KR20070038738A

KR20070038738A - 성장인자가 함유된 하이드로젤의 조직 공학적 이용과 이의체내 주입형 물질로의 이용방법

Info

Publication number: KR20070038738A
Application number: KR1020050093990A
Authority: KR
Inventors: 차광렬
Original assignee: (주) 차바이오텍
Priority date: 2005-10-06
Filing date: 2005-10-06
Publication date: 2007-04-11

Abstract

본 발명은 성장인자가 함유된 하이드로젤의 조직공학적응용으로, 더욱 구체적으로는 온도민감성인 하이드로젤이 성장인자인 섬유아세포성장인자(bFGF)를 함유하여 초대배양세포 및 세포주의 분화유도를 유발하여 조직재건 및 재생을 위한 주입형물질로의 이용과 줄기세포를 하이드로젤과 혼합하여 성장인자에 의한 분화된 세포를 획득하는 기질로 이용될 수 있다.

마이크로스피어, 성장인자, 나노파티클, 체내주입형물질

Description

성장인자가 함유된 하이드로젤의 조직 공학적 이용과 이의 체내 주입형 물질로의 이용방법 {The use of growth factor containing hydrogel for tissue engineering and the using method for internal injecion substance thereby.}

도 1은 PC12 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자가 함유된 하이드로젤과 성장인자가 없는 하이드로젤에서 현미경(× 400)으로 관찰한 도이고,

도 2는 PC12 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자의 농도에 따른 β-3 튜불린(tubulin)의 발현을 공집점레이저현미경으로 관찰한 도이며,

젤이란 물리적 혹은 화학적으로 결합되어 구성요소들이 삼차원형 망상구조를 의미하는데 특히 수용성 또는 수팽윤성 고분자 시스템에서 온도와 pH에 의하여 조절되는 반응은 수소결합과 소수성 상호작용과 삼투압, 이온의 종류와 이온화 정도에 크게 영향을 받는다.(Tanaka et al., Macromolecules, 25, pp 1516-1523, 1992)

온도에 의한 젤화는 고분자의 분자량과 용해 상수에 의존하여 농도에 의하여 불용성으로 변하는 임계온도가 조절될 수 있음이 보고되었다.(Borchard Chemistry and Tehcnology of Water-soluble polymers, Plenum Press, pp 113-124, 1983) 특히 소수성이나 친수성을 지닌 단량체와의 공중합체에 관한 연구는 분자량뿐 아니라 온도에 의한 불용성되는 임계온도가 pH에 민감성을 지닌 단량체와의 공중합체를 만들어 조절할 수 있다.

이 중에 수팽윤성 고분자(hydrogel)는 물속 또는 수증기와 같은 수성환경에 노출되었을 때, 물을 흡수하나 물에 용해되지 않는 고분자를 말한다. 물의 함유량에 따라 물질전달계수(확산도) 조절이 용이하고, 수팽윤 상태에서 유연한 기계적 성질을 나타낸다. 수팽윤성 고분자의 응용범위로는 약물전달체계, 콘택트렌즈. 생체 조직적 합성재료 등 의료용 재료로 사용이 가능할 뿐만 아니라, 기존의 재료표면에 윤활성을 부여하고 이물질 부착을 방지하기 위한 표면도포(antifouling surface)등 산업용으로 응용이 가능하다. 이러한 하이드로젤은 화학적 하이드로젤과 물리적 하이드로젤로 나뉘어 진다.(윤주표 등, Polymer (Korea), 27, pp. 159-166, 2003)

수팽윤성 고분자는 수용성 고분자의 화학적 가교에 의하여 만들어지는 예가 대부분이며, 수팽윤도는 고분자쇄와 물과의 상호작용과 가교에 의한 고분자쇄의 고무탄성도의 정도에 의하여 결정된다. 장점으로는 고분자의 화학적 조성변화 또는 가교도의 변화로 수팽윤도는 쉽게 조절되는 점이며 단점으로는 건조된 상태에서 유리전이온도가 주변온도보다 높아 충격에 약하며, 구부림 등의 변형에 쉽게 파손되고, 합성시 일단 특정 모양이 형성되면 열에 의한 가공이 되지 않고, 용매에 용해 되지 않으며, 수팽윤도가 증가함에 따라 수팽윤된 고분자의 물리적 성질은 급격히 감소되고, 수팽윤도가 적은 고분자는 탄성도를 잃게 된다. 이러한 특성으로 말미암아 실질적인 응용 시에는 가공성이 제한되며, 합성시 사용된 용매 또는 반응되지 않은 화합물 추출 등 복잡한 준비 단계 등을 거쳐야 한다. 화학적 가교에 의한 수팽윤성 고분자의 제한된 가공성과 취약한 물리적 물성을 극복하기 위한 방안으로 제안된 물리적 가교는 화학적 가교 대신 물과 상호작용하지 않는 고분자의 일부분이 서로 모여 소수성 결합, 고분자 나선 구조와 같은 특정구조, 또는 고분자 결정 등으로 이루어진다.

상품화된 물리적 가교에 의한 하이드로젤은 친수성 폴리우레탄을 들 수 있다. 친수성 폴리우레탄은 열가공성이 우수하면 조성에 따라 휘발성 유기용매에 잘 용해되며, 건조 또는 수팽윤된 상태에 탄성도가 뛰어나고, 친수성 폴리우레탄으로 열가공법과 고분자용액 도포법 등으로 특정 형태 제조가 용이하며, 일반적으로 친수성 폴리우레탄은 대체로 비점이 높은 용매에 잘 용해된다. 제품 제조 후에는 고분자 건조에 많은 시간이 소요되고 건조된 후에도 용매 잔류량이 높다는 단점을 갖고 있다. 잔류 유기용매는 인체에 대한 독성을 나타내므로 비점이 높은 유기용매는 의료용 하이드로젤 고분자 제품 생산시에는 많은 어려움이 수반된다. 조성에 따라 테트라히드로푸란과 같은 휘발성 용매에 용해될 수는 있으나 이러한 용매 역시 인체 독성을 나타낸다. 의료용 또는 약제학용 수팽윤성 고분자 타성체 제조 시에는 용매 회수를 위한 설비 투자, 환경 오염 등 많은 문제를 야기시킬 수 있을 뿐 아니라 최종 사용자가 직접 고분자 용액을 사용할 수 없다. 부분적으로 가수분해된 폴 리아크릴로니트릴의 변형체 니트릴은 니트릴 그룹의 극성으로 말미암은 상호작용으로 유기용매에 잘 용해되지 않는다. 이 고분자는 일반적인 고분자 열가공법에 의하여 가공될 수 있으며, 높은 수팽윤 상태에서도 뛰어난 탄성을 나타낸다. 반면에 건조된 상태에서는 높은 유리전이 온도로 말미암아 물성은 취약한 편이다. 친수성 고분자블록과 생분해성 소수성 고분자블록으로 이루어진 3중 공중합체, 아령(dumbbel)형 다중공중합체 형태를 가지고 있으며, 알려진 블록공중합체는 기계적 물성이 약하여 미세구 제조 등에만 사용될 수 있으며 탄성체가 아니다. 하지만 약물전달 시스템에 사용할 하이드로젤의 제조는 에탄올, 물과 에탄올 혼합용매와 같은 무독성 용매에 용해성을 가져야 하며, 건조 또는 수팽윤 상태에서 탄성체를 이루며, 분해성 또는 비분해성, 열가소성, 선택된 약물 또는 첨가제와 친화성을 가져야 한다. 분해속도가 조절될 수 있는 분해성 고분자는 건조된 상태에서 보관 가능한 형태 (예, 미세구)의 약물전달 제제로 응용이 가능하다. (Kim et al., J. Appl. Polymer Sci., 46, p2147, 1992)

자극 민감성 폴리머(stimuli-sensitive polymer)라고 불리는 지능형 하이드로젤은, 온도, pH, 이온화세기, 자외선 등의 자극에 대해 액체에서 젤 상태로 바뀐다. 이런 특성 때문에 의사들은 약물이 들어있는 폴리머 용액을 신체의 특정 부분에 주입할 수 있으며, 주입된 폴리머는 체온으로 인해 즉시 젤로 변한다. 가장 유망한 치료 응용 분야는, 의학적인 방사능 원소나 화학치료 약물을 수술하기 힘든 종양 조직에 투여하는 것이다.

최근에는 줄기세포를 사용한 생체조직공학연구가 활발히 진행되고 있다. 생 체조직재생용 소재를 이용하여 손상조직의 재건을 성공적으로 수행하기 위해서는 조직세포의 고유한 분화 기능을 유지하는 것이 중요하다. 대부분의 하이드로젤은 단순히 삼차원 구조의 조직 형성을 유도하는 틀을 제공하는데 역할을 두고 있다.(Kroupova et al., J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 온라인 publish, 2005)

또한, 최근 연구의 동향은 조직세포의 분화를 유도, 증진하는 여러 가지 생리활성물질을 자극민감성 하이드로젤로부터 서방형으로 방출되도록 하거나, 하이드로젤과 혼합하여 세포의 점착과 분화가 이루어지는데 초점이 모아지고 있다. (Hwang et al., Stem Cells, 온라인 publish, 2005)

이에 본 발명자들은 생리활성물질을 하이드로젤에 함유하여 초대배양 세포나 세포주(PC12)를 원활히 점착시키고, 배양액 존재 하에서 하이드로젤에서 분비되는 생리활성물질에 의하여 여러 종류의 세포의 분화를 유도하여 조직재생을 유도할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 생리활성물질인 섬유아세포성장인자(bFGF)를 함유한 하이드로젤을 이용하여 초대배양세포 및 줄기세포의 분화유도를 통한 조직의 재건 및 재생을 원활히 하는 것과 하이드로젤에서 방출되는 생리활성물질에 의하여 줄기세포의 분화를 유도하여 분화가 유도되는 세포를 제공하는 것이다.

본 발명은 조직재건, 조직재생, 인공혈관 재생 및 줄기세포 분화를 위한 섬유아세포성장인자(bFGF)를 함유한 온도민감성 하이드로젤을 제공한다.

본원에서 정의되는 성장인자는 섬유아세포성장인자(bFGF)를 포함한다.

상기 성장인자가 0 내지 10 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 1㎍/㎖의 농도로 하이드로젤에 함유되는 것을 특징으로 하는 온도민감성 하이드로젤을 포함한다.

상기 하이드로젤로는 콜라젠, 파이브로넥틴, 테나신, 바이트로넥틴, 라미닌으로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포외기질을 함유하는 온도민감성 하이드로젤을 제공한다.

하이드로젤을 구성하는 수용성 고분자로 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴산의 알카리 염, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 젤라틴, 히드록시프로필셀루로오스, 히드록시프로필메틸셀루로오스, 메틸셀루로오스등과 같이 수용매에 가용성 또는 팽윤성을 가지는 고분자가 사용될 수 있다.

본 발명을 실시하는데 있어서 유용한 친수성 고분자로는 폴리비닐알콜과 폴리비닐피롤리돈, 무수말레인산/비닐에테르 공중합체, 젤라틴, 알지네이트, 히드록시에틸메타크릴레이트, 카리기난, 히드록시에틸 셀룰로오스, 실리콘 고무, 아가, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 카르복시비닐 공중합체, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아마이드, 폴리히 드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리디옥솔란, 폴리아크릴릭산, 폴리아크릴 아세테이트, 폴리아크릴아마이드, 폴리비닐클로라이드 등의 친수성 고분자중에서 선택된 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.

친수성의 시스템 중에 쉽게 용해될 수 없는 약물 분자에 대해서는, 약물 및 중합체에 대한 보조용매를 첨가할 수 있다. 본 발명에서는 친수성 고분자 혼합물 시스템 내의 약물의 용해도에 따라 레시틴, 레티놀 유도체, 토코페롤, 디프로필렌 글리콜, 트리아세틴, 프로필렌 글리콜, 포화 및 불포화 지방산, 광유, 실리콘액, 부틸벤질 프탈레이트 등과 같은 보조용매가 유용하다.

또한 본 발명은 조직재건, 조직재생, 인공혈관 재생 및 줄기세포 분화를 위한 성장인자를 함유한 온도민감성 하이드로젤을 포함하는 체내 주입형 물질을 제공한다.

상기 성장인자는 섬유아세포성장인자(bFGF)를 포함한다.

상기 성장인자가 0 내지 10 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 1㎍/㎖의 농도로 하이드로젤에 함유되는 것을 특징으로 하는 체내 주입형 물질을 제공한다.

상기 하이드로젤에 콜라젠, 파이브로넥틴, 테나신, 바이트로넥틴, 라미닌으로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포외기질을 함유하는 체내주입형물질을 포함한다.

상기 초대배양 및 줄기세포 배양은 섬유아세포성장인자(FGF)를 0.1~1 ㎍/㎖의 농도로 하이드로젤에 함유되어 각각 2, 3, 5, 7, 10 일까지 수행하는 것이 바람직하며, 상기 성장인자들이 0.01 ㎍/㎖미만으로 하이드로젤에 함유되면, 성장인자의 자극이 약하여 세포의 배양에 영향을 미치지 못하며, 1 ㎍/㎖ 이상이면 1 ㎍/㎖의 농도와 비교할 때 세포가 받는 자극의 변화를 살펴볼 수 없어 바람직하지 않은 농도이다.

또한 본 발명은 벤젠(10wt%)을 용매로, AIBN(azoisobutylronitrile, 7 X 10^-3 mol/mol of monomer)을 개시제로 사용하고, 개시제를 넣기 전에 먼저 약 15분간 건조된 질소로 버블링 작업을 한 후, 40 내지 80℃ 항온조에서 10 내지 20시간 동안 반응하고. 개시제를 넣은 후에도 5 내지 20분간 다시 반응기 안의 잔존 산소를 제거하는 제 1단계;

반응이 끝난 후, 침전되어있는 고분자를 제외한 용액을 제거하고 아세톤/메탄올을 이용하여 온도를 가하면서 고분자를 용해한 후, 디에틸 에테르에 2차례 침전을 시켜서 미반응 단량체를 제거하고, 분자량이 상대적으로 낮은 P(NiPAAm-co-AAc) (98/2 mol%)은 1,4-디옥산(dioxane)(33 wt%)을 용매로, AIBN(7 X 10^-3 mole/mole of monomer)을 개시제로 사용하여 위의 반응과 동일하게 40 내지 80℃ 항온조에서 10 내지 20시간 동안 반응하는 제 2단계;

회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 제거한 후, 아세톤에 녹이고 디에틸 에테르를 이용하여 침전물을 획득하고, P(NiPAAm-co-AAc) (98/2 mol%)의 고분자는 처음 반응과 같이 반응 전에 반응기안의 산소를 제거한 후, 반응온도를 50℃ 내지 60℃의 항온조에서 10 내지 50분간 실시함으로서 전환율을 낮추는 제 3단계;

합성된 모든 고분자를 20 내지 60℃ 진공오븐에서 24시간 이상 건조시킨 후, 분자량 15,000까지를 제거하는 투석과정을 1차 증류수에서 최소한 96시간 병행함으로써 저분자량의 물질을 제거하는 제 4단계;

0.01~1 ㎍/㎖의 성장인자와 온도민감성 하이드로젤을 혼합하는 제 5단계를 포함하는 성장인자가 함유된 온도민감성 하이드로젤을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 성장인자가 함유된 하이드로젤의 조직공학적응용으로, 더욱 구체적으로는 온도민감성인 하이드로젤이 성장인자인 섬유아세포성장인자(bFGF)를 함유하여 초대배양세포 및 세포주의 분화유도를 유발하여 조직재건 및 재생을 위한 주입형 물질로의 이용과 줄기세포를 하이드로젤과 혼합하여 성장인자에 의한 분화된 세포를 획득하는 기질로 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 온도 민감성 하이드로젤의 제조

세포간 기질용 감온성 하이드로젤 합성은 NiPAAm(N-isopropylacrylamide)을 기본으로 높은 분자량(1,000,000 amu)을 목표로 하며 다양한 비율의 AAc(acrylic acid)를 공단량체(comonomer: 010 mole% of NiPAAm)로 합성되었다. 벤젠(10wt%)을 용매로 사용하고, AIBN(azoisobutylronitrile, 7 X 10^-3 mol/mol of monomer)을 개시제로 하여 60℃ 항온조에서 16시간 동안 반응하였다. 반응은 AIBN을 넣기 전에 먼저 약 15분간 건조된 질소로 기포생성(bubbling)작업을 하고 개시제를 넣은 후에도 약 15분간 다시 반응기 안의 잔존 산소를 제거하였다. 반응이 끝난 후에는 침전 되어있는 고분자를 제외한 용액을 제거하고 아세톤/메탄올(90/10 V/V%)을 이용하여 온도를 가하면서 고분자를 용해하였다. 그 후 디에틸에테르에 2차례 침전을 시켜서 미반응 단량체를 제거하였다. 분자량이 상대적으로 낮은 P(NiPAAm-co-AAc) (98/2 mol%)은 1,4-디옥산(dioxane)(33 wt%)을 용매로 사용하고, AIBN(7 X 10^-3 mole/mole of monomer)을 개시제로 하여 위의 반응과 동일하게 60℃ 항온조에서 16시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후에는 회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 제거한 후, 아세톤에 녹이고 디에틸에테르를 이용하여 침전물을 획득하였다. 전환율을 낮춘P(NiPAAm-co-AAc) (98/2 mol%)의 고분자는 처음 반응과 같이 반응 전에 반응기안의 산소를 제거한 후, 반응온도를 50 ℃ 또는 60 ℃의 항온조에서 30분간 실시함으로서 전환율을 낮추었다. 합성된 모든 고분자는 40 ℃ 진공오븐에서 48시간 이상 건조시킨 후에 분자량 15,000까지를 제거하는 투석과정을 1차 증류수에서 최소한 96시간 병행함으로써 저분자량의 물질을 제거하여, 온도민감성을 갖는 하이드로젤을 제조하였다.

실시예 2. 섬유아세포성장인자가 함유된 하이드로젤 제조

각각의 농도(0.01, 0.1, 1 ㎍/㎖)의 성장인자 및 온도민감성 하이드로젤(6 w/v%)과 혼합한 후 세포의 생존율, 증식, 외부 성장(exonal outgrowth)을 관찰하였다

실험예 1. 성장인자에 의한 외부 성장( exonal outgrowth )을 위한 동물실험

PC12 세포주는 콜라젠(collagen)이 코팅된 조직배양용 접시에 RPMI1640 배양액에서 10% 말혈청(horse serum)과 5% 어린 송아지 혈청(fetal calf serum)의 조건하에서 배양하였다.

배양된 PC12 세포를 1× 10⁵ 세포(cells)의 밀도로 상기 실시예 2의 성장인자 및 세포외기질이 함유된 하이드로젤에 분주를 하여 Balb-c 누드 마우스(nude mouse)에 주입한다. 주입한 후 시간 및 농도에 따른 PC12 세포의 외부 생성물(exonal outgrowth)를 관찰한다.

실험예 2. 면역염색( immunostaining )에 의한 외부 생성물( exonal outgrowth )의 관찰

실험군과 대조군을 주입한 Balb-c 누드 마우스(nude mouse)를 3, 5, 7, 10일이 지나 후 희생을 시킨 후 각각의 하이드로젤을 채취한 다음 얼려 마이크로톱(microtop)으로 절편을 만든다.

실험예 3. 1 ㎍/㎖의 농도로 함유된 하이드로젤에서 성장인자의 자극에 의한 PC12 세포의 분화

상기 실험예 1의 신경세포 배양방법에 의한 PC12 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자가 함유된 하이드로젤과 성장인자가 없는 하이드로젤에서 현미경 (400)으로 관찰하였다.

도 1 에서 보는 바와 같이, 세포의 성장율 및 증식은 온도민감성 하이드로젤이 각각 콜라젠과 파이브로넥틴을 함유하고 있는 하이드로젤에서 높게 나타났다((b), (c)). 하지만 온도민감성 하이드로젤에 세포외기질이 함유되지 않은 대조군(a)에서는 상대적으로 낮은 생존율과 증식을 관찰하였다. 이와 같은 결과로 온도민감성 하이드로젤이 증식 및 생존을 하기 위해서는 점착을 할 수 있는 결합부위(binding site)가 필요하다는 것이 증명되었다.

실험예 4. β-3 튜불린(tubulin)을 이용한 신경돌기의 관찰

상기 실험예 1에서 수행한 신경세포의 배양방법에 의한 PC12 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자의 농도에 따른 β-3 튜불린(tubulin)의 발현을 공집점레이저현미경(confocal laser microscope)으로 관찰하였다. 성장인자가 함유되지 않은 마이크로스피어에 점착된 PC12 세포를 비교 예로 하였다.

도 2에서 보는 바와 같이, 섬유아세포성장인자(bFGF)를 이용하여 PC12 세포의 외부 성장(exonal outgrowth)을 관찰하였다. 섬유아세포성장인자(bFGF)의 농도가 증가함에 따라 세포의 분화에 미치는 영향이 큼을 알 수 있다. 0.1 ㎍/㎖(a)의 섬유아세포성장인자(bFGF)가 함유된 하이드로젤에서는 외부 성장(exonal outgrowth)이 거의 보이지 않다가 1 ㎍/ml(b)로 증가하면 외부 성장(exonal outgrowth)이 커짐을 알 수 있다. 또한 섬유아세포성장인자(bFGF)가 10 ㎍/ml(c)로 증가하면 세포의 신경돌기의 크기가 증가함을 알 수 있다. 상기 결과로 신경세포가 분화하는데 있어서 외부 자극이 필수적이며, 이 외부의 자극도 어느 정도 이상이 되지 않으면 세포의 분화를 유도하지 못함을 알 수 있다. 그러나 섬유아세포성장인자(bFGF)이 10 ㎍/ml 이상이 되어도 10 ㎍/ml과 비교를 해보아도 크게 차이가 나지 않음을 관찰하였다.

실험예 5. 시간에 따른 성장인자의 자극에 의한 PC12 세포의 분화

상기 실험예 3에서 수행한 신경세포의 배양방법에 의한 PC12 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자의 자극에 대한 시간에 따른 PC12 세포의 β-3 튜불린(tubulin)의 발현을 공집점레이져현미경으로 관찰하였다.

도 3에서 보는 바와 같이, 10 ㎍/㎖의 농도로 함유된 하이드로젤에서 신경세포의 외부 성장(exonal outgrowth)은 3일(a)이 지난 뒤에 관찰이 되었지만 그 크기는 미비하다고 할 수 있다. 5일이 지난 후 PC12세포에서는 3일 보다 더 긴 외부 성장(exonal outgrowth)이 관찰되었으며, 7일 후 관찰된 PC12세포에서는 외부 성장(exonal outgrowth)이 더 많이 길어짐을 알 수 있다. 10일 후에는 관찰된 신경돌기 중 가장 길게 신경돌기가 나옴을 알 수 있었다. 상기 결과 섬유아세포성장인자(bFGF)가 함유된 PC12 세포가 즉각적인 반응은 보이지 않았지만 시간이 지남에 따라 세포가 성장인자에 반응함을 알 수 있었다.

실험예 6. 초대배양세포인 HUVEC 의 원통형구조

상기 실험예 3에서 수행한 신경세포의 배양방법에 의한 PC12 세포의 분화를 관찰하기 위하여 PC12 세포의 분화를 주사현미경으로 관찰하였다. 성장인자가 함유되지 않은 마이크로스피어에 점착된 PC12 세포를 비교 예로 하였다.

도 4에서 보는 바와 같이, 섬유아세포성장인자(bFGF)가 하이드로젤에 함유됨에 따라 초대배양세포인 HUVEC세포가 원통형(tubular)구조를 이루고 있음을 알 수 있다. 이러한 원통형 구조는 대조군인 섬유아세포성장인자와 혈관내피세포성장인자가 함유되지 않은 하이드로젤에서는 관찰되지 않았다. 이러한 사실은 성장인자들에 의해 초대배양세포인 HUVEC세포가 분화를 일으켰다는 것을 증명하는 것이다.

본 발명은 섬유아세포성장인자가 함유된 온도민감성 하이드로젤에 신경세포를 혼합시킨 후 배양액 존재 하에서 성장인자의 자극에 의한 신경세포의 분화 유도 및 신경돌기를 유도를 관찰하였다. 구체적으로 성장인자의 농도를 조절하여 신경세포로부터 돌기 및 축사 돌기(axon guidance) 형성을 관찰할 수 있었으며, 형성된 돌기 및 축삭돌기로부터 이온채널을 통한 전기적 신호를 관찰할 수 있었다. 상기한 바와 같이, 상기 신경세포 배양방법은 일반 주사기를 통한 주입이 가능하며, 이러한 온도민감성 하이드로젤은 주입형 스캐폴드로서 이용이 가능하다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 2의 하이드로젤...............................10㎎

소디움 메타비설파이트..............................3.0㎎

메틸파라벤.........................................0.8㎎

프로필파라벤.......................................0.1mg

주사용 멸균증류수...................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2㎖로 한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

Claims

조직재건, 조직재생, 인공혈관 재생 및 줄기세포 분화를 위한 성장인자를 함유한 온도민감성 하이드로젤.
제 1항에 있어서, 상기 성장인자는 섬유아세포성장인자(bFGF)를 포함하는 하이드로젤.
제 1항에 있어서, 상기 성장인자가 0.1 내지 1㎍/㎖의 농도로 하이드로젤에 함유되는 것을 특징으로 하는 온도민감성 하이드로젤.
제 1항에 있어서, 하이드로젤로는 콜라젠, 파이브로넥틴, 테나신, 바이트로넥틴, 라미닌으로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포외기질을 함유하는 온도민감성 하이드로젤.
조직재건, 조직재생, 인공혈관 재생 및 줄기세포 분화를 위한 성장인자를 함유한 온도민감성 하이드로젤을 유효성분으로 하는 체내 주입형 물질.
제 5항에 있어서, 상기 성장인자가 섬유아세포성장인자(bFGF)를 포함하는 체내 주입형 물질.
제 5항에 있어서, 상기 성장인자의 농도가 0.1 내지 1㎍/㎖임을 특징으로 하는 체내 주입형 물질.
제 5항에 있어서, 하이드로젤에 콜라젠, 파이브로넥틴, 테나신, 바이트로넥틴, 라미닌으로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포외기질을 함유하는 체내 주입형 물질.