KR20070088214A - 복합용출 패턴을 가진 생분해성 고분자 복합재 및 그 제조방법 - Google Patents
복합용출 패턴을 가진 생분해성 고분자 복합재 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제 및 그 제조방법에 관한 것이다. 특히, 생분해성 고분자 및 제1성장인자로 이루어진 나노입자가 수용성 고분자 및 제2성장인자로 이루어진 섬유상 지지체 상에 코팅형성된 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제 및 그 제조방법에 대한 것이다.
이에 따라, 본 발명은 두 가지 이상의 성장인자 혹은 약물을 세포주기에 맞추어 독립적으로 속방출 내지 서방출시킬 수 있고 지속적으로 약효를 낼 수 있어 생체친화력 및 조직 재생능을 크게 높일 수 있는 유용한 효과를 제공할 수 있다.
생분해성 고분자, 수용성 고분자, 성장인자, 다중 방출, 전기방사, 습식방사
Description
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리락트산-글리콜산 공중합체 및 혈소판 유래 성장인자로 코팅되기 전 고분자 복합 제제의 시차주사 현미경 사진;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리락트산-글리콜산 공중합체 및 혈소판 유래 성장인자로 코팅한 후 고분자 복합 제제의 시차주사 현미경 사진; 및
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 고분자 복합 제제로부터 인슐린 유사 성장인자와 혈소판 유래 성장인자가 용출되는 양상을 누적적으로 나타낸 그래프.
본 발명은 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제 및 그 제조방법에 관한 것이다. 특히, 두 가지 이상의 성장인자 혹은 약물을 세포주기에 맞추어 방출시킴으로써 지속적으로 약효를 낼 수 있고, 이에 따라 생체친화 력 및 조직 재생능을 크게 높일 수 있는 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제 및 그 제조방법에 대한 것이다.
빠르게 발전하고 있는 조직 공학 분야 연구의 목적은 생체재료, 세포, 생리활성을 지닌 물질을 이용하여 손상되었거나 소실된 장기 혹은 조직의 재생을 유도함에 있다. 신체 내의 여러 조직은 소실 혹은 손상되었을 때 자가적으로 재생할 수 있는 기능을 가지고 있다. 그러나, 재생 능력의 정도는 세포 종류와 상처의 정도에 따라 다양하다.
활발하게 재생되는 조직에는 피부, 골수, 장점막 등이 있다. 이들 조직의 재생은 상처의 정도, 원인, 환자의 능력 등에 따라 다소 차이가 보이지만 대체로 신속하게 치유가 되는 조직에 속한다. 반면에, 심장근, 신경 등의 조직은 손상을 입었을 때, 그 구조, 기능 등은 일반적으로 재생이 진행되지 않는다고 알려져 있다. 그리고, 뼈, 연골 등의 조직은 재생 속도가 매우 느리다. 이러한 경우에 소실 부위에의 세포의 이식 또는 골형성 유도 약물, 성장인자의 주입 등이 궁극적으로 조직 재생 과정에 중요한 역할을 한다.
성장인자와 골형성 유도 약물은 조직재생 시 세포의 이동, 분화, 증식 등의 기능을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 성장인자와 약물을 체내에 주입 하는 방법으로는 주사를 사용하는 방법이 기술적으로 가장 간편하다. 그러나, 성장인자의 반감기가 2분~50분 내외로 매우 짧다는 사실을 고려하고, 원치 않는 전신 작용과 과량 투여로 인한 독성뿐만 아니라, 결손 부위에의 효과 미달 등의 문제를 해결하기 위해서는 고분자 제제에 성장인자를 포함시키는 방법을 이용하여 생체 내로 전달함으로써 국소적, 지속적인 적용을 이루는 것이 필요하다.
성장인자와 약물을 포함한 고분자 제제를 제조하는 방법으로는 1) 혼합하여 고분자 제제를 만드는 방법, 2) 고분자 제제를 만든 후에 적용시키는 방법, 3) 고분자 제제의 표면에 코팅하는 방법, 4) 고분자 제제 내부에 위치시키는 방법 등이 있다. 이러한 방법으로 만들어진 성장인자 및 약물이 함유된 고분자 제제에서의 약물 용출 패턴은 성장인자와 약물 자체의 확산력, 고분자 제제의 붕해 정도, 고분자 제제와 성장인자, 약물 간의 상호작용 등에 따라 결정된다.
각 약물은 세포 성장 및 분화 시, 세포 주기에 있어서 작용하는 시점이 다양하다. 세포 주기의 여러 단계는 약물, 성장인자, 세포외 기질 성분 등 여러 요인에 의해서 조절되기 때문에, 조직 재생에 있어서 다양한 패턴으로 세포에 약물을 노출시키는 것은 매우 중요한 작업이다.
현재 약물을 복합적으로 포함시킨 고분자 제제에 대한 연구를 살펴보면, 세포 주기의 단계별 작용에 대한 것보다는 한 단계에 있어서 두 종류 이상의 약물 또는 성장인자를 투여했을 시의 상승효과를 확인하는 연구가 주를 이루고 있다. 이와 관련하여, 데이비드 무니(D.J. Mooney)등은 알지네이트 하이드로젤에 전환 성장인자-베타 (Transforming Growth Factor-β; TGF-β), 골형성단백질-2(Bone Morphogenetic Protein-2; BMP-2)을 첨가하는 실험과 폴리락트산 글리콜산 공중합체(Poly-lactic-co-glycolic acid; PLGA) 마이크로스피어에 골형성단백질-4(Bone Morphogenetic Protein-4; BMP-4)과 혈관내피성장인자(Vascular Endotherial Growth Factor; VEGF)를 첨가하는 실험을 통해 골수 줄기세포가 골세포로 분화하는 과정을 관찰하였다. 이를 통해 두 성장인자 간의 공동작용을 확인하였다. 이 실험을 통해 고분자 제제를 통한 성장인자의 조절방출 및 두 성장인자 간의 상호작용을 확인할 수 있었다. 그러나, 두 성장인자의 방출시기를 조절하는 방법에는 아직 무리가 있다.
또한, 빌데만(B. Wildemann) 등은 티타늄 임플란트 표면에 폴리(D,L-락타이드)(poly(D,L-lactide))를 이용하여 전환 성장인자-베타 (Transforming Growth Factor-β; TGF-β), 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like Growth Factor; IGF)를 코팅하여 약물의 지속적 방출을 관찰한 바 있다. 이 실험에서 역시 두 성장인자의 상승작용은 확인할 수 있었으나, 약물의 용출 시간이 짧아 장기간의 효과를 보기는 어려웠다.
따라서, 본 발명은 두 가지 이상의 성장인자 혹은 약물의 용출시간을 지속시켜서 세포주기에 맞추어 독립적으로 속방출 내지 서방출될 수 있고 지속적으로 약효를 낼 수 있어 생체친화력 및 조직 재생능을 크게 높일 수 있는 약물의 이중적 용출 패턴을 가진 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제 및 그 제조방법을 제공하고자 함에 그 목적이 있다.
상기의 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 생분해성 고분자 및 제1성장인자로 이루어진 나노입자가 수용성 고분자 및 제2성장인자로 이루어진 섬유상 지지체 상에 코팅형성된 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 수성 용매에 용해시킨 수용성 고분자 및 제2성장인자 수용액을 혼합하여 분사액을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자 혼합액을 제조하는 단계; (c) 수성 용매에 용해시킨 생분해성 고분자 및 제1성장인자 수용액을 혼합하여 코팅용 조성물을 제조하는 단계; (d) 상기 분사액을 상기 단계 (b)의 생분해성 고분자 혼합액 내로 분사하여 마이크로 크기의 섬유를 형성하는 단계; 및 (e) 상기 얻어진 마이크로 크기의 섬유 상에 상기 제조된 코팅용 조성물을 분사하여 나노입자로 코팅하는 단계를 포함하는 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제는 생분해성 고분자 및 제1성장인자로 이루어진 나노입자가 수용성 고분자 및 제2성장인자로 이루어진 섬유상 지지체 상에 코팅형성된 섬유형 매트릭스 구조를 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 생분해성(biodegradable) 고분자는 약물 또는 성장인자의 담체 역할을 하는 동시에 방출 조절 기능을 가지며 생분해성이고 생체적합성을 가진다. 본 발명에서는 일반적으로 생체재료로 사용되는 생분해성 합성 고분 자 또는 천연 고분자를 사용할 수 있다. 상기 생분해성 고분자 또는 천연 고분자의 비제한적인 예로는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리락트산-글리콜산 공중합체 등과 같은 생분해성 합성 고분자; 또는 키토산, 콜라겐, 젤라틴 등과 같은 천연 고분자를 들 수 있으며, 이들 군 중에서 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 또는 수용성 화학기가 붙은 수용성 키토산을 사용할 수 있다. 특히, 폴리글리콜산은 친수성이 커서 분해가 빠르므로 체내 강도 유지 기간은 1 개월이고, 체내 물질 잔류 기간은 3 개월 미만이다. 이 때문에 상기 폴리글리콜산은 적절한 속도로 약물이 용출될 수 있는 조건을 지니고 있는 생분해성 고분자이다.
상기 생분해성 고분자의 함량은 본 발명에 따른 고분자 복합 제제 전체에 대하여 0.1 내지 5 중량부로 포함되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.15 내지 0.25 중량부로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.1 중량부 미만일 경우에는 전기분사가 어려우며, 5 중량부를 초과할 경우에는 전기방사(electrospinning)가 일어나서 섬유상을 형성하므로 입자형의 코팅이 어려울 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용성 고분자로는 상기 생분해성 고분자의 가수분해에는 직접적인 영향을 미치지는 않으나, 수용성 고분자의 용해도에 따라 약물 방출속도를 조절할 수 있는 기능을 가진다. 동시에, 30 내지 37℃의 온도에서 그 유연성이 증대되어 투여에 이로움을 주고 그 성형을 용이하게 한다. 본 발명에서는 키토산계 고분자를 사용할 수 있다. 바람직하게는 요오드염 키토산, 카복시메틸염 키토산, 젖산염 키토산 등을 사용할 수 있으나, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 이들 수용성 고분자, 특히 본 발명에 따른 고분자 복합 제제의 내부에 삽입되는 요오드염 키토산은 고분자 복합 제제의 친수성을 높여주고, 예컨데 생분해성 고분자인 폴리락트산(poly-D,L-lactic acid; PLLA)과 폴리카프로락톤(polycaprolacton; PCL)으로 코팅형성된 고분자 복합 제제가 분해되는 패턴에 따라서 생체로 서서히 확산되므로 약물의 용출기간을 장기간으로 설정해 줄 수 있다.
상기 수용성 고분자의 함량은 약물의 방출속도 및 제제의 강도, 유연성 등의 물리화학적인 성질에 중요한 영향을 미친다. 수용성 고분자의 함량이 너무 많으면 수분을 머금는 양이 많아져 분해도를 촉진시킬 수 있고, 수용성 고분자의 함량이 너무 적으면 수분을 머금는 양이 적어져 분해 기간이 길어지나 강도가 높아 쉽게 부서지며 제제의 유연성이 떨어져 사용에 불편할 수 있다. 이에 따라 본 발명에 있어서, 수용성 고분자의 함량은 본 발명에 따른 고분자 복합 제제 전체 중량에 대하여 0.5 내지 1 중량부이며, 바람직하게는 0.7 내지 0.8 중량부이다.
본 발명에 있어서, 상기 제1성장인자 또는 제2성장인자는 골 생성과 관련된 모든 성장인자를 포함한다. 이들 성장인자의 비제한적인 예로는 혈소판 유래 성장인자(Platelet-derived Growth Factor; PDGF), 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like Growth Factor; IGF), 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor; EGF), 전환 성장인자-베타(Transforming Growth Factor-β; TGF-β), 혈관 내피세포 성장인자(Vascular Endotherial Growth Factor; VEGF), 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast Growth Factor; bFGF), 골형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein; BMP) 등을 들 수 있으며, 이들 중에서 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 바람 직하게는 혈소판 유래 성장인자와 인슐린 유사 성장인자를 각각 제1성장인자와 제2성장인자로 사용할 수 있다.
전기분사에 사용되는 혼합액의 특성을 고려한 상기 성장인자의 함량은 본 발명에 따른 고분자 복합 제제 전체 중량에 대하여 0.00005 내지 0.0001 중량부, 바람직하게는 0.00006 내지 0.00008 중량부로 포함될 수 있다. 그 함량이 0.00005 중량부 미만일 경우에는 고분자 복합 제제에 세포를 심어줄 때 본 발명에서 의욕하는 효과를 유의적으로 달성하기 어려우며, 0.0001 중량부를 초과할 경우에는 고분자 혼합 용액 내에서 성장인자 또는 고분자의 석출이 일어날 수 있다.
상기 성장인자들은 이식 골 치유과정 시 신생혈관 생성, 세포 화학주성 및 분열촉진(stimulation of chemotaxis and mitosis), 간세포 증식(proliferation of stem cell), 세포외 기질(Extra Cellular Matrix; ECM)의 합성을 증가시키고, 골편 간 결합력을 제공하며, 피브린(fibrin) 망을 통한 골 전도율을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 이로써, 초기 골 재생을 촉진하는 역할을 할 수 있으며, 생체친화성도 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 복합 제제는 상기 생분해성고분자, 수용성 고분자 및 성장인자 이외에 칼슘, 에스트로겐, 칼시토닌, 비스포스포네이트, 비타민 D 등과 같은 골 흡수 억제제를 1종 이상, 또는 불화나트륨, 부갑상선호르몬 및 성장호르몬 등과 같은 골 형성 자극제를 1종 이상 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코팅형성된 나노입자는 그 모양이 섬유 상이 아닌 조립 상의 조립 입자(granulated particles)인 것이 바람직하며, 그 평균 입경은 50 nm 내지 5 ㎛, 바람직하게는 50 nm 내지 1 ㎛이다. 상기한 범위에서 약물 또는 성장인자의 용출속도가 유의적으로 조절되기 때문이다.
이상과 같은 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제는 (a) 수성 용매에 용해시킨 수용성 고분자 및 제2성장인자 수용액을 혼합하여 분사액을 제조하는 단계와; (b) 생분해성 고분자 혼합액을 제조하는 단계와; (c) 수성 용매에 용해시킨 생분해성 고분자 및 제1성장인자 수용액을 혼합하여 코팅용 조성물을 제조하는 단계와; (d) 상기 분사액을 상기 단계 (b)의 생분해성 고분자 혼합액 내로 분사하여 마이크로 크기의 섬유를 형성하는 단계와; (e) 상기 얻어진 마이크로 크기의 섬유 상에 상기 제조된 코팅용 조성물을 분사하여 나노입자로 코팅하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.
여기서, 상기 수성용매는 물에 잘 녹는 용매를 의미하며, 본 발명에서는 바람직하게 물, 아세톤, C1 내지 C4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합액을 사용할 수 있으나, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 그 함량은 전체 조성물에서 상기 생분해성 고분자와 수용성 고분자 및 제1성장인자와 제2성자인자를 제외한 나머지 부분인 것으로 95 내지 99.9 중량부인 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 (c)의 생분해성 고분자 및 제1성장인자를 포함하는 코팅용 조성물은 상기 생분해성 고분자 및 제1성장인자가 7,500:1 내지 12,500:1의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다. 상기한 범위에서 입자 상의 조립 입자가 유의적으 로 코팅형성되기 때문이다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (d) 및 (e)의 분사 방법으로는 전기분사(electrospray)법을 이용할 수 있으나, 이에만 한정되지 않는다. 전기분사법은 가스가 아닌 전기(electricity)를 이용하여 매우 미세한 액체 연무질(aerosol)을 생성하는 방법이다. 전기분사 장치 안에서 액체는 분사구를 통과하게 되며, 이 액체에 아주 높은 전압을 가하여 전기적으로 전하를 띠게 함으로써 작은 물방울의 기둥(plume)을 생성하게 한다. 분사구 내의 전하를 띤 액체가 점점 더 강한 전하를 띠게 됨에 따라 불안정한 상태가 되며, 액체가 더 이상의 전하를 유지할 수 없는 임계점(critical point)에 이르면 분사구의 끝에서 강한 전하를 띠는 액체가 미세한 액체 연무질 형태로 뿜어져 나오게 된다. 전기분사법은 미세한 분무(spray)가 미세한 입자를 이루어 표면을 코팅한다. 전기분사법은 산업적으로는 페인트 및 금속 표면을 코팅하는 데 사용되고 있고, 의료용 임플란트 등의 코팅에도 다양하게 이용되고 있다.
본 발명에서는 통상적으로 사용되고 있는 전기분사기를 이용할 수 있다. 또한, 당업계에 알려진 세포치료용 고분자 복합 제제의 조성물은 어떤 것이든 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 생분해성 고분자, 수용성 고분자 및 제1, 제2성장인자를 포함하는 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 조성물을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (d)에 따라 고분자 복합 제제의 내부에 포함된 수용성 고분자 및 제2성장인자의 혼합 입자 조성물의 전기분사 시, 전압은 0.1 내 지 30 kV, 바람직하게는 5 내지 15 kV, 가장 바람직하게는 12 kV이다. 그 전압이 0.1 kV 미만일 경우에는 혼합액이 섬유상을 형성할 만큼의 전위차가 발생하지 못하며, 30 kV를 초과할 경우에는 용매가 증발되지 않은 채로 수용성 고분자 용액의 표면에 남아 수용성 고분자와 성장인자의 입자를 형성하지 못하고 고분자 용액 내부에 큰 덩어리로 남게 될 수 있다. 이는 이후의 습식방사 시에 방사된 섬유가 끊어지는 이유가 될 수 있다.
단계 (d)에 있어서, 상기 수용성 고분자 및 제2성장인자의 혼합 입자 조성물의 전기분사 시 분사속도는 0.001 내지 0.01 ㎖/분, 바람직하게는 0.001 내지 0.005 ㎖/분, 가장 바람직하게는 0.002 ㎖/분이다. 분사속도가 0.001 ㎖/분 미만일 경우에는 전기분사가 일어나지 못하며, 0.01 ㎖/분을 초과할 경우에는 막을 형성하게 되어 입자코팅이 어려워질 수 있다.
상기 수용성 고분자 및 제2성장인자의 혼합 입자 조성물의 전기분사 시 분사가 이루어지는 분사체, 즉 분사구 끝과 단계 (b)로부터 얻어진 피분사체, 즉 생분해성 고분자 혼합액과의 거리는 2 ㎝ 내지 50 ㎝가 바람직하다. 그 거리가 2 ㎝ 미만일 경우에는 용매가 휘발되기에 충분한 거리를 확보할 수 없어 입자가 형성되지 않고, 50 cm를 초과할 경우에는 양극과 음극 사이의 거리가 지나치게 떨어져 분사효율이 매우 떨어진다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (e)에 따라 고분자 복합 제제의 표면에 코팅된 생분해성 고분자 및 제1성장인자의 코팅용 입자 조성물의 전기분사 시, 전압은 0.1 내지 30 kV, 바람직하게는 5 내지 15 kV, 가장 바람직하게는 13 kV이다. 그 전압 이 0.1 kV 미만일 경우에는 코팅용 조성물이 입자상을 형성할 만큼의 전위차가 발생하지 못하며, 30 kV를 초과할 경우에는 용매가 증발되지 않은 채로 생분해성 고분자 용액의 표면에 입자가 아닌 막 형태로 코팅될 수 있다.
단계 (e)에 있어서, 상기 생분해성 고분자 및 제1성장인자의 코팅용 입자 조성물의 전기분사 시, 분사속도는 0.005 내지 0.03 ㎖/분, 바람직하게는 0.01 내지 0.025 ㎖/분, 가장 바람직하게는 0.02 ㎖/분이다. 분사속도가 0.005 ㎖/분 미만일 경우에는 전기분사가 일어나지 못하며, 0.03 ㎖/분을 초과할 경우에는 막을 형성하게 되어 입자코팅이 어려워질 수 있다.
상기 생분해성 고분자 및 제1성장인자의 코팅용 입자 조성물의 전기분사 시, 분사가 이루어지는 분사체, 즉 분사구 끝과 단계 (d)로부터 얻어진 피분사체, 즉 마이크로 크기의 섬유상 지지체와의 거리는 2 ㎝ 내지 50 ㎝가 바람직하다. 그 거리가 2 ㎝ 미만일 경우에는 용매가 휘발되기에 충분한 거리를 확보할 수 없어 입자가 형성되지 않고, 50 cm를 초과할 경우에는 양극과 음극 사이의 거리가 지나치게 떨어져 분사효율이 매우 떨어진다.
이때, 상기의 코팅 방법에 의해 코팅된 조립상의 조립 입자(granulated particles)의 평균 입경은 50 nm 내지 1 ㎛이고, 모양은 섬유상이 아닌 조립 입자로 분리될 수 있다.
본 발명에 따른 전기분사법을 이용한 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제는 그 내부 및 외부에 수용성 고분자 및 성장인자와 생분 해성 고분자를 포함시킴으로써 성장인자의 속방출, 서방출 등의 속도조절방출을 용이하게 할 수 있다. 이에 따라, 성장인자를 원하는 시점까지 방출하도록 조절할 수 있고, 생체친화력을 크게 높일 수 있다.
또한, 성장인자의 양과 방출시간을 조절하여 골아세포의 초기 증식과 후기 분화에 가장 효과적인 조건을 설정함으로써 고분자 복합 제제의 성능을 최대화 할 수 있다. 그러므로, 생분해성 고분자, 수용성 고분자 및 세포 성장인자를 포함하는 본 발명에 따른 고분자 복합 제제의 조성 및 전기분사법은 세포치료용 고분자 제제를 제조하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되거나 제한되지 않음은 물론이다.
<실시예 1> 수용성 고분자 및 성장인자를 포함하는 입자 조성물의 제조
수용성 고분자로서 요오드염 키토산과 성장인자로서 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like Growth Factor; IGF, R&D system)를 준비하였다. 상기 요오드염 키토산을 제조하기 위해 정제한 키토산을 요오드산에 충분히 담근 채 4시간 동안 교반한 후, 상기 요오드산을 붙여놓은 키토산을 메탄올이나 에탄올로 여분의 요오드산을 닦아내어 요오드염 키토산을 제조하였다.
요오드염 키토산을 메탄올과 다이메틸포름아마이드 2:1 혼합액 1.1㎖에 0.7%(w/v)가 되도록 용해하고, 인슐린 유사 성장인자를 1% BSA(Bovine Serum Albumin)을 포함한 DPBS(Dulbecco's Phosphate buffered saline) 10㎕에 80%(w/v) 가 되도록 용해한 후, 두 용액을 균일하게 혼합하여 에멀젼 상태의 혼합액을 제조하였다. 이때, 혼합액 내 요오드염 키토산과 인슐린 유사 성장인자 각각의 질량비가 1,000:1이 되도록 하였다.
표 1에 상세 조건을 나타내었다.
| 실시예 1 | |
| 요오드염 키토산 용액의 농도(%) | 7% |
| 인슐린 유사 성장인자의 농도(%) | 80% |
| 혼합액 내 요오드염 키토산 및 인슐린 유사 성장인자의 질량비 | 10,000:1 |
<실시예 2> 생분해성 고분자 조성물의 제조
폴리-D,L-락트산(Purac사)을 염화메틸렌(methylene chloride) 10㎖에 10%가 되도록 용해하고, 폴리카프로락톤(Purac사)을 염화메틸렌(methylene chloride) 10㎖에 5%가 되도록 용해하여 혼합하였다. 이때, 혼합액 내 폴리-D,L-락트산과 폴리카프로락톤 각각의 질량비가 2:1이 되도록 하였다. 그 이유는 폴리락트산의 강함과 폴리카프로락톤의 연성을 모두 적절하게 이용할 수 있기 때문이다.
표 2에 상세 조건을 나타내었다.
| 실시예 2 | |
| 폴리-D,L-락트산 용액의 농도(%) | 10% |
| 폴리카프로락톤의 농도(%) | 5% |
| 폴리-D,L-락트산 및 폴리카프로락톤의 질량비 | 2:1 |
<실시예 3> 생분해성 고분자 및 성장인자를 포함하는 코팅용 조성물의 제조
생분해성 고분자인 폴리락트산-글리콜릭산 공중합체(Purac사) 및 혈소판 유래 성장인자(Platelet-Derived Growth Factor; PDGF, R&D system)을 준비하였다.
폴리락트산-글리콜산 공중합체를 아세톤 5㎖에 0.2%(w/v)가 되도록 용해하고, 혈소판 유래 성장인자를 1% BSA(Bovine serum albumin) 수용액 0.2㎖에 0.00084%(w/v)가 되도록 용해한 후, 두 용액을 균일하게 혼합하여 에멀젼 상태의 혼합액을 제조하였다. 이때, 혼합액 내 폴리락트산-글리콜산 공중합체와 혈소판 유래 성장인자 각각의 질량비가 6,000:1이 되도록 하였다.
표 3에 상세 조건을 나타내었다.
| 실시예 3 | |
| 폴리락트산-글리콜산 공중합체의 농도(%) | 0.2% |
| 혈소판 유래 성장인자의 농도(%) | 0.00084% |
| 폴리락트산-글리콜산 공중합체 및 혈소판 유래 성장인자의 질량비 | 6,000:1 |
<실시예 4> 수용성 고분자 및 생성인자의 생분해성 고분자 조성물 내부로의 포함
실시예 1에서 제조한 요오드염 키토산 및 인슐린 유사 성장인자 혼합 조성물을 전압 발생기(voltage generator)(nano NC사)를 이용하여 실시예 2에서 제조한 폴리-D,L-락트산과 폴리카프로락톤 혼합액 10㎖에 수직으로 전기분사 하였다. 전기분사 시 전압은 12 kV, 분사속도는 0.002㎖/분으로 하였으며, 분사량은 1.1㎖로 하였다. 이때, 분사기와 생분해성 고분자 조성물과의 거리는 30㎝로 하였다. 이를 수거하여 메탄올을 응고조로 하여 습식방사법으로 마이크로사이즈의 섬유를 제조하였다. 제조된 섬유의 굵기는 500㎛ 이하, 평균적으로는 50 내지 100㎛이고, 표면은 울퉁불퉁 요철이 심하다. 이때, 전기분사한 요오드염 키토산과 10% 폴리-D,L-락트산 및 5% 폴리카프로락톤 혼합액 간의 질량비가 1:1,000이 되도록 하였다.
표 4에 상세 조건을 나타내었다.
| 실시예 4 | |
| 폴리-D,L-락트산의 농도(%) | 10% |
| 폴리카프로락톤의 농도(%) | 5% |
| 요오드염 키토산:폴리-D,L-락트산 및 폴리카프로락톤 혼합액의 질량비 | 100:1 |
<실시예 5> 생분해성 고분자 및 성장인자 혼합 조성물의 코팅
실시예 3에서 제조한 폴리락트산-글리콜산 공중합체 및 혈소판 유래 성장인자 혼합액을 전압 발생기(voltage generator)(nano NC사)를 이용하여 실시예 4에서 제조한 마이크로 크기의 섬유 상에 코팅하여 섬유형 매트릭스 구조의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제를 얻었다. 전기분사 시 전압은 13kV, 분사속도는 0.02㎖/분으로 하였으며, 분사량은 5㎖로 하였다. 이때, 분사기와 상기 마이크로 크기의 섬유상과의 거리는 15㎝로 하였다.
<평가>
나노 크기의 입자로 표면 코팅하기 전과 후의 고분자 복합 제제의 표면을 시차주사 현미경으로 3,500배 배율에서 관찰하였다.
도 1은 표면처리 하기 전의 고분자 복합 제제를 나타낸 사진이고, 도 2는 폴리락트산-글리콜산 공중합체 및 혈소판 유래 성장인자로 표면처리한 고분자 복합 제제를 나타낸 사진이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 고분자 복합 제제의 코팅 전(도 1)과 코팅 후(도 2)를 비교하면, 코팅 후에 폴리락트산-글리콜산 공중합체 및 혈소판 유래 성장인자가 나노 크기의 입자형으로 코팅되었음을 확인할 수 있다.
<실험예 1> 성장인자의 용출 실험
실시예 1~4의 요오드염 키토산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 혈소판 유사 성장인자, 및 인슐린 유사 성장인자의 혼합액을 포함한 고분자 복합 제제로부터 성장인자가 용출되는 것을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
상기의 성장인자를 포함한 고분자 복합 제제를 37℃에서 인산완충용액(PBS, pH 7.4)에 담궈 용출하였다. 용출시간은 각각 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 96시간, 168시간 또는 336시간으로 하여 용출되는 성장인자의 농도를 ELISA 리더를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
측정 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 혈소판 유래 성장인자(PDGF)는 이틀만에 용출이 모두 끝난 데 반해, 인슐린 유사 성장인자는 14일까지 지속적으로 방출이 됐음을 확인할 수 있다. 이로부터, 상기의 성장인자들이 독립적으로 속방출 내지 서방출되어 이중적인 용출 패턴을 가짐이 확인되었다.
또한, 고분자 복합 제제에 두 가지 이상의 성장인자 혹은 약물을 포함시키는 경우, 그 고분자 및 주입 방법을 달리하여 약물의 용출속도를 다르게 할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 두 가지 이상의 성장인자 혹은 약물이 세포주기에 맞추어 독립적으로 속방출 내지 서방출될 수 있고 지속적으로 약효를 낼 수 있어 생체친화력 및 조직 재생능을 크게 높일 수 있으므로 세포의 성장뿐만 아니라 분화를 증가시킬 수 있는 약물의 이중적 용출 패턴을 가진 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 설계에 유용하게 이용될 수 있다.
Claims (17)
- 생분해성 고분자 및 제1성장인자로 이루어진 나노입자가 수용성 고분자 및 제2성장인자로 이루어진 섬유상 지지체 상에 코팅형성된 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤 및 폴리락트산-글리콜산 공중합체 중에서 1종 이상이 선택되는 생분해성 합성 고분자, 및 키토산, 콜라겐 및 젤라틴 중에서 1종 이상이 선택되는 천연 고분자로 이루어진 군 중에서 1종 이상이 선택되는 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 상기 고분자 복합 제제 전체에 대하여 0.1 내지 5 중량부로 포함되는 것인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 고분자는 요오드염 키토산, 카복시메틸염 키토 산 및 젖산염 키토산 중에서 1종 이상이 선택되는 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 고분자는 상기 고분자 복합 제제 전체에 대하여 0.5 내지 1 중량부로 포함되는 것인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 제1성장인자 또는 제2성장인자는 혈소판 유래 성장인자, 인슐린 유사 성장인자, 상피세포 성장인자, 전환 성장인자-베타, 혈관 내피세포 성장인자 및 섬유아세포 성장인자 중에서 1종 이상이 선택되는 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 제1성장인자 또는 제2성장인자는 상기 고분자 복합 제제 전체에 대하여 0.00005 내지 0.0001 중량부로 포함되는 것인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제1항에 있어서, 칼슘, 에스트로겐, 칼시토닌, 비스포스포네이트 및 비타민 D 중에서 1종 이상이 선택되는 골 흡수 억제제, 또는 불화나트륨, 부갑상선호르몬 및 성장호르몬 중에서 1종 이상이 선택되는 골 형성 자극제를 추가적으로 포함하는 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 코팅형성된 나노입자는 조립 입자(granulated particles)인 것인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- 제9항에 있어서, 상기 조립 입자의 평균 입경은 50 nm 내지 5 ㎛인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제.
- (a) 수성 용매에 용해시킨 수용성 고분자 및 제2성장인자 수용액을 혼합하여 분사액을 제조하는 단계;(b) 생분해성 고분자 혼합액을 제조하는 단계;(c) 수성 용매에 용해시킨 생분해성 고분자 및 제1성장인자 수용액을 혼합하여 코팅용 조성물을 제조하는 단계;(d) 상기 분사액을 상기 단계 (b)의 생분해성 고분자 혼합액 내로 분사하여 마이크로 크기의 섬유를 형성하는 단계; 및(e) 상기 얻어진 마이크로 크기의 섬유 상에 상기 제조된 코팅용 조성물을 분사하여 나노입자로 코팅하는 단계를 포함하는 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 수성용매는 물, 아세톤, C1 내지 C4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합액인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 및 제1성장인자를 포함하는 코팅용 조성물은 상기 생분해성 고분자 및 제1성장인자가 7500:1 내지 12,500:1의 중량비로 혼합되는 것인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 분사는 전기분사법을 이용하는 것인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 제조방법.
- 제14항에 있어서,상기 전기분사 시 전압은 5 내지 15 kV인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 제조방법.
- 제14항에 있어서, 상기 전기분사 시 분사속도는 0.005 내지 1 ㎖/분인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 제조방법.
- 제14항에 있어서, 상기 전기분사 시 분사체와 피분사체 간의 거리는 2 ㎝ 내지 50 ㎝인 맞춤형 약물 방출양상의 세포치료용 생분해성 고분자 복합 제제의 제조방법.
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