KR20070100351A

KR20070100351A - 이식된 신경 줄기세포의 면역보호를 위한 골수 스트로마세포

Info

Publication number: KR20070100351A
Application number: KR1020077018252A
Authority: KR
Inventors: 케빈 알 맥킨토시
Original assignee: 코그네이트 세러퓨틱 인크.
Priority date: 2005-01-11
Filing date: 2006-01-10
Publication date: 2007-10-10
Also published as: EP1841322A4; EP1841322A1; US20060153819A1; CR9288A; JP2008526891A; MX2007008437A; RU2007130695A; BRPI0606678A2; CN101137292A; WO2006076374A1; AU2006205033A1; CA2593668A1; IL184470A0

Abstract

본 발명은, NSC의 숙주 거부를 감소 또는 억제하는 유효량의 골수 스트로마로 이식편 수용자를 치료함으로써, NSC를 도입한 이식편 수용자에 대한 면역 반응을 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 포함한다.

Description

이식된 신경 줄기세포의 면역보호를 위한 골수 스트로마 세포{BONE MARROW STROMAL CELLS FOR IMMUNOPROTECTION OF TRANSPLANTED NEURAL STEM CELLS}

발생 손상(genesis trauma), 종양 형성 또는 유전 또한 기타 인자를 가지는 포유류 신경 손상은 치료 및/또는 역전이 매우 어렵다. 중추신경계 신경 손상에 대한 한 치료는, 각종 세포의 신경이식이다. 신경이식은 중추신경계의 발달, 성형성 및 재생을 연구하기 위해 사용되어 왔다 (McKay, 1997, Science 276:66- 71). 또한 신경이식은, 질병 및 손상된 신경 조직의 복구 및 기능 회복을 실시하기 위해 사용되어 왔다 (Bjorklund, 1993, Nature 362:414-415; Olson, 1997, Nature Med. 3:1329-1335; Spencer 등, 1992, N. Engl. J. Med. 327:1541-1548: Freed 등, 1992, N. Engl. J. Med 327:1549-1555; Kordower 등, 1995, N. Engl. J. Med. 332:1118-1124; Defer 등, 1996, Brain 119:41-50; Lopez-Lozano 등, 1997, Transp. Proc. 29:977-980; Rosenstein, 1995, Exp. Neurol. 33:106; Turner 등, 1993, Neurosurg. 33:1031-1037; Kang 등, 1993, J. Neurosci. 13:5203-5211; Andersson 등, 1993, Int. J. Dev. Neurosci. 11:555-568; Sanberg 등, 1997, Nature Med. 3:1129-1132). 일례로, 파킨슨씨병을 가진 일련의 인간 환자들이, 인간 태아의 6 내지 9주 낙태아로부터 수득한 중뇌 세포의 신경이식에 의해 치료되어 왔다 (Spencer 등, 1992, N. Engl. J. Med. 327:1541-1548: Freed 등, 1992, N. Engl. J. Med 327:1549-1555; Kordower 등, 1995, N. Engl. J. Med. 332:1118-1124; Defer 등, 1996, Brain 119:41-50; Lopez- Lozano 등, 1997, Transp. Proc. 29:977-980). 이들 환자의 일부는, 임상 증상 및 도파민 합성 모두에서 상당한 개선을 나타내는 것으로 관측되었다 (Spencer 등, 1992, N. Engl. J. Med. 327:1541-1548; Freed 등, 1992, N. Engl. J. Med 327:1549-1555; Kordower 등, 1995, N. Engl. J. Med. 332:1118-1124; Defer 등, 1996, Brain 119:41-50). 그러나, 치료 용도를 위해 태아 조직을 수득하는 과정은 심대한 논리상 및 윤리상 장벽에 부딪혀 왔다 (Rosenstein, 1995, Exp. Neurol. 33:106; Turner 등, 1993, Neurosurg. 33:1031-1037). 또한, 단지 약 5% 내지 10%만의 도파민성 신경만이 생존하는데, 이는, 상기에 대한 면역 부반응 (Lopez-Lozano 등, 1997, Transp. Proc. 29:977-980) 및, 태아 조직이 해당과정 대사 대신 지방에 주로 의존하는 이유 때문이다 (Rosenstein, 1995, Exp. Neurol. 33:106). 이러한 이유들로 인해, 신경이식을 위해 섬유아세포 (Kang 등, 1993, J. Neurosci. 13:5203-5211), 태아 성상세포 (Andersson 등, 1993, Int. J. Dev. Neurosci. 11:555-568) 및 세르톨리 세포 (Sanberg 등, 1997, Nature Med. 3:1129-1132)와 같은 대체 세포를 개발하고자하는 시도가 있어 왔다.

일례로 뇌종양, 뇌 손상, 헌팅턴씨병, 알츠하이머병, 파킨슨씨병 및 척수 상처와 같은 중추신경계의 질병, 질환 또는 상태를 이식에 의해 치료하기 위해서는, 공여자 세포를 쉽게 구할 수 있고, 이는 배양에 의해(또는 중에서) 신속히 증폭(또는 확대) 가능하고, 면역적으로 비활성이고, 장기간 생존 및 숙주 뇌 조직에서의 혼입이 가능하고, 안정한 형질 감염이 가능하고, 장기간의 외래 유전자 발현이 가능한 것이어야만 한다 (Bjorklund, 1993, Nature 362:414-415; Olson, 1997, Nature Med. 3:1329-1335). 이러한 기준을 만족하는 공여자 세포는 현재 존재하지 않는다.

중추신경계 ("CNS")의 발달(분리) 중, 신경 줄기 세포 (NSC)로도 알려진 다분화능 전구세포는 증식하여, 종국에는 성인 뇌를 형성하는 세포 타입으로 분화하는 일시 분열 선조 세포를 유도한다. (다른 조직으로부터의) 줄기 세포는 자가 재생 (즉 더 많은 줄기 세포를 형성), 증식 및 다중의 상이한 표현형 계통으로 분열하는 능력을 가진 것으로 통상 정의되어왔다. 신경 줄기 세포의 경우, 상이한 표현형 계통은, 신경세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포를 포함한다.

NSC는 마우스, 래트, 돼지 및 인간을 포함하는 각종 포유류 종으로부터 분리되었다 (WO 93/01275, WO 94/09119, WO 94/10292, WO 94/16718; Cattaneo 등, 1996, MoI. Brain Res. 42:161-66). 인간 CNS 신경 줄기세포는, 그의 쥐과 동족체(rodent homologs)와 유사하게, 마이토젠 함유 (보통 상피 성장 세포 또는 상피 성장 세포와 염기성 섬유아세포 성장 인자) 및 무혈청 배양 배지 내에서 보관시, 현탁액 배양으로 성장하여 "신경구체 (neurospheres)"로 알려진 세포 응집물을 형성한다. 인간 신경 줄기세포는 약 30일의 배가 속도를 가지는 것으로 관측되었다 (Cattaneo 등, 1996, MoI Brain Res. 42:161-66). 마이토젠 (들)을 제거함에 따라, 줄기세포는 신경세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포로 분화 가능하다.

포유류 면역 시스템은, 감염시약으로부터 개체의 보호 및 종양 성장 방지에 중심 역할을 수행한다. 그러나 동일한 면역 시스템은 비관련 공여자로부터의 세포, 조직 및 장기 이식편 거부와 같은 원치 않는 반응을 발생할 수 있다. 면역 시스템은, 이식된 조직과 같은 유익한 침입물과 유해한 침입물을 구분하지 못하고 따라서 면역 시스템은 이식된 조직 또는 장기를 거부하게 된다. 이식된 장기의 거부는 보통, 공여자 동종항원 (alloantigen) 또는 이종항원을 인식하는, 숙주 내 존재하는 동종반응성 T 세포에 의해 매개 된다.

유전적으로 상이한 개인 간의 세포, 조직 및 장기 이식은 이식 거부 위험을 필연적으로 야기한다. 거의 모든 세포는 주요 조직적합 복합체의 생성물인 MHC 클래스 I 분자를 발현한다. 또한, 많은 세포타입은, 염증성 사이토카인에 노출시 MHC 클래스 II 분자를 발현하도록 유도될 수 있다. 추가의 면역원성 분자는, 여성 수용자에 의해 인식되는 Y 염색체 항원과 같은 미소 조직적합 항원으로부터 유도된 것을 포함한다. 동종이식물의 거부는 주로 CD4 및 CD8 하부클래스 둘 다의 T 세포에 의해 매개 된다 (Rosenberg 등, 1992, Annu. Rev. Immunol. 10:333). 동종반응성 CD4+ T 세포는, 동종항원에 대한 조직용해성 CD8 반응을 악화시키는 사이토카인을 생성한다. 이들 하부클래스 중에서, 세포의 경쟁 하부군들이, 이들이 생성하는 사이토카인에 의해 특징지워지는 항원 자극 이후에 발달한다. IL-2 및 IFN-γ를 생성하는 Th1 세포는, 동종이식물 거부에 주로 관련된다 (Mossmann 등, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7:145). IL-4 및 IL-10를 생성하는 Th2 세포는 IL-10 을 통하여 Th1의 반응을 하향 조절 (down regulate) 할 수 있다 (Fiorentino 등, 1989, J. Exp. Med. 170:2081). 실제로, Th2 경로에 대 한 Th1의 원치않는 반응을 피하기 위해 많은 노력이 있어 왔다. 환자에 있어 원치않는 동종 반응성 T 세포 반응 (동종이식물 거부, 이식물 대 숙주 질병(또는 이식편 대 숙주병))은, 프레드니손, 아자티오프린, 및 시클로스포린 A와 같은 면역억제 약물로 보통 처리된다. 불행하게도, 이들 약물은 환자의 일생동안 보통 유지되어야 하고, 일반화된 면역억제와 같은 위험한 부작용 다수를 가진다. 범용 면역억제보다 우수한 접근법은 공여자 세포의 동종항원에 대한 특이적 또는 국부적 억제를 유도하며, 나머지 면역 시스템은 그대로 놓아두는 것이다.

동종이계 (allogeneic) 줄기 세포의 이식을 허여하는 동종항원에 대한 면역 관용(tolerance)을 유도하기 위한 각종 방법이 있을 것이다. 불행하게도, 쥐과 동물 모델에서 성공한 이들 접근법의 다수는 비인간 영장류 또는 인간에게 적용시 성공적이지 못하였다. 유사하게, 수용자와 유전적으로 동일한 배아 줄기 세포의 클론을 생성하고자 핵 전달을 사용하는 것은 고급 종에 있어 문제가 있고, 인간에 대해 제한적 성공만이 최근 보고되었다 (Hwang 등, 2004, Science 303:1669). 줄기 세포의 기타 타입의 엔지니어링에 이러한 기술이 어떻게 적용될 수 있는지, 그리고, 조작 및 팽창에 필요한 시간에 의해 이들의 유용성이 소멸되는지의 여부는 불분명하다.

줄기 세포는 낮은 정도의 면역원성을 나타내는 것으로 보고되었는데, 이는 아마도 이들의 분화 및 면역조절 특성 상태가 미성숙한 때문으로 보인다. 래트 유사 배아 줄기 세포는 MHC 클래스 I 항원을 낮은 수준으로 발현하고, 이는 MHC 클래스 II 분자 및 CD80(B7-l)/86(B7-2) 공자극성 분자 발현에 대해 음성이다 (Fandrich 등, 2002, Nat. Med. 8:171). 이들 세포는, 문맥 정맥으로 주입시 면역경쟁성 동종이계 수용자의 간에 이식되었다. 이러한 이식화는, 공자극성 분자의 결여 및, 줄기세포주에 의한 FasL 발현에 기인한 것이었다. 활성화된 T 세포는 Fas 수용체를 발현하며, 따라서 줄기 세포주에 의한 세포 사멸에 이들이 취약하게 만든다. 이들 특성이 다른 배아 줄기 세포주에 의해 공유되는지의 여부는 현재 비공지이며, 이는 이식된 태아 및 배아 줄기세포 유도된 조직들이 수용체의 면역 시스템에 의해 종종 거부되기 때문이다 (Bradley 등, 2002, Nat. Rev. 2:859, Kaufman 등, 2000, E-biomed 1 :11). 쥐과로부터 유도된 신경 줄기세포는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 항원을, 낮거나 무시할만한 수준으로 발현하지만 (McLaren 등, 2001, J. Neuroimmunol 112:35), 이들 세포는 면역억제 약물을 사용하지 않는다면 동종이계 수용자에게 임플랜트 이후 보통 거부된다 (Mason 등, 1986, Neuroscience 19:685, Sloan 등, 1991, Trends Neurosci. 14:341, Wood 등, 1996, Neuroscience 70:775). IFN 패밀리의 염증성 사이토카인에 대한 노출 이후 세포막 상에서 MHC 분자가 상향 조절 (up regulate) 된 이후에 거부가 시작될 수 있다 (McLaren 등, 2001, J. Neuroimmunol 112:35).

장기 이식의 주요 목적은, 기타 외부 항원에 대항하는 수용자의 면역경쟁성을 보존하면서, 수용자에 의해 생성되는 이식물 거부 면역 반응을 유도하지 않는, 공여자 장기의 영구 이식화이다. 보통, 숙주 거부 반응을 방지하기 위해, 시클로스포린, 메토트릭세이트, 스테로이드 및 FK506과 같은 비특이적 면역억제 약제를 사용한다. 이들 시약은 매일 기준으로 투여되어야하고, 투여가 중단되면 보통 이식물 거부가 발생한다. 그러나 비특이적 면역억제 약제 사용의 주요 문제는, 이들이 면역 반응의 모든 면을 억제하도록 작용하여, 감염 및 암을 포함한 기타 질병에 대해 수용자의 취약성을 크게 증가시킨다는 점이다. 또한, 면역억제 약제의 사용에도 불구하고, 인간 장기 이식에서 이식물 거부는 여전히 사망 및 병적상태의 주원인으로 남아있다. 영구적 이식물 수용이 없다면 대부분의 인간 이식은 10년 이내에 실패한다. 단지 50%만의 심장 이식자들이 5년간 생존하고, 20%만의 신장 이식자들이 10년을 생존한다 (Opelz 등, 1981, Lancet 1 :1223).

성공적인 이식은, 공여자 조직의 숙주 거부를 피하기 위하여, 면역 효과자 (effector) 세포에 의해 매개되는 이식편에 대한 숙주에 의한 원치않는 면역 반응의 방지 및/또는 감소에 의존하는 것으로 현재 여겨진다. 또한 성공적 이식을 위해 유리한 것은, 이식물 대 숙주 질병으로 알려진 수용자 조직에 대항한 공여자 조직에 의한 원치않는 면역 반응을 제거 또는 감소하는 방법이다. 따라서, 유전적으로 상이한 개인 간의 세포, 조직 및 장기 관련 원치않는 면역 반응을 억제 또는 다르게는 방지하기 위한 방법에 대한 필요가 오랫동안 공감되어 왔다. 본 발명은 그러한 필요를 만족시킨다.

(발명의 간단한 요약)

본 발명은, 신경 줄기세포 (NSC) 이식용 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 NSC 이식을 수용하는 환자 치료용 조성물 및 방법을 포함한다.

본 발명은, 이식편이 신경 줄기세포 (NSC)인, 효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한 수용자 내 상기 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기 위한, 이식편 수용자 치료 방법을 포함한다.

한 면에서, 본 방법은, 이식편 수용자에게 골수 스트로마 세포 (BMSC)를 효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한 상기 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기에 유효한 양으로 투여함을 포함하며, 이로써 이식편 수용자 내에서 상기 효과자 세포는, 상기 동종항원에 대항한 감소된 면역 반응을 가진다.

다른 면에서 효과자 세포는 T 세포이다.

추가의 면에서 T 세포는 공여자로부터, 동종항원은 수용자로부터 유래한 것이다.

또한 추가의 면에서, T 세포는 수용자로부터, 동종항원은 공여자로부터 유래한 것이다.

다른 면에서, T 세포는 이식편 내에 존재한다.

추가의 면에서, BMSC는 이식편 수용자에게 BMSC를 투여하기 이전에 배양으로 증폭된다.

한 면에서, 효과자 세포는 BMSC 투여 이전에 활성화된 T 세포이고, 추가로, 면역반응은 공여자로부터의 T 세포의 재활성화인 것이다.

또 다른 면에서, BMSC는 수용자에 의한 이식편 거부를 치료하기 위해 이식편 수용자에게 투여된다.

추가의 면에서, BMSC는 인간 유래이다.

다른 면에서, BMSC는 마우스 또는 래트 유래이다.

또 다른 면에서, NSC는 인간 유래이다.

추가의 면에서, 면역억제 약제이 이식편 수용자에게 투여된다.

한 면에서 BMSC는 이식편의 수용자에게의 투여 이전에 수용자에게 투여된다.

다른 면에서, BMSC는 이식편과 동시에 수용자에게 투여된다.

추가의 면에서 BMSC는 이식편의 일부로 투여된다.

또 다른 면에서 BMSC는 이식편의 이식에 이어 수용자에게 투여된다.

한 면에서, BMSC는 수용자에게 정맥 내 투여된다.

다른 면에서 효과자 세포는 이식편의 수용자의 세포이다.

추가의 면에서, BMSC는 유전적으로 변형된 것이다.

본 발명은, 이식편이 신경 줄기 세포 (NSC)이고, 효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기 위해 유효한 양의 BMSC와 NSC를 이식편 수용자에게 이식하는 것을 포함하며, 이로써 이식편 수용자 내 효과자 세포는 동종항원에 대항하여 감소된 면역 반응을 가지는, 효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한 효과자 세포의 수용자 내 면역 반응을 감소시키기 위한 이식편 수용자의 치료 방법을 포함한다.

한 면에서 효과자 세포는 T 세포이다.

(도면의 간단한 설명)

상기한 요약 및 하기의 본 발명 상세한 설명은, 추가된 도면과 연계되어 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명 예시를 위해, 현재 바람직한 구현(들)을 도면에 개시한다. 그러나 본 발명은 개시된 정확한 배열 및 수단에 국한되지 않음을 이해하여야한다.

도 1은, 신경 줄기세포 (NSC)의 면역원성을 시사하는 그래프이다. 도 1은, NSC 자극된 동종이계 T 세포의 증식을 개시한다.

도 2는, 일방 혼합 림프구 반응 (MLR)에 의해 평가된 골수 스트로마 세포 (BMSC)의 면역원성을 시사하는 그래프이다. 도 2는, BMSC가 동종이계 T 세포 증식을 자극하지 않음을 나타낸다.

도 3은, 동종이계 T 세포 상의 활성화된 CD25 분자의 발현을 BMSC가 유도하지 않음을 나타내는 그래프이다.

도 4는, BMSC에 의한 MLR의 억제를 나타내는 그래프이다.

본 발명은, 이식편에 대한 수용자의 고유한 면역 시스템에 의한 면역 반응을 감소 및/또는 제거하므로써, 골수 스트로마 (BMSC)가 신규한 면역 특성을 소지하고, 따라서 일례로 생물적합성 격자 또는 공여자 조직, 장기 또는 세포인 이식편의 이식에 유용 가능한 것을 발견한 것과 관련된다. 하기에 더욱 충분히 설명한 바와 같이, BMSC는 이식편의 동종이식 거부를 억제 및/또는 방지하는 역할을 한다.

추가로, 본원에 기재된 데이터는, 이식물 대 숙주 질병으로 알려진, 수용자 조직에 대항하여, 일례로 생물적합성 격자 또는 공여자 조직, 장기 또는 세포인 공여자 이식편에 의한 원치않는 면역 반응의 억제 및/또는 방지를 위해 BMSC가 유용하다는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명은, 이식편의 숙주 거부를 감소 또는 억제하기에 유효한 BMSC의 양으로 수용자를 치료함에 의해 수용자 내 이식편의 면역 반응을 감소 및/또는 제거하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 또한, 수용자에 대항한 공여자 이식편에 의한 부반응을 억제 또는 감소시키기 위해 골수 스트로마 세포를 수용자 이식편 및/또는 이식편의 수용자를 처리함으로써, 일례로 이식물 대 숙주 질병인, 숙주에 대항한 외부 이식편에 의한 숙주 내 면역 반응을 감소 및/또는 제거하기 위한 조성물 및 방법이 포함된다.

(용어 정의)

본원에 사용된 하기 각 용어들은 본 단원에 관련된 의미를 가진다.

본원에 사용된 "a" 및 "an"의 관사들은, 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과를 (즉, 적어도 하나) 일컫는다. 일례로, '한 성분"은, 한 개의 성분 또는 한 개 초과의 성분을 의미한다.

"약"의 용어는, 당업자에 의해 이해되는 것으로, 사용된 내용에 따라 어느 정도 가변이다.

본원에 사용된 "자가 유래(autologous)"의 용어는, 동일한 개인에서 유래한 임의의 물질로, 상기 개인에게 이후 재도입되는 것을 의미한다.

본원에 사용된 "생물적합성 격자"의 용어는, 조직 발달(또는 분화)에 도움이 되는 3차원 구조로의 형성을 촉진하는 기질을 이르는 것을 의미한다. 따라서, 일례로, 세포외 매트릭스 물질, 합성 중합체, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함하는 것과 같은 생물적합성 격자 상에 세포를 배양 또는 시딩 (seeding) 가능하다. 격자는, 조직 타입(형태)의 발달을 촉진하는 원하는 형상으로 성형가능하다. 또한, 적어도 세포 배양의 초기 단계에서, 매질 및/또는 기질에는 적절한 조직 타입 및 구조의 발달을 촉진하는 인자들을 보충한다 (일례로, 성장 인자, 사이토카인, 세포외 매트릭스 물질 등).

본원에 사용된 "골수 스트로마 세포", "스트로마 세포", "간엽 줄기 세포" 및 "MSC"의 용어는, 상호 교환적으로 사용되며, 골세포, 연골세포 및 지방세포에 대한 줄기세포 -유사 전구체로 작용가능한 골수 중 세포의 작은 분획을 의미한다. 골수 스트로마 세포는 널리 연구되어왔다 (Castro-Malaspina 등, 1980, Blood 56:289-30125; Piersma 등, 1985, Exp. Hematol 13:237-243; Simmons 등, 1991, Blood 78:55-62; Beresford 등, 1992, J. Cell. Sci. 102:341-3 51; Liesveld 등, 1989, Blood 73:1794-1800; Liesveld 등, Exp. Hematol 19:63-70; Bennett 등, 1991, J. Cell. Sci. 99:131-139). 골수 스트로마 세포는 임의 동물로부터 유도될 수 있다. 일부 구현에서, 스트로마 세포는, 유인원, 바람직하게 인간에서 유리된다. 추가로, BMSC는 면역 반응 동안 동종반응성 T 세포의 증식을 억제 가능하다. 일례로, BMSC는, 동종이계 T 세포 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 간의 혼합된 림프구 반응 (MLR)을 억제 가능하다.

본원에 사용된 "신경 줄기 세포" 또는 "NSC"는, 미분화, 다분화능, 자가재생 (self-renewing) 신경 세포를 의미한다. 신경 줄기 세포는, 분열 가능하고, 적절한 조건하에서는 자가 재생능을 가지며, 신경세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포로 최종 분화 가능한, 클론원성 다분화능 줄기세포이다. 따라서, 줄기세포 자손이 다중 분화 경로를 가지므로, 신경 줄기 세포는 "다분화능"이다. 신경 줄기 세포는 자가 유지능을 가지며, 이는 각 세포 분열마다 평균 하나의 딸세포 또한 줄기세포임을 의미한다.

"이식물"은, 세포, 조직, 장기 또는 기타 이식을 위한 임의의 생물적합성 격자를 일컫는다.

"동종이계 (allogeneic)"는, 동일 종의 상이한 동물에서 유래한 이식물을 일컫는다.

"이종발생성 (xenogeneic)"은, 상이한 종의 동물에서 유래한 이식물을 일컫는다.

"이식편"은, 이식될 공여자의 조직, 장기 또는 세포 또는 생물적합성 격자를 가리킨다. 비제한적인 이식편의 예는, 피부 세포 또는 조직, 골수 및 고형 장기, 일례로, 심장, 췌장, 신장, 폐 및 간을 포함 가능하다. 바람직하게, 이식편은 인간 줄기 세포이다.

본원에 정의된 "동종이계 골수 스트로마 세포 (BMSC)"는, 수용자와 동일한 종의 상이한 개인으로부터 수득한 것이다.

"공여자 항원"은, 수용자에게 이식될 공여자 조직에 의해 발현되는 항원을 가리킨다.

"동종항원(alloantigen)"은, 수용자에 의해 발현되는 항원과 상이한 항원이다.

본원에 사용된 "효과자 세포(effector cell)"는, 항원에 대항하여 면역반응을 매개하는 세포를 가리킨다. 수용자에게 이식편이 도입되는 경우, 효과자 세포는 공여자 이식편 내에 존재하는 항원에 대항하여 면역 반응을 일으키는 수용자 고유 세포일 수 있다. 다른 경우에서, 효과자 세포는, 이식편의 일부일 수 있고, 이식편을 수용자 조직에 도입하는 것은, 이식편 내에 존재하는 효과자 세포가 이식편의 수용자에 대항한 면역 반응을 야기하게 한다.

"효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한, 수용자 내에서 효과자 세포의 면역반응을 감소시키기 위하여 이식편 수용자를 치료"라는 용어는, 본원에 사용된 구절과 같이 BMSC로 치료되지 않은 기본적으로는 동일한 동물 내의 내재적 면역 반응과 비교하여, 일례로 수용자에게 BMSC를 투여하는 것과 같은 임의의 방법에 의해 수용자 내의 동종항원에 대항한 내재적 면역 반응을 감소시킨다는 의미이다. 내재적 면역 반응 감소는, 본원에 기재된 방법 또는, 동물에서 내재적 면역 반응을 평가하는 기타 방법에 의해 평가 가능하다.

본원에 사용된 "치료적 유효량"은, BMSC가 투여되는 대상에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한 BMSC의 양이다.

본원에 사용된 "내재적"은, 생물, 세포 또는 시스템 내부로부터의 또는 거기에서 생성되는 임의의 물질을 가리킨다.

"외래"는, 생물, 세포 또는 시스템 외부로부터 도입되는 또는 거기에서 생성되는 임의의 물질을 가리킨다.

"코딩하는"은, 일례로 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드의 특정 서열의 본질적 성질로서, 뉴클레오티드의 규정된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는, 이에서 비롯되는 생물적 성질 및 규정된 성질 및 아미노산 서열을 가지는, 생물 과정상 다른 중합체 및 고분자의 합성에서 주형으로 작용하는 것이다. 따라서, 유전자에 해당하는 mRNA의 전사 및 번역이, 세포 내에서 또는 다른 생물 시스템에서 단백질을 생성하면, 유전자는 단백질을 코딩하는 것이다. mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록으로 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥 및, 유전자 또는 cDNA의 전사 주형으로 사용되는 비코딩 가닥 모두, 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 코딩하는 것으로 언급 가능하다.

달리 특정되지 않는 한, "아미노산 서열 코딩 뉴클레오티드 서열"은, 상호의 퇴화형 (degenerate version)이면서 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함 가능하다.

'단리된 핵산"은, 일례로, 천연에서 발생하는 게놈 내의 단편에 인접한 서열인, 일례로, 단편에 보통 인접한 서열들로부터 제거된 DNA 단편인, 천연 발생 상태에서 가장자리에 놓인 (flanking) 서열들로부터 분리한 핵산 조각 또는 단편을 가리킨다. 상기 용어는 또한, 세포 내에서 천연으로 수반되는 일례로 RNA 또는 DNA 또는 단백질인, 핵산과 천연에서 수반되는 기타 성분들로부터 실질적으로 정제한 핵산에 적용된다. 상기 용어는 따라서, 일례로, 벡터, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스 또는 진핵 또는 원핵의 게놈 DNA에 혼입된 재조합 DNA, 또는 다른 서열과 독립적으로 별도의 분자로 존재하는 것 (일례로, PCR 또는 제한 효소 분해에 의해 생성되는 게놈 또는 cDNA 단편 또는 cDNA)를 포함한다. 이는 또한, 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

본 발명의 내용에서 통상 존재하는 핵산 염기에 대한 하기의 약어를 사용한다. "A"는 아데노신, "C"는 시토신, "T"는 티미딘, "G"는 구아닌을 의미하고 "U"는 유리딘을 의미한다.

"벡터"는, 세포 내부에 단리된 핵산을 전달하기 위하여 사용되며, 단리된 핵산을 포함하는 물질의 조성물이다. 각종 벡터가 당업계에 공지이고, 비제한적으로는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친성 화합물 관련 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 따라서, "벡터"라는 용어는 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는, 일례로, 폴리라이신 화합물, 리포좀 등과 같이 세포 내로의 핵산 전달을 촉진하는 비플라스미드 및 비바이러스성 화합물을 포함하는 것으로 또한 이해되어야 한다. 제한이 아닌 예로서의 바이러스성 벡터는, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함한다.

"발현 벡터"는, 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 가리킨다. 발현 벡터는, 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주세포에 의해 제공되거나, 시험관내 발현시스템 내로 제공 가능하다. 발현 벡터는, 일례로 코스미드, 플라스미드 (일례로 그 자체 또는 리포좀에 포함된 것) 및 재조합 뉴클레오티드를 혼입하는 바이러스와 같이 당업계 공지의 모든 것을 포함한다.

설명

본 발명은, 골수 스트로마 세포 (BMSC)를 상이한 개인으로부터 수득한 T 세포와 접촉시 (동종이계 T 세포), 동종이계 T 세포가 증식하지 않는다는 발견에 관련된다. 선행기술의 도그마는, T 세포를 임의의 다른 세포와 혼합시, T 세포 증식을 유발한다는 점을 제시한다. 혼합된 림프구 반응 (MLR)은, 면역원성 평가를 위해 사용되는 표준 어세이이다. 본원에 개시된 데이터는, 한 개인에게서 유도된 T 세포가 상이한 개인에게서 수득한 BMSC에 반응하지 않음을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 것을 바탕으로, BMSC는 명백한 T 세포 반응과 관련한 면역 시스템에 대해 면역원성이지 않다.

상이한 개인에서의 T 림프구에 관련한 BMSC의 비면역원성 표현형에 추가하여, 본 발명은 또한, 일례로 한 개인의 T 세포와 다른 개인의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 사이와 같은, 동종이계 세포 간에서의 MLR을 BMSC가 억제할 수 있다는 발견과 관련된다. 이러한 예측하지 못한 결과는, 상이한 개인들로부터의 PBMC와 T 세포 간의 MLR 에서의 동종이계 T 세포 반응을, BMSC가 활발하게 감소시킬 수 있음을 시사한다. 나아가, 본원 다른 곳에서 더 자세히 논의된 바와 같이, 이와 같은 감소는, 투여량 의존적 방식으로 발생하는 것이 관측된다. 이는, BMSC가 이식편의 숙주 거부 억제 치료 및 추가로, 이식 이후 이식물 대 숙주 질병을 방지 또는 다르게는 억제하기 위한 치료로 사용 가능함을 나타낸다.

I. 이식편의 숙주 거부 억제 치료

본 발명은 이식편의 숙주 거부 억제 치료로서 BMSC를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은, BMSC가 동종이계 T 세포 증식을 촉진하지 않는다는 발견에 기초한다. 추가로, BMSC는 MLR 반응에서 T 세포 증식을 억제하는 것으로 관측되었다.

당업자는, 본원에 제공된 내용을 바탕으로, BMSC가 동종이계 T 세포 반응을 억제하는 활성이, 상이한 개인들로부터의 PBMC 및 T 세포 사이의 MLR에 국한되지 않음을 알 수 있을 것이다. 이와는 다르게, BMSC는, 상이한 개인으로부터의 임의의 타입의 세포 및 T 세포 간의 MLR의 억제를 포함하기 위해 사용 가능하다. 일례로, T 세포 및 신경 줄기 세포 (NSC), 간세포, 심장 세포, 연골세포, 신장세포, 지방 세포 등 간의 MLR은, BMSC를 사용하여 억제 가능하다. 바람직하게, BMSC는 이식된 인간 NSC의 숙주 거부를 억제하기 위해 사용된다.

본 발명은, 이식편의 숙주 거부를 감소 또는 억제하기에 유효한 양의 BMSC를 이식편 수용자에게 투여함에 의해 수용자 내에서의 이식편에 대한 면역 반응을 감소 및/또는 제거하는 방법을 포함한다. 임의의 특정 이론에 국한되지 않으면서, 이식편의 수용자에게 투여되는 BMSC는, 수용자 T 세포의 활성화 및 증식을 억제한다.

이식편은, 이식하고자 하는 생물적합성 격자 또는 수용체 조직, 장기 또는 세포를 포함한다. 비제한적인 이식편의 예는, 피부 세포 또는 조직, 골수, 및 고형 장기, 일례로, 심장, 췌장, 신장, 폐 및 간을 포함한다. 바람직하게, 이식편은 인간 신경 줄기 세포이다.

본원에 제공된 내용을 바탕으로, BMSC는 임의의 공급원, 일례로, 조직 공여자, 이식편 수용자 또는 다른 비관련 공급원에서 수득 가능하다 (상이한 개인 또는 종 전부). BMSC는 T 세포 관련하여 자가유래이거나 (동일 숙주로부터 수득), T 세포 관련하여 동종이계일 수 있다. BMSC가 동종이계인 경우, BMSC는 T 세포가 반응하는 이식편에 관련하여 자가유래이거나 또는 T 세포가 반응하는 이식편의 공급원 및 T 세포의 공급원 모두와 관련하여 동종이계인 개인으로부터 BMSC를 수득 가능하다. 나아가, BMSC는 T 세포에 대해 이종발생성일 수 있고 (상이한 종의 동물로부터 수득), 일례로 MLR에서 인간 T 세포의 활성화 및 증식을 억제하는데 래트 BMSC를 사용 가능하다.

추가의 구현에서, 본 발명에서 사용되는 BMSC는 비제한적으로, 인간, 마우스, 래트, 유인원, 긴팔원숭이, 소를 포함하는 포유류의 임의 종의 골수로부터 분리 가능하다. 바람직하게, BMSC는 인간, 마우스 또는 래트에게서 분리된다. 보다 바람직하게, BMSC는 인간에서 분리된다.

본 내용을 바탕으로, BMSC는 분리되어 시험관 내에서 배양중 확대(또는 배양에서 증폭)되어, 본원에 기재된 방법에 사용되기 위한 세포를 충분한 수로 얻을 수 있다. 일례로, BMSC는 인간 골수로부터 분리되어 완전 배지에서 배양 가능하다 (DMEM 저 글루코스; 4 mM L-글루타민, 10% FBS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 함유). 그러나 본 발명은, BMSC를 분리하고 배양하는 어느 한 방법에 제한되는 것으로 이해되어서는 안 된다. 오히려, BMSC를 분리 및 배양하는 임의의 방법이 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

시험관 내에서 BMSC를 유지할 수 있는 임의의 배지를 BMSC 배양을 위해 사용 가능하다. BMSC 성장을 유지할 수 있는 배지 제제는, 비제한적으로 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM), 알파 변형 최소 본질 배지 (α MEM), 및 로스웰 파크 메모리알 연구소 배지 (Roswell Park Memorial Institute Media 1640; RPMI Media 1640) 등을 포함한다. 일반적으로, 0-20%의 태아 소 혈청 (FBS) 또는 1-20%의 말 혈청 (FBS)을 상기 배지에 첨가하여, BMSC의 성장을 유지한다. 그러나 BMSC를 배양하기 위한 성장 인자, 사이토카인 및 호르몬이 배지 내에 적절한 농도로 제공되면, 규정된 배지도 사용 가능하다. 본 발명 방법에 유용한 배지는, 비제한적으로, BMSC 배양에 유용한 항생제, 마이토젠 또는 분화 화합물을 포함하는, 관심 화합물 하나 이상을 함유 가능하다. 세포는, 27℃ 내지 40℃, 바람직하게는 31℃ 내지 37℃의 온도에서, 더욱 바람직하게는 가습 항온기 내에서 성장 가능하다. 이산화탄소의 함량은 2-10%이고, 산소 함량은 1-22%로 유지 가능하다. 그러나 본 발명은 BMSC의 분리 및 배양을 위한 임의의 방법에 제한되는 것으로 절대 이해되어서는 안 된다. 오히려, BMSC를 분리하고 배양하는 임의의 방법이 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

배지에 첨가 가능한 비제한적인 항생제는 페니실린과 스트렙토마이신을 포함한다. 배양 배지 내 페니실린의 농도는 1ml 당 약 10-약 200 유닛이다. 배양 배지 내 스트렙토마이신의 농도는 1ml 당 약 10-약 200㎍이다.

본 발명의 다른 구현은, 이식편의 수용자에게 BMSC를 투여하는 경로를 포함한다. BMSC는, 즉 이식될 생물적합성 격자 또는 공여자 조직, 기관 또는 세포인 이식편을 위치시키기에 적합한 경로에 의해 투여 가능하다. BMSC는, 즉 정맥 내 주사에 따른 비경구에 의해 전신으로 투여 가능하고 또는 골수와 같은 특정 조직 또는 장기에 목표 될 수 있다. BMSC는, 일례로 근육인 결합 조직으로 세포를 주사 또는 세포의 피하 임플란트에 의해 투여 가능하다.

BMSC는 약 0.01-약 5x10⁶ 세포/ml의 농도로 적절한 희석제 내에 현탁 가능하다. 주사 용액을 위한 적절한 부형제는, BMSC 및 수용자와 생물 및 생리적으로 작합한 것으로, 일례로 완충화 식염용액 또는 기타 적절한 부형제이다. 투여 조성물은 적절한 멸균 및 안정성에 따른 표준 방법에 따라 제제화, 생산 및 저장 가능하다.

BMSC의 투여량은, 광범위에 걸쳐 가변이고, 각 특정 경우의 개인 요구에 따라 조절 가능하다. 사용한 세포의 개수는, 수용자의 체중 및 상태, 투여의 횟수 및/또는 빈도, 및 당업자에게 공지인 기타 변수에 의존한다.

100kg 체중 당 약 10⁵내지 약 10¹³ 개의 BMSC를 개인에게 투여 가능하다. 일부 구현에서, 100kg 체중 당 약 1.5x10⁶내지 약 1.5x10¹²개의 세포를 투여한다. 일부 구현에서, 100kg 체중 당 약 1x10⁹내지 약 5x10¹¹개의 세포를 투여한다. 일부 구현에서, 100kg 체중 당 약 4x10⁹내지 약 2x10¹¹개의 세포를 투여한다. 일부 구현에서, 100kg 체중 당 약 5x10⁸내지 약 1x10¹개의 세포를 투여한다.

본 발명의 다른 구현에서, BMSC는, 이식편의 숙주 거부를 제거 및/또는 감소하기 위해 이식 이전 또는 동시에 수용자에게 투여된다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 수용자의 T 세포에 의한 이식편에 대항한 면역 반응을 감소, 억제 또는 제거하기에 유효량인 이식편의 이식 이전, 또는 동시에 BMSC를 수용자에게 투여하여 이식편에 대한 수용자의 면역 시스템을 조절하기 위해 BMSC를 사용 가능하다. BMSC는, 이식편과 함께 제시될때 T 세포 반응이 감소, 억제 또는 제거 되도록 수용자의 T 세포에 영향을 미친다. 따라서, 이식 이전, 또는 동시에 수용자에게 BMSC를 투여함에 의해 숙주의 이식편 거부를 피하거나 또는 그 중증도를 감소시킬 수 있다.

또 다른 구현에서, BMSC는, 이식편의 투여 이후 이식편 수용자에게 투여 가능하다. 또한, 본 발명은, 숙주 이식편 거부로 또한 알려진, 이식편에 대한 면역 반응을, 감소, 억제 또는 제거하기 위한 유효량으로 환자에게 BMSC를 투여하여 이식편에 대한 부정적 면역 반응을 겪고 있는 환자를 치료하는 방법을 포함한다.

II . 이식 이후 이식물 대 숙주 질병 억제 요법

본 발명은, 이식 이후 이식물 대 숙주 질병 억제 요법으로 BMSC를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은, BMSC가 동종이계 T 세포 증식을 자극하지 않는다는 발견에 기초한다. 또한, BMSC는 MLR 반응에서 T 세포 증식을 억제하는 것으로 관측되었다.

본 발명은 또한, 수용자에 대항한 공여자 이식편에 의한 면역 반응 (즉, 이식물 대 숙주 반응)을 감소 및/또는 제거하는 방법을 제공한다. 따라서 본 발명은, 일례로 생물적합성 격자 또는 공여자 조직, 장기 또는 세포, 바람직하게는 신경 줄기 세포인 공여자 이식편을, 수용자에게 이식편 이식 이전에 BMSC와 접촉시키는 방법을 포함한다. BMSC는, 수용자에 대항한 공여자 이식편에 의한 부정적 반응을 완화, 억제 또는 감소시키는 작용을 한다.

본원 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 이식편 수용자에 대항한 이식편에 의한 부정적 면역 반응을 제거 또는 감소시키는 용도로, BMSC는 임의의 공급원, 일례로, 조직 공여자, 이식편 수용자 또는 달리 연관되지 않은 공급원 (전혀 다른 개인 또는 종)으로부터 수득 가능하다. 따라서, BMSC는 조직 공여자, 이식편 수용자 또는 달리 연관되지 않은 공급원에 대해 자가유래이거나, 동종이계 또는, 이종발생성일 수 있다.

본 발명의 구현에서, 수용자로 이식편의 이식 이전에 이식편을 BMSC에 노출시킨다. 이 경우, 임의의 동종반응성 수용자 세포에 의해 야기되는 이식편에 대항한 면역 반응은 이식편 내 존재하는 BMSC에 의해 억제될 것이다. BMSC는 수용자에게 동종이계이며, 공여자, 또는 공여자 또는 수용자 이외의 공급원으로부터 유래 가능하다. 일부 경우, 수용자 자가 유래인 BMSC를 이식편에 대항한 면역 반응 억제를 위해 사용 가능하다. 다른 경우에서, BMSC는 수용자에 대하여 이종발생성으로, 일례로, 인간의 면역 반응 억제를 위해 마우스 또는 래트 BMSC를 사용 가능하다. 그러나 본 발명에서 인간 BMSC를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 구현에서, 공여자 이식편은, 수용자에게 대항한 이식편의 면역원성 감소를 위해 수용자에게 이식 이전 이식편을 처리하여 "선조절" 또는 "선처리" 가능하며, 이에 따라 이식물 대 숙주 질병을 감소 및/또는 방지 가능하다. 이식편은, 이식편과 관련될 수 있는 T 세포 활성화를 위해 이식 이전 수용자로부터의 세포 또는 조직과 접촉가능하다. 수용자로부터의 세포 또는 조직과 이식편의 처리 이후, 세포 또는 조직을 이식편으로부터 제거 가능하다. 처리된 이식편은, 이후 BMSC와 추가로 접촉시켜, 수용자의 세포 또는 조직 처리에 의해 활성화된 T 세포의 활성을 감소, 제거 또는 억제한다. BMSC로 이식편을 처리 후, 수용자로 이식 이전에 BMSC를 이식편으로부터 제거 가능하다. 그러나 일부 BMSC는 이식편에 부착하여, 이에 따라 이식편과 함께 수용자에게 도입 가능하다. 이 경우, 이식편 관련 임의의 세포에 의해 야기되는 수용자에 대항한 면역 반응을, 수용자에게 도입된 BMSC가 억제 가능하다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 수용자에게 이식편을 이식하기 이전에 BMSC로 이식편을 처리하는 것은, 활성화된 T 세포의 활성도를 감소, 억제 또는 제거하도록 하여, 수용자의 조직 및/또는 세포로부터의 연이은 항원성 자극에 대한 T 세포의 저반응성을 유도 또는 재자극을 억제할 수 있다. 당업자는, 본 내용을 바탕으로, 이식 이전의 이식편 선처리 또는 선조절이, 이식물 대 숙주 반응을 감소 또는 제거함을 이해할 것이다.

일례로, 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 (조혈 줄기 세포) 이식에서, 이식물에 의한 숙주 공격은, 숙주에 대한 이식물의 면역원성을 감소하기 위한 본원에 기재된 선처리 방법을 사용하여 공여자 골수를 선조절함에 의해 감소, 억제 또는 제거 가능하다. 본원 다른 곳에 기재된 바와 같이, 공여자 골수는 수용자에게 공여자 골수를 이식하기 이전에, 시험관내에서 임의 공급원의 BMSC, 바람직하게는 수용자 BMSC로 선처리 가능하다. 바람직한 구현에서, 공여자 골수는, 수용자 조직 또는 세포로 먼저 노출되고 이후 BMSC로 처리된다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않으며, 공여자 골수를 수용자 조직 또는 세포와 초기 접촉시키는 것은, 공여자 골수 중 T 세포 활성화 기능을 하는 것으로 여겨진다. BMSC로 공여자 골수를 처리하는 것은, 연이은 항원성 자극에 대한 T 세포의 저반응성 또는 재자극 억제를 유도하여, 수용자에 대한 공여자 골수에 의해 유도되는 부작용을 감소, 억제 또는 제거한다.

본 발명의 구현에서, 이식물 대 숙주 질병으로 고생하는 이식편 수용자는, 이식물 대 숙주 질병 감소 또는 제거를 위한 유효량으로 BMSC를 투여하는, 이식물 대 숙주 질병으로부터의 그 중증도를 감소, 억제 또는 제거하기 위해 수용자에게 BMSC를 투여하여 치료 가능하다.

본 발명의 이러한 구현에서, 바람직하게 수용자의 BMSC는, 이식 이전에 수용자로부터 수득하여, 보관 및/또는 배양으로 증폭하여, 진행중인 이식물 대 숙주 반응을 치료하기에 충분량으로 BMSC의 저장량을 제공할 수 있다. 그러나 본원 다른 곳에서 논의된 바와 같이, BMSC는 임의의 공급원, 일례로, 조직 공여자, 이식편 수용자 또는 달리 연관되지 않은 공급원 (전혀 다른 개인 또는 종)으로부터 수득 가능하다.

III . BMSC 사용의 장점

본원에 기재된 내용을 바탕으로, 본 발명의 BMSC는, 공여자 조직에 대한 숙주 거부 또는 이식물 대 숙주 질병의 치료를 위해, 일례로 면역억제 약물 요법을 사용하는 현대 방식과 함께 사용 가능하다. 이식에 있어 BMSC를 면역억제 약물과 함께 사용하는 것은, 본 발명의 방법을 사용함에 의해, 이식편 수용자 내의 면역 반응의 중증도를 완화하고, 사용되는 면역억제 약물 요법의 양 및/또는 면역억제 약물 요법 투여 빈도를 감소시킬 수 있다는 점이다. 면역억제 약물 요법 사용을 감소하는 이점은, 면역억제 약물 요법 관련 일반적 면역억제 및 원치않는 부작용을 경감할 수 있다는 것이다.

본 발명의 세포는 또한, 공여자 조직의 숙주 거부 또는 이식물 대 숙주 질병 치료를 위한 '1회' 요법으로 수용자에게 투여될 수 있다. 이식편 수용자에게 BMSC를 1회 투여하는 것은, 만성적 면역억제 약물 요법의 필요성을 제거한다. 그러나 필요시에는, BMSC를 다중 투여하는 것도 또한 사용 가능하다.

본원에 기재된 발명은 또한, 숙주 이식편 거부 및/또는 이식물 대 숙주 질병을 방지, 치료 또는 완화하기에 예방 또는 치료적 유효량으로 BMSC를 투여함에 의한 이식편 거부 및/또는 이식물 대 숙주 질병을 방지 또는 치료하는 방법을 포함한다. 본 내용을 기초로, BMSC의 치료적 유효량은, BMSC 투여 부재시 활성화된 T 세포의 개수와 비교하여, 활성화된 T 세포의 개수를 억제 또는 감소하는 양이다. 숙주 이식편 거부의 경우, BMSC의 유효량은, BMSC의 투여 이전 수용자 내의 활성화된 T 세포의 개수와 비교하여, 이식편 수용자 중 활성화된 T 세포의 개수를 억제 또는 감소시키는 양이다. 이식물 대 숙주 질병의 경우, BMSC의 유효량은 이식편 내에 존재하는 활성화된 T 세포의 개수를 억제 또는 감소시키는 양이다.

BMSC의 유효량은, 수용자 내에서 또는 그에 BMSC가 투여되기 이전 이식편 내의 활성화 T 세포 개수와, 수용자 내에 또는, 이에 BMSC를 투여한 이후 이식편 내에 존재하는 활성화 T 세포의 개수를 비교하여 측정 가능하다. BMSC 투여와 관련된 이식편 수용자 또는 이식편 자체 내에서의 활성화 T 세포 개수의 감소 또는 증가 결여는, 투여된 BMSC의 개수가, BMSC의 치료적 유효량임을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 구현에서, BMSC는, 포유류에서 외래 유전자의 발현을 위한 유전자 요법 담체로 사용 가능하다. 현재 사용되는 세포와 비교하여 유전자 요법 담체로 BMSC를 사용하는 이점은, 유전자 요법 적용에 현재 사용되는 세포와 비교시, BMSC가 장기간 생존가능하다는 신규한 발견에 기초한다.

유전적 변형

본 발명의 세포는, 영양인자, 성장 인자, 사이토카인, 뉴로트로핀 등과 같은 인자 생성을 위해, BMSC 내로 외래 유전자를 도입시킴으로써 유전자 변형이 가능하다. 분비된 인자들은 인접 세포에 유익하다. 비제한적인 인자는, LIF, 뇌 유도된 호중구 인자 (BDNF), 상피 성장 인자 수용체 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), FGF-6, 신경교 유도된 호중구성 인자 (GDNF), 과립구 군락 자극 인자 (GCSF), 간세포 성장 인자 (HGF), IFN-γ, 유사 인슐린 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1ra, IL-6, IL-8, 단구 주화성 단백질 (MCP-1), 단핵 식세포 군락 자극 인자 (M-CSF), 호중구성 인자 (NT3), 금속단백질분해효소 조직 억제제 (TIMP-I), TIMP-2, 종양 괴사인자 (TNF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), VEGF-D, 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체 (uPAR), 골 형태발생 단백질 4 (BMP4), IL1-a, IL-3, 렙틴, 줄기세포인자 (SCF), 스트로마 세포 유도된 인자-1 (SDF-1), 혈소판 유도된 성장 인자-BB (PDGFBB), 변형 성장 인자 베타 (TGFβ-1) 및 TGFβ-3를 포함한다.

다른 면에서, BMSC는, 각각 갠시클로비어와의 처리에 의한 제거 또는 플로우 사이토메터에 의한 분리를 위해 사용 가능한 초록 형광 단백질 (GFP) 또는 HSV-티미딘 키나아제와 같은 유전자 발현을 위해 유전자 변형 가능하다.

유전자 변형 BMSC에 추가하여, 본 발명은, 유전자 변형 NSC를 포함한다. 유전자 변형 NSC는, 개인에게서 결함 있는 세포 대체를 위해 사용 가능하다. 본 발명은 또한, 분비된 목적 단백질 발현을 위해 사용 가능하다. 즉, NSC를 단리하여, 목적 단백질 유전자를 삽입하고, 목적 단백질이 생산되어 치료 효과를 발생 또는 도모하는 개인 내로 도입할 수 있다. 본 발명의 이러한 면은, 개인에게 유전자 변형 NSC를 도입함에 의해 개인에게 치료 단백질을 투여하는 유전자 요법과 관련된다. 유전자 변형 NSC는, 본원에 기재된 방법으로 배양, 단리되고, 체내에서 NSC에 의해 단백질 발현과 분비될 때 효과를 입는 개인 내로 임플랜트된다.

본 발명에서, 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 함유 유전자 구축물을 NSC 내로 도입한다. 즉, 개인에서 그 발현이 치료적 효과를 가지는 유전자를 도입하도록 세포를 유전자 변화시킨다. 본 발명의 일부 구현에서, 개인의 NSC 또는 다른 개인 또는 비인간 동물의 NSC를 유전자 변화시켜, 결함 유전자를 대체 및/또는 그 발현이 개인에게서 치료 효과를 가지는 유전자를 도입하도록 할 수 있다.

세포 내로 유전자 구축물이 형질감염되는 모든 경우에서, 이종 유전자는, 세포 내 유전자 발현 달성을 위해 요구되는 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 그러한 조절 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다.

유전자 구축물은 바람직하게, 필수 조절 서열에 작동적으로 연결된 이종 단백질 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 제공되며, 따라서 벡터가 세포로 형질감염시, 코딩 서열이 세포에 의해 발현하게 된다. 코딩 서열은, 세포의 서열 발현에 필요한 조절 성분에 작동적으로 연결된다. 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 그 하이브리드 또는 mRNA와 같은 RNA 분자일 수 있다.

유전자 구축물은, 조절 성분에 작동적으로 연결된 유익한 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 기능성 세포질 분자, 기능성 에피좀 분자로 세포 내에 잔존하거나, 또는 세포의 염색체 DNA로 혼입 가능하다. 외래 유전자 물질은 세포 내로 도입되어, 플라스미드 형태의 별개의 유전자 물질로 존재 가능하다. 이와 다르게, 염색체에 혼입 가능한 선형 DNA를 세포 내로 도입 가능하다. 세포 내로 DNA 도입시, 염색체 내 DNA 도입에 유용한 시약을 첨가 가능하다. 혼입 촉진에 유용한 DNA 서열 또한 DNA 분자에 포함 가능하다. 이와 다르게, RNA를 세포 내로 도입 가능하다.

유전자 발현 조절 성분을 다음을 포함한다: 프로모터, 개시 코돈, 종결 코돈, 및 폴리아데닐화 시그날. 이들 성분들은 본 발명의 세포 내에서 작동가능한 것이 바람직하다. 또한, 이들 성분들이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어, 세포에서 뉴클레오티드 서열이 발현하고, 따라서 단백질이 생산되는 것이 바람직하다. 개시 코돈과 종결 코돈은 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열의 일부로 보통 생각된다. 그러나 이들 성분은 세포 내에서 기능성인 것이 바람직하다. 유사하게, 사용되는 폴리아데닐화 시그날 및 프로모터는 본 발명 세포 내에서 기능성이어야만 한다. 본 발명 실시예 유용한 다수의 세포에서 활성인 프로모터의 비제한적인 예는, 사이토메가로바이러스 프로모터, SV40 프로모터 및 레트로바이러스 프로모터를 포함한다. 본 발명 실시예 유용한 다른 프로모터의 비제한적인 예는, 조직 특이적 프로모터, 즉 다른 조직이 아닌 일부 조직에서만 기능하는 프로모터; 또한, 특정 또는 일반적 인핸서 서열의 존재 또는 부재하에 세포 내에서 보통 발현되는 유전자의 프로모터를 포함한다. 일부 구현에서, 사용되는 프로모터는, 인핸서 서열의 존재 또는 부재하에 세포 내에서 유전자를 구성적으로 발현한다. 인핸서 서열은, 적절하거나 필요한 경우 그러한 구현들에서 제공된다.

본 발명의 세포는, 당업자에게 용이한 공지의 기법으로 형질감염 가능하다. 외래 유전자는, 유전자에 의해 코딩된 단백질을 발현할 세포 내로 유전자 구축물을 도입하기 위해 사용되는 표준 방법에 의해 세포 내로 도입 가능하다. 일부 구현에서, 세포는, 인산칼슘 침전 형질감염, DEAE 덱스트란 형질감염, 전기천공, 마이크로주사, 리포좀 매개 전달, 화합물 매개 전달, 리간드 매개 전달 또는 재조합 바이러스 벡터전달에 의해 형질감염된다.

일부 구현에서, 목적 서열을 가진 DNA의 세포내 도입을 위해 재조합 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 일부 구현에서, 목적 서열을 가진 DNA의 세포내 도입을 위해 재조합 레트로바이러스 벡터가 사용된다. 일부 구현에서, 표준 CaPO₄, DEAE 덱스트란 또는 액체 담체 매개 형질감염 기법을 사용하여 분열하는 세포 내로 목적 DNA를 도입한다. 표준 항생제 내성 선택 기법을 사용하여 형질감염 세포를 동정 및 선택 가능하다. 일부 구현에서, DNA는 마이크로주사에 의해 세포 내로 직접 도입된다. 유사하게, 공지의 전기천공 또는 입자 충격법을 사용하여 외부 DNA를 세포 내로 도입 가능하다. 제 2의 유전자는 보통 치료 유전자와 함께 형질감염 또는 연결된다. 제 2의 유전자는 빈번하게는 선택가능한 항생제 내성 유전자이다. 형질감염 세포는, 선택가능 유전자를 취하지 않은 세포를 사멸시키는 항생제 내에서 세포를 성장시켜 선택한다. 대부분의 경우, 2개의 유전자가 연결되지 않은 채 함께 감염되면, 항생제 처리에서 살아남은 세포는 그 안에 2개 유전자 모두를 가지며 이들 모두를 발현한다.

달리 기재하지 않는 한, 유전자 조작은 문헌에 기재된 대로 실시한다 (Sambrook 등, 2002, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). 본 발명은, 외래 유전자를 발현하도록 엔지니어링된 유전자 변형 세포를 포함한다. 외래 유전자는, 일례로 내재 유전자의 외래 형일 수 있다 (일례로, 돌연변이 포함 결함 있는 대립유전자 대체를 위해 동일 유전자의 야생형을 사용 가능함). 외래 유전자는 보통 (그러나 필수적이지는 않게), 하나 이상의 추가의 유전자와 연결된다 (즉, '융합'). '추가의' 유전자의 예는, 외래 유전자를 혼입한 세포를 선택하기 위한 '양성' 선택에 유용한 유전자 및, 내재 유전자로서의 동일 염색체 유전자좌 내로 외래 유전자를 혼입한 세포 선택을 위한 '음성' 선택에 유용한 유전자 또는 이들 모두를 포함한다.

본원에 기재된 방법은, 당업계 공지의 각종 방식 및 각종 변형 그리고 그 조합으로 실시 가능함을 이해하여야한다. 또한, 세포 타입간 상호 작용 또는 작용 방식에 관해 기재한 임의의 이론은 본 발명을 어느 방식으로나 제한하지 않고, 본 발명 방법이 보다 잘 이해되도록 하는 면에서 제시됨을 알아야한다.

하기의 실시예는 본 발명의 면들을 추가로 예시한다. 그러나 절대로 이들이 본원에 기재된 본 발명 내용 또는 교시를 제한하는 것이 아니다.

줄기세포는 질병 또는 외상에 의해 손상된 조직의 복구 및 대체를 위한 잠정적인 다수의 임상 적용을 가진다. 본원의 실시예는, 동종이계 NSC에 대한 T 세포 반응을 특정화하여, NSC의 면역원성을 평가하는 것과 관련된다. 이들 세포 는 T 세포에 의해 인식되어 증식 반응을 유도하는 것으로 보여졌다. 본 실시예는, 시험관내에서 NSC에 대한 T 세포 활성화를 BMSC가 억제하는지의 여부 및 생체 내에서 NSC의 생존을 BMSC가 연장하는지의 여부를 논의한다. 추가로, 본 내용은, 동종이계 줄기세포 이식을 돕는 면역 특권 또는 면역억제를 국소적으로 형성하기 위한 BMSC의 용도를 개시한다.

실시예 1: 신경 줄기 세포( NSC )의 특정화:

인간 태아 신경 줄기 세포의 단리 및 배양:

인간 태아 뇌조직은 Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA)로부터 구입 가능하다. 조직을 PBS/항생제로 세척하고, 목적 뇌 조직 사용 이전 뇌막을 제거한다. 잔류 조직을 족집게로 찢어 분리하고 파스퇴르 피펫으로 분쇄하여 추가 분해한다. 이후 실온에서 5분간 1000rpm으로 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 세포 펠릿을 NSC 성장 배지 10ml에 재현탁한다 (DMEM/F12, 8mM 글루코스, 글루타민, 2OmM 중탄산 나트륨, 15 mM HEPES, 8㎍/ml 헤파린, N2 보충제, 10ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF). 세포를 구멍난 뚜껑을 가진 코팅된 (15㎍/ml 폴리오르니틴으로 밤새, 그리고 이후 lO㎍/ml 인간 피브로넥틴으로 4시간 초과) T-25 cm² 플라스크에 도말하고, 5% CO₂ 항온기에서 37℃로 성장시킨다. 백혈병 억제 인자 (LIF)로 성장시킨 세포를, bFGF 존재하 및 EGF 단독으로 먼저 성장시킨 후 (1-2 계대), 10ng/ml LIF 와 함께 완전 성장 배지에 도말한다. 신선한 완전 배 양 배지로 배지의 50%를 대체하여 격일 간격으로 배양액을 공급한다. 2-3 분간 PBS 내에서 0.05% 트립신-EDTA로 트립신화하여 세포를 계대하고, 이후 대두 트립신 억제제를 가하여 트립신을 불활성화한다. 실온에서 5분간 1200rpm으로 세포를 펠릿화하고, 성장 배지 내에 재현탁하고, 코팅된 플라스크 상에 1.0-1.25 x 10⁵ 세포/ cm² 로 도말한다. 세포를 10% DMSO 및 90% 완전 배양 배지 내에서 냉동보존한다.

NSC 는 MHC 클래스 I 항원을 발현한다:

본원에 기재한 방법에 따라 인간 태아 조직으로부터 NSC를 제조하고, 약 13 계대로 배양하였다. 표준 플로우 사이토메트리 기법을 사용하여 면역적 관련 세포 막 분자에 대해 세포를 평가하였다. 간단하게, 세포를 5% FBS 함유 PBS로 세척하고, 형광색소 태깅된 모노클로날 항체로 염색 이전에 마우스 면역글로불린으로 블라킹한다. 동형 매칭된 형광색소 레벨링된 면역글로불린으로 세포를 인큐베이션하여 배경 (background) 염색을 측정한다. Cell Quest 획득 소프트웨어를 사용한 Becton Dickinson FACSCaliber 플로우 사이토메터의 분석을 위해 약 50,000개의 세포가 수득된다. BMSC/NSC 및 조혈 세포는 그 크기 및 광산란 특성에서 크게 상이하므로, 사이토메터 상에서 각 세포타입에 따라 분리하여 세포를 수득하는 것이 바람직하다. PBMC로 BMSC를 스파이킹하여 게이트 좌표를 측정하였다. 결과는 히스토그램 또는 점 찍음으로 표시한다.

NSC 군은, 조혈 마커 (CD45, CD14, CD34), 공자극 분자 (CD80, CD86) 또는 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않는 것으로 관측되었다. 그러나 NSC는 줄기세포 마커인 CD133 및 MHC 클래스 I 항원을 발현하였다. 클래스 I 분자의 발현은 세포가 동종반응성 T 세포에 의해 인지되고, 면역경쟁성 동종이계 수용자에게 이식될 때 세포가 거부될 것임을 보통 나타낸다.

NSC 는 동종이계 T 세포의 증식을 촉진한다

NSC의 면역원성을 일방 혼합 림프구 반응 (MLR)으로, 반응세포를 T 세포로 하고 조사된 (irradiated) NSC를 자극 세포로 하여 평가하였다. 동종항원에 대한 T 세포 증식 반응을 측정하는 MLR은, 생체 내 동종이계 세포의 생존을 예측한다. 본원 다른 곳에서 기재한 바와 같이 인간 태아 조직으로부터 NSC를 준비하여, 약 13 계대로 배양하였다. 약 5 x 10⁴ 세포/웰의 고투여량으로 시작하여, 자극 세포로 NSC를 3배 감소로 감소 적정하였다. 비관련 공여자의 정제 T 세포 (2 x 10⁵ 세포/웰)를 반응자 세포로 준비하였다. 자가유래 PBMC를 대조군 자극 세포로 사용하였다. 도 1에서처럼, 최고 세포투여량에서조차 상당량의 T 세포 증식을 자극하지 못한 자가유래 PBMC와 비교하여, NSC는 T 세포 증식을 현격한 정도를 자극하였다 (P<0.05, 스튜던트 T 시험). 이들 결과는 T 세포에 의해 동종이계 NSC가 인지되어, 기능성 면역 반응을 유도함을 시사한다.

실시예 2: 골수 스트로마 세포 ( BMSC )의 특정화:

BMSC를 당업계 공지의 방법으로 제조하였다. 일례로, 인간 골수는 AllCells LLC (Berkeley, CA)에서 구입하거나, 또는 공여자로부터 바늘 흡입으로 취할 수 있다. Hespan 밀도 구배로 세포를 회전시켜 (800xg, 30분), 경계면의 세포를 10% FBS가 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)를 사용하여 T-185 플라스크 내에 1.62 x 10⁵/cm² 로 도말한다. 배양기간 이후, 비부착성 세포를 세포군으로부터 제거하고 세포가 컨플루언트(confluent)할 때까지 (P0; 이는 배양 이후 보통 약 2-3 주에 발생), 보통 3-4일마다 배지를 교환한다. 부착된 세포를 트립신화 (0.05% 트립신)로 수합하고, 추가의 확대가 필요한 경우 T185 플라스크 내에서 5000 세포/cm²의 시딩 밀도로 재도말한다. 배양 배지는, 세포가 컨플루언트할 때까지 (보통 1주), 3-4일마다 교환하고, 트립신화로 계대한다. 플로우 사이토메트리에 의해 특정 마커를 사용하여 세포를 테스트하였다. 실험에 사용 이전 또는 액체 질소에 냉동 보존 이전에 BMSC를 보통 2-4 계대한다.

래트 BMSC는 당업계 공지의 방법으로 단리가능하다. 일례로, 뒷다리를 제거하여 경골로부터 대퇴골을 분리한다. 소독된 골 절단기를 사용하여 대퇴골의 말단을 제거하고 18 게이지 바늘이 구비된 주사기를 사용하여 일례로 10% 소 태아 혈청과 페니실린/스트렙토마이신 보충된 알파 변형 이글 매질인 소독 매질 내로 골수 충전물을 삽입한다. 골수 충전물을 단일 세포 현탁액에 재현탁하고, 현탁액을 100 마이크론 세포 체에 걸러 덩어리를 제거한다. 세포를 세척하고 세포 배지 내에 재현탁한다. 세포를 약 9xlO⁵/cm²의 밀도로 T-185 플라스크에 도말한다. 5% 이산화탄소 함유 가습 대기하에서 37℃에서 플라스크를 배양한다. 2일 후, 비부착 세포 함유 매질을 흡입해버리고, 신선한 매질로 교체한다. 부착성 스트로마 세포가 컨플루언트할 때까지 (약 14일), 3-4일마다 배지를 교환한다. P0 세포를 트립신화 (0.25% 트립신, 5분간, 37℃)하고, 신선한 매질을 가하여 트립신을 불활성화한 후, 세포를 세척하여 1.08xl0⁴/cm²로 재도말한다. 일반적으로, 세포는 컨플루언트해짐에 따라 매주 계대한다. 3 계대에서, CD45, T 세포 (OX-52), 대식세포 (CDll b/c), 및 B 세포 (항-카파 경쇄)에 대한 항체를 사용한 플로우 사이토메트리에 의해 평가한 바, 조혈 세포에 의한 1% 미만의 감염만이 존재한다. BMSC는 Thy-1 (CD90) 및 MHC 클래스 I (OX-18)에 대해 양성 염색되고; MHC 클래스 II 항원에 대해서는 음성이다.

BMSC 표현형

인간 BMSC를 본원 다른 곳에서 기재한 바와 같이 골수에서 제조하고, 2계대 배양하였다. 이를, 각종 형광색소 레벨링된 모노클로날 항체로 염색하고, 플로우 사이토메트리로 세포 표면 마커의 발현을 평가하였다. BMSC는, CD45, CD3, CD34, CD19, 및 CD14를 포함하는 조혈 마커를 발현하지 않으나, CD90, CD105, 및 MHC 클래스 I 마커를 발현한다. 이는 또한 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않는다.

BMSC 는 동종이계 T 세포 증식을 자극하지 않는다

BMSC의 면역원성은 반응세포를 T 세포로 하고 조사된 (irradiated) BMSC를 자극 세포로 하여 일방 혼합 림프구 반응 (MLR)으로 평가하였다. 결과는, 동종이계 BMSC에 대해 T 세포가 증식하지 않으나, 동종이계 PBMC에 대해 격렬하게 반응함을 나타낸다 (도 2).

인간 MLR 어세이:

BMSC의 면역원성을 반응세포를 T 세포로하고 동종이계 PBMC를 자극 세포로 하여 혼합 림프구 반응 (MLR)으로 평가하였다. 루코프레시프 팩 (AllCellsLLC, Berkeley, CA; Poietics, Rockville, MD)으로부터, 모노 클로날 항-마우스 IgG 항체 (Dynal Biotech, Inc, Lake Success, NY)로 코팅된 자기 비드를 사용한 제거를 위해 비(非) T 세포 레벨링을 위한 단구세포 (CD 14), B 세포 (CD19), MHC 클래스 II, 및 NK 세포 (CD56)에 특이적인 마우스 모노클로날 항체 (Serotec, Raleigh, NC)를 사용한 음성 선택으로, T 세포를 정제하였다. 제거 이후 나머지 세포군은 플로우 사이토메트리 분석에 의하면 보통 85% 초과로 CD3 양성이었다. T 세포를 배양 배지 내에 현탁하였다; Iscove 변형 둘베코 매질 (IMDM)로서, 소듐 피루베이트, 비필수 아미노산, 2-머캅토에탄올, 항생제/항진균제, 및 5% 인간 AB 혈청 (모든 보충물은, Gibco, Carlsbad, CA에서 수득하고, 단 인간 AB 혈청만 PelFreez, Brown Deer, WI에서 수득)가 보충된 것. T 세포를 96웰 저증발 평편바닥 플레 이트 (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ)의 96웰 마이트로타이터 웰 (2 x 10⁵/웰)에, 동종이계 자극 세포와 함께 시딩하였다. 자극 세포를, 실험을 위해 필요한 수 (보통, 5 x 10⁴ 세포/웰의 고투여량으로부터 감소 적정)로 도말 이전, 세슘 광원 (Isomedix Gammator B, Parsippany, NY) 을 사용하여 5000 라드 감마 조사로 조사하였다. 처리당 3개의 웰로 배양을 실시하였다. 동종항원에 대한 T 세포 증식을, 배양 6일째, ³H-티미딘으로 배양을 펄스화하여 측정하였다. 96웰 세포 수확기를 사용하여 16시간 이후 필터메트 (Skatron, Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA) 상에 세포를 수확하고, 필터메트 상의 세포를 Microbeta 섬광 계수기 (Perkin Elmer, Turku, Finland)를 사용하여 계수하였다.

래트 MLR 어세이:

본 어세이는 인간 MLR과 유사한 방식으로 세팅된다. 간략하게, 반응세포는, 경부 및 장간막 림프 결절 세포 (LNC)를 수확하여 제조한다. 6웰 플레이트에서 세포 여과기 (BD Falcon)에 대한 주사기 누르개를 사용하여 세포를 갈아서 단일 세포 현탁액으로 반응 세포를 분해한다. 반응 세포를 인간 MLR 배지와 유사한 배양 배지에 현탁하되 단, 혈청은 10% FBS (HyClone, Logan, UT)이다. LNC를 실험을 위해 필요한 수로 동종이계 자극 세포와 함께 마이트로타이터 웰에 시딩한다 (4 x 10⁵/웰). 도말 이전 자극 세포를 5000라드로 조사한다. 처리당 3 개의 웰로 배양을 실시하였다. 동종항원에 대한 T 세포 증식을, 본원의 다른 곳에서 기재한 바와 같이 평가한다.

면역원성 실험

일방 MLR 어세이를 동종이계 BMSC에 대한 T 세포 증식 평가에 사용 가능하다. 간략히, T 세포를 (2 x 10⁵/웰), 5000라드로 감마 조사된 동종이계 BMSC, 자가유래 PBMC, 또는 동종이계 PBMC (30,000 세포/웰)와 함께 96웰 마이트로타이터 배양 플레이트에서 배양한다. BMSC는 본원에 기재된 방법으로 수득한다. 당업계 공지의 방법으로 상이한 4 공여자들로부터 수득한 PBMC에서 T 세포를 정제하였다. 비 (非) T 세포 제거를 위한 자기 비드 (Dynal, Inc)를 사용하여, 음성 선택에 의해 T 세포 풍부화를 달성 가능하다. 대식세포/단구세포/덴드라이트 세포 (항-CD14), B 세포 (항-CD19), NK 세포 (항-CD56), 및 MHC 클래스 II 항원 (항-DR)에 특이적인 마우스 모노클로날 항체 (mAb)를 사용하여 이들 세포를 레벨링하였다. 염소 항-마우스 IgG 항체로 코팅된 자기 입자를, 자기장에서 상기 세포를 끄집어내는데 사용한다. 결과의 세포군은 보통, T 세포를 검출하기 위한 플루오레신화 항-CD3 mAb를 사용한 플로우 사이토메트리 분석에 의해 90% 초과의 T 세포이다. 사용한 세포 배양액은, Iscove 변형된 둘베코 배지 (IMDM)로, 이는, 5% 인간 AB 혈청, 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트, 펜-스트렙/펀지온 및 2-머캅토에탄올이 보충된 것이다. 16시간 동안 ³H-티미딘 (1 μCi/웰)으로 배양을 펄 스화하면서, 6일간 5% CO_2,37℃의 가습 대기하에서 배양을 인큐베이션하고, 세포를 96웰 수확기를 사용하여 7일째 수확한다. 혼입된 방사능은, 섬광계수기로 측정하고, 결과는 분당 계수로 나타낸다 (cpm).

BMSC 는 동종이계 T 세포 상의 활성 분자 CD25 발현을 유도하지 않는다

1) T 세포 마이토젠 PHA, 2) 동종이계 PBMC, 또는 3) 동종이계 BMSC의 존재 하에 정제된 인간 T 세포를 배양하였다. 7일 후, 배양으로부터 T 세포를 수확하여 T 세포 하부세트인 CD4 및 CD8에 특이적 모노클로날 항체 (FTIC 레벨링된 mAb) 및 T 세포 활성화 마커인 CD25에 특이적 모노클로날 항체 (APC-레벨링된 mAb)로 2중 염색하였다. 적절히 레벨링된 동위원소 대조군 면역글로불린을 사용하여 배경 염색을 표준화하였다. 결과는, T 세포 하부세트 모두가 PHA 및 동종이계 PBMC에 의해서 활성화되나, 동종이계 BMSC에 의해서는 활성화되지 않음을 나타낸다 (도 3).

BMSC 는 T 세포 증식을 억제한다

BMSC가 동종활성 T 세포를 억제하는지의 여부를 측정하기 위해, T 세포 (2 x 10⁵ 세포/웰) 및 동종이계 조사된 PBMC (1 x 10⁵ 세포/웰)로 이루어진 MLR 배양액으로 BMSC를 적정하였다. 상이한 2 공여자들로부터의 BMSC를 배양 기간의 개시점에 MLR 배양에 첨가하였다. 결과는 T 세포증식이 BMSC 최고 투여량 (3 x 10⁴ 세 포/웰)에서 62% (공여자 8) 및 90% (공여자 20)로 억제됨을 나타낸다. 이들 결과를 바탕으로 7개의 반응 T 세포에 대해 약 1개의 BMSC의 비율이 상당한 억제를 발생하기에 충분한 것으로 보인다.

본원의 결과는, MLR 에서 NSC가 동종이계 T 세포 증식을 유도함을 나타낸다. 임의의 특정이론에 얽매이지 않고, 이들 세포는, 동종이계 세팅에서 이식될 때, 숙주에 의해 거부될 수 있는 것이다. NSC와 비교하여 유사한 세포 표면 마커 무리가 BMSC에 의해 발현되지만, BMSC는 T 세포를 활성화하지 않는 것으로 관측되었다. 본원의 결과를 바탕으로, BMSC는 면역억제 특성을 가지는 것으로 보인다.

억제 실험

BMSC를 일방 MLR 어세이에 첨가하여, 이들이 동종활성 T 세포 증식을 억제가능한지 측정하였다. 간략하게, BMSC를 조사 (5000라드) 하고, 정제된 T 세포 (반응 세포) 및 조사된 동종이계 PBMC (자극 세포)를 포함하는 일방 MLR 배양에 첨가하였다. T 세포의 정제 및 MLR 배양 조건은 본원 다른 곳에 기재된 바와 같다. 30,000 세포/웰의 투여량으로 T 세포 및 PBMC의 상이한 조합 내에서 MLR 배양에 BMSC를 첨가하였다. 결과는, BMSC가 첨가되지 않은 기본 MLR 반응의 억제 백분율로 표현 가능하다. 하기식에 따라 시험 세포 함유 반응 대 대조군 MLR을 비교하여 억제를 측정하였다;

억제 백분율 = [1-(시험 세포 함유 MLR 배양의 cpm/대조군 MLR 배양의 cpm)] x 100

실시예 3: 이식에서의 BMSC

하기의 실험은, 거부에 대한 BMSC 매개 줄기 면역보호를 연구하기 위해 고안된 것이다. 임의의 줄기세포를 사용 가능하나, 다음 실험을 위해서는, 수득 가능성 및, 면역원성을 나타낸다는 선행 결과 때문에, 인간 NSC를 모델 줄기세포로 사용한다.

시험관내에서 NSC에 대한 면역 반응을 조사하기 위해, NSC에 대한 T 세포반응을 동종이계 PBMC (양성 대조군) 및 BMSC와 비교하여, T 세포 반응의 어떤 종류가 각 세포타입에 의해 유도되는가를 알고자 하였다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 이들 실험 결과는 증식 및 CD25 마커 발현에 의해 T 세포가 활성화되는지의 여부를 검증하고, T 세포가 CD4 또는 CD8 양성인가를 검증 가능하게 한다. 사이토카인 프로필에 따라, 세포가 Th1 또는 Th2-타입 T 세포인가를 검증할 수 있다.

제 2군의 실험은, 시험관내에서 T 세포의 NSC에 대한 활성을 BMSC가 억제 가능한지의 여부와, 면역억제 과정 동안 BMSC가 사이토카인 생성에 영향을 미치는 여부를 검증하기 위해 고안된 것이다. 본 개시를 바탕으로, T 세포 및 동종이계 NSC 배양에 첨가된 BMSC는, 유전적으로 비제한적인 방식으로 T 세포 증식을 억제 가능한 것으로 보여진다.

다른 세트의 실험은, 생체 내에서 이식물 거부에 대해 NSC를 보호하는 BMSC 능력을 평가하기 위해 고안된 것이다. 여기의 예로서, 래트 섬유아세포 (대조군) 또는 래트 BMSC와 함께 인간 NSC를 수용자 래트의 간에 임플랜트하는 이종발생성 모델을 사용한다. 그러나 현재 개시를 기준으로, 당업자는 동종이계 모델을 사용 가능하다. 이종발생성 모델은 다음 기준을 포함한다:

1) 공여자 세포로서 인간 NSC:

2) 동종이계 T 세포 증식을 유도하는 면에서 인간 BMSC가 비면역원성인 것으로 밝혀진 (Mclntosh 등, 2000 Graft 3:324) 까닭으로 래트 BMSC;

3) 문맥 정맥을 통한 세포 투여 용이성, 면역 시스템에 대한 주입 세포의 접근 가능성, 및 주입 세포 회수능 때문에, 간을 임플랜트 지점으로 선정하였다.

임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 문맥 내 주입된 BMSC는 간에 안착 가능하다. 또한, NSC는 BMSC와 거의 같은 크기이므로, 문맥 전달 이후 NSC 또한 간에 트래핑 가능하다. 본 모델에서 인간 NSC를 유일한 인간세포로 사용하는 것은, 인간 Alu DNA 서열에 특이적인 PCR 기법을 사용한 이식 평가를 가능하게 한다. 여기에 기재된 모델은 또한, 이들 세포를 일방 MLR 어세이에서 사용하여 수용자 동물의 림프 결절에서 NSC 및 BMSC 가 T 세포 반응을 유도하는 여부를 측정하는데 사용 가능하다.

실시예 4: 동종이계 NSC 및 BMSC 에 대한 T 세포 반응 특정화

NSC에 대한 T 세포 반응을 세 명의 상이한 공여자로부터 특정화하고, 반응을, BMSC에 대해 수득한 반응과 비교한다. 미분획화된 갓 녹여낸 PBMC를 대조 군으로 사용한다. 이들 세포군 각각을 다음에 대해 평가한다: 1) 면역적 연관 세포 표면 마커, 2) 동종이계 T 세포 자극 능력, 및 3) 활성 마커 및 사이토카인의 발현에 대한 T 세포 반응. 이들 실험으로 발생된 결과는, 이들 세포군 각각의 면역원성을 결정하는 특징에 대한 관점을 제공한다.

플로우 사이토메트리에 의한 면역 관련 세포 표면 마커의 특정화

이들 실험을 위해 충분한 세포 개수를 수득하기 위해 필요한 최소 계대에서 NSC 및 BMSC를 평가한다. 이들 세포는 0.05% 트립신을 사용하여 T-185 플라스크 (5 x 10⁶ 세포/플라스크)의 계속적 배양물에서 수확한다. 갓 녹여낸 PBMC를 대조군으로 사용한다. 플로우 사이토메트리로, MHC 항원 (클래스 I 및 클래스 II) 및 공자극 분자 (CD40, CD54, CD80, CD86) 에 대해 세포를 특정화한다. 간략하게, 5% FBS 함유 PBS로 세포를 세척하고, 형광색소 태깅된 모노클로날 항체로 염색 이전에 마우스 면역글로불린으로 블라킹한다. 동위원소 매칭된 형광색소 레벨링된 면역글로불린으로 세포를 인큐베이션하여 배경 염색을 결정한다. Cell Quest 획득 소프트웨어를 사용한 Becton Dickinson FACSCaliber 플로우 사이토메터의 분석을 위해 약 50,000개의 세포가 사용된다. BMSC/NSC 및 조혈 세포는 그 크기 및 광산란 특성에서 크게 상이하므로, 사이토메터 상에서 각 세포타입에 따라 분리하여 세포를 수득하는 것이 필요하다. PBMC로 BMSC를 스파이킹하여 게이트 좌표를 측정하였다. 결과는 히스토그램 또는 점 찍음으로 표시한다.

MLR 어세이에 의해 동종이계 NSC 및 BMSC 에 대한 T 세포 증식 반응의 측정

동종이계 자극 세포에 대한 T 세포의 기능성 반응 평가를 위해 일방 MLR 어세이를 사용한다. MLR 어세이는, 정제된 T 세포를 반응세포로서 미분획화 PBMC와 비교하기 위한 것으로, 이에 따라 직접 대 간접 T 세포 활성화를 평가할 수 있다 (즉, 줄기세포가 직접적으로 T 세포를 활성화하여 항원 제시 세포 (APC)로 작용하는지 또는 동종항원을 취하는 전문적인 APC (대식세포, 덴드라이트 세포)를 통해 줄기세포가 T 세포를 활성화하는가의 여부).

(모두 동일한 공여자로부터) 미분획화 PBMC 또는 정제된 T 세포를 반응 세포로하고, 자극 세포로 NSC 또는 BMSC를 사용하여 혼합 림프구 배양을 세팅한다. 간단하게 T 세포 (2 x 10⁵/웰)를, 5000라드 감마 조사로 조사한 동종이계 BMSC, 자가유래 PBMC 또는 동종이계 PBMC (30,000 세포/웰)과 함께, 96 웰 마이트로타이터 배양 플레이트에서 배양한다. 본원에 공지된 방법에 의해 상이한 공여자로부터 BMSC를 수득한다. 당업계 공지의 방법으로 수득된 PBMC로부터 T 세포를 정제한다. 비 (非) T 세포 제거를 위한 자기 비드 (Dynal, Inc)를 사용하여, 음성 선택에 의해 T 세포 풍부화를 달성 가능하다. 대식세포/단구세포/덴드라이트 세포 (항-CD14), B 세포 (항-CD19), NK 세포 (항-CD56), 및 MHC 클래스 II 항원 (항-DR) 에 특이적인 마우스 모노클로날 항체 (mAb)를 사용하여 이들 세포를 레벨링한다. 염소 항-마우스 IgG 항체로 코팅된 자기 입자를, 자기장에서 세포를 끄집 어내는데 사용한다. 결과의 세포군은 보통, T 세포를 검출하기 위한 플루오레신화 항-CD3 mAb를 사용한 플로우 사이토메트리 분석에 의해 90% 초과의 T 세포이다. 세포를 Iscove 변형된 둘베코 배지 (IMDM)로 배양하며, 이는, 5% 인간 AB 혈청, 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트, 펜-스트렙/펀지온 및 2-머캅토에탄올이 보충된 것이다. 16시간 동안 ³H-티미딘 (1 μCi/웰)으로 배양을 펄스화하면서, 6일간 5% CO_2,37℃ 의 가습 대기하에서 배양을 인큐베이션하고, 세포를 96웰 수확기를 사용하여 7일째 수확한다. 혼입된 방사능은, 섬광계수기로 측정하고, 결과는 분당 계수로 나타낸다 (cpm).

시험 세포가 면역원성이기 위해서는 하기의 3가지 조건이 충족되어야한다:

1) 시험 세포는, 자가유래 반응보다 적어도 750cpm 초과의 T 세포 증식 반응을 유도해야함;

2) 자극 인덱스 (T + 시험 세포 cpm / T + 자가유래 세포 cpm)는 3.0 이상이어야 함; 그리고

3) T + 자가유래 PBMC 및 T + 시험 세포 간에 통계적 유의차가 있어야 함 (P<0.05, 스튜던트 T 시험).

비반응성의 원인으로 유전적 인자를 소거하기 위해 (일례로, MHC 유사성), 각 시험 세포는 적어도 2 (바람직하게는 3)의 상이한 T 세포 공여자와 함께 배양된다. 공여자 중 어느 것이라도 상기한 바와 같은 양성 반응을 나타내면, 시험군은 면역원성인 것으로 간주된다.

NSC는 T 세포 증식을 상당히 자극할 것으로 기대되나, 전문적인 APC 다수를 포함한 동종이계 PBMC에서 보이는 것만큼은 아닐 것이다. BMSC는 면역억제성이기 때문에, T 세포 증식을 자극하지 않아야만 한다. NSC가 APC로 직접 작용하거나 NSC 내에 APC 군이 존재한다면, 이들 세포는 정제된 T 반응 세포의 증식을 자극하여야만 한다. APC 함유 PBMC 반응군 내의 T 세포는, 간접적 항원 제시 덕분에 더 격렬히 증식 가능하다. 후자 반응의 일시적 키네틱은, 최적의 증식을 위해 보다 긴 시간 기간으로 이동 가능한데, 이는, PBMC 군에서 APC에 의해 동종항원이 취하여져서, 가공되고, T 세포를 자극하기 위해 제시되어야하기 때문이다.

플로우 사이토메트리에 의한, 동종이계 NSC 및 BMSC 에 대한 반응에서 T 세포 하부세트에 대한 CD -25의 상향 조절 ( up - regulation ) 측정

CD25 (IL-2 수용체)는, 활성화된 T 세포에 따라 상향 조절된다. T 세포 활성화의 마커로서의 증식 이외의 추가의 변수를 발견하고, 하부군 수준에서의 활성화를 추가로 평가하기 위해, NSC 및 BMSC로 배양후 CD4- 및 CD8- 양성 T 세포에 대하여 CD25를 분석 가능하다.

하기 실험을 위해 사용한 NSC 및 BMSC는, 본원 다른 곳에 기재된 T-185 플라스크에서 수확된다. 벌크 MLR 배양을 3개 시점에서 수확하기 위해 3중으로 6웰 플레이트에 세팅한다. 정제된 T 세포 (14 x 10⁶ 세포/웰)를 자가유래 PBMC (7 x 10⁶/웰), 동종이계 PBMC (7 x 10⁶/웰), NSC (2 x 10⁶ 세포/웰), 또는 BMSC (2 x 10⁶ 세포/웰)과 함께 배지 내에서 배양한다. 추가의 대조군으로, NSC 및 BMSC는 또한 배지 단독에서 배양한다 (2 x 10⁶ 세포/웰). 모든 자극 세포는 배양 이전에 5000라드로 조사한다. 1, 4, 및 7일째 배양을 종결하고, 사이토카인 분석을 위해 상층액을 수집한다. 비부착성 T 세포는 배양물을 약한 세척으로 수집하고, APC, FITC, 및 PE 형광색소 접합 항체를 이용하여 CD3, CD4 또는 CD8, 및 CD25 발현에 대해 3색 플로우 사이토메트리로 세포를 분석한다. CD25의 발현은 T 세포 및 자가유래 PBMC의 기저선 배양과 비교한다.

임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, CD25는, PBMC에 반응하여 CD4- 및 CD8-양성 T 세포에서 상향 조절되어야만 하는데, 이는, 동종이계 MHC 클래스 I 및 II 두 분자 모두가 존재하는 때문이다. NSC가 MHC 클래스 I는 발현하나 MHC 클래스 II는 발현하지 않으므로, CD25는 활성화된 CD8+ T 세포 상에는 존재하나, CD4+ T 세포 상에는 관측가능하게 존재할 것으로 기대되지 않는다. 또한, BMSC와 배양된 T 세포 상에서 CD25의 발현 관측은 기대되지 않는다.

동종이계 NSC , BMSC 및 PBMC 에 대한 T 세포 사이토카인 반응의 특정화

동종이계 줄기세포에 대한 T 세포 반응을 추가로 특정화하고자, NSC 및 BMSC 에 대한 사이토카인 반응을 평가 가능하다 (PBMC를 대조군으로 사용). Th1 타입반응은 IFN-γ 및 IL-2 를 분비하고, Th2 반응은 IL-4 및 IL-10을 선호하여야만 한다 (Mossmann 등, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7:145). 반응이 클래식 Th1 거 부 반응으로 분극화되면, Th2 반응을 유도함에 의해 상기 반응을 하향 조절하기 위해 사이토카인 유도 전략을 사용할 수 있다 (즉, IL-4 사이토카인의 사용 또는 IL-10을 사용하여 반응을 하향 조절함).

6웰 플레이트 중 벌크 배양 세포로부터 본원 다른 곳에 기재된 바와 같이 상층액을 수확한다. 플로우 사이토메트리를 위해 1, 4, 및 7일째 세포를 수확시, 웰당 적어도 4ml의 상층액이 수확된다. 생물 샘플 내 다중 사이토카인을 검출하는 RayBio

Cytokine Antibody Array (RayBiotech Inc., Norcross, GA) 에 의해 사이토카인을 평가한다. G-CSF, GM-CSF, 인터루킨-lα -3, -5, -6, -7, -8, -12, -13, -15, MCP-1, 2, 및 3, MIG, RANTES, TNF-α 및 β 및, TGF-β1 에 추가하여 IL-2, INFγ, IL-4, 및 IL-10를 검출하는데 맞춤화한 어레이를 사용 가능하다. ELISA에 의해 관심상의 사이토카인의 추가의 정량측정을 실행 가능하다.

임의의 특정 이론에 얽매이지 않으면서, PBMC 및 NSC 자극제들은 높은 수준의 IL-2 및 INF-γ와 클래식 Th1 반응을 유도할 수 있어야 한다.

실시예 5: 시험관내에서 동종이계 NSC 에 대한 T 세포 반응에 대한 BMSC 면역억제 효과 측정

하기의 시험관내 연구는, 면역억제 BMSC가 NSC에 대항하여 T 세포 증식을 방지하는지의 여부와 반응 T 세포에 대한 BMSC의 유전적 일치가 억제에서 변화를 초래하는지의 여부를 조사하기 위한 것이다. 나아가 본원의 실험은, 사이토카인 어레이를 사용하여 측정한 억제 과정 동안 생성된 사이토카인을 특정화함을 포함한 다. 관심상의 사이토카인은 비제한적이지만 다음과 같은 사이토카인을 포함한다: 1) Th1 에서 Th2로의 T 세포 반응의 전이를 명시하며; 2) 줄기 세포상의 MHC 발현을 증가시키고; 3) 억제 효과를 갖는 사이토카인.

MLR 반응에서 T 세포 증식에 대한 BMSC 의 억제 효과 검증

본 내용은, 시험관 내에서 NSC에 대항하여 BMSC가 T 세포 동종반응성을 억제 가능함을 보여준다. 최소 3의 상이한 공여자들로부터의 BMSC를, T 세포 증식에 대한 BMSC의 효과 평가를 위해 사용한다. BMSC에 대항하여 매개되는 동종반응성이 억제에 유익한가를 평가하기 위해, T 세포에 대해 매칭된 BMSC (자가유래)를 비교하여 HLA 매칭의 효과를, 매칭시키지 않은 BMSC를 사용하여 비교하였다.

1차 MLR의 억제 조사를 위해, T 세포 (2 x 10⁵/웰)를 동종이계 PBMC (5 x 10⁴/웰) 또는 NSC (5 x 10⁴/웰)와 함께 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 마이트로타이터 플레이트에서 배양한다. BMSC (T 세포에 대해 자가유래)를 5 x 10⁴/웰로 시작하여 배양에 첨가하고, 투여량 의존 곡선을 생성하기 위해 3,125 세포/웰까지 2배씩 감소하여 적정한다. 대조군 배양에는 BMSC가 없다. BMSC가 존재하는 반응에 비교하여, BMSC가 없는 MLR 반응을 비교하여 억제 백분율을 측정한다. 통계적으로 유의한 억제는, 스튜던트 T 시험을 사용하여 측정한다.

본 내용에 따르면, BMSC는 1차 반응을 억제한다. 상이한 2 공여자들로부터의 BMSC는, 1차 MLR 반응을 억제하는 것으로 관측되었다. 지속적인 2차 MLR 반응의 억제는 또한 본원에 기재된 방법으로 측정가능하다.

억제된 MLR 배양에서의 사이토카인 프로필 특정화

억제 과정 동안 생성된 사이토카인의 특정화는, 기본 MLR 단독과 비교한 사이토카인 프로필을 비교하여 수행가능하다. 사이토카인 프로필의 결과는, BMSC에 의한 억제 기작 검증에 사용가능하다.

T 세포 (14 x 10⁶/웰) 및 동종이계 NSC 또는 PBMC (2 x 10⁶/웰) 함유 6-웰 플레이트 중의 벌크 MLR 배양을 BMSC (2 x 10⁶/웰) 존재 또는 부재하에 세팅한다. 배양 이전에 5000라드로 자극 세포를 조사한다. 1, 4, 및 7일째 배양을 종결한다. 상층액을 수합하여 RayBio

Cytokine Antibody Array (RayBiotech Inc., Norcross, GA)를 사용하여 25개의 사이토카인에 대하여 시험한다. 사이토카인 반응에 대한 BMSC 억제 효과 평가를 위해 T + NSC 및 T + NSC + BMSC 간, 그리고, T + PBMC 및 T + PBMC + BMSC간의 비교를 실시한다.

임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, BMSC는, MLR 반응에서 보통 생성되는 사이토카인의 이동을 초래할 수 있는 것으로 보인다.

실시예 6: BMSC 가 래트에 이식된 NSC의 생존을 연장할수 있는지 여부의 측정

본원에 기재된 실험은, 포유류에 이식된 NSC의 생존에 대한 BMSC의 기여를 검증하고자 한다. 시험관 내에서 BMSC가 동종반응성 T 세포 반응에 대해 억제 성이라면, 생체 내에서도 이러한 반응을 억제할 것으로 생각된다. 따라서, 조직 내에 충분한 수로 BMSC가 임플랜트 된다면, 거부 반응 유도 없이 동종이계 세포들이 임플랜트되는, '면역 특권' 영역을 이들이 만들 수 있을 것이다. 면역보호 개념 원리의 증거로서, 하기의 실험은, 대조군 래트 섬유아세포 및 래트 BMSC와 함께, 수용자 래트의 간에 인간 NSC를 임플랜트하고, 인간 특이적인 Alu PCR를 이용하여 1달의 기간 동안 그들의 생존을 정량화함을 포함한다. 하기의 이종발생성 모델은, 래트 T 세포 및 인간 자극 세포 사의의 이종발생성 반응을 래트 BMSC가 억제한다는 높은 가능성과, 줄기 세포를 얻을 수 있는 가능성 문제에 따라 선택된 것이다.

제 3의 세포를 사용한 원하는 임상 경로를 복제하기 위하여, 본 실험에서는 동종이계 래트 BMSC를 사용한다. 문맥 정맥을 통한 전달의 용이성, 면역 시스템에 대한 접근 및 주입한 세포의 회수능 때문에, 이식 부위로는 간이 선택되었다. 이러한 경로로 투입된 NSC는 간에 트랩되어 적어도 1주일 동안 검출가능한 것으로 보여졌다. 처리한 래트로부터 림프 결절을 회수하고, 일방 MLR에 의해, 주입한 각 세포 타입 (래트 섬유아세포, 래트 BMSC 및 인간 NSC)에 대한 감작화에 대해 분석한다.

래트 BMSC 에 의한 이종발생성 래트 대 인간 MLR 의 억제

래트 BMSC 매개된 억제를 평가하기 위해, 래트 및 인간 세포 간의 이종발생성 MLR을 세팅한다. 수용자에 대해 동종이계인 래트 BMSC를 본 실험 세트에 사 용하되, MLR 반응 억제를 위해서는 임의의 공급원의 BMSC를 사용 가능하다. 일례로, 수용자에 대해 자가유래인 BMSC를 또한 사용 가능하다.

피셔 래트 림프 결절 (LN)을 수확하고, 단일세포 현탁액으로 분해하여, MLR에서의 반응 세포로서 마이트로타이터 웰에 도말한다 (4 x 10⁵/웰). 인간 PBMC 및 NSC를 조사하여 자극세포로서 웰 당 1 x 10⁵으로 도말한다. ACI주 래트의 피부 섬유아세포 및 BMSC를 5 x 10⁴세포/웰의 고투여량으로 MLR 내로 적정하고, 3,125 세포/웰까지 2배의 감소 투여량으로 적정한다. BMSC 및 피부 섬유아세포는 임의의 래트주에서 수득할 수 있음을 알 수 있다. 래트 MLR 배양조건은 본원 다른 곳에 기재된 바와 같다. 섬유아세포 또는 BMSC를 포함하는 MLR에 대해 대조군 MLR (BMSC 없음)을 비교하여 억제를 평가한다. 통계적 평가는, 스튜던트 T 시험을 사용하여 실시한다.

Wilstar 래트 LNC가 인간 PBMC에 대해 격렬히 증식 (>100 x 10³ cpm) 하는 것으로 관측된 사실에 기초하여, 이종발생성 MLR에서 래트 BMSC를 사용하는 것은, MLR에서 BMSC가 소지한 억제 수준 평가를 위한 귀중한 모델을 나타내는 것임을 알 수 있다. 래트 BMSC는, 활성화 동종반응성 T 세포에서 비반응성을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Small 등, 1999 Blood 94:333). 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 래트 BMSC는 래트/인간 MLR을 억제하는 것으로 여겨진다. ACI주 BMSC가 이종발생성 MLR을 억제하지 않는 경우, 인간 BMSC 및 다른 래트 주에서 유 도된 BMSC를 이종발생성 MLR에 사용 가능하다. 래트 섬유아세포가 MLR을 억제할 것으로는 기대되지 않으므로, 섬유아세포를 대조군으로 사용한다.

이식된 NSC 의 생존 측정

하기의 실험은, 대조군 섬유아세포 또는 BMSC 투여 이후 생체 내에서 NSC의 생존을 평가하고자 고안된 것이다. 본 내용에서, 시험관 내에서 BMSC 대 자극 PBMC의 1:3 비율이 충분한 것으로 관측됨에 따라, 생체 내에서는 BMSC 대 NSC의 비율 1:1이 억제에 충분하여야만 한다. 또한, NSC에 비해서 PBMC가 더 강한 T 세포 자극제이므로, 이는 BMSC 대 NSC 비율 1:1을 지지하는 것이다. 또한, 생체 내 억제에서는 더 낮은 BMSC 대 NSC 비율을 사용 가능하다.

ACI주 래트 피부 섬유아세포 (5 x 10⁶세포)와 혼합된 인간 NSC (5 x 10⁶세포)를 25마리 피셔 래트 각각에게 200마이크로리터의 부피로 문맥내 주사한다. 피부 섬유아세포는 ACI 래트로부터 수득한 피부 샘플에서 제조하고, 본원 다른 곳에서 BMSC에 대해 기재한 바와 같이 확장한다. ACI주 래트 BMSC를 동일한 개수 (5 x 10⁶세포/래트)로 혼합한 NSC (5 x 10⁶세포/래트)를 25마리의 래트 다른 그룹에 문맥내 주사한다. 각 그룹에서 5마리 래트를 주사 후 1, 7, 14, 21 및 28일째에 희생시킨다. 간을 제거하고, 순간 냉동하고 인간 NSC의 이식을 평가하기 위한 Alu PCR 어세이를 실시할 때까지 -8O℃ 에 보관한다.

인간 Alu PCR 어세이 :

래트 간 내의 인간 NSC의 개수는 문헌에 기재된 바와 같이 인트라-Alu 성분 기재 PCR 어세이에 의해 정량화 가능하다 (Walker 등, 2003, Analytical Biochem. 315:122-128). 인간 DNA에 존재하는 천연 발생 반복 Alu 서열은 단일 카피 서열/유전자에 비해 우수한 검출 감도를 가능하게 한다. 따라서, 인간 특이적 Alu 반복 서열에 대한 RealTime PCR를 통해 인간 기원 게놈 DNA를 정량화한다. 본 어세이를 위해 사용한 프라이머는 Yb8 Alu 하부패밀리 내의 ~200bp 인트라-Alu 핵심 반복 서열을 증폭한다. 혼합 종 샘플 DNA 2ng 중 10pg 이상 (~ 1 세포와 동등)의 인간 DNA 특이적 검출을 위해, 이들 프라이머의 사용이 문헌에 의해 보고된 바 있다 (Walker 등, 2003, Analytical Biochem. 315:122-128). Puregene DNA 분리 키트 (Gentra Systems)를 사용하여 순간 냉동된 래트 간으로부터 게놈 DNA를 단리한다. 알려진 개수의 인간 세포로 스파이킹된 (10 배 증가로) 래트 세포의 군에서 생성한 Alu 특이적 DNA 표준 곡선과 비교하여 인간 DNA를 정량화한다.

본 내용에서, BMSC는 생체 내에서 국소적 억제를 매개하고, 간에서 이종발생성 세포의 생존을 연장하는 것으로 보여진다. 따라서, 비억제적인 섬유아세포와 NSC를 투여받은 래트보다, BMSC를 투여한 래트에서 더 많은 수의 NSC가 회수된다. 이들 두 그룹간의 최대 차이점은, 이종 발생성 NSC에 대한 면역반응이 활성화된 1-2주 이후에 발생할 것으로 기대된다. 인간 특이적 Alu 반복 서열을 측정함에 따라 이식에서 살아남은 NSC을 측정하기 위해 PCR 어세이를 사용 가능하 다.

수용자 래트 내에서 주입된 세포에 대한 T 세포 프라이밍의 측정

하기의 실험은, 수용자 래트의 말초 림프 결절 내에서 NSC, 섬유아세포, 또는 BMSC가 동종/이종 반응성 T 세포를 프라이밍 (priming) 하는지의 여부를 측정하기 위해 고안된 것이다. 일방 MLR 어세이를 사용하여 그러한 프라이밍을 평가 가능하다.

주사 1개월 이후, 최종 시점에서 희생시킨 2 그룹으로부터의 각 5마리 래트 (NSC + 섬유아세포 대 NSC + BMSC)로부터 경부 및 장간막 림프 결절 (NL)을 제거한다. 래트 LN을 분리하여 단일세포 현탁액으로 하여, 자극 세포로서 조사된 공여자 NSC, 섬유아세포 및 BMSC (5 x 10⁴ 세포/웰)와 함께 MLR 어세이에서 반응 세포로 사용한다. 이들 실험에서 사용한 대조군은, 자극자로서 조사된 동계 (syngeneic) 피셔주 비장 세포 (배경), 매질 단독 내에서 배양된 LNC, 및 매질 단독 내에서 배양된, 조사된 자극 세포이다. 각 래트는 분리하여 평가한다. 피크 반응을 측정하기 위해 MLR 어세이를 3일 및 7일째에 수확한다. 각 자극자 군에 대한 평균 반응을, 동계 비장 세포에 대한 배경 반응과 비교한다. 스튜던트 T 시험을 사용하여 통계적 유의차를 측정한다.

임의의 특정 구현에 얽매이지 않고, T 세포가 동종이계 또는 이종발생성 세포에 대해 프라이밍되면, 이들은 7일째가 아닌 3일째에 피크를 가지는 MLR에서 이 들 세포에 대해 촉진된 증식 반응을 나타내어야만 할 것이다 (7일째의 시점은, 1차 MLR에 대해 관측된 피크 활성임). 이종발생성 NSC가 수용자 래트를 프라이밍하면, 그들의 T 세포는 자극 세포로 NSC에 대해 MLR 어세이에서 2차 반응을 나타내어야 할 것이다. 반대로, BMSC가 NSC에 대한 면역 반응을 방해하면, 수용자 T 세포는 1차 MLR 반응을 제공하여야만 한다. NSC에 대하여 BMSC가 수용자 T 세포를 용인한다면, 이는 MLR에서 감소된 반응을 나타내어야만 한다.

본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허출원 및 문헌의 내용은 여기에 그 전체가 참조로 편입된다.

본 발명이 특정 구현을 참조로 기술되었으나, 본 발명의 다른 구현 및 변형이, 본 발명의 참 정신 및 범위를 벗어나지 않고도 당업자에 의해 고안 가능함이 명백하다. 첨부된 청구항들은, 그러한 구현 및 균등 변형 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

이식편이 신경 줄기세포 (NSC)이고, 효과자 세포(effector cells)에 대한 동종항원에 대항한 상기 효과자 세포의 수용자 내 면역 반응을 감소시키는 이식편 수용자의 치료 방법에서, 이러한 방법이

효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한 상기 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기에 유효한 양의 골수 스트로마 세포를 이식편 수용자에게 투여하는 것을 포함하며, 이로써 이식편 수용자 내의 상기 효과자 세포는 상기 동종항원에 대항하여 감소된 면역 반응을 가지는 치료 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효과자 세포가 T 세포인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 T 세포는 공여자로부터, 상기 동종항원은 수용자로부터의 것인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 T 세포는 수용자로부터, 상기 동종항원은 공여자로부터의 것인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 T 세포가 이식편 내에 존재하는 방법.
제 1 항에 있어서, 이식편 수용자에게 골수 스트로마 세포를 투여하기 이전에, 상기 골수 스트로마 세포는 배양중 확대(또는 배양에서 증폭)된 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효과자 세포는 골수 스트로마 세포 투여 이전에 활성화된 T 세포이고, 나아가 상기 면역반응은 공여자로부터의 상기 T 세포의 재활성화인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 세포가, 수용자에 의한 이식편 거부를 치료하기 위해 이식편 수용자에게 투여되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 세포가, 인간 골수 스트로마 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 세포가, 래트 골수 스트로마 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 NSC가 인간 NSC인 방법.
제 1 항에 있어서, 면역억제 약제를 상기 수용자에게 투여함을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 세포가, 상기 이식편 이전에 수용자에게 투여되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 줄기 세포가, 상기 이식편과 동시에 수용자에게 투여되는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 세포가, 이식편의 일부로 투여되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 세포가, 이식편의 이식에 이어서 수용자에게 투여되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 세포가, 수용자에게 정맥 내로 투여되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효과자 세포가 상기 공여자 이식편 수용자의 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 골수 스트로마 세포가 유전적으로 변형된 것인 방 법.
이식편이 신경 줄기 세포 (NSC)이고, 효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한 효과자 세포의 수용자 내 면역 반응을 감소시키기 위한 이식편 수용자의 치료 방법에서, 이러한 방법이

효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한 상기 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기 위해 유효한 양의 골수 스트로마 세포와 함께 NSC를 이식편 수용자에게 이식하는 것을 포함하며, 이로써 이식편 수용자 내의 상기 효과자 세포는 상기 동종항원에 대항하여 감소된 면역 반응을 가지는 치료 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 효과자 세포가 T 세포인 방법.