In general, it is known that a substance having a molecular weight of 600 Daltons or more is almost impossible to pass through the cell membrane.
최근에, 사람 면역결핍 바이러스 (Hunan Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat(transactivator of transcription) 단백질은 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 기능은 Tat 단백질의 중간부위인 단백질 형질도입 부위(Protein Transduction Domain)의 특성 때문에 나타나며 아직 그 정확한 기전은 알려지지 않은 상태이다[10-13]. 그러나 Tat 단백질의 세포막 통과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며 단백질 형질도입 부위가 직접 막의 지질 이중층과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해하고 있다[13, 14]. 이것은 Tat 단백질이 세포막을 통과하여 모든 종류의 세포 내로 투과할 수 있음을 의미한다.Recently, it has been found that the Tat (transactivator of transcription) protein, a type of Human Immunodeficiency Virus type-1 protein, efficiently moves through the cell membrane and easily migrates into the cytoplasm. This function appears due to the properties of the protein transduction domain, which is an intermediate part of the Tat protein, and its exact mechanism is still unknown [10-13]. However, Tat protein transmembrane does not seem to be involved in specific receptors or carriers and it is understood that the protein transduction site occurs by directly interacting with the lipid bilayer of the membrane [13, 14]. This means that Tat protein can pass through cell membranes and into all kinds of cells.
그러나, 모든 단백질이 Tat 단백질 수송 도메인과 융합 단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 이러한 사례들이 종종 논문으로 발표된 바 있다.However, not all proteins are fusion proteins with the Tat protein transport domain and can be permeable into cells. These cases have often been published in papers.
본 발명의 목적은 천식, 아토피 등의 면역 및 염증질환의 치료 및 예방에 유용한 아넥신 단백질을 세포 내로 효율적으로 도입할 수 있는 방법을 제공하려는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for efficiently introducing annexin protein into cells useful for the treatment and prevention of immune and inflammatory diseases, such as asthma, atopy and the like.
또한, 본 발명의 목적은 천식, 아토피 등의 면역 및 염증질환의 예방 또는 치료제로서 사용가능한 아넥신 융합 단백질을 제공하려는 것이다.It is also an object of the present invention to provide an annexin fusion protein that can be used as a prophylactic or therapeutic agent for immune and inflammatory diseases such as asthma, atopy and the like.
또한, 본 발명의 목적은 상기 세포 투과성 아넥신 융합 단백질을 주요성분으로 포함하는 천식, 아토피 등의 면역 및 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하려는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune and inflammatory diseases, such as asthma, atopy, including the cell-permeable Annexin fusion protein as a main component.
뿐만 아니라, 본 발명의 목적은 상기 세포 투과성 아넥신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품 조성물을 제공하려는 것이다.In addition, it is an object of the present invention to provide a health functional food composition comprising the cell-permeable Annexin fusion protein as an active ingredient.
본 발명자들은 아넥신 단백질을 효율적으로 세포 내로 도입하기 위하여 Tat 단백질 수송 도메인을 외부 단백질인 인간 아넥신에 융합(좀더 구체적으로는 공유결합 상태를 의미함)시켜 Tat-아넥신 융합 단백질을 제조하였고, 금속-킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다. 정제된 융합 단백질이 효과적으로 폐 및 RAW 264.7 세포 내로 투과되는지를 확인하였다. 또한 효과적으로 염증반응의 매개체인 NO 발현을 억제하는지를 확인하였다. 따라서 본 발명은 Tat-아넥신 융합 단백질이 세포 내 운반과 단백질 치료제 및 응용성에 있어서 매우 획기적인 기술이 라고 사료된다.The present inventors prepared the Tat-annexin fusion protein by fusing the Tat protein transport domain to an external protein, human annexin (more specifically, a covalent state) in order to efficiently introduce the annexin protein into cells. Purification was easy and convenient by metal-chelating affinity chromatography. It was confirmed that the purified fusion protein was effectively permeated into lung and RAW 264.7 cells. In addition, it was confirmed whether to effectively inhibit the expression of NO, a mediator of the inflammatory response. Therefore, the present invention is considered to be a very breakthrough technology for the Tat-annexin fusion protein in intracellular transport, protein therapeutics and applicability.
사람 면역결핍 바이러스(HIV-1)의 Tat 단백질이 이형 단백질을 세포 내로 이동시키는데 운반체로써 이용될 수 있다는 것이 여러 연구자들에 의하여 밝혀졌다. 따라서 본 발명에서는 이러한 Tat 단백질이 파킨슨 질환에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 아넥신을 세포 내로 운반시킬 수 있는지, 운반된 Tat-아넥신 융합 단백질이 세포 내에서 단백질의 기능을 나타내는지를 알아보고자 수행하였다.Several researchers have shown that the Tat protein of human immunodeficiency virus (HIV-1) can be used as a carrier to transfer heterologous proteins into cells. Therefore, the present invention was performed to determine whether the Tat protein can carry annexin known to play an important role in Parkinson's disease into the cell, and whether the delivered Tat-annexin fusion protein exhibits the function of the protein in the cell.
본 발명자들은 먼저 Tat-아넥신 융합 단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Tat-아넥신 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 아넥신, Tat 형질도입 부위의 9개 아미노산(Tat 49-57), 그리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다.We first developed a Tat-annexin expression vector that can overexpress and easily purify the Tat-annexin fusion protein. The expression vector contains human annexin, nine amino acids (Tat 49-57) at the Tat transduction site, and cDNA capable of expressing six histidine residues at the amino acid terminal.
이 발현벡터를 이용하여 Tat-아넥신 융합 단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 Tat-아넥신 융합 단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질은 세포 내에서 최소 60시간 지속적으로 유지되었으며 세포 내에서 NO 발현을 효과적으로 억제시켰다.The expression vector was used to overexpress Tat-annexin fusion protein in E. coli and purified using Ni-affinity chromatography. Western blots confirmed that the Tat-annexin fusion protein was delivered to the cells in a time and concentration dependent manner in cultured cells. The Tat-annexin fusion protein permeated into cells was maintained for at least 60 hours in cells and effectively inhibited NO expression in cells.
이러한 결과는 Tat-아넥신 융합 단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 아넥신의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 Tat-아넥신 융합 단백질은 천식 및 염증질환(아토피, 피부염 등)과 관련하여 세포의 보호 등 다양한 염증질환에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.These results indicate that the Tat-annexin fusion protein permeates well into the cell and exhibits the function of annexin in the cell. Therefore, the Tat-annexin fusion protein suggests the possibility of application to various inflammatory diseases such as protection of cells with respect to asthma and inflammatory diseases (atopic dermatitis, etc.).
Tat-아넥신 융합 단백질을 포함하여 수송도메인 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.Pharmaceutical compositions containing a transport domain fusion protein as an active ingredient, including a Tat-annexin fusion protein, can be formulated in oral or injectable form by conventional methods in combination with a carrier that is commonly acceptable in the pharmaceutical art. . Oral compositions include, for example, tablets and gelatin capsules, which, in addition to the active ingredient, may contain diluents (e.g. lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine), lubricants (e.g. silica, talc) , Stearic acid and its magnesium or calcium salts and / or polyethylene glycols, the tablets also contain binders (e.g. magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidone). ), And optionally a disintegrant (eg starch, agar, alginic acid or its sodium salt) or boiling mixture and / or absorbent, colorant, flavor and sweetener. Injectable compositions are preferably aqueous isotonic solutions or suspensions, and the compositions mentioned are sterile and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifier solution promoters, salts or buffers for controlling osmotic pressure. They may also contain other therapeutically valuable substances.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 천식에 적용하는 경우에는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 바와 같이 흡입 방식이나 스프레이 방식의 제제로 제형화할 수 있 다. 용량은 일일 투여량 0.001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The pharmaceutical preparations thus prepared may be administered orally as desired, or parenterally, i.e., intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically, and when applied to asthma in the art to which this invention pertains. As is well known to those skilled in the art, it may be formulated into inhaled or sprayed formulations. The dose may be administered by dividing the daily dose of 0.001-100 mg / kg in one to several times. Dosage levels for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, time of administration, method of administration, rate of excretion, severity of the disease, and the like.
나아가, 본 발명은 상기 Tat-아넥신 융합 단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 천식, 아토피 피부염, 피부염을 비롯한 다양한 면역질환 및 염증질환의 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention is characterized in that the Tat-annexin fusion protein as an active ingredient and comprising a pharmaceutically acceptable carrier, for the prevention and treatment of various immune diseases and inflammatory diseases, including asthma, atopic dermatitis, dermatitis Provided useful pharmaceutical compositions.
본 발명은 또한, 상기 Tat-아넥신 융합 단백질을 유효성분으로 하는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.The present invention also provides a health functional food composition comprising the Tat-annexin fusion protein as an active ingredient.
본 발명은 또한, 상기 Tat-아넥신 융합 단백질을 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 비롯한 피부 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 Tat-아넥신 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.The present invention also provides a topical skin composition including a cosmetic composition comprising the Tat-annexin fusion protein as an active ingredient. The coating agent which uses the fusion protein of this invention as an active ingredient can be easily manufactured in any form according to the conventional manufacturing method. As an example, in preparing a cream coating agent, the Tat-annexin fusion protein of the present invention is contained in a creamy oil-in-water (O / W) or water-in-oil (W / O) cream base, and includes perfume, chelating agent, pigment, Antioxidants, preservatives, etc. may be used as necessary, and synthetic or natural materials such as proteins, minerals, vitamins, etc. may be used in combination for the purpose of improving physical properties.
뿐만 아니라, 본 발명의 융합 단백질은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센 스 등으로 제형화될 수 있다.In addition, the fusion protein of the present invention can be used as a cosmetic, by adding a pH adjuster, fragrance, emulsifier, preservatives, etc. as needed, in the usual cosmetic preparation method, lotion, gel, water-soluble powder, fat-soluble powder, water-soluble liquid, cream Or formulated with an essence or the like.
본 발명은 또한 아넥신 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 아넥신 단백질 분자의 세포 내 전달은 HIV Tat 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 aa 49-57의 아홉 개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 1과 같은 아미노산 서열로 이루어진 HIV Tat 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 1의 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 7~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 다수 포함하는 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.The present invention also provides a method for efficiently delivering annexin protein into cells. Intracellular delivery of an annexin protein molecule according to the present invention is carried out by constructing a fusion protein in the form of a covalently bonded HIV Tat protein transport domain. An example of the transport domain of the present invention is an HIV Tat peptide consisting of nine amino acids of aa 49-57 and consisting of an amino acid sequence such as SEQ ID NO: 1. However, the protein transport domain of the present invention is not limited to the Tat peptide of SEQ ID NO: 1, and the production of a peptide having a function similar to the Tat peptide by partial substitution, addition or lack of the amino acid sequence of Tat in the field of the present invention belongs. Since it is easy for a person skilled in the art, a protein transport domain composed of 7 to 15 amino acids, including four or more lysine or arginine, and a protein transport function that performs the same or similar protein transport function by partially replacing amino acids therefrom. It will be apparent that the fusion protein using the domain belongs to the scope of the present invention.
구체적으로, 본 발명은 Tat-아넥신 융합 단백질, 이 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 이 융합 단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 건강 기능성 식품 등에 관한 것이다.Specifically, the present invention relates to a Tat-annexin fusion protein, a recombinant nucleotide and a vector for producing the fusion protein, a therapeutic composition comprising the fusion protein, a pharmaceutical composition for the purpose of prevention, a health functional food, and the like.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.Definitions of main terms used in the detailed description of the present invention are as follows.
"Tat-아넥신 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 아넥신을 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질(즉, 본 발명에서는 아넥신을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-아넥신", "아넥신 융합 단백질" 또는 "Tat-ANX"와 혼용하였다.“Tat-annexin fusion protein” refers to a covalent complex formed by genetic fusion or chemical bonding of a protein transport domain and annexin, and of the transport domain and a target protein (ie, annexin in the present invention). In this specification, it is mixed with "Tat-annexin", "annexin fusion protein" or "Tat-ANX".
"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 아넥신 단백질을 의미한다.A “target protein” is a molecule that is not originally a transport domain or fragment thereof that cannot enter the target cell or is not able to enter the target cell at its original useful rate, and is a molecule of the transport domain or of the transport domain-target protein complex prior to fusion with the transport domain. Refers to the target protein portion. The target protein includes a polypeptide, a protein, and a peptide, and means annexin protein in the present invention.
"융합 단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다."Fused protein" means a complex comprising a transport domain and one or more target protein moieties and formed by genetic fusion or chemical bonding of the transport domain and the target protein.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.In addition, the "genetic fusion" means a linear, covalent linkage formed through the genetic expression of the DNA sequence encoding the protein.
또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.In addition, "target cell" means a cell to which a target protein is delivered by a transport domain, and a target cell refers to a cell in or outside the body. That is, a target cell is meant to include cells in the body, that is, cells constituting organs or tissues of a living animal or human, or microorganisms found in a living animal or human. In addition, target cells are meant to include extracellular cells, ie cultured animal cells, human cells or microorganisms.
본 발명에서의 "수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.In the present invention, the "transport domain" may be covalently bonded to a polymer organic compound such as oligonucleotide, peptide, protein, oligosaccharide or polysaccharide to introduce the organic compound into cells without requiring a separate receptor, carrier, or energy. Say what it is.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.In addition, the specification is used interchangeably with the expressions "transport", "penetration", "transport", "delivery", "transmission", "pass" for "introducing" a protein, peptide, organic compound into a cell.
본 발명은 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 아넥신의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 아넥신 융합 단백질을 제공한다.The present invention provides an annexin fusion protein composed of 9 to 15 amino acid residues, wherein the transport domain comprising 3/4 or more of arginine or lysine residues is covalently bonded to at least one end of annexin to improve cell penetration efficiency.
또한, 본 발명에서 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the transport domain is characterized in that at least one of HIV Tat 49-57 residue, oligolysine, oligoarginine or oligo (lysine, arginine).
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질의 그 아미노산 서열이 서열번호 7과 같은 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the amino acid sequence of the fusion protein is the same as SEQ ID NO: 7.
또한, 본 발명은 아넥신 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 상기 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 아넥신 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.The present invention also provides a recombinant polynucleotide in which the transport domain coding oligonucleotide sequence is linked to at least one end of an annexin coding cDNA to encode an annexin fusion protein.
또한, 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 그 염기 서열이 서열번호 6과 같은 것을 특징으로 한다.In addition, the recombinant polynucleotide is characterized in that the nucleotide sequence is the same as SEQ ID NO: 6.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위한 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 아넥신 융합 단백질 발현벡터를 제공한다.The present invention also provides an annexin fusion protein expression vector comprising a recombinant polynucleotide for expressing the fusion protein.
또한, 본 발명은 상기 아넥신 융합 단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 천식, 피부염, 아토피 피부염 등 면역성 질환 또는 염증질환의 예방 및 치료제로서 사용되는 약제학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the annexin fusion protein as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier, and used as a prophylactic and therapeutic agent for immune diseases or inflammatory diseases such as asthma, dermatitis and atopic dermatitis. .
나아가, 본 발명은 상기 아넥신 융합 단백질을 유효성분으로 하며, 천식, 피부염, 아토피 피부염 등 면역성 질환 또는 염증질환의 예방 및 개선 효과가 있는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides the health functional food composition having the annexin fusion protein as an active ingredient and preventing and improving an immune disease or inflammatory disease such as asthma, dermatitis and atopic dermatitis.
본 발명은 9.15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 포함하는 단백질 수송 도메인이 아넥신 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성(cell-transducing) 아넥신 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.The present invention relates to a cell-transducing Annexin fusion protein consisting of 9.15 amino acids, wherein a protein transport domain comprising at least four lysine or arginine covalently attached to at least one end of the Annexin protein. In addition, silent changes may result in one or more amino acids in the sequence being substituted with other amino acid (s) of similar polarity that function functionally equivalently. Amino acid substitutions in the sequence may be selected from other members of the class to which the amino acid belongs.
예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.For example, hydrophobic amino acid classifications include alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, valine, tryptophan, proline and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positive basic amino acids include arginine, lysine and histidine. Negative charged acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Also included within the scope of the invention are fragments or derivatives thereof having the same similar biological activity within a range of homology between the fusion protein and amino acid sequence of the invention, such as 85-100%.
또한, 본 발명은 아넥신 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.The present invention also relates to recombinant polynucleotides including SEQ ID NO: 6, wherein the protein transport domain peptide coding DNA sequence is coupled to annexin cDNA to encode the cell-inducible fusion protein. The scope of the present invention extends not only to recombinant polynucleotides of SEQ ID NO: 6 but also to nucleic acid molecules having sequences by the codon degeneracy of the genetic code.
이하, 본 발명의 구성을 아래의 실시예의 기재를 통하여 좀더 상세히 알아본다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정된 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 자명하다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, it is apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited only to the description of the following examples.
재료 및 방법Materials and methods
<< 실시예Example 1: 재료> 1: material>
제한 효소와 T4 DNA 리가아제(ligase)는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머라아제는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Tat 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer(USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa(Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드(plasmid)는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-nitrilotriactic acid sepharose superflow는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 인간 아넥신 cDNA는 PCR 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.Restriction enzymes and T4 DNA ligase were purchased from Promega (USA) and Pfu polymerase was purchased from stratagene (USA). Tat oligonucleotides were synthesized in Gibco BRL custom primer (USA). IPTG was purchased from Duchefa (Netherland). pET-15b and BL21 (DE3) plasmids were purchased from Novagen (USA) and Ni-nitrilotriactic acid sepharose superflow was purchased from Qiagen (Germany). Human annexin cDNA was isolated from human liver cDNA library by PCR method. All other reagents were used as express products.
<< 실시예Example 2: 2: TatTat -- 아넥신Annexin 융합 단백질 발현벡터의 제조 및 형질변 환( Preparation and Transformation of Fusion Protein Expression Vectors transformationtransformation )>)>
Tat-아넥신 융합 단백질을 생산하기 위하여 우선, HIV-1 Tat의 염기성 도메인(아미노산 49-57)이 포함된 pET-Tat 발현벡터를 만들었다. Tat 염기성 도메인에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(상위 쇄, 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'; 하위 쇄, 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3')를 NdeI - XhoI 제한효소로 자른 pET15b에 결찰(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 아넥신의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머(Forward primer)는 5'- CTCGAGATGGCAATGGTATCAGAA-3' 로 Xho I 제한부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머(reverse primer)의 서열은 5'-GGATCCTTAGTTTCCTCCACAAAG-3' 로 BamH I 제한부위가 있다.To produce a Tat-annexin fusion protein, first, a pET-Tat expression vector containing a basic domain (amino acids 49-57) of HIV-1 Tat was made. Two types of oligonucleotides (top chain, 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3 '; lower chain, 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3') corresponding to the Tat basic domain were ligated into pET15b cut with NdeI - XhoI restriction enzymes. It was. Then, based on the sequence of the cDNA of human annexin Two kinds of oligonucleotides were synthesized. Forward primer is 5'- CTCGAGATGGCAATGGTATCAGAA-3 'has an Xho I restriction site and the reverse primer sequence has a BamH I restriction site at 5'-GGATCCTTAGTTTCCTCCACAAAG-3'.
중합효소 연쇄반응(PCR)은 온열 순환반응기(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였으며, 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 튜브(siliconized reaction tube)에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 55℃에서 1분간 어닐링(annealing), 그리고 74℃에서 1분 30초간, 72℃에서 5분간 최종 연장(final extension)을 30회 반복 유도하였다. PCR 수행 후 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결하였다. 이어 이 벡터를 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법(alkaline lysis method)으로 분리하였다[15]. 인간 아넥신 cDNA가 포함된 TA 벡터를 Xho Ⅰ과 BamH Ⅰ로 절단한 다음 HIV-1 Tat 발현 벡터에 삽입하였다. Tat-아넥신 융합 단백질로 형질변환된 E. coli BL21(DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎖ LB 배지에 접종하고 IPTG (0.5mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 Tat-아넥신의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 Tat-아넥신은 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.Polymerase chain reaction (PCR) was performed in a thermal cycle reactor (Perkin-Elmer, model 9600), and the reaction mixture was placed in a 50 µl silicon tube (siliconized reaction tube) and heated at 94 ° C for 5 minutes. PCR reactions induced 30 minutes of denaturation at 94 ° C., annealing at 55 ° C. for 1 minute, and final extension at 74 ° C. for 1
<< 실시예Example 3: 재조합 3: recombination TatTat -- 아넥신Annexin 융합 단백질의 정제> Purification of Fusion Proteins>
형질전환된 E. coli BL21을 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D600 = 0.5~1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM되게 한 다음 3시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리 하여 모은 뒤 5㎖ 결합 완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)에 6M 우레아(urea)를 첨가하여 초음파 파쇄(sonication)하였다.Transformed E. coli BL21 was put in LB medium containing ampicillin (ampicillin) and incubated with stirring at 200 rpm at 37 ℃. When the bacterial concentration in the culture medium showed OD 600 = 0.5-1.0, IPTG was added to the medium to bring the final concentration to 0.5 mM, followed by further incubation for 3 hours. The cultured cells were collected by centrifugation and sonicated by adding 6M urea to 5ml binding buffer (5mM imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9).
원심분리하여 상청액을 즉시 2.5㎖ Ni2 +-nitrilotriacetic acid sepharose column에 부하하고 10배 부피의 결합 완충액과 6배 부피의 세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 세척한 다음 용출 완충액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD10 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다. 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다[16].Centrifuge immediately and load the supernatant into 2.5 ml Ni 2 + -nitrilotriacetic acid sepharose column and with 10 volumes of binding buffer and 6 volumes of wash buffer (60 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) After washing, the fusion protein was eluted with elution buffer (1M imidazole, 0.5M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9). Subsequently, the fractions containing the fusion protein were collected and PD10 chromatography was performed to remove salts contained in the fractions. Protein concentration was measured by Bradford method using bovine serum albumin as a standard [16].
<< 실시예Example 4: 세포배양 및 재조합 4: Cell Culture and Recombination TatTat -- 아넥신Annexin 융합 단백질의 세포 내 투과> Intracellular Permeation of Fusion Proteins>
폐 세포 및 RAW264.7 세포는 ATCC에서 구입하였고, 37℃에서 95% 공기와 5% CO2를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH(pH 7.4), 5mM NaHCO3, 10% 우태혈청(fetal bovine serum; "FBS") 및 항생제(100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다.Lung cells and RAW264.7 cells were purchased from ATCC and supplied 95% air and 5% CO 2 at 37 ° C., 20 mM HEPES / NaOH (pH 7.4), 5 mM NaHCO 3 , 10% fetal bovine serum; Cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) medium with antibiotics (100 μg / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin).
Tat-아넥신의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, 세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하고 여러 농도의 재조합 Tat-아넥신 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 1시간 뒤, 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 PBS(phosphate buffered saline)으로 충분히 세척하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질의 양을 웨스턴 블랏 분석으로 비교 측정하였다.To observe intracellular penetration of Tat-annexin, cells were grown for 4-6 hours in 6-well plates, replaced with 1 ml fresh culture medium without FBS, and various concentrations of recombinant Tat-annexin fusion protein were replaced. Treated in culture. After 1 hour, the cells were treated with trypsin-EDTA (Gibco BRL) and washed sufficiently with PBS (phosphate buffered saline). After crushing the cells, the amount of Tat-annexin fusion protein permeated into the cells was compared by Western blot analysis.
<< 실시예Example 5: 5: 웨스턴Weston 블랏Blot 분석> Analysis>
Tat-아넥신 융합 단백질의 세포 내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏팅 방법을 수행하였다. 준비된 세포에 Tat-아넥신 융합 단백질을 농도 및 시간별로 처리한 다음, 세포들만 모아서 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이 동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 5% 탈지분유가 들어 있는 PBS로 블로킹하였다. 이어 멤브레인은 래빗 항-히스티딘 폴리클론 항체(polyclonal antibody; Santacruze, USA, 1:1,000)로 1시간 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-래빗 (mouse anti-rabbit) IgG 항체(1:10,000 희석)와 한 시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL kit(ECL; Amersham)을 이용하여 아넥신 단항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.Western blotting was performed to confirm intracellular penetration of the Tat-annexin fusion protein. Tat-annexin fusion protein was treated to the prepared cells by concentration and time, and then cells were collected and western blotting was performed. Proteins in the cell mill were separated by 12% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and the proteins in the gels were then electrophoresed to the nitrocellulose membrane (Amersham, UK). The protein shifted nitrocellulose membrane was blocked with PBS containing 5% skim milk powder. The membrane was then treated with a rabbit anti-histidine polyclonal antibody (Santacruze, USA, 1: 1,000) for 1 hour. After washing, one hour of reaction with horseradish peroxidase-coupled mouse anti-rabbit IgG antibody (1: 10,000 dilution) was performed. Finally, an ECL kit (ECL; Amersham) was used to confirm the protein band in response to the annexin monoantibody.
<< 실시예Example 6: 세포로 투과된 6: permeated into cells TatTat -- 아넥신Annexin 융합 단백질의 안정성> Stability of Fusion Proteins>
세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질의 세포 내 안정성을 측정하기 위하여, 피부 세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하고 재조합 Tat-아넥신 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 처리 1 시간 후 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 FBS가 포함된 배지를 넣고 계속 배양하면서, 시간별(1~60시간)로 세포를 모아 세포 내에 남아 있는 융합 단백질의 양을 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다.To measure the intracellular stability of Tat-annexin fusion proteins permeated into cells, skin cells were grown for 4-6 hours in 6-well plates, replaced with 1 ml fresh culture medium without FBS and recombinant Tat- Annexin fusion proteins were treated in culture. One hour after treatment cells were treated with trypsin-EDTA and washed well with PBS. Subsequently, the medium containing the FBS was added and the culture was continued, and the cells were collected hourly (1 to 60 hours) to measure the amount of fusion protein remaining in the cells by Western blotting.
<< 실시예Example 7: 면역반응 억제 효과> 7: inhibitory effect of immune response>
LPS로 유도한 면역억제 효과를 측정하기 위해 세포를 6-웰 플레이트에서 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하고 재조합 Tat-아넥신 융합 단백질을 배양액 내에 처리한 후 LPS를 투여하였다. 투여 후 NO의 발현 및 억제효과를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.To measure LPS-induced immunosuppressive effects, cells were grown in 6-well plates and replaced with 1 ml of fresh culture without FBS, and treated with recombinant Tat-annexin fusion protein in the culture, followed by LPS. . After administration, expression and inhibition of NO were confirmed by Western blotting.
결과result 1) 재조합 1) recombination TatTat -- 아넥신Annexin 융합 단백질의 과대발현 및 정제 Overexpression and Purification of Fusion Proteins
Tat-아넥신 융합 단백질을 과대 발현시키기 위하여 아넥신, Tat의 형질 도입부위(Tat 49-57) 및 6개의 히스티딘에 대한 cDNA가 연속적으로 포함되어 있는 Tat-아넥신 융합 단백질 발현 벡터를 개발하였다(도 1). 융합 단백질에 대한 대조 단백질인 아넥신을 과대 발현시키기 위하여 Tat의 형질 도입부위(Tat 49-57)만 포함되지 않고 나머지 부위는 동일한 아넥신 발현 벡터를 개발하였다.To overexpress the Tat-annexin fusion protein, a Tat-annexin fusion protein expression vector was developed that contains annexin, the transduction site of Tat (Tat 49-57) and cDNAs for six histidines in succession ( 1). In order to overexpress Annexin, a control protein for the fusion protein, only the transduction site of Tat (Tat 49-57) was included and the other sites developed the same Annexin expression vector.
IPTG로 융합 단백질의 과대 발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파로 파쇄한 다음, 원심분리하여 상청액의 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분리하였다. 융합 단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합 단백질을 순수하게(순도 〉95%) 정제하였다(도 2A). 정제된 융합 단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 다시 한 번 확인하였다(도 2B).Escherichia coli cells induced overexpression of the fusion protein with IPTG were sonicated at 4 ° C, and then centrifuged to separate the supernatant proteins by 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Since the fusion protein contains six histidines at the N-terminus, the fusion protein was purified (purity> 95%) in a single step using immobilized metal-chelate affinity chromatography (FIG. 2A). . Purified fusion protein was once again confirmed by Western blot analysis (FIG. 2B).
결과result 2) 재조합 2) recombination TatTat -- 아넥신Annexin 융합 단백질의 세포 투과 Cell Permeation of Fusion Proteins
정제한 Tat-아넥신 융합 단백질의 신경 세포 내 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 도 3에 나타낸 것처럼 Tat-아넥신이 시간 및 농도 의존적으로 신경 세포 내로 투과되는 것을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 3A는 농도별(1~5μM) 및 시간별(10~60분)로 Tat-아넥신 융합 단백질을 폐 세포에, 도 3B는 매크로파아지 RAW264.7 세포 배양액 내에 처리하였을 때의 결과이다. Tat-아넥신 융합 단백질의 세포 내 투과 정도를 농도별로 관찰했을 때 농도 의존적으로 세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 시간별로 관찰하였을 경우 투여 10분 이내에 투과된 융합 단백질을 확인할 수 있었고, 처리 시간에 비례하여 세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질의 양이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과로부터 Tat-아넥신 융합 단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포 내 투과가 일어남을 알 수 있었다.The neural cell permeation of the purified Tat-annexin fusion protein was observed to change with time and concentration. As shown in FIG. 3, Western blotting confirmed Tat-annexin permeation into nerve cells in a time and concentration dependent manner. 3A shows the results of treatment of lung cells with Tat-annexin fusion protein by concentration (1-5 μM) and time (10-60 minutes), and FIG. 3B in macrophage RAW264.7 cell culture. When the degree of intracellular permeation of the Tat-annexin fusion protein was observed by concentration, it was confirmed that the amount of Tat-annexin fusion protein permeated into the cell increased in a concentration-dependent manner. In addition, when observed over time, the permeated fusion protein could be confirmed within 10 minutes of administration, and it was confirmed that the amount of Tat-annexin fusion protein permeated into cells increased in proportion to the treatment time. From these results, it can be seen that intracellular permeation of Tat-annexin fusion protein occurs in a time and concentration-dependent manner.
세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질은 상당 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이 세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질은 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소하였으나, 최소 60시간 동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다. 따라서 세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질은 최소 60시간은 안정성을 유지하고 있기 때문에 유용하게 단백질 치료에 응용할 수 있다.Tat-annexin fusion proteins permeated into cells must remain stable in the cells for a significant period of time before they can be effectively applied to protein therapy. As shown in FIG. 4, the Tat-annexin fusion protein permeated into the cell was degraded with time, and the amount of protein gradually decreased, but it was found to exist in the cell for at least 60 hours. Therefore, the Tat-annexin fusion protein penetrated into the cell is useful for protein treatment because it maintains stability for at least 60 hours.
결과 3) Result 3) TatTat -- 아넥신Annexin 융합 단백질의 생물학적 기능 Biological Functions of Fusion Proteins
신경세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질은 그 고유한 활성을 유지해야만 이를 단백질 치료에 응용할 수 있다. 따라서 세포 내로 투과된 융합 단백질이 어느 정도 생물학적인 활성을 지니는지는 매우 중요한 문제이다. 따라서 정제된 Tat-아넥신 융합 단백질의 생물학적 기능을 알아보기 위해 LPS에 의해 유발되는 NO 생성 억제를 확인하였다(도 5). 아넥신 단백질은 유해산소인 NO에 대한 저항성을 가진다. 이러한 결과는 아넥신 단백질이 LPS 노출에 의한 세포를 보호하는 효과를 나타내어 세포 내로 투과된 Tat-아넥신 융합 단백질이 면역억제 및 NO 제거기능을 나타냄을 의미한다. 따라서 이러한 결과는 Tat-아넥신 융합 단백질이 천식 및 면역질환에 대한 새로운 질환치료제로의 사용할 수 있음을 제시해 준다.Tat-annexin fusion proteins permeated into neurons must maintain their inherent activity before they can be applied to protein therapy. Therefore, the degree of biological activity of the fusion protein penetrated into the cell is a very important problem. Therefore, in order to examine the biological function of the purified Tat-annexin fusion protein, NO inhibition induced by LPS was confirmed (FIG. 5). Annexin protein is resistant to the noxious oxygen NO. These results indicate that the annexin protein has an effect of protecting the cells by LPS exposure, indicating that the Tat-annexin fusion protein permeated into the cells exhibits immunosuppression and NO elimination functions. These results thus suggest that the Tat-annexin fusion protein can be used as a novel disease treatment for asthma and immune diseases.
본 발명은 인간 아넥신을 효과적인 방법으로 단백질 수준에서 세포 내로 직접 투과시키는 실험적 보고이다.The present invention is an experimental report of direct penetration of human annexin into cells at the protein level in an effective manner.
천식 및 다양한 면역질환(아토피, 피부염 등) 에 대한 염증을 회복하는데 있어서 주된 역할을 담당하는 아넥신을 세포 내 투여함으로써 천식 및 아토피 피부염, 그와 관련된 염증질환을 치료하는 단백질 치료에 Tat-아넥신 융합 단백질이 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.Tat-annexin fusion in protein therapy to treat asthma and atopic dermatitis and related inflammatory diseases by intracellular administration of annexin, which plays a major role in restoring inflammation against asthma and various immune diseases (atopic dermatitis, etc.) It is thought that protein can be effectively used.
본 발명을 바탕으로 Tat-아넥신 융합 단백질을 세포 내로 직접 전달하여 천식 및 아토피, 피부염 등의 염증질환으로부터 세포 및 조직을 보호할 수 있기 때문에 질병 이외에도 기능성 화장품 산업 등에 더욱 효과적으로 본 기술이 광범위하게 활용될 수 있다.Based on the present invention, Tat-annexin fusion protein can be delivered directly into cells to protect cells and tissues from inflammatory diseases such as asthma, atopic dermatitis and dermatitis. Can be.
<110> Hallym University <120> ANNEXIN FUSION PROTEIN <130> hallymU-tatanx <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagatgg caatggtatc agaa 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggatccttag tttcctccac aaag 24 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence which consists of HIV Tat coding sequence and human annexin cDNA sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1065) <400> 6 agg aag aag cgg aga cag cga cga aga atg gca atg gta tca gaa ttc 48 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Ala Met Val Ser Glu Phe 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