KR20080017208A - A method of amplifying a nucleic acid from a microorgansim using a nonplanar solid substrate - Google Patents
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Abstract
Description
도 1과 2는 SPS를 포함하는 용액을 고체 지지체를 포함하는 유동 장치 내로 흘려주고, 상기 유동장치 통과 전 (도 1)과 후 (도 2)에 상기 용액에 대하여 분광분석한 결과를 나타내는 도면이다. 1 and 2 are diagrams showing the results of spectroscopic analysis of the solution containing the SPS flow into the flow apparatus including a solid support, before the passage of the flow apparatus (Fig. 1) and (Fig. 2) .
도 3은 SPS를 포함하는 혈액 배양물과 SPS를 포함하지 않은 혈액 배양물을, 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치를 이용하여 대장균 세포를 분리 및 파쇄하고, 그 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과로서, 실시간으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 3 shows that E. coli cells are isolated and disrupted by using a flow apparatus including a solid support of the present invention, and a blood culture containing SPS and a blood culture containing SPS, and the DNA in the lysate as a template. It is a figure which shows the result measured in real time as a result of PCR.
도 4는 SPS를 포함하는 혈액 배양물과 SPS를 포함하지 않은 혈액 배양물을, 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치를 이용하여 대장균 세포를 분리 및 파쇄하고, 그 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과로서, PCR 완료 후 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다.4 is a blood culture containing SPS and a blood culture containing no SPS, by using a flow apparatus including a solid support of the present invention, E. coli cells are isolated and crushed, and DNA in the lysate is used as a template. As a result of PCR, it is a figure which shows the result of the electrophoresis of the amplification product after completion of PCR.
도 5는 SPS를 포함하거나 포함하지 않는 다양한 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR하고, 그 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 5 is a diagram showing the results of PCR using various DNA samples with or without SPS as a template and electrophoresis of the amplification products thereof.
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for amplifying nucleic acids from microorganisms using a non-planar solid support.
종래 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법은 미생물 분리, 핵산 분리 및 핵산 증폭 단계가 별도로 독립된 단계로 이루어진다. 미생물의 분리는 원심분리 및 여과법이 사용되어 왔다. The conventional method for amplifying nucleic acids from microorganisms consists of separate stages of microbial separation, nucleic acid separation and nucleic acid amplification. Centrifugation and filtration have been used for the separation of microorganisms.
핵산분리 방법으로, 예를 들면 고상 물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,234,809호에는 핵산에 결합하는 고상물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 시간이 오래 소요되기 때문에 복잡하며, 랩온어 칩에 부적합하다. 또한, 상기 방법은 반드시 카오트로픽 물질을 사용하여야 하는 문제점이 있었다. 즉, 상기 카오트로픽 물질을 사용하지 않는 경우에는 고상 물질에 핵산이 결합하지 않는다.As the nucleic acid separation method, for example, a nucleic acid purification method using a solid material has been known. For example, US Pat. No. 5,234,809 discloses a method for purifying nucleic acids using solid materials that bind to nucleic acids. However, the method is complicated because it takes time and is not suitable for lab-on-a-chip. In addition, the method has a problem that must be used chaotropic material. In other words, when the chaotropic material is not used, the nucleic acid does not bind to the solid material.
또한, 미국특허 제6,291,166호에는 고상 매트릭스를 이용한 핵산의 집적 (archiving) 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 핵산이 고상 매트릭스에 비가역적으로 결합하기 때문에, 상기 핵산 고상 매트릭스 복합체를 보관한 후 나중에 분석 (delayed analysis)하거나 반복 분석 (repeated analysis)하는 것이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 이 방법에 의하면, 알루미나와 같은 표면에 양전하를 띠는 물질을 NaOH와 같은 염기성 물질로 활성화하여야 하고, 핵산은 이렇게 활성화된 알루미나에는 비가역적으로 결합하기 때문에 알루미나로부터 분리할 수 없게 된다.In addition, US Pat. No. 6,291,166 discloses a method for archiving nucleic acids using a solid matrix. Since the nucleic acid binds irreversibly to the solid matrix, the nucleic acid solid matrix complex may be stored and then analyzed later or repeated. However, according to this method, a positively charged material such as alumina must be activated with a basic material such as NaOH, and the nucleic acid cannot be separated from the alumina because it irreversibly binds to the activated alumina.
미국 특허 제5,705,628호에는 DNA를 포함하는 용액을 염 및 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 카르복실기로 코팅된 표면을 갖는 자성 마이크로입자를 결합시켜 가역적 및 비특이적으로 DNA를 결합시키는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 DNA를 분리하기 위해 카르복실기 표면을 갖는 자성 입자, 염 및 폴리에틸렌 글리콜을 이용하고 있다.US Pat. No. 5,705,628 describes a method for mixing reversible and nonspecifically binding DNA by mixing magnetic microparticles having a surface coated with a carboxyl group by mixing a solution comprising DNA with a salt and polyethylene glycol. The method utilizes magnetic particles, salts and polyethylene glycols having a carboxyl group surface to separate DNA.
상기한 바와 같은, 기존의 핵산의 분리 및 정제 방법은 핵산을 결합시키기 위해 별도로 고농도의 시약을 첨가해야 하는데 이는 PCR과 같은 후속 공정에 영향을 줄 수 있으며, 또한 랩온어칩 (LOC) 상에 적용하기 힘들다는 문제점이 있었다. 또한, 종래의 핵산 분리 및 정제 방법은 미생물의 정제 또는 농축과는 별개의 독립된 단계로서 구성되어 있으며, 상기 미생물을 분리하는 단계와 상기 미생물로부터 핵산을 증폭하는 단계가 하나의 용기 내에서 수행되는 방법은 알려진 바 없다. As described above, existing nucleic acid isolation and purification methods require the addition of high concentrations of reagents separately to bind the nucleic acids, which may affect subsequent processes such as PCR, and are also applied on lab-on-a-chip (LOC). There was a problem that was difficult to do. In addition, the conventional nucleic acid separation and purification method is configured as a separate step separate from the purification or concentration of the microorganism, wherein the step of separating the microorganism and amplifying the nucleic acid from the microorganism in a single container Is unknown.
따라서, 기판과 같은 고체 표면상에 미생물을 부착시켜 미생물을 분리 또는 농축할 수 있는 동시에, 핵산에 대한 친화성이 높아 상기 미생물로부터 유래하는 핵산을 정제 또는 농축할 수 있는 고체 지지체를 이용한, 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법이 요구되고 있었다. Therefore, microorganisms can be separated or concentrated by attaching microorganisms on a solid surface such as a substrate, and have a high affinity for nucleic acids, and using a solid support capable of purifying or concentrating nucleic acids derived from the microorganisms. There is a need for a method for amplifying nucleic acids.
또한, 종래 혈액 중의 미생물을 검출하는 방법에 있어서, 상기 미생물의 농도는 아주 낮은 경우가 많아 직접적으로 상기 미생물을 검출할 수 없는 경우가 많다. 이를 해결하기 위한 방법으로, 상기 혈액을 배양하여 상기 미생물을 증식시키는 방법이 이용되어 왔다. 상기 혈액 배양에는 일반적으로 소듐 폴리아네톨 술포네이트 (sodium polyanethol sulfonate: 이하 SPS라고도 함)가 포함된 배지가 사용되 어 있고 있다 (예를 들면, Blood Culture Bottle (BC). http://www.hylabs.co.il/SiteFiles/1/36/180.asp). 소듐 폴리아네톨 술포네이트는 혈액 배양에서 박테리아 세포의 생존을 위하여 사용되는 폴리 음이온 항응고제이다, SPS는 핵산의 염기와 유사한 구조를 가지고 있어, 인터칼레이터로서 작용하여, PCR을 저해하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 SPS는 상업적으로 알려진 핵산 분리 키트 (예를 들면, QIAgen 키트)에 의하여 제거되지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 종래 SPS를 포함하는 시료, 예를 들면 SPS를 포함하는 혈액 배양물로부터 PCR을 통하여 핵산을 증폭하고자 하는 경우, 상기 시료를 높은 약 5,000 배 이상으로 희석한다. 또는, 종래 상업적으로 구입가능한 핵산 분리 키트를 이용하여 분리된 핵산으로부터 별도의 SPS 제거 과정을 거쳐야 하는 문제점이 있었다. In the conventional method for detecting microorganisms in blood, the concentration of the microorganisms is often very low, and in many cases the microorganisms cannot be detected directly. As a method for solving this problem, a method of culturing the blood to propagate the microorganism has been used. In the blood culture, a medium containing sodium polyanethol sulfonate (hereinafter also referred to as SPS) is generally used (for example, Blood Culture Bottle (BC). hylabs.co.il/SiteFiles/1/36/180.asp). Sodium polyanetol sulfonate is a polyanion anticoagulant used for the survival of bacterial cells in blood cultures. SPS is known to inhibit PCR by acting as an intercalator because it has a structure similar to that of a nucleic acid base. It is also known that the SPS is not removed by commercially known nucleic acid isolation kits (eg, QIAgen kits). Therefore, when amplification of nucleic acid by PCR from a sample containing SPS, for example, a blood culture containing SPS, the sample is diluted to about 5,000 times higher. Or, there is a problem that a separate SPS removal process from the nucleic acid separated using a conventional commercially available nucleic acid separation kit.
본 발명의 목적은 비평면 형상의 표면을 갖는 고체 지지체를 이용하여 SPS를 포함하는 미생물 시료로부터 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for amplifying a nucleic acid from a microbial sample comprising SPS using a solid support having a non-planar surface.
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 혈액 배양물을 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계, The present invention comprises the steps of attaching the microorganism to the solid support by contacting a non-planar solid support and a blood culture containing the microorganism in the range of pH 3.0 to 6.0,
상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하여 제거하는 단계, 및Washing and removing material not attached to the solid support, and
상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물에 대하여 PCR을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법으로서, A method for amplifying a nucleic acid from a microorganism, comprising amplifying a nucleic acid by performing PCR on the microorganism attached to the solid support,
상기 접촉단계, 세척 단계, 및 증폭 단계는 동일한 용기 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. The contacting step, the washing step, and the amplifying step are provided in a same vessel.
본 발명의 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법은, 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉에 의하여 상기 미생물은 상기 고체 지지체에 부착하게 된다. The method for amplifying nucleic acid from a microorganism of the present invention includes contacting a non-planar solid support with a sample containing the microorganism in the range of pH 3.0 to 6.0 to attach the microorganism to the solid support. The contact causes the microorganism to adhere to the solid support.
본 명세서에 있어서, "핵산"에는 DNA, RNA 및 PNA가 포함되며, 바람직하게는 DNA이다. As used herein, "nucleic acid" includes DNA, RNA and PNA, preferably DNA.
고체 지지체가 포함되어 있는 액체 매질 중에서, 미생물은 액체 매질 중에 존재하거나 고체 지지체에 부착할 수 있다. 이러한 액체 매질과 고체 지지체 사이의 분포는, 액체 매질의 표면 장력과 박테리아의 표면 장력의 차이에 의하여 결정되는 것으로 알려져 있다. 즉, 액체 매질의 표면 장력이 박테리아의 표면 장력보다 큰 경우, 상기 박테리아는 표면장력이 작은 고체 지지체, 즉 소수성 고체 지지체에 더 잘 부착하고, 박테리아의 표면 장력이 액체 매질의 표면 장력보다 큰 경우, 상기 박테리아는 표면장력이 큰 고체 지지체, 즉 친수성 고체 지지체에 더 잘 부착하고, 박테리아의 표면 장력이 액체 매질의 표면 장력과 동일한 경우에는, 박테리아 세포의 고체 지지체 부착에는 표면 장력의 영향이 없고 정전기적 상호작용과 같은 다른 상호작용이 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다 (Applied and Environmental Microbiology, July 1983, p.90-97). 또한, 상기의 표면 장력에 근거한 열역학적 접근을 통하여, 박테리아 세포가 부착할 뿐만 아니라 정전기적 인력 특성을 통하여서도 박테리아 세포가 표면에 부착할 수 있다는 것도 알려져 있다. 그러나, 이러한 현상들은 그 부착 속도가 매우 느리다는 문제점이 있었다. Among the liquid media in which the solid support is included, the microorganisms may be present in or attached to the solid support. The distribution between this liquid medium and the solid support is known to be determined by the difference between the surface tension of the liquid medium and the surface tension of the bacteria. That is, if the surface tension of the liquid medium is greater than the surface tension of the bacteria, the bacteria adhere better to the solid support, that is, the hydrophobic solid support, the surface tension of the bacteria is greater than the surface tension of the liquid medium, The bacteria adhere better to a solid support having a high surface tension, i.e., a hydrophilic solid support, and when the surface tension of the bacteria is equal to the surface tension of the liquid medium, the attachment of the solid support of the bacterial cells has no effect of surface tension and is electrostatic Other interactions, such as interactions, have been reported to affect (Applied and Environmental Microbiology, July 1983, p. 90-97). It is also known that through thermodynamic approach based on surface tension, bacterial cells can adhere to surfaces not only by bacterial cells but also through electrostatic attraction characteristics. However, these phenomena have a problem that their attachment speed is very slow.
이에 본 발명자들은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자, 비평면 형상의 고체 지지체를 사용하는 동시에, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 상기 고체 지지체와 접촉시킴으로써, 높은 수율로 미생물을 분리할 수 있음을 확인하였다. 이는 고체 지지체의 표면적이 증가하는 동시에, pH 3.0 내지 6.0의 액체 매질을 사용함으로써 미생물의 세포막이 변성되어 용액에 대한 용해도가 저하되어 고체 표면에 부착하는 비율이 상대적으로 높아지는 것으로 여겨지나, 본 발명의 범위가 이러한 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. In order to solve the problems of the prior art as described above, the present inventors use a non-planar solid support, and at the same time by contacting the sample containing microorganisms with the solid support in the range of pH 3.0 to 6.0, It was confirmed that the microorganisms can be separated. This is believed to increase the surface area of the solid support and at the same time, by using a liquid medium of pH 3.0 to 6.0, the cell membrane of the microorganisms is denatured, solubility in the solution is lowered, so that the rate of attachment to the solid surface is relatively high, but of the present invention The scope is not limited to this particular mechanism.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 상기 시료는 소듐 폴리아네톨 술포네이트 (sodium polyanethol sulfonate: 이하 SPS라고도 함)를 포함하는 생물학적 시료일 수 있다. 본 발명에 있어서, "생물학적 시료 (biological sample)"란 개체로부터 분리된 세포 또는 생물학적 액체와 같은, 세포 또는 조직물을 포함하거나 그들로 구성된 시료를 의미한다. 상기 개체는 사람을 포함한 동물일 수 있다. 생물학적 시료의 예에는, 타액, 가래, 혈액, 혈액 세포 (예, 백혈구, 적혈구), 혈액 배양물, 양막액, 혈청, 정액, 골수, 조직 또는 미세 바늘 생검 시료, 뇨, 복막액, 늑막액 및 세포 배양물이 포함된다. 생물학적 시료에는 조직학적 목적을 위하여 취하여진 냉동 절편과 같은 조직 절편이 포함된다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료는, 인간 환자로부터 유래된 시료인 "임상 시료 (clinical sample)"이고, 더욱 바람직하게는, 상기 시료는 혈액, 뇨, 타액, 또는 가래이다. In the contacting step, the sample may be a biological sample including sodium polyanethol sulfonate (hereinafter also referred to as SPS). In the present invention, "biological sample" means a sample containing or consisting of cells or tissues, such as cells or biological liquids isolated from an individual. The subject may be an animal including a human. Examples of biological samples include saliva, sputum, blood, blood cells (e.g. white blood cells, red blood cells), blood cultures, amniotic fluid, serum, semen, bone marrow, tissue or microneedle biopsy samples, urine, peritoneal fluid, pleural fluid and Cell cultures are included. Biological samples include tissue sections, such as frozen sections taken for histological purposes. Preferably, the biological sample is a "clinical sample" which is a sample derived from a human patient, and more preferably, the sample is blood, urine, saliva, or sputum.
소듐 폴리아네톨 술포네이트 (sodium polyanethol sulfonate: 이하 SPS라고도 함)는 혈액 배양에서 박테리아 세포의 생존을 위하여 사용되는 폴리 음이온 항응고제이다, SPS는 핵산의 염기와 유사한 구조를 가지고 있어, 인터칼레이터로서 작용하여, PCR을 저해하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 SPS는 상업적으로 알려진 핵산 분리 키트 (예를 들면, QIAgen 키트)에 의하여 제거되지 않는 것으로 알려져 있다. Sodium polyanethol sulfonate (also called SPS) is a polyanionic anticoagulant used for the survival of bacterial cells in blood cultures. SPS acts as an intercalator because it has a structure similar to that of a nucleic acid base. This is known to inhibit PCR. It is also known that the SPS is not removed by commercially known nucleic acid isolation kits (eg, QIAgen kits).
본 발명에 있어서, 분리의 대상이 되는 미생물에는 박테리아 세포, 곰팡이 및 바이러스가 포함된다. In the present invention, microorganisms to be isolated include bacterial cells, fungi and viruses.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 상기 미생물을 낮은 pH에서 완충 역할을 할 수 있는 용액 또는 버퍼에 의하여 희석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼 (예, 소듐 포스페이트, pH 3.0 내지 6.0) 또는 아세테이트 버퍼 (소듐 아세테이트, pH 3.0 내지 6.0)로 희석된 것일 수 있다. 상기 희석의 정도는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는, 1:1 내지 1:1,000의 배율, 더욱 바람직하게는, 1:1 내지 1:10의 배율로 희석되는 것일 수 있다.In the contacting step, the sample may be diluted with a solution or a buffer that can serve as a buffer for the microorganism at low pH. Preferably, the buffer may be diluted with phosphate buffer (eg sodium phosphate, pH 3.0 to 6.0) or acetate buffer (sodium acetate, pH 3.0 to 6.0). The degree of dilution is not particularly limited, but may be preferably diluted at a magnification of 1: 1 to 1: 1,000, more preferably 1: 1 to 1:10.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 염 농도를 갖는 것이다. 상기 시료는, 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 아세테이트 및 포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 이온 농도를 갖는 것이다In the contacting step, the sample is one having a salt concentration of 10 mM to 500 mM, preferably 50 mM to 300 mM. The sample has an ion concentration selected from the group consisting of 10 mM to 500 mM, preferably 50 mM to 300 mM acetate and phosphate.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 비평면 형상을 가지고 있어, 표면적이 평면에 비하여 증가되어 있는 표면을 갖는 것이다. 상기 고체 지지체는 표면에 요철 구조가 형성되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "요철 구조"란 표면이 부드럽지 않고 오목함과 볼록함이 있는 구조를 말한다. 이러한 요철 구조에는 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 표면 또는 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 망상 구조를 갖는 표면이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. In the contacting step, the solid support has a non-planar shape and thus has a surface whose surface area is increased compared to the plane. The solid support may be a concave-convex structure is formed on the surface. In the present invention, the "concave-convex structure" refers to a structure having a concave and convex surface without smooth surface. The uneven structure includes a surface having a columnar structure in which a plurality of pillars are formed or a surface having a network structure in which a plurality of pores is formed, but is not limited to these examples.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체, 및 표면에 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 있다. 상기 고제 지지체는, 단독으로 또는 복수 개의 상기 고체 지지체의 집합 (예를 들면, 관 또는 용기 내에 충진된 집합체)으로 사용될 수 있다. In the contacting step, the non-planar solid support may have any shape. For example, a solid support having a pillar structure having a plurality of pillars formed on a surface thereof, a solid support having a bead shape, and a sieve structure having a plurality of pores formed on a surface thereof. It may be selected from the group consisting of a solid support. The solid support may be used alone or as a collection of a plurality of the solid supports (eg, an aggregate packed in a tube or a container).
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 미세유동장치 내의 마이크로채널 또는 마이크로챔버의 내벽의 형태인 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 입구 및 출구가 구비되어 있고, 상기 입구 및 출구가 채널 또는 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device) 내에서 수행될 수 있다. In the contacting step, the solid support may be in the form of an inner wall of the microchannel or microchamber in the microfluidic device. Thus, the method of the present invention may be carried out in a fluidic device or microfluidic device having one or more inlets and outlets, the inlets and outlets communicating through channels or microchannels. have.
본 발명의 방법의 제1 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 그 표면에 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 것일 수 있다. 고체 지지체 상에 기둥 (pillar)을 제조하는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 반도체 제조 공정에 사용되는 포토리소그래피 공정 등을 사용하여 미세 기둥을 높은 밀도로 형성시킬 수 있다. 상기 기둥은 어스팩 비 (aspect ratio)가 1:1 내지 20:1인 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "어스팩 비 (aspect ratio)" 란 기둥의 단편 직경 대 높이의 비율을 의미한다. 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것일 수 있다. 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것일 수 있다. In a first embodiment of the method of the present invention, in the contacting step in the method of the present invention, the solid support may have a columnar structure in which a plurality of pillars are formed on the surface thereof. The manufacture of pillars on solid supports is well known in the art. For example, fine pillars can be formed at high density using a photolithography process or the like used in a semiconductor manufacturing process. Preferably, the pillar has an aspect ratio of 1: 1 to 20: 1, but is not limited thereto. In the present invention, "aspect ratio" means the ratio of the fragment diameter to the height of the pillar. The pillar structure may be a ratio of the distance between the pillar height and the pillar is 1: 1 to 25: 1. The pillar structure may have a distance between the pillars in a range of 5 μm to 100 μm.
본 발명의 방법에 있어서 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성은 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 코팅되어, 부여되는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 자가조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. In the contacting step in the method of the present invention, the non-planar solid support may have a hydrophobicity of 70 ° to 95 ° water contact angle. The hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 ° consists of octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxysilane (DFS). The compound selected from the group may be coated and given. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° preferably has octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxy in the SiO 2 layer of the solid support. Compounds selected from the group consisting of silanes (DFS) may be self-assembled monolayer (SAM) coated.
본 발명의 방법에서, 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 상기 고체 지지체의 표면에 폴리에틸렌이민트리메톡 시실란 (PEIM)이 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 코팅된 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 자기조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 양전하를 띤다.In the method of the present invention, in the contacting step, the non-planar solid support may have one or more amine-based functional groups on its surface. The surface having at least one functional group of the amine system may be coated with polyethyleneiminetrimethoxysilane (PEIM) on the surface of the solid support. The coated surface may preferably be a self-assembled monomolecular (SAM) coating of polyethyleneiminetrimethoxysilane (PEIM) on the SiO 2 layer of the solid support. The amine-based functional group has a positive charge in the range of pH 3.0 to 6.0.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고제 지지체는 상기한 바와 같은 물 접촉각 특성을 갖는 것 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 것이면 어떠한 재질의 지지체도 포함된다. 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 및 플라스틱 물질 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 표면은, 상기 표면을 가진 고체 지지체에 미생물을 포함하는 시료가 접촉되는 경우, 미생물이 부착하는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. In the method of the present invention, in the contacting step, the solid support includes a support of any material as long as it has water contact angle characteristics as described above or one or more amine-based functional groups on its surface. For example, glass, silicon wafers, plastic materials, and the like are included, but are not limited to these examples. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° or a surface having at least one amine-based functional group on the surface thereof is considered to be attached to the microorganism when the sample containing the microorganism contacts the solid support having the surface. The present invention is not limited to a specific mechanism.
본 발명의 방법은, 상기 접촉 단계 후에 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하여 제거하는 단계를 포함한다. 상기 세척에는 상기 고체 지지체 표면에 부착된 목적 미생물은 상기 고체 지지체로부터 이탈시키지 않으면서, 후속 공정에 악영향을 미칠 수 있는 불순물 등을 제거할 수 있는 임의의 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, 결합 버퍼로 사용된 아세테이트 버퍼 및 포스페이트 버퍼 등이 사용될 수 있다. 상기 세척 용액은 바람직하게는, pH 3.0 내지 6.0의 범위에 포함되는 pH를 갖는 버퍼이다. The method includes washing and removing material that is not attached to the solid support after the contacting step. In the washing, any solution capable of removing impurities and the like which may adversely affect subsequent processes may be used without causing the target microorganism attached to the surface of the solid support to detach from the solid support. For example, acetate buffers and phosphate buffers used as binding buffers can be used. The wash solution is preferably a buffer having a pH in the range of pH 3.0 to 6.0.
본 발명의 방법은 또한, 상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물에 대하여 PCR을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다. The method also includes amplifying the nucleic acid by performing PCR on the microorganism attached to the solid support.
상기 증폭 단계에 있어서, 상기 핵산 증폭에는 당업계에 알려진 임의의 증폭 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 PCR에 의하여 수행되는 것이다. "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. PCR에는 일반적으로 주형, 프라이머, DNA 중합효소, DNA 단량체로서 4가지 종류의 dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 및 버퍼가 포함된다. 본 발명의 증폭 단계에서는, 상기 주형 DNA는, PCR 중의 열순환 (thermal cycling)에 의하여 상기 고체 지지체 중에 부착된 미생물로부터 노출되는 핵산이 사용된다. 따라서, 상기 PCR은 예를 들면, 상기 주형 DNA를 제외한 PCR 반응 성분을 상기 미생물이 부착된 고체 지지체가 포함되어 있는 용기에 첨가하고, PCR을 수행함으로써 표적 핵산을 증폭할 수 있다. 상기 PCR을 위한 열 순환 중에서 세포가 파쇄되는 단계는, 전 변성 및/또는 변성 단계로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 증폭 단계에 있어서, 상기 주형 DNA는 별도의 분리과정을 거치지 않고, 상기 고체 지지체에 부착된 미생물 중에 포함되어 있는 상태로서 PCR 반응에 사용된다. In the amplification step, any nucleic acid amplification method known in the art may be used for the nucleic acid amplification, and is preferably performed by PCR. "PCR" refers to a polymerase chain reaction, and is a method of amplifying a target nucleic acid from a primer pair that specifically binds to the target nucleic acid using the polymerase. PCR generally includes four types of dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) and buffers as templates, primers, DNA polymerases, DNA monomers. In the amplification step of the present invention, the template DNA is a nucleic acid exposed from the microorganisms attached to the solid support by thermal cycling during PCR. Therefore, the PCR can amplify a target nucleic acid by, for example, adding a PCR reaction component other than the template DNA to a container containing the solid support to which the microorganism is attached, and performing PCR. The step of crushing cells in the thermal cycle for the PCR is considered to be a pre-denatured and / or denatured step, but the present invention is not limited to a specific mechanism. Therefore, in the amplification step, the template DNA is used in the PCR reaction as contained in the microorganism attached to the solid support without undergoing a separate separation process.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 접촉단계, 세척 단계, 및 증폭 단계는 동일한 용기 내에서 수행된다. 상기 용기는 예를 들면, 마이크로채널, 마이크로챔버 및 튜브 등이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 미세유동장치에 형성되어 있는, 마이크로챔버로서, PCR 장치가 구비되어 있는 것이다. 상 기 PCR 장치는 히터, 냉각기 및 온도 조절기를 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은, 상기 핵산 추출이 마이크로챔버에서 수행되고, 상기 핵산 증폭이 동일한 상기 마이크로챔버에서 수행되는 것일 수 있다. In the method of the present invention, the contacting step, the washing step, and the amplifying step are performed in the same vessel. The vessel may be, for example, microchannels, microchambers and tubes, but is not limited to these examples. Preferably, the microchamber formed in the microfluidic device is provided with a PCR device. The PCR apparatus includes a heater, a cooler, and a temperature controller. Thus, the method of the present invention may be such that the nucleic acid extraction is performed in a microchamber and the nucleic acid amplification is performed in the same microchamber.
실시예Example
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1 : 기둥 구조를 갖는 고체 지지체에 소듐 1: sodium on a solid support having a columnar structure 폴리아네톨Polyantol 술포네이트가Sulfonate 결합하는지 여부의 확인 Confirmation of joining
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 7.5 mm x 15 mm인 칩 (칩 1) 및 10 mm x 23 mm인 칩 (칩 2) 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체를 포함하는 챔버를 갖는 유동 장치에 소듐 폴리아네톨 술포네이트 (sodium polyanethol sulfonate : SPS)를 포함하는 용액을 흘려주였다. 상기 용액에 대하여, 상기 유동 장치 통과 전 후에 분광 분석을 수행하여, SPS가 고체 지지체에 부착하는지를 확인하였다. In this embodiment, the inlet and outlet are provided and include a solid support having an array of pillars formed on a chip having a size of 7.5 mm x 15 mm (chip 1) and a chip having a size of 10 mm x 23 mm (chip 2). A solution comprising sodium polyanethol sulfonate (SPS) was flowed into a flow device with a chamber. For the solution, spectroscopic analysis was performed before and after passing through the flow device to confirm that the SPS adhered to the solid support.
상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다. 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 Si02 층으로 되어 있다. In the pillar array, the distance between the pillars is 15 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side. The surface of the region in which the pillar array is formed has a SiO 2 layer.
상기 SPS를 포함하는 용액은 혈액 배양 배지 용액 중 0.05% SPS 용액을 사용 하였다. 상기 시료를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 200 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. The solution containing the SPS was used 0.05% SPS solution in blood culture medium solution. The sample was injected at the inlet to flow through the chamber to the outlet. The flow rate was 200 μl / min and 500 μl flowed.
도 1과 2는 SPS를 포함하는 용액을 고체 지지체를 포함하는 유동 장치 내로 흘려주고, 상기 유동장치 통과 전 (도 1)과 후 (도 2)에 상기 용액에 대하여 분광분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 1과 2에 나타낸 바와 같이, 상기 유동장치 통과 전후의 분광곡선은 거의 동일하였다. 이는 상기 SPS는 본 실시예에 사용된 고체 지지체에는 전혀 부탁하지 않는다는 것을 나타낸다. 상기 칩 1과 2에서, 비슷한 결과가 관찰되었으며, 도 1과 2는 상기 칩 1을 사용한 실험한 결과이다. 1 and 2 are diagrams showing the results of spectroscopic analysis of the solution containing the SPS flow into the flow apparatus including a solid support, before the passage of the flow apparatus (Fig. 1) and (Fig. 2) . As shown in Figs. 1 and 2, the spectral curves before and after the passage of the flow apparatus were almost the same. This indicates that the SPS does not attach to the solid support used in this example. Similar results were observed in
실시예Example 2 : 기둥 구조를 갖는 고체 지지체를 이용한 혈액 배양물로부터 핵산의 증폭 : 2: Amplification of Nucleic Acids from Blood Cultures Using a Solid Support Having a Columnar Structure: SPSSPS 의 영향Influence
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm인 칩 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체를 포함하는 챔버를 갖는 유동 장치에 대장균과 SPS를 포함하는 혈액 배양물 흘려주어, 대장균 세포를 상기 고체 지지체에 부착시켰다. 다음으로, 상기 고체 지지체를 세척하여 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 제거하고, 상기 고체 지지체에 부착되어 있는 세포를 용액 중에서 열에 의하여 파쇄하였다. 다음으로, 상기 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. In this embodiment, a blood culture comprising E. coli and SPS is flowed into a flow apparatus having a chamber including a solid support having an inlet and an outlet and an array of pillars formed on a chip having a size of 10 mm x 23 mm. Given, E. coli cells were attached to the solid support. Next, the solid support was washed to remove substances not attached to the solid support, and cells adhered to the solid support were crushed by heat in a solution. Next, PCR was performed using the DNA in the lysate as a template.
상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다. 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 Si02 층으로 되어 있다. In the pillar array, the distance between the pillars is 15 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side. The surface of the region in which the pillar array is formed has a SiO 2 layer.
상기 유동장치에 흘려진 혈액 배양물 시료는, 0.01 OD의 대장균을 포함하는 SPS가 포함되어 있는 혈액 배양물을 100 mM 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 3.0)과 1:1로 혼합하여 얻어진 시료 (pH 4.7)이었다. 상기 혈액 배양물은 SPS를 0.05% 및 혈액 10 %를 포함하는 BHI 배지에 특정한 농도의 대장균을 첨가하여, 혈액 배양물과 유사하게 한 것을 사용하였다. 상기 대장균은 실험을 위하여, 설정된 농도로 첨가하였다. 대조군으로는, SPS를 포함하지 않은 일반 혈액 배양물을 사용한 것을 제외하고, 동일하게 실험하였다. 상기 일반 혈액 배양물은 SPS 및 혈액을 포함하지 않은 BHI 배지를 사용하였다.The blood culture sample flowing into the flow apparatus is a sample obtained by mixing a blood culture containing SPS containing Escherichia coli of 0.01 OD 1: 1 with 100 mM sodium acetate buffer (pH 3.0) (pH 4.7). It was. The blood cultures were prepared by adding E. coli at a specific concentration to BHI medium containing 0.05% SPS and 10% blood, similar to blood cultures. The E. coli was added at a set concentration for the experiment. As a control, the same experiment was conducted except that a general blood culture without SPS was used. The general blood culture used BHI medium without SPS and blood.
상기 혈액 배양물 시료를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 200 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. 다음으로, 아세테이트 버퍼 (pH 4.0)를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 500 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. 그런 다음, 상기 유동 장치를 원심분리하여 챔버에 남아 있는 용액을 제거하고, PCR 반응 용액 3.5 ㎕를 주입하였다. 상기 PCR 반응 용액은, 총 부피 3.5 ㎕에 1x PCR 버퍼, 200 μM dNTP, 각 프라이머 200 nM, MgCl2 2.5 mM, BSA 1 mg, 5% PEG, 400 nM Taqman probe (서열번호 3), 및 0.1 유니트의 Taq 폴리머라제를 포함하는 PCR 반응용액을 상기 챔버에 첨가하였다. 상기 프라이머는 각각 서열번호 1과 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이다.The blood culture sample was injected into the inlet to flow through the chamber to the outlet. The flow rate was 200 μl / min and 500 μl flowed. Next, acetate buffer (pH 4.0) was injected into the inlet to flow out through the chamber to the outlet. The flow rate was 500 μl / min and 500 μl flowed. Then, the flow apparatus was centrifuged to remove the solution remaining in the chamber, and 3.5 μl of the PCR reaction solution was injected. The PCR reaction solution contained 1 × PCR buffer, 200 μM dNTP, 200 nM of each primer, 2.5 mM of MgCl 2 ,
상기 챔버를 포함하는 유동장치를 TMC-1000 (삼성테크원, 한국)에 장착하고, 95℃에서 10초 및 65℃에서 10초을 3회 반복하여, 대장균 세포를 열에 의하여 파쇄시켰다. 본 실시예에서 사용된 상기 유동 장치는, TMC-1000에 모듈의 형태로 장착되어, PCR 반응이 수행될 수 있도록 되어 있는 것이다.The flow apparatus including the chamber was mounted on the TMC-1000 (Samsung Tech One, Korea), and the E. coli cells were disrupted by heat by repeating 10 seconds at 95 ° C. and 10 seconds at 65 ° C. three times. The flow apparatus used in the present embodiment is mounted on the TMC-1000 in the form of a module so that a PCR reaction can be performed.
상기 세포 파쇄 단계 후, PCR을 위한 열 순환을 수행하였다. 열순환 조건은 다음과 같다. 95℃에서 1분 동안 전 변성시키고, 변성 94℃에서 5초, 어닐링 45℃에서 20초 및 연장 72℃에서 20초를 40회 반복하였다. After the cell disruption step, thermal cycling for PCR was performed. The thermocycling conditions are as follows. Total denaturation at 95 ° C. for 1 minute was repeated 40 times at 5 ° C. at 94 ° C., 20 seconds at 45 ° C. annealing and 20 seconds at 72 ° C. extension.
PCR 중 증폭된 핵산의 농도는 Tagman probe를 검출함으로써, 확인하였다. 도 3은 SPS를 포함하는 혈액 배양물과 SPS를 포함하지 않은 혈액 배양물을, 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치를 이용하여 대장균 세포를 분리 및 파쇄하고, 그 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과로서, 실시간으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4는 SPS를 포함하는 혈액 배양물과 SPS를 포함하지 않은 혈액 배양물을, 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치를 이용하여 대장균 세포를 분리 및 파쇄하고, 그 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과로서, PCR 완료 후 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3과 4에 나타낸 바와 같이, SPS를 포함하고 있는 혈액 배양물을 시료로 한 경우에도, 그렇지 않은 시료에 비하여 유사한 농도로 표적 핵산이 증폭되었다. 이는 본 발명의 방법에 의하여, SPS를 포함하는 시료로부터, 별도의 SPS 제거 단계를 거치지 않고서도, 표적 핵산을 증폭할 수 있다는 것을 나타낸다. The concentration of nucleic acid amplified during PCR was confirmed by detecting the Tagman probe. FIG. 3 shows that E. coli cells are isolated and disrupted by using a flow apparatus including a solid support of the present invention, and a blood culture containing SPS and a blood culture containing SPS, and the DNA in the lysate as a template. It is a figure which shows the result measured in real time as a result of PCR. 4 is a blood culture containing SPS and a blood culture containing no SPS, by using a flow apparatus including a solid support of the present invention, E. coli cells are isolated and crushed, and DNA in the lysate is used as a template. As a result of PCR, it is a figure which shows the result of the electrophoresis of the amplification product after completion of PCR. As shown in Figs. 3 and 4, even when a blood culture containing SPS was used as a sample, the target nucleic acid was amplified at a similar concentration as compared to the sample that was not. This indicates that by the method of the present invention, the target nucleic acid can be amplified from the sample including the SPS without undergoing a separate SPS removal step.
실시예Example 3 : 기둥 구조를 갖는 고체 지지체를 이용한 3: using a solid support having a columnar structure SPSSPS 를 포함한 시료로부 터 핵산 증폭 : Nucleic acid amplification from a sample containing: SPSSPS 의 영향Influence
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm인 칩 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체를 포함하는 챔버를 갖는 유동 장치에 대장균과 SPS를 포함하는 혈액 배양물 흘려주어, 대장균 세포를 상기 고체 지지체에 부착시켰다. 다음으로, 상기 고체 지지체를 세척하여 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 제거하고, 상기 고체 지지체에 부착되어 있는 세포를 용액 중에서 알칼리 및 열에 의하여 파쇄하였다. 다음으로, 상기 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. In this embodiment, a blood culture comprising E. coli and SPS is flowed into a flow apparatus having a chamber including a solid support having an inlet and an outlet and an array of pillars formed on a chip having a size of 10 mm x 23 mm. Given, E. coli cells were attached to the solid support. Next, the solid support was washed to remove substances not attached to the solid support, and the cells attached to the solid support were crushed by alkali and heat in a solution. Next, PCR was performed using the DNA in the lysate as a template.
상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다. 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 Si02 층으로 되어 있다. In the pillar array, the distance between the pillars is 15 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side. The surface of the region in which the pillar array is formed has a SiO 2 layer.
상기 유동장치에 흘려진 혈액 배양물 시료는, 0.01 OD의 대장균을 포함하는 SPS가 포함되어 있는 혈액 배양물을 100 mM 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 3.0)과 1:1로 혼합하여 얻어진 시료 (pH 4.7)이었다. 상기 혈액 배양물은 SPS를 0.05% 및 혈액 10 %를 포함하는 BHI 배지에 대장균을 첨가하여 혈액 배양물과 유사하게 하여 사용하였다. 상기 대장균은 실험을 위하여, 설정된 농도로 첨가하였다. 대조군1로는, SPS를 포함하지 않은 일반 혈액 배양물을 사용한 것을 제외하고, 동일하게 실험하였다. 상기 일반 혈액 배양물은 SPS 및 혈액을 포함하지 않은 BHI 배지이다.The blood culture sample flowing into the flow apparatus is a sample obtained by mixing a blood culture containing SPS containing Escherichia coli of 0.01 OD 1: 1 with 100 mM sodium acetate buffer (pH 3.0) (pH 4.7). It was. The blood culture was used similar to the blood culture by adding E. coli to BHI medium containing SPS of 0.05% and
상기 혈액 배양물 시료를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러 나가도록 하였다. 유속은 200 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. 다음으로, 아세테이트 버퍼 (pH 4.0)를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 500 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. 그런 다음, 상기 유동 장치를 원심분리하여 챔버에 남아 있는 용액을 제거하고, 0.01 N NaOH 용액을 주입한 후 95℃에서 5분 동안 방치하여 대장균 세포를 파쇄하였다. 상기 유동장치를 원심분리하여 대장균 파쇄물 2 ml를 얻었다. 비교 실험 3 및 4로서, 상기 0.05% SPS 및 10% 혈액을 포함하는 배지 및 상기 0.05% SPS 및 10% 혈액을 포함하지 않은 QiAgen mini kit를 이용하여 DNA를 분리하여, 최종 50㎕의 DNA 용액을 얻었다. 또한, 비교 실험 1과 2로서, DNA 5ng/㎕ 용액 및 0.05 %SPS와 DNA를 포함하는 용액을 사용하였고, 비교 실험 5 및 6으로서, 상기 0.05% SPS 및 10% 혈액을 포함하는 배지, 및 상기 0.05% SPS 및 10% 혈액을 포함하지 않은 배지를 핵산 분리과정을 거치지 않고, 직접적으로 PCR하였다. The blood culture sample was injected at the inlet to flow through the chamber to the outlet. The flow rate was 200 μl / min and 500 μl flowed. Next, acetate buffer (pH 4.0) was injected into the inlet to flow out through the chamber to the outlet. The flow rate was 500 μl / min and 500 μl flowed. Then, the flow apparatus was centrifuged to remove the solution remaining in the chamber, injected with 0.01 N NaOH solution, and left at 95 ° C. for 5 minutes to disrupt E. coli cells. The flow apparatus was centrifuged to obtain 2 ml of E. coli lysate. As
PCR을 위하여, 먼저 총 부피 50 ㎕의 1x PCR 버퍼 중에서 200 μM dNTP, 각 프라이머 200 nM, MgCl2 2.5 mM, 상기 각 주형 1㎕, 및 2.5 유니트의 Taq 폴리머라제를 포함하는 PCR 반응용액을 PCT 튜브에 첨가하였다 . 상기 프라이머는 각각 서열번호 1과 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이다. PCR을 위한 열 순환을 수행하였다. 열순환 조건은 다음과 같다. 95℃에서 1분 동안 전 변성시키고, 변성 95℃에서 5초, 어닐링 62℃에서 13초 및 연장 72℃에서 15초를 25회 반복하였다. For PCR, first PCR reaction solution containing 200 μM dNTP, 200 nM of each primer, 2.5 mM of MgCl 2 , 1 μl of each template, and 2.5 units of Taq polymerase in a 1 × PCR buffer with a total volume of 50 μl PCT tube Added to. The primers have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. Thermal cycling for PCR was performed. The thermocycling conditions are as follows. Premodified for 1 minute at 95 ° C., repeated 5 times at 95 ° C. denaturation, 13 seconds at annealing 62 ° C. and 15 seconds at 72 ° C. extension.
도 5는 SPS를 포함하거나 포함하지 않는 다양한 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR하고, 그 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 도 5에서, 레인 1: DNA, 2: DNA + 0.05% SPS, 3: 0.05% SPS 및 10% 혈액을 포함하는 배양 배지를 QIAgen mini kit를 사용하여 핵산을 분리한 시료, 4: 배양 배지를 QIAgen mini kit를 사용하여 핵산을 분리한 시료, 5: 0.05% SPS 및 10% 혈액을 포함하는 배양 배지를 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치에 통과시키고, 대장균을 파쇄하고 용출한 시료, 6: 배양 배지를 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치에 통과시키고, 대장균을 파쇄하고 용출한 시료, 7: 0.05% SPS 및 10% 혈액을 포함하는 배양 배지를 직접적 PCR에 사용한 시료, 8: 배양 배지를 직접적 PCR에 사용한 시료, 9: 음성대조군. 도 5에 나타낸 바와 같이, SPS는 PCR 저해제임을 알 수 있다 (레인 2). 그러나, 본 발명의 고체 지지체를 이용하여 대장균을 분리하는 경우에는, 핵산 증폭이 효율적으로 이루어졌다. 이는 본 발명의 고체 지지체를 이용하여 대장균을 분리하는 과정에서, SPS는 상기 고체 지지체에 부착되지 않아 제거된다는 것을 나타낸다. FIG. 5 is a diagram showing the results of PCR using various DNA samples with or without SPS as a template and electrophoresis of the amplification products thereof. In Figure 5, lane 1: DNA, 2: DNA + 0.05% SPS, 3: 0.05% SPS and 10% blood culture medium containing a QIAgen mini kit, nucleic acid was isolated sample, 4: culture medium QIAgen A sample from which nucleic acid was separated using a mini kit, 5: a culture medium containing 0.05% SPS and 10% blood was passed through a flow apparatus including the solid support of the present invention, and the sample was crushed and eluted. The culture medium was passed through the flow apparatus including the solid support of the present invention, the sample was crushed and eluted Escherichia coli, 7: the sample using the culture medium containing 0.05% SPS and 10% blood for direct PCR, 8: the culture medium Was used for direct PCR, 9: negative control. As shown in Figure 5, it can be seen that SPS is a PCR inhibitor (lane 2). However, when E. coli was isolated using the solid support of the present invention, nucleic acid amplification was efficiently performed. This indicates that in the process of separating E. coli using the solid support of the present invention, SPS is not attached to the solid support and is removed.
본 발명에 따른 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법에 의하면, 하나의 용기에서 미생물 분리, 세포 파쇄 및 핵산 증폭이 수행됨으로써, 편리하고, 빠르고, 높은 민간도로 핵산을 증폭할 수 있다. 또한, 미생물로부터 핵산 증폭까지의 단계가 단일 용기에서 이루어지기 때문에 자동화가 용이하게 이루어질 수 있다. 또한, 미생물을 고체 지지체에 부착시키기 위하여 높은 유속으로 고체 지지체와 접촉시킬 수 있기 때문에, 많은 양의 초기 시료를 사용할 수 있다. According to the method for amplifying a nucleic acid from a microorganism according to the present invention, by separating microorganisms, cell disruption and nucleic acid amplification in one container, the nucleic acid can be amplified conveniently, quickly and with high folklore. In addition, automation can be easily performed because the steps from the microorganism to the nucleic acid amplification are performed in a single container. In addition, a large amount of initial sample can be used because the microorganisms can be contacted with the solid support at a high flow rate to adhere to the solid support.
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