KR20070072301A - Retinol encapsulated low molecular water-soluble chitosan nanoparticles and method for preparation thereof - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 (a) 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 크기 분포, (b) 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 투과전자현미경 사진이고,1 is a size distribution of (a) the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated by the retinol of the present invention, (b) a transmission electron micrograph of the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated by the retinol of the present invention,
도 2는 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 적외선 분광 스펙트럼을 나타내고,2 shows an infrared spectroscopy spectrum of the retinol-encapsulated low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles of the present invention,
도 3은 (a) D2O하에서 저분자량 수용성 키토산, (b) DMSO하에서 레티놀, (c) D2O하에서 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 및 (d) D2O/DMSO 혼합용액(1:4, v/v)하에서 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 1H NMR 스펙트럼을 나타내고,Figure 3 shows (a) low molecular weight water soluble chitosan under D 2 O, (b) retinol under DMSO, (c) retinol-enclosed low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles under D 2 O and (d) D 2 O / 1 H NMR spectrum of the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated by the present invention under DMSO mixed solution (1: 4, v / v) is shown.
도 4는 (a) 레티놀, (b) 저분자량 수용성 키토산 및 레티놀의 물리적 혼합물, (c) 저분자량 수용성 키토산 및 (d) 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자(실시예 1~4)의 X-선 회절(X-ray powder diffraction) 분석 결과를 나타내고,Figure 4 is a physical mixture of (a) retinol, (b) low molecular weight water soluble chitosan and retinol, (c) low molecular weight water soluble chitosan and (d) retinol-enclosed low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles (Example 1 ~ X-ray diffraction analysis results of 4) are shown,
도 5는 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자에 의한 레티놀의 용해도 측정 결과를 나타내고,5 shows the results of measuring the solubility of retinol by the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles retinol-encapsulated of the present invention,
도 6은 실시예 1~4에서 제조된 (a) 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 동결건조 전 입자 분포 변화 및 (b) 동결건조 후 증류수에 재분산한 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 입자 분포 변화를 측정한 결과를 나타내고,Figure 6 is the retinol of the present invention (a) the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles prepared in Examples 1 to 4 before the lyophilized particle distribution change and (b) re-dispersed in distilled water after lyophilization The result of having measured the particle distribution change of this enclosed low molecular weight water soluble chitosan nanoparticle is shown,
도 7은 실시예 1~4에서 제조된 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 안정성 시험 결과를 나타내고,Figure 7 shows the stability test results of the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles retinol encapsulated of the present invention prepared in Examples 1 to 4,
도 8은 실시예 1~4에서 제조된 (a) 동결건조 전 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 및 (b) 동결건조 3일 후 증류수에 재분산시킨 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 촬영한 사진을 나타내고,Figure 8 is a low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles (a) retinol encapsulated before lyophilization prepared in Examples 1 to 4 and (b) retinol-enclosed low molecular weight of the present invention redispersed in distilled water after 3 days of lyophilization The photograph which photographed water-soluble chitosan nanoparticles is shown,
도 9의 (a)는 순수한 레티놀을 에탄올에 0.125 mg/㎖의 농도로 녹이고 이를 1/2씩 희석해 가면서 측정한 용액의 HPLC 분석 결과와 상기 각 농도에 대한 피크 면적을 나타내고, (b)는 실시예 1~4에서 제조된 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸다. (A) of FIG. 9 shows the results of HPLC analysis and the peak area for each concentration of the solution measured while dissolving pure retinol at a concentration of 0.125 mg / ml in ethanol and diluting by half. The results of HPLC analysis for the retinol-encapsulated low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles of the present invention prepared in Examples 1-4 are shown.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명><Description of the symbols for the main parts of the drawings>
1 : 실시예 1에서 제조된 레티놀이 봉합된 저분자량 수용성 키토산 나노입자1: Retinol-sealed low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles prepared in Example 1
2 : 실시예 2에서 제조된 레티놀이 봉합된 저분자량 수용성 키토산 나노입자2: Retinol-sealed low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles prepared in Example 2
3 : 실시예 3에서 제조된 레티놀이 봉합된 저분자량 수용성 키토산 나노입자3: Retinol-sealed low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles prepared in Example 3
4 : 실시예 4에서 제조된 레티놀이 봉합된 저분자량 수용성 키토산 나노입자4: Retinol-sealed low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles prepared in Example 4
5 : 순수한 레티놀 5: pure retinol
6 : 레티놀이 봉입되지 않은 저분자량 수용성 키토산 6: low molecular weight water-soluble chitosan without retinol inclusion
7 : 순수한 레티놀과 순수한 저분자량 수용성 키토산의 물리적 혼합물7: Physical mixture of pure retinol and pure low molecular weight water soluble chitosan
도 3의 1~20 : 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 키토산 나노입자에 대한 1H NMR 특성 피크1 to 20 of FIG. 3: 1 H NMR characteristic peak of the low molecular weight chitosan nanoparticles encapsulated retinol of the present invention
본 발명은 지용성이며 빛과 공기 중의 수분에 불안정한 레티놀의 안정성, 용해도 등이 개선된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles having improved fat stability and solubility in light and air, and a method for preparing the same.
키토산은 글루코오스아민(glucosamine)의 피라노스(pyranose) 단위체가 β-1,4 결합된 것으로서, 글루코오스아민 잔기가 5,000 개 이상 결합된 분자량이 100 만 이상이고 다가의 양이온을 가진 다당류(polysaccharide) 계열의 생체고분자물질로 게 껍질이나 새우와 같은 갑각류 및 오징어를 포함하는 수산계로부터 추출할 수 있으며, 그 분자 구조로 볼 때 다당류의 일종인 셀룰로오스와 유사한 구조로서, 생체 친화성이 우수하여 면역 반응시 거부 반응이 일어나지 않기 때문에 의약 산업에 응용되고 있고, 최근 미국의 FDA에서 식품으로서 인증을 받은 후, 키토산은 21세기의 중요한 생물산업 및 생체의료용 물질로 응용되고 있다.Chitosan is a β-1,4 conjugated pyranose unit of glucoseamine (glucosamine), and has a molecular weight of 1 million or more and a polyvalent cation having a polyvalent cation in which 5,000 or more glucoseamine residues are bound. As a biopolymer, it can be extracted from aquatic systems including crustaceans such as crab shells and shrimps and squids.Its structure is similar to cellulose, which is a kind of polysaccharides. Since this is not happening, it has been applied to the pharmaceutical industry, and recently certified as a food by the US FDA, chitosan has been applied as an important bioindustry and biomedical material of the 21st century.
특히, 20,000 ∼ 100,000 이내의 특정 분자량의 범위를 가진 키토산은 강한 생리활성 기능을 띠고 있는 것으로 알려져 있기 때문에 건강 식품분야, 식ㆍ음료 분야, 화장품 분야, 보건위생 분야 및 의약품 분야에 대한 응용성을 기대할 수 있다. In particular, chitosan, which has a specific molecular weight range of 20,000 to 100,000, is known to have strong physiologically active functions. Therefore, it is expected to have applicability to health food, food and beverage, cosmetics, health and hygiene and pharmaceuticals. Can be.
그러나, 상술한 특징 및 장점을 갖는 키토산은 서로 이웃하는 분자가 강한 수소결합으로 견고하게 결합되어 물에 녹지 않는 불용성 물질로서, 종래 이러한 키토산을 녹이기 위하여 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산을 포함하는 유기산 및 염산, 질산 및 황산으로 구성되는 무기산을 사용함으로 생체에 응용하는 데 제한을 주고 있다는 문제점을 가지고 있었다. 본 발명자들은 이러한 문제를 해결할 수 있는 획기적인 수용성 키토산을 개발하고 이를 특허출원하여 등록받은 바 있다(대한민국 등록특허 제441270호). 이를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.However, chitosan having the above-described features and advantages is an insoluble substance in which neighboring molecules are firmly bonded to each other by strong hydrogen bonds and are insoluble in water. In order to dissolve such chitosan, lactic acid, acetic acid, propionic acid, formic acid, ascorbic acid, and The use of organic acids including tartaric acid and inorganic acids consisting of hydrochloric acid, nitric acid and sulfuric acid has the problem of limiting their application to living bodies. The present inventors have developed and patented a breakthrough water-soluble chitosan that can solve this problem (Korean Patent No. 441270). Looking at this in detail.
상기 대한민국 등록특허 제441270호는 "1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼100,000 Da의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 방법"을 개시하고 있다.The Republic of Korea Patent No. 441270 is "1) treating a solution of an organic acid or inorganic acid salt of chitosan oligosaccharide with a trialkyl amine which is a base, and 2) adding an organic solvent to the solution to bind an organic acid or inorganic acid bound to chitosan oligosaccharide. The chitosan oligosaccharides removed in the form of alkyl amine salts are recovered, and 3) the chitosan oligosaccharide solution from which the acid is removed is treated with inorganic acid, and purified by activated carbon / ion exchange resin column to obtain 1,000 to 100,000. A process for preparing pure water-soluble free amine chitosan with a molecular weight of Da is disclosed.
한편, 레티놀은 전 세계적인 주목을 받고 있는 새로운 기능성 물질로서 그 실체는 순수 지용성 비타민 A이다. 이러한 레티놀은 그 활성형태인 레티노인산(retinoic acid)으로 변형되어 그 기능을 나타낸다. 이들의 주요 기능으로는 표피세포가 원래의 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 살펴보면, 레티놀은 피부세포에 존재하는 세포 핵 중의 DNA로 하여금 RNA를 발현시키게 함으로써 세포분화를 촉진하고 세포 사이에 존재하는 조직물인 콜라겐, 엘라스틴 등의 생합성을 촉진하여 주름 생성을 억제하고 피부탄력을 유지 및 증대시키는 효능을 가지고 있다. 또한, 레티놀은 세포의 증식을 억제하는 작용을 함으로써, 전신에 섭취될 경우에는 암의 증식을 예방하는 작용을 할 뿐만 아니라, 백혈병 치료제, 항염증제 등으로 사용되는 등 면역 기능의 수행에 있어서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.Retinol, on the other hand, is a new functional substance that is attracting worldwide attention, and its substance is pure fat-soluble vitamin A. These retinols are transformed into their active form retinoic acid to show its function. Their main function is known to play an important role in epidermal cells to maintain their original function. Specifically, retinol promotes cell differentiation by causing DNA in the cell nucleus in skin cells to express RNA and inhibits wrinkle formation and promotes skin elasticity by promoting biosynthesis of tissues such as collagen and elastin, which exist between cells. It has the effect of maintaining and increasing. In addition, retinol acts to inhibit the proliferation of cells, and when it is ingested systemically, not only prevents the proliferation of cancer, but also plays an important role in the performance of immune function, such as being used as a leukemia treatment agent or anti-inflammatory agent. It is known.
그러나, 지용성 비타민인 레티놀은 물에 대한 용해도가 매우 낮고, 빛, 열, 산소 등과 접촉되는 경우에는 쉽게 산화되거나 변형되어 변색, 변취, 역가가 떨어져 효과가 저하되는 불안정한 물질로서, 소량 사용에도 피부자극이 유발되는 문제점 등으로 인하여 이의 우수한 주름 생성 억제 기능 등에도 불구하고 화장료로서의 사용이 극히 제한되어 왔다. 따라서, 1차적으로 레티놀 자체를 안정화시킬 수 있는 기술이 선행되지 않는 한 레티놀의 제품화는 기대할 수 없는 실정이다.However, retinol, a fat-soluble vitamin, has a very low solubility in water and is an unstable substance that is easily oxidized or deformed when it comes into contact with light, heat, oxygen, etc., resulting in decreased discoloration, discoloration, and titer, and thus lowers the effect even when used in small amounts. Due to such a problem, the use as a cosmetic has been extremely limited despite its excellent anti-wrinkle function. Therefore, the commercialization of retinol is not expected unless there is a technology that primarily stabilizes retinol itself.
종래, 이러한 레티놀의 불안정성, 불수용성 등의 문제를 개선하려는 연구가 많이 시도되었다. 이를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.In the past, many studies have been attempted to improve such problems as instability and insolubility of retinol. Looking at this in detail.
미합중국 등록특허 제5,855,826호는 콜라겐 또는 콘드로이친황산나트륨과 같은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)으로 제조된 캡슐 내에 레티놀을 포접시켜 1차 안정화시키고, 겔란(gellan)검으로 상기 1차 안정화된 캡슐을 매트릭스화하여 2차 안정화시키는 방법을 개시하고 있다. 상기 방법은 2중으로 안정화시켰으나, 겔란검에 의한 2차 안정화는 오픈 매트릭스 시스템으로 이루어져 있어 산소, 수분, 열에 아주 민감한 레티놀을 이들과의 접촉으로부터 효과적으로 차단하기 어렵기 때문에 여전히 레티놀의 안정화에 한계가 있다.U.S. Patent No. 5,855,826 discloses the first stabilization by enclosing retinol in a capsule made of glycosaminoglycan, such as collagen or sodium chondroitin sulfate, and matrixing the first stabilized capsule with gellan gum. The second stabilization method is disclosed. The method was stabilized in twofold, but the second stabilization by gellan gum consists of an open matrix system, which still limits the stabilization of retinol because it is difficult to effectively block retinol from contact with oxygen, moisture and heat. .
미합중국 등록특허 제3,906,108호는 유용성 항산화제인 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxyltoluene, BHT), DL-α-토코페롤 및 킬레이트제인 EDTA를 사용하여 레티노인산의 안정화를 시도한 수중유(O/W, oil in water)형의 유화제형에 대한 내용을 개시하고 있다. 또한, 미국특허 제4,247,547호는 유용성 항산화제인 토코페롤, 구연산을 사용하여 레티놀을 안정화시킨 수중유형의 유화제형에 대한 내용을 개시하고 있다.U.S. Patent No. 3,906,108 discloses oil-in-water type (O / W), which attempts to stabilize retinoic acid using oil-soluble antioxidant butylated hydroxyltoluene (BHT), DL-α-tocopherol and EDTA, a chelating agent. The content of the emulsifier type is disclosed. U.S. Patent No. 4,247,547 also discloses an oil-in-water emulsifier type in which retinol is stabilized using oil-soluble antioxidants, tocopherol and citric acid.
미합중국 등록특허 제4,826,828호는 유용성 항산화제인 상기 BHT 및 BHA(butylated hydroxylanisole)를 사용하여, 레티놀, 레티닐아세테이트 또는 레티 닐 팔미테이트를 안정화시킨 유중수(W/O)형의 유화제형에 대한 내용을 개시하고 있다. 또한, 미합중국 등록특허 제4,720,353호는 레티놀을 항산화제인 상기 BHA, 아스코르빈산 및 토코페릴리놀레이트를 사용하여 안정화시킨 유중수형의 유화제형에 대한 내용을, 유럽등록특허 제0440,398 B1호는 레티노이드의 화학적 안정성을 향상시키기 위해 1종 이상의 수ㆍ유용성 항산화제 및 킬레이트제를 함유한 수중유형 유화조성물에 대한 내용을, 유럽공개특허공보 제1,568,106 A1호는 레티노이드를 안정화시키는 시스템으로 킬레이트제와 수ㆍ유용성 항산화제, 유화물의 유상과 수상에 동시에 존재하는 항산화제 및 유리염기형의 이미다졸을 함유하는 수중유형의 유화조성물에 대한 내용을 개시하고 있다. U.S. Patent No. 4,826,828 discloses a water-in-oil (W / O) type emulsion formulation of stabilizing retinol, retinyl acetate or retinyl palmitate using the useful antioxidants BHT and butylated hydroxylanisole (BHA). It is starting. In addition, U.S. Patent No. 4,720,353 discloses a water-in-oil emulsifier type in which retinol is stabilized using the antioxidants BHA, ascorbic acid and tocopherylinate. For the oil-in-water emulsion composition containing one or more water-soluble antioxidants and chelating agents to improve the chemical stability of the retinoids, European Patent Publication No. 1,568,106 A1 is a system for stabilizing retinoids and chelating agents and water Disclosed is an oil-in-water emulsion composition containing an oil-soluble antioxidant, an antioxidant present in the oil phase and the water phase of the emulsion, and an imidazole of a free base type.
이러한 수중유형 또는 유중수형의 유화제형 또는 유화조성물에 관한 종래 기술의 특징은 레티놀 및 이의 유도체를 안정화시키기 위해 유화형태에 따라 유ㆍ수용성 항산화제, 킬레이트의 종류를 변화시켜 이들의 안정화를 시도한 방법으로 요약될 수 있다. 그러나, 불안정한 레티놀을 빛, 열, 산소, 수분 등으로부터 완전하게 보호할 수 없기 때문에 장시간 레티놀을 효과적으로 안정화시키기에는 여전히 한계가 있다.The characteristics of the prior art regarding the oil-in-water or water-in-oil emulsifier type or emulsion composition is a method that attempts stabilization by changing the types of oil- and water-soluble antioxidants and chelates according to the emulsification type to stabilize the retinol and its derivatives. Can be summarized. However, there is still a limit to effectively stabilize the retinol for a long time because unstable retinol cannot be completely protected from light, heat, oxygen, moisture, and the like.
대한민국 공개특허공보 제2003-0021709호는 불안정한 유용성 물질인 레티놀을 비이온계면활성제, 콜레스테롤 및 콜레스테릴에스테르로 제조된 베시클(vesicle)에 1차 안정화시킨 후, 이를 다시 레시친과 세라마이드로 제조된 멀티 라멜라리포좀인 스핑고좀 내에 첨가한 다음, 마지막으로 라멜라 액정 유화베이스에 첨가함으로써 공기와 수분 등으로부터 산화되기 쉬운 레티놀을 3중으로 안정화시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 3중으로 안정화시키기까지의 다단계 공정으로 인해 시간과 비용면에서 불리하다는 단점이 있다. Korean Patent Laid-Open Publication No. 2003-0021709 discloses a stabilizing useful agent, retinol, first stabilized in vesicles made of nonionic surfactants, cholesterol, and cholesteryl esters, and then again made of lecithin and ceramide. A method of triple stabilization of retinol, which is susceptible to oxidation from air, moisture, and the like, is added to sphingosomes, which are multi-lamellar liposomes, and then to the lamellar liquid-crystal emulsion base. However, this method is disadvantageous in terms of time and cost due to the multi-step process up to triple stabilization.
이에, 본 발명자들은 상술한 생체 고분자 물질인 저분자량 수용성 키토산을 이용하여 core-shell 형태의 나노입자를 제조하고, 그 내부에 레티놀을 봉입시킴으로써 레티놀의 불안정성을 개선하고 체내에서 효과적으로 전달될 수 있도록 용해도를 향상시킨 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제조하는 방법을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors prepared core-shell-type nanoparticles using low molecular weight water-soluble chitosan, which is the above-described biopolymer, and encapsulating retinol therein so as to improve instability of retinol and to be effectively delivered in the body. To find a method for producing a low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated with improved retinol, the present invention was completed.
본 발명의 목적은 레티놀의 안정성 및 수용성을 확보할 수 있는 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제공하는 데 있다.An object of the present invention to provide a retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles that can ensure the stability and water solubility of retinol.
본 발명의 다른 목적은 상기 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated retinol.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태는 저분자량 수용성 키토산이 레티놀 분자들을 둘러싸고 있는 구형의 core-shell 형태를 띠고 있다(도 1b 참조). 따라서, 이러한 구형의 core-shell 형태가 갖는 구조적 특성에 의해, 저분자량 수용성 키토산의 내부에 위치하게 되는 레티놀은 빛, 열, 공기 중의 수분 등과 접촉이 차단되고, 그 결과 레티놀의 안정성 확보가 가능하게 된다.The retinol-encapsulated low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles according to the present invention have a spherical core-shell form in which the low molecular weight water soluble chitosan surrounds the retinol molecules (see FIG. 1B). Therefore, due to the structural characteristics of the spherical core-shell form, the retinol located inside the low molecular weight water-soluble chitosan is blocked from contact with light, heat, and moisture in the air, and as a result, it is possible to secure stability of the retinol. do.
본 발명에 따른 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 하기 화학식 1과 같이 저분자량 수용성 키토산의 아민기와 레티놀의 하이드록시기가 수소결합에 의해 결합된 것으로 판단되나, 반드시 이 이론에 한정되지는 아니한다. Retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles according to the present invention, as shown in the following
상기 식에서, n은 6 내지 310이다.Wherein n is 6 to 310.
상기 저분자량 수용성 키토산은 500~100,000 Da의 분자량을 갖는 순수한 유리 아민기를 갖는 저분자량의 수용성 키토산이 바람직하고, 1,000~50,000 Da인 것이 더욱 바람직하다.The low molecular weight water-soluble chitosan is preferably a low molecular weight water-soluble chitosan having a pure free amine group having a molecular weight of 500 to 100,000 Da, more preferably 1,000 to 50,000 Da.
예를 들면, 불수용성인 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기로 처리하고, 이를 유기용매로 처리하여 상기 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산을 상기 염기 염의 형태로 제거한 키토산 올리고당을 회수하고, 간단한 처리 후 정제하여 얻어지는 수용성 키토산으로서, 본 발명자들의 대한민국 등록특허 제441,270호에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있다.For example, a solution of an organic or inorganic acid salt of water-insoluble chitosan oligosaccharide is treated with a base and treated with an organic solvent to recover the chitosan oligosaccharide from which the organic or inorganic acid bound to the chitosan oligosaccharide is removed in the form of the base salt, As the water-soluble chitosan obtained by purification after a simple treatment, those disclosed in Korean Patent No. 441,270 of the present inventors can be used.
상기 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 크기는 봉입되는 레티놀의 양에 의존한다. 따라서, 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자가 적용되는 목적에 따라서, 상기 나노입자의 크기는 자유롭게 조절될 수 있다. 예를 들면, 피부 투과를 목적으로 하는 화장품의 원료로 사용되는 경우에는 피부 투과 효율을 최대화하기 위해, 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 50 ~ 250 nm의 크기를 갖는 것이 바람직하고, 50 ~ 150 nm인 것이 더욱 바람직하며, 이는 봉입되는 레티놀의 양을 조절함으로써 확보될 수 있다. The retinol encapsulated low molecular weight water soluble chitosan nanoparticle size depends on the amount of retinol encapsulated. Therefore, the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the present invention can be freely controlled in accordance with the purpose of applying the nanoparticles. For example, when used as a raw material for cosmetics for the purpose of skin permeation, in order to maximize skin permeation efficiency, the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the present invention preferably have a size of 50 to 250 nm. More preferably 50 to 150 nm, which can be ensured by controlling the amount of retinol encapsulated.
또한, 본 발명의 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 수용성이므로, 용해도가 매우 작은 레티놀의 용해도를 증대시킬 수 있다. 나아가, 무독성, 생분해성 특징을 갖는 저분자량 수용성 키토산 나노입자로 둘러싸여 있기 때문에, 인체에 아무런 부작용이 없으며, 체내 복용 또는 피부에 흡수된 나노입자는 레티놀을 서서히 방출시키는 역할을 수행함으로써, 레티놀의 작용을 극대화하는 역할을 한다.In addition, since the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the present invention are water-soluble, the solubility of retinol having a very low solubility can be increased. Furthermore, because it is surrounded by low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles with non-toxic, biodegradable properties, there are no side effects to the human body, and the nanoparticles taken in the body or absorbed by the skin play a role of slowly releasing retinol, thereby acting as a retinol. Plays a role in maximizing
본 발명에 따른 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 레티놀의 산화 방지를 위해 토코페롤, BHT, BHA, 아스코르빈산 등과 같은 항산화제를 1 또는 2 이상 더 포함할 수 있다. 이러한 항산화제들은 레티놀과 함께 본 발명의 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 내부에 위치하게 된다.The low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles according to the present invention may further include one or two or more antioxidants such as tocopherol, BHT, BHA, ascorbic acid, etc. to prevent oxidation of retinol. These antioxidants, along with retinol, will be placed inside the low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles of the present invention.
본 발명은 또한, 저분자량 수용성 키토산 용액을 준비하는 단계; 레티놀 용액을 준비하는 단계; 상기 레티놀 용액을 상기 저분자량 수용성 키토산 용액과 혼합, 교반하는 단계; 및 상기 혼합 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for preparing a low molecular weight aqueous chitosan solution; Preparing a retinol solution; Mixing and stirring the retinol solution with the low molecular weight water soluble chitosan solution; And it provides a method for producing a low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated retinol comprising the step of lyophilizing the mixed solution.
본 발명은 상기 레티놀 용액을 준비하기 위해 사용되는 항산화제 용액을 준비하는 단계를 더 포함하여 수행될 수 있다.The present invention may further comprise the step of preparing an antioxidant solution used to prepare the retinol solution.
본 발명의 상기 저분자량 수용성 키토산 용액을 준비하는 단계는 적당량의 저분자량 수용성 키토산을 증류수에 용해시킴으로써 수행될 수 있다. 이때 사용되는 저분자량 수용성 키토산은 본 발명자들의 상기 등록특허 제4,412,705호에 기재되어 있는 방법에 의해 제조된 것을 사용할 수 있다. 상기 저분자량 수용성 키토산은 피부에 적절하게 투과되도록 하기 위해, 분자량이 500~100,000 Da이고, 1,000~ 50,000 Da으로 평균 분자량이 1,000~24,000 Da인 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.The preparing of the low molecular weight water soluble chitosan solution of the present invention may be performed by dissolving an appropriate amount of low molecular weight water soluble chitosan in distilled water. The low molecular weight water-soluble chitosan used at this time may be prepared by the method described in the Patent No. 4,412,705 of the present inventors. In order to allow the low molecular weight water-soluble chitosan to permeate the skin properly, it is more preferable to use a molecular weight of 500 ~ 100,000 Da, 1,000 ~ 50,000 Da with an average molecular weight of 1,000 ~ 24,000 Da.
본 발명의 상기 항산화제 용액을 준비하는 단계는 레티놀의 산화안정성을 확보하기 위해 레티놀의 산화를 방지할 수 있는 항산화제를 적당한 용매에 용해시킴으로써 수행될 수 있다. 이때 사용되는 용매는 사용되는 항산화제를 용해시킬 수 있으며 인체에 무해한 용매이면 제한없이 사용될 수 있으나, 상기 항산화제 용액은 하기의 레티놀을 용해시킬 수 있어야 하므로 수성 용액은 사용할 수 없다. 상기 용매로는 예를 들어 DMSO(Dimethyl sufoxide), THF(Tetrahydrofuran), 에탄올 등을 사용하는 것이 바람직하며, 이 중 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 항산화제로는 토코페롤 외에 BHT, BHA, 아스코르빈산 등 레티놀의 산화를 방지할 수 있는 항산화제이면 제한없이 사용할 수 있다. Preparing the antioxidant solution of the present invention may be carried out by dissolving an antioxidant that can prevent the oxidation of retinol in a suitable solvent in order to ensure the oxidation stability of the retinol. In this case, the solvent used may dissolve the antioxidant used and may be used without limitation as long as the solvent is harmless to the human body. However, since the antioxidant solution should be able to dissolve the following retinol, an aqueous solution cannot be used. As the solvent, for example, DMSO (dimethyl sufoxide), THF (Tetrahydrofuran), ethanol, or the like is preferably used. Among them, ethanol is more preferable. In addition, the antioxidant may be used without limitation as long as it is an antioxidant that can prevent oxidation of retinol, such as BHT, BHA, ascorbic acid, in addition to tocopherol.
상기 항산화제 용액 내의 항산화제는 용해되는 레티놀 1 중량부에 대하여 0.3~4 중량부인 것이 바람직하다. 0.3 중량부 이하인 경우에는 레티놀을 안정화시키기에는 부족하고, 4 중량부 이상인 경우에는 초과되는 양에 의한 안정화 효과를 기대할 수 없으므로 시약의 낭비가 된다The antioxidant in the antioxidant solution is preferably 0.3 to 4 parts by weight based on 1 part by weight of the retinol to be dissolved. If it is 0.3 parts by weight or less, it is insufficient to stabilize the retinol, and when it is 4 parts by weight or more, the stabilizing effect by the excess amount cannot be expected, which is a waste of reagents.
본 발명의 상기 레티놀 용액을 준비하는 단계는 상기 제조된 항산화제 용액을 적당량의 레티놀에 적하하는 방법으로 수행될 수 있다. The preparing of the retinol solution of the present invention may be performed by dropping the prepared antioxidant solution into an appropriate amount of retinol.
본 발명의 상기 레티놀 용액을 상기 제조된 저분자량 수용성 키토산 용액에 혼합, 교반하는 단계는 저분자량 수용성 키토산 용액을 교반시키면서 상기 레티놀 용액을 서서히 적하하는 방법으로 수행될 수 있다. 이때, 상기 저분자량 수용성 키토산 용액 및 레티놀 용액의 혼합은 저분자량 수용성 키토산 1 중량부에 대하여 레티놀 0.04 ~ 0.4 중량부로 이루어지는 것이 바람직하다. The step of mixing and stirring the retinol solution of the present invention into the prepared low molecular weight water soluble chitosan solution may be performed by slowly dropping the retinol solution while stirring the low molecular weight water soluble chitosan solution. At this time, it is preferable that the mixing of the low molecular weight water soluble chitosan solution and the retinol solution is made of 0.04 to 0.4 parts by weight of retinol based on 1 part by weight of the low molecular weight water soluble chitosan.
교반은 상기 두 용액의 혼합에 의해 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자가 물리적인 힘에 의해 파괴되지 않도록 적당한 시간 동안 수행한다. 바람직하게는 25 ~ 35분 동안 수행한다.Stirring is performed for a suitable time so that the low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles encapsulated by the retinol by mixing the two solutions are not destroyed by physical force. Preferably it is carried out for 25 to 35 minutes.
본 발명의 상기 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 용액을 동결건조하는 단계는 통상적으로 사용되는 동결건조 방법 또는 동결건조기를 사용하여 수행될 수 있고, 그 결과 고체형태의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 나노입자를 얻을 수 있다.Lyophilizing the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan solution of the present invention may be performed using a commonly used lyophilization method or lyophilizer, and as a result, the retinol-enclosed low molecular weight water-soluble nanoparticles in solid form Particles can be obtained.
본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 나노입자가 갖는 구형의 core- shell 형태는 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 1H NMR 또는 XRD 스펙트럼을 분석한 결과, 상기 스펙트럼에서는 저분자량 수용성 키토산의 피크만 관찰되는 것으로부터 알 수 있고, 이러한 구조적 특성에 의해 레티놀의 안정성이 확보될 수 있다(도 3 및 4 참조). The spherical core-shell form of the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble nanoparticles of the present invention was analyzed by 1 H NMR or XRD spectra of the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the present invention. It can be seen that only the peak of the molecular weight water-soluble chitosan is observed, and the stability of the retinol can be secured by this structural property (see FIGS. 3 and 4).
본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 지용성인 레티놀을 담지함으로써, 수환경에서도 그 용해도를 현저히 상승시킬 수 있다(도 5 참조).The low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated in the retinol of the present invention can significantly increase their solubility even in an aquatic environment by carrying a fat-soluble retinol (see FIG. 5).
본 발명에 의해 제조되는 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 나노입자는 동결건조 과정에 의해 그 크기가 감소한다(도 6 참조). 또한, 시간의 경과에 의한 레티놀의 불안정성 문제 및 분산 능력을 크게 향상시킬 수 있다(7 및 8 참조).Retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble nanoparticles prepared by the present invention are reduced in size by a lyophilization process (see FIG. 6). It is also possible to greatly improve the instability problem and dispersion ability of retinol over time (see 7 and 8).
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by Examples and Experimental Examples. However, the following examples are merely to illustrate the present invention, but the content of the present invention is not limited by the following examples.
<< 실시예Example 1> 레티놀이 1> Retinol 봉입된Enclosed 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 나노입자의 제조 Preparation of Water-soluble Chitosan Nanoparticles
분자량이 1,000~50,000 Da인 저분자량 수용성 키토산 50 mg을 증류수에 용해시켜 저분자량 수용성 키토산 용액을 준비하고, 산화방지제로서 토코페롤(시그마 제품) 및 BHT(시그마 제품) 10 mg을 에탄올 1 ml에 각각 용해시켜 항산화제 용액을 준비하였다. 이후, 상기 제조된 토코페롤 및 BHT 항산화제 용액을 레티놀(시그마 제품) 2 mg에 각각 0.2 ml를 적하하는 방법으로 용해시켜 레티놀을 용해시켰다. 상기 제조된 저분자량 수용성 키토산 용액을 교반시키면서 상기 제조된 레티놀 용액을 서서히 적하한 후, 30분 동안 더 교반시켜 레티놀이 저분자량 수용성 키토산 나노입자 내부에 봉입되도록 하였다. 교반이 끝난 후, 상기 반응용액을 동결건조기(77510-03, LABCONCO사, USA)에 24-48시간 동안 동결건조시킨 후, 고체형태의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 얻었다(47mg, 94%).50 mg of low molecular weight water soluble chitosan having a molecular weight of 1,000 to 50,000 Da was dissolved in distilled water to prepare a low molecular weight water soluble chitosan solution, and 10 mg of tocopherol (Sigma) and BHT (Sigma) was dissolved in 1 ml of ethanol, respectively. To prepare an antioxidant solution. Thereafter, the prepared tocopherol and BHT antioxidant solutions were dissolved by dropping 0.2 ml of 2 mg of retinol (Sigma), respectively, to dissolve retinol. The prepared retinol solution was slowly added dropwise while stirring the prepared low molecular weight water soluble chitosan solution, followed by further stirring for 30 minutes to encapsulate the retinol inside the low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles. After stirring, the reaction solution was freeze-dried for 24 to 48 hours in a freeze dryer (77510-03, LABCONCO, USA), to obtain a low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated in solid form (47mg, 94%).
<< 실시예Example 2~4> 레티놀이 2 ~ 4> Retinol 봉입된Enclosed 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 나노입자의 제조 Preparation of Water-soluble Chitosan Nanoparticles
*레티놀(시그마 제품)을 각각 5, 10, 20 mg으로 준비하여 레티놀 용액을 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 얻었다.* Retinol (Sigma) was prepared in 5, 10 and 20 mg respectively to obtain a low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles retinol-encapsulated in the same manner as in Example 1 except for preparing a retinol solution.
< 실험예 1> 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태, 크기 및 표면 전압 측정 <Experimental Example 1> The encapsulated retinol Measurement of Morphology, Size and Surface Voltage of Low Molecular Weight Water Soluble Chitosan Nanoparticles
상기 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태, 크기 및 표면 전압을 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다. The following experiments were performed to determine the morphology, size and surface voltage of the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles retinol-encapsulated prepared in Examples 1 to 4 above.
먼저, 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태를 TEM(Transmission Electron Microscope; JEOL JEM-2000 FX-II)을 이용하여 관찰하 였다. 0.01%의 PTA(phosphotungstic acid)에 분산시킨 후 이 용액 한 방울을 탄소 필름이 코팅된 동 그리드(copper grid) 위에 떨어뜨리고 실온에서 건조하였다. First, the morphology of the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated in retinol was observed using a transmission electron microscope (TEEM) (Jeol JEM-2000 FX-II). After dispersion in 0.01% phosphotungstic acid (PTA), a drop of this solution was dropped onto a copper film coated copper grid and dried at room temperature.
다음으로, 동결건조된 레티놀이 봉입된 키토산 나노입자를 1mg/ml의 농도로 증류수에 분산시킨 후, 광산란(Dynamic Light scattering)에 의한ELS-8000(Otsuka, Electronics사, Japan)를 이용하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다. Next, the lyophilized retinol-encapsulated chitosan nanoparticles were dispersed in distilled water at a concentration of 1 mg / ml, and then the nanoparticles were prepared using ELS-8000 (Otsuka, Electronics, Japan) by light scattering (Dynamic Light scattering). The size of the particles was measured.
다음으로, 동결건조된 레티놀이 봉입된 키토산 나노입자를 1mg/ml의 농도로 증류수에 분산시킨 후, ELS-8000(Otsuka, Electronics사, Japan)을 이용하여 상기 나노입자의 표면 전압을 측정하였다.Next, the lyophilized retinol-encapsulated chitosan nanoparticles were dispersed in distilled water at a concentration of 1 mg / ml, and the surface voltage of the nanoparticles was measured using ELS-8000 (Otsuka, Electronics, Japan).
상기 측정 결과를 하기 표 1에 나타내었다.The measurement results are shown in Table 1 below.
표 1 및 도 1a 에 나타난 바와 같이, 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 크기는 평균 141.1 nm로 측정되었으며, 레티놀이 봉입된 양에 따라 50 ~250 nm의 값을 나타냄을 알 수 있다. 이로부터, 봉입되는 레티놀의 양을 조절하여 원하는 크기의 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 얻을 수 있음을 알 수 있다.As shown in Table 1 and Figure 1a, the size of the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles was measured to average 141.1 nm, it can be seen that the value of 50 ~ 250 nm depending on the amount of retinol encapsulated. From this, it can be seen that by adjusting the amount of retinol encapsulated to obtain a low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of a desired size.
또한, 제타 전위는 (+) 50~75 mV 범위의 값을 갖는 것으로 나타났다. 나노입자 표면이 (+)값을 나타내는 것으로 보아, 상기 나노입자의 표면을 키토산이 둘러싸고 있음을 알 수 있다In addition, the zeta potential was found to have a value in the range of (+) 50-75 mV. It can be seen that chitosan surrounds the surface of the nanoparticles as the surface of the nanoparticles exhibits a positive value.
또한, 도 1b의 TEM 사진 결과로부터, 본 발명의 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 형태는 구형의 형태를 갖는 것을 알 수 있다.In addition, it can be seen from the TEM photograph results of FIG. 1B that the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the present invention have a spherical shape.
<< 실험예Experimental Example 2> 레티놀이 2> Retinol 봉입된Enclosed 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 나노입자의 FT-IR 측정 FT-IR Measurement of Water Soluble Chitosan Nanoparticles
실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 아민기 및 하이드록시기 간의 봉입 여부를 알아보기 위해 FT-IR 분광 분석기(Shimadzu사, FR-IR 8700)를 이용하여 측정하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.In order to determine whether the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles prepared in Examples 1 to 4 were encapsulated between amine and hydroxy groups, they were measured using an FT-IR spectrometer (Shimadzu, FR-IR 8700). The results are shown in FIG. 2.
도 2를 참조하면, 3750 cm-1 부근에서 유리 하이드록시기(OH) 피크가 레티놀의 봉입량이 증가함에 따라 함께 증가하는 것을 볼 수 있다. 이로부터, 저분자량 수용성 키토산의 아민기와 레티놀의 하이드록시기 간에 수소결합이 레티놀의 봉입량에 따라 증가함을 알 수 있다. Referring to FIG. 2, it can be seen that the free hydroxy group (OH) peak increases with increasing amount of retinol in the vicinity of 3750 cm −1 . From this, it can be seen that the hydrogen bond increases between the amine group of the low molecular weight water-soluble chitosan and the hydroxyl group of the retinol with increasing amount of retinol.
또한, 레티놀의 특성 피크인 1720 cm-1 부근의 피크도 레티놀의 봉입량이 증가함에 따라 함께 증가하는 것을 볼 수 있다. 이로부터, 레티놀이 저분자량 수용성 키토산 나노입자 내부로 봉입됨을 알 수 있다.In addition, it can be seen that the peak around 1720 cm −1, which is a characteristic peak of retinol, also increases as the amount of retinol inclusion increases. From this, it can be seen that retinol is encapsulated inside the low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles.
<< 실험예Experimental Example 3> 레티놀이 3> Retinol 봉입된Enclosed 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 나노입자의 Of water-soluble chitosan nanoparticles 1One H NMR 측정H NMR measurement
상기 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 1H NMR 스펙트럼을 얻기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. The following experiments were performed to obtain 1 H NMR spectra of the retinol-encapsulated low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles prepared in Examples 1 to 4.
먼저, 친수성 물질인 저분자량 수용성 키토산을 0.5~1 mg/ml의 농도로D2O에 용해하여 298 K에서 1H NMR 분석기(AVANCE 400(400MHz), Bruker사, Germany)로 스펙트럼을 측정하였다.First, a low molecular weight water-soluble chitosan, a hydrophilic substance, was dissolved in D 2 O at a concentration of 0.5-1 mg / ml, and the spectrum was measured by a 1 H NMR analyzer (AVANCE 400 (400 MHz), Bruker, Germany) at 298 K.
다음으로, 소수성 물질인 레티놀을 0.5~1 mg/ml의 농도로 유기용매인 DMSO에 용해하여 298 K에서 1H NMR 스펙트럼을 측정하였다.Next, retinol, a hydrophobic substance, was dissolved in DMSO, an organic solvent, at a concentration of 0.5-1 mg / ml, and the 1 H NMR spectrum was measured at 298 K.
다음으로, 실시예 3에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 0.5~1 mg/ml의 농도로 D2O에 용해하여 298 K에서 1H NMR 스펙트럼을 측정하였다.Next, the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles prepared in Example 3 were dissolved in D 2 O at a concentration of 0.5-1 mg / ml, and the 1 H NMR spectrum was measured at 298 K.
다음으로, 실시예 3에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 0.5~1 mg/ml의 농도로 D2O : DMSO = 1:4 (v/v)로 혼합하여 298 K에서 1H NMR 스펙트럼을 측정하였다. Next,
상기 측정 결과를 순서대로 도 3의 a~d에 나타내었다.The measurement results are shown in Figs. 3A to 3D in order.
도 3a에 나타난 바와 같이, 친수성 물질인 저분자량 수용성 키토산은 D2O에 용해된 결과, 5.0~3.0 ppm 사이에서 깨끗한 저분자량 수용성 키토산 피크를 나타냄을 확인하였다.As shown in Figure 3a, the low molecular weight water-soluble chitosan hydrophilic material was dissolved in D 2 O, it was confirmed that a clear low molecular weight water-soluble chitosan peak between 5.0 ~ 3.0 ppm.
도 3b에 나타난 바와 같이, 소수성 물질인 레티놀은 유기용매인 DMSO에 용해된 결과, 2.0~1.0 ppm 사이에서 깨끗한 레티놀 피크를 나타냄을 확인하였다.As shown in Figure 3b, the hydrophobic retinol was dissolved in DMSO as an organic solvent, it was confirmed that the clear retinol peak between 2.0 ~ 1.0 ppm.
도 3c에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 D2O에 녹여 측정한 NMR 스펙트럼에서는 도 1a에서 나타난 피크와 같은 저분자량 수용성 키토산 피크만 확인할 수 있었다. 이로부터, 저분자량 수용성 키토산이 레티놀을 Core-Shell 형태로 감싸 안고 있음을 알 수 있다.As shown in FIG. 3c, in the NMR spectrum measured by dissolving the retinol-encapsulated low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles prepared in Example 3 in D 2 O, only the low molecular weight water soluble chitosan peaks shown in FIG. . From this, it can be seen that the low molecular weight water-soluble chitosan surrounds the retinol in the form of Core-Shell.
도 3d에 나타난 바와 같이, 저분자량 수용성 키토산 피크와 레티놀 피크를 동시에 확인할 수 있었다. 변성되지 않는 레티놀(도 3b)과 똑같은 레티놀 피크를 확인함으로써, 레티놀이 저분자량 수용성 키토산에 봉입될 때 어떠한 변화도 생기지 않고 봉입되었음을 알 수 있다.As shown in FIG. 3D, the low molecular weight water soluble chitosan peak and the retinol peak could be identified simultaneously. By identifying the same retinol peak as undenatured retinol (FIG. 3B), it can be seen that retinol was encapsulated without any change when encapsulated in low molecular weight water soluble chitosan.
<< 실험예Experimental Example 4> 레티놀이 4> Retinol 봉입된Enclosed 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 나노입자의 Of water-soluble chitosan nanoparticles XRDXRD 측정 Measure
순수한 레티놀, 저분자량 수용성 키토산, 레티놀과 저분자량 수용성 키토산의 10:50(v/v) 비율에 의한 물리적 혼합물 및 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자를 XRD 분석기(제작사 및 제원을 기재하여 주시기 바랍니다)를 이용하여 X-선 회절 스펙트럼을 얻고, 그 결과를 도 4의 a~d에 순서대로 나타내었다. XRD spectroscopy of the retinol-encapsulated low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles prepared in Examples 1-4 and the physical mixture of pure retinol, low molecular weight water soluble chitosan, 10:50 (v / v) ratio of retinol and low molecular weight water soluble chitosan The X-ray diffraction spectrum was obtained using (please describe the manufacturer and specification), and the results are shown in order in Figs.
도 4에 나타난 바와 같이, 레티놀은 강한 결정성을 보이는 반면(도 4a), 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자(도 4d)는 저분자량 수용성 키토산(도 4c)에 나타난 바와 같이 결정성을 나타내지 않았다. 이는 NMR결과를 뒷받침하는 결과로 레티놀이 저분자량 수용성 키토산에 봉입되었기 때문에 결정성이 나타나지 않았다. 이는 도 4b에 나타난 바와 같이, 레티놀과 저분자량 수용성 키토산 나노입자와의 단순한 물리적 혼합물인 경우에도 레티놀이 강한 결정성을 나타내는 것과 대조를 이룸을 알 수 있다.As shown in FIG. 4, the retinol shows strong crystallinity (FIG. 4A), while the low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles (FIG. 4D) retinol-encapsulated prepared in Examples 1-4 (FIG. 4C) were shown As shown in), it did not show crystallinity. This was supported by the NMR results and showed no crystallinity because retinol was encapsulated in low molecular weight water-soluble chitosan. This can be seen in contrast to the strong crystallinity of retinol even in the simple physical mixture of retinol and low molecular weight water soluble chitosan nanoparticles, as shown in FIG. 4B.
<< 실험예Experimental Example 5> 레티놀의 용해도 측정 5> Determination of the solubility of retinol
불수용성인 레티놀이 본 발명에 의해 저분자량 수용성 키토산 나노입자에 봉입되는 경우 용해도의 변화 여부를 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다. Insoluble water retinol was carried out the following experiment to determine the change in solubility when encapsulated in low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles by the present invention.
키토산 용액을 10, 7, 3, 1, 0.7, 0.5, 0.1, 0.07, 0.03 및 0.01 ㎎/ml 농도로 준비하고 여기에 파우더 형태의 레티놀을 키토산 용액에 떨어뜨리고, shaking incubater에서 1일 및 3일 동안 흔들어 준 후, UV spectrophotometer(UV-1610, shimadzu사, Japan)를 이용하여 레티놀의 농도를 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.Prepare chitosan solutions at concentrations of 10, 7, 3, 1, 0.7, 0.5, 0.1, 0.07, 0.03 and 0.01 mg / ml, add powdered retinol to chitosan solution, and shake incubater for 1 and 3 days After shaking for a while, the concentration of retinol was measured using a UV spectrophotometer (UV-1610, shimadzu, Japan), and the results are shown in FIG. 5.
도 5에 나타난 바와 같이, 3일 경과 후의 레티놀의 용해도가 전체적으로 1일 경과 후의 레티놀의 용해도 측정값에 비하여 증가하였음을 알 수 있다. 또한, 레티놀의 용해도는 저분자량 수용성 키토산의 양이 증가함에 따라 함께 증가하여 최대 28 ㎍/ml까지 증가함을 알 수 있다. 이러한 용해도 값은 일반적으로 레티놀의 수용액 상태에서의 용해도가 0.06 ㎍/ml인 것과 비교할 때 무려 460 배 이상 증가한 값으로서, 본 발명에 의한 레티놀의 용해도 상승 효과가 매우 우수함을 알 수 있다. As shown in FIG. 5, it can be seen that the solubility of retinol after 3 days has been increased as compared with the measured value of solubility of retinol after 1 day as a whole. In addition, it can be seen that the solubility of retinol increases with increasing amount of low molecular weight water soluble chitosan, up to 28 μg / ml. This solubility value is a value that is increased by 460 times or more when compared with the solubility of 0.06 μg / ml in the aqueous solution of retinol, and it can be seen that the effect of increasing the solubility of retinol according to the present invention is very excellent.
<< 실험예Experimental Example 5> 레티놀이 5> Retinol 봉입된Enclosed 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산의 안정성 시험 Stability Test of Water Soluble Chitosan
실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산의 안정성을 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다.In order to determine the stability of the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan prepared in Examples 1 to 4, the following experiment was performed.
먼저, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자 용액에 대하여 동결건조를 수행하기 전의 입자 크기와 동결건조 후의 고체 형태를 증류수에 재분산 한 후 입자크기를 ELS-8000을 이용하여 측정 비교하였다. First, for the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticle solution prepared in Examples 1 to 4, the particle size before performing lyophilization and the solid form after lyophilization are redispersed in distilled water and then the particle size is ELS-8000. The measurements were compared using.
다음으로, 동결 건조 후 재분산시킨 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 크기를 1일, 1주, 1, 2, 3개월 간격으로 ELS-8000을 이용하여 측정함으로써 안정성 여부를 확인하였다.Next, the size of the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles prepared in Examples 1 to 4 after freeze-drying was redispersed using ELS-8000 at intervals of 1 day, 1 week, 1, 2, and 3 months. The stability was confirmed by measuring.
다음으로, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 분산 능력을 레티놀 분말과 비교하기 위해, 동결건조 후 3일이 경과한 실시예 1~4의 나노입자와 레티놀 분말을 증류수에 재분산시켰다.Next, in order to compare the dispersibility of the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles prepared in Examples 1 to 4 with the retinol powder, the nanoparticles and retinol of Examples 1 to 4 after 3 days of freeze-drying The powder was redispersed in distilled water.
상기 실험 결과를 도 6~8에 순서대로 나타내었다.The experimental results are shown in order in Figures 6-8.
도 6에 나타난 바와 같이, 동결건조 전의 입자의 크기 및 분포는 최소 약 80 nm에서 최대 약 350 nm를 나타낸 반면, 동결 건조 후 재분산시킨 입자의 크기 및 분포는 최소 약 60 nm에서 최대 약 260 nm로 나타났다. 이로부터, 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 동결건조과정에 의해 안정성이 향상되는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 6, the size and distribution of particles before lyophilization showed a minimum of about 80 nm and a maximum of about 350 nm, while the size and distribution of redispersed particles after freeze-drying ranged from a minimum of about 60 nm to a maximum of about 260 nm. Appeared. From this, it can be seen that the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the present invention have improved stability by a lyophilization process.
도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자의 크기는 3개월이 경과한 후에도 입자의 크기 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 시간의 경과에 따른 레티놀의 불안정성을 개선할 수 있음을 알 수 있다.As shown in Figure 7, the size of the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles retinol-encapsulated prepared in Examples 1 to 4 was found to have almost no change in the size of the particles even after 3 months. Therefore, it can be seen that the retinol-encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the present invention can improve instability of retinol over time.
도 8에 나타난 바와 같이, 소수성을 띤 레티놀 분말은 증류수에 거의 분산 되지 않으나, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 증류수에 현저하게 재분산되는 것으로 나타났다. 이로부터, 소수성을 띤 레티놀의 분산 능력 본 발명의 저분자량 수용성 키토산 나노입자에 의해 크게 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.As shown in FIG. 8, the hydrophobic retinol powder was hardly dispersed in distilled water, but the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated in the retinol prepared in Examples 1 to 4 were re-dispersed remarkably in distilled water. From this, it can be seen that the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the present invention can greatly improve the dispersion ability of hydrophobic retinol.
<< 실험예Experimental Example 6> 레티놀의 봉입 효율 측정 6> Measurement of encapsulation efficiency of retinol
실시예 1~4에서 제조된 레티놀의 봉입된 저분자량 수용성 키토산의 봉입 효율을 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다.In order to determine the encapsulation efficiency of the encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan prepared in Examples 1 to 4, the following experiment was performed.
먼저, 순수한 레티놀의 검량하기 위해 레티놀을 에탄올에 0.125 mg/㎖의 농도로 녹이고 이를 1/2씩 희석해 가면서 HPLC(Spectra Physics사(미국) 제품, P4000) 분석을 수행하였다. 상기 HPLC는 이동상으로 95% 메탄올(메탄올:물=95:5(v/v))을 사용하였으며, 유속은 1.5 ㎖/분으로 조절하였다. HPLC 수행 온도는 25 ℃이었으며, UV 검출기 흡수파장은 325 nm에서 측정하였다.First, in order to calibrate pure retinol, retinol was dissolved in ethanol at a concentration of 0.125 mg / ml, and diluted 1/2 by dilution to perform HPLC (Spectra Physics (US), P4000) analysis. The HPLC used 95% methanol (methanol: water = 95: 5 (v / v)) as the mobile phase and the flow rate was adjusted to 1.5 mL / min. The HPLC run temperature was 25 ° C. and the UV detector absorption wavelength was measured at 325 nm.
다음으로, 실시예 1~4에서 제조된 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 탄올을 첨가하여 상기 나노입자를 완전히 녹였다. 그 후, 상기 나노입자가 녹아있는 용액으로부터 각각 0.1 ㎖를 취하여 0.9 ㎖의 에탄올로 희석하고 상기 HPLC의 수행조건과 동일한 조건하에서 HPLC 분석을 수행하였다. 상기 분석 결과는 하기의 표 2 및 도 9에 나타내었다.Next, retinol prepared in Examples 1 to 4 was added to the low molecular weight water-soluble chitosan ethanol encapsulated to completely dissolve the nanoparticles. Thereafter, 0.1 ml of each of the nanoparticles was dissolved, diluted with 0.9 ml of ethanol, and HPLC analysis was performed under the same conditions as the HPLC. The analysis results are shown in Table 2 below and FIG. 9.
먼저, 도 9의 (a)에 나타낸 바와 같이, 최초 순수한 레티놀의 농도 0.125 mg/㎖를 1/2씩 희석해 가면서 측정된 용출시간은 4.3 분인 것을 알 수 있다. 도 9의 (a)의 그래프 내의 또 다른 그래프는 순수한 레티놀의 농도를 1/2씩 희석한 것을 나타내고 있다.First, as shown in (a) of FIG. 9, the elution time measured by diluting the concentration of 0.125 mg / ml of the first pure retinol by 1/2 can be found to be 4.3 minutes. Another graph in the graph of Fig. 9 (a) shows diluting the concentration of pure retinol by 1/2.
다음으로, 도 9의 (b)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1~4의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자가 레티놀의 용출시간인 4.3 분에서 저분자량 수용성 키토산 나노입자/레티놀의 중량비에 반비례하는 경향을 나타내면서 검출되는 것을 알 수 있다. Next, as shown in (b) of Figure 9, the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of the retinol-enclosed low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles of Examples 1 to 4 according to the present invention at 4.3 minutes, the elution time of the retinol / It can be seen that it is detected while showing a tendency in inverse proportion to the weight ratio of retinol.
또한, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1~4의 레티놀이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자는 최저 63%에서 최고 77.3%의 봉입 효율로 레티놀 분자를 봉입하고 있음을 알 수 있다.In addition, as shown in Table 2, it can be seen that the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles encapsulated in the retinol of Examples 1 to 4 according to the present invention encapsulate the retinol molecule with an encapsulation efficiency of at least 63% and at most 77.3%. have.
본 발명에 의하면, 새로운 기능성 물질로 주목 받고 있는 레티놀을 산화 또는 변성 등이 없이 간단한 공정에 의해 본래 형태대로 안전하게 저분자량 수용성 키토산에 봉입시킬 수 있다. 또한, 표피층을 투과할 수 있는 물질의 제한성 및 흡수성의 문제를 나노기술을 이용하여 해결하였으며, 레티놀을 담지하는 저분자량 수용성 키토산의 무독성 및 생분해성은 인체에 아무런 부작용이 없을 뿐만 아니라, 담지된 레티놀을 서서히 방출함으로써 레티놀의 효과를 높이는 데 유용하게 사용할 수 있다. According to the present invention, retinol, which is attracting attention as a new functional substance, can be safely and safely encapsulated in a low molecular weight water-soluble chitosan in its original form by a simple process without oxidation or denaturation. In addition, the problem of limitation and absorption of the material that can penetrate the epidermal layer was solved using nanotechnology, and the non-toxic and biodegradability of the low molecular weight water-soluble chitosan carrying retinol had no side effects on the human body, and the supported retinol Slow release can be useful for increasing the effectiveness of retinol.
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