KR20080023729A - 미토겐-활성화 단백질 키나아제의 신규 인산화 자리, 변형단백질 및 적용 - Google Patents

Abstract

미토겐-활성화된 키나아제 단백질 (MAPK)의 신규 인산화 자리가 발견되었다. 상기 인산화 자리에서 인산화된 MAPKs는 및 MAPKs에 의해 매개된 병들의 진단 마커(marker)로서 사용될 수 있다.

Description

미토겐-활성화 단백질 키나아제의 신규 인산화 자리, 변형 단백질 및 적용{NEW PHOSPHORYLATION SITE OF MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASES, MODIFIED PROTEINS AND APPLICATIONS}

본 발명은 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK), 상기 인산화 자리에서 변형된 MAPKs 및 그들의 적용에 관한 것이다.

미토겐-활성화된 단백질 키나아제 (MAPK)

MAPK 라는 용어는 세 개의 키나아제 캐스캐이드(cascades) ERK, JNK 및 p38, 및 그들 각각의 동종체들을 포함한다 [Pearson G., 등, 2001, "Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: Regulation and Physiological Functions", Endocrine Reviews 22(2):153-183]. 이들 키나아제들에 의해 매개되는 세포 효과들은 다양하며, 세포의 전체 생활환: 성장, 분열, 분화, 운동성, 삼투 반응, 스트레스에 대한 반응, 염증, 암 등을 망라한다

어떤 세포외 자극의 검출은, 그 타겟이 다른 키나아제 MAPKK의 세린 및 트레오닌인, MAPKKK 로 불리우는 제 1 의 키나아제에 전달된다. 이 인산화는, 활성화 단편으로 불리는, 이 3단위성(trimodular) 캐스캐이드의 최종 타겟을 운반하는, 제한된 T-Xaa-Y 트리아드 (triad) 또는 삼-아미노산 모티프 (motif) (여기에서, T 는 트레오닌, Y 는 티로신 및 Xaa 는 예로서 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신 또는 프롤린과 같은 아미노산의 잔기이다) 중의 세린 및 트레오닌 잔기들을 인산화함으로써 MAPKK 활성화를 결정한다. MAPK 는, 세린 및 트레오닌 중에서 전사 인자, 기타 키나아제들, 구조 성분 등과 같은 일부 기질들의 인산화에 책임이 있는 효과기 키나아제이다.

P38

단백질 p38 MAPK, 또는 p38은, 세린/트레오닌 키나아제들의 족에 속하는 효소로, 자외선, 삼투 쇼크, 열 등과 같은 외부의 스트레스 신호들에 대한 세포 반응에 중요한 역할을 한다. 이러한 이유로, 이 단백질은 스트레스-활성화 단백질 키나아제 또는 SAPK 로서도 알려져 있다. p38 은, 전사 인자들, 기타 키나아제들의 인산화 및 활성화를 통한 유전자 발현을 제어함에 의해, 또한 중요한 메신저 RNA의 안정성을 조절함에 의해 그의 조절 역할을 수행한다.

가장 많이 연구되고, 그에 따라 가장 잘 알려진 형태는, 적절한 자극 처리 후 많은 세포 유형들(조혈성 및 비-조혈성 조직 모두)에서 그 활성화가 관찰되어온 알파 동종체이지만, p38 에는 4 개의 동종체가 있으며 이들은 상이한 조직에서의 그들의 분포 면 및 상이한 p38 저해제들에 대한 그들의 감수성 면에서 상이하다. 그러나, 이러한 차이점들에도 불구하고, 모든 p38 동종체들은 12 개의 아미노산들에 의해 형성된 활성화 도메인을 가지며, 이는 세포 신호 캐스캐이드 중 상류(upstream) p38에서 발견되는 키나아제 족의 효소들인, MKK6/MKK3에 의해 인산화 된 활성화 단편 Thr-Gly-Tyr 을 함유한다.

p38 은 시토카인 및 염증성 과정의 발생에 책임이 있는 기타 분자들의 제조를 매개하고, 일부 심장병들 및 염증성 현상들에서의 경우 및 세포 주기 제어에서와 같은, 세포성 스트레스에 의해 유도되는 상이한 생리학적 상태들에 관여한다.

수년간에 걸쳐, 여러 상이한 질병들의 발생 또는 전개에 있어서의 p38 의 연루가 분석되어 왔다. 심부전의 수립 및 발전에 있어서 p38 활성화의 중요성은 이미 확립되어져 왔다. 대동맥 수축 후의 구성적 활성화가 마우스들 시험 모델들에서, 그리고 고염도 식이를 이용한 고혈압 래트에서의 모델에서 관찰되었다. 인간에서, p38은 진행된 관상동맥 질환에 따른 심부전에 의해 영향을 받은 심장에서 활성화된다. p38 활성화의 조절은 심장병의 발전에서 필수적인 것으로 보이며, 이는 인간 및 래트 심근에서 말기 심부전에서의 p38 활성의 감소가 관찰되었기 때문이다. p38 MAPK 저해제를 사용함에 의해, 염증성, 폐 또는 신경 질환과 같이, 심장병과 상이한 기타 병들에서의 p38 MAPK 의 연루도 최신 기술에서 설명되어 왔다. 모든 이러한 병들은 활성 p38, 즉 인산화된 Thr180 및 Tyr182 잔기들이 있는 p38을 갖는다는 면에서 특징화된다.

한편, 암환자로부터 유래된 세포들에서 화학 요법 및 방사선 요법 모두 p38 활성화를 일으킨다는 것이 관찰되었으며, 이는 종양 세포의 사멸을 유도하는 신호의 원인이 되는 것으로 보인다.

활성 p38의 존재에 의해 특징화되는 상이한 질병들의 치료에 가장 널리 보급된 전략은 WO 2005/032551, WO 2004/021988, EP1534282 또는 CA2497448에서 언급된 것과 같은, 다른 치료제들과 조합된, 그의 활성의 약리학적 저해 또는 그의 활성화의 저해로 이루어진다.

GRKs

G 단백질-결합된 수용체 (GPCR)는 심장혈관계 또는 면역계 기능에서 필수적인 역할을 수행하는 상이한 메신저들의 작용을 매개한다. 이형삼합체성 (heterotrimeric) G 단백질과의 상호작용에 추가하여, 활성화된 GPCRs은 G 단백질 결합된 수용체 키나아제들 (GRKs) 및 아레스틴(arrestins)으로 불리는 조정 단백질들과 상호작용한다. 구조적 유사성에 근거하여, GRK 족의 7 구성원 (GRK1-7)들은 4 개의 하위-족인 GRK1, GRK2/3, GRK4/5/6 및 GRK7로 분류되며, 여기에서 GRK2/3 및 GRK5/6 은 유기체에서 편재하여 분포되어 있다. 그러나, GPCR 신호를 변경하고 이들 병의 유발 및/또는 진행에 기여하는 기작은 알려지지 않았다.

이들 단백질들은, 기타 세포 단백질들의 보충 및 조절을 허용하는 것에 추가하여, 리간드에 의한 활성화 후의 수용체의 세포간 기능성 및 역학의 신속한 조절에 필수적인 역할을 하여, 새로운 신호 경로를 시작하고, 그에 따라 이들은 GPCR-매개 신호 변환의 필수적인 조절제이자 성분이다. 몇몇 GRKs의 수준 및 기능성은 울혈성 심부전, 심비대 (cardiac hypertrophy), 고혈압 또는 류마티스성 관절염과 같은 염증성 과정과 같은 병리학적 상태들에서 변경된다.

한편, 심근증 및 심부전의 발생에 있어서 SAPKs의 중요한 역할이 알려져 있으며, 선택적인 GPCR 활성화가 이들 키나아제들의 심근에서의 만성적인 활성화를 촉진하는 것도 알려져 있으며, 이 단계는 심실비대로부터 심부전의 발생에 필수적이다.

한 측면에서, 본 발명은 MAPK 단백질에 관한 것으로, 본 설명에서 종종 하기로부터 선택된 "본 발명의 MAPK 단백질"로서 나타낸다:

a) 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화자리에서 인산화된 잔기를 포함하는 MAPK 단백질, 또는 상기 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편, 여기에서

- 상기 상이한 인산화 자리는, 마우스 p38, α 동종체의 123 위치에서의 트레오닌 잔기(Thr123), 또는 아미노산 서열의 다중 정렬에 의해 정의된 것과 같은, 또다른 MAPK 단백질 중의 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 그리고

- 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화 및 그의 기질에 대한 그의 활성을 방지하며; 및

b) 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에, 또는 상기 인산화 자리 주변 영역에 음전하 또는 부피가 큰(bulky) 잔기를 포함하는 MAPK 단백질, 또는 상기 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편, 여기에서

- 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 123 위치의 트레오닌 잔기(Thr123), 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고,

- 상기 인산화 자리, 또는 상기 인산화 자리 주변 영역에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입은, 상기 MAPK 단백질의 활성화 및 그의 기질에 대한 활성을 방지한다.

여기 사용된 것과 같은, "위치적으로 균등한" 이라는 표현은 MAPK 단백질의 아미노산의 위치를 의미하며, 이는 MAPK 단백질들의 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해, 마우스 p38, α 동종체의 Thr123 에 대응한다.

"MAPK 단백질"이라는 표현은, 임의의 종의, ERK, JNK 및 p38 단백질 키나아제, 및 그들의 개별적인 동종체들을 포함한다. 상기 키나아제들 및 그들의 기능들 및 그들의 세포적 효과들에 대한 정보는 Pearson 등에 의해 실시된 리뷰에서 찾을 수 있다 [Pearson G., 등, 2001, "Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: Regulation and Physiological Functions", Endocrine Reviews 22(2):153-183]. 상기 MAPK 단백질들의 아미노산 서열들에 대한 정보는 당업자에게 알려진 적합한 데이타베이스에서 찾을 수 있다 (예로서, Swissprot, NCBI, etc.). MAPK 키나아제들은 상이한 종들 중에 널리 분포되어있으며, 그들의 일차 구조는 상이한 족들의 상이한 원들 중에 널리 보존된다 (ERK, JNK 및 p38).

MAPK 단백질들은 특히, 적당한 키나아제에 의해 인산화될 수 있는 적어도 하나의 잔기를 포함하는 활성화 단편의 존재에 의해 특징화된다.

특정 구현예에서, 상기 활성화 단편은 화학식 (I)의 아미노산 트리아드를 포함한다:

Thr-Xaa-Tyr (I)

식 중,

Thr은 트레오닌이고,

Tyr은 티로신이고,

Xaa은 아미노산 잔기이다.

특정 구현예에서, Xaa 는 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신 및 프롤린으로부터 선택된 아미노산의 잔기이다.

p38, α 동종체의 구체적인 경우에서, 상기 활성화 단편은 그의 아미노산 서열의 180-182 위치에서 화학식 (I)의 아미노산 트리아드를 포함한다.

또다른 특정 구현예에서, 상기 활성화 단편은 화학식 (II)의 아미노산 트리아드를 포함한다:

Ser-Glu-Gly (II)

식 중,

Ser은 세린이고,

Glu은 글루탐산이고,

Gly은 글리신이다.

본 발명의 구현예에서, 본 발명의 MAPK 단백질은 ERK, JNK 및 p38 키나아제들로부터 선택된다. 예시로서, 특정 구현예에서, 본 발명의 MAPK 단백질은 p38이 다. p38 키나아제는 상이한 종들 중 널리 분포되어 있으며, 그의 일차 구조는 널리 보존된다 (도 10). 특정 구현예에서, 상기 p38는, 그의 동종체들 (α, β, γ 또는 δ) 중 임의의 형태의, 포유류 p38, 예로서 인간, 설치류 등의 p38이다. 특정 구현예에서, 상기 p38은 마우스 p38 (Mus musculus)의 α 동종형으로, 그의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다 (GenBank, 접근 번호 P47811).

본 발명자들은 놀랍게도, 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 가능한 자리에서의 MAPK 단백질의 인산화가 상기 MAPK 단백질의 활성화를 저해할 수 있다는 것을 발견하였으며, 여기에서 활성화는, 알려진 바와 같이, 상기 활성화 단편, 예로서 구체적으로 상기에서 참조한 아미노산 트리아드에 존재하는 인산화 가능한 잔기들(예를들어 트레오닌 또는 티로신)의 인산화를 통해 일어난다.

실제로, 본 발명자들에 의해 실시된 연구들은, 마우스 p38, α 동종체의 123 위치에서의 트레오닌 잔기 (Thr123)의 인산화가, 상기 p38의 활성화 단편에 존재하는 화학식 (I)의 아미노산 트리아드의 180 및 182 위치 각각에 존재하는 트레오닌 및 티로신 잔기들의 인산화를 방지한다는 것을 명백히 나타내었다. 그 결과, p38은 활성화될 수 없으며, 따라서 이는 신호 형질도입 캐스캐이드 중에서의 그 기능을 실시할 수 없어, 세포 신호 캐스캐이드에서 상기 MAPK의 활성화가 연루되는 질병들의 치료에 특히 유용할 수 있다.

당업자는 상기 신규 인산화 자리에서의 인산화 뿐만 아니라, 상기 신규 인산화 자리에서 또는 상기 자리 주변의 영역에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도 입도 MAPK 단백질의 활성화 및 그의 기질에 대한 활성을 방지하는 효과를 일으킬 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다.

따라서, 본 발명은 MAPK 단백질에 존재하는 신규 인산화 자리의 존재를 교시하며, 여기에서 상기 인산화 자리는 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이하며, 예컨대 마우스 p38 α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열의 다중 정렬에 의해 정의된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서의 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 이는 또한 일단 인산화되면 상기 MAPK 단백질의 활성화를 저해할 수 있다는 특이성을 갖는다.

상기 상이한 인산화자리의 특이적 위치는 당해 MAPK 단백질 (ERK, JNK 또는 p38), 그 동종체 및 동물 종들에 따라 다를 수 있을 것이나, 그의 인산화 후 (또는 상기 인산화 자리 또는 상기 자리 주변 영역에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입 후)의 당해 MAPK 단백질의 활성화를 방지하는 기능, 또는 그의 위치적 균등성 또는 대응성은 변하지 않을 것이다. 상기 언급된 위치적 및 기능성 특징들을 갖는 상기 인산화 자리를 함유하는 MAPK 단백질들이 본 발명의 범주에 포함된다. 따라서, 본 발명의 MAPK 단백질은 Thr123에서 인산화된 마우스 p38 단백질, α 동종체 뿐만 아니라, 그의 오르토로거스(orthologous) 단백질들, 즉 동일한 조상 유전자로부터 유래하여, 상이한 종들에서 동일한 기능을 수행하는 단백질들도 포함하며, 또한 인산화자리가 상기 위치 (Thr123) 또는 다른 상이한 위치에 있든지, 그리고 상기 인산화된 아미노산이 트레오닌과 상이한 아미노산인지의 여부에 관계없이, MAPK 단백질들의 군에 포함된 그들의 동종체들 및 기타 키나아제들 (ERK 및 JNK)을 포함한다.

추가적으로, 본 발명의 MAPK 단백질은 신규 인산화 자리 또는 상기 자리 주변 영역에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 갖는 변경 MAPK 단백질, 예로서 Thr123에 또는 상기 자리 주변 영역에 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 함유하는, 변경된 마우스 p38 단백질, α 동종체도 포함할 뿐 아니라, 그의 오르토로거스 단백질들도 포함하며, 또한 음전하 또는 부피가 큰 잔기가 상기 위치 (Thr123) 또는 다른 상이한 위치에 있든지, 그리고 상기 변경된 아미노산이 트레오닌과 상이한 아미노산인지의 여부에 관계없이, MAPK 단백질들의 군에 포함된 그들의 동종체들 및 기타 키나아제들 (ERK 및 JNK)을 포함한다. 본 발명에 따른, 상기 신규 인산화 자리 또는 상기 자리 주변 영역에 도입될 수 있는, 예시적이지만 제한적이지 않은, 음전하의 예들은 당업자에게 자명할 것이며, 예로서 음전하를 제공할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물, 예로서 인산염 기를 갖는 펩티드로, 상기 펩티드는 상기 인산화 자리 또는 그의 주변 영역에 결합가능하고, 상기 자리에서 인산화의 효과를 모방할 수 있다. 본 발명에 따라, 상기 신규 인산화 자리 또는 상기 자리 주변 영역에 도입될 수 있는 부피가 큰 잔기들의 예시적이지만 비제한적인 예들은 당업자들에게 자명할 것이며, 예로서 상기 인산화 자리 또는 그의 주변 영역에 결합할 수 있고, 상기 자리에서 인산화의 효과를 모방할 수 있는, 임의의 분자, 예로서 펩티드 또는 저분자량 화합물이 있다; 본 발명자들은 임의의 이론에 합류되기를 원하지는 않지만, 상기 부피가 큰 잔기는, 상기 MAPK 단백질의 활성화 및 그의 기질에 대한 그의 활성화를 방지하는 MAPK 단백질에서의 분자구조적(conformational) 변화를 일으킬 수 있는 것으로 생각된다. 여기 사용된 것과 같은, "(신규) 인산화 자리 주변 영역에" 라는 표현은 상기 인산화 자리 주변의 지역을 의미하며, 여기에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기에 의해 그 안에 도입된 변경은 MAPK 단백질의 활성화 및 그의 기질에 대한 그의 활성을 방지한다. MAPK 단백질의 활성화 및 그의 기질에 대한 그의 활성의 방지 또는 저해 효과를 결정하는데 적합한 분석들은 첨부한 실시예에서 찾을 수 있으며; 따라서 상기 정보는, 상기 "인산화 자리 주변 영역"을 확인하기 위하여 당업자에 의해 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 MAPK 단백질은 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서, 인산화된 잔기를 포함하는 MAPK 단백질의 절편으로, 여기에서, 상기 언급된 것과 같이, 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 정의된 것과 같은 또다른 MAPK 단백질의 인산화가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다.

상기 절편의 길이는 넓은 간격 내에서, 예로서 3 내지 30 아미노산 잔기들 사이, 전형적으로 5 내지 25 아미노산 잔기들 사이, 바람직하게는 10 내지 20 아미노산 잔기 사이로 변화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바람직한 경우, 상기 절편은 다수의 아미노산 잔기들을 함유할 수 있다. 유리하게는, 상기 절편은 본 발명의 MAPK 단백질의 에피토프를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 절편은 에피토프 QKLpTDDHVQFLIY 에 대응하는 서열번호 2를 포함하며, 여기에서 "pT"는 인산화된 Thr123 잔기를 나타내고, 나머지 문자는 마우스 38 키나아제, α 동종체의 단문자 코드에 기초한, 아미노산들의 주해를 나타낸다. 상기 에피토프는 진화 동안에 걸쳐 매우 높게 보존되며, 따라서 상기 서열번호 2는 상이한 종들의 p38의 오르토로거스 단백질들 중 상기 에피토프의 컨센서스 서열인 것으로 간주될 수 있다.

다른 특정 구현예에서, 본 발명의 MAPK 단백질은, 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리 (또는 상기 자리 주변 영역)에 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 포함하는 MAPK 단백질의 절편으로, 상기 언급된 것과 같이, 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 또다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 상기 변경 (음전하 또는 부피가 큰 잔기)은 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다. 상기 절편의 길이는, 넓은 간격 내에서, 예로서 3 내지 30 아미노산 잔기 사이, 전형적으로 5 내지 25 아미노산 잔기 사이, 바람직하게는 10 내지 20 아미노산 잔기 사이에서 변화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바람직한 경우, 상기 절편은 다수의 아미노산 잔기들을 함유할 수 있다. 유리하게는, 상기 절편은 본 발명의 MAPK 단백질의 에피토프를 포함한다.

MAPK 의 활성화가 연루되는 다수의 병들이 알려져 있다. 비제한적이고 예시적인 실시예로, 활성 p38, 즉 활성화 단편에 존재하는 인산화 잔기들에서, 예로서 포유류 (마우스) p38, α 동종체의 Thr180 및 Tyr182 잔기들에 존재하는 인산화 잔기들에서, 인산화된 p38 과 상이한 질병들 간에 존재하는 관계가 알려져 있다. 따 라서, 인산화에 의해, 또는 본 발명에서 동정된 MAPKs의 상기 신규 인산화 자리 또는 신규 인산화 자리 주변 영역에서, 인산화, 또는 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입에 의해 MAPK의 활성화가 방지될 수 있다는 사실 (MAPK의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리들에서의 인산화를 방지) (예로서, Thr123에서의 인산화는 포유류 (마우스) p38, α 동종체의 Thr180 및 Tyr182 중에서의 인산화를 방지한다), 및 Thr123 에서 또는 Thr123 주변 영역에서의 인산화 또는 음전하나 부피가 큰 잔기의 도입이 p38의 그의 기질에 대한 도킹 및 활성을 방지할 수 있다는 사실은 중요한 생물학적 의미를 갖는 것이며, 이는 특히 활성 MAPK에 의해 매개되는 질병의 진단에, 또는 어떤 대상이 상기 병을 발생하는 위험 또는 소인(prdisposition)을 결정하는데, 또는 상기 병을 가진 대상에게 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링하는데, 또는 상기 병의 단계 또는 심각성 및/또는 전개의 분석에 유용하며, 또한 상기 질병의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물들의 동정에 유용하다. 본 발명의 MAPK 단백질은 이러한 의미에서 중요한 역할을 할 수 있다.

"대상" 이라는 표현은, 인간을 포함한 동물 종들의 임의의 원을 포함하며; 예시로서, 상기 대상은 포유류, 예컨대 인간, 가축, 설치류 등일 수 있으며, 바람직하게는 임의의 연령 및 인종의 남자 또는 여자이다.

여기 사용된 것과 같은 "활성 MAPK에 의해 매개된 병(pathology)"이라는 표현은, 활성 MAPK, 즉 활성화 단편에 존재하는 인산화 잔기들에서 인산화된 MAPK가 연루되거나 또는 어떤 역할을 하는 임의의 병을 포함한다. 활성 MAPK에 의해 매개되는 상기 병의 예시적이며 비제한적인 예들은 암, 심장병, 감염성 질병, 신경성 질병, 뉴런성 질병, 폐 질환 및 염증성 질병들을 포함한다. 상기 질병들의 예시적인 비제한적인 예들은 심근경색, 비대증 (hypertrophia), 고혈압, 심근염, 혈관성형-유래 병변 (angioplasty-induced lesions), 심근 부전, 바이러스성 또는 세균성 감염, 신경 사멸 또는 기타 세포 유형의 사멸, 알츠하이머병, 건선, 류머티스성 관절염, 자동면역 신경염, 크론병, 암 (암종, 백혈병, 림프종, 육종 등), 혈전 형성, 화학치료제 및 방사성 치료제에 대한 반응, 국소빈혈/재관류에 대한 반응, 등을 포함한다.

따라서, 본 발명의 MAPK 단백질은 진단 마커로서 또는 어떤 대상이 활성 MAPK에 의해 매개되는 병, 예로서 암 또는 심장병, 감염성 질병, 신경성 질병, 뉴런성 질병, 폐 질환 및 염증성 질병을 발생하는 소인에 대한 마커로서 유용하다. 활성 MAPK의 존재가 활성 MAPKs에 의해 매개되는 상기 언급된 병들과 관련되었음을 가정하면, 본 발명의 MAPK 단백질의 동정은 상기 병의 발생의 보다 낮은 위험 또는 소인을 나타낼 수 있는 것이며, 이는 본 발명에서 동정된 인산화 자리에서의 인산화, 또는 상기 인산화 자리 또는 그 자리 주변 영역에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입이 상기 MAPK의 활성화를 방지할 것이기 때문이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 MAPK 단백질은, 상기 포유류 p38의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서 인산화된 포유류 p38, 예로서 Thr123에서 인산화된 포유류 p38, 또는 상기 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 어떤 대상이 활성 MAPK에 의해 매개되는 질병을 발생하는 위험 또는 소인을 분석하기 위한 하기를 포함하는 시험관 내 방법을 제공한다:

a) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 본 발명의 MAPK 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및

b) 상기 수준을 대조구 샘플의 수준과 비교하는 단계,

여기에서, 대조구 샘플의 수준에 대한 상기 수준에서의 감소는, 상기 대상이 활성 MAPK에 의해 매개되는 상기 병을 발생하는 위험을 나타내는 것이다.

연구될 상기 대상으로부터의 실질적으로 어떤 임의의 생물학적 샘플도 사용될 수 있으며, 예로서 혈액, 혈청, 혈장, 조직 등이 있다. 상기 샘플은 통상적인 방법들에 의해 수득될 수 있다. 대조구 샘플은 활성 MAPK에 의해 매개되는 상기 병을 겪지 않는 대상들로부터의 샘플이며, 참조 또는 기준선 값을 포함한다.

본 발명의 상기 MAPK 단백질의 수준 (농도)의 검출 및/또는 정량은 당업자에 의해 알려진 통상적인 방법들, 예로서 면역화학적 방법들에 의해 결정될 수 있다 (하기 참조).

본 발명의 MAPK 단백질은 활성 MAPK에 의해 매개되는 병, 예로서 암 또는 심장병, 감염성 질병, 신경성 질병, 뉴런성 질병, 폐 질환 및 염증성 질병을 갖는 어떤 대상에 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링하는데 사용될 수도 있다. 이러한 의미에서, MAPK의 활성화를 방지하는 처리, 예로서 본 발명에서 동정된 인산화 자리에서의 인산화에 의한, 또는 상기 인산화 자리 또는 상기 인산화 자리 주변 영역에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입에 의한 처리는, 상기 병을 가진 대 상에게 투여되는 치료의 효과를 분석가능하게 할 것이며, 만일 그가 효과적이지 않은 경우, 그 치료를 변경하거나 또는 개인에 맞추어진 (customized) 치료법을 설계할 수 있게 할 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 MAPK 단백질은 포유류 p38의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서 인산화된 포유류 p38 단백질로, 예로서 Thr123에서 인산화된 포유류 p38, 또는 상기 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편이다.

본 발명의 MAPK 단백질은 활성 MAPK에 의해 매개되는 상기 병, 예로서 암 또는 심장병, 감염성 질병, 신경성 질병, 뉴런성 질병, 폐 질환 및 염증성 질병의 단계 또는 심각성 및/또는 전개를 분석하는데 사용될 수도 있다. 이러한 의미에서, 본 발명의 MAPK 단백질의 동정은 이러한 유형의 병의 보다 나은 전개를 나타낼 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 MAPK 단백질은 포유류 p38의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서 인산화된 포유류 p38 단백질로, 예로서 Thr123에서 인산화된 포유류 p38, 또는 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편이다.

특정 구현예에서, 본 발명은, 하기를 포함하는, 활성 MAPK에 의해 매개되는 상기 병을 갖는 대상에게 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링하는 시험관 내 방법, 또는 활성 MAPK에 의해 매개되는 상기 병의 단계 또는 심각성 및/또는 전개의 시험관 내 분석 방법을 제공한다:

a) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플 중에서 본 발명의 MAPK 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및

b) 상기 수준을 상기 동일한 대상으로부터의 대조구 샘플의 수준과 비교하는 단계.

두 수준 간의 비교는 상기 병의 치료 및/또는 전개의 효능을 나타낼 것이다. 그러한 목적을 위하여, 이 경우에서 상기 대조구 샘플은 치료를 적용하기 전의 또는 그의 효능 및 병의 전개를 분석하기 위한 처리의 투여 이후 일정 기간 후에, 대상으로부터 얻은 샘플을 샘플이다.

본 발명의 상기 MAPK 단백질의 수준 (농도)의 검출 및/또는 정량은 당업자에게 알려진 통상적인 방법들, 예로서 면역화학적 방법에 의하여 결정할 수 있다 (하기 참조).

본 발명의 MAPK 단백질은 활성 MAPK에 의해 매개된 상기 병, 예로서 암 또는 심장병, 감염성 질병, 신경성 질병, 뉴런성 질병, 폐 질환 및 염증성 질병의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물들을 동정하는데 사용될 수도 있다. 이러한 의미에서, 상기 MAPK의 활성화를 방지하는 화합물들은, 상기 심장병, 감염성 질병, 신경성 질병, 뉴런성 질병, 폐 질환 또는 염증성 질병의 치료에 사용될 수 있으며; 본 발명의 MAPK를 탈인산화하는 화합물들은 암의 치료에 사용될 수도 있으며, 이는 대상을 화학 요법 또는 방사선 요법에 투입한 후 상기 MAPKs의 활성화가 종양 세포들의 사멸을 유도하는 신호를 생성하기 때문이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 MAPK 단백질은 포유류 p38의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서 인산화된 포유류 p38 단백질로, 예로서 Thr123에서 인산화된 포유류 p38 또는 상기 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편, 또는 Thr 123 또는 Thr 123 주변 영역에 결합된 화합물을 갖는 p38이고, 상기 MAPK 단백질은 Thr 123 에서 또는 상기 Thr 123 잔기 주변 영역에서의 인산염 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 존재를 모방한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, MAPK 단백질들에 의해 매개되는 병들의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물을 동정하는 시험관 내 방법을 제공한다:

a) 후보 화합물을 MAPK 단백질과 접촉되도록 하는 단계, 및

b) 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서의 상기 MAPK 단백질의 인산화를 검출하는 단계, 및

c) 상기 인산화 자리가 (i) 마우스 p38, α 동종체의 Thr123인지 (상기 사용된 MAPK 단백질이 상기 단백질인 경우), 또는 아미노산 서열의 다중 정렬에 의해 정의된 것과 같은, 또다른 MAPK 단백질 중의 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기의 여부를 분석하고, 그리고 (ii) 상기 상이한 인산화 자리에서의 상기 인산화가 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지하는지의 여부를 분석하는 단계;

또는 선택적으로,

i) 후보 화합물 (예로서, MAPK 단백질을 인산화할 수 있는 화합물 또는 상기 인산화의 효과를 모방하는 화합물)을 MAPK 단백질과 접촉되도록 하는 단계;

ii) 후보 화합물의 MAPK 활성화에 대한 영향을 측정하기 위해, 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편의 인산화 자리에서의 상기 MAPK 단백질의 인산화를 검출하거나, 또는 후보 화합물의 MAPK의 활성화에 대한 영향을 측정하기 위해 상기 MAPK 단 백질 상에서의 상기 인산화 모방 효과를 검출하는 단계;

iii) 경쟁 화합물 존재 하에 MAPK 단백질의 그의 기질에 대한 도킹 및/또는 활성의 저해 가능성을 시험하기 위하여, 후보 화합물의 존재하에 상기 MAPK 단백질의 그의 기질에 대한 활성을 분석하는 단계; 및

iv) (i) 마우스 p38, α 동종체의 Thr123에서의 상기 인산화 자리 (사용된 MAPK 단백질이 상기 단백질인 경우)가 후보 화합물에 의해 영향을 받는지의 여부, 및 (ii) 상기 인산화 자리에서의 인산화가 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지하는지의 여부를 분석하는 단계.

상기 후보 화합물은, 특정 구현예에서, MAPK 단백질과 접촉하여 MAPK 단백질을 인산화할 수 있는 화합물 (예로서, 키나아제 등)이거나 또는 상기 인산화의 효과를 모방하는 화합물이다. 경쟁 화합물은, 특정 구현예에서, MAPK 단백질을 인산화할 수 있는 화합물이다 (예로서, 키나아제 등).

단백질의 인산화 및 인산화 모방의 MAPK 단백질에 대한 효과의 결정은 당업자에 의해 알려진 임의의 통상적인 방법에 의해 결정될 수 있다. 단백질의 인산화 상태 또는 특정 단백질에서 인산화된 아미노산 잔기를 결정하기 위한 각종 분석들이 알려져 있으며, 예로서 하기가 있다: 방사능 표지된 ATP를 사용하는 시험관 내 키나아제 활성 분석; 인산화 및 표지된 단백질의 이차원 전기영동 (이는 단백질 내에서 얼마나 많은 아미노산 잔기들이 인산화되었는지를 분석하는 것을 가능하게 한다); 그의 인산화 상태가 측정될 미리 정제된 단백질의 질량 분석; 정제된 단백질을 이용하여, 유도된 (directed) 돌연변이생성 후 시험관 내 키나아제 활성 분석; 트립신에 의한 절단 후 인산화된 단백질의 2차원적 분리를 포함하는 포스포-펩티드 분석 또는 기술적으로 복잡하지 않은, 인산화된 단백질의 아미노산 잔기 또는 에피토프를 특이적으로 인식하는 상기 단백질에 대항하는 항체의 사용을 고려하는 웨스턴 블롯. 단백질에서 인산화된 잔기들을 검출하기 위한 기술들은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 최신 기술에 포함된다.

특정 구현예에서, 상기 MAPK 단백질은 p38 키나아제로, 예컨대 포유류 p38이고, 인산화는 상기 포유류 p38, α 동종체에 존재하는 Thr123 잔기에서 실시된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 MAPK 단백질에 결합할 수 있고/있거나 본 발명의 상기 MAPK 단백질을 검출할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 화합물은 본 발명의 상기 MAPK 단백질에 결합 및/또는 그를 검출할 수 있는 항체이다.

본 명세서에 사용된 것과 같은, "항체"라는 용어는 키메라성 또는 재조합 항체들 및 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체들 또는 그의 단백분해성 단편들, 예로서 Fab 또는 F(ab')2 등을 모두 포함하고자 한다. 또한, 상기 항체의 가변성 영역을 암호화하는 DNA는, 이러한 방식으로 키메라성 항체들을 생성하도록, 다른 항체들에 삽입될 수 있다. 단일 사슬 항체들 (scFv)은, 항원에 결합하는 항체의 특징적인 능력을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 영역(VH-VL 또는 scFv 결합)에 상동성 또는 상사성인 한 쌍의 아미노산 서열들을 포함하는 단일 사슬들에 의해 형성된 폴리펩티드일 수 있다. 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역들에 상사성인 폴리펩티드들은, 그러한 것이 바람직한 경우, 링커 폴리펩티드를 통해 결합할 수 있다. 항체들의 제조 방법은 당업자에게 공지이며, 최신 기술에 포함된다.

예시를 위해, 본 발명에 의해 제안된 항체는 본 발명의 상기 MAPK 단백질에 존재하는 에피토프에 결합 및/또는 그를 검출할 수 있는 항체이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 MAPK 단백질은 포유류 p38의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서 인산화된 포유류 p38 단백질로, 예로서 Thr123에서 인산화된 포유류 p38, 또는 상기 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편이다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 포유류 p38 키나아제의 절편에 포함된 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 절편은 인산화된 Thr123 잔기, 또는 다른 MAPK 단백질들 중에서 위치적으로 균등한 (매치되는) 잔기를 포함한다. 또다른 특이적인 구현예에서, 상기 항체는 진화 동안 매우 잘 보존된 에피토프인, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합가능한 항체이고, 따라서 상기 서열번호 2는 다른 종들의 상동성 p38 단백질들 중 상기 에피토프의 컨센서스 서열인 것으로 생각될 수 있다.

다른 구체적인 구현예에서, 본 발명의 MAPK 단백질에 결합가능한 상기 화합물은 본 발명에 의해 동정된 신규 인산화 자리 [즉, 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열의 다중 정렬에 의해 정의된 것과 같은 또다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기]에서, 또는 상기 자리의 주변 영역에서 상기 MAPK 단백질에 결합하는 화합물로, 상기 화합물은 활성화 단편에서 MAPK 단백질의 인산화를 감소시키고, 그에 따라 그의 활성화 및/또는 기질에 대한 활성을 방지하며, 예로서 상기 인산화 자리 또는 상기 자리의 주변 영역 중 하나에 음 전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하는 화합물이다. 상기 화합물의 예시적이고 비제한적인 예들은 다음을 포함한다:

(i) p38 의 도킹 영역에 결합가능하고, 상기 영역에 음전하 (예로서, 인산염기)의 도입, 예로서 마우스 p38, α 동종체의 Thr123 (또는 그 주변 영역에서)에서의 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123에서, 또는 Thr123 주변 영역에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(ii) p38 의 도킹 영역에 결합가능하고, 상기 영역에 음전하 (예로서, 인산염 기)의 도입, 예로서, 마우스 p38, α 동종체의 Thr123에서의 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123 에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 그의 기질에 대한 활성을 손상시킨다.

또다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 MAPK 단백질에 결합가능하고/하거나, 본 발명의 상기 MAPK 단백질을 검출할 수 있는 상기 화합물의, 어떤 대상이 활성 MAPK에 의해 매개되는 병을 발생시키는 위험 또는 소인의 분석을 위한, 또는 상기 질병을 갖는 대상에게 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링하기 위한, 또는 상기 병의 단계 또는 심각성 및/또는 전개를 분석하기 위한 용도 및 상기 병의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물들의 동정에서의 용도에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 벡터에 관한 것으로, 이하에서는 본 발명의 벡터라 한다:

(i) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물을 암호화하는 핵산 서열, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(ii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리의 인산화를 방지하는 화합물을 암호화하는 핵산 서열; 또는

(iii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(iv) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서의 인산화를 방지하는 화합물.

특정 구현예에서, 상기 MAPK 단백질은 포유류 p38 키나아제이고, 상기 인산화는 포유류 p38의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인 산화 자리, 예로서 포유류 p38의 Thr123에서 일어난다.

본 발명의 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비-바이러스성 벡터일 수 있으며, 이들은 당업자에게 공지이며, 치료법, 예로서 유전자 치료요법에서 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는, MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물을 암호화하는 핵산 서열 (여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다), 또는 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물을 포함한다 (여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다). 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성 저해를 생성하고, 따라서 본 발명의 상기 벡터는 활성 MAPKs 에 의해 매개되는 병의 치료에 유용할 수 있다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리의 인산화를 방지하는 화합 물을 암호화하는 핵산 서열, 또는 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리의 인산화를 방지하는 화합물을 포함하며, 예컨대 GRK2 키나아제 저해제와 같은 키나아제 저해제 또는 상기 인산화 자리를 탈인산화하는 포스파타제가 있다. 상기 인산화 자리의 인산화가 방지되기 때문에, 상기 MAPK 단백질의 활성화가 촉진될 수 있으며, 이는 대상을 방사능 요법 또는 화학치료 요법에 투입한 후, 활성 MAPK 단백질들의 존재가 종양 세포들의 사멸을 이끄는 경우 암의 치료에 특히 유리할 수 있다. 따라서, 이 경우, 본 발명의 벡터는 활성 MAPKs에 의해 매개되는 병, 특히 암의 치료에 유용할 수 있다.

본 발명의 벡터의 특정 구현에에서, MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물은 키나아제, 또는 상기 키나아제의 특징적인 기능을 실시할 수 있는 그의 기능적으로 활성인 절편, 예로서 GRK2 키나아제, 또는 본 발명에 의해 나타낸 바와 같이, 예컨대 마우스 p38, 동종체 α와 같은 포유류 p38에 존재하는 Thr123을 인산화하는, 그의 기능적으로 활성인 절편이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 치료적으로 유효한 양의 하기를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다:

(i) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물로, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기 이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(ii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리에서의 인산화를 모방하는 화합물로, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(iii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리에서의 인산화를 방지하는 화합물; 또는

(iv) 본 발명의 벡터; 또는

(v) 본 발명에 의해 동정된 신규 인산화 자리, 또는 상기 자리 주변 영역에서 상기 MAPK 단백질에 결합하는, 본 발명의 MAPK 단백질에 결합가능한 화합물로, 상기 화합물은 활성화 단편에서 MAPK 단백질의 인산화를 감소시키며, 이에 따라 그의 활성화 및/또는 그의 기질에 대한 그의 활성을 방지하며, 예로서, 상기 인산화 자리 또는 상기 자리 주변 영역에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하는 화합물이다; 또는

(vi) p38의 도킹 영역에 결합가능하고, 상기 영역에 음전하 (예로서 인산염기)의 도입, 예로서 마우스 p38, α 동종체의 Thr123에서 (또는 그 주변 영역에서) 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위 치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123 에서, 또는 Thr123 주변 영역에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(vii) p38의 도킹 영역에 결합가능하고 상기 영역에 음전하 (예로서, 인산염기)의 도입, 예로서 마우스 p38, α 동종체의 Thr123에서 (또는 그 주변 영역에서) 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123 에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 그의 기질들에 대한 활성을 손상시킨다.

특정 구현예에서, 상기 MAPK 단백질은 포유류 p38 키나아제이며, 상기 인산화는 상기 포유류 p38의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리, 예로서 포유류 p38의 Thr123 에서 일어난다.

특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물, 예컨대 키나아제, 또는 상기 키나아제의 특징적 기능을 실시할 수 있는 그의 기능적으로 활성인 단편, 예로서 GRK2 키나아제 또는 그의 기능적으로 활성인 단편을 포함한다. 상기 키나아제는 포유류 p38의 Thr123을 인산화한다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리에서의 인산화를 방지하는 화합물을 포함한다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 벡터를 포함한다.

활성 MAPK에 의해 매개되는 병의 예방 및/또는 치료에의 투여를 위해, 활성 화합물들 (벡터 포함)을 치료적으로 유효한 양으로, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 또는 부형제들과 함께, 적당한 약학 조성물로 제형화한다.

임의의 적당한 투여 방법, 예로서 경구, 피하주사, 복강내, 정맥 등을 통한 투여를 위한 임의의 고체 (예로서, 정제, 캡슐, 과립, 등) 또는 액체 (예로서, 용액, 현탁액, 에멀션, 등) 조성물을 포함하는 약학 조성물들의 예는, 전형적으로 경구적으로 투여되며, 이는 치료될 질병의 일반적으로 만성적인 특징 때문이다.

특정 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구 투여되는 고체 또는 액체의 제약학적 형태일 수 있다. 경구 투여되는 제약학적 형태들의 예시적인 예들은 정제, 캡슐, 과립, 용액, 현탁액 등을 포함하며, 결합제, 희석제, 붕괴제, 윤활제 및 습윤제 등과 같은 통상적인 부형제들을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은, 그의 비경구적 투여를 위해, 예로서 멸균액, 동결건조 용액, 현탁액 또는 적당한 투여 형태의 제품 형태로 조정될 수도 있으며; 이 경우, 상기 약학 조성물은 버퍼, 계면활성화제 등과 같은 적당한 부형제들을 포함할 것이다. 임의의 경우에, 상기 부형제들은 선택된 약학적 투여 형태에 따라 선택될 것이다. 상이한 약학적 투여 형태들 및 그들의 제조의 리뷰는 C. Fauli i Trillo의 "Tratado of Farmacia Galenica"라는 책 (제 10 판, 1993, Luzan, 5, S.A. de Ediciones)에서 찾을 수 있다.

일반적으로, 투여될 치료적으로 유효한 양 (또는 벡터)는, 다른 인자들 중, 치료될 대상, 상기 대상이 겪고 있는 병의 심각성, 선택된 투여 형태 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 이유로, 본 발명에서 언급된 투약량은 당업자를 위한 지침으로서만 고려되어야 하며, 상기 투약량은 상기 언급된 변수들에 따라 조정되어야만 한다. 그렇지만, 본 발명의 약학 조성물은 일일 1 회 이상, 예로서 일일 1, 2, 3 또는 4 회로, 25 내지 75 mg/kg/일의 전형적인 총 일일 투여량으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 병용 치료를 제공하기 위하여, 활성 MAPKs에 의해 매개되는 상기 병들의 예방 및/또는 치료에 유용한 기타 추가적인 약물들과 함께 사용될 수 있다. 상기 추가적인 약물들은 동일한 약학 조성물의 일부를 형성할 수 있거나, 또는 선택적으로 그들은 본 발명에 의해 제공되는 약학 조성물과 함께 그의 동시 또는 비-동시 투여를 위해, 별개의 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 활성 MAPKs에 의해 매개되는 병의 치료용 약학 조성물의 제조에서 하기의 이용에 관한 것이다:

(i) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물로, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(ii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리에서의 인산화를 모방하는 화합물, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(iii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서의 인산화를 방지하는 화합물; 또는

(iv) 본 발명의 벡터;

(v) 본 발명에 의해 동정된 신규 인산화 자리, 또는 상기 자리 주변 영역에서 상기 MAPK 단백질에 결합하는, 본 발명의 MAPK 단백질에 결합가능한 화합물로, 상기 화합물은 활성화 단편에서 MAPK 단백질의 인산화를 감소시키며, 그에 따라 그의 활성화 및/또는 그의 기질에 대한 활성을 방지하며, 예로서 상기 인산화 자리 또는 상기 자리 주변 영역 중 하나에 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하는 화합물이다; 또는

(vi) p38의 도킹 영역에 결합할 수 있고, 상기 영역에 음전하 (예로서, 인산염기)의 도입, 예로서 마우스 p38, α 동종체의 Thr123에서 (또는 그 주변 영역), 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입을 모방할 수 있는 화합물이고, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123 또는 Thr123 주변 영역에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

(vii) p38의 도킹 영역에 결합할 수 있고, 상기 영역에 음전하 (예로서, 인산염기)의 도입, 예로서 마우스 p38, α 동종체의 Thr123 (또는 그 주변 영역), 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입을 모방할 수 있는 화합물이고, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 그의 기질에 대한 활성을 손상시킨다.

특정 구현예에서, 상기 MAPK 단백질은 포유류 p38 키나아제이고, 상기 인산화는 포유류 p38의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리, 예로서 포유류 p38의 Thr123에서 일어난다.

특정 구현예에서, MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 상기 화합물은 키나아제, 또는 상기 키나아제의 특징적 기능을 수행할 수 있는 그의 기능적으로 활성인 절편으로, 예로서 GRK2 키나아제 또는 그의 기능적으로 활성인 절편이며, 이는 포유류 (마우스) p38, α 동종체의 Thr123을 인산화한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 MAPK 단백질, 또는 상기 언급된 것과 같은 본 발명의 상기 MAPK 단백질에 결합가능하고/거나 그를 검출할 수 있는 화합물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 키트는 활성 MAPK에 의해 매개되는 병의 진단에, 또는 어떤 대상이 상기 병을 발생하는 위험 또는 소인을 결정하기 위하여, 또는 상기 병을 가진 대상에게 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링하기 위하여, 또는 상기 병의 단계 또는 심각성 및/또는 전개를 평가하기 위하여 사용될 수 있으며, 또한 상기 병의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물들의 동정에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 MAPK 단백질은 포유류 p38, 동종체 α의 Thr123 중 인산화된 포유류 p38 키나아제이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 활성 MAPK에 의해 매개되는 병의 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의해 제공되는 약학 조성물의, 치료를 필요로 하는 대상에로의 투여를 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하며, 그 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1A 내지 도 1E는 GRK2 가 시험관 내에서 p38을 직접적으로 인산화하는 것을 나타낸다. 도 1A는 p38이 GRK2 에 의해 인산화된 것을 나타낸다. 배큘로바이러스 시스템 (50nM)에 의해 정제된 재조합 GRK2를 p38 인산화 버퍼 (25 mM 헤페스 (Hepes), pH 7.5, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 50μM ATP, 2000-3000 cpm/pmol [γ-³²P]ATP) 중에서 50 nM 의 재조합 p38 (GST-p38)과 함께, GRK2 활성의 저해 목적으로 헤파린과 함께 또는 헤파린 없이 (50 ng/㎕) 최종 부피 40 ㎕ 로 30℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 키나아제 자동인산화 대조구들을 동일한 조건에서 실시하였다. SDS 부하 버퍼를 첨가하여 반응을 멈추고, 단백질을 8% SDS-폴리아크릴 아미드 겔 중에서 분리하고, 자기방사법에 의해 전개하였다. 도 1B는 GRK2 가 p38을 직접적으로 인산화하고, 그의 자동인산화를 촉진하지 않는 것을 보여준다. 상기 인산화 반응들은 도 1A 와 관련하여 나타낸 것과 같이 실시하였다. 헤파린 및 SB203580 화합물들, GRK2 및 p38 저해제들을, 개별적인 키나아제들의 완전한 저해를 보장하기 위하여, 각각 10 배의 IC₅₀ 농도, 즉 헤파린에 대해 1.5 μM 및 SB203580에 대해 0.5 μM 를 사용하였다. 사용된 기질들은 p38에 대해 MPB (포인트 당 14 ㎍) 및 카세인 (포인트 당 7.5 ㎍)이었다. SDS 부하 버퍼를 첨가하여 반응을 멈추고, 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 중에서 분리하고, 자기방사법에 의해 검출하였다. 도 1C 는 GRK2 가 그의 활성화 단편 중에서 p38을 인산화하지 않음을 나타낸다. 상기 인산화 반응을 상기 기재된 조건 하에서 방사성 ATP의 부재 하에서 시작하였다. 40 ng 의 MKK6_CAM (MKK6/MKK3, Upstate)를 사용하여 시험관 내에서 GST-p38 을 인산화하는데 사용하였다. 전기영동 분리 후 검출을 위해 사용된 항체들은, 보다 큰 단백질들인 GRK2 및 GST-p38 을 인식하였다 (항-PF2 항체, GST-PF2 융합 단백질에 대한 항체들을 가지고, 본 발명자들의 실험실에서 생성된, 폴리클로날 혈청으로, 여기에서 PF2 는 GRK2의 C-말단 절편이다). p38 활성화 상태를 검출하는데 사용된 T180/Y182 의 인특이적 (phosphospecific) 항체는 Cell Signaling의 것이다. 도 1D 는 GRK2에 의한 p38 인산화의 시간 의존성을 나타낸다. 상기 인산화는, 0 내지 90 분의 범위로 나타낸 것과 같은 인큐베이션 시간을 제외하고, 상기 설명된 것과 동일한 조건 하에서 실시되도록 하였다. 두 단백질들 모두의 (GRK2 79.6 kDa; GST-p38 68 kDa) 이동성을 화살표로 나타내었다. 체렌코프법 (Cerenkov)에 의한 정량 후 겔의 절제된 밴드들에 대해 수득된 데이타를 우측에 나타내었다. 도 1E 는 인산화 역학 파라미터들을 나타낸다. 섹션 D의 데이타를 고려하여, 15 분의 반응은 초기 속도 조건화에서 인산화 역학 상수들을 결정하기 위한 기간인 것으로 고려하였다. 이마 설명된 바와 같이, GRK2 농도를 고정되게 (25nM) 유지하고, p38 농도는 12.5 에서 40nm로 변화시키며, 인산화 반응들을 수행하였다. SDS 부하 버퍼를 첨가하여 반응을 중단시키고, 단백질을 8% SDS-폴리아미드 겔 중에서 분해하여 자기방사법에 의해 검출하고, 체렌코브법에 의해 정량하였다. 역학 파라미터를 추론할 수 있는 알고리즘을 제공하는, Kaleidagraph 프로그램으로 그래프를 만들었다: 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수 (Km=79.56 nM) 및 최대 속도 (Smax= mg GRK2^-1분^-1 당 포함된 PO₄ ^3- 0.9 nmol).

도 2A 내지 도 2D 는 GRK2 및 p38이 β₂-아드레날린성 (β₂-AR) 수용체 자극에 종속적으로 연합되어 있음을 나타낸다. 도 2A: HEK 293 세포들을 pCDNA3-GRK2, pBC12BI-β2-AR 및 pCDNA3-Flag-p38α(p60 당 각 DNA 1㎍) 벡터들로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48 시간 및 혈청 기아상태(starvation) 2 시간 후, 세포들을 아드레날린성 아고니스트 이소프로테레놀 (ISO, 10μM)로 5 또는 10 분 동안 자극시키거나, 또는 세포들을 자극시키지 않았다 (0 분 ISO). 유사하게, 과잉발현된 β2-AR 수용체 없는 세포들을 0.5 M NaCl로 15 분 동안 자극하였다. 상기 세포들을, 면역침강에 적합한 버퍼 중에서 아가로오스에 결합된 M2 항-Flag 항체를 이용하여 가용화하고, 이들 용해물 (10%)의 분액을 과잉발현 대조구 용으로 취한 후(용해물 패널), 면역 복합물들을 4℃ 에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 면역침강된 단백질들을 (Ip 항-Flag) 전기영동 절단 (breaking) 버퍼 중에 재현탁시키고, 결합된 단백질들을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분해시켰다. 전기전이(electrotransference) 후, 단백질을 항-p38 및 GRK2에 대항하는 항체, 항-PF2 로 검출하였다 (각각, 상부 및 하부 패널). Flag-p38α 부재 및 10 μM 이소프로테레놀을 이용한 자극의 부재하에서의 음성 면역침강 대조구들 (Cneg)도 상기 도면에 포함시켰다. 용해물 패널에서, 상부의 GRK2 및 하부의 p38 활성 상태를 항-포스포-p38 항체를 사용하여 검출하였다 (표 1 참조). 도 2B: 2A 에 기재된 것과 동일한 방법에서, 과잉발현된 단백질들을 GRK2 항-PF2 에 대항하는 항체를 사용하여 면역침강시켰으며, 후자의 공-면역침강을 각 자극점에서 항-p38 을 사용하여 검출하였다 (0 및 5 분의 이소프로테레놀, 왼쪽 상부 패널). Flag-p38 발현 대조구들 (상부) 및 GRK2 발현 대조구들 (하부) 및 총 면역침강된 GRK2 (하부 왼쪽 패널)은 인접 패널들에 나타내었다. 두 개의 단백질들 간의 연합이 다시 검출되었으며, 10 μM 이소프로테레놀에의 노출 후 5 분 동안 자극되었다. 도 2C: 이번에는, 내생의 GRK2가 p38 (0.5 ㎍ DNA) 보다 적은 총 량으로 공침전되는 것을 보장하기 위한 목적으로, β₂-AR 및 Flag-p38α를 암호화하는 벡터들만을 HEK293 세포들 중에 도입시켰다. Flag-p38α 및 GRK2 간의 최대 연합이 10 μM 이소프로테레놀 처리 후 5분에 생성되었다 (상부 및 하부 왼쪽 패널 참조). 오른쪽 패널들에서 세포 용해물 중에서 GRK2 발현 (상부, 항-PF2) 및 p38 발현(하부, 항-p38)을 확인하였다. 도 2D: 섹션 A 에 기재된 것과 동일한 실험에서, 촉매적으로 비활성인 GRK2-K220R 돌연변이의 Flag-p38 와의 공침전 능력을 시험하였다. 2 개의 상부 패널들은, 각각 두 개의 GRK2 동종체들 및 총 면역침강된 p38의 공침전을 나타낸다. 두 개의 용해물 패널들은 GRK2 및 GRK2-K220R 과잉발현 (상부, 항-PF2) 및 각 포인트에서 Flag-p38 활성화 상태 (하부, 항-포스포-p38)를 나타낸다. A 에 기재된 것과 같이, M2 항-Flag-아가로스 항체의 비특이적 면역침강 대조구들 (Cneg)을 실시하였다.

도 3 은 GRK2 가 어떻게 MKK6_CAM에 의해 p38 활성화를 감소시킬 수 있는지를 보여준다. 도 3A: 6 또는 12 개의 웰을 갖는 다중 웰(multiwell) (M6 또는 M12) 에 정상적으로 접종된 HEK 293 세포들을, pCDNA3-Flag-p38α, pCDNA3-MKK6_CAM, 및 증량의 pCDNA3-GRK2 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 이 실험에서, M6 플레이트들을 사용하였으며, 도입된 DNA 양은: 100 ng 의 Flag-p38, 100 ng 의 MKK6_CAM, 및 0 내지 1 ㎍ 의 GRK2. 모든 포인트들에서, DNA 총 양은 pCEFL-EGFP로, 그리고 대조구의 경우 (CTRL), pCDNA3-MKK6_CAM 대신 공(empty) pCDNA3 로 완료하였다. 48 시간 후, 세포들을 M2 버퍼 중에서 용해시켜 수확하였다. 상부 패널은 과잉발현된 GRK2 투약을 나타낸다. p38 활성화 상태를 Cell signaling의 항-포스포-p38을 사용하여 최초 면역검출의 항체 방출 후, 이를 동일한 회사의 총 항-p38을 이용하여 검출하였다. 전개의 낮은 해상도의 채도(saturation)를 피하기 위해, 매우 약간 노출된 자기방사사진들을 나타내었음에 유의한다. 도 3B: pCDNA3-GRK2로 안정하게 형질감염되어 이에 따라 두 개의 상이한 GRK2 수준을 과잉발현하는, EBNA 293 세포들의 두 개의 거대-배양물들을 Flag-p38 및 MKK6_CAM으로 형질감염시켰다. Flag-p38 활성화 상태를 A에서와 동일한 방법으로 결정하였다. 또한, Upstate Biotechnology의 항-MKK6/SKK3 항체를 사용하여, 정확한 MKK6_CAM 발현을 보장하였다.

도 4에서, 실험들은 GRK2 가 p38의 촉매 활성을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 4A: p60에 접종된, HEK 293 세포들을, 0.5 ㎍ 의 pCDNA3-Flag-p38α, 0.5 ㎍ 의 pCDNA3-MKK6_CAM (또는 대조구에서 0.5 ㎍ 의 공 pCDNA3, CTRL), 및 1 또는 2 ㎍ 의 pCDNA3-GRK2 (+) 벡터를 사용하여 일시적으로 형질감염시켰으며, 각 포인트는 이중으로 실시하였다. 대조구들을, pCDNA3-GRK2 ㎍을 pCEFL-EGFP (-)으로 치환하여 병렬 방식으로 실시하였다. 총 DNA 양을 공 pCDNA3으로 완료하였다. 48 시간 후, 세포들을 분해하고, 용해물 분액을 취하고, Flag-p38 을 이들로부터 면역침강시켰다. A 의 패널들은 GRK2 (항-PF2) 및 MKK6_CAM (항-MKK6) 과잉발현 및 Flag-p38 (항-포스포-p38) 활성화를 나타낸다. 도 4B: 면역침강물들을 15 ml 의 M2 버퍼로 3 회, 그리고 ATP 없이 15 ml의 인산화 버퍼로 2회 세척하였다 (15mM NaF, 25 mM 헤페스 pH 7.5 및 10mM 마그네슘 아세테이트). 마지막 세척 단계에서, 아가로스-면역 복합물들을 1 ml 버퍼 중에 재현탁시키고, 각 포인트의 10% 를 분리하여 Flag-p38의 면역침강을 제어하였다 (섹션 B의 그래프에 삽입된 패널). 키나아제-분석을 면역침강된 Flag-p38으로, APRTPGGRR 펩티드 (CalbioChem에 의해 최초로 제 공되고, 이어서 CBMSO의 Servicio de Quimica de Proteinas (Protein Chemistry Service)에 의해 합성됨)를 기질로서 사용하여 실시하였다. 반응들을 최종 부피 25㎕ 로, 25 mM 헤페스 pH 7.5; 10 mM 마그네슘 아세테이트, 15 mM NaF, 50μM ATP 및 l500-1000 cpm/pmol [g-³²P] ATP 및 2 mM 의 펩티드 기질에 의해 형성된 인산화 버퍼 중에서 실시하였다. (+SB)가 특정된 경우, SB203580을 0.5 μM의 최종 농도로, 시험관 내 반응에 첨가하였다. 인산화가 30 ℃ 에서 30 분 동안 일어나도록 두고, 그 후 15 ㎕의 30% TCA를 첨가함에 의해 이를 중단시켰다. 단백질들을 원심분리(25000 xg, 15 분, 4℃)에 의해 침전시키고, 인산화된 펩티드를 함유하는 상등액을 각 반응물로부터 회수하였다. 정사각형 (1 cm x 1 cm)의 Whatman P81 용지 절취물들을 용액 중 펩티드로 함침시켰다 (impregnated). 이들을 건조되도록 두고, 75 mM 인산으로 충분히 세척하고, 흡수된 펩티드에 포함된 방사성을 체렌코브법에 의해 정량하였다. 활성 수준들은, MKK6_CAM (CTRL) 부재 하에서 Flag-38에 의한 펩티드 기질 인산화를 참조한다.

도 5 는 GRK2 수준의 감소가 제 위치에서의 (in situ) MKK6_CAM 에 의한 보다 큰 p38 활성화를 허용함을 보여준다. 도 5A: M6 플레이트들에 접종된 HEK 293 세포들을 150 ng 의 pCDNA3-Flag-p38α, 50 ng 의 pCDNA3-MKK6_CAM를 사용하여, 그리고 증가량의 pCEFL-GRK2 안티센스 (AS) 벡터를 사용하여 일시적으로 형질감염시켰다: 0.5 ㎍ 내지 2 ㎍ 또는 동량의 pCEFL-EGFP 를 대조구로서 사용하였다 (C). 모든 포인트들에서, 총 DNA 양을 공 pCEFL 벡터로 완료하였다. 세포들을 분해시키고, 총 양의 GRK2 (상부 패널, 항-PF2), p38 활성화(중간 패널, 항-포스포-p38) 및 총 p38 (하부 패널, 항-p38N)의 면역검출을 각 포인트에서 실시하였다. 대표적인 시험의 2 ㎍ (GFP 및 안티센스의) 포인트로부터의 데이타를 그래프에 나타내었다. 두 개의 조건 각각에서의 p38 활성화 수준은 MKK6_CAM 없는 그들의 개별적인 대조구들을 참조한다. 도 5B: 기저 p38 활성화가 GRK2 양에 의해 조절되었다. HEK 293 세포들의 M6 플레이트들을 100 ng 의 pCDNA3-Flag-p38α 및 0.5 ㎍ 내지 2 ㎍ 의 pCEFL-GRK2 안티센스 또는 pCEFL-EGFP를 이용하여 일시적으로 형질감염시켰다. 각 포인트에서의 총 DNA 양을 pCEFL로 완료하였다. GRK2 (항-PF2, 상부 패널)의 총 량, p38 활성화 상태 (중간패널, 항-포스포-p38, 화학발광 전개 동안 과잉노출된 자기방사법) 및 총 p38 (하부 패널, 항-p38)을, 이들 조건 하에서 전기 전이 및 면역 검출에 의해 평가하였다. 세 개의 독립적인 연구들로부터의 데이타의 평균 값들 (+ SEM)을 도면의 아래부분의 그래프에 이중으로 나타내었다. *p<0.005 를 사용하여, 양측 스튜던트 t-검정 통계치를 유의성을 결정하는데 적용하였다.

도 6A 및 도 6B 는 그의 완전한 구조적 결정인자들을 가진 p38 만이 GRK2 기질임을 보여준다. 도 6A: GST (단백질 도식에서 검은 직사각형)에 융합된 단백질들을 플라스미드 pGEX2T-p38α, pGEX4T-Mxi2 및 pGEX4T-Mxi2Δ17로 형질전환된 박테리아로부터 정제하였다: p38α Mxi2 및 Mxi2Δ17. Mxi1 동종체들을 GRK2 인산화 자리를 제한하기 위한 C-말단 절단된 돌연변이로서 사용하였다. 재조합 GRK2 (200 nM)를 각 융합 단백질 0.5 ㎍ 와 함께, 인산화 버퍼 중에서 (25 mM 헤페스 pH 7.5, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 50μM ATP, 2000-3000 cpm/pmol [γ³²P]ATP) 30 분 동안 30℃ 까지 인큐베이션하였다. 헤파린 (150 nM)을 특이적 GRK2 저해제로서 포함시켰다. 반응들을 SDS 중단 버퍼를 첨가하여 중지시켰다. 샘플들을 8% SDS-PAGE 중에서 분해시켰다. 동일한 양의 단백질의 포함을 보장하기 위하여, 이들을 쿠마씨 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue: CBB) 염색에 의해 겔 중에서 1차적으로 가시화하였다. 그 후, 겔을 건조시키고, 단백질들에 포함된 방사성(³²P)을 검출하였다. 도 6B: 마지막 80 개의 p38α 아미노산에 대응하는, 절단된 GST-280-360p38 단백질을, Invitrogen Gateway 시스템에 의해 생성하였다. p38 N-말단으로서 Mxi2Δ17 을, C-말단으로서 280-360 p38 을 사용하고, 전체 p38α을 사용하여 상기 섹션 A에서 설명된 것과 동일한 조건 하에서, 인산화 분석을 실시하였다. 상기 인산화를 자기방사법 (³²P)에 의해 검출하고, 분석에 사용된 단백질의 양의 대조구들을 항-GST 항체를 이용한 웨스턴 분석에 의해 동시에 실시하였다. 인산화되지 않은, GST-280-360p38 단백질의 존재가 명백히 관찰되었다. STD, 표준 분자량 단백질들의 이동도.

도 7 은 GRK2 가 단일 잔기 중에서 p38을 인산화하는 것을 보여준다. 도 7A: GRK2에 의한 p38 인산화가 2차원적 전기영동으로 분석되었으며, 이는 상기 설명된 것과 같은 동일한 조건 하에서 일어나도록 두었다. 등전점전기영동(isoelectrofocusing) 부하 버퍼를 첨가함에 의해 반응을 중지시켰다. 첫 번째 전기영동 차원은 pH 3 내지 10의 양쪽성전해질 (ampholyte) 구배를 가졌다. 두 번 째 차원은 8% 폴리아크릴아미드 겔에 의해 분석되었다. 두 단백질들 (GRK2 79.6 kDa; GST-p38 68 kDa)의 이동도를 화살표로 나타내었다. 도 7B: 비-방사성 인산화 분석으로부터의 샘플들을 프로테옴성 (proteomic) 서열화용으로 의도된 겔에 적용하였다. 밴드(bands)를 가시화하기 위하여 상기 겔을 염색하고, GST-p38 에 대응하는 것을 겔로부터 잘라내어 트립신 절단에 투입하였다. 결과의 펩티드들을 MALDI-TOF에 의해 분석하였다. 수득된 질량 스펙트럼 영역의 확대를 나타내었으며, 여기에서 GRK2 에 의한 인산화로부터의 샘플에만 존재하는 인산화된 펩티드 (1,945.330에 대응하는 질량)이 검출되었다.

도 8A 및 8B 는 GRK2 가 단일 잔기 중의 p38을 인산화하는 것을 보여준다. MALDI-TOF (Broker Autoflex 모델)에서 수득된 데이타를 이용하여, 인산화를 이끌기 위한 후보자인, 트립신성 펩티드를 동정하였다: LTDDHVQFLIYQILR. 이들 표시들을 입증하기 위하여, 샘플을 HPLC-ESI-IT (Thermo-Finnigan Deca-XP 모델)에 의해, SIM (단일 이온 모니터링)으로 작업하여 상기 분석기가 후보 펩티드만을 절편화하도록 하여 분석하였다. 한 시리즈(절편화 진행에 따라, b_n 또는 y"_n라고 함)를 인식가능한 펩티드 매스(masses)에 지정하였다. 분석된 펩티드 중에 존재하는 트레오닌에서의 인산화를 나타내는 Δb₈ 시리즈 (오렌지 디스크 중)에 대응하는 매스가 하부 스펙트럼에서, 인산화된 샘플로부터 나타난다. 유사하게, 펩티드의 총 매스를 (황색 타원 내) 두 경우들 모두에서 확인하였다. 도의 우측에 삽입된 작은 윈도우 (window)는 인산화된 샘플 및 대조구로부터의 동일한 펩티드의 HPLC 컬럼 중 에서 구분되는 용출에 대한 정보를 보여준다. 친수성이 보다 큰 경우, 인산화된 펩티드는 몇십분의 일초 전에 용리된다.

도 9 는 p38 T123A 및 T123D 돌연변이들이 GRK2에 의해 시험관 내 인산화되지 않음을 나타낸다. 도 9A: GST에 융합된 p38T123A 및 p38T123D 단백질들을, 원핵성 발현 플라스미드 pGEX2T 중에서의 유도된 돌연변이생성에 의해 만들었다. 야생형 GST-p38WT 단백질에 비하여, 도에 나타낸 최종 농도에서, 재조합 GST-p38T123A 및 GST-p38T123D 단백질들의 GRK2 기질이 되는 능력을 분석하였다. 상부 패널은 수득된 인산화 (³²P)를 나타내고, 하부 패널은, 항-p38N WB에 의한, 분석에 사용된 재조합 단백질의 양을 나타낸다. 도 9B: p38α의 대표적인 도식으로, 여기에서 키나아제 도메인 연장부, 그 안의 TGY 활성화 단편 및 GRK2에 의해 가설적으로 조절된 LTDD 서열의 위치와 같은 동일 기능성 특징들을 강조하여 나타내었다. 기질 제어 및 활성화제 연합에 초기 관여하는 CD 모티프도 강조하여 나타내었다.

도 10 은 트레오닌 123이 매우 보전성이 높은 잔기로, p38 활성화제 및 기질들에 대한 도킹(docking) 홈의 외측 표면에 위치되어 있음을 보여준다. 나타나는 다중 정렬들은 Dr. Perdiguero에 의하여, ClustalX 프로그램 (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)에 의해 만들어졌다. 대시들(dashes)은 정렬을 조정하기 위한 갭들을 도입한다. 모든 동종체들 중 동일한 잔기들을 황색 바탕에 붉은 글씨로 강조하여 나타내었으며, 청색 및 녹색 바탕은, 크거나 작은 분포에 따라, 각각 정렬된 단백질들간의 보존성 치환들을 나타낸다. 비-보존성 아미노산들 은 백색 바탕 상에 그대로 두었다. 컨센서스(consensus)는, 각 다중 정렬의 말단에 나타내었으며, 적색 타원들에 의해, 트레오닌 123 영역을 강조하여 나타내었으며, 아래 부분에서의 서열 비교에서 추가적으로 화살표로 표시하였다.

도 11 은, p38T123D 돌연변이가 MKK6_CAM 에 의해 활성화되지 않고, 시험관 내 ATF2 상에서 키나아제 활성이 없음을 보여준다. 도 11A: 인산화 분석 (25 mM 헤페스 pH 7.5; 10 mM 마그네슘 아세테이트, 15 mM NaF, ATP 50μM 및 1000-2000 cpm/pmol [γ-³²P]ATP)을, 융합 단백질 GST-p38WT, GST-p38T123A 및 GST-p38T123D (150 nM)을 재조합 MKK6_CAM (40 ng) 인산화 기질들로서 사용하여 시험관 내에서 실시하였다 (Upstate Biotechnology). 반응을 30℃ 에서 30 분 동안 실시하고, 단백질들을 8% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 각 포인트에서의 p38의 양을, 쿠마씨 블루 염색에 의해 가시화하였다. 그 후, 각 p38 동종체에서의 방사능을 측정하였다. 자기방사법 (³²P)은, 이중으로 실시된, 세 개의 독립된 분석들 중 대표적인 실험을 나타낸다. 도 11B: 이들 동일한 분석들 중, MKK6_CAM-활성화된 GST-p38WT, GST-p38T123A 및 GST-p38T123D의 GST-ATF2 2㎍ 를 인산화하는 능력이 평가된다. 총 GST-ATF2 대조구 (쿠마씨 블루)의 대표적인 자기방사사진 (³²P)을 첨부하였다.

도 12 는 p38 트레오닌 123이 MEF2A 기질 상에서의 정확한 촉매 활성을 위해 필요함을 보여준다. 도 12A: 도에서 나타낸 융합 단백질을 사용하여, 재조합 MKK6_CAM (40 ng) 및 2 ㎍의 GST-MEF2A의 존재 (+) 또는 부재 (-) 하에, 시험관 내 인산화를 실시하였다. 분석이 일어나도록 30 분 동안 방치하였다. 단백질을 8% SDS-PAGE에서 분리하고, CBB 로 염색하고, 포함된 방사성 (³²P)을 검출하였다. 독립적으로 실시된 세 개의 분석들의 대표적인 실험의 패널들을 제공하였다. 도 12B: MKK6_CAM 활성화제 부재 하에서 세 개의 p38 융합 단백질들의 기준선(baseline) 활성을, 상기 기재된 조건 하에서 평가하였다. 장시간 노출 후 대표적인 자기방사사진을 나타내었다.

도 13 은 p38 T123D 돌연변이가 야생형 p38 보다 제자리에서 MKK6_CAM 에 의해 덜 활성화됨을 보여준다. 상기 설명된 것들과 유사한 과잉발현 실험들에서, 항상 이중으로, M6 에 접종된 HEK293 세포들을 150 ng 의 pCDNA3-Flag-p38αWT, 또는 pCDNA3-Flag-p38αT123D 및 50 ng 의 pCDNA3-MKK6_CAM, (또는 공 pCDNA3)으로 형질감염시켰다. 항-포스포-p38 항체를 이용하여 p38 활성화를 평가하였다. 두 개의 동종체들 각각에 대해, MKK6_CAM 에 의한 활성화는 기준선 상황을 참조하여, 특정의 활성화 수준을 수득하였다. 각 실험에서 p38αWT 활성화로서 100% 활성화를 수립하였다. 세 개의 독립된 실험들의 데이타 (SEM)를 나타내었다. 양측 스튜던트-t 검정을 실시하고, *p<0.0001 를 수득하였다. 우측 패널들 (웨스턴 블롯)은 실험들 중 하나를 예시한다.

도 14 는 p38 T123D 돌연변이가 기질들에 결합하지 않고, 또한 MKK6에 의해 인산화되거나 또는 연합되지 않음을 보여준다. 정제된 GST-p38 및 그의 T123 돌연 변이들 (300 nM)을 풀 다운 (pull down) 분석에서 정제된 MKK6 (3 nM) 또는 His-태그된(tagged) MAPKAPK2 (MK2, 20 nM) 존재 하에 음성 대조구로서 GST와 함께 인큐베이션하였다. 침전된 단백질들을, 항-MKK6, 항-히스티딘 (His-MK2에 대해) 또는 항-GST (GST-p38s의 총 양에 대해) 항체들을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 전개하였다. 모든 패널들에서, 결과들은 이중으로 수행된 세 개의 독립적인 실험들을 대표한다.

도 15는 GRK2 가 섬유아세포의 지방세포로의 p38-의존된 분화를 어떻게 감소시키는지를 보여준다. pCDNA3-GRK2 및 pCDNA3-GRK2K220R로 안정적으로 형질감염된 3T3L1 주들을 만들었다. 세포주들에서 수득된 GRK2 (항-GRK2) 발현 대조구들이, 3T3L1 수준에 비교되어, 포함되었다. 세포들을 표준 분화 처리에 투입하였으며, 15일 후에 세포들을 포르말린으로 고정하고, 지방세포에 의해 축적된 지방들에 결합하는 친지성 안료인 오일 레드 (Oil Red)로 염색하였다. 지방세포 표현형을 갖는 세포들 (적색)을 총 25 필드 중에서 현미경 하에서 계수하였다. 두 개의 독립적인 실험들의 대표적인 사진들을 이중으로 나타내었다. 분화 과정동안 인슐린 자극이 없는 3T3L1 세포들의 사진 (대조구)도 포함시켰다. 그래프는 이들 실험들에서 지방세포의 수를 반영한다 (±SEM). 양측 스튜던트-t 검정을 3T3L1 세포들에 대하여 각각 안정한 주에 대해 실시하고, *p<0.0001 을 수득하였다. p38 의존성 대조구들을, 10 μM 의 SB203580을 사용한 약물학적 처리에 의하여 병렬로 실시하였다.

도 16 은 배양물 중 인간 세포들로부터 면역침강된 p38 의 항-포스포-Thr123 항체에 의한 인식 및 GRK2에 의한 p38의 시험관 내 인산화를 나타낸다. 도 16A: HEK293 세포들을 마우스 Flag-p38α 및 GRK2 또는 그의 비활성 돌연변이 (GRK2-K220R)에 대한 발현 벡터들로 형질감염시켰다. 세포들을, 용해 전에 혈청 없이 16 시간 동안 배양하였다. Flag-p38을 항 flag (M2) 항체에 의하여 면역침강시키고, 전기영동 및 전이 후, 인산화된 단백질을, 친화성 컬럼에서 정제된 특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블롯(WB)에 의해 Thr123에서 검출하였다 (P-p38-T123, 희석 1:200). 동일한 막을 총 항-p38 (p38)을 사용하여 전개하였으며, 세포 추출물 중에 함유된 단백질들에 대응하는 또다른 막을 면역침강 (용해물) 전에 항-GRK2 436-689을 사용하여 전개하였다 (GRK2). 도 16B: S GST-p38 (50 nM)을 단독으로, 정제된 GRK2 (150 nM)와 함께 또는 40 ng 의 구성적으로 활성인 MKK6_CAM 와 함께 인산화 버퍼 중에서, 비-방사능 표지된 ATP의 존재 하에, 30℃ 에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상부 패널은 인산화된 형태의 p38의 Thr123 에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 전개되었다. 중간 패널은 p38의 Thr180/Tyr182 잔기들의 인산특이적 항체 (항-Pp38)와 함께 인큐베이션되었으며, 총 p38에 대한 항체가 하부 전개에 사용되었다.

도 17 은 항-포스포 항체가 GRK2에 의해 트레오닌 123에서 인산화된 p38을 인식함을 보여주며, 이는 p38의 T123A 돌연변이는 이러한 조건들 하에서 인식되지 않기 때문이다. GST-p38wt 및 GST-p38T123A (70 nM)을 단독으로, 정제된 GRK2 (25 nM)과 또는 재조합 MKK6CAM (2 ng)과 함께 인큐베이션하였다; 표시된 경우, 특이적 GRK2 저해제인, 헤파린 (100 ng/㎕)을 첨가하였다. GSTp38 단백질들의 인산화를 항-포스포T123를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였으며, 총 GST-p38 는 항-GST를 이용하였다. 데이타는 3 개의 독립적인 실험들을 대표한다.

도 18 은 부분적으로 GRK2-결핍 마우스들로부터 추출된 마크로파지들의 지질 다당류에 반응한 p38 활성화 수준 및 TNF 분비 수준을 나타낸다. 야생형 C57BL/6 (+/+) 또는 GRK2 반접합성(hemizygous) (+/-) 마우스들로부터의 복막 마크로파지. 이들에서 자극을 2시간 동안 없앤 후, 박테리아성 지질다당류 (LPS: 0.5 ㎍/ml)를 배양 매질에 16 시간 동안 첨가하였다. 염증성 시토카인들 (TNFa)의 생산을, 상용 ELISA 키트 (Amersham Biotrak)로 정량하였다. 이 과정의 p38 활성 의존성을 확인하기 위하여, LPS 첨가 전 SB203580 (30 μM)을 30분 동안 사용하였다. 4 개의 독립적인 실험들에서 처리된 10 마리 마우스들의 평균+SD 를 나타내었다. 데이타는 M24의 웰 당 106 세포들로부터 유도된 TNFa 분비에 대응한다. * p<0.005 (스튜던트의 t-검정에 따름).

GRK2 효소에 의한, p38 단백질의 Thr123의 인산화

I. 재료 및 방법

제품

사용된 모든 시약 및 제품들은 분석 등급이다. 염화나트륨, 염화칼슘, 염화암모늄, 염화망간 및 염화마그네슘, 인산 나트륨 및 인산 칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 초산나트륨, 수크로오스, 요소, 트리스(Tris), 포름알데히드, 파라포름 알데히드, 글리신, 빙초산, 염산, 에탄올, 에탄올, 부탄올 및 글리세롤을 머크(Merck)사에 의해 공급받았다. ATP (아데노신 삼인산), 불화 나트륨, 데옥시콜산(deoxycholic acid), EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), EGTA (에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸렌 에테르)-N-N-N'-N'-테트라아세트산), β-머캡토에탄올, DTT (디티오트레이톨), 헤파린, 나트륨 오르토바나데이트, DMSO (디메틸술폭사이드), 폰소 레드 (Ponceau red), 헤페스 (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-2-에탄술폰산), 노니뎃 P-40 (서열번호 P-40), 트리톤 x-100 (Triton x-100), 트윈-20 (Tween-20), 아프로티닌, 트립신 저해제, 나트륨 아지드, 단백질 A-세파로오스는 시그마(Sigma)사에 의해 공급받았다. PMSF (페닐-메틸-술포닐 플루오라이드), 벤즈아미딘(benzamidine), 환원 글루타티온, BSA (소 혈청 알부민) 및 암피실린 및 카나마이신 항생제 및 IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)를 로슈 (Roche)로부터 얻었다. TEMED (N,N,N,N-테트라메틸에틸렌디아민), SDS (나트륨 도데실 술페이트), 암모늄 퍼술페이트, 브로모페놀 블루, 쿠마씨 블루, 알려진 분자량을 갖는 예비염색된 단백질 표준물질들, 니트로셀룰로스지 및 브래드포드 (Bradford) 시약은 바이오-래드 (Bio-Rad)에 의해 공급받았다. 폴린-치오칼토 (Folin-Ciocalteau) 시약은 판리악 (Panreac)으로부터 얻었으며, TCA (트리클로로아세트산)은 카를로-에르바(Carlo-Erba)로부터 얻었다. 방사성 [γ-³²P] ATP 동위원소를 에머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences)에 의해 공급받았으며, 메티오닌-시스테인 대사 마킹 혼합물[³⁵S]을 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear)에 의 해 공급받았다.

구축 및 사용된 플라스미드들

하기 플라스미드들을 본 명세서에서 사용하였다:

GRKs

- 래트 pCMV-GRK3 구축물을 스위스, Lausanne 대학의 Dr. S. Cotecchia에 의해 제공받았다.

- 소 pCDNA3-GRK2, 소 pCDNA3-GRK2-K220R 및 pCDNA3-GRK5 구축물들을, 미국 필라델피아의 Thomas Jefferson 대학의 Dr. J. L. Benovic 의 실험실로부터 제공받았다.

- GRK2의 pCEFL-DNAc 안티센스 구축물을 Dr. C. Shayo로부터 받았다.

p38 MAPK 모듈

- 구조적으로 활성인 돌연변이 pCDNA3-MKK6β(E) (pCDNA3-MKK6β (Glu): MKK6S207E/T211E 를, Centro of Biologia Molecular Severo Ochoa (세베로 오코아 분자생물학 센터) (마드리드) 의 Dr. J. M. Redondo에 의해 제공받았으며, 유사하게, 마우스 pCDNA3-Flag-p38α 구축물 및 pGEX2T-p38α 원핵성 발현 벡터를 제공받았다.

- GST와의 융합 단백질의 제조를 위해 의도된, pGEX4T-Mxi2 및 pGEX4T-Mxi2Δ17 벡터들은 Cantabria 대학의 Dr. P. Crespo 및 Dr. V. Sanz에 의해 기증받았 다.

기타

- 공 pCDNA3 벡터는 Invitrogen 사로부터 얻었다.

- 플라스미드 pCEFL-EGFP 를 Dr. C. Murga (Centro of Biologia Molecular Severo Ochoa)에 의해 제공받았다.

- pBC12BI-β₂-AR 구축물은 Dr. A. Ruiz-Gomez (Centro of Biologia Molecular Severo Ochoa)에 의해 제공받았다.

- Raf-1YY340/341DD 돌연변이를, 영국 글라스고의 Beatson Institute for Cancer Research의 Doctor A. S. Dhillon에 의해 제공받았다.

- pTrcHisB 를 Invitrogen 으로부터 수득하였다.

세포 배양물

수립된 세포주들

몇몇 수립된 세포주들을 사용하였다: HEK293 세포들 (인간 배아 신장)을 Invitrogen으로부터 수득하였으며, COS-7 세포들 (초록색 원숭이 신장 세포) 및 Sf9 (Spodoptera frugiperda: 스포돕테라 프루지페르다) 세포들을 ATCC (미국 균주 보관소)로부터 수득하였다. HEK293 및 COS-7 세포들을 개별적인 P-100, P-60 (Falcon) 플레이트들 또는 멀티웰 M6, M12 또는 M24 (Falcon, Costar) 플레이트들 상에서 단일층으로, 2 mM 글루타민, 10% 소 태아 혈청 및 항생제들의 혼합물 (50 ㎍/ml 젠타마이신, 0.01% 스트렙토마이신 및 0.063% 페니실린 G)으로 보충된, 둘베 코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 상에서 배양하였다.

유사하게, EBNA (HEK로부터 유래되고, EBNA 항원을 암호화하는 플라스미드로 형질감염됨) 세포들로부터 및 네오마이신-내성 pCDNA3-GRK2 벡터로부터 생성된, GRK2를 안정하게 발현하는 두 개의 대량 배양(mass-culture)을 사용하였으며, 따라서 이들은 200㎍/ml 제네티신 (네오마이신 G418, Calbiochem) 존재 하에 배양되었다.

ATCC로부터 수득된 예비지방세포성(preadipocyte) 세포주 3T3-L1, 및 그로부터 생성된 안정한 주들을, 글루타민 및 10% 갓 태어난 소 혈청 (NCS)을 가진 항생제들로 보충된, DMEM 배지에서 유지하였다. 750 ㎍/ml 제네티신을, pCDNA3-GRK2 및 pCDNA3-K220R으로 안정하게 형질감염된 개체군들에 첨가하였다. 지방세포로의 분화 조건은 아래에 상술하였다.

이들 모든 세포 유형들을, 5-7%의 CO₂ 를 가진 습윤된 분위기 중 37℃에서 인큐베이션하였다.

Sf9 세포들을, 3x10⁵ 세포들/ml 밀도의 현탁액 중에서 150 rpm으로 교반하며 배양하거나, 또는 소의 태아 혈청 및 젠타마이신 (50㎍/ml)로 보충된 그레이스 배지 (Grace's medium) (Gibco)에서 P-100 또는 P-150 상의 단일층에서 CO₂ 분위기없이 27℃ 에서 배양하였다.

표준 프로토콜을 사용하여, 뮤린(murine) 파크로파지들 (pacrophages)의 일차 배양물을 수득 및 유지하였다. 필수적으로, Dr. Marc Caron (Duke 대학, 노쓰 캐롤라이나)에 의해 기증받은, 3 월령의 C57BL/6 GRK2 +/+ 및 +/- 마우스들에게 나트륨 티오글리콜레이트 (1ml)를 복강내 주사하였다. 4일 후, 15 ml의 PBS를 사용한 복강내 세척으로 복강 마크로파지들을 단리하였다. M12 플레이트 상의 웰 당 백만개의 세포들을 접종하여, 0.5% FCS로 보충된 RPMI 배지에 부착되도록 하고, 광범위하게 세척하였다. 결과의 마크로파지들을, RPMI 0.5% FCS 중에서 대장균 (Sigma)으로부터의 상세 농도들의 LPS를 이용하여 습윤된 쳄버 내, 37℃ 에서 16 시간 동안 자극되었다 (estimulated).

형질감염

HEK293 및 COS-7 세포들의 일시적 형질감염을, P-100 P-60 플레이트에서 70 내지 80% 사이의 컨플루언스(confluence), 리포펙타민/PLUS (Invitrogen)법에 의해 수행하였다. 대안적인 형질감염 프로토콜들이, 푸진 (Fugene) (Roche), 제트페이 (JetPei) (Poly Transfection) 또는 에스코트-II (Escort-II) (Sigma)과 같은 시약들을 이용하여 사용되었지만, 가장 많이 사용된 프로세스는 리포펙타민 프로세스이다. 요약하면, 형질감염 하루 전날, 1.5×10⁶ 세포들 (HEK293)을 P-60 에 의해 도말하거나 또는 사용된 플레이트의 표면에 상관적으로 비례하는 다수의 세포들을 도말하였다. 이 시점 이후부터, 상기 프로토콜들을 P-60 플레이트로 언급한다. 다음날, (1) 고순도 플라스미드성 DNA (Quiagen 에 의해 공급된 친화성 컬럼에서 단리되고 MilliQ 멸균수 중에 재현탁됨) (P-60의 경우 3-5 ㎍), PLUS 시약 (P-60에 대해 8 ㎕) 및 OPTIMEM (Gibco, BRL), (P-60에 대해 250 ㎕)의 혼합물을 제조하고, 이를 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 각 실험에서, 필요량의 공벡터 (일반적으로, pCDNA3)를 첨가하여, 플레이트 당 DNA 의 총량을 일정하게 유지하였다. 병렬식으로, 또다른 튜브에, 리포펙타민 (P-60에 대해 12 ㎕)을 (2) OPTIMEM (P-60에 대해 250 ㎕)과 혼합하고, 인큐베이션하였다. 15 분 후, (1) 및 (2)를 동일한 비율로 혼합하고, 제조된 혼합물을 추가로 15 분 동안 인큐베이션하고, 이를 OPTIMEM (P-60 당 2 ml)으로 미리 커버된 플레이트들 상에 최종적으로 쏟았다 (최종 반응 혼합물: P-60에 대해 0.5ml). 세포들을 형질감염 배지 중, 37℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션하였으며, 그 후 상기 형질감염 배지를 제거하고, 10% 혈청으로 보충된 DMEM 배지로 치환하였다. 다음날, 배지를 신선한 배지로 교환하고, 세포들이 회복되도록, 실험을 위해 배양물을 가공하기 전 적어도 24 시간 동안 두었다. 일반적으로, 세포들의 처리, 수집 및 용해는 형질감염 후 48 시간에 하였다.

GRK2 및 p38MAPK

GRK2 및 Flag-p38α 연합 실험에서, 1:1:1 비의 GRK2 (또는 GRK2-K220R), Flag-p38α 및 β₂-아드레날린 수용체를 사용하였다 (일반적으로, 각 p60 당 1㎍ ). 증가하는 투여량으로 GRK2의 과잉발현 분석들 중, 6 또는 12 (M6 or M12)의 다중웰 플레이트들에 정상적으로 접종된 HEK293 세포들을 pCDNA3-Flag-p38α, pCDNA3-MKK6_CAM, 을 사용하고, 증가하는 양으로 pCDNA3-GRK2 벡터를 사용하여 형질감염시켰 다 (도에 나타냄). 일반적으로, 100 ng 의 Flag-p38α, 100 ng 의 MKK6_CAM, 및 0 내지 1 ㎍의 GRK2를 M6에 대해 사용하였다. 모든 포인트들에서, DNA의 총량을 pCEFL-EGFP로 완료하였으며, 대조구 포인트들의 경우, pCDNA3-MKK6_CAM 대신, 공 pCDNA3을 사용하여 완료하였다.

M6 다중웰 플레이트에서의 GRK2 안티센스 DNA 형질감염에서, 사용된 DNA의 양은 다소 상이하였다: 150 ng의 pCDNA3-Flag-p38α, 50 ng의 pCDNA3-MKK6_CAM, 및 0.5 ㎍ 내지 2 ㎍의 pCEFL-GRK2 안티센스 (AS) 벡터 또는 동량의 pCEFL-EGFP. 모든 포인트들에서, DNA의 총량은 공 pCEFL 벡터로 완료되었다.

유사한 과잉발현 분석에서, M6 중의 세포들은 일시적으로, 150 ng의 pCDNA3-Flag-p38αWT, 또는 pCDNA3-Flag-p38αT123D 및 50 ng의 pCDNA3-MKK6_CAM (또는 공 pCDNA3)을 이용하여 항상 이중으로 형질감염되었다.

상이한 단백질들의 일시적 발현을, 각 경우에서 특정된 것과 같은 특이적 항체들을 사용하여, 세포 용해물들 (세포 용해물의 총 부피의 약 10%)을 전기영동 후 면역검출 (웨스턴 블롯)에 의해 분석하여 확인하였다.

세포 처리

일시적으로 형질감염된 세포들의 자극 처리를, 형질감염 후 48 시간에 모든 경우들에서 실시하였다. 상이한 제제를 사용하여 자극후, 세포들을 차가운 인산염 완충 생리식염수 (PBS)로 세척하고, 스크래퍼로 수집하였다. 세포들이 수집된 용 해 버퍼는 실시될 특이적 면역침강법에 따라 달라진다 (면역침강법 섹션 참조).

10 μM 이소프로테레놀 (Sigma)을 이용한 HEK293 세포들의 자극을 혈청 없는 배양 배지에서 37℃ 에서 실시하였다. 이들 실험에서, 혈청에 존재하는 화합물들로부터의 자극들을 모방하기 위한 목적으로, 자극 전 약 2 시간 동안 세포들을 혈청 없이 (혈청 결핍) 유지하였다.

0.5 M NaCl (Merck)을 이용한 자극을, 세포 인큐베이터 중에서 15 분 동안 실시하였다.

지방세포 분화

세포 배양을 NCS 혈청의 10% DMEM 배지를 사용하여 실시하였다. 그러나, 하기 기재된 전체 분화 프로세스는, 음이온 교환 수지 및 활성탄 상에서 태아 소 혈청의 연속적인 흡수물에 의하여, 고갈된 AXC 혈청 (이온 교환 수지)에서 수행되어야만 한다. AXC 혈청은 Instituto of Investigaciones Biomedicas (생물의학 연구회)의 키친 서비스에 의해 제공받았다. 세포들을 그들의 컨플루언스까지 배양하고, 4 μM의 비오틴(Sigma)으로 보충된 DMEM-10% AXC 배지에 도말하였다 (P-100에서 5 x 10⁵). 다음날, 상기 배지를 신선한 배지로 교환하였다. 컨플루언스에 다시 도달될 때까지, 세포들을 또다른 3일 동안 배양하였으며, 상기 컨플루언스 도달 일을 "0" 일로 하였다. 분화 0일에, 상기 세포들을 0.5 μM 덱사메타손 (Sigma), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IMBX, Sigma) 및 1 μM 인슐린 (Sigma)을 함유 하는 배지에서 배양하고, 여기에서 그들을 또다른 3일 동안 유지하였다. 3 일째에, 이 지방생성 초기화 처리의 배지를 4 μM 비오틴 및 1 μM 인슐린으로 보충된 DMEM-10% AXC으로 교환하고, 여기에서 남은 분화를 일어나게 하며, 상기 배지를 매 3일마다 교환하였다. 6일부터 15일까지, 세포질 중의 지방세포에 의해 축적된 지방의 액적에 결합하는 친지질성 구조의 적색 착색제인, 오일 레드(Oil Red)를 사용한 염색에 의해 지방생성을 분석하였다. 이를 위하여, 상기 세포들을 5 분 동안 포르말린 (3.7% 포름알데히드)으로 고정시키고, 냉 PBS 로 세척하였다. 이들을, 미리 여과된 60:40 (v/v) 오일 레드 (0.2% 이소프로판올 w/v 중에 용해됨) 및 수 용액과 함께 인큐베이션하였다. 이들을 PBS 로 충분히 세척하고, 세포들을 광학 현미경 하에서 가시화하였다. 세포들을 각 실험 플레이트 당 총 25 필드에서 계수하였다.

돌연변이 생성

점 돌연변이들

대부분의 돌연변이들은 Stratagene QuickChange 유도 돌연변이생성 프로토콜에의해 생성되었다. 요약하면, 열 사이클러 (thermal cycler) (Applied Biosystems Gene Amp®9700)에서 실시된 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 사용한 항-평형(anti-parallel) 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드들 - 이들을 각 특정 돌연변이에 대해 하기에 나타내었다 -을, 열안정성 Pfu 를 중합효소로서 사용하여 제조하였다. 완전히 증폭된 벡터들을 DpnI로 절단하여 몰드 및 모체 (parenteral) DNA를 제거하고, 절단 생성물을 경쟁 박테리아 내로 형질전환시키고, 그로부터의 돌연변이 포함은, 각 유형의 플라스미드(Sp6, T7, T3, 또는 pGEX 벡터들 중 클론된 단백질의 서열화에 대해 특이적인 것들)에 대한 특이적 프라이밍 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 SIDI (Servicio Interdepartamental of Investigacion, Interdepartmental Research Service (각 부처간 연구 서비스))에서 서열화함에 의해 확인할 수 있었다.

p38T123A

- 올리고뉴클레오티드 FWD: 5' GTG AAG TGC CAG AAG CTG GCC GAC GAC CAC GTT CAG 3' (서열번호 3)

- 올리고뉴클레오티드 REV: 5' CTG AAC GTG GTC GTC GGC CAG CTT CTG GCA CTT CAC 3' (서열번호 4)

돌연변이원성 PCR 생성물들을, pCDNA3 중의 p38의 ORF (오픈 리딩 프레임: open reading frame)를 라이닝(lining)하는 프라이밍 뉴클레오티드 SP6 및 T7 을 사용하거나, 또는 Amersham pGEX 플라스미드 계열들을 서열화하는데 특이적인 뉴클레오티드들을 사용하여 서열화하였다

p38T123D

- 올리고뉴클레오티드 FWD: 5' GTG AAG TGC CAG AAG CTG GAC GAC GAC CAC GTT CAG 3' (서열번호 5)

- 올리고뉴클레오티드 REV: 5' CTG AAC GTG GTC GTC GTC CAG CTT CTG GCA CTT CAC 3' (서열번호 6)

절단된(truncated) 돌연변이들

p38α의 마지막 80 개 아미노산들에 대응하는, 절단된 단백질 GST-280-360p38을 Invitrogen Gateway 시스템을 사용하여 생성하였다. 재조합효소에 의한 이 다가 클로닝 방법은, 진핵성 및 원핵성 숙주에 대한 다수의 플라스미드에서 몇 개의 에피토프들을 이용하여 관심 대상의 단백질 또는 단백질 절편의 발현을 가능하게 한다.

먼저, 재조합효소의 타겟인, attB 서열들의 포함을 허용하는 올리고뉴클레오티드들을 설계하여 번역되기를 원하는 p38α의 ORF 영역을 라이닝하는 것이 필요하였다. 이들은, Gateway 로부터 얻었으며, GTW라 칭한다. 상기 올리고뉴클레오티드 GTW-FWD 를, 번역될 p38의 최초 아미노산이 (Ala 281, 뉴클레오티드 서열에서 밑줄 표시됨) attB1 서열과 일치되도록 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 GTW-REV 는 번역의 종결 코돈을 포함한다 (이 또한 밑줄 표시됨). 플라스미드 pGEX2T-p38α를 PCR에서 몰드로서 사용하였다.

- 올리고뉴클레오티드 GTW-FWD: 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGC TGT CGA CCT ACT GGA GAA GAT G 3' (서열번호 7)

- 올리고뉴클레오티드 GTW-REV: 5' GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCA GGA CTC CAT TTC TTC TTG GTC 3' (서열번호 8)

240 bp PCR 생성물의 pDONOR^TM201 벡터로의 클로닝을, BP-클로나제 반응에 의해 실시하였으며(25℃에서 적어도 1 시간 동안), 이는 attB 서열들에 의해 매개된, pDONOR 벡터를 이용한 PCR 생성물의 재조합으로 이루어진다. 상기 반응을 프로테나아제-K를 10분, 37℃ 에서 첨가함에 의해 중단시켰다. 재조합 생성물인 DNA를, 카나마이신으로 선택된, DH5α 박테리아를 형질전환하는데 사용하였다.

이어서, 의도된 플라스미드를 선택하였다: pDEST15, 이는 그 안에 클로닝된 단백질의 진핵성 발현을, 재조합 서열들로부터 GST의 상에서, 융합으로서, 보장한다. (p38의 C-말단 단편도 진핵성 발현 플라스미드 pDEST27 내로 도입되었으나, 상기 결과들은 생략하였다). 상기 LR-클로나아제 반응을, 도입 클론 (pDONOR-280-360p38) 및 선형화된 pDEST15 벡터를 사용하고, 효소적 LR-클로나아제 혼합물과 함께 25℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 실시하였다. 상기 샘플을 프로테나아제-K과 20 분, 37℃ 에서 인큐베이션함에 의해 반응을 중단시키고, attB 올리고뉴클레오티드들로 서열화하여 적절한 확인 후, 수득된 DNA를 BL21 박테리아를 형질전환하는데 사용하였으며, 그로부터 GST-280-360 p38 구축물을 정제하였다.

DNA 서브클로닝

C-말단 히스티딘 태그를 가진 MAPKAPK2 (MK2)의 발현 및 정제를 위해, 보다 안정한 발현을 위해 프롤린-풍부 N-말단 영역에서 결실된 플라스미드 pFtx5-MK2DN1을 Dr. Phil Cohen (Dundee 대학, 스코틀랜드, 영국)로부터 수득하였으며, 하기 프라이머들을 사용하는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다:

5' GGG GCC ATG GTC AAG TCC GGC C 3' (서열번호 9) 및

5' CCCC CTC GAG GTG GGC CAG AGC CGC AGC 3' (서열번호 10).

생성물은 pTrcHis2B 벡터 (Invitrogen) 중에서 서브클로닝된 NcoI-XhoI (진한 글씨) 이었다.

정제된 재조합 단백질 및 폴리펩티드들

활성화된 MEKK6/MEKK3을 Upstate에 의해 제공받았다.

배큘로바이러스 중 GRK2 구축물로 감염된 Sf9 세포들로부터 GRK2의 정제를 Dr. A. Ruiz-Gomez 에 의해 실시하였다.

통상적인 방법에 따라, 소 망막으로부터 로돕신을 정제하였다. 그에 따라 수득된 제제에는 로돕신이 단백질의 90% 이상이다 (쿠마씨 블루 염색으로 입증됨).

융합 단백질들 GST-p38, GST-ATF2, GST-MEF2A, GST-Mxi2, GST-MxiD17 및 GST-280-360p38, GST-p38T123A 및 p38T123D 을, 간단히 기재한 통상적인 방법들에 따라 정제하였다: 상기 구축물들을 대장균 박테리아 내로 형질전환시키고, 그들의 발현을 IPTG 를 사용하여 유도하였다. 상기 박테리아를 10mM Tris-HCl pH 8, 1% TritonX-100, 2 mg/ml 리소자임 및 프로테아제 저해제들 중에서 침전 및 용해시켰으며, 그 후 박테리아성 용해물을 초음파처리하고 청징화하였다. 이를 글루타티온-세파로오스4B®(AmershamBiosciences) 컬럼에 로드(load)하고, 이를 최소 3 시간 동안 통과시키고, 상기 컬럼을 PBS로 세척하였으며, 그 후, 단백질들을 50 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM 환원 글루타티온 (Sigma)으로 용리하였다. 수득된 단백질들 의 순도 및 농도를 변성 폴리아크릴아미드-SDS 겔에서 확인하였다. 이들 단백질들을 암호화하는 플라스미드들의 기원은 이전 섹션에서 특정되었으며, 또는 그들이 본 발명자들에 의해 생성된 경우, 적절한 곳에 지정되었다.

MBP (미엘린 기초 단백질) 또는 PHAS-I (인산화되고, 인슐린에 의해 열 및 산에 안정하게 조절됨)와 같은 특이적 p38 기질들을 SIGMA 및 Stratagene 각각으로부터 수득하였다. p38 키나아제와의 인산화 반응에 사용된 MAPKs의 특이적 기질로서 기재된, APRTPGGRC 펩티드는 CBMSO의 Servicio Proteomica (프로테옴 서비스(Proteomic Service))에 의해 합성되었다. pH 7.6, Tris 20 mM 중 0.5 mM 의 최종 농도로 용해시켰다.

단백질 측정을, 브래드포드법에 의해 또는 로우리 법 등에 의해, 소 혈청 알부민을 표준 주를 구축하기 위한 표준물질로서 사용하여, 실시하였다.

전기영동

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동

1차원 겔

SDS-폴리아크릴아미드 겔들을, Laemmli 에 의해 기재된 방법에 따라 사용하였으며, 그의 아크릴아미드-비스아크릴아미드 백분율은 실험에 요구되는 분해해능에 따라, 7 내지 12%의 범위였다. 하기 단백질들을 분자량 표준물질로서 사용하였다: 미오신 (200 kDa), β-갈락토시다제 (116.25 kDa), 포스포릴라제 B (97.4 kDa), 소 혈청 알부민 (66.2 kDa), 오보알부민 (45 kDa), 탄산 탈수효소(31 kDa), 콩 트립신 저해제 (21 kDa) 및 리소자임 (14 kDa) (Bio-Rad의 Rainbow Markers). 몇몇 경우들에서, 상기 겔들을 쿠마씨 블루로 염색하였다. 단백질들을 분해시킨 후, 상기 겔은 단백질들이 [γ-³²P]ATP로 마크된(marked) 경우 자기방사법에 투입되거나, 또는 단백질들이 [³⁵S]-메티오닌으로 마크된 경우 X선 형광투시사진법에 투입될 수 있다. 두 경우 모두에서, 메탄올:아세트산 (50:10) 중에서 20 분 동안의 고정 단계가 요구된다. 대사적 마킹들에서, 신호는 Amplify (Amersham)와 함께 20 분 동안 인큐베이션함에 의해 종종 증폭되었고, 그 후 그 겔을 건조하고 100 NIF의 Agfa Curix RP2 X-선 필름에 노출시켰다.

이차원 겔

p38에서 GRK2 에 의한 인산화의 기질 잔기들의 수의 분석 목적으로, 두 단백질들 모두를 하기 특정한 반응 조건에서 인큐베이션하였다. 결과의 인단백질들을 2차원 겔들 중에 분해시켰다. 등전점전기영동 또는 1 차원 전기영동을, 4% 아크릴아미드-비스아크릴아미드 겔 중에서, 최종 pH 범위 3-10으로 양쪽성 전해질 (Bio-Rad)의 8 M 요소와의 분해성 혼합물을 사용하여 수행하였다. 때때로, Biorad의 예비-조립된 스트립들(IPG 스트립, pH 범위가 3-10)을 사용하여 제 1 차원을 번갈아 실시하였다. 제 2 차원을 8% 겔 SDS-PAGE 중에서 실시하고, 인단백질을 자기방사법에 의해 검출하였다.

핵산의 TAE-아가로오스 겔 전기영동

DNA 절편들의 분리를 0.8-1% 수평 아가로오스 겔 중에서 실시하였다. 사용된 전기영동 버퍼는 TAE (40 mM Tris-아세트산, 2 mM EDTA)이었으며, 샘플들의 충전 버퍼 (charging buffer)는 50% 글리세롤, 0.4% 브로모페놀 블루 및 0.4% 자일렌 블루였다. 분자량 표준물질은 식세포들 및 Φ29의 HindIII에 의한 효소 절단의 단편이었다 (Centro de Biologia Molecular (분자생물학 센터: Molecular Biology Centre)의 발효 서비스에 의해 공급받음).

프로테옴성 서열화

관심 대상의 번역 후 변경의 위치 결정은, Servicio de Proteomica del Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa" (http://www.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/plt_Servicio_Pagina.aspx?IdServicio=29&IdObjeto=118) 내에 포함된, Cardiovascular Network의 Servicio de Proteomica del Nodo UAM (마드리드의 Universidad Autonoma)에 의해 실시되었다.

샘플들을 전기영동으로 분리하고 (SDS-PAGE 8%), 상기 겔을 염색하였다. 분석될 밴드들을 폴리아크릴아미드 겔로부터 잘라내어, 트립신성 절단에 투입하였다 (Promega의 트립신).

트립신성 펩티드들의 혼합물을 MALDI-TOF (매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화-비행시간: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight, Broker의 Autoflex 모델)에 의해 분석하였다. 요약하면, 펩티드 종들은 결정화에 의해 매트릭스에 흡수되고, 그 후 그들은 레이저로부터의 짧은 파동의 투사에 의해 양자화된 형태로 비결합되어 있다. 이러한 샘플 이온화 방법은 비행 시간 분석기에 결합된다. 실제로, 단일-로딩된 펩티드들은 그들의 질량에 비례하여 동력학적 에너지를 획득하며, 그들이 검출기에 충돌할 때까지 진공관을 통해 "비행" 한다. 상기 절단물의 상등액의 소량의 분액 (0.5 ㎕)을, Bruker의 오토플렉스 모델인, 반사경이 장착된 상기 MALDI-TOF 유형의 질량 분광분석기 중에서, DHB (2,5-디히드록시벤조산)를 매트릭스로서 그리고 앵커-칩 표면 (Anchor-Chip surface) (Bruker)을 샘플 홀더로서 이용하여, 직접 분석하였다. 최종적으로 수득된 스펙트럼은, 질량-전하 비율 (m/z)에 따라 분리된 펩티드들에 대응하였다. GST-p38 및 GRK2-인산화된 GST-p38의 단편화 스펙트럼들을 비교하고, 후보 펩티드를 찾았다.

이 표시를 확인하기 위하여, 샘플들을, 개별적인 펩티드들의 단편화 스펙트럼들 (MS/MS)의 수득을 가능하게 하는 다른 유형의 분광계 분석에 투입하였다: Thermo-Finnigan (산 호세, 캘리포니아, 미국)의 전기분무/질량분석기-이온성 트램프 ES/MS-IT, Deca-XP 모델). 이온화 전에, 후자는 액체 샘플들을 이용하여 모세관에서 실시될 수 있기 때문에, 후보 펩티드 (MALDI-TOF에 의해 미리 "의심된")를 RP-HPLC (역상 고압 액체 크로마토그래피: reversed-phase high pressure liquid chromatography)에 의해 분리하였다. 내경이 180㎛ 인 컬럼 (Thermo-Keystone의 0.18 mm x 150 mm BioBasic 18 RP 컬럼)을, "금속 니들-키트" 인터페이스 (Thermo-Finnigan)을 사용하는 미세분무 모드로 1.5 ㎕/m 의 유속으로, 상기 펩티드의 용리 동안(90 분) 용매 B를 5% 내지 60% 의 구배로 사용하였다. 상기 크로마토그래피는 이온성 트램프 질량 분석기에 결합되어 있다. 이 절편화 프로세스에서, 상기 샘플들을 강한 전기장에 투입하고, 그 결과로서 하전된 액적들을 생성하였으며, 이는 용매 증발 후 상기 샘플 혼합물의 펩티드들에 대응하는 이온들을 방출하는 것으로 종료되었다. 이들은, 바람직하게는 N-말단 및 히스티딘, 아르기닌 및 리신의 잔기들에서 다중양자화될 수 있다. 이온성 트램프 분석기는 삼차원적 전기장을 생성하며, 이는 전기분무에 의한 이온화로부터 이온들을 분리하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 절편화 분광 또는 MS/MS 분광이 최종적으로 수득되며, 이는 "SIM" 모드 (단일 이온 모니터링: single ion monitering)로 작업시 후보 화합물의 단편화 스펙트럼으로 제한된다. 샘플들을 고감도 모드 또는"SIM" 모드에서 분석하여, 다음의 m/z를 모니터링하였다: 937.51 및 977.51. "추정적으로" 인산화된 펩티드의 절편화 시리즈들을 이론적으로 예측한 후, 상기 시리즈들 b 및 y의 몇몇 효소들을 수득된 스펙트럼에 지정하였다.

면역-프로토콜

표 I은 사용된 일차 항체를 나타낸다.

전기영동 후 면역검출("면역블롯 또는 웨스턴 블롯")

분석용 샘플들을 (정제된 단백질들, 용해물들 또는 서브-세포 분획, 등), 상용 분자량 표준물질들 (Bio-Rad)과 함께 SDS-폴리아크릴아미드 겔 중에 용해시켰 다. 이렇게 분리된 단백질들을, 75 분 동안 탄산염 버퍼 (3 mM Na₂CO₃,10 mM NaHCO₃, 20% 메탄올 pH 약 10) 중에서의 액체 전이에 의해, 니트로셀룰로오스 필터 (Bio-Rad Transblot)로 이동시켰다 (Bio-Rad Trans-Blot Cell을 이용하여 12 x 14 cm 겔의 경우 50V에ㅓ 또는 120 분 동안 30V에서) . 가능한 비특이적 결합 자리들을 저해할 목적으로, 폰소 레드로 니트로셀룰로스 막을 염색한 후, 이를 5% 탈지분유 (Molico) 또는 5% BSA로 보충된 TBS 배지(10 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl) 중 4℃ 에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 저해 배지를 버린 후, 막을 1% TBS-BSA 중에서 희석된 대응 항체 (표 I)와 접촉시켰다. 1:50,000으로 희석된 제 2 항체 (퍼옥시다아제에 결합된 토끼 항-면역글로불린, 제 1 체가 폴리클로날인 경우, 및 단일클론성 체들의 경우 마우스 항-면역글로불린, 이들 모두 Nordic Immunology사 제품)와 인큐베이션하기 전, 막을 con TBS-Tween 20 내지 0.15%로 3 회 세척하였다 (3 x 10 분). 최종적으로, 전개를 위해, 화학발광법을 사용하였으며, 여기에서 퍼옥시다아제는 H₂O₂ (ECL, Amersham)의 존재 하에 루미놀 기질의 산화를 촉매한다. 노출된 필름의 레이저 농도계에 의해 정량화를 실시하였다 (Molecular Dynamics 300A Computing Densitometer). 폴리클로날 항-포스포-Thr123p38 혈청을, Pacific Immunology에 의해, 면역원으로서 뮤린 p38a으로부터의 펩티드 QKL pT DDHVQFLIYC를 사용하여 토끼에서 생성하였으며, 이어서 두 개의 일련의 펩티드 및 항-포스포 펩티드 친화 컬럼을 통과시켜 정제하였다. 항-His 항체는 Sigma로부터 구입하였다.

p38 및 ERK의 활성의 측정

상이한 활성화 자극들에 의해 유발된 형질감염된 p38 및 형질감염된 ERK의 활성도 측정을, 면역검출법으로 실시하였다. 특정 항체들은 인산화되고 활성인 이들 키나아제들 형태와만 반응한다 (항-포스포 p38 및 항-포스포 ERKs 각각 (표 I의 설명 참조).

일반적으로, 가변성 기간 (p38의 경우 2 시간이고, ERK의 경우 하룻밤 동안)의 기아상태에 (혈청이 없는 배지) 투입된 HEK293 세포들을 자극하고, 용해 세포들을 가공한 후, 인단백질의 면역검출을, 두 단백질들의 활성화 단편의 인-특이적 항체들을 이용하여 실시하였다. 이 제 1 면역검출을 전개한 후, 면역 복합물들을 버퍼로 유리시켰다: 2% SDS, 100 mM β-머캡토에탄올, 62.5 Mm TrisHCl, pH 6.7, 그리고 총 항-p38 또는 항-EKR 항체들과 함께 막들의 재-인큐베이션을 실시하였다. 밴드들의 정량화를 레이저 농도계에서 실시하였다. 모든 경우들에서, 항-포스포-단백질 항체를 이용하여 검출된 밴드들에 대해 수득된 값들을, 세포에서 발현된 p38 또는 ERK의 총 량에 관하여 정규화하였다. 이러한 방식으로, 기준선 조건에 대하여, 상이한 키나아제들의 자극의 증가를 나타낸다. 그러나, 일부 경우들에서, 첫번째 전개가 두번째 전개를 간섭할 위험을 고려하면, 활성화는, 하나는 인-특이적 항체로, 다른 하나는 총 단백질에 대한 항체로, 구분지어 전개시킨 두 개의 상이한 막들을 농도계로 평가하였다.

면역침강

면역침강에 투입될 총 샘플들 또는 세포 용해물들을, 프로테아제 저해제들 (STI: 콩 트립신 저해제) 및 벤즈아미딘 100 ㎍/ml, PMSF 200 ㎍/ml 및 아프로티닌 10 ㎍/ml)로 보충된 상이한 버퍼들 중에서 희석하였다. 버퍼들은 각 경우에 사용된 항체에 따라 달랐으며, 아래 특정한 바와 같다. 모든 경우들에서, 용해가 최소 1 시간 동안 4℃ 에서 교반하며 일어나도록한 후, 샘플들을 원심분리하고 (24000 xg), 분액들을 취하여 (약 10%) 특이적 단백질의 발현을 확인하였다. BSA (p60 당500 ㎍) 및 각 경우에 대해 대응 양의 항체를 잔여 샘플에 첨가하였다. 모든 면역침강은 4℃ 에서 밤새도록 실시하였다. 다음날, 항체가 폴리클로날인지 또는 모노클로날인지에 따라, 30㎕ 의 50% 단백질 A-세파로오스 (Sigma) 또는 단백질 G-세파로오스 (Zymed)를 각각 첨가하였으며, 이를 4℃ 에서 90 분 동안 더 인큐베이션하였다. 항체들이 수지들에 공유결합적으로 결합된 경우, 이 단계는 생략되었으며, 이 경우에 5-10 ㎕ 의 "면역-수지"가 첨가되었다. 이 면역 복합물들을 원심분리에 의해 수집하고, 상등액을 버린 후, 이들을 10-15 ml 의 세척 버퍼로 3-5 회 (800 xg, 5 분) 세척하였다.

면역침강의 목적이 인산화 반응인 경우, 이들을 동일한 인큐베이션 버퍼로. ATP 없이 2회 더 세척하였다 (2 x 10-15 ml).

면역침강된 단백질들을 전기영동 중단 버퍼 중에 재현탁시키고, 이후에 적합한 퍼센트의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 중에 완료 샘플을 부하하기 위하여, 일반적으로 이들을 5 분 동안 비등시켰다.

RIPA (방사면역침강 분석) 버퍼

이 가용화 버퍼는 널리 사용되며, 특히 GRKs의 면역 침강에 사용되었다: 300 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 2% 노니뎃 P-40, 1% 데옥시콜산 및 0.2% SDS.

"M2 항-flag" 면역침강 버퍼

M2 항-flag 항체를 사용한 면역 침강을 위해, 세포들을 하기 중에서 수집하였다: 10 mM 인산나트륨 버퍼 pH 7.4 (0.1 M NaHPO₄ 및 NaH₂PO₄의 부모용액으로부터 제조), 150 mM NaCl 및 1% n-도데실-β-D-말도시드. 용해 후, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 및 단백질 저해제에 의해 형성된 염수 버퍼를 사용하여 300 ㎕ (p60 플레이트 당)으로 완료되었다. 최종적으로, 면역침강물들을 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM MgCl₂, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl₂, 15 mM NaF, 20 mM 피로포스페이트에 의해 형성된 버퍼 중에서 세척하였다.

풀-다운 시험들

단백질들 GST, GST-p38wt, GST-p38T123A 및 GST-p38T123D 를 박테리아 발현시키고, 표준 절차들을 따라 글루타티온-세파로오스 4B (GE-Amersham)를 사용하여 단리시켰다 (Murga, C. 등, High affinity binding of beta-adrenergic receptor kinase to microsomal membranes. Modulation of the activity of bound kinase by heterotrimeric G protein activation. J Biol Chem 271, 985-994 (1996)). His- MAPKAPK2 를, 제조자 지시에 따라 Probond 수지 (Invitrogen)를 사용하여 정제하였다. MKK6_CAM 을 Upstate Biotech로부터 구매하였다. 각 도에 대한 설명에 상술된 단백질의 양을 결합 버퍼 (25 mM Tris pH 7.5, 0.25 M NaCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM NaF 및 0.5% BSA) 중에서, 30℃ 에서 30 분 동안 일정하게 진탕하며 인큐베이션하였다. MAPKAPK2 풀 다운을 위해 ATP (50 mM)를 첨가하였다. 침전물들을 0.5% Triton X100를 함유하는 동일한 버퍼로 3 회 (10ml) 세척하였다. 침전된 복합물들을 SDS-PAGE에 의해 분해하고, 웨스턴 블롯에 의해 전개하였다.

인산화 분석

재조합 단백질들의 시험관 내 인산화

GRK2에 의한 p38 인산화

재조합 GST-p38 및 GRK2 (이들 모두 25-150 nM에서 동일몰이며, 이는 농도가 특정된 동력학 파라미터들을 계산하기 위한 실험들에서는 제외됨)를 p38 인산화 버퍼 (25 mm 헤페스 pH 7.5, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 50μM ATP, 2000-3000 cpm/pmol [γ-32P] ATP)중에서 최종 부피 40 ㎕ 로 인큐베이션하였다. 보통, 인산화 반응들이 일어나도록 30℃ 에서 30 분 동안 두었다. 이차원 전기영동 또는 프로테옴성 서열화를 위해 의도된 샘플들의 경우, 반응을 1 또는 2 시간으로 연장한다.

헤파린 및 SB203580 (Calbiochem) 화합물들, GRK2 및 p38 저해제들 각각을, 개별적인 키나아제들의 완전한 저해를 보장하기 위하여 IC₅₀ 의 10 배 농도에서 사용하였으며, 이는 헤파린의 경우 1.5μM, SB의 경우 0.5μM 였다. 사용된 기질들은 MBP (포인트 당 14 ㎍) 또는 p38에 대해 25 ng/㎕의 최종 농도의 PHAS-I 및 GRK2에 대해 카세인 (포인트 당 7.5 ㎍)이었다.

인산화 중지 후 샘플 가공은 상기 전술한 경우들과 동일하며, 단백질 분해가 8% 겔 (SDS-PAGE) 중에서 실시된 경우는 제외한다.

GST에 대해 융합하는 단백질들: p38α, Mxi2, Mxi2Δ17 및 280-360 p38 (이들 각각 5 ㎍)을 재조합 GRK2 (200 nM)와 함께, 인산화 버퍼 (25 mM 헤페스 pH 7.5, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 50μM ATP, 2000-3000 cpm/pmol [γ-³²P] ATP)중에서 30℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 헤파린 (150 nM)을 특이적 GRK2 저해제로서 포함시켰다. 반응을 SDS와 함께 중단 버퍼를 첨가함에 의해 중단시켰다. 샘플들을 8% SDS-PAGE을 이용하여 분해하였다. 동일한 양의 단백질의 포함을 확인할 목적으로, 이들을 먼저 쿠마씨 블루 염색에 의해 겔 중에서 가시화하였다. 이어서, 겔을 건조하고, 단백질(³²P)에 포함된 방사성을 검출하였다.

GRK2에 의한 인산화의 가정적 자리에서의 (T123) 정확한 p38 돌연변이들을 생성하고, 앞에서 설명된 바와 같이 정제하고, 최종 부피 40 ㎕로, p38 인산화 버퍼 (25 mM 헤페스 pH 7.5, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 50μM ATP, 2000-3000 cpm/pmol [γ-32P] ATP) 중에서 GRK2에 의한 인산화에 투입하였다. GRK2 및 p38 동종체들의 상대적인 농도 (10-80 nM)는 도면들에서 나타낸 바와 같이 변화하였다.

MKK6 _CAM 에 의한 p38 인산화

인산화 분석들 (25 mM 헤페스 pH 7.5, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 15 mm NaF, 50μM ATP 및 1000-2000 cpm/pmol [γ-³²P]ATP)을, 융합 단백질들 GST-p38 WT, GST-p38 T123A 및 GST-p38 T123D (150 nM)를 재조합 MKK6_CAM (40 ng) (Upstate Biotechnology)의 인산화 기질로서 사용하여 시험관 내에서 실시하였다. 이전 경우에서와 같이, 반응들이 일어나도록 30℃ 에서 30 분 동안 두고, 단백질들을 8% SDS-PAGE 겔들 중에서 분리하였다. 동일한 양의 단백질의 포함을 확인하기 위하여 이들을 쿠마씨 블루 염색으로 겔 중에서 가시화하였다. 이어서, 각 p38 동종체 중에 포함된 방사성을 결정하였다.

p38에 의한 APRTPGGRR 펩티드 인산화

HEK293, Flag-p38α 세포들을 M2 항-Flag-아가로오스를 이용하여 면역침강시켰다. 면역침강물들을 10-15 ml의 M2 버퍼로 3 회, 그리고 동일한 부피의 인산화 균형 버퍼(15 mM NaF, 25mM 헤페스 pH 7.5 및 10 mM 마그네슘 아세테이트)로 2 회 세척하였다. Flag-p38의 면역침강을 제어하기 위하여, 마지막 세척에서, 면역-아가로오스 복합물들을 1 ml의 버퍼에 재현탁시키고, 각 포인트의 10% 를 분리하였다 (100 ㎕). APRTPGGRR 펩티드를 기질로서 사용하여, 잔류하는 면역침강된 Flag-p38을 가지고 키나아제-분석들을 실시하였다. 반응들을, 최종 부피 25 ㎕로, 25 mM 헤페스 pH 7.5; 10 mM 마그네슘 아세테이트, 15 mM NaF, 50μM ATP 및 500-1000 cpm/pmol [γ-³²P]ATP 및 1-2 mM의 기질 펩티드에 의해 형성된 인산화 버퍼 중에서 실시하였다. 특정된 경우, SB203580을 최종 농도에서 시험관내 0.5μM의 최종물에 첨가하였다. 인산화는 30℃에서 30 분 동안 일어나도록 하고, 그 후 15㎕의 30% TCA를 첨가하여 중단하였다. 단백질들을 원심분리 (25,000 xg, 15 분, 4℃)에 의해 침전시키고, 인산화된 펩티드를 함유하는 상등액을 각 반응으로부터 수집하였다. 정사각형 (1 cm x 1 cm)의 Whatman P81 용지 조각들을 용액 중의 펩티드로 함침시켰다. 이들을 건조되도록 두고, 75 mM 인산으로 충분히 세척하고, 흡수된 펩티드에 포함된 방사능을 체렌코브법에 의해 최종적으로 정량화하였다. 그 펩티드 상에서의 p38 활성은, 각각의 경우에서, 그 펩티드에 대해서만 대응하는 포인트들에서 검출된 기준선 (또는 백그라운드) 활성을 참조한다.

p38에 의한 ATF2 및 MEF2A 의 기질들의 인산화

GST에 결합된 ATF2 및 MEF2A 형태들을 사용하여 GST-p38의 촉매 활성을 시험하였다. 대부분의 경우에서, 자체 제조의, 2㎍의 GST-ATF2 또는 GST-MEF2A를 사용하였다. 인산화 조건들은 전술한 경우들에서 설명된 것과 동일하였다. 하지만, 도에서 관련하여 나타낸, 다른 경우들에서, 0.2㎍의 기질을 사용하고, 그 인산화 반응은 15 분 동안만 일어나도록 두었다.

서열 비교

p38 오르토로거스 및 동종체들의 정렬.

발생하는 다중 정렬들을 프로그램 ClustalX (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)로 제조하고, 마드리드의 Centro Nacional of Investigaciones Oncologicas (국립 종양학 연구 센터: National Centre for Oncological Research)의 Dr. Perdiguero에 의해 갭들을 도입함에 의해 수동으로 조정되었다.

데이타의 수학적 및 통계적 분석

실험들을 최소한 2 회 실시하였고, 일반적으로, 포인트들을 이중 또는 삼중으로 실시하였다. 데이타를 평균의 표준편차와 함께 평균값으로서 나타내었다 (±SEM).

키나아제들의 미카엘리스-멘텐 거동은, 효소 반응들의 동력학적 상수들의 계산을 위해 추정되었다. "Kaleidagraph" 프로그램으로 그래프들을 작성하여, 동력학적 파라미터들: 미카엘리스-멘텐 상수 (Km) 및 최대 속도 (Smax=So (mg 효소^-1분^-1 중 포함된 nmol의 PO₄ ^3-)를 추론할 수 있는 알고리즘을 제공하였다.

"양측 스튜던트 t-검정" (양쪽: two-tailed) 및 n-1 의 자유도에 의하여 통계분석을 실시하였으며, 여기에서 귀무 가설은 상황 또는 조건, 우리가 결정하기를 바라는 통계적 유의성 및 기준선 또는 제어 상황 간에 유의 차가 없다는 것이다. 각 경우에서 수득된 상기 귀무가설을 따르는 가능성에 대응하는 값 (p)은 p<0.001 내지 p<0.0001의 범위였으며, 이는 도면에 나타낸 바와 같다.

II. 결과

GRK2 및 p38MAPK 간의 기능적 상호관계.

p38 은 GRK2에 의해 인산화된다

본 발명자들은, GRK2 및 그의 기질 수용체들 모두의 심장 생리기능에의 관련 및 심혈관 질환, 예컨대 고혈압, 울혈성 심부전 또는 협심증의 원인 (ethiology)에의 현저한 관련; 심근의 발달 및 그에 따른 그의 기능에서 p38 MAPK 모듈의 중요성을 고려하여, GRK2의 활성 및 MAPK 에 의한 그의 발현의 조절을 제어하는 기작을 연구하였다. 울혈성 심부전에서 GRK2의 증가된 수준과 p38의 비활성화간에는 역의 상관관계가 있다. 또한, GRK2의 수준은 염증성 유형 질병, 예로서 류마티즘성 관절염에서 감소된다.

이어서, 본 발명자들은 GRK2 및 p38 간의 가능한 상호작용을 연구할 것을 결정하였다. 첫 번째 실험적 접근방법은 두 단백질들 모두의 인산화 분석들이었다. 도 1A는 GRK2가 p38을 인산화한다는 것을 보여준다. GRK2의 존재에 의해 어떤 방식으로 일어난 p38의 자동인산화의 가능성을 없애기 위하여, GRK2 저해제로서 널리 사용되는 헤파린 (16 ng/㎕)을, 헤파린이 p38의 촉매 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 미리 확인한, 인산화 분석들에 포함시켰다. 상기 동일한 패널은 GRK2의 촉매 활성이 p38의 보다 적은 인산화를 일으켜, 그에 따라 GRK2의 Ser/Thr 키나아제의 활성은 GST-p38 중에 포함된 방사성 마크에 대해 직접적인 원인이 됨을 보여준다. 이들 실험들은, GRK2에 의해 그리고 상기 GST 부분 및 p38의 ORF 간의 결합 영역을 조사함에 의해 GST 인산화의 음성 대조구들을 사용하여 완료되었다.

최근 간행물에 TAB1과의 상호작용에 의해 자극된 p38의 자동인산화가 설명되었다; p38의 특이적 ATP에 대한 경쟁적 저해제인 피리디닐이미다졸 SB203580이 인산화 분석에 포함되었다. 도 1B는 p38의 촉매 활성에서 SB203580 저해제의, MBP (미엘린 기초 단백질)와 같은 p38의 일반 기질에 대한 영향을 나타낸다. p38α의 기준선 활성이 작은 경우, MBP의 큰 인산화가 관찰되지 않으며, 그렇다 하더라도 SB203580에 의한 저해는 검출된다. 두개의 잇따른 래인들은, 피리디닐이미다졸이 GRK2의 키나아제 활성에 영향을 주지 않음을 보고한다. 최종적으로, 자기방사법의 마지막 두 래인들은, p38의 자동인산화 활성이 GRK2 존재 하에서 증가된다는 것을 나타낸다. 이들 기재된 실험들의 최종 결론은 p38이 GRK2에 의해 시험관 내에서 인산화된다는 것이다.

p38-활성 키나아제들 (MAPKK), 예컨대 MKK3 및 MMK6에 의해 인산화될 수 있는 잔기들에서, 인산화가 일어나지 않는다는 것을 확인하기 위하여, 상기 인산화 반응들은 냉 조건 하에서 (즉, sin [γ-³²P]-ATP 없이) 실시되었으며, 면역검출은 항-P-p38의 인특이적 항체를 사용하여 실시하였다 (도 1C). 이 항체는, p38의 트레오닌 180에서 또는 티로신 182에서 서열중 인산화 에피토프들을 인식한다. 하부 패널에서 관찰될 수 있는 것과 같이, 재조합 단백질 MKK6의 존재만이 상기 언급된 항체에 의한 포스포-p38의 인식을 일으킨다. 상부 패널에서는, GST를 인식하는 항-GRK2 항체에 의해 총 단백질이 검출되었다 (GST-p38 참조). 이들 실험들은 GRK가 T180과 상이한 잔기에서 p38에서 인산화한다는 것을 보여준다.

GRK2는 p38을 신속하고 높은 친화도로 인산화한다

반응의 동력학적 파라미터들의 연구는, 상기 반응이 생체 내에서 일어난다는 것을 이들이 나타낸다는 것을 보여준다. 도 1D는 인산화의 동력학적 특징화를 보여준다. 먼저, 시간 경과 반응들의 실험들이 실시되었으며, 여기에서 인산화가 빨리 (5 분 후) 검출되는 것으로 나타나, 최대 인산화의 50%에 도달하는데 평균 15 분 걸릴 것으로 추정된다. GRK2는, 튜불린, 시뉴클레인(sinucleins) 및 포스듀신(phosducins)과 같은 비-입자화된 기질들을 인산화할 수 있는 절충적 (eclectic) 키나아제이다. GRK2에 의해 나타난 그의 기질에 대한 친화성은 가변적이다. 따라서, 시뉴클레인 및 β-튜불린에 대한 Km은, 이들 둘 모두의 아류형에 따라 달라지며, 약 1-2μM이다. p38의 경우, Km=80 nM (도 1E 참조) 값은, 포스듀신 및 포스듀신과 유사한 단백질과 같은 GRK2의 다른 생리학적 기질들 (PhD 및 PhLP, Km은 40-100 nM 사이 또는 m₂-무스카린 수용체들)에 대해 설명된 것에 보다 가깝다. 체렌코브법에 의한 적어도 3 회의 정량화에서 알아낸 화학양론적 값들은 0.4-0.8 P_i 몰/p38 몰의 범위였으며, 이는 GRK2에 의한 인산화 자리의 존재를 나타낸다.

GRK2과 p38은 아고니스트에 따라 다르게 상호작용한다.

GRK2는 신호화 및 세포 교통 모두에 관련된 몇몇 단백질들과 상호작용한다. 이에 따라, GRK2는, 다른 분자들에 더하여, Gαq, Gβγ, PI3Kα 및 γ, 클라트린, GIT (GRK Interacting protein: GRK 상호작용 단백질) 및 카베올린(caveolin)과 상호작용하며, 그의 상호작용은 그의 활성의 조절을 일으킨다 (인지질, Ca²⁺-칼모듈리나 (calmodulina), 키나아제들, 등). GRK2는 조절성 키나아제이며, 그의 촉매 활성은 그의 상이한 도메인들 간의 분자내 반응들에 의해 제한된다. 이로 인해, p38과의 연합하는 그의 능력을 관찰하기 위하여, β₂AR 수용체들을 사용한 자극에 의해 그의 활성형 구조의 획득이 유발되었으며, 이들에 의한 p38의 활성화는 매우 적었다. β₂AR 수용체, Flag-p38 및 GRK2를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포들을 사용하였다. 세포들을 야간 기아 (nocturnal starvation)에 투입한 후, 이들을 10μM의 농도의 이소프로테레놀 아고니스트를 이용하여 자극하였다. 이들 조건들 하에서, 면역침강은 면역침강물들 중에서 GRK2 키나아제의 검출을 일으키며, 이러한 효과는 β₂AR 수용체를 이용한 자극에 의해 증가된다 (도 2A). 도 2A 내지 2D 에서 나타낸 바와 같이, 최대 연합은, 이소프로테레놀에의 노출 후 5 분에 수득된다. 한편, 이들은 또한 기본 조건들 하에서 공면역침전한다는 가정 하에 (0분), 두 키나아제들간의 연합이 β₂AR의 자극에 필수적이 지 않음이 관찰되었다. 도 2A 에서, 항-Flag 면역침전의 비특이적 드래그 제어구들 (Cnge) 및 p38의 또다른 주목할 만한 자극 (NaCl)이 이러한 연합을 유발하지 않는다는 것의 입증이 포함되었다. 최종적으로, 이들 조건들 하에서 p38 활성화의 수준을 나타내었다. 이들은 먼저, 이소프로테레놀에 의한 p38 활성화가 매우 강하지는 않다는 것과, 두번째로는, GRK2 에 더 결합할수록 상기 활성화가 더 적어진다는 것을 나타낸다.

동일한 세포계에서, 그러나 면역침전물들 중에서 p38을 검출하기 위해 항-GRK2 항체들을 사용하는, "상호적" 면역침전 분석들을 실시하였다. 도 2B에서, p38 및 GRK2 가 아고니스트에 의존하여 상호작용한다는 것이 관찰되었다 (이소프로테레놀 5분). 도 2C 에서, GRK2의 농도 감소에 의하여, 이는 여전히 Flag-p38에 결합되어 구제됨이 입증되었다. β₂AR 아고니스트에 의한 자극 후 5 분에 증가된 결합이 다시 발견되었다.

도 2D에서, 촉매적으로 비활성인 돌연변이 GRK2, K22OR과 공면역침전하는 p38의 능력을 검정하였다. GRK2-K220R 및 GRK2-WT의 유사한 발현 수준에서 (세 번째 패널 참조), 상기 돌연변이는 보다 큰 정도로 그 자신을 p38에 연합할 수 있을 뿐 아니라, 그의 상호작용은 β₂AR 자극에 관계없는 것으로 보이는 것을 관찰할 수 있다.

GRK2의 과잉발현은 MKK6 키나아제에 의해 활성화되는 p38의 능력을 감소시킨 다.

p38 및 그의 가장 일반적인 활성화제들 중 하나인 MKK6 간의 간기 (interphase)를 검사하였다. 가능한 교차된 활성화를 제한 및 절단하려는 목적으로, 이 MAPKK의 구조적으로 활성인 돌연변이, MKK6CAM을 사용하였다. 도 3, 섹션 A는 HEK293 세포들에서 일시적 형질감염 실험들의 대표적인 패널들을 포함하며, 여기에서 증가 투여량의 pCDNA3-GRK2 플라스미드가, Flag-p38 및 MKK6CAM과 함께 과잉발현되었다 (총 양의 DNA를 항상 pCDNA3-GFP로 완료). 더욱 많은 양의 GRK2가 세포들 중에서 발현됨에 따라, MKK6CAM 에 의존한 p38 활성화는 더욱 감소됨이 관찰되었다. 과잉발현은, 결과의 동일한 세포들의 평가를 확실하게 할 수 있다. 확실히, Flag-p38의 면역검출만이 취해지기 때문에, 형질감염된 세포들이 선택되고 (그리고 따라서 GRK2 및 MKK6CAM의 효과에 종속된다), 그리고 나머지의 효과들은 무시된다. 한편, 내생의 p38은 모든 경우에서 이들 세포들에서 검출되기 어려웠다. 고정된 양의 GRK2를 발현하는 세포들, 상이한 양의 GRK2를 안정하게 발현하는 두 개의 HEK293 개체군들이 사용되었으며, Flag-38 및 MKK6CAM (또는 그의 대조구)를 암호화하는 DNAs를 그들 내로 일시적으로 도입되었다. 결과들을 섹션 B에서 모으고, 그 결과들은, 이 시스템 중에서 MKK6CAM에 의해 활성화될 수 있는 p38의 능력에서의 감소가 다시 관찰되었음을 보여준다.

GRK2의 과잉발현은 펩티드-기질에 대한 p38의 키나아제 활성을 감소시킨다.

이어서, 그의 활성화제 MKK6CAM 의 자극 및 외생의 기질에 대한 GRK2의 증가 투여량의 자극 모두에 p38의 촉매 활성을 시험하였다. 이러한 이유로, HEK293 세포들을, 최적 발현이 일어나는데 요구되는 기간 동안 혈청과 함께 배지 중에 두었다; 그 결과로서 GRK2는, LPA 등과 같이 혈청 중에 존재하는 인자들에 의해 자극될 수 있었으며, 그의 신호들은 GPCRs 로부터 발생한다. 세포들을 수집하고, 아가로오스 수지에 결합된 모노클로날 항-flag 항체에 의해 인식된 Flag-p38 키나아제를 그들로부터 면역침강시켰다. 각 포인트에서 (항상 이중으로 실시됨), 면역침강물의 분액은 면역검출에 의해 그의 양을 확인하기 위해 보존되었다 (도 4의 섹션 B에서 삽입된 패널 참조). 반복하여 세척된 면역침강물들을 그 후 펩티드 기질 APR에 대한 인산화 반응에 대해 시험하였다. 그의 서열의 처음 3 개의 아미노산들에 기인하여 명명되는, 이 펩티드는 MBP 의 94 내지 102 잔기들에 대응하며, 이들 효소들의 인산화 컨센서스를 갖는지에 대한 MAPK의 활성을 시험하는데 이전에 사용되었다. 섹션 A는 GRK2의 발현 수준 및 p38이 그러한 조건들 하에서 도달한 활성화 상태 모두를 나타내는 용해물 대조구들을 포함한다. 섹션 B의 분석은 상이한 결론들이 나오도록 한다. 첫 번째로는, 면역침강된 p38의 촉매 활성이, A에서 항-포스포 p38 항체를 사용하여 검출된, 그의 개별적인 활성화 상태와, 각 포인트에서, 상관된다는 것과, 이는 GRK2의 과잉발현에 의해 약화됨에 의해 특징화된다는 것이다. 두 번째로는, 상기 배양 배지의 혈청 중에 미리 설정된 자극들에 투입된 Flag-p38도 펩티드-기질 APR에 비해 현저하지 않은 촉매 활성을 갖는다는 것이다. 따라서, 이들 수준은 그래프 정량화에 대한 기준으로서 취해졌다. SB 203580에 의한 그의 명백한 저해를 고려하여, APR 펩티드의 인산화는 p38에 엄격히 의존하였음이 최종 적으로 강조되어야 한다.

GRK2 수준의 감소는 MKK6 _CAM 에 의한 p38의 보다 큰 활성화에 영향을 미친다.

상기 결과들을 확인하기 위한 목적으로, 상호적 실험들을 하였다. 즉, GRK2가 p38 활성에 부정적인 영향을 미치고 있는지의 여부를 확인하였다. GPCRs 에 대한 그의 키나아제 활성에 무관하게, GRK2 수준에서의 감소는 동일한 맥락에서, MKK6_CAM에 의한 보다 큰 항-포스포-p38 신호를 가능하게 하여야 한다. GRK2 에 대해 증가량의 DNA 안티센스 (AS)의 일시적 형질감염을 실시하는데 HEK293 세포들을 사용하였다 (도 5 A, 왼쪽 부분), 그의 병렬 대조구는 GFP 를 암호화하는 동량의 플라스미드이다 (C). 상기 도면은 대표적인 실험의 패널들을 나타낸다. GRK2 수준에서, 사용된 DNA 투여량에 따라, 20-50 % 감소가 평균적으로 수득되었다. 이들 데이타는, 조기 GRK2 과잉발현 실험들로부터 추론될 수 있는 것이 무엇인지, 즉 세포들 중에서 GRK2 의 양이 보다 적을수록 p38이 MKK6_CAM에 의해 보다 큰 활성화를 겪을 수 있다는 것을 확인하여준다. 이 효과를 나타내는 그래프적 추정을 첨부하였다 (도 5 A, 오른쪽 부분). p38 (항-포스포-p38/항-p38)의 활성화 수준은 각 상황에서 기준선 활성화를 참조한다: GRK2 (AS) 또는 GFP (C, 대조구) 중 하나의 보다 큰 감소.

이들 동일한 실험들에서, Flag-p38의 활성화는 기준선 조건 하에서 평가된다. p38α의 휴지 (resting) 활성은, 즉, MKK6_CAM 이 없는 활성은 일반적으로 드물 다. 이는, 화학발광 전개동안 긴 노출에 방치함에 의해, 면역검출에 의해 검출될 수 있다 (도 5, 섹션 B에서 "과잉노출"로서 언급됨). 이에 따라, 관찰될 수 있는 것과 같이, p38의 활성화의 프로파일은, MKK6_CAM 의 비-공-형질감염 조건 하에서, 이러한 구조적으로 활성인 돌연변이의 활성화에 투입된 p38의 프로파일을 모방한다. 변수들 중 하나인, p38의 일정하지 않은 활성화에 대한 관계를 갖는 MKK6_CAM 의 과잉발현의 삭제에 따라, 보다 큰 또는 보다 작은 수준의 총 GRK2 의 존재에 의해 영향을 받은 p38의 기준선 활성의 데이타는 보다 정량적이다. 이에 따라, MKK6_CAM 없이 Flag-p38α의 활성화의 정량화로부터의 데이타를 도의 하부에 나타내었다. DNA 안티센스의 각 포인트에서 GFP의 병렬 대조구에 대한 p38의 활성화와 관련하여, GRK의 존재가 더 적을 수록, 그의 세포 활성화제들의 최선의 기질인 p38에서 마크된 경향이 수득된다 (도 5, 섹션 B의 그래프). 별표에 의해 표시된, 유의성은, 따라서 p<0.05 인 값이, 그의 개별적인 GFP 대조구에 비교하여, DNA 안티센스의 각 포인트에서의 통계학적 t-스튜던트 시험에서 수득되었다는 사실을 참조한다.

절단된 구조에 의한, p38에서 GRK2에 의한 인산화 자리의 위치는 p38-GRK2 상호작용에서 삼차 구조적 결정인자들의 관련을 나타낸다.

Mxi2는 그의 C-말단이 p38α의 말단과 상이한 p38의 선택적인 가공 변이체이다. Mxi2는, 단백질 Max와의 상호작용에 대한 이중 혼성 실험에서 초기에 단리되 는 단백질이다. 아미노산 1에서 280까지, 이는 p38α와 동일하지만, 완전히 상이한 17 개 잔기의 C-말단을 갖는다 (도 6의 도식 참조). Mxi2에 추가적으로, 절단된 돌연변이 MxiΔ17을 사용하여 (정확히 p38αΔ80에 대응하여) p38의 C-말단의 세린 또는 트레오닌 중 GRK2의 인산화의 타겟을 결정하였다. 단백질 정제의 표준 방법들을 사용하여 융합 단백질들을 수득하였으며, 이들을 p38α에 비교하여, GRK2 기질이 되는 그들의 능력을 시험하였다 (도 6A). 필적하는 양의 p38α, Mxi2 및 MxiΔ17 을 이용하였으며, 마지막 두 개는 GRK2에 의해 인산화되지 않았다. 또한, Mxi2 및 MxiΔ17 에서 구분될 수 있는 인산화 흔적들은 헤파린 존재하에서의 p38α의 인산화에 대응하는 것에 비해 더 희미하다. 도면은 또한 이들 키나아제들 각각의 자동인산화 대조구들을 포함한다.

이러한 결과들을 고려시, p38α 서열의 80개의 마지막 아미노산들의 생성 및 정제는, GST에 다시 융합되었다. 이 구조물은 QuickChange의 돌연변이 생성 프로토콜 및 이후에 Gateway의 다가 시스템 중에서 GST-280-360 p38α을 암호화하는 DNA 절편을 포함함에 의해 만들어졌다. 놀랍게도, 상기 융합 단백질을 정제하고, 그를 GRK2에 대해 시험한 후, 인산화의 어떤 흔적도 얻어지지 않았다. 이들 결과들을 도 6B에 나타내었다. 이들은, GST-MxiΔ17 및 GST-p38α의 양보다 더 많은 양의 GST-280-360 p38α를 이용시 (WB 항-GST, 하부 패널), 처음 둘 중 임의의 것의 인산화가 수득되지 않았으며, 마지막 것에서는 수득되었음을 보여준다.

이 데이타로부터, 단백질 p38αWT에 존재하고, 그의 절단된 N- 및 C-말단 부분들에는 부재하는 구조적 결정인자들이 GRK2의 인식 및 이후 인산화에 필요하다는 것을 추론할 수 있다.

GRK2는 단일 잔기에서 p38을 인산화한다.

GRK2에 의해 인산화된 잔기를 결정하기 위한 전술한 시도들의 부적당성을 입증한 후, 계산된 화학양론이 하나의 인산화 자리에 대응함을 확인하기 위하여, 프로테옴 기술에 의해 그 잔기를 검색하였으며, GRK2 및 p38의 인산화 분석들은 2차원 전기영동에 의해 분해되었으며, 그 결과들을 도 7의 섹션 A에 나타내었다. 첫 번째 전기영동에서, 포스포릴의 포함 결과로서 그 단백질들의 등전점에서의 변화가 이용된 한편, 두 번째에서, 단백질들은 통상적인 SDS-PAGE에 의하여 그들의 질량에 따라 분해되었다. GRK2 존재 하에서의 인산화에 대응하는 패널에서만, GST-p38에 대응하는 강한 방사능 밴드가 관찰될 수 있었다. 유사하게, 이 패널에서, ³²P의 확산된 흔적들이 구분될 수 있었으며, 이는 GRK2의 다중 자동인산화를 나타내는 것이다.

Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa의 Servicio de Proteomica 내에 포함된, Cardiovascular Network의 Servicio de Proteomica del Nodo UAM에서(http://www.cbm.uam.is/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/plt_Servicio_Pagina.aspx?IdServicio=29&IdObjeto=118), 번역 후 변경이 동정되었다. GST-p38 및 GRK2에 의해 인산화된 GST-p38의 절편화 스펙트럼들을 비교함에 의해, 트립신성 절단 및 MALDI-TOF 질량분석 후, 펩티드의 존재가 인산화된 샘플에서 관찰되었으며, 그의 질량은, 개별적인 샘플들에서 검출된, 또다른 펩티드의 질량+80 Da에 대응할 것이다. 효과적으로, 인산기로 번역후 변경된 이 펩티드의, GRK2에 의한 인산화에 투입된 샘플의 적지만 배타적인 존재가 (1954.330=1874.326+80) 관찰되었다. 이 도면 (도 7의 섹션 B)은, 이 추정적인 인산화 담체의 흔적들이 검출된 스펙트럼의 영역의 증폭을 포함하며, 완전한 도는 재료 및 방법 섹션에서 제공된다. 질량 스펙트럼의 상세한 분석은 트립신을 이용한 절단의 결과인 후보 펩티드의 동정을 가능하게하였다: LTDDHVQFLIYQILR.

이 표시를 확인하기 위하여, 후보 펩티드를 HPLC로 분리하고, 보다 세밀한 분광 분석을 실시하였다: 전기분무/질량분석기-이온 트램프 (IS/MS-IT)는 이전에 발견된 펩티드에 대응하는 이온을 산발적으로 모니터링한다. 그 결과들은 먼저, 두 샘플들에서 모니터링된 펩티드의 용리 시간과 관련하여, 고압 액체 크로마토그래피로부터의 정보를 나타낸다. 보다 일찍 나온, GRK2에 의한 인산화로부터의 펩티드는, 소수성에 의해 펩티드를 분리하여 극성이 적은 펩티드가 더 오래 보유되는 크로마토그래피의 수립에 의해 비롯됨이 관찰되었다.

두 번째로, 두 펩티드들 모두의 절편화 스펙트럼들 및 수득된 펩티드들에 대한 시리즈의 지정을 나타내었다. 이 분석은 인산화 담체로서 후보 펩티드 LTDDHVQFLIYQILR의 트레오닌을 동정하는 것을 허용하였다. 도 8에서, 개별적인 샘플들 중에서 그의 상이한 종들의 펩티드의 총 질량에 대응하는 피크들을 황색으로 강조하여 나타내었으며, 인산화된 샘플 및 비-인산화된 샘플의 스펙트럼들 간의 상이한 종들에 대응하는 938.3 Da 피크는 주황색으로 강조하여 나타내었다.

분광광도법 및 프로테옴성 시도들의 최종 결론은 p38 상에서 GRK2의 인산화가 p38α 서열의 트레오닌 123에서 이루어졌다는 것이었다.

p38α의 트레오닌 123의 돌연변이는 GRK2 인산화를 방지한다.

GRK2에 의한 인산화의 타겟 잔기를 확인하기 위한 목적으로, T123 중의 p38α의 두 개의 돌연변이들을 생성하였다. 돌연변이 p38αT123A는 GRK2에 의해 인산화될 수 없는 p38 형태를 나타내는 한편, 돌연변이 p38αT123D는, 아스파르트산의 음전하 및 그 측쇄의 길이로 인하여, 트레오닌 123의 구조적으로 인산화된 형태를 모방한다. 융합 단백질들 GST-p38αT123A 및 GST-p38αT123D는 정제되고, GRK2에 의한 인산화에 투입되었으며, 단백질 p38αWT을 항상 대조구로서 이용하였다 (도 9, 섹션 A). 키나아제에 대해, 기질의 낮은 농도 및 균등몰 농도에서, 두 돌연변이 중 어떤 것도 GRK2 기질이 아니라는 것이 확인되었으며, 상기 인산화의 기질로서의 트레오닌 123의 실체를 확인하였다. 도면의 섹션 A 는 항-p38 항체에 의한 면역검출에 의해 정량화된 p38의 총 양의 대조구들도 포함한다. B에, p38α의 눈금표시된(scaled) 대표적인 도식이 포함되며(Swiss-Prot 데이타베이스에 대한 접근 번호 Q16539, www.expasy.org), 여기에서 거의 단백질 전체를 포함하는, 넓은 키나아제 도메인이 강조되어야 한다. CD로 불리는, 작은 영역은 단백질의 말단에 위치하며, 이는 p38의 기질들 및 활성화제들에 대한 공통 도킹 도메인을 형성하며, 이는 MAPK 족 중에서 단백질-단백질 인식들을 매개하는 것으로 관찰되었다. MKK3 및 MEF2A으로부터의 펩티드와의 p38 결정의 분석은 이 도킹 그루브(groove)의 설명 을 수정 및 완전하게 하는 것을 가능하게 하였다.

트레오닌 123은 동종체들간 및 종들 간에 매우 잘 보존되는 잔기이다.

도 10은 본 발명자들에 의해 제조된 상이한 p38 단백질들의 서열의 두 개의 정렬들을 나타낸다. 상부 패널에서, 상이한 종들의 p38의 α 동종체들 (Swiss Prot 데이타베이스 중 MK14)이 비교되었다: 사이프리너스 카피오(Cyprinus carpio) (잉어, MK14A_CYPCA: Q90336), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (초파리, MK14A_DROME: O62618), 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) (아프리카 발톱 개구리, MK14_XENLA: P47812), 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes) (침팬지, MK14_PANTR: Q95NE7), 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris) (개, MK14_CANFA: O02812), 호모 사피엔스(Homo sapiens) (인간, MK14_HUMAN: Q16539), 무스 무스쿨루스(Mus musculus) (마우스, MK14_MOUSE: P47811) 및 래투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) (래트, MK14_RAT: P70618). 단순 색상 코드를 사용하여, 컨센서스에 동일한 매우 잘 보존된 아미노산들(청색) 및 컨센서스에 균등한 매우 잘 보존된 아미노산들 (녹색)의 p38 (황색) 오르토로거스들간의 동일한 아미노산들을 구분하였다. 남은 비-보존된 잔기들은 백색으로 남겨놓았다. 보다 큰 가변성이 허용된 영역들은 정확히 p38의 키나아제 도메인 외부의 것들이며, 그들 중 C-말단 영역을 강조하여 나타내었으며, 여기에 CD 영역이 위치되며; 이 도메인의 산성 아미노산들은, 기질, 활성화제 및 탈활성화제들의 염기성 아미노산들과의 정전기적 상호작용의 수립으로 인해, 그의 인식이 허용된다. 모든 정렬된 p38α의 서열 중 T123의 위치는 적색 타원에 의해 강조하여 나타내었다. 거의 모든 동종체들에 트레오닌 123이 존재할 뿐만 아니라, 이것이 나타나지 않는 경우, 세린이 발견되며, 이는 그 위치에서 동등하게 인산화될 수 있다. 또한, GRK2에 의한 인산화의 컨센서스를 형성하는 것으로 추정되는 산성 아미노산들에 의해 정렬된 영역은 모든 오르토로거스들에서 보존된다.

이어서, 본 발명자들에 의해 설명된 규칙이 p38, α, β, γ 및 δ의 4개의 현저한 동종체들에 공통될 수 있는지의 여부를 연구하였다. 이를 위하여, 효모들의 p38 동종체들의 120 내지 140 잔기들을 포함하는 영역들: 칸디다 알비칸 (Candida albicans)의 HOG1 (Q92207), 사카로마이세스 세레베시에 (Saccharomyces cerevisiae)의 HOG1 (P32485), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)의 Sty1 (Q09892); 인간, 마우스, 쥐 및 아프리카 개구리의 p38의 γ 동종체들(배열상에서 MK12 동종체들, P53778, O08911, Q63538, P47812); 인간, 침팬지, 마우스 및 래트의 p38의 δ 동종체들 (동종체들 MK13: 정렬 중 개별적으로 O15264, Q9N272, Q9Z1B7 및 Q9WTY9); 드로소필라의 p38의 두 개의 동종체들 (MK14_DROME, O62618 및 O61443), 인간의 β 동종체들 (β₂는 β에 존재하는 8 개의 아미노산들의 선택적인 가공에 의한 삽입이 없다는 점에서 초기에 단리된 β와 상이하다. β 동종체는 소수이며, 따라서 단리하기 어려우며, β 형태는 정상적으로 β₂ 변이체와 동일하였다) 및 쥐의 β 동종체들 (MK11: Q15759, Q9WUI1); 및 마지막으로, 제노푸스, 사이프리누스의 (비교에서 이전에 포함된 동종체 MK14A 및 동종체 MK14B, Q9I958) 및 이전에 정렬된, 침팬지, 개, 인간, 마우스 및 래트의 α 동종체들 (MK14). 심지어 효모로부터의 것들도 포함하여, 그들 모두 간의 높은 보존은 현저한 것이다. 문제의 트레오닌과 관련하여 (p38α인간의 T123), 이는 척추동물에서 - 심지어는 후생동물에서도- 및 주변 아미노산들에서 보존되는 것으로 발견된다고 말할 수 있으며, 여기에서 산성 잔기들 D 및 E가 발견된다. 이에 따라, 상기 정렬이 이 잔기의 정확한 위치에서 방해를 받는다 하더라도, p38의 δ 동종체들은 여전히 보존된다. 동종 상황에서 세린 또는 트레오닌을 결여한 이 정렬 중에 포함된 하나의 동종체는 인간 p38γ.

GRK2에 의한 p38의 인산화는 p38의 그의 기질에 대한 촉매 활성 및 MKK6 기질이 되는 능력 모두를 감소시킨다.

도 11 및 12는 GRK2의 인산화가 p38의 T123 상에 가질 수 있는 기능적 결과들을 결정하기 위해 계획된 실험들을 나타낸다. 먼저, p38 상에서 GRK2의 인산화가 시험관 내에서 MKK6_CAM 에 의한 p38의 활성화를 감소시킬 수 있는지의 여부를 연구하였다. GST-p38 및 돌연변이들 GST-p38T123A 및 GST-p38T123D의 인산화의 실험들에서 이중으로 수득된 결과들을 도 11에서 A 를 형성하는 패널들에 나타내었다. 재조합 단백질들의 유사한 양에서 (쿠마씨 블루), GST-p38T123D는 다른 두 개의 p38 (³²P)보다 훨씬 더 좋지 않은 MKK6_CAM 기질이었다.

이어서, MKK6_CAM 에 의해 인산화된 경우, GST-p38T123D의 이러한 감소된 능력 이 그의 시험관 내 촉매 활성의 감소에 상관되었는지의 여부를 연구하였다. 이를 위하여, 몇몇 인산화 분석들을 하였으며, GST-p38의 검출가능하지 않은 기준선 활성으로 인해, 이는 활성화 키나아제 MKK6_CAM의 포함을 요구하였다. 도 11의 B 부분에서, GST-p38WT 및 두 개의 돌연변이들 GST-p38T123A 및 GST-p38T123D의, GST에 대한 융합 단백질로서 미리 정제된, ATF2와 같이 알려진 p38 기질을 인산화하는 능력이 시험되었다. 이에 따라, 각 인산화 반응에는, 기질, MAPK 및 MAPKK가 포함된다. 대표적인 실험 (³²P)을 나타내었으며, 여기에서 포인트들은 이중이다 (쿠마씨 블루). 따라서, 이들 실험들은, p38Tα123D가 GST-ATF2에 대한 가장 최소의 촉매 활성을 결여하는 한편, p38α 및 p38Tα123A가 이를 유사하게 인산화한다는 것을 보여준다.

ATF2는 JNK에 의해서도 인산화되기 때문에, 보다 특이적인 p38 기질로 데이타를 확인하기로 결정하였다. p38과 함께 최근 결정화된다는 사실 및 바람직한 p38 기질이라는 사실로 인해, GST-MEF2A 를 정제하였다. 도 12는 이 기질을 사용하여 실시된 분석들을 나타낸다. 섹션 A는 이전의 추론을 이전의 추론을 강화하여 주며, MEF2A에 대한 p38Tα123D의 활성은 완전히 없어지는 한편, 돌연변이 p38Tα123A은 이 기질을 인산화하는 능력을 보존한다. 상기 인산화는, 쿠마씨 블루 염색에 의해 검출되는, GST-MEF2A 기질의 이동성에서의 상관적 변화가 따르는 것이 관찰된다. 단백질의 과인산화가 그의 전기영동 이동성에서의 변화에 관련성을 갖는다는 것은 정상이며, 이는 폴리아크릴아미드 및 SDS 겔들의 변성시에도 관찰될 수 있다. 인산화 분석들을 전체로서 분석한 후, 돌연변이 p38Tα123A가 MKK6_CAM 에 의해 정확히 인산화되더라도, 이는 시험된 두 개의 기질들에 대하여 감소된 키나아제 활성을 갖는다는 것을 더 관찰할 수 있었다. p38Tα123A 및 p38αWT 간의 차별적인 효과를 조금 더 분석하기로 결정하였으며, 이를 위하여 본 발명자들은 그들의 개별적인 기준선 활성, 즉 활성화 키나아제 MKK6 부재 하에 및 MEF2A에 대한 활성에 대해 주목하였다 (도 12, 섹션 B). p38의 기준선 활성은 충분한 기질 및 긴 노출 조건 하에 평가될 수 있으며, T123에서의 개별적인 돌연변이들이 야생형 키나아제보다 더 작은 기준선 촉매 활성을 갖는지의 여부를 확인할 수 있다. p38Tα123A은 p38αWT와 p38Tα123D 사이의 중간 정도와 같이 작용하였다. 따라서, 돌연변이 p38Tα123A는, 보다 제한적인 효소 조건 하에서 (10 배 적은 기질 및 15 분의 인산화; 도 12의 패널 C), 나타낸 초기 실험들보다 p38αWT에 대하여 보다 큰 촉매적 차이를 갖는다.

p38T123D 돌연변이는 MKK6 _CAM 에 의해 제자리에서 활성화되는 능력이 보다 낮다.

HEK293 세포들에서의 초기 데이타에 일치하는 설명을 제공하는 결과들을, 이 동일한 시스템에서 확인되었다. 먼저, 발현 pCDNA3-Flag-p38T123D 돌연변이를 진핵생물에서 PCR에 의해 생성하였다. 그 후, HEK293에서의 GRK2의 과잉발현 또는 감소에 유사한 실험 시도들에 이어, Flag-p38WT 및 Flag-p38T123D를 활성화제 MKK6_CAM와 함께 형질감염시켰다. 도 13에서의 그래프는, Flag-p38T123D의 활성화 (그의 기준선 활성화에 대비)를 Flag-p38WT의 활성화에 비교시, 그의 현저한 감소를 보여준다. 세포들 중에서 p38T123D의 활성화는 야생형 키나아제의 활성화처럼 가능하지 않을 것이다. 이들 실험들에 의해 제공된 면역검출들의 예시적인 패널들도 이 도에 포함되었다.

도 14에서, p38 또는 T123에서의 그의 돌연변이에 대한 기질들 (MK2) 및 활성화제들 (MKK6)의 결합을, 정제 단백질을 사용하여 시험관 내 결합 분석하여 분석하였다. 나타낸 바와 같이, T123D 돌연변이의 MK2 또는 MKK6에 연합하는 능력이, T123A 돌연변이 또는 야생형 단백질에 대해 심하게 손상된다.

GRK2는 인슐린에 의해 유도된 예비지방세포성 3T3- L1 주의 분화를 음으로 조절한다.

예비지방세포 주 3T3- L1을, GRK2의 p38의 조정의 연구를 가능하게 한 세포 모델로서 사용하였다. 이들 섬유아세포들은, 어떤 자극에 투입된 경우, (그들 중 인슐린이 두드러짐) 약 2 주의 처리 종료시 이들이 지방세포 표현형을 수득하는 흥미로운 특질을 갖는다. 이러한 분화는, 적색 친지성 착색제로 염색되고 3T3-L1의 세포질의 거의 전체를 차지하는, 지방의 액적들의 축적에 의해 쉽게 구분될 수 있다.

세포 스트레스에 대한 가장 정통적인 반응 외의, p38의 생리학적 기능들 중 하나는, 분화 과정에서의 그의 역할이다. 지방세포들로의 분화가 SB203580에 의해 방지되고, MKK6_CAM 의 존재가 충분한 범위에서는, 3T3L1 섬유아세포들의 특이적인 경우에서, p38의 관련이 증명되었다. 그의 발현이 분화 동안에 걸쳐 변화하는, 전사 인자들 C/EBP (CCAAT/증진제-결합 단백질: enhancer-binding protein) 및 PPARγ (페록시좀 증식제-활성된 수용체 γ: peroxisome proliferator-activated receptor)은 p38에 의한 조절에 투입되는 것으로 보인다. 보다 특이적으로, C/EBP β는 아마 p38에 의해 인산화되며, 이는 분화의 초기 단계들에서만 활성이고, 이는 PPARγ 및 그의 제어 하에 있는 지방세포 마커들의 이후 발현을 촉진할 수 있을 것이다.

GRK2 가 3T3L1의 지방세포 분화에 대해 미칠 수 있는 효과를 조사하기 위하여, 네오마이신에 대한 내성을 제공하는 플라스미드 pCDNA3-GRK2 및 pCDNA3-GRK2K220R로 안정하게 형질감염된 주들을 생성하였다. GRK2 수준이, 3T3L1 주에 비교시 두 경우들 모두에서 효과적으로 과잉발현되었음을 적절히 확인한 후 (도 15의 그래프에 삽입된 창), 표준 프로토콜에 따라 분화를 유발하였다. 3T3L1 세포들은, 지질생성 자극의 부재 하에서, 적색 지질 액적들 및 이들 세포들이 획득하는 둥근 형태에 의해 나타낸 것과 같은 지방세포 표현형으로 명백히 전환된, 건강한 섬유아세포들 (3T3L1 중에서 대조구에 대응하는 사진)을 나타나게 한다 (사진 + 3T3L1 중 인슐린). 안정한 GRK2의 경우에, 필드 당 지방세포들의 수는, 이 키나아제의 내생의 수준을 가진 섬유아세포들의 경우에서보다 뚜렷이 적었다. 그리고, 3T3L1-K220R 세포들 고려시, 지방세포생성 효과는, 대조구 세포들의 효과보다 실질적으로 더 컸다. 따라서, GRK2는 인슐린에 의해 매개되는 지방세포 형태학의 획득을 저해하는 한편, K22OR은 그를 자극한다. 또한, 이 효과는, 약학적 저해제 SB203580의 첨가가 전체 지방세포생성을 전환함에 따라, p38에 의존한다. 또한, 분화 처리들에 투입되지 않은 플레이트들이, 실험에 대한 내부 대조구로서 보존된 경우, 안정한 K220R은 다른 세포들에 비해, 지방세포들로의 보다 큰 자발적인 전환을 겪을 것이다. 세 3개의 세포주들 중 각 하나에서의 필드 당 지방세포들의 수의 계수는 우측의 그래프에 나타내었다. 필드는 각 p100 또는 p60에서 광학 현미경을 사용하여 조망된 영역인 것으로 이해된다. 정상적으로, 총 25 개에 이르는 랜덤 필드들이 각 플레이트에서 계수되었다. 데이타의 유의성은 대응 데이타에 대한 스튜던트 t-시험 (p<0.001)에 의해 계산되었다 (3T3L1과 비교된 각 안정한 세포주).

도 16 및 17으로부터의 데이타는, T123에서 인산화된 p38의 펩티드에 대하여 발생된 폴리클로날 항혈청이 GRK2에 의해 시험관 내에서 인산화된 p38 단백질을 인식할 수 있지만, 다른 잔기에서 MKK6에 의해서는 가능하지 않다는 결론, 및 T123A 돌연변이는 이 항체에 의해 면역검출되지 않기 때문에, 이러한 인식은 T123에 대해 특이적이라는 결론을 이끌어낼 수 있다. 또한, GRK2의 과잉발현이, 이 항체에 의한 이 에피토프의 면역검출에서의 증가를 촉진할 수 있으며, GRK2 비활성 돌연변이 (K220R)가 과잉발현된 경우, 신호가 감소된다는 결론도 끌어낼 수 있다.

표 1

<110> UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID <120> NEW PHOSPHORYLATION SITE OF MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASES,MODIFIED PROTEINS AND APPLICATIONS <130> P1467PC00(F07-5547-ES) <150> P200501404 <151> 2005-06-10 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> CHAIN <222> (1)..(360) <223> p38 alpha protein <400> 1 Met Ser Gln Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gln Glu Leu Asn Lys Thr 1 5 10 15 Ile Trp Glu Val Pro Glu Arg Tyr Gln Asn Leu Ser Pro Val Gly Ser 20 25 30 Gly Ala Tyr Gly Ser Val Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly His 35 40 45 Arg Val Ala Val Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Ser Ile Ile His 50 55 60 Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Lys His Met Lys His 65 70 75 80 Glu Asn Val Ile Gly Leu Leu Asp Val Phe Thr Pro Ala Arg Ser Leu 85 90 95 Glu Glu Phe Asn Asp Val Tyr Leu Val Thr His Leu Met Gly Ala Asp 100 105 110 Leu Asn Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Glu 115 120 125 Phe Leu Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gln Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 130 135 140 Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu 145 150 155 160 Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp 165 170 175 Asp Glu Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu 180 185 190 Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val Asp Ile Trp Ser 195 200 205 Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro 210 215 220 Gly Thr Asp His Ile Asp Gln Leu Lys Leu Ile Leu Arg Leu Val Gly 225 230 235 240 Thr Pro Gly Ala Gln Leu Leu Lys Lys Ile Ser Ser Glu Ser Ala Arg 245 250 255 Asn Tyr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn 260 265 270 Val Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Met 275 280 285 Leu Val Leu Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ala 290 295 300 His Ala Tyr Phe Ala Gln Tyr His Asp Pro Asp Asp Glu Pro Val Ala 305 310 315 320 Asp Pro Tyr Asp Gln Ser Phe Glu Ser Arg Asp Leu Leu Ile Asp Glu 325 330 335 Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Val Ile Ser Phe Val Pro Pro Pro 340 345 350 Leu Asp Gln Glu Glu Met Glu Ser 355 360 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> ACT_SITE <222> (1)..(13) <223> fragment of protein p38 containing Thr123 <400> 2 Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Glu Phe Leu Ile Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward mutagenic oligonucleotide used for the p38T123A mutant <400> 3 gtgaagtgcc agaagctggc cgacgaccac gttcag 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse mutagenic oligonucleotide used for the p38T123A mutant <400> 4 ctgaacgtgg tcgtcggcca gcttctggca cttcac 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward mutagenic oligonucleotide used for the p38T123D mutant <400> 5 gtgaagtgcc agaagctgga cgacgaccac gttcag 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse mutagenic oligonucleotide used for the p38T123D mutant <400> 6 gtgaagtgcc agaagctgga cgacgaccac gttcag 36 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GTW-FWD oligonucleotide used to make the truncated protein GST-280-360p38 <400> 7 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgctgtcgac ctactggaga agatg 55 <210> 8 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GTW-REV oligonucleotide used to make the truncated protein GST-280-360p38 <400> 8 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcaggactcc atttcttctt ggtc 54 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for the expression and purification of MAPKAPK2 (MK2) <400> 9 ggggccatgg tcaagtccgg cc 22 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for the expression and purification of MAPKAPK2 (MK2) <400> 10 ccccctcgag gtgggccaga gccgcagc 28

Claims (23)

1. 하기로부터 선택된 MAPK 단백질:

   a) 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서 인산화된 잔기를 포함하는 MAPK 단백질, 또는 상기 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편, 여기에서

   - 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 123 위치의 트레오닌 잔기(Thr123), 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고,

   - 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화 및 그의 기질들에 대한 활성을 방지하고;

   b) 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에, 또는 상기 인산화 자리 주변 영역에 음전하 또는 부피가 큰(bulky) 잔기를 포함하는 MAPK 단백질, 또는 상기 인산화된 잔기를 포함하는 상기 단백질의 절편, 여기에서

   - 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 123 위치의 트레오닌 잔기(Thr123), 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고,

   - 상기 인산화 자리, 또는 상기 인산화 자리 주변 영역에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기의 도입은, 상기 MAPK 단백질의 활성화 및 그의 기질에 대한 활성을 방지한다.
2. 제 1 항에 있어서, MAPK 단백질이, 임의의 종들의, ERK, JNK 및 p38 단백질 키나아제들, 및 그들의 개별적인 동종체들로부터 선택되는 단백질.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, MAPK 단백질이 포유류 p38인 단백질.
4. 제 3 항에 있어서, MAPK 단백질이 마우스 p38, α 동종체이고, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질.
5. 제 1 항에 있어서, MAPK 단백질이 하기로부터 선택된 활성화 단편을 포함하는 단백질:

   - 화학식 (I)의 아미노산 트리아드(triad)를 포함하는 활성화 단편;

   [화학식 I]

   Thr-Xaa-Tyr (I)

   식 중,

   Thr은 트레오닌이고,

   Tyr은 티로신이고,

   Xaa는 아미노산 잔기로, 바람직하게는 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신 및 프롤린으로부터 선택된 아미노산이고;

   - 화학식 (II)의 아미노산 트리아드를 포함하는 활성화 단편

   [화학식 II]

   Ser-Glu-Gly (II)

   식 중,

   Ser은 세린이고,

   Glu은 글루탐산이고,

   Gly은 글리신임.
6. 제 1 항에 있어서, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
7. 제 1 항에 따른 단백질의, 활성 MAPK에 의해 매개되는 병의 진단, 또는 어떤 대상이 상기 병을 발생하는 위험 또는 소인을 결정, 또는 상기 병을 갖는 대상에게 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링, 또는 상기 병의 단계 또는 심각성 및/또는 전개를 분석, 및 상기 병의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물들의 동정에서의 용도.
8. 제 7 항에 있어서, 활성 MAPK에 의해 매개되는 병이 암, 심장병, 감염성 질병, 뉴런성 질병, 폐 질환 및 염증성 질병들을 포함하는 용도.
9. 하기 단계를 포함하는, 어떤 대상에서 활성 MAPK에 의해 매개되는 병을 검출 하거나 또는 대상이 활성 MAPK에 의해 매개되는 병을 발생하는 위험 또는 소인을 분석하기 위한 시험관 내 방법:

   a) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플에서, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및

   b) 상기 수준을 대조구 샘플의 수준과 비교하는 단계,

   여기에서, 대조구 샘플의 수준에 비해 상기 수준의 감소는, 그 대상이 활성 MAPK에 의해 매개되는 상기 병을 발생할 위험을 나타내는 것임.
10. 하기 단계를 포함하는, 활성 MAPK에 의해 매개되는 병을 갖는 대상에게 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링하거나, 또는 활성 MAPK에 의해 매개되는 상기 병의 단계, 또는 심각성 및/또는 전개를 분석하기 위한 시험관 내 방법:

    a) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플에서, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및

    b) 상기 수준을 동일한 대상으로부터의 대조구 샘플의 수준과 비교하는 단계.
11. 하기 단계를 포함하는, 활성 MAPK 단백질들에 의해 매개되는 병들의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물을 동정하기 위한 시험관 내 방법:

    a) 후보 화합물을 MAPK 단백질과 접촉시키는 단계,

    b) 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서 상기 MAPK 단백질의 인산화를 검출하는 단계, 및

    c) 상기 인산화 자리가 (i) 마우스 p38, α 동종체의 Thr123인지 (사용된 MAPK 단백질이 상기 단백질인 경우), 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기인지의 여부, 및 (ii) 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화가 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지하는지의 여부를 분석하는 단계;

    또는 선택적으로,

    i) 상기 MAPK 단백질을 인산화 할 수 있는 화합물 또는 상기 인산화의 효과를 모방하는 화합물로부터 선택된 후보 화합물을 MAPK 단백질과 접촉시키는 단계;

    ii) 후보 화합물의 MAPK 활성화에 대한 영향을 측정하기 위해, 상기 MAPK 단백질의 활성화 단편의 인산화 자리에서의 상기 MAPK 단백질의 인산화를 검출하거나, 또는 후보 화합물의 MAPK의 활성화에 대한 영향을 측정하기 위해, 상기 MAPK 단백질 상에서의 상기 인산화 모방 효과를 검출하는 단계;

    iii) 경쟁 화합물 존재 하에 MAPK 단백질의 그의 기질에 대한 도킹 및/또는 활성의 저해 가능성을 시험하기 위하여, 후보 화합물의 존재하에 상기 MAPK 단백질의 그의 기질에 대한 활성을 분석하는 단계; 및

    iv) (i) 마우스 p38, α 동종체의 Thr123에서의 상기 인산화 자리 (사용된 MAPK 단백질이 상기 단백질인 경우)가 후보 화합물에 의해 영향을 받는지의 여부, 및 (ii) 상기 인산화 자리에서의 인산화가 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지하는지의 여부를 분석하는 단계.
12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질에 결합가능하고/하거나 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질을 검출할 수 있는 화합물.
13. 제 12 항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 화합물.

    - 항체; 또는

    - 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질에 결합가능한 화합물로, 상기 MAPK 단백질에, 마우스 p38, α 동종체의 Thr123 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에 결합하고, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123에서의 연합은, 활성화 단편에서의 MAPK 단백질의 인산화를 감소시켜, 이에 따라 그의 활성화 및/또는 그의 기질에 대한 그의 활성을 방지한다; 또는

    - p38의 도킹 영역에 결합가능하고 상기 영역에서 음전하의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물은 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 그의 주변 영역, 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하고, 상기 인산화 자리 Thr123, 또는 Thr123 주변 영역에서의 상기 화합물의 연합은 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

    - p38의 도킹 영역에 결합가능하고 상기 영역에서 음전하의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물은 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하고, 상기 인산화 자리 Thr123에서 상기 화합물의 연합은 상기 MAPK 단백질의 그의 기질에 대한 활성을 손상시킴.
14. 제 13 항에 있어서, 항체가 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합가능한 항체인 화합물.
15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의, 어떤 대상이 활성 MAPK에 의해 매개되는 병을 발생하는 위험 또는 소인의 분석, 또는 상기 병을 갖는 대상에게 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링, 또는 상기 병의 단계 또는 심각성 및/또는 전개의 분석, 및 상기 병의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물들의 동정에 있어서의 용도.
16. 하기를 포함하는 벡터:

    (i) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물을 암호화하는 핵산 서열, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균 등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

    (ii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리의 인산화를 방지하는 화합물을 암호화하는 핵산 서열; 또는

    (iii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

    (iv) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리에서의 인산화를 방지하는 화합물.
17. 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 치료적으로 유효한 양의 하기를 포함하는 약학 조성물:

    (i) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한 다; 또는

    (ii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리에서의 인산화를 모방하는 화합물, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

    (iii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리에서의 인산화를 방지하는 화합물; 또는

    (iv) 제 16 항에 따른 벡터; 또는

    (v) 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질에 결합가능한 화합물로, 상기 MAPK 단백질에 마우스 p38, α 동종체의 Thr123 에서, 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에 결합하고, 상기 인산화 자리 Thr123 에서의 상기 화합물의 연합은 활성화 단편에서의 MAPK 단백질의 인산화를 감소시키고, 따라서 그의 활성화 및/또는 그의 기질에 대한 그의 활성을 방지한다; 또는

    (vi) p38의 도킹 영역에 결합가능하고, 상기 영역에 음전하의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물은 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 그 주변 영역에서, 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하고, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123 에서, 또는 Thr123 주변 영역에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

    (vii) p38의 도킹 영역에 결합가능하고 상기 영역에 음전하의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물은 마우스 p38, α 동종체의 Thr123 에서, 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하고, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123 에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 그의 기질들에 대한 활성을 손상시킴.
18. 제 17 항에 있어서, 키나아제를 포함하는 조성물.
19. 제 18 항에 있어서, 키나아제가 GRK2 키나아제 또는 그의 기능적으로 활성인 단편인 조성물.
20. 활성 MAPKs 에 의해 매개되는 병을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에 있어서의 하기의 용도:

    (i) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 인산화 자리를 인산화하는 화합물, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이 고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

    (ii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리에서의 인산화를 모방하는 화합물, 여기에서 상기 상이한 인산화 자리는 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 아미노산 서열들의 다중 정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 인산화 가능한 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기이고, 상기 상이한 인산화 자리에서의 인산화는 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

    (iii) MAPK 단백질의 활성화 단편에 존재하는 인산화 자리 또는 자리들과 상이한 상기 인산화 자리에서의 인산화를 방지하는 화합물; 또는

    (iv) 제 16 항에 따른 벡터; 또는

    (v) 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질에 결합가능한 화합물로, 상기 MAPK 단백질에 마우스 p38, α 동종체의 Thr123 에서, 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에 결합하고, 상기 인산화 자리 Thr123 에서의 상기 화합물의 연합은 활성화 단편에서의 MAPK 단백질의 인산화를 감소시키고, 따라서 그의 활성화 및/또는 그의 기질에 대한 그의 활성을 방지한다; 또는

    (vi) p38의 도킹 영역에 결합가능하고, 상기 영역에 음전하의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물은 마우스 p38, α 동종체의 Thr123, 또는 그 주변 영역에서, 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단 백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하고, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123 에서, 또는 Thr123 주변 영역에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 활성화를 방지한다; 또는

    (vii) p38의 도킹 영역에 결합가능하고 상기 영역에 음전하의 도입을 모방할 수 있는 화합물로, 상기 화합물은 마우스 p38, α 동종체의 Thr123 에서, 또는 아미노산 서열의 다중정렬에 의해 규정된 것과 같은 다른 MAPK 단백질에서 위치적으로 균등한 아미노산의 잔기에서의 음전하 또는 부피가 큰 잔기를 도입하고, 상기 화합물의 상기 인산화 자리 Thr123 에서의 연합은 상기 MAPK 단백질의 그의 기질들에 대한 활성을 손상시킴.
21. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질, 또는 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 MAPK 단백질에 결합가능하고/하거나 그를 검출할 수 있는 화합물을 포함하는 키트.
22. 제 21 항에 있어서, 활성 MAPK에 의해 매개되는 병의 진단에, 또는 어떤 대상이 상기 병을 발생하는 위험 또는 소인을 결정하기 위하여, 또는 상기 병을 가진 대상에게 투여된 치료의 효과를 평가 또는 모니터링하기 위하여, 또는 상기 병의 단계 또는 심각성 및/또는 전개를 평가하기 위하여, 또한 상기 병의 치료에 잠재적으로 유용한 화합물들의 동정에 유용한 키트.
23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, MAPK 단백질이 포유류 p38, α 동종체의 Thr123에서 인산화된 포유류 p38 키나아제인 키트.

Images