KR20080024594A - Drug delivery system for controlled release of angiogenesis-promoting protein drugs - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 헤파린 함량이 다른 나노입자로부터 방출되는 모델 단백질 라이소자임(lysozyme)의 누적 방출량(%)을 나타낸 그래프이다. 도면에서, HEP는 헤파린, 숫자는 헤파린의 함량, NP는 나노입자를 나타낸다.1 is a graph showing the cumulative release (%) of the model protein lysozyme released from nanoparticles with different heparin contents. In the figure, HEP represents heparin, numbers represent heparin content, and NP represents nanoparticles.
도 2는 헤파린 기능화 나노입자(헤파린 4.7 중량%) 및 PLGA 나노입자(헤파린 0.0 중량%)를 포함하는 수화젤 복합체와 피브린 수화젤만으로 구성된 시스템으로부터 방출되는 모델 단백질인 BMP-2(bone morphogenetic protein-2)의 누적 방출량(%)을 나타낸 그래프이다. 여기서, BMP-NP-Fibrin과 BMP-PLGA NP-Fibrin은 각각 BMP-2가 충진된 헤파린 기능화 나노입자 또는 헤파린으로 기능화 되지 않은 PLGA 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체이고, BMP-Fibrin은 BMP-2가 충진된 피브린 수화젤을 나타낸다.FIG. 2 is a model protein BMP-2 (bone morphogenetic protein-) released from a hydrogel complex comprising only heparin functionalized nanoparticles (4.7 weight percent heparin) and PLGA nanoparticles (0.0 weight percent heparin) and fibrin hydrogels. It is a graph which shows the cumulative emission amount (%) of 2). Here, BMP-NP-Fibrin and BMP-PLGA NP-Fibrin are each a hydrogel complex containing heparin functionalized nanoparticles filled with BMP-2 or PLGA nanoparticles not functionalized with heparin, and BMP-Fibrin is BMP-2. Represents fibrin hydrated gel.
도 3는 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)가 충진된 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체를 우측대퇴동맥 절제가 이루어진 토끼하지허혈모델에 이식하고 2주 후 혈관신생을 관측한 혈관 조영상이다. 패널 A는 피브린 수화젤만을 이식한 결과, 패널 B는 VEGF가 충진된 피브린 수화젤을이식한 결과, 및 패널 C는 VEGF가 충진된 본 발명의 수화젤 복합체를 이식한 결과를 보여준다.FIG. 3 shows angiogenesis two weeks after implanting a hydrogel gel complex containing heparin-filled nanoparticles filled with vascular endothelial growth factor (VEGF) into a rabbit lower limb ischemia model with right femoral artery resection. Angiography observed. Panel A shows the result of transplanting only the fibrin hydrogel, Panel B shows the result of transplanting the fibrin hydrogel filled with VEGF, and Panel C shows the result of implanting the hydrogel complex of the present invention filled with VEGF.
도 4은 혈관조영상을 기반으로 대퇴심동맥 및 내장골동맥으로부터 분지되는 측부혈관을 스코어링하여 통계적으로 처리한 그래프이다. 대조군은 피브린만을 이식한 군, VEGF는 VEGF가 충진된 피브린 수화젤을 이식한 실험군, 그리고 VEGF in NPs는 VEGF가 충진된 본 발명의 수화젤 복합체를 이식한 실험군을 나타낸다.FIG. 4 is a graph obtained by statistically treating the side vessels branched from the femoral artery and the visceral bone artery based on the angiogram. The control group represents a group implanted with fibrin alone, the VEGF represents an experimental group transplanted with VEGF-filled fibrin hydrogels, and the VEGF in NPs represents an experimental group transplanted with a VEGF-filled hydrogel complex.
도 5는 VEGF가 충진된 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 본 발명의 수화젤 복합체를 우측대퇴동맥 절제가 이루어진 토끼하지허혈모델에 이식하고 13일 후 도플러 초음파를 이용하여 측정된 혈압의 회복속도를 관찰한 그래프이다.FIG. 5 shows the recovery rate of blood pressure measured using Doppler
본 발명은 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템 및 그의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a sustained release topical drug delivery system for angiogenesis-promoting protein drugs and a method of making the same.
성장인자 및 호르몬과 같은 치료용 단백질이나 펩타이드는 생체 내에서 반감기가 매우 짧고 친수/소수 계면 상에서 쉽게 변성이 되므로, 소수성의 합성 약물에 비해 서방형 전달시스템의 개발이 매우 어렵다. 이러한 면에서 친수성 수화젤제 의 사용은 계면 상에서의 단백질 약물의 변성을 근본적으로 해결할 수 있으며 특히 성장인자와 같은 단백질 약물의 사용에 있어서 국소적 적용을 가능하게 하므로 다양한 경우의 단백질 약물전달계에 적용되어 왔다. Therapeutic proteins and peptides, such as growth factors and hormones, have very short half-lives in vivo and are readily denatured on hydrophilic / hydrophobic interfaces, making it more difficult to develop sustained release delivery systems than hydrophobic synthetic drugs. In this respect, the use of hydrophilic hydrogels has been applied to protein drug delivery systems in various cases since it can fundamentally solve the denaturation of protein drugs on the interface and enables local application in the use of protein drugs such as growth factors. .
그러나, 일반적인 수화젤제의 경우 대상물질이 수화젤 안에서 확산에 의해서 방출되는 방법에 의존하기 때문에 긴 방출 시간을 얻을 수 없고, 초기 약물방출(initial burst)이 매우 크게 나타나는 문제점이 지적되어 왔다. 또한, 일부 수화젤의 경우 충진된 단백질 약물이 수화젤을 구성하는 물질과 비가역적 결합을 형성하여 단백질의 활성 저하를 야기하는 문제점이 발생하였다. 따라서, 이와 같은 수화젤제 적용상의 한계를 극복하기 위한 구체적인 방법들이 제시되었다.However, it has been pointed out that in the case of general hydrogel, a long release time cannot be obtained because an object is released by diffusion in the hydrogel, and an initial burst is very large. In addition, in some hydrogels, the filled protein drug forms a irreversible bond with the material constituting the hydrogel, causing a problem of deactivation of the protein. Therefore, specific methods for overcoming the limitation of the application of the hydrogel agent have been proposed.
콜라겐과 황산화 다당류로 구성된 수화젤의 경우(EP 1374857), 약물의 안정화와 방출조절을 위하여 화학적 가교를 도입하였으며, 특이적 결합을 통한 성장인자의 안정화를 위하여 황산화 다당류와의 화학적 가교가 시도되었다(WO 00/78356). 하지만 가교도입 시, 화학적 반응으로 인하여 단백질 약물의 활성저하가 야기되는 문제점이 있다.In the case of hydrogels composed of collagen and sulfated polysaccharides (EP 1374857), chemical crosslinking was introduced for stabilization and release control of drugs, and chemical crosslinking with sulfated polysaccharides was attempted to stabilize growth factors through specific binding. (WO 00/78356). However, when cross-linking, there is a problem that the deactivation of the protein drug due to the chemical reaction.
WO 03/028779호는 비황산화 음이온성 다당류인 알지네이트와 단백질 상호간의 이온 복합체 형성을 이용하여 로딩된 약물의 방출조절을 유도하였으며, 유럽특허 제0321277호는 콜라겐을 이용한 수화젤제를 개시하고 있다. 전자의 경우에는 수화젤 형성 시, 성장인자의 비가역적 결합으로 인한 활성저하가 발생하며, 후자의 경우 과다한 초기방출로 인해 고가인 성장인자를 과량으로 지지체내에 로딩해야 하는 경제적인 부담과 질병 전이의 잠재적인 위험성이 존재한다.WO 03/028779 induces controlled release of loaded drugs using the formation of ionic complexes between alginates and proteins, which are non-sulfurized anionic polysaccharides, and European Patent No. 0321277 discloses hydrogels using collagen. In the former case, the formation of hydrogel causes deactivation due to irreversible coupling of growth factors, and in the latter case, the economic burden of overloading expensive growth factors into the support due to excessive initial release and disease transfer There is a potential risk of
히알루론산 수화젤을 이용한 골 형성 단백질의 서방형 약물전달시스템의 경우(CA 2486113), 소수성 기능기의 도입으로 지지체내의 계면 상에서 단백질 입체구조가 불안정해지고, 잔류 유기용매로 인한 단백질의 비활성화가 발생한다.In the sustained-release drug delivery system of bone-forming protein using hyaluronic acid hydrogel (CA 2486113), introduction of hydrophobic functional groups leads to unstable protein conformation at the interface in the support, and inactivation of proteins due to residual organic solvents. do.
피브린 수화젤 내에 서방형 시스템을 도입하기 위해 헤파린을 포함하는 피브린 수화젤이 개발되었으며, 분자내에 헤파린 결합부위가 있는 성장인자들을 대상으로 서방형 시스템의 구성이 보고 되었다. 이 경우 헤파린과 정전기적 상호작용이 가능한 펩타이드를 우선 수화젤내에 공유결합시키는 방식으로 헤파린을 수화젤 내에 고정시켰다[J. Control Release 65(3):389-402(2000); 미국 특허 제6468731호 및 제 6723344호]. 그러나, 제조과정이 복잡하고 재료비가 고가라는 단점이 있다.Fibrin hydrogels containing heparin have been developed to introduce sustained release systems in fibrin hydrogels, and the composition of sustained release systems has been reported for growth factors with heparin binding sites in the molecule. In this case, heparin was immobilized in the hydrogel by covalently binding a peptide capable of electrostatic interaction with heparin in the hydrogel [J. Control Release 65 (3): 389-402 (2000); U.S. Pat.Nos. 6468731 and 6723344. However, there is a disadvantage that the manufacturing process is complicated and the material cost is expensive.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 특히 혈관신생-촉진 단백질 약물의 서방성(controlled-release potential)을 개선하고 비교적 간단한 공정으로 제조될 수 있는 약물전달 시스템을 개발하기 위하여, 예의 연구 노 력하였다. 그 결과, 다당류로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤을 제조하되 두 종의 수화젤 층을 형성시켜 약물전달 시스템을을 제조하면, 운반되는 단백질 약물의 안정성 및 서방성이 크게 개선되며, 특히 VEGF와 같은 혈관신생-촉진 단백질 약물의 초기방출을 크게 감소시켜 서방성을 개선함으로써 단백질 약물의 국소적 전달 효과를 극대화하여, 혈관의 폐쇄와 연관된 질환 또는 허혈성 질환의 치료가 매우 유용한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.In order to solve the above-mentioned problems of the prior art, the inventors of the present invention, in particular, improve the controlled-release potential of angiogenesis-promoting protein drugs and develop drug delivery systems that can be manufactured in a relatively simple process. Research efforts have been made. As a result, when a hydrogel containing polysaccharide-functionalized nanoparticles is prepared, but two hydrogel layers are formed to prepare a drug delivery system, the stability and sustained release of the transported protein drug are greatly improved, especially VEGF. By greatly reducing the initial release of angiogenesis-promoting protein drugs such as to maximize the local delivery effect of protein drugs by discovering the fact that treatment of diseases associated with occlusion or ischemic diseases is very useful. The present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템을 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a sustained release topical drug delivery system for angiogenesis-promoting protein drugs.
본 발명의 다른 목적은 상기 서방형 국소 약물전달 시스템을 포함하는 혈관의 폐쇄와 연관된 질환 또는 허혈성 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating a disease or ischemic disease associated with occlusion of blood vessels comprising the sustained release topical drug delivery system.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 서방형 국소 약물전달 시스템을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide a method for producing the sustained release topical drug delivery system.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 도면을 통하여 보다 명확하게 설명된다.Other objects and advantages of the present invention will be more clearly understood through the following detailed description and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템을 제공한다:According to one aspect of the invention, the invention provides a sustained release topical drug delivery system for angiogenesis-promoting protein drugs comprising:
(a) 다음을 포함하는 수화젤 복합체: (a-1) (ⅰ) 생분해성 고분자를 포함하는 코어; (ⅱ) 상기 코어 상에 형성된 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤; 및 (ⅲ) 상기 코어 및 제1수화젤에 비공유결합된 다당류 분자를 포함하는 다당류-기능화(functionalized) 나노입자; 그리고 (a-2) 상기 나노입자를 함유하는 담체로서 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자로 이루어진 제2수화젤; 그리고, (a) a hydrogel complex comprising: (a-1) (iii) a core comprising a biodegradable polymer; (Ii) a first hydrogel made of a biocompatible polymer formed on the core; And (iii) polysaccharide-functionalized nanoparticles comprising polysaccharide molecules non-covalently bonded to the core and the first hydrogel; And (a-2) a second hydrogel made of a biocompatible polymer having cell adhesion as a carrier containing the nanoparticles; And,
(b) 상기 다당류 분자에 특이적으로 비공유결합된 VEGF(vascular endothelial cell growth factor), FGF(fibroblast growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor) 또는 이의 조합. (B) vascular endothelial cell growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet-derived growth factor (PDGF), or a combination thereof, specifically non-covalently bound to the polysaccharide molecule.
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 특히 VEGF와 같은 혈관신생-촉진 단백질 약물의 서방성(controlled-release potential)을 개선하고 비교적 간단한 공정으로 제조될 수 있는 약물전달 시스템을 개발하고자 하였다. 그 결과, 다당류로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤을 제조하되 두 종의 수화젤 층을 형성시켜 약물전달 시스템을을 제조하면, 운반되는 단백질 약물의 안정성 및 서방성이 크게 개선되며, 특히 단백질 약물의 초기방출을 크게 감소시켜 서방성을 개선함으로써 단백질 약물의 국소적 전달 효과를 극대화 할 수 있다는 사실을 발견하였다.In order to solve the above-mentioned problems of the prior art, the present inventors seek to develop a drug delivery system that can be manufactured in a relatively simple process and in particular to improve the controlled-release potential of angiogenesis-promoting protein drugs such as VEGF. It was. As a result, when a hydrogel containing polysaccharide functionalized nanoparticles is prepared, but two hydrogel layers are formed to prepare a drug delivery system, the stability and sustained release of the transported protein drug is greatly improved. It has been found that the initial release of the drug can be greatly reduced to maximize the local delivery effect of the protein drug by improving the sustained release.
본 발명은 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템을 제공한다.The present invention provides a sustained release topical drug delivery system for angiogenesis-promoting protein drugs.
본 발명의 수화젤 복합체에서 코어를 형성하는 것은 생분해성 고분자이다. 본 명세서에서 용어 "생분해성 고분자"는 pH 6-8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때 분해되는 고분자를 의미하며, 바람직하게는 생체 내에서 체액 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있는 고분자를 의미한다. 본 발명에서 사용가능한 생분해성 고분자는, 상술한 분해성을 가지는 고분자이면 어떠한 것도 가능하며, 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(이하, "PLGA"라 한다), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트), 폴리(하이드록시발러레이트) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 다당류가 첨가된 유화제 수용액에 첨가되어 다당류로 기능화된 나노입자를 제조하기에 충분하기만 하면 위에 예시한 고분자에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 상기 생분해성 고분자는 미국 FDA에서 생체 내 독성이 없는 것으로 승인을 받은 PLGA이며, 가장 바람직하게는 화학식 1로 표시되는 PLGA이다.In the hydrogel composite of the present invention, the core is formed of a biodegradable polymer. As used herein, the term "biodegradable polymer" refers to a polymer that decomposes when exposed to a physiological solution having a pH of 6-8, preferably a polymer that can be decomposed by a body fluid or microorganism in vivo. do. The biodegradable polymer that can be used in the present invention may be any polymer as long as it has the above-described degradable polymer, and may be poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid) (hereinafter referred to as "PLGA"), polylactic acid, or polyglycol. Acids, poly (caprolactone), poly (valerolactone), poly (hydroxybutylate), poly (hydroxyvallate), and combinations thereof. In particular, the polysaccharide is not limited to the polymers exemplified above as long as it is sufficient to prepare the nanoparticles functionalized with the polysaccharide by being added to the aqueous solution of the emulsifier. More preferably, the biodegradable polymer is PLGA approved by the US FDA as non-toxic in vivo, most preferably PLGA represented by the formula (1).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생분해성 고분자의 중량평균분자량은 5,000-100,000이며, 보다 바람직하게는 10,000-20,000이다. 분자량이 5,000 미만이면 나노입자를 형성하는데 분자 자체의 응집이 어려워 수율이 감소하며 입자내에 다당류가 불안정하게 고정되는 문제가 발생한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the weight average molecular weight of the biodegradable polymer is 5,000-100,000, more preferably 10,000-20,000. If the molecular weight is less than 5,000 to form the nanoparticles are difficult to agglomerate of the molecules themselves, the yield is reduced and there is a problem that the polysaccharide is fixed in the particles unstable.
본 발명에서 제1수화젤은 생체적합성 고분자로 형성되어 있다. 본 발명의 수화젤 복합체 및 단백질 약물 전달시스템에서 제1수화젤은 헤파린과 같은 다당류 를 생분해성 나노입자에 고정시켜 주며, 또한 단백질 약물이 안정된 상태로 충진되어 유지되도록 하는 역할을 한다.In the present invention, the first hydrogel is formed of a biocompatible polymer. In the hydrogel complex and protein drug delivery system of the present invention, the first hydrogel fixes polysaccharides such as heparin to biodegradable nanoparticles, and also serves to keep the protein drug in a stable state.
본 명세서에서 용어 "생체적합성 고분자"는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 가지고 있는 고분자를 의미한다. 본 명세서 용어 "생체적합성 고분자 유화제(emulsifier)"란 상술한 생체적합성을 가지면서, 분리된 2개 이상의 상을 혼화시키는 유화성을 함께 지닌 고분자를 의미한다.As used herein, the term "biocompatible polymer" refers to a polymer having tissue compatibility and blood compatibility that does not necrotic tissue or coagulate blood in contact with living tissue or blood. As used herein, the term "biocompatible polymer emulsifier" refers to a polymer having the above-described biocompatibility and having an emulsification property that blends two or more separated phases together.
본 발명에서 사용가능한 생체적합성 고분자 유화제는 상술한 특성을 가지는 고분자이면 어떠한 것도 가능하며, 폴락사머, 폴락사민, 폴리(비닐 알코올), 알킬 알코올의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 및 플루론을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 생체적합성 고분자 유화제는 수중유형(o/w 형)의 유제를 형성시키는 것이며, 보다 바람직하게는, 폴락사머 또는 폴락사민이며, 가장 바람직하게는 생체 내 독성이 없는 것으로 미국 FDA가 승인한 폴락사머이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자 유화제의 중량평균분자량은 5,000-100,000, 보다 바람직하게는 10,000-20,000이다. The biocompatible polymer emulsifiers usable in the present invention may be any polymer having the above-mentioned properties, and may include poloxamer, poloxamine, poly (vinyl alcohol), polyethylene glycol ethers of alkyl alcohols, sorbitan esters, polysorbates and flu. Including but not limited to loans. Preferably the biocompatible polymer emulsifier forms an oil-in-water (o / w type) emulsion, more preferably poloxamer or poloxamine, most preferably non-toxic in vivo and approved by the US FDA. One is poloxamer. According to a preferred embodiment of the present invention, the weight average molecular weight of the biocompatible polymer emulsifier is 5,000-100,000, more preferably 10,000-20,000.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 생체적합성 고분자 유화제를 이용하는 경우, 유화제 분자에 있는 친수성기 및 소수성기에 의해 결정되는 친수성-친유성 균형(HLB)이 본 발명의 목적에 적합하도록 고분자 유화제를 선택한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 적합한 생체적합성 고분자 유화제를 선택할 때 친수성 부분이 전체 분자 구조에서 60-80%가 되는 것을 선택한다. 상기 범위를 벗어나는 경우 나노입자의 불안정한 분산으로 인한 수득율 감소 및 기능성 다당류의 고정화가 어려운 문제점이 발생할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, in the case of using the biocompatible polymer emulsifier in the present invention, the polymer emulsifier is prepared so that the hydrophilic-lipophilic balance (HLB) determined by the hydrophilic group and the hydrophobic group in the emulsifier molecule is suitable for the purpose of the present invention. Choose. More preferably, when selecting a biocompatible polymeric emulsifier suitable for the present invention, the hydrophilic portion is chosen such that it is 60-80% of the total molecular structure. If the range is out of the above range, the yield may be reduced due to unstable dispersion of the nanoparticles, and it may be difficult to fix the functional polysaccharide.
본 발명의 나노입자에 포함되는 다당류는, VEGF, FGF 및/또는 PDGF, 이의 단편(fragments) 또는 펩타이드와 특이적으로 상호작용을 하며, 이를 통해 상기 단백질의 3차원 구조를 유지하고 생물학적 활성(즉, 혈관신생 촉진 활성)을 증가시키며 가수분해를 저해하여 단백질을 안정화시키는 역할을 한다.The polysaccharides included in the nanoparticles of the present invention specifically interact with VEGF, FGF and / or PDGF, fragments or peptides thereof, thereby maintaining the three-dimensional structure of the protein and biologically active (ie , Angiogenesis promoting activity) increases and inhibits hydrolysis to stabilize the protein.
본 발명에서 이용될 수 있는 다당류 분자는 상술한 작용을 할 수 있는 어떠한 다당류도 가능하며, 헤파린, 알지네이트, 히아루론산, 키토산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 5-설페이트(dermatan 5-sulfate), 케라탄 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 다당류 분자는 헤파린, 알지네이트, 히아루론산 및 키토산이며, 보다 바람직하게는 생체 내 독성이 없는 것으로 미국 FDA가 승인한 음이온성 다당류인 헤파린이고, 가장 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시되는 헤파린이다.The polysaccharide molecule that can be used in the present invention may be any polysaccharide capable of the above-mentioned functions, heparin, alginate, hyaluronic acid, chitosan, chondroitin sulfate, dermatan 5-sulfate, keratan sulfate, Dextran, including but not limited to dextran sulfate and combinations thereof. Preferably, the polysaccharide molecule is heparin, alginate, hyaluronic acid and chitosan, more preferably heparin, an anionic polysaccharide approved by the US FDA as non-toxic in vivo, most preferably heparin represented by the following formula (2) to be.
본 발명에 이용되는 다당류의 분자량은, 수화젤 복합체 내에서 코어 및 수화젤막과 충분한 물리/정전기적 결합력을 얻고 또한 제조된 나노입자의 안정성 측면을 고려하여, 바람직하게는 3,000-100,000이고, 보다 바람직하게는 8,000-15,000이 다. 다당류는 나노입자 1 mg 당 2-100 ㎍이 포함되는 것이 바람직한데, 상기 범위를 벗어나는 경우에 각각 단분산성의 나노입자 수득이 어려운 문제점 및 나노입자의 서방출 효과가 감소하는 문제점이 발생할 수 있다. The molecular weight of the polysaccharide used in the present invention is preferably 3,000-100,000, more preferably in view of stability of the nanoparticles obtained in order to obtain sufficient physical / electrostatic bonding strength with the core and the hydrogel film in the hydrogel composite. For example, 8,000-15,000. It is preferable that the polysaccharide contains 2-100 μg per 1 mg of nanoparticles. If the polysaccharide is out of the above range, it may be difficult to obtain monodisperse nanoparticles, respectively, and a problem of decreasing the sustained release effect of the nanoparticles.
본 발명의 나노입자는 바람직하게는, 평균 지름이 1-400 nm의 입자, 보다 바람직하게는 10-300 nm의 입자, 가장 바람직하게는 50-200 nm의 입자이다.The nanoparticles of the invention are preferably particles having an average diameter of 1-400 nm, more preferably particles of 10-300 nm, most preferably particles of 50-200 nm.
본 발명의 나노입자의 표면전하(대부분 다당류에 의해 결정된다)는 충진되는 대상 단백질에 따라 결정되며, 효과적인 충진을 고려하여 +20 mV 이상인 것과 -40 mV 이하인 것이 바람직하다. 본 발명의 나노입자가 음전하를 가지는 다당류, 예컨대 헤파린으로 기능화되는 경우, 본 발명의 나노입자의 표면전하는 바람직하게는, -30 mV ~ -70 mV, 보다 바람직하게는 -40 mV ~ -60 mV, 가장 바람직하게는 -40 mV ~ -50 mV이다. 나노입자의 표면전하는 수화젤 막 내 단백질의 효과적인 충진을 고려하여 -40 mV 이하인 것이 유리하다.The surface charge (mostly determined by polysaccharides) of the nanoparticles of the present invention is determined by the target protein to be filled, and is preferably +20 mV or less and -40 mV or less in consideration of effective filling. When the nanoparticles of the present invention are functionalized with negatively charged polysaccharides such as heparin, the surface charge of the nanoparticles of the present invention is preferably -30 mV to -70 mV, more preferably -40 mV to -60 mV, Most preferably, it is -40 mV--50 mV. The surface charge of the nanoparticles is advantageously -40 mV or less in view of the effective filling of the protein in the hydrogel film.
또한 나노입자의 다분산(polydispersity) 지수는 0.1 이하인 것이 유리하며, 이는 일반적으로 다분산 지수가 0.1 이하인 경우 안정적인 단분산 분포를 갖는 나노입자로 간주하기 때문이다. 나노입자의 바람직한 다분산 지수는 0.01-0.1 이다. In addition, the polydispersity index of the nanoparticles is advantageously 0.1 or less, since it is generally regarded as a nanoparticle having a stable monodispersion distribution when the polydispersity index is 0.1 or less. The preferred polydispersity index of the nanoparticles is 0.01-0.1.
본 발명의 수화젤에 포함되어 있는 나노입자는 다당류-기능화 나노입자이다. 본 명세서에서 용어 "다당류-기능화 나노입자"는 다당류를 통해서 단백질과 특이적으로 비공유결합을 할 수 있는 기능성이 부여된 나노입자를 의미한다.Nanoparticles contained in the hydrogel of the present invention are polysaccharide-functionalized nanoparticles. As used herein, the term "polysaccharide-functionalized nanoparticles" refers to nanoparticles endowed with functionality capable of specifically non-covalently binding to proteins via polysaccharides.
본 발명에서 제2수화젤은 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자로 형성되 어 있다. 제2수화젤은 표면에 수화젤층을 포함하는 상기 나노입자들을 함유하는 담체(또는 매트릭스)의 역할뿐만 아니라, 초기 결손 공간을 채우고 본 발명의 VEGF를 함유하는 수화젤 복합체가 투여된 위치의 주위에서 수화젤 복합체 안쪽으로 신생혈관 등이 생장하여 들어 올 수 있도록 하는 역할을 한다. 또한, 본 발명의 수화젤 복합체 내에 충진된 단백질 약물은 1차적으로 나노입자에 결합된 다당류와 결합을 형성하여 안정화되고, 나아가서 제2수화젤 내에서 부가적으로 안정화 된다. 제2수화젤 내에는 상기 나노입자뿐만 아니라, 다른 생리활성물질들이 포함될 수 있다.In the present invention, the second hydrogel is formed of a biocompatible polymer having cell adhesion. The second hydrogel not only serves as a carrier (or matrix) containing the nanoparticles including a hydrogel layer on the surface, but also fills the initial defect space and around the site where the hydrogel complex containing the VEGF of the present invention is administered. It acts to allow new blood vessels to grow into the hydrogel complex. In addition, the protein drug filled in the hydrogel complex of the present invention is primarily stabilized by forming a bond with the polysaccharide bonded to the nanoparticles, and further stabilized in the second hydrogel. In addition to the nanoparticles, the second hydrogel may contain other bioactive materials.
본 명세서에서 용어 "세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자"는 상술한 생체적합성 고분자의 특성을 가지면서도 인 비보(in vivo) 또는 엑스 비보(ex vivo)에서 세포에 대한 부착능력이 있는 고분자를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자는 상술한 특성을 가지는 고분자이면 어떠한 것도 가능하며, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠) 및 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트)와 같은 합성고분자; 그리고 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 및 알지네이트와 같은 천연고분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 또는 알지네이트이며, 보다 바람직하게는 펩타이드 고분자인 콜라겐, 젤라틴 및 피브린이고, 가장 바람직하게는 피브린이다. 피브린은 분자 내에 세포 결합자리와 당아미노글라이칸 결합자리가 공존하며, 수화젤 제조가 용이하고 조직접합 및 국소지혈제로서 임상적 적용이 일반화되어 있다.As used herein, the term "biocompatible polymer having cell adhesion" refers to a polymer having the properties of the above-described biocompatible polymer and having the ability to adhere to cells in vivo or ex vivo . . Biocompatible polymer having a cell adhesion ability that can be used in the present invention can be any polymer having the above-described characteristics, poly (ethylene glycol), poloxamer, poly (organophosphazene) and oligo (poly (ethylene Synthetic polymers such as glycol) fumarate); And natural polymers such as, but not limited to, collagen, gelatin, fibrin, hyaluronic acid and alginate. Preferably, the biocompatible polymer having cell adhesion is collagen, gelatin, fibrin, hyaluronic acid or alginate, more preferably collagen which is a peptide polymer, gelatin and fibrin, most preferably fibrin. Fibrin coexists with a cell binding site and a sugar aminoglycan binding site in a molecule, and is easy to manufacture hydrogel, and its clinical application is widely used as a tissue bonding and hemostatic agent.
제2수화젤의 탄성강도는 이용되는 생체적합성 고분자 및 이 고분자에 대한 가교인자의 종류와 사용량에 결정될 수 있다. 본 발명의 수화젤 복합체가 생체 내에 적용되는 경우, 이식된 위치의 주위 세포가 제2수화젤에 결합하여 증식 및 분화를 할 수 있다. 이러한 주위 세포의 생존, 증식 및 분화를 고려하면, 제2수화젤의 탄성강도는 1,000-10,000 Pa이다. The elastic strength of the second hydrogel may be determined by the type and amount of biocompatible polymer used and the crosslinking factor for the polymer. When the hydrogel complex of the present invention is applied in vivo, the cells surrounding the transplanted position may bind to the second hydrogel to proliferate and differentiate. Considering the survival, proliferation and differentiation of the surrounding cells, the elastic strength of the second hydrogel is 1,000-10,000 Pa.
본 발명의 단백질 약물전달 시스템에서 운반되는, VEGF, FGF 및/또는 PDGF는 본 발명의 시스템에서 다당류에 특이적으로 비공유결합 되어 운반될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "비공유결합"은 공유결합, 이온결합 및 배위결합을 제외한 물리/화학적 결합을 나타내기 위하여 사용된다. 예컨대, 용어 "비공유결합"은 흡착(adsorption), 응집(cohesion), 사슬엉킴(entanglement) 및 잡힘(entrapment) 등과 같은 물리적 결합뿐만 아니라, 수소결합 및 반데르발스결합과 같은 상호작용이 단독으로 또는 상기 물리적 결합과 함께 작용하여 발생되는 결합을 포함하는 개념이다.VEGF, FGF, and / or PDGF, which are delivered in the protein drug delivery system of the present invention, can be delivered specifically non-covalently to the polysaccharide in the system of the present invention. The term "non-covalent bond" is used herein to denote physical / chemical bonds except covalent, ionic and coordinative bonds. For example, the term “non-covalent bond” refers to the interactions such as hydrogen bonds and van der Waals bonds alone or in addition to physical bonds such as adsorption, cohesion, entanglement and entrapment, or the like. The concept includes a bond generated by working together with the physical bond.
VEGF, FGF 및/또는 PDGF는 다당류, 특히 헤파린 결합 도메인을 가지고 있기 때문에, 이들 단백질과 다당류 사이의 결합은 특이적 결합이라 할 수 있다.Since VEGF, FGF and / or PDGF have polysaccharides, especially heparin binding domains, the binding between these proteins and polysaccharides can be called specific binding.
방출경향 및 약물의 국소적 유효량을 고려하여, 상기 나노입자 1 mg 당 0.01-5 μg의 단백질 약물이 포함되는 것이 바람직하다.Considering the release trend and the topically effective amount of the drug, it is preferred to include 0.01-5 μg of protein drug per mg of the nanoparticle.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 서방형 국소 약물전달 시스템을 포함하는 혈관의 폐쇄와 연관된 질환 또는 허혈성 질환의 치료 용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of a disease or ischemic disease associated with occlusion of blood vessels comprising the sustained release topical drug delivery system of the present invention. The pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여하는 것이 바람직하고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 국소 투여 (topical administration 또는 local site에 직접 주입 또는 이식 포함) 등으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 국소 투여된다.The pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, topical administration or direct injection or implantation into a local site. And the like, most preferably topically.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 질환의 종류, 단백질 약물의 종류, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 ㎎/㎏(체중)이다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention include the type of disease, type of protein drug, method of formulation, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response of the patient. It can be prescribed in various ways by factors such as On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-100 mg / kg body weight per day.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 수화젤 복합체의 제조방법 및 통상적인 방법에, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 형태로 제조될 수 있다. The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form or in multi-dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient in the methods and methods for preparing the hydrogel complex described herein. Can be.
본 발명의 약제학적 조성물은, 혈관(예컨대, 동맥, 정맥 또는 모세혈관)의 폐쇄(obstruction)과 연관된 질환 또는 허혈성 질환의 치료에 이용될 수 있으며, 상기 질환은 관상폐색질환, 경동맥폐색질환, 동맥폐색질환, 말초동맥질환, 아테롬성동맥경화증, 폐색성 혈전맥관염, 혈전성 질환 및 맥관염을 포함하나 이에 한정되 는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방될 수 있는 질환 또는 상태는 심장마비(심근경색) 또는 다른 혈관 사멸, 발작 및 혈류 감소와 연관된 림(limbs)의 사멸 또는 손실을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 상처 또는 궤양의 치료 촉진, 피부이식물 또는 재결합된 림의 혈관신생 촉진, 문합수술의 치료 촉진, 또는 피부 또는 모발의 성장 촉진에도 이용될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention can be used for the treatment of diseases associated with obstruction of blood vessels (eg arteries, veins or capillaries) or ischemic diseases, which are coronary obstruction diseases, carotid occlusive diseases, arteries. Occlusion disease, peripheral arterial disease, atherosclerosis, obstructive thrombovascular disease, thrombotic disease and vasculitis. Diseases or conditions that can be prevented by the pharmaceutical compositions of the invention include, but are not limited to, death or loss of limbs associated with heart attack (myocardial infarction) or other blood vessel death, seizures, and decreased blood flow. . In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention may be used to promote the treatment of wounds or ulcers, to promote angiogenesis of skin grafts or recombined rims, to promote the treatment of anastomotic surgery, or to promote the growth of skin or hair.
단백질 약물 치료는 다양한 질환, 특히 치료적 혈관신생에 의한 허혈성 질환의 치료 전략의 하나로서 많은 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 치료학적 효과를 나타내기 위해서는 고순도의 단백질 약물을 다량 사용해야 하므로 막대한 비용이 소요되는 문제점이 있었다. 본 발명의 단백질 약물전달 시스템 및 약제학적 조성물은 이러한 종래의 기술적 문제점 및 한계를 극복하는 것으로서, 단백질 약물의 서방출 및 안정화를 크게 개선시켜 종래의 단백질 약물 치료의 한계를 극복하고 있다. 허혈성 질환에 대해서는 줄기세포를 이용한 치료방법들도 많이 제시되고 있는데, 본 발명의 단백질 운반시스템 또는 약제학적 조성물을 이러한 치료용 줄기세포와 병행하여 이용하거나, 본 발명의 수화젤 복합체 내에 줄기세포를 포함시켜 이용하면 허혈성 질환의 치료를 극대화시킬 수 있을 것으로 기대된다.Protein drug therapy has been studied as one of the treatment strategies for various diseases, especially ischemic diseases by therapeutic angiogenesis. However, in order to exhibit a therapeutic effect, a large amount of high-purity protein drugs have to be used, resulting in enormous costs. The protein drug delivery system and pharmaceutical composition of the present invention overcome these conventional technical problems and limitations, and greatly improve the slow release and stabilization of protein drugs to overcome the limitations of conventional protein drug treatment. There are also many treatment methods using stem cells for ischemic disease, using the protein delivery system or pharmaceutical composition of the present invention in parallel with such therapeutic stem cells, or including the stem cells in the hydrogel complex of the present invention. If used, it is expected to maximize the treatment of ischemic disease.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템의 제조방법을 제공한다: According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing a sustained release topical drug delivery system for angiogenesis-promoting protein drug comprising the following steps:
(a) 다음의 소단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계: (a-1) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해하여 생분해성 고분자 용액을 수득하는 단계, (a-2) 다당류 분자 및 생체적합성 고분자 유화제를 친수성 용매에 용해하여 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 혼합용액을 수득하는 단계, 및 (a-3) 상기 생분해성 고분자 용액을 상기 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 혼합용액의 첨가 및 분산시켜, 생분해성 고분자가 코어에 존재하고 상기 코어 상에 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤이 형성되어 있으며, 그리고 상기 코어 및 제1수화젤에 다당류 분자가 비공유결합된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계; (a) preparing a polysaccharide-functionalized nanoparticle comprising the following substeps: (a-1) dissolving the biodegradable polymer in an organic solvent to obtain a biodegradable polymer solution, (a-2) a polysaccharide molecule and Dissolving the biocompatible polymer emulsifier in a hydrophilic solvent to obtain a mixed solution of the polysaccharide and the biocompatible polymer emulsifier, and (a-3) adding and dispersing the biodegradable polymer solution into the mixed solution of the polysaccharide and the biocompatible polymer emulsifier. A biodegradable polymer is present in the core, a first hydrogel comprising a biocompatible polymer is formed on the core, and a polysaccharide-functionalized nanoparticle in which polysaccharide molecules are noncovalently bonded to the core and the first hydrogel is prepared. Making;
(b) 상기 단계 (a)에서 형성된 나노입자를 회수하는 단계; (c) 상기 회수된 나노입자를 분산매에 재분산시키는 단계; (d) 상기 재분산된 나노입자 분산액 및 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합의 용액을 혼합하여 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합을 상기 나노입자에 충진시키는 단계로서, 상기 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합은 나노입자에 있는 다당류 분자에 특이적으로 비공유결합되고; (e) 상기 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합이 충진된 나노입자 분산액을 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자 용액에 분산시키는 단계; 그리고, (f) 상기 단계 (e)의 결과물에 가교제, 가교활성제 및 물리적 가교인자로 구성된 군으로 선택되는 가교인자를 제공하여 상기 생체적합성 고분자를 가교시켜 제2수화젤을 형성시키는 단계.(b) recovering the nanoparticles formed in step (a); (c) redispersing the recovered nanoparticles in a dispersion medium; (d) mixing the redispersed nanoparticle dispersion and a solution of VEGF, FGF, PDGF or a combination thereof to fill VEGF, FGF, PDGF or a combination thereof in the nanoparticle, wherein the VEGF, FGF, PDGF or The combination is specifically noncovalently bound to the polysaccharide molecule in the nanoparticle; (e) dispersing the nanoparticle dispersion filled with the VEGF, FGF, PDGF or a combination thereof in a biocompatible polymer solution having cell adhesion ability; And (f) providing a crosslinking factor selected from the group consisting of a crosslinking agent, a crosslinking activator and a physical crosslinking factor to the resultant of the step (e) to crosslink the biocompatible polymer to form a second hydrogel.
본 발명의 제조방법은 상술한 본 발명의 서방형 국소 약물전달 시스템을 제조하기 위한 것이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다. 예를 들어, 코어를 형성하는 생분해성 고분 자, 제1수화젤, 다당류 분자, 제2수화젤 및 단백질 약물에 대한 설명은 상기 두 발명 사이에 공통적이다.Since the preparation method of the present invention is for producing the sustained-release topical drug delivery system of the present invention described above, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification. For example, descriptions of biodegradable polymers, first hydrogels, polysaccharide molecules, second hydrogels, and protein drugs that form the core are common between the two inventions.
단계 (a)는 수화젤 복합체에서 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계이다. 우선, 생분해성 고분자(예컨대, PLGA)를 유기용매에 용해하여 생분해성 고분자 용액을 얻는다. 상기 유기용매는 "저농도에서 세포독성이 없는 유기용매"가 바람직하며, 보다 바람직하게는 디메틸술폭사이드, 테트라글리콜, 에틸 락테이트 또는 에탄올이며, 보다 더 바람직하게는 10 %(w/w) 이하의 농도에서 세포독성이 없다고 보고된 디메틸술폭사이드 또는 테트라글리콜이며, 가장 바람직하게는 디메틸술폭사이드이다. 생분해성 고분자 용액을 준비하는 경우 생분해성 고분자의 사용량은, 나노입자 제조단계 시 생분해성 고분자의 응집으로 인한 손실을 최소화하는 측면에서 0.5-2.0 %(w/v)인 것이 바람직하다.Step (a) is a step of preparing the polysaccharide-functionalized nanoparticles in the hydrogel complex. First, a biodegradable polymer (eg PLGA) is dissolved in an organic solvent to obtain a biodegradable polymer solution. The organic solvent is preferably "an organic solvent having no cytotoxicity at low concentration", more preferably dimethyl sulfoxide, tetraglycol, ethyl lactate or ethanol, even more preferably 10% (w / w) or less Dimethyl sulfoxide or tetraglycol reported to be non-cytotoxic at concentration, most preferably dimethyl sulfoxide. When preparing a biodegradable polymer solution, the amount of the biodegradable polymer is preferably 0.5-2.0% (w / v) in terms of minimizing the loss due to aggregation of the biodegradable polymer during the nanoparticle manufacturing step.
다당류 분자 및 생체적합성 고분자 유화제를 친수성 용매[예를 들어, 물 또는 완충액, 바람직하게는 물)에 용해하여 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 혼합용액을 얻는다. 상기 (a-2) 단계에서, 생분해성 고분자의 입자 외부에 형성되는 수화젤막의 두께, 효율적인 입자형성을 위한 수용액의 점도를 고려하여 생체적합성 고분자 유화제의 농도가 0.01-5 %(w/v)인 것이 바람직하다. 생분해성 고분자가 용해되어 있는 유기용매는 이후에 다당류가 첨가된 생체적합성 고분자 유화제가 용해된 수용액에 분산되어 다당류-기능화 나노입자를 형성시키는데, 생체적합성 고분자 유화제가 용해된 수용액에 첨가되는 다당류의 양은 나노입자의 다분산 지수(polydispersity)와 수득율을 고려하여 수용액 상의 생체적합성 고분자 유화제 질량 대비 10% 이하를 유지하는 것이 바람직하다.The polysaccharide molecule and the biocompatible polymer emulsifier are dissolved in a hydrophilic solvent (eg water or buffer, preferably water) to obtain a mixed solution of the polysaccharide and the biocompatible polymer emulsifier. In the step (a-2), the concentration of the biocompatible polymer emulsifier is 0.01-5% (w / v) in consideration of the thickness of the hydrogel film formed outside the particles of the biodegradable polymer and the viscosity of the aqueous solution for efficient particle formation. Is preferably. The organic solvent in which the biodegradable polymer is dissolved is then dispersed in an aqueous solution in which the biocompatible polymer emulsifier containing polysaccharide is dissolved to form polysaccharide-functionalized nanoparticles. The amount of polysaccharide added to the aqueous solution in which the biocompatible polymer emulsifier is dissolved is In consideration of the polydispersity and yield of the nanoparticles, it is desirable to maintain 10% or less of the biocompatible polymer emulsifier mass in the aqueous solution.
상기 생분해성 고분자 유기용액을 상기 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 수용액에 첨가 및 분산시켜, 생분해성 고분자가 코어에 존재하고 상기 코어 상에 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤이 형성되어 있으며, 그리고 상기 코어 및 제1수화젤에 다당류 분자가 비공유결합된 다당류-기능화 나노입자를 제조한다. 이 과정에서 생분해성 고분자 유기용액 및 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 수용액의 함량비율은 특별한 한정이 요구 되지 않지만, 나노입자 내 유기용매의 잔류와 이로 인한 세포독성을 고려하여, 유기용액의 부피를 혼합용액 부피 대비 10% 이하로 하는 것이 바람직하다.The biodegradable polymer organic solution is added to and dispersed in the aqueous solution of the polysaccharide and the biocompatible polymer emulsifier, so that the biodegradable polymer is present in the core, and the first hydrogel made of the biocompatible polymer is formed on the core. A polysaccharide-functionalized nanoparticle having a polysaccharide molecule covalently bonded to the core and the first hydrogel is prepared. In this process, the content ratio of the biodegradable polymer organic solution and the aqueous solution of the polysaccharide and the biocompatible polymer emulsifier is not particularly limited, but the volume of the organic solution is mixed in consideration of the residual of the organic solvent in the nanoparticles and the resulting cytotoxicity. Preferably, the solution volume is 10% or less.
본 발명에서 물은 특별한 독성 등을 나타내지 않는 생체 내 적합성을 보이는 것이라면 모두 사용가능하며, 증류수 등에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에서 유기용액을 수용액에 첨가하여 분산시키는 방법은 통상적으로 사용되는 분산방법이 모두 사용 가능하다.In the present invention, water can be used as long as it shows compatibility in vivo without exhibiting special toxicity, and the like, and is not limited to distilled water. In addition, in the present invention, the method of dispersing the organic solution by adding it to an aqueous solution may be used as a dispersion method that is commonly used.
상기 과정을 통해 생성된 다당류-기능화 나노입자를 회수(예컨대, 원심분리에 의해)하고 회수된 나노입자를 적합한 분산매에 재분산시킨다. 상기 적합합 분산매는 PBS(phosphate-buffered saline), PB(phosphate buffer), 물(탈이온수 또는 증류수), 트리스(Tris) 및 헤페스(Hepes) 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 적합합 분산매는 PBS, PB, 탈이온수 또는 증류수이며, 가장 바람직하게는 PBS이다.The polysaccharide-functionalized nanoparticles produced through this procedure are recovered (eg, by centrifugation) and the recovered nanoparticles are redispersed in a suitable dispersion medium. The suitable dispersion medium includes, but is not limited to, phosphate-buffered saline (PBS), phosphate buffer (PB), water (deionized or distilled water), Tris and Hepes buffers. Preferably, the suitable dispersion medium is PBS, PB, deionized water or distilled water, most preferably PBS.
이어, 상기 재분산된 나노입자 분산액 및 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합을 혼합하여 단백질 약물을 상기 나노입자에 충진시킨다. 이 경우, 상기 단백질 약물은 나노입자에 있는 다당류 분자에 비공유적으로 결합 된다. 이용되는 단백질 약물 용액에서 용매는 단백질 입체구조의 안정성 측면을 고려하여 완충력이 있는 PBS, PB, 트리스 또는 헤페스 완충액이 바람직하며, 가장 바람직하게는 PBS이다. 상기 다당류-기능화 나노입자 재분산액은 최종 수화젤 복합체의 부피 및 강도를 고려하여 농도가 25 %(w/v) 이상인 것이 바람직하고, 상기 단백질 용액에서 단백질의 농도는 최종 수화젤 복합체의 부피 및 강도를 고려하여 0.01-0.5 %(w/v)로 하는 것이 바람직하다.The redispersed nanoparticle dispersion and VEGF, FGF, PDGF or a combination thereof are then mixed to fill the protein drug with the nanoparticles. In this case, the protein drug is noncovalently bound to the polysaccharide molecule in the nanoparticle. In the protein drug solution used, the solvent is preferably PBS, PB, Tris, or Hepes buffers, most preferably PBS, considering the stability of the protein conformation. The polysaccharide-functionalized nanoparticle redispersion has a concentration of 25% (w / v) or more in consideration of the volume and strength of the final hydrogel complex, and the protein concentration in the protein solution is the volume and strength of the final hydrogel complex In consideration of this, it is preferable to set it as 0.01-0.5% (w / v).
그런 다음, 상기 단백질 약물이 충진된 나노입자 분산액을 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자 용액에 분산시키고, 가교제, 가교활성제 및 물리적 가교인자로 구성된 군으로 선택되는 가교인자를 첨가하여 상기 생체적합성 고분자를 가교시켜 제2수화젤을 형성시켜, 최종적으로 단백질이 충진된 수화젤 복합체를 제조한다.Then, the nanoparticle dispersion filled with the protein drug is dispersed in a biocompatible polymer solution having cell adhesion, and the biocompatible polymer is added by adding a crosslinking factor selected from the group consisting of a crosslinking agent, a crosslinking agent and a physical crosslinking factor. By crosslinking to form a second hydrogel, finally a protein-filled hydrogel complex is prepared.
가교제, 가교활성제 및/또는 물리적 가교인자는 생체적합성 고분자를 가교(cross-linking)시켜, 적합한 탄성강도(elastic modulus, G')를 가지는 제2수화젤을 제공한다. 제2수화젤의 탄성강도는 세포부착성을 가지는 생체적합성 고분자 용액 및 가교인자의 사용량에 의해 결정될 수 있으며, 1,000-10,000 Pa이다.The crosslinking agent, crosslinking agent and / or physical crosslinking agent cross-links the biocompatible polymer to provide a second hydrogel having a suitable elastic modulus (G ′). The elastic strength of the second hydrogel may be determined by the amount of the biocompatible polymer solution and crosslinking factor having cell adhesion, and may be 1,000-10,000 Pa.
가교제, 가교활성제 및/또는 물리적 가교인자는 사용되는 세포부착성을 가지는 생체적합성 고분자의 종류에 따라 다양하다. 예를 들어, 생체적합성 고분자로 피브리노겐이 이용되는 경우, 트롬빈을 가교활성제로 이용할 수 있으며, 트롬빈에 의해 피브리노겐이 가교되어 피브린으로 이루어진 제2수화젤을 형성하게 된다. 상기 물리적 가교인자는 예컨대, 온도, pH 및 분자간 특이적 상호작용(specific interaction)을 포함한다. Crosslinking agents, crosslinking agents and / or physical crosslinking factors vary depending on the type of biocompatible polymer having the cell adhesion used. For example, when fibrinogen is used as a biocompatible polymer, thrombin may be used as a crosslinking activator, and fibrinogen is crosslinked by thrombin to form a second hydrogel made of fibrin. Such physical crosslinking factors include, for example, temperature, pH and specific intermolecular specific interactions.
생체적합성 고분자로 피브리노겐이 이용되는 경우, 제2수화젤을 형성시키기 위한 용액에는 세린 프로테아제 억제제의 일종인 아프로티닌(aprotinin)을 항피브린분해제(antifibrinolytic agent)로서 추가적으로 포함시키는 것이 바람직하다. 또한, 제2수화젤을 형성시키기 위한 반응용액에는 혈액항고인자인 FXⅢ을 추가적으로 포함시키는 것이 바람직한데, 이 혈액항고인자는 가교결합 되어 형성된 피브린의 강도를 높이는 작용을 한다.When fibrinogen is used as a biocompatible polymer, it is preferable to further include aprotinin, a kind of a serine protease inhibitor, as an antifibrinolytic agent in the solution for forming the second hydrogel. In addition, it is preferable to further include FXIII, a blood anticoagulant, in the reaction solution for forming the second hydrogel. The blood anticoagulant functions to increase the strength of the fibrin formed by crosslinking.
상술한 본 발명의 서방형 단백질 약물전달 시스템의 제조방법에 있어서, (ⅰ) 단계 (a-2)에서 다당류 분자의 농도를 변화시키거나, 또는 단계 (a-3)에서 상기 유기용액 및 수용액의 혼합비율을 변화시킴으로써, 상기 나노입자 단위질량 당 다당류의 함량을 변화시키는 방법; (ⅱ) 상기 단계 (e)의 제2수화젤 제조용 생체적합성 고분자 용액에서, 다당류-기능화 나노입자 및 제2수화젤 제조용 생체적합성 고분자의 농도비를 변화시킴으로써 수화젤 복합체 단위질량 당 나노입자의 함량을 변화시키는 방법; 또는 상기 (ⅰ) 방법 및 (ⅱ) 방법을 병용하여 수행함으로써 단백질 약물의 방출속도를 조절할 수 있다.In the above-described method for preparing a sustained release protein drug delivery system of the present invention, (i) changing the concentration of the polysaccharide molecule in step (a-2), or in step (a-3) of the organic solution and aqueous solution Changing the content ratio of polysaccharides per unit mass of the nanoparticles; (Ii) In the biocompatible polymer solution for preparing the second hydrogel of step (e), the content of the nanoparticles per unit mass of the hydrogel composite is changed by changing the concentration ratio of the polysaccharide-functionalized nanoparticle and the biocompatible polymer for preparing the second hydrogel. How to change; Alternatively, the release rate of the protein drug can be controlled by performing the combination of the above (iv) and (ii) methods.
본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:In summary, the features and advantages of the present invention are as follows:
(ⅰ) 다당류로 기능화된 나노입자를 포함하며 두 종의 수화젤층으로 이루어 진 본 발명의 수화젤 복합체는 운반하는 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합의 초기 방출을 감소시키고 국소적 서방출 효과를 크게 개선한다.(Iii) The hydrogel complex of the present invention, which comprises nanoparticles functionalized with polysaccharides and consists of two hydrogel layers, reduces the initial release of VEGF, FGF, PDGF or a combination thereof and greatly enhances the local sustained release effect. Improve.
(ⅱ) 본 발명의 수화젤 복합체는 운반하는 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합의 안정성을 크게 개선한다.(Ii) The hydrogel complex of the present invention greatly improves the stability of VEGF, FGF, PDGF or a combination thereof that carries.
(ⅲ) 물질의 성질이 변화되는 화학적인 공정 없이 비교적 간단한 공정에 의해 제조될 수 있다.(Iii) It can be produced by a relatively simple process without a chemical process in which the properties of the material are changed.
(ⅳ) 물질의 성질이 변화되는 화학적인 공정 없이 생체적합성이 우수한 물질을 이용하여 제조되기 때문에, 본 발명의 단백질 약물 운반시스템은 생체 적합성이 매우 우수하다.(Iii) Since the protein drug delivery system of the present invention is manufactured using a material having excellent biocompatibility without a chemical process in which the properties of the material are changed, the protein drug delivery system of the present invention is very excellent in biocompatibility.
(ⅴ) 본 발명의 단백질 약물 운반시스템은 FDA에서 임상 사용이 허가된 물질로만 구성될 수 있어, 의약의 상업화에 소요되는 시간 및 비용을 크게 격감시킬 수 있다.(Iii) The protein drug delivery system of the present invention can be composed only of substances approved for clinical use by the FDA, which can greatly reduce the time and cost required for commercialization of the drug.
(ⅴ) 본 발명의 수화젤에 포함되는 나노입자의 평균 지름을 400 nm 이하로 유지하는 경우에는 간단한 필터 과정만으로 멸균 처리가 가능하다.(Iii) In the case where the average diameter of the nanoparticles contained in the hydrogel of the present invention is maintained at 400 nm or less, sterilization is possible by a simple filter process.
(ⅵ) 줄기세포 치료법과 병행하여 이용하면 허혈성 질환의 치료를 극대화시킬 수 있다.(Iv) can be used in combination with stem cell therapy to maximize the treatment of ischemic diseases.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통 상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
실시예Example
실시예 1: 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 피브린 수화젤 복합체의 제조Example 1 Preparation of Fibrin Hydrogel Complex Comprising Nanoparticles Functionalized with Heparin
헤파린(Celsus Laboratories (Cincinnati, OH, USA))이 각각 30 mg 및 120 mg 포함된 폴락사머 수용액(BASF Corp.(Seoul, Korea)) 30 ml에 PLGA(Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Germany)) 40 mg가 용해된 디메틸술폭사이드 2 ml을 천천히 첨가하여 나노입자를 제조하였다. 나노입자 용액에 존재하는 과량의 헤파린, 폴락사머 및 디메틸술폭사이드를 고속 원심분리 후 상층액을 분리하는 방식으로 제거시켰다. PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) 40 ㎕를 이용하여 회수된 나노입자를 재분산시킨 후, PBS에 용해되어 있는 모델 단백질(라이소자임, Sigma (St. Louis, MO, USA) 및 BMP-2, PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)) 또는 대상 단백질(VEGF, PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA))을 충진하였다. 상기 단백질 약물이 충진된 나노입자 분산액 62.5 ㎕를 피브리노겐 용액(Greencross (Yongin, Korea)) 200 ㎕와 균일하게 혼합한 후 가교활성제인 트롬빈 용액(Greencross (Yongin, Korea))을 피브리노겐 용액과 동일부피로 추가 혼합함으로써 피브린 수화젤 복합체를 제조하였다. 이때 이용되는 피브리노겐 용액은 피브리노겐(fibrinogen, 71.5-126.5 mg), 혈액응고인자 XⅢ(44-88 Units) 및 아프로티닌(aprotinin, 1,100 Kallikrein Inhibitor Units)을 주성분으로 하며, 트롬빈 용액은 트롬빈(thrombin, 400-600 IU)이 용해된 염화칼슘 용액이다.30 mg of Heparin (Celsus Laboratories (Cincinnati, OH, USA)) in 30 ml and 120 mg of aqueous solution of poloxamer (BASF Corp. (Seoul, Korea)) in 40 ml of Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Germany) (PLGA) Nanoparticles were prepared by slowly adding 2 ml of dissolved dimethylsulfoxide. Excess heparin, poloxamer and dimethylsulfoxide present in the nanoparticle solution were removed by high speed centrifugation followed by separation of the supernatant. 40 μl of PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) was used to redistribute the recovered nanoparticles, followed by model proteins dissolved in PBS (lysozyme, Sigma (St. Louis, MO, USA) and BMP-2, PeproTech. (Rocky Hill, NJ, USA)) or the target protein (VEGF, PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)). 62.5 μl of the nanoparticle dispersion filled with the protein drug was uniformly mixed with 200 μl of the fibrinogen solution (Greencross (Yongin, Korea)), and then the crosslinking agent thrombin solution (Greencross (Yongin, Korea)) was added to the same volume as the fibrinogen solution. Fibrin hydrogel composite was prepared by further mixing. The fibrinogen solution used at this time is composed of fibrinogen (fibrinogen, 71.5-126.5 mg), blood coagulation factor XIII (44-88 Units) and aprotinin (1,100 Kallikrein Inhibitor Units), and the thrombin solution is thrombin (400). -600 IU) is dissolved calcium chloride solution.
실시예 2: 헤파린-기능화 나노입자의 입자크기, 표면전하, 구성성분 질량비, 다분산 지수 관찰Example 2 Observation of Particle Size, Surface Charge, Component Mass Ratio, and Polydispersity Index of Heparin-Functionalized Nanoparticles
오츠카 전자(Otsuka Electronics Co.)의 ELS-8000을 사용하여 동적 광산란법에 의해 제조된 나노입자의 크기를 측정하였으며 전기영동 광산란법을 이용하여 입자의 표면 전하를 측정하였다.The size of the nanoparticles prepared by the dynamic light scattering method was measured using ELS-8000 manufactured by Otsuka Electronics Co., and the surface charge of the particles was measured by the electrophoretic light scattering method.
폴락사머 수용액 상의 헤파린 양을 증가시킴에 따라 합성된 나노입자의 표면전하는 -26.0± 1.1에서 -44.4± 1.2 mV로 증가하였으며 크기는 123.1± 2.0 nm에서 188.1± 3.9 nm로 변화하였다. 헤파린이 강한 음전하를 띤 물질이므로, 음의 값으로 증가하는 표면전하는 생성된 입자의 표면에 더 많은 헤파린이 존재함을 나타낸다.As the amount of heparin in the poloxamer solution was increased, the surface charge of the synthesized nanoparticles increased from -26.0 ± 1.1 to -44.4 ± 1.2 mV and the size was changed from 123.1 ± 2.0 nm to 188.1 ± 3.9 nm. Since heparin is a strong negatively charged material, a surface charge that increases to a negative value indicates that more heparin is present on the surface of the resulting particles.
입자를 구성하는 각 성분의 질량비를 얻기 위해 우선 나노입자 용액을 동결 건조하여 나노입자의 건조 무게를 계산하였다. 입자 상태로 anti-factor Xa 분석(C. Chauvierre et al., Biomaterials 25:3081-3086(2004))을 통해 입자 표면층에 존재하는 헤파린의 내의 헤파린 양을 계산하였고, 입자를 녹여 전체 헤파린을 수거한 후 anti-factor Xa 분석을 통하여 입자내 전체 헤파린 양을 계산하였다. 최종적으로 1H NMR 분석을 통해 입자 내 PLGA와 폴락사머의 비를 계산하여 각 성분의 질량비를 결정하였다(표 1).To obtain the mass ratio of each component constituting the particles, the nanoparticle solution was first freeze-dried to calculate the dry weight of the nanoparticles. Anti-factor Xa analysis of particles (C. Chauvierre et al., Biomaterials 25: 3081-3086 (2004)) was used to calculate the amount of heparin in the heparin present in the particle surface layer, and the particles were dissolved to collect the whole heparin. The total amount of heparin in the particles was calculated by anti-factor Xa analysis. Finally, the mass ratio of each component was determined by calculating the ratio of PLGA and poloxamer in the particles by 1 H NMR analysis (Table 1).
표 1에 기재된 바와 같이, 물리적으로 고정화된 헤파린은 대부분 입자표면층 에 존재하고, 또한, 제조된 입자에서 강하게 결합되지 않은 헤파린과 폴록사머는 고속 원심분리에 의해서 제거되었으므로, 헤파린이 PLGA 나노입자 내에 물리적 방법에 의해 고정화되었으며 대부분 폴락사머로 구성된 입자 표면층내에 존재한다는 것을 알 수 있었다. 수화젤층을 만드는 폴록사머는 폴록사머의 소수성부분과 역시 소수성인 PLGA와의 인력에 의해서 입자제조시 안정화되는 것으로 생각되고, 헤파린의 카르복실그룹이 폴록사머의 친수성부분인 폴리에틸렌글리콜부분과의 인력에 의해서 입자생성 중 헤파린이 표면층에 고정화되는 것으로 생각된다.As shown in Table 1, heparin was physically immobilized in the PLGA nanoparticles because most of the physically immobilized heparin was present in the particle surface layer, and heparin and poloxamer that were not strongly bound in the prepared particles were removed by high speed centrifugation. It has been found that it is immobilized by the method and is mostly present in the particle surface layer consisting of poloxamer. The poloxamer forming the hydration gel layer is thought to be stabilized during the preparation of the particles by the attraction of the hydrophobic portion of the poloxamer and also the hydrophobic PLGA, and the attraction of the carboxyl group of heparin to the polyethylene glycol portion, the hydrophilic portion of the poloxamer. It is believed that heparin is immobilized on the surface layer during particle formation.
제조된 나노입자를 구성하는 각 성분의 질량비를 표 1에 나타내었다.Table 1 shows the mass ratios of the components constituting the prepared nanoparticles.
표 1에 기재된 바와 같이, 폴락사머 수용액 내에 용해된 헤파린의 양이 증가할수록 입자 표면의 수화젤에 존재하는 헤파린의 양도 따라서 증가하는 결과를 보였다. 그러나, 나노입자의 다분산 지수와 수득률을 고려하여 폴락사머 수용액내에 첨가되는 헤파린의 양은 120 mg 이하를 유지 하는 것이 바람직하다. 특히, 폴락사머 수용액 내 헤파린 양이 0, 30, 120 mg인 조건에서 제조한 나노입자의 경우에 각각 0, 2.4 및 4.7 중량%의 헤파린이 포함된 나노입자가 제조되었다.As shown in Table 1, as the amount of heparin dissolved in the aqueous solution of poloxamer increased, the amount of heparin present in the hydrogel on the particle surface was also increased. However, in consideration of the polydispersity index and the yield of the nanoparticles, the amount of heparin added in the poloxamer aqueous solution is preferably maintained at 120 mg or less. In particular, nanoparticles containing 0, 2.4 and 4.7% by weight of heparin were prepared for nanoparticles prepared under the condition that the amount of heparin in the aqueous solution of poloxamer was 0, 30 and 120 mg.
실시예 3: 나노입자로부터 방출되는 모델 단백질의 시험관내(Example 3 In Vitro of Model Proteins Released from Nanoparticles in vitroin vitro ) 서방출 효과Slow release effect
실시예 1에서 제조된 단백질 약물이 충진된 나노입자에 대해서 약물의 서방출 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같은 시험관 내 조건으로 방출양상을 측정하였다. 라이소자임 1 mg이 충진된 나노입자 분산용액을 투석용 튜브(dialysis tube, MWCO 500 kDa)에 넣은 후, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS 용액을 이용하여 방출된 라이소자임을 회수하고, 그 양을 Micro BCA 단백질 정량법(C.J.R. Thorne, in Techniques in Protein and Enzyme Biochemistry, Part I, Section B 104, Elsevier-North Holland(1978))을 이용하여 정량하였다. 라이소자임 회수에 사용되는 PBS 용액은 매일 새로운 PBS 용액으로 교체되었고 단백질 정량 시까지 샘플은 4℃에서 보관되었다.In order to confirm the sustained release effect of the drug on the nanoparticles filled with the protein drug prepared in Example 1, the release pattern was measured under the following in vitro conditions. The nanoparticle dispersion solution filled with 1 mg of lysozyme was put in a dialysis tube (MWCO 500 kDa), and then the released lysozyme was recovered using an excess PBS solution satisfying the infinite dilution condition. Quantification was performed using BCA protein assay (CJR Thorne, in Techniques in Protein and Enzyme Biochemistry , Part I, Section B 104, Elsevier-North Holland (1978)). The PBS solution used for lysozyme recovery was replaced with fresh PBS solution daily and the samples were stored at 4 ° C. until protein quantification.
도 1은 이러한 방출실험의 결과로서 시간의 경과에 따라 나노입자로부터 방출되는 라이소자임의 누적 방출량(%)을 나타낸 그래프이다. 헤파린이 포함되지 않은 나노입자의 경우에는 3일 이내에 충진량의 2/3가 방출되었으나, 나노입자 내 고정화된 헤파린 양이 증가함에 따라 단백질의 서방출 형태가 관찰되었다. 한편, 헤파린 함량이 4.7 중량%인 나노입자의 경우 초기 약물방출 없이 최대 19일까지 방출이 진행되었다.1 is a graph showing the cumulative release amount (%) of lysozyme released from the nanoparticles over time as a result of this release experiment. In the case of nanoparticles without heparin, two-thirds of the filling amount was released within three days, but the sustained release form of the protein was observed as the amount of immobilized heparin in the nanoparticles increased. On the other hand, heparin content of 4.7% by weight of nanoparticles were released for up to 19 days without initial drug release.
실시예Example 4: 나노입자를 포함하는 4: containing nanoparticles 수화젤Hydrogel 복합체로부터 방출되는 모델 단백질의 시험관내( In vitro of the model protein released from the complex inin vitroin vitro ) ) 서방출Slow release 효과 effect
실시예 1에서 제조된 단백질 약물이 충진된 수화젤 복합체에 관해 약물의 서방출 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같은 시험관 내 조건으로 모델 단백질인 BMP-2 (bone morphogenetic protein-2)의 방출양상을 측정하였다. 대상 단백질인 VEGF 경우, 대상 단백질의 항원-항체 특이적 결합 외에 피브린 구성 단백질의 비특이적 결합으로 인해 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용한 정량분석이 불가능하였다. 따라서 헤파린과 특이적 결합이 가능하며 ELISA를 통한 정량분석이 가능한 BMP-2를 VEGF에 대한 대체 모델 단백질로 선정하였다. BMP-2가 충진된 헤파린 기능화 나노입자(헤파린 4.7 중량%)를 포함하는 수화젤 복합체(BMP-NP-Fibrin), PLGA 나노입자(헤파린 0.0 중량%)를 포함하는 수화젤 복합체(BMP-PLGA NP-Fibrin) 및 담체인 피브린 수화젤(BMP-Fibrin)만으로 구성된 시스템을 제작하여 방출용기에 넣은 후, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS 용액을 이용하여 각각의 시스템으로부터 방출된 BMP-2를 회수하고, 회수된 BMP-2의 방출량은 ELISA를 이용하여 정량하였다. PBS 용액은 매일 새로운 용액으로 교체하였고 단백질 정량 시까지 회수된 샘플은 -30℃ 이하에서 보관하였다.In order to confirm the sustained release effect of the drug on the protein drug-filled hydrogel complex prepared in Example 1, the release pattern of BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), a model protein, was determined under the following in vitro conditions. Measured. In the case of VEGF, which is a target protein, quantitative analysis using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was not possible due to the nonspecific binding of the fibrin constituent protein in addition to the antigen-antibody specific binding of the target protein. Therefore, BMP-2, which can be specifically bound to heparin and can be quantitatively analyzed by ELISA, was selected as an alternative model protein for VEGF. Hydrogel complex (BMP-NP-Fibrin) containing heparin functionalized nanoparticles (4.7 wt% heparin) filled with BMP-2, hydrogel complex (BMP-PLGA NP) containing PLGA nanoparticles (0.0 wt% heparin) -Fibrin) and a carrier consisting of only fibrin hydrogel (BMP-Fibrin) was prepared and put in the discharge vessel, and recovered the BMP-2 released from each system using an excess of PBS solution satisfying the infinite dilution conditions The amount of released BMP-2 was quantified by ELISA. The PBS solution was replaced with fresh solution every day and the recovered samples were stored at −30 ° C. or lower until protein quantification.
실시예 1에서 제조한 바와 같이, 헤파린 기능화 나노입자 1 mg당 156 ng의 BMP-2를 충진하여 수화젤 복합체를 제조한 경우, 초기방출이 관찰되지 않았으며 15일까지 충진된 BMP-2의 약 25%가 지속적으로 방출되었다(도 2). 반면 PLGA 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체 및 피브린 수화젤의 경우, 초기 24시간 이내에 총 BMP-2 충진량의 23%와 18%가 각각 방출되었으며, 15일까지 약 60%의 BMP-2가 유사한 방출경향을 보이며 방출되었다. 이를 통해 서방형 단백질 약물전달을 위한 헤파린 기능화 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체의 활용 가능성을 확인하였다.As prepared in Example 1, when hydrated gel complex was prepared by filling 156 ng of BMP-2 per mg of heparin-functionalized nanoparticles, no initial release was observed and about 15 days of BMP-2 was filled. 25% was released continuously (FIG. 2). On the other hand, the hydrogel complex and fibrin hydrogel containing PLGA nanoparticles released 23% and 18% of total BMP-2 content within the initial 24 hours, respectively, and about 60% of BMP-2 was released by 15 days. It was released with a tendency. Through this, the availability of the hydrogel complex including heparin functionalized nanoparticles for sustained-release protein drug delivery was confirmed.
실시예 5: 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체로부터 방출되는 대상 단백질의 생체내(Example 5: In vivo of the protein of interest released from the hydrogel complex comprising nanoparticles ( in vivoin vivo ) 국소적 서방출 및 안정화 효과Local slow release and stabilization effect
실시예 1의 과정을 통해 대상 단백질인 VEGF 2.5 μg이 충진된 나노입자-수화젤 복합체를 준비하고, 단백질 약물의 국소적 방출 효과를 확인하였다. 다당류로 기능화된 나노입자를 포함하는 본 발명의 수화젤 복합체(C: VEGF loaded Hep-NP in Fibrin, n = 4)로부터 방출되는 단백질 약물의 생체내 국소적 서방출 및 안정화 효과에 대한 유의한 차이를 확인하기 위하여, 피브린 수화젤만 이식한 경우(A: Fibrin, n = 4)와 피브린 수화젤에 VEGF를 충진하고 이식한 경우(B: VEGF in Fibrin, n = 4)를 포함하여 모두 3군에 대한 동물실험을 진행하였다.Through the process of Example 1 was prepared a nanoparticle-hydrate gel complex filled with 2.5 μg of the target protein VEGF, and confirmed the local release effect of the protein drug. Significant difference in the local sustained release and stabilization effects of protein drugs released from the hydrogel complex of the present invention (C: VEGF loaded Hep-NP in Fibrin, n = 4) comprising polysaccharide functionalized nanoparticles In order to confirm, all three groups including fibrin hydration gel implantation only (A: Fibrin, n = 4) and fibrin hydration gel filled VEGF and implantation (B: GFVEGF in Fibrin, n = 4) Animal experiments were conducted.
일반적으로 단백질 약물치료의 경우 국소적으로 일정수준의 활성단백질 농도를 지속적으로 유지하는 것이 매우 중요하다는 것은 이미 알려진 사실이므로 동물실험에서의 유의적 차이를 통해 직접적으로 단백질 약물에 대한 수화젤 복합체의 국소적 서방출 및 안정화 효과를 확인할 수 있다. 대조군(A: Fibrin) 및 실험군(B: VEGF in Fibrin, C: VEGF loaded Hep-NP in Fibrin)으로 설정된 총 12마리의 토끼를 이용하여 우측대퇴동맥을 결찰 후 절제하여 하지허혈 모델을 만든 후 즉시 각 군의 해당 시스템을 절제부위에 이식하고 수술 부위를 봉합하였다. 토끼하지허혈모델에 대해 이식 13일후 도플러 초음파를 이용하여 혈압의 회복속도를 측정하였으며, 2주후 혈관조영을 시행하여 대퇴심동맥 및 내장골동맥으로부터 분지되는 측부혈관을 혈관조영상을 통해 직접 관찰하였다.In general, in the case of protein drug treatment, it is already known that it is very important to continuously maintain a certain level of active protein concentration locally. The effect of slow release and stabilization can be confirmed. Using a total of 12 rabbits set up in the control group (A: Fibrin) and the experimental group (B: VEGF in Fibrin, C: VEGF loaded Hep-NP in Fibrin), the right femoral artery was ligated and excised to create a lower limb ischemia model. The respective system of each group was implanted into the resection site and the surgical site was closed. Blood pressure recovery rate was measured using
도 3은 VEGF가 충진된 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체를 우측대퇴동맥 절제가 이루어진 토끼하지허혈모델에 이식하고 2주 후 혈관신생을 관측한 혈관조영상이며, 도 4는 이를 기반으로 대퇴심동맥 및 내장골동맥으로부터 분지되는 측부혈관을 스코어링하여 통계적으로 처리한 그래프이다. 혈관조영상 및 혈관조영 스코어링 결과로부터 이식부위 내의 혈관신생 정도는 실험군 C(VEGF loaded Hep-NP in Fibrin)의 경우 나머지 실험군 및 대조군에 비해 유의하게 높음을 알 수 있다.FIG. 3 is an angiogram obtained by implanting a hydrogel gel containing nanoparticles functionalized with VEGF-filled heparin into a rabbit lower limb ischemia model in which right femoral artery resection was performed and observing angiogenesis after 2 weeks. It is a graph that statistically processed by scoring the side vessels branched from the femoral artery and the visceral artery. From the angiographic and angiographic scoring results, angiogenesis in the graft site was significantly higher in the experimental group C (VEGF loaded Hep-NP in Fibrin) than in the other experimental groups and the control group.
도 5는 VEGF가 충진된 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체를 우측대퇴동맥 절제가 이루어진 토끼하지허혈모델에 이식하고 13일 후 도플러 초음파를 이용하여 측정된 혈압의 회복속도를 관찰한 그래프이다. 혈압이 회복되는 정도는 실험군 C(VEGF loaded Hep-NP in Fibrin) ＞ 실험군 B(VEGF in Fibrin) > 대조군(A: Fibrin) 순으로 측정되었으며 유의적인 차이를 나타내었다. 토끼하지허혈모델에서의 혈압 회복속도는 동맥절제부위 부근 조직의 측부혈관 발달정도와 밀접한 관계가 있다는 사실을 고려할 때, 혈압 회복속도 결과는 혈관조영 스코어링 결과와 일치됨을 알 수 있다.FIG. 5 shows the recovery rate of blood pressure measured using Doppler ultrasound after 13 days of implantation of a hydrogel gel complex containing VEGF-filled heparin-containing nanoparticles into a rabbit lower limb ischemia model in which right femoral artery resection was performed. It is a graph. The recovery of blood pressure was measured in the order of experimental group C (VEGF loaded Hep-NP in Fibrin)> experimental group B (VEGF in Fibrin)> control group (A: Fibrin) and showed a significant difference. Considering the fact that the blood pressure recovery rate in the rabbit lower limb ischemia is closely related to the development of lateral blood vessels in the tissues near the arterial site, the blood pressure recovery rate is consistent with the angiographic scoring results.
결론적으로, 본 발명의 수화젤 복합체는 단백질의 국소적 서방출 및 안정화를 상당히 개선시켜, 약물로서의 단백질의 생체 내 작용을 크게 개선 시킬 수 있음을 알 수 있다.In conclusion, it can be seen that the hydrogel complex of the present invention significantly improves the local slow release and stabilization of the protein, thereby greatly improving the in vivo action of the protein as a drug.
상술한 바와 같이, 본 발명의 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템은 운반하는 단백질 약물의 초기 방출을 감소시키고 국소적 서방출 효과를 크게 개선할 수 있으며, 또한 단백질 약물의 안정성을 크게 개선한다. 한편, 물질의 성질이 변화되는 화학적인 공정 없이 비교적 간단한 공정에 의해 제조될 수 있기 때문에, 본 발명의 단백질 약물 운반시스템은 생체 적합성이 매우 우수하다.As described above, the sustained release topical drug delivery system for the angiogenesis-promoting protein drug of the present invention can reduce the initial release of the transporting protein drug and greatly improve the local sustained release effect, and also the stability of the protein drug. Greatly improves. On the other hand, because the protein drug delivery system of the present invention can be produced by a relatively simple process without a chemical process that changes the properties of the material, the biocompatibility of the present invention is very excellent.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
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