KR20080023278A - Detecting method of dna hybridization using scattering - Google Patents

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Abstract

A method for detecting DNA hybridization of a DNA chip is provided to improve detection convenience by using scattering phenomenon through an inexpensive scanner instead of labeling of fluorescent material and expensive optical devices therefor, so that the availability of the DNA chip is improved. A DNA hybridization of a DNA chip is detected by measuring the light scattering degree of the DNA chip by using a probe nanoparticle DNA with a laser scanner or digital camera. A method for detecting DNA hybridization of a DNA chip comprises the steps of: reacting the capture DNA of the DNA chip for inspection with a probe nanoparticle DNA to induce hybridization; (ii) removing the unhybridized probe nanoparticle DNA; and (iii) measuring the light scattering degree of the DNA chip, wherein the nanoparticle is made of silica, gold, polystyrene or quantum dot and contains a fluorescent material TMR(tetramethyl rhodamine) or radioactive isotope in the inside or on the outside surface.

Description

산란 현상을 이용한 ＤＮＡ혼성화 측정방법{Detecting Method of DNA Hybridization Using Scattering}Detecting Method of DNA Hybridization Using Scattering

도 1은 일반적인 DNA 칩의 혼성화(hybridization, 교잡반응) 측정방법에 사용되는 DNA의 상보적인 결합을 이용하여 캡처 DNA와 시료의 타겟 DNA의 결합, 타겟 DNA와 탐침 DNA의 결합을 이용하는 일반적인 DNA 칩의 DNA 혼성화 과정(A) 및 상기 방법의 변형으로 본 발명의 빛의 산란을 이용한 DNA 혼성화 측정방법으로 본 발명에 이용된 탐침 나노파티클 DNA를 이용한 본 발명의 DNA 혼성화(샌드위치 혼성화; sandwich hybridization) 과정(B)을 설명하기 위한 도식도이고, 1 is a block diagram of a general DNA chip using the binding of a capture DNA to a target DNA of a sample, and a binding of a target DNA to a probe DNA using complementary binding of DNA used for a hybridization method of a general DNA chip. DNA hybridization process ( A ) and DNA hybridization method of the present invention using the probe nanoparticle DNA used in the present invention as a method of measuring DNA hybridization using light scattering of the present invention by a modification of the method (sandwich hybridization; sandwich hybridization) process ( B ) is a schematic for explaining,

도 2는 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법에 이용된 탐침 나노파티클 DNA의 제조에 이용되는 나노파티클의 한 실시예로 water-in-oil 마이크로에멀젼(microemulsion)에 의한 염료-실리카 나노파티클의 합성과정의 도식도이고(이때, 우측 사진은 직경 50 nm의 나노파티클에 대한 TEM 전자현미경 사진이다) Figure 2 is an embodiment of the nanoparticles used in the preparation of the probe nanoparticle DNA used in the DNA hybridization measurement method of the present invention of the synthesis process of the dye-silica nanoparticles by water-in-oil microemulsion (microemulsion) Schematic diagram, where the right photograph is a TEM electron micrograph of a nanoparticle 50 nm in diameter.

도 3은 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법에 이용된 탐침 나노파티클 DNA(TMR-NP-DNA)의 제조의 일 실시예로 실리카 나노입자에 탐침 DNA를 결합시키는 과정을 나타낸 도식도이고, 3 is a schematic diagram illustrating a process of binding probe DNA to silica nanoparticles as an example of preparation of probe nanoparticle DNA (TMR-NP-DNA) used in the method for measuring DNA hybridization of the present invention.

도 4는 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법에 이용된 탐침 나노파티클 DNA의 제조의 또 다른 일 실시예로서 나노파티클에 탐침 DNA를 결합시키는 또 다른 방법으로 황(sulfur) 원자와 DNA 결합력을 이용하는 경우로서 나노파티클의 실란화 과정 및 올리고뉴클레오티디 캡처 DNA의 고정화(oligonucleotide probe immobilization)를 설명하는 도식도이고, Figure 4 is another embodiment of the production of the probe nanoparticle DNA used in the DNA hybridization measurement method of the present invention as another method of binding the probe DNA to the nanoparticles (sulfur) using a DNA binding force A schematic diagram illustrating the silanization process of nanoparticles and the immobilization of oligonucleotide capture DNA,

도 5는 본 발명의 빛의 산란을 이용한 DNA 혼성화 측정방법에 사용된 본 발명의 실시예의 하나인 탐침 나노파티클 DNA를 이용한 본 발명의 DNA 혼성화를 설명하기 위한 도식도이고(도 1(B)와 다른점은 시료의 타겟 DNA가 갭처 DNA에 결합되기에 앞서 탐침 나노파티클 DNA와 먼저 결합된다), 5 is a schematic diagram illustrating the DNA hybridization of the present invention using probe nanoparticle DNA, which is one of the embodiments of the present invention used in the method of measuring DNA hybridization using light scattering of the present invention ( FIGS. 1 (B) and The difference is that the target DNA of the sample is first combined with the probe nanoparticle DNA before it is bound to the gap DNA),

도 6은 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법의 한 실시예의 결과로서 검증용 DNA 칩으로 사용된 HPV DNA 칩에 대하여 실시예에서 제조된 탐침 나노파티클 DNA의 DNA 혼성화 반응인 HPV 16 타겟의 샌드위치 혼성화 정도를 레이저 스캐너로 측정한 과정을 나타낸 개념도이고, 6 shows the degree of sandwich hybridization of the HPV 16 target, which is a DNA hybridization reaction of the probe nanoparticle DNA prepared in Example, for the HPV DNA chip used as the verification DNA chip as a result of one embodiment of the DNA hybridization measuring method of the present invention. A conceptual diagram showing the process measured by a laser scanner,

도 7은 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법의 한 실시예의 결과로서 상기 HPV DNA 칩에 대하여 실시예에서 제조한 염료-실리카 나노파티클을 사용한 탐침 나노파티클 DNA의 DNA 혼성화 반응을 각각 레이저 스캐너와 디지털 카메라를 사용하여 확인한 사진이고, FIG. 7 shows DNA hybridization of the probe nanoparticle DNA using the dye-silica nanoparticles prepared in Example for the HPV DNA chip as a result of one embodiment of the DNA hybridization measuring method of the present invention. Is a photo you have verified using

도 8은 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법의 한 실시예의 결과로서 상기 HPV DNA 칩에 대하여 실시예에서 제조한 직경 50 ㎚의 TMR-나노파티클을 사용한 탐침 나노파티클 DNA(나노파티클당 TMR 염료의 수는 대략 103~104라고 계산됨) 및 동일 농도의 TMR-DNA의 DNA 혼성화 정도를 산란현상에 의하여 측정한 S/N(신호/잡음, signal/noise) 비율을 나타낸 그래프이고(이때, TMR-나노파티클을 사용한 경우의 (S/N)산란/(S/N)형광의 비는 대략 0.7 ~ 1.0이고, 단순히 TMR을 사용한 경우는 10-3이하이다), FIG. 8 shows probe nanoparticle DNA using TMR-nanoparticles having a diameter of 50 nm prepared in Example for the HPV DNA chip as a result of one embodiment of the DNA hybridization measuring method of the present invention (the number of TMR dyes per nanoparticle is A graph showing the ratio of S / N (signal / noise, signal / noise) measured by scattering to determine the degree of DNA hybridization of approximately 10 3 to 10 4 ) and the same concentration of TMR-DNA. The ratio of (S / N) scattering / (S / N) fluorescence in the case of using nanoparticles is approximately 0.7 to 1.0, or less than 10 −3 in the case of simply using TMR),

도 9는 다양한 종류의 탐침 형태를 사용한 경우의 DNA 혼성화를 디지털 카메라 및 스캐너를 사용한 산란현상에 의하여 측정한 사진이다. FIG. 9 is a photograph of DNA hybridization when various types of probes are used by scattering using a digital camera and a scanner.

본 발명은 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법 및 상기 측정방법에 이용되는 탐침 나노파티클 DNA의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 탐침 나노파티클 DNA를 이용한 DNA 칩의 빛의 산란 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for measuring DNA hybridization of a DNA chip and a method for producing probe nanoparticle DNA used in the measurement method, and more particularly, to measure the degree of light scattering of a DNA chip using probe nanoparticle DNA. It relates to a method for measuring DNA hybridization of the DNA chip.

바이오칩은 다루는 생체 분자의 종류에 따라 세포칩, 단백질칩, DNA 칩 등으로 나누어지고, 인간 게놈프로젝트에서 얻어진 방대한 DNA의 정보로부터 인간의 유전병을 조기에 발견하고 치료할 수 있는 가능성과 그에 따른 기대가 커지고 있어 이중에서 DNA 칩에 대한 연구가 가장 활발하게 진행되고 있으며, 가장 상용화도 많이 이루어지고 있다. DNA 칩은 유전자 검색용으로 엄청나게 많은 종류의 DNA를 실리콘이나 유리 등의 작은 기판에 고밀도로 붙여 놓은 것으로 동시에 수백개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있다. DNA 칩은 기존의 서던블럿이나 노던블럿을 대체하여 짧은 시간에 대량으로 유전자검색을 할 수 있으며, 돌연변이 검색, 유전자 진단, 약물유전학 등에 이용될 수 있다. 현재 이 분야의 추세는 저렴성, 신속성, 정확성, 조작의 간편성, 탐침의 편리성에 대해 연구초점이 맞춰지고 있다.Biochips are divided into cell chips, protein chips, and DNA chips according to the types of biomolecules to be dealt with, and the possibility of early detection and treatment of human genetic diseases from the vast amount of DNA information obtained from the Human Genome Project increases, and thus the expectation. Among these, research on DNA chips is the most active and most commercialized. DNA chips can be used to search for hundreds of genes at the same time, with huge numbers of DNA attached to small substrates such as silicon or glass at high density for gene detection. The DNA chip replaces the existing Southern blot or Northern blot and can be searched in large quantities in a short time, and can be used for mutation detection, gene diagnosis, and pharmacogenetics. Current trends in this area are focused on inexpensiveness, speed, accuracy, ease of operation and convenience of probes.

병원에 질병 검사를 받으러 가본 사람은 복잡한 검사 절차와 그 검사 결과가 나올 때까지의 그 지루한 기다림을 알고 있으며, 만일 이러한 검사를 가정이나 응급실과 같은 환자 옆이나 현장에서 바로 할 수 있는 휴대용 진단 도구의 개발을 무척이나 고대하고 있을 것이다. 이러한 것은 POCT에 기반한 랩온어칩(lap on a chip)에 의해 발전되고 있으며 현재 이 시장규모는 엄청나다. 그러나, 현장 현시검사는 실제로는 그 결과를 확인하기 위해 필요한 장비들에 의해 많은 제약을 받고 있으며, 따라서 손쉽게 그 결과를 확인하는 방법을 개발하는 것은 이제 다가올 고령화, 복지 사회를 대비하고 삶의 가치 향상을 추구하는 추세에서 이 시장의 규모를 더욱 크게 할 수 있을 것이다.Anyone who has been to the hospital for a disease test knows the complicated test procedure and the tedious wait until the test results come out, and if the test is done by a portable diagnostic tool that can be done right next to the patient or in the field, such as a home or emergency room, You will be looking forward to development. This is being developed by a lap on a chip based on POCT, and the market is huge. However, field visual inspections are in fact limited by the equipment necessary to verify the results, so developing an easy way to verify the results is now preparing for an aging, well-being society and improving the value of life. In the pursuit of the market, this market could be made larger.

일반적으로 DNA 칩의 기본원리는 특정 염기서열을 가지는 캡쳐 DNA(capture DNA)를 칩에 다양한 방법으로 집적하고 집적된 캡쳐 DNA 중 어떤 것이 시료의 타겟 DNA(target DNA) 또는 RNA와 상보적으로 결합하였는지를 검출하는 것이다. 시료중의 타겟 DNA와 칩 내에 집적된 캡쳐 DNA와의 결합 여부, 즉 혼성화(hybridization)여부를 검출하는 방법으로는 방사선 동위원소를 사용하거나 고가의 형광물질을 표지하여 이를 스캐너 장비를 사용하여 탐침하고 있다.In general, the basic principle of the DNA chip is to capture capture DNA having a specific sequence on the chip in various ways, and which of the accumulated capture DNAs complementarily binds to the target DNA or RNA of the sample. To detect. As a method of detecting the binding of the target DNA in the sample and the capture DNA accumulated in the chip, that is, hybridization, a radioisotope or an expensive fluorescent substance is labeled and probed using a scanner device. .

방사능 표지법은 민감하고 널리 활용가능한 부분이 있지만 환경 문제가 있어서 형광물질로 표지하는 방식으로 대체되고 있는 추세이다. 형광물질로 표지하는 방식은 매우 민감하고 위험하지 않고 비파괴적이며 저렴하다는 장점이 있어 가장 널리 쓰이고 있지만, 반드시 표지가 필요하며 DNA 칩에서 신호를 검출하기 위해서는 형광을 검출하여야 하므로 레이저나 고출력 램프가 설치되어 있는 고가의 형광 스캐너를 필요로하고, 이로 인해 DNA 칩 검사 시장이 크지 못하는 실정이다. 질량분석기를 사용하는 방법은 표지가 필요 없고 구조에 관한 정보를 제공한다는 장점이 있지만, 그 장비가 고가이고 복잡하다는 단점이 있다. 따라서, DNA 칩의 연구에 있어 이러한 간단하고도 용이하게 혼성화를 탐침할 수 있는 방법을 모색하는 것이 매우 중요해지고 있다.Although radiolabeling is sensitive and widely available, there is an environmental problem that is being replaced by a fluorescent labeling method. The method of labeling with fluorescent material is the most widely used because it is very sensitive, not dangerous, non-destructive and inexpensive, but it is necessary to label and the fluorescence must be detected to detect the signal from the DNA chip. There is a need for an expensive fluorescent scanner, which is not a large market for DNA chip inspection. The method of using a mass spectrometer has the advantage of not requiring a label and providing information on the structure, but the disadvantage is that the equipment is expensive and complicated. Therefore, in the study of DNA chips, it is very important to find a method for probing such a simple and easy hybridization.

이에, 본 발명자들은 상기 DNA 혼성화 방법을 측정하는 새로운 방법을 개발하고자 노력하던 중 캡쳐 DNA와 시료 중 타겟 DNA의 결합을 확인하기 위한 한 방법으로 나노파티클에 탐침 DNA를 고정시킨 탐침 나노파티클 DNA를 제조하고 이를 상기 타겟 DNA와 반응시킨 뒤, 상기 나노파티클의 산란 현상을 측정함으로써 캡쳐 DNA와 타겟 DNA의 혼성화 정도를 손쉽게 측정할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors prepared probe nanoparticle DNA in which probe DNA was immobilized to nanoparticles as a method for confirming binding of a capture DNA to a target DNA in a sample while trying to develop a new method for measuring the DNA hybridization method. The present invention was completed by confirming that the hybridization of the capture DNA and the target DNA can be easily measured by measuring the scattering phenomenon of the nanoparticles after the reaction with the target DNA.

본 발명의 목적은 DNA 칩에 결합한 나노파티클의 빛의 산란 정도를 측정함으로써 DNA 칩의 DNA 혼성화를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for measuring DNA hybridization of a DNA chip by measuring the degree of light scattering of the nanoparticles bound to the DNA chip.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탐침 나노파티클 DNA(probe nanoparticle DNA)를 이용한 DNA 칩의 빛의 산란 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 칩의 DNA 혼성화(hybridization) 측정방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for measuring DNA hybridization (hybridization) of the DNA chip, characterized in that for measuring the degree of light scattering of the DNA chip using the probe nanoparticle DNA (probe nanoparticle DNA).

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

탐침 나노파티클 DNA를 이용한 DNA 칩의 빛의 산란 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법을 제공한다.It provides a method for measuring DNA hybridization of the DNA chip, characterized in that for measuring the scattering degree of light of the DNA chip using the probe nanoparticle DNA.

상기 본 발명의 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법은 검사용 DNA 칩의 캡처(capture) DNA에 상기 탐침 나노파티클 DNA를 반응시켜 혼성화 형성을 유도하는 단계; 상기 반응 후에 혼성화되지 않은 탐침 나노파티클 DNA를 제거하는 단계; 및 상기 DNA 칩의 빛의 산란 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.The DNA hybridization measurement method of the DNA chip of the present invention comprises the steps of inducing hybridization formation by reacting the probe nanoparticle DNA to capture DNA of the test DNA chip (capture); Removing unhybridized probe nanoparticle DNA after said reaction; And measuring the scattering degree of light of the DNA chip.

또한, 상기 본 발명의 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법은 검사용 DNA 칩의 캡처 DNA에 시료 DNA를 반응하여 혼성화를 유도하는 단계; 상기 반응후에 혼성화되지 않은 시료 DNA를 제거하는 단계; 상기 DNA칩에 상기 탐침 나노파티클 DNA를 상기 DNA 칩내의 시료 DNA와 혼성화 형성을 유도하는 단계; 및 상기 DNA 칩의 빛의 산란 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.In addition, the DNA hybridization measurement method of the DNA chip of the present invention comprises the steps of inducing hybridization by reacting the sample DNA to the capture DNA of the test DNA chip; Removing unhybridized sample DNA after the reaction; Inducing hybridization of the probe nanoparticle DNA with the sample DNA in the DNA chip on the DNA chip; And measuring the scattering degree of light of the DNA chip.

또한, 상기 본 발명의 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법에 있어서, 상기 나노파티클은 실리카(silica), 금, 폴리스티렌(polystyrene) 및 양자점(quantum dot)으로 구성되는 군중에서 선택되는 물질로 제조되는 것이 바람직하고, 실리카로 제조되는 것이 보다 바람직하다In addition, in the DNA hybridization measurement method of the DNA chip of the present invention, the nanoparticles are preferably made of a material selected from the group consisting of silica (silica), gold, polystyrene and quantum dot (quantum dot). More preferably made of silica.

또한, 상기 본 발명의 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법에 있어서, 상기 나노파티클 내부에 형광물질 또는 방사성 동위원소가 포함되는 것이 바람직하고, 상기 형광물질은 TMR(tetramethyl rhodamine)일 수 있다. In addition, in the DNA hybridization measurement method of the DNA chip of the present invention, it is preferable that a fluorescent substance or radioisotope is contained in the nanoparticles, and the fluorescent substance may be tetramethyl rhodamine (TMR).

또한, 상기 본 발명의 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법에 있어서, 상기 DNA 혼성화 측정은 레이저 스캐너 또는 디지털카메라를 이용하여 측정하는 것이 바람직하다.In the method for measuring DNA hybridization of the DNA chip of the present invention, the DNA hybridization measurement is preferably performed using a laser scanner or a digital camera.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 측정방법에 관하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기에 설명되는 것은 본 발명의 기술적 사상을 구체화한 바람직한 일 실시예로서 본 발명의 기술적 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, with reference to the accompanying drawings will be described in more detail with respect to the measuring method of the present invention. However, what is described below is not limited to the technical scope of the present invention as a preferred embodiment that embodies the technical spirit of the present invention.

도 1은 일반적인 DNA칩의 혼성화(hybridization, 교잡반응) 측정방법((A)) 및 본 발명의 빛의 산란을 이용한 DNA 혼성화 측정방법으로 본 발명에 이용된 탐침 나노파티클 DNA를 이용한 본 발명의 DNA 혼성화(샌드위치 혼성화; sandwich hybridization) 과정((B))을 나타낸 것이다. 상기 도 1(B)는 산란현상을 활용하여 캡쳐 DNA와 타겟 DNA간의 혼성화 여부를 알 수 있는 방법을 제시한 본 발명의 바람직한 일 실시예의 도식도이다. 즉, 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법 역시, 일반적인 경우와 동일하게 DNA의 상보적인 결합을 이용하여 캡처 DNA와 시료의 타겟 DNA의 결합, 타겟 DNA와 탐침 DNA의 결합을 이용하는 일반적인 DNA 칩의 DNA 혼성화 과정을 이용한다. 일반적인 DNA 칩의 DNA 혼성화의 측정방법은 다음과 같다. 1 is a method of measuring hybridization (hybridization) of a general DNA chip ( (A) ) and a method of measuring DNA hybridization using light scattering according to the present invention, and the DNA of the present invention using the probe nanoparticle DNA used in the present invention. Hybridization (sandwich hybridization) process (B ) is shown. 1 (B) is a schematic diagram of a preferred embodiment of the present invention showing a method for determining whether hybridization between a capture DNA and a target DNA using scattering. In other words, the method for measuring DNA hybridization of the present invention also uses the complementary binding of DNA as in the general case, and the DNA hybridization process of the general DNA chip using the binding of the capture DNA and the target DNA of the sample and the binding of the target DNA and the probe DNA. Use The method for measuring DNA hybridization of a general DNA chip is as follows.

실리콘웨이퍼, 유리나 플라스틱 같은 기판 표면에 검출하고자 하는 타겟 DNA와 상보적으로 결합하는 캡쳐 DNA를 띠 또는 점 형태로 고정을 하며(본 발명에서 사용하는 캡쳐 DNA를 프로브 DNA라는 용어로 사용하는 경우도 많으나, 본 발명에서는 칩에 고정되어 타겟 DNA와 혼성화되는 것을 캡쳐 DNA라는 용어로 사용한다), 시료 중의 특정한 염기서열을 가지는 타겟 DNA가 상기 캡쳐 DNA와 혼성화하고 타겟 DNA의 남는 부분이 표지된 탐침 DNA와 결합을 한다. 캡쳐 DNA와 혼성화 형성을 하지 못한 시료부분과 완충액 등은 배출시킨 후에 표지 물질을 검출함으로써 시료중에 어떤 타겟 DNA가 있는지의 여부를 알 수 있게 된다. 도면에서는 도시하지 않았으나 시료를 증폭하기 위한 PCR 등의 과정에 있어 처음부터 형광 물질 등을 표지하여, 캡쳐 DNA에 결합한 타겟 DNA에 표지된 형광물질 등을 검출하는 경우도 있다.The capture DNA binding complementary to the target DNA to be detected on the surface of the substrate such as silicon wafer, glass or plastic is fixed in the form of a band or dot (the capture DNA used in the present invention is often used as the term probe DNA). In the present invention, the immobilized on the chip and hybridized with the target DNA is used as the term capture DNA), and the target DNA having a specific nucleotide sequence in the sample hybridizes with the capture DNA and the remaining portion of the target DNA is labeled with the probe DNA. Combine. Sample portions and buffers that do not hybridize with the capture DNA are discharged to detect the labeling substance, thereby determining whether there is any target DNA in the sample. Although not shown in the drawings, fluorescent materials or the like may be labeled from the beginning in a process such as PCR for amplifying a sample to detect fluorescent materials or the like labeled on the target DNA bound to the capture DNA.

그러나, 본 발명의 특징은 상기 통상적인 DNA 칩의 측정방법이 일반적으로 형광물질로 표지된 DNA를 이용하는 방법(도 1(A))으로 이루어지는데 반하여 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법은 빛의 산란을 측정하므로 형광물질과 같은 별도의 표지물질이 요구되지 아니하고 나노파티클 자체가 표지자의 역할을 한다. 오히려, 빛의 산란이 잘 일어나도록 적당한 나노파티클의 크기 내지는 농도가 중요한 것으로 나노파티클 DNA의 컨쥬게이션 방법(도 1(B))이 중요하다. However, the feature of the present invention is that the conventional DNA chip measuring method generally comprises a method using DNA labeled with fluorescent material ( FIG. 1 (A) ), whereas the DNA hybridization measuring method of the present invention provides light scattering. As a result of the measurement, no separate labeling material such as a fluorescent material is required, and the nanoparticles themselves serve as markers. Rather, the proper size or concentration of the nanoparticles is important so that light scattering occurs well, the method of conjugation of nanoparticle DNA ( Fig. 1 (B) ) is important.

형광물질을 검출하기 위한 레이저 스캐너는 검출기와 광학소자가 고가이기 때문에 일반적으로 매우 고가이며, 신속 정확성을 위하여는 상당한 출력을 갖는 레이저 스캐너가 필요하므로 실제로는 이러한 방법을 사용하는 검출방식 때문에 DNA 칩의 보편화가 더뎌지고 있다. 이에, 본 발명에서는 상기 형광 측정 대신에 빛의 산란을 이용하여 DNA 칩의 DNA 혼성화 정도를 측정하는 방법을 제시하고 있다. 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법에 이용되는 입자에 의한 산란현상(scattering)은 입자의 반지름의 6제곱에 비례하므로, 반지름이 10배만 커지면 물질의 부피 및 질량은 1,000배로 증가하며, 산란은 100만배가 된다.Laser scanners for detecting fluorescent materials are generally very expensive because of the high cost of detectors and optical elements, and in practice, a laser scanner with considerable output is required for rapid accuracy. Universalization is slowing down. Thus, the present invention proposes a method of measuring the DNA hybridization degree of the DNA chip by using light scattering instead of the fluorescence measurement. Scattering caused by the particles used in the DNA hybridization measurement method of the present invention is proportional to the sixth square of the radius of the particle, so if the radius is only 10 times larger, the volume and mass of the material are increased to 1,000 times, and the scattering is 1 million times higher. do.

본 발명의 산란현상을 이용한 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정 과정을 살펴보면 다음과 같다.Looking at the DNA hybridization measurement process of the DNA chip using the scattering phenomenon of the present invention.

통상적인 DNA 칩과 같이 기판에 캡쳐 DNA가 고정되어 있고 이곳에 시료를 통과시키게 된다. 시료중에 특정한 염기서열의 타겟 DNA가 있는 경우 캡쳐 DNA와 상보적으로 결합을 하며 타겟 DNA가 길어서 남게 되는 부분이 존재한다. 이러한 혼 성화 여부를 탐침하기 위한 탐침 DNA는 종래의 것과는 달리 나노파티클과 결합되어 있으며, 본 발명자들은 이를 탐침 나노파티클 DNA라고 명명하였다. 나노파티클을 가지고 있는 탐침 DNA(탐침 나노파티클 DNA)가 상기의 남아 있는 타겟 DNA와 상보적으로 결합하게 하며, 이러한 상태의 경우 샌드위치 혼성화되었다고 표현한다. 샌드위치 혼성화된 DNA칩에 있어서, 상기 나노파티클의 산란 현상을 검출함으로써 결과적으로는 캡쳐 DNA와 타겟 DNA간의 혼성화 여부를 알 수 있게 되는 원리를 이용한 것이다.Like a conventional DNA chip, capture DNA is fixed on a substrate and a sample is passed through it. If there is a target DNA of a specific nucleotide sequence in the sample, it binds complementarily with the capture DNA, and there is a part where the target DNA is left long. Probe DNA for probing such hybridization, unlike the conventional one is coupled with nanoparticles, the inventors named it probe nanoparticle DNA. Probe DNA with nanoparticles (probe nanoparticle DNA) allows complementary binding to the remaining target DNA, which is expressed as sandwich hybridization. In the sandwich-hybridized DNA chip, the scattering phenomenon of the nanoparticles is detected, resulting in the principle that hybridization between the capture DNA and the target DNA can be known.

나노파티클은 그 입자의 크기가 나노 사이즈를 반드시 의미하는 것은 아니다. 수 ㎛의 입자의 경우에는 눈으로 확인할 수 있을 정도이거나 디지털 카메라로 찍어 확인할 수 있으며, 크기가 작아져도 저출력의(즉, 저가의) 레이저 스캐너로서 충분히 그 산란현상을 검출할 수 있다. 즉, 상기 나노파티클은 충분히 작아도 저가의 장비로서도 충분히 그 산란현상을 검출할 수 있다는 의미를 내포하고 있다.Nanoparticles do not necessarily mean nanoparticle size. Particles of several micrometers can be visually confirmed or photographed with a digital camera. Even if the size is small, the scattering phenomenon can be sufficiently detected by a low-power (ie low-cost) laser scanner. In other words, the nanoparticles have the meaning that they can sufficiently detect the scattering phenomenon even with low-cost equipment.

도 2는 본 발명의 실시예에서 사용되는 또 다른 형태의 염료 실리카 나노파티클의 합성과정을 나타낸 도식도로 water-in-oil 마이크로에멀젼(microemulsion)에 의한 염료-실리카 나노파티클의 합성과정을 기재하고 있다. 또한, 이러한 과정에 의해 제조된 직경 50 nm의 나노파티클에 대한 TEM 전자현미경 사진을 기재하고 있다. Figure 2 is a schematic diagram showing the synthesis of another type of dye silica nanoparticles used in the embodiment of the present invention describes the synthesis of the dye-silica nanoparticles by water-in-oil microemulsion (microemulsion). . In addition, TEM electron micrographs of nanoparticles of 50 nm in diameter prepared by this procedure are described.

도 3은 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법에 이용된 탐침 나노파티클 DNA(TMR-NP-DNA)의 제조의 일 실시예로 실리카 나노입자에 탐침 DNA를 결합시키는 과정을 나타낸 도식도이다. 상기 도 1 에 제시된 탐침 나노파티클 DNA의 제조과정을 이하에서 보다 상세히 설명한다. Figure 3 is a schematic diagram showing a process of binding the probe DNA to the silica nanoparticles as an embodiment of the production of probe nanoparticle DNA (TMR-NP-DNA) used in the DNA hybridization measurement method of the present invention. The Figure is described in more detail the manufacturing process of the probe nanoparticle DNA set out in 1 below.

우선, 나노파티클의 한 예로 실리카를 재료로 이용하고, 실리카 표면에 아민기를 도입하다. 예를 들어, 실리카 표면을 하기와 같이 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane)과 같은 물질로 실란화(silanization)시킴으로써 아민기를 도입할 수 있다. 실란화는 실리카 표면에 아민, 설파이드(sulfide), 탄화수소(hydrocarbon) 등의 각종 작용기를 도입하기 위하여 널리 사용되는 방법이다. 대략적인 반응기작은 하기와 같으면, 이와 같은 반응에 의하여 유리 표면이 OH기에서 R 잔기로 바뀐다.First, silica is used as a material as an example of nanoparticles, and an amine group is introduced to the silica surface. For example, an amine group may be introduced by silanizing the silica surface with a material such as 3-aminopropyltrimethoxysilane as follows. Silaneization is a widely used method for introducing various functional groups such as amines, sulfides, hydrocarbons, etc. on the silica surface. The approximate reaction mechanism is as follows, by this reaction the glass surface changes from OH groups to R residues.

Figure 112006065220331-PAT00001
Figure 112006065220331-PAT00001

또한, 실리카 표면에 아민기를 도입하기 위하여, 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane) 처리과정은 다음과 같다.In addition, in order to introduce an amine group on the surface of silica, 3-aminopropyltrimethoxysilane treatment is as follows.

Figure 112006065220331-PAT00002
Figure 112006065220331-PAT00002

이어서, 아미노 실란화된 실리카의 아민기와 다른 물질의 알데하이드기 간의 화학반응을 이용하여 특정 단백질을 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타알데히드(glutaraldehyde)를 이용하여 아비딘(avidin)을 실리카 표면에 결합시킬 수 있다. 이러한, 나노파티클을 3'에 바이오틴(biotin)이 결합된 탐침 DNA와 반응시키면 바이오틴의 특이적 결합반응을 통하여 나노파티클과 탐침 DNA를 컨쥬게이션(conjugation)시킬 수 있으므로, 상기와 같은 과정을 통해 탐침 나노파티클 DNA를 합성할 수 있다. 이러한 부분은 당업자에게 자명한 사실이지만, 보다 자세히 살펴보면 다음과 같다.Subsequently, chemical reactions between the amine groups of the amino silanated silica and the aldehyde groups of other materials can be used to bind specific proteins. For example, avidin may be bound to the silica surface using glutaraldehyde. When the nanoparticles are reacted with the probe DNA bound to the biotin at 3 ′, the nanoparticles and the probe DNA can be conjugated through the specific binding reaction of the biotin. Nanoparticle DNA can be synthesized. This part is obvious to those skilled in the art, but in more detail as follows.

아비딘이나 항체 모두 단백질이고 한쪽 끝은 NH2로 되어 있기 때문에 종류에 상관없이 하기의 방법을 따르면 된다. 여기서는 아비딘을 결합시키는 과정으로 보다 상세히 설명한다.Since both avidin and an antibody are proteins and one end is NH 2 , the following method can be followed regardless of the type. Here, the process of binding avidin will be described in more detail.

Figure 112006065220331-PAT00003
Figure 112006065220331-PAT00003

아비딘 또는 스트렙타비딘(streptavidin)과 같은 단백질은 바이오틴과의 결합력이 매우 세기 때문에 많이 사용된다. 아비딘은 테트라머(tetramer) 구조이므 로 4개의 결합 부위를 갖는다. 또한, 바이오틴은 비타민 H라고도 하는 작은 분자로 DNA의 한쪽 말단에 이 물질을 결합시켜 이미 널리 상용화되어 있다. 전체적인 반응은 나노파티클과 상기 탐침 DNA 용액을 혼합하여 반응시키고, 세척하여 제거하는 과정을 반복함으로써 상기 탐침 나노파티클 DNA의 제조가 가능하다. 현재, 다양한 크기의 실리카 파티클이 상용화되어 손쉽게 구입 가능하므로, 다양한 방법을 통하여 아민기, 또는 카르복실기가 도입된 실리카 파티클을 제조하거나 구입할 수 있다.Proteins such as avidin or streptavidin are commonly used because of their high binding strength to biotin. Avidin is a tetramer structure and therefore has four binding sites. Biotin is also a small molecule, also known as vitamin H, that is already widely commercialized by binding this substance to one end of DNA. The overall reaction is possible to prepare the probe nanoparticle DNA by repeating the process of mixing, washing and removing the nanoparticles and the probe DNA solution. At present, since silica particles of various sizes are commercialized and can be easily purchased, silica particles having an amine group or carboxyl group introduced therein may be manufactured or purchased through various methods.

또한, 탐침 DNA를 나노파티클에 결합시키는 다양한 방법이 있다. 예를 들어, 황(sulfur)과 DNA의 결합력을 이용할 수 있다. 도 4는 본 발명의 DNA 혼성화 측정방법에 이용된 탐침 나노파티클 DNA의 제조의 예로 상기 황 원자와 DNA 결합력을 이용한 것이다. 도 4는 나노파티클의 실란화 과정과 올리고뉴클레오티디 캡처 DNA의 고정화(oligonucleotide probe immobilization) 과정이다. 상기 방법은 나노파티클의 티올(thiol)기의 도입과 타겟 DNA의 부분과 상보적 결합을 이룰 수 있는 올리고머 탐침을 고정화시킨다. 이외에도, 나노파티클의 표면에 아민, 설파이드, 하이드로 카본 등의 각종 작용기를 도입하기 위해 실란화시키고, 이것에 탐침 DNA를 결합시킬 수 있다. 결합하는 방식은 당업자의 입장에서 다양하게 이용할 수 있으며, 도면에서 보여주는 것은 그 한 실시예에 불과한 것으로 이에 의해 본 발명의 기술적 사상이 한정되는 것은 아니다. 이러한 나노파티클에 탐침 DNA를 고정하는 방법은 바이오틴과 아비딘의 결합력을 이용하는 것이 일반적인 방법일 수 있으 나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 탐침 나노파티클 DNA의 제조방법은 탐침 DNA와 나노파티클이 결합할 수 있는 수 많은 방법이 있음은 당업자에게 자명하다.In addition, there are a variety of ways to bind probe DNA to nanoparticles. For example, the binding force between sulfur and DNA can be used. Figure 4 is an example of the production of the probe nanoparticle DNA used in the DNA hybridization measurement method of the present invention using the sulfur atom and the DNA binding force. 4 is a process for silanization of nanoparticles and for immobilization of oligonucleotide capture DNA. The method immobilizes an oligomeric probe capable of introducing a thiol group of nanoparticles and complementary binding to a portion of the target DNA. In addition, the surface of the nanoparticles can be silanized in order to introduce various functional groups such as amines, sulfides, and hydrocarbons, and the probe DNA can be bound thereto. Combination can be used in various ways from the viewpoint of those skilled in the art, it is shown in the drawings is only one embodiment by which the technical spirit of the present invention is not limited. The method of fixing the probe DNA to the nanoparticles may be a general method using the binding force of biotin and avidin, but is not limited thereto. The method of preparing the probe nanoparticle DNA of the present invention may bind the probe DNA to the nanoparticles. It will be apparent to those skilled in the art that there are many ways to do this.

한편, 본 발명의 범위내에 상기와 같이 나노파티클을 탐침 DNA에 도입하는 것이 아니라 시료의 특정 타겟 DNA 부분에 나노파티클을 고정하는 것도 가능하며, 상기 내용을 도 5에 도식적으로 기재하였다. 보다 상세히 설명하면, 먼저 시료중의 타겟 DNA에 나노파티클을 결합시킨다. 그리고, 통상적인 DNA 칩과 같이 유리 등의 기판에 특정 유전자 서열의 캡쳐 DNA가 고정되어 있으므로, 상기 나노파티클이 결합된 타겟 DNA를 이러한 캡쳐 DNA와 혼성화시킨다. 최종적으로 이러한 혼성화된 DNA 칩에서 나노파티클의 산란현상을 검출함으로써 캡쳐 DNA와 타겟 DNA간의 혼성화 여부를 검출할 수 있다. 타겟 DNA-나노파티클간의 결합은 앞서 설명한 것과 동일한 방법에 의해서 제조할 수 있으며, 예를 들어 시료중의 타겟 DNA에 바이오틴을 도입하고 나노파티클에 아비딘을 도입하여 아비딘과 바이오틴의 특이적 결합반응을 이용하는 것이다. 그러나, 상기의 도 1(B)의 경우와 동일하게 다양한 방법이 가능하며, 이것은 당업자에게 자명하다. 이러한, 실시예의 중요한 특징은 타겟 DNA와 나노파티클이 결합된 것을 이용하는 경우에도 나노파티클의 산란을 측정함에 의하여 DNA 혼성화 정도를 측정가능하다는 점이다.On the other hand, instead of introducing the probe nanoparticle DNA as described above within the scope of the invention also possible to fix the nanoparticles to a specific target DNA of the sample, and was described diagrammatically in the details in Fig. In more detail, first, nanoparticles are bound to target DNA in a sample. Since the capture DNA of a specific gene sequence is immobilized on a substrate such as glass as in a conventional DNA chip, the target DNA to which the nanoparticles are bound is hybridized with the capture DNA. Finally, by detecting scattering of nanoparticles in the hybridized DNA chip, hybridization between the capture DNA and the target DNA can be detected. The binding between the target DNA and the nanoparticles can be prepared by the same method as described above. For example, biotin is introduced into the target DNA in the sample and avidin is introduced into the nanoparticle, thereby utilizing specific binding reaction between avidin and the biotin. will be. However, in the case of the above-mentioned FIG. 1 (B) it can be the same, and various methods and, it is apparent to those skilled in the art. An important feature of this embodiment is that the degree of DNA hybridization can be measured by measuring the scattering of nanoparticles even when the target DNA and nanoparticles are combined.

본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 제조된 나노파티클 DNA와 캡처 DNA의 결합 여부를 산란현상을 측정함으로써 확인하였다. 이를 위하여, 상용화된 HPV(Human Papillomavirus) DNA 칩에 적용하였다. HPV DNA 칩은 22가지의 HPV type-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있다. 본 발명자들은 상기 HPV DNA 칩을 검증용 DNA 칩으로 사용하여 실시예에서 제조된 탐침 나노파티클 DNA의 DNA 혼성화 반응인 HPV 16 타겟의 샌드위치 혼성화 여부를 레이저 스캐너로 측정하였다(도 6 참조). The present inventors confirmed the binding of nanoparticle DNA and capture DNA prepared by the above method by measuring scattering phenomenon. To this end, it was applied to the commercialized HPV (Human Papillomavirus) DNA chip. The HPV DNA chip is immobilized with 22 HPV type-specific oligonucleotide probes. The present inventors measured the sandwich hybridization of the HPV 16 target, which is a DNA hybridization reaction of the probe nanoparticle DNA prepared in Example, using the HPV DNA chip as a verification DNA chip (see FIG. 6 ).

또한, 상기 HPV DNA 칩에 대하여 실시예에서 제조한 염료-실리카 나노파티클을 사용한 탐침 나노파티클 DNA의 DNA 혼성화 반응을 각각 레이저 스캐너와 디지털 카메라를 사용하여 확인하였다(도 7 참조). 그 결과, 탐침 나노파티클 DNA의 염료인 TMR을 레이저 스캐너로 확인하여 HPV 16형에서 캡쳐 DNA와 타겟 DNA간의 혼성화가 이루어졌음을 확인할 수 있고, 단순히 디지털 카메라로도 확인가능 하였다. 즉, DNA의 산란현상을 이용한 DNA 혼성화 측정의 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.In addition, the DNA hybridization reaction of the probe nanoparticle DNA using the dye-silica nanoparticles prepared in Example for the HPV DNA chip was confirmed using a laser scanner and a digital camera, respectively (see FIG. 7 ). As a result, TMR, which is a dye of the probe nanoparticle DNA, was confirmed by a laser scanner to confirm that hybridization between the capture DNA and the target DNA was performed in HPV type 16, and could be simply confirmed by a digital camera. That is, it was confirmed that the DNA hybridization measurement using the scattering phenomenon of DNA can be usefully used.

또한, 상기 HPV DNA 칩에 대하여 실시예에서 제조한 직경 50 ㎚의 TMR-나노파티클을 사용한 탐침 나노파티클 DNA(나노파티클당 TMR 염료의 수는 대략 103~104라고 계산됨) 및 동일 농도의 TMR-DNA의 DNA 혼성화 정도를 산란현상에 의하여 측정한 S/N(신호/잡음, signal/noise) 비를 측정하였다. 그 결과, 단순히 TMR 만을 사용한 경우에 비하여 TMR-나노파티클의 산란이 매우 증가함을 확인하였고, 아울러 TMR-나노파티클을 사용한 경우의 (S/N)산란/(S/N)형광의 비는 대략 0.7 ~ 1.0인데 반하여 단순히 TMR을 사용한 경우는 10-3 이하임을 확인하였다(도 8 참조). 즉, 나노 파티클의 산란현상에 의한 신호는 노이즈에 비해 매우 확실하게 인식할 수 있으며, 이는 염료가 포함되지 않는 나노파티클의 산란현상에서도 동일하게 측정되었다.Further, the probe nanoparticle DNA using the TMR-nanoparticle having a diameter of 50 nm prepared in Example for the HPV DNA chip (the number of TMR dyes per nanoparticle is calculated to be approximately 10 3 to 10 4 ) and the same concentration The S / N (signal / noise, signal / noise) ratio measured by the degree of DNA hybridization of TMR-DNA was measured. As a result, it was confirmed that the scattering of TMR-nanoparticles was greatly increased compared to the case of using only TMR, and the ratio of (S / N) scattering / (S / N) fluorescence when TMR-nanoparticles were used was approximately In contrast to 0.7 to 1.0, it was confirmed that the case of simply using TMR was 10 −3 or less (see FIG. 8 ). In other words, the signal due to the scattering phenomenon of nanoparticles can be recognized very reliably compared to the noise, which was also measured in the scattering phenomenon of nanoparticles that do not contain dyes.

또한, 다양한 종류의 탐침 형태를 사용한 경우의 DNA 혼성화를 디지털 카메라 및 스캐너를 사용한 산란현상에 의하여 측정하였다(도 9 참조). 그 결과, cy5로 탐침 DNA를 표지한 것은 단순한 디지털 카메라로는 확인할 수가 없고, 스캐너를사용한 경우에만 그 확인이 가능하였다. 이와는 달리 단순 실리카 나노파티클을 탐침 DNA에 부착하여 나노파티클의 산란현상을 이용한 경우에는 디지털 카메라로 만으로도 혼성화 여부를 확인할 수 있었다. DNA 칩의 혼성화 정도의 측정은 나노파티클의 크기, 나노파티클의 농도, 물질의 특성 등에 의해서도 달라질 수 있을 것이다. In addition, DNA hybridization in the case of using various types of probe types was measured by scattering using a digital camera and a scanner (see FIG. 9 ). As a result, the labeling of the probe DNA with cy5 could not be confirmed with a simple digital camera, but only with a scanner. On the other hand, when silica nanoparticles were attached to the probe DNA and scattering of nanoparticles was used, hybridization was confirmed only with a digital camera. The measurement of the degree of hybridization of the DNA chip may also vary depending on the size of the nanoparticles, the concentration of the nanoparticles, and the properties of the materials.

상기 DNA 혼성화 측정방법에 이용되는 탐침 나노파티클 DNA의 제조방법에 있어서, 상기 탐침 DNA에 결합하는 물질은 바이오틴(biotin)인 것이 바람직하고, 상기 나노파티클은 실리카로 제조되며, 실리카 표면은 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane)으로 실란화(silanization) 처리해서 아민기를 도입하고, 여기에 글루타알데하이드(glutaraldehyde)를 이용하여 실리카 표면에 아비딘(avidin)을 결합시키는 것이 바람직하다.In the method for producing the probe nanoparticle DNA used in the DNA hybridization measurement method, the material binding to the probe DNA is preferably biotin (biotin), the nanoparticles are made of silica, the silica surface is 3-amino It is preferable to introduce an amine group by silanization treatment with 3-aminopropyltrimethoxysilane and to bind avidin to the surface of silica using glutaraldehyde.

본 발명의 탐침 나노파티클 DNA를 이용한 DNA 혼성화의 측정은 종래의 DNA 칩에서와 같은 표지물질 없이 DNA 혼성화 여부의 측정이 가능하다.DNA hybridization using the probe nanoparticle DNA of the present invention can be determined whether or not DNA hybridization without a label as in the conventional DNA chip.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the present invention is not limited to the contents of the present invention.

<실시예 1> 나노파티클의 합성Example 1 Synthesis of Nanoparticles

본 발명자들은 산란현상을 이용한 DNA 칩의 DNA 혼성화 정도의 측정에 유용하게 이용가능한 탐침 나노파티클 DNA를 제조하기 위한 전 단계로 나노파티클을 제조하였다. 나노파티클의 예로 실리카 나노파티클을 이용하였고, 이러한 실리카 나노파티클만으로 이루어지거나 여기에 염료가 포함된 염료-실리카 나노파티클을 합성하였다.The present inventors prepared nanoparticles as a preliminary step to prepare probe nanoparticle DNA which can be usefully used for measuring the degree of DNA hybridization of DNA chips using scattering. As an example of nanoparticles, silica nanoparticles were used, and dye-silica nanoparticles composed of only these silica nanoparticles or dyes were synthesized.

<1-1> 염료-실리카 나노파티클의 합성<1-1> Synthesis of Dye-Silica Nanoparticles

본 발명자들은 염료-나노파티클의 한 예로 염료-실리카 나노파티클을 합성하였다. 그 합성 과정을 도 2에 제시하였다. 이때, 염료로는 TMR(tetramethyl rhodamine)을 사용하였고, 염료가 도핑된 입자는 실리카 모노머(TEOS)를 중합시켜 만드는 것으로 도 2를 보다 자세히 설명하면, 실리카 모노머를 계면활성제에 증착시키고 이들을 계속적으로 충돌시켜 성장시켰다. 그 결과, 충분한 크기에 도달한 염료-실리카 나노파티클만을 분리시켰다. We have synthesized dye-silica nanoparticles as an example of dye-nanoparticles. The synthesis process is shown in FIG. 2 . In this case, TMR (tetramethyl rhodamine) was used as the dye, and the dye-doped particles were made by polymerizing silica monomer (TEOS). Referring to FIG. 2 in more detail, silica monomer was deposited on a surfactant and continuously collided with them. To grow. As a result, only the dye-silica nanoparticles which reached a sufficient size were separated.

그 결과, 충분한 크기의 염료-실리카 나노파티클을 제조함으로써 염료를 충분한 크기로 나노화하였으며, 이것은 단순히 형광표지만이 아니라 충분한 크기의 형광물질과 실리카 파티클이 결합하여 신규 나노파티클을 형성하였음을 나타낸다.As a result, the dye was nanoscaled to a sufficient size by preparing a sufficient size of dye-silica nanoparticles, indicating that not only a fluorescent label but also a sufficient size of fluorescent material and silica particles were combined to form new nanoparticles.

<1-2> 단순 실리카 나노파티클의 합성<1-2> Synthesis of Simple Silica Nanoparticles

본 발명자들은 상기 실시예 1-1에서 TMR과 같은 염료가 포함되지 아니한 것이고, 비슷한 크기의 Bangs Laboratories, Inc 사의 SILICA MICROSPHERE PLAIN으로 O.3 ㎛의 것을 사용하였으며 본 발명자들은 이를 단순 실리카 나노파티클이라 명명하였다.The present inventors did not include dyes such as TMR in Example 1-1, and used a SILICA MICROSPHERE PLAIN of Bangs Laboratories, Inc. of a similar size, and having a diameter of 0.3 µm, and the inventors named it as simple silica nanoparticles. It was.

<실시예 2> 탐침 나노파티클 DNA의 제조Example 2 Preparation of Probe Nanoparticle DNA

상기 실시예 1에서 제조한 실리카 나노파티클을 이용하여 탐침 나노파티클 DNA를 제조하였다. 구체적으로 상기 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 제조한 각각의 실리카 나노파티클(염료-실리카 나노파티클과 단순 실리카 나노파티클)의 실리카 표면을 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane)으로 실란화(silanization) 처리해서 아민기를 도입하고, 이어서 글루타알데하이드(glutaraldehyde)를 이용하여 실리카 표면에 아비딘(avidin)을 결합시켰다. 그리고 나서, 상기 제조된 아비딘이 결합된 나노파티클과 3'에 바이오틴(biotin)이 도입된 DNA와 반응시켜 DNA와 나노파티클을 컨쥬게이션(conjugation)시켜 탐침 나노파티클 DNA를 제조하였다(도 4). 도 4에 제시된 합성 과정은 당업자에게 자명한 사실로서 자세한 설명은 생략한다.Probe nanoparticle DNA was prepared using the silica nanoparticles prepared in Example 1 . Specifically, the silica surface of each of the silica nanoparticles (dye-silica nanoparticles and simple silica nanoparticles) prepared in Examples 1-1 and 1-2 was prepared with 3-aminopropyltrimethoxysilane (3-aminopropyltrimethoxysilane. ) Was introduced into an amine group by silanization treatment, and then avidin was bound to the silica surface using glutaraldehyde. Then, the prepared avidin-bound nanoparticles and 3 'biotin (biotin) introduced into the DNA was reacted (conjugated) DNA and nanoparticles to prepare a probe nanoparticle DNA ( Fig. 4 ). 4 is a fact apparent to those skilled in the art, and a detailed description thereof will be omitted.

<실시예 3> 탐침 나노파티클 DNA의 산란현상을 이용한 DNA 혼성화 검출Example 3 DNA Hybridization Detection Using Scattering of Probe Nanoparticle DNA

상기 실시예 2에서 제조한 탐침 나노파티클 DNA가 산란현상을 이용한 DNA 칩의 DNA 혼성화 검출에 유용하게 이용가능함을 확인하였다. 이하, 사용된 검사용 DNA 칩 및 확인 과정을 자세히 살펴보면 다음과 같다.It was confirmed that the probe nanoparticle DNA prepared in Example 2 could be usefully used for detecting DNA hybridization of DNA chips using scattering. Hereinafter, a detailed look at the DNA chip and the verification process used are as follows.

<3-1> 검사용 DNA 칩<3-1> DNA chip for inspection

본 발명자들이 검사용으로 사용한 DNA칩은 (주)바이오메드랩의 HPV DNA 칩이다. 상기 칩의 캡쳐 DNA(서열번호 1: 5'H2N-TATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATA-3')로 유리 표면에 22 가지 HPV type-특이적 올리고뉴클레오타이드가 고정된 것을 이용하였다. 참고적으로, HPV는 DNA 바이러스로서 여성의 자궁경부암을 유발하며 여러 가지 악성 종양과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.The DNA chip used by the present inventors for the test is the HPV DNA chip of Biomed Lab. Twenty-two HPV type-specific oligonucleotides were immobilized on the glass surface by using the capture DNA of the chip ( SEQ ID NO : 5'H 2 N-TATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATA-3 '). For reference, HPV is a DNA virus that causes cervical cancer in women and is known to be closely related to various malignancies.

<3-2> 혼성화 및 탐침 나노파티클 DNA의 샌드위치 혼성화<3-2> Hybridization and Sandwich Hybridization of Probe Nanoparticle DNA

상기 실시예 3-1의 검사용 DNA 칩에 시료 내의 타겟 DNA(서열번호 2 : 5'-ATTGAATCAAGTTATGTAGTTTCTGAAGTAGATATGGCAGCACATA-3)를 완충액에 유지시킨 상태로 상기 칩에 흘려주어 혼성화 형성을 유도한 뒤, 혼성화되지 않은 시료 및 완충액을 제거하였다. 그리고 나서, 상기 실시예 2의 나노파티클과 결합한 탐침 DNA(서열번 호 3 : 5'-ACTTGATTCAAT-3')(탐침 나노파티클 DNA)를 서열번호 2의 타겟 DNA의 남은 부분과 혼성화시켰다(도 1(B)). 이하, 혼성화 방법은 당업자에게는 자명하기에 구체적인 과정은 생략한다.The target DNA ( SEQ ID NO : 2′-ATTGAATCAAGTTATGTAGTTTCTGAAGTAGATATGGCAGCACATA-3) in the sample was kept in a buffer in the test DNA chip of Example 3-1 , and flowed into the chip to induce hybridization formation, and then not hybridized. Samples and buffers were removed. Then, the probe DNA ( SEQ ID NO : 5'-ACTTGATTCAAT-3 ') (probe nanoparticle DNA) bound to the nanoparticles of Example 2 was hybridized with the remainder of the target DNA of SEQ ID NO: 2 ( FIG. 1). (B) ). Hereinafter, the hybridization method will be apparent to those skilled in the art, so a specific process is omitted.

<3-3> 산란현상을 이용한 DNA칩의 DNA 혼성화 확인<3-3> DNA hybridization of DNA chips using scattering

상기 실시예 3-2의 DNA칩의 DNA 혼성화에 따른 결과를 확인하였다. 구체적으로, 도 7에 HPV 16형이 반응한 결과를 나타내었으며, 이것은 아울러 상기 HPV(Human Papillomavirus) DNA 칩에 대한 본 발명의 탐침 나노파티클 DNA의 작용을 나타내는 개념도를 나타낸다. 도 8에서 탐침 나노파티클 DNA가 혼성화된 부위에서만 산란이 일어남을 확인할 수 있으며, 다른 부위에서는 서열번호 1로 기재되는 캡쳐 DNA와 서열번호 2로 기재되는 타겟 DNA의 혼성화 형성이 이루어지지 않은 것으로 파악되었다. 참고적으로 산란정도를 측정하는 방법 중 하나는 DNA칩에 45도 정도의 각도로 레이저 빔을 조사하고 그렇게 되면 레이저 빔이 전방향으로 산란을 하게 되는데 이 산란된 빛을 검출기로 측정하여 산란 정도를 비교할 수 있다. The result of DNA hybridization of the DNA chip of Example 3-2 was confirmed. Specifically, FIG. 7 shows the results of the reaction of HPV 16, which also shows a conceptual diagram showing the action of the probe nanoparticle DNA of the present invention on the HPV (Human Papillomavirus) DNA chip. In FIG. 8, it can be seen that scattering occurs only at the site where the probe nanoparticle DNA is hybridized, and the hybridization of the capture DNA described in SEQ ID NO: 1 and the target DNA described in SEQ ID NO: 2 was not performed at other sites. . For reference, one of the methods of measuring the scattering degree is to irradiate the laser beam to the DNA chip at an angle of about 45 degrees, and then the laser beam scatters in all directions. The scattered light is measured by a detector Can be compared.

아울러, 레이저 스캐너와 디지털 카메라를 사용하여 본 발명의 탐침 나노파티클 DNA의 산란현상을 이용한 DNA 혼성화 측정방법의 유용성을 확인하였다(도 8). 구체적으로, 탐침 나노파티클 DNA의 염료인 TMR을 레이저 스캐너로 확인하여 본 결과, HPV 16형에서 캡쳐 DNA와 타겟 DNA간의 혼성화가 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 또한, 레이져 스캐너를 사용하지 않고, 보다 단순히 디지털 카메라로 만으로 도 동일한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, 실리카 나노파티클의 직경이 10배만 증가하더라도 상기에서 설명한 바와 같이 산란현상은 100 만배가 증가하기 때문에 파티클의 크기 조정을 통해서 더욱 더 그 확인을 명확하게 할 수 있을 것이다.In addition, the use of a laser scanner and a digital camera confirmed the usefulness of the DNA hybridization measurement method using the scattering phenomenon of the probe nanoparticle DNA of the present invention ( FIG. 8 ). Specifically, as a result of confirming TMR, which is a dye of probe nanoparticle DNA, by laser scanner, it was confirmed that hybridization between capture DNA and target DNA was performed in HPV type 16. In addition, it was confirmed that the same result was obtained by simply using a digital camera without using a laser scanner. That is, even if the diameter of the silica nanoparticles increases only 10 times, as described above, since the scattering phenomenon increases by 1 million times, the identification of the particles may be further improved by adjusting the size of the particles.

상기 실시예에서의 염료-나노파티클의 산란현상과 단순한 염료의 형광 발광현상에 의한 S/N 비율을 도 9에 기재하였다. 나노파티클의 산란현상에 의한 신호는 노이즈에 비해 매우 확실하게 인식할 수 있으며, 이는 염료가 포함되지 않는 나노파티클의 산란현상에 있어서도 마찬가지이다. 구체적으로, 실시예에서 제조한 직경 50 ㎚의 TMR-나노파티클을 사용한 탐침 나노파티클 DNA(나노파티클당 TMR 염료의 수는 대략 103~104라고 계산됨) 및 동일 농도의 TMR-DNA의 DNA 혼성화 정도를 산란현상에 의하여 측정한 S/N(신호/잡음, signal/noise) 비를 측정하였다. 그 결과, 단순히 TMR 만을 사용한 경우에 비하여 TMR-나노파티클의 산란이 매우 증가함을 확인하였고, 아울러 TMR-나노파티클을 사용한 경우의 (S/N)산란/(S/N)형광의 비는 대략 0.7 ~ 1.0인데 반하여 단순히 TMR을 사용한 경우는 10-3 이하임을 확인하였다. 9 shows the S / N ratio due to the scattering phenomenon of the dye-nanoparticle and the fluorescence emission of the simple dye. The signal caused by scattering of nanoparticles can be recognized very reliably compared to noise, even in the case of scattering of nanoparticles without dyes. Specifically, probe nanoparticle DNA using 50 nm diameter TMR-nanoparticles prepared in Example (the number of TMR dyes per nanoparticle is calculated to be approximately 10 3 to 10 4 ) and DNA of the same concentration of TMR-DNA. S / N (signal / noise, signal / noise) ratio measured by the degree of hybridization was measured. As a result, it was confirmed that the scattering of TMR-nanoparticles was greatly increased compared to the case of using only TMR, and the ratio of (S / N) scattering / (S / N) fluorescence when TMR-nanoparticles were used was approximately In contrast to 0.7 to 1.0, it was confirmed that the case of simply using TMR was 10 −3 or less.

본 발명의 효과를 더욱 확인하기 위하여 cy5로 표지한 것과 TMR-실리카NP로 표지한 것과 그리고 단순 실리카 NP로 표지한 탐침 DNA를 사용한 것들의 결과를 디 지털 카메라 또는 레이저 스캐너를 이용해 검출한 결과를 도 10에 나타내었다. 그 결과, 단순히 cy5로 탐침 DNA를 표지한 것은 단순한 디지털 카메라로는 확인할 수가 없었고, 고가의 스캐너 장비를 사용하여야만 확인이 가능하였다. 이와는 달리 단순 실리카 나노파티클을 탐침 DNA에 부착하여 나노파티클의 산란현상을 이용한 경우에는 디지털 카메라로 만으로도 혼성화 여부를 확인할 수 있었다. TMR-NP의 경우에는 스캐너를 이용하거나 디지털 카메라를 이용하여 검출한 경우는 모두 충분히 혼성화 여부를 확인할 수 있으며, 따라서 굳이 고가의 스캐너를 쓸 필요가 없었다. 실험 결과 왼쪽 하단 부분이 DNA에 실리카 나노입자가 결합해서 보이는 곳이다. 이 부분의 캡쳐 DNA에 시료중의 특정한 염기서열을 갖는 타겟 DNA가 혼성화되었다는 것을 의미하며, 이러한 것을 검출함에 있어 디지털 카메라 또는 눈으로 확인할 수 있었다. 또는 입자의 크기에 따라서 저가의 다른 스캐너를 사용하더라도 충분히 산란현상을 검출할 수 있게 된다.In order to further confirm the effects of the present invention, the results of detection using cy5 labeled with TMR-silica NP and probe DNA labeled with simple silica NP using a digital camera or a laser scanner are shown . 10 is shown. As a result, the simple labeling of probe DNA with cy5 could not be confirmed with a simple digital camera, but only with expensive scanner equipment. On the other hand, when silica nanoparticles were attached to the probe DNA and scattering of nanoparticles was used, hybridization was confirmed only with a digital camera. In the case of TMR-NP, the detection using a scanner or a digital camera was sufficient to confirm whether the hybridization was sufficient. Therefore, it was not necessary to use an expensive scanner. The bottom left corner shows where the silica nanoparticles bind to DNA. This means that the target DNA having a specific nucleotide sequence in the sample was hybridized to the captured DNA of this part, and it could be confirmed by a digital camera or the eye in detecting this. Alternatively, scattering may be sufficiently detected even if other low-cost scanners are used, depending on the particle size.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 DNA칩의 DNA 혼성화를 측정하는 신규 방법을 제시하고 있으므로, 형광물질의 표지나 그에 따른 별도의 고가의 광학기계 없이 저가의 램프가 설치된 스캐너 등으로 DNA칩의 DNA 혼성화 정도를 손쉽게 확인할 수 있게 되어 DNA 칩의 활용을 용이하게 하여 DNA 칩의 활성화에 기여한다.As described above, the present invention proposes a novel method for measuring DNA hybridization of DNA chips. Therefore, DNAs of DNA chips can be prepared by scanners equipped with low-cost lamps without labeling fluorescent materials or correspondingly expensive optics. The degree of hybridization can be easily confirmed, thereby facilitating the utilization of the DNA chip, contributing to the activation of the DNA chip.

<110> Seoul National University <120> Detecting Method of DNA Hybridization Using Scattering and Producing Method of Probe NanoParticle DNA Utilizing This Method <130> 6p-08-11 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture DNA <400> 1 tatgtgctgc catatctact tcagaaacta cata 34 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target DNA <400> 2 attgaatcaa gttatgtagt ttctgaagta gatatggcag cacat 45 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe DNA <400> 3 acttgattca at 12 <110> Seoul National University <120> Detecting Method of DNA Hybridization Using Scattering and          Producing Method of Probe NanoParticle DNA Utilizing This Method <130> 6p-08-11 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture DNA <400> 1 tatgtgctgc catatctact tcagaaacta cata 34 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target DNA <400> 2 attgaatcaa gttatgtagt ttctgaagta gatatggcag cacat 45 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe DNA <400> 3 acttgattca at 12

Claims (8)

탐침 나노파티클 DNA(probe nanoparticle DNA)를 이용한 DNA 칩의 빛의 산란 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 칩의 DNA 혼성화(hybridization) 측정방법.A method for measuring DNA hybridization of a DNA chip, characterized by measuring the scattering degree of light of a DNA chip using probe nanoparticle DNA. 제 1항에 있어서, The method of claim 1, ⅰ) 검사용 DNA 칩의 캡처(capture) DNA에 상기 탐침 나노파티클 DNA를 반응시켜 혼성화 형성을 유도하는 단계;Iii) inducing hybridization by reacting the probe nanoparticle DNA with capture DNA of a test DNA chip; ⅱ) 상기 반응 후에 혼성화되지 않은 탐침 나노파티클 DNA를 제거하는 단계; 및Ii) removing unhybridized probe nanoparticle DNA after said reaction; And ⅲ) 상기 DNA 칩의 빛의 산란 정도를 측정하는 단계를 포함하는 상기 DNA칩의 DNA 혼성화 측정방법.Iii) measuring the DNA hybridization of the DNA chip comprising measuring the degree of scattering of light of the DNA chip. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, ⅰ) 검사용 DNA 칩의 캡처 DNA에 시료 DNA를 반응하여 혼성화를 유도하는 단계;Iii) reacting the sample DNA with the capture DNA of the test DNA chip to induce hybridization; ⅱ) 상기 반응후에 혼성화되지 않은 시료 DNA를 제거하는 단계;Ii) removing unhybridized sample DNA after said reaction; ⅲ) 상기 DNA칩에 상기 탐침 나노파티클 DNA를 상기 DNA 칩내의 시료 DNA와 혼성화 형성을 유도하는 단계; 및Iii) inducing hybridization of the probe nanoparticle DNA with the sample DNA in the DNA chip on the DNA chip; And ⅳ) 상기 DNA 칩의 빛의 산란 정도를 측정하는 단계를 포함하는 상기 DNA칩의 DNA 혼성화 측정방법. Iii) measuring the DNA hybridization of the DNA chip comprising measuring the degree of scattering of light of the DNA chip. 제 1항에 있어서, 상기 나노파티클은 실리카(silica), 금, 폴리스티렌(polystyrene) 및 양자점(quantum dot)으로 구성되는 군중에서 선택되는 물질로 제조되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법.The method of claim 1, wherein the nanoparticles are made of a material selected from the group consisting of silica, gold, polystyrene, and quantum dots. 제 4항에 있어서, 상기 나노파티클은 실리카로 제조되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법.The method of claim 4, wherein the nanoparticles are made of silica. 제 1항에 있어서, 상기 나노파티클 내부 또는 외부 표면에 형광물질 또는 방사성 동위원소가 포함되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법.The method of claim 1, wherein the fluorescent material or radioisotope is included in the inner or outer surface of the nanoparticles. 제 6항에 있어서, 상기 형광물질은 TMR(tetramethyl rhodamine)인 것을 특징 으로 하는 DNA 칩의 DNA 혼성화 측정방법.The method of claim 6, wherein the fluorescent material is tetramethyl rhodamine (TMR). 제 1항에 있어서, 상기 DNA 혼성화 측정은 레이저 스캐너 또는 디지털 카메라를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 DNA 혼성화 측정방법.The method of claim 1, wherein the DNA hybridization measurement is performed using a laser scanner or a digital camera.
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