KR20070030815A - Use of mitochondrially targeted antioxidant in the treatment of liver diseases and epithelial cancers - Google Patents
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Abstract
본 발명은 간질환 및/또는 상피암의 치료 및 예방에서 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제, 예컨대 비타민 E의 유도체, 조효소 Q10 또는 글루타민 퍼옥시다아제 유사약(mimetic)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 목적에 맞게 사용하기 위한 산화방지제를 함유하는 약학적 조성물에도 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 예방 및 치료에 유용한 산화방지제를 함유하는 의약 제조에도 관한 것이다. The present invention relates to the use of mitochondrially targeted antioxidants such as derivatives of vitamin E, coenzyme Q 10 or glutamine peroxidase mimetic in the treatment and prevention of liver disease and / or epithelial cancer. The invention also relates to a pharmaceutical composition containing an antioxidant for use for purpose. The invention also relates to the manufacture of a medicament containing an antioxidant useful for such prophylaxis and treatment.
미토콘드리아, 산화방지제, 비타민 E, 조효소 Q10, 글루타치온 퍼옥시다아제, 간질환, 상피암 Mitochondria, antioxidants, vitamin E, coenzyme Q10, glutathione peroxidase, liver disease, epithelial cancer
Description
본 발명은 간질환 및/또는 상피암의 치료 및 예방에서 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제, 예컨대 비타민 E의 유도체, 조효소 Q10 또는 글루타치온 퍼옥시다아제 유사약(mimetic)의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to the use of mitochondrially targeted antioxidants, such as derivatives of vitamin E, coenzyme Q 10 or glutathione peroxidase mimetic, in the treatment and prevention of liver disease and / or epithelial cancer.
간질환의 범주는 경증의 가역적인 지방간에서부터 점진적 만성 간질환까지 다양하며, 간 경화, 간 부전 및 간암과 같은 생명을 위협하는 상태의 발생을 초래할 수 있다. The categories of liver disease range from mild reversible fatty liver to progressive chronic liver disease and can lead to the occurrence of life-threatening conditions such as liver cirrhosis, liver failure and liver cancer.
만성적 간질환의 주요 원인은 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스, 과도한 알코올 섭취 및 비-알코올성 지방간질환(NAFLD)이다. The main causes of chronic liver disease are hepatitis B virus or hepatitis C virus, excessive alcohol intake and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적인 건강 문제이다. 이것은 전세계적으로 간경화 및 간세포 종양(HCC)의 주요 원인이다(Conjeevaram H.S. et. al., 2003, Journal of Hepatology, 38: 90-103). 전 세계적으로 간-관련 이환율 및 사망율의 주요 원인인 C형 간염 바이러스(HCV)는 주요 보건 건강 문제 중의 하나를 나타낸다(Alberti A. and Benvegnu L., Journal of Hepatology 2003, 38: 104-118). HCV 감염은 흔히 만성 간염을 초래하며, 이것은 간경화 및 HCC의 발병과 관련된다(Cyong J. C. et al., 2002, Am J Chin Med, 28: 351-360). Hepatitis B virus (HBV) infection is a worldwide health problem. This is a major cause of cirrhosis and hepatocellular tumors (HCC) worldwide (Conjeevaram H.S. et. Al., 2003, Journal of Hepatology, 38: 90-103). Hepatitis C virus (HCV), the leading cause of liver-related morbidity and mortality worldwide, represents one of the major health and health problems (Alberti A. and Benvegnu L., Journal of Hepatology 2003, 38: 104-118). HCV infection often results in chronic hepatitis, which is associated with cirrhosis and the development of HCC (Cyong J. C. et al., 2002, Am J Chin Med, 28: 351-360).
알코올성 간질환(ALD)은 서양에서 가장 흔한 간경화 원인이며, 현재 10개의 가장 흔한 사망 원인 중의 하나이다. 미국에서, ALD는 약 2백만명 이상 또는 인구의 거의 1%를 감염시키고 있다. 경미한 형태의 ALD의 발병은 실질적으로 더 많을 수 있는데 이는 많은 환자들이 증상을 못 느끼고 있기 때문에 어떠한 의료적 관심을 추구하지 않기 때문일 것이다. ALD의 범위는 상습적인 술꾼이 아닌 경우 흔히 존재하는 지방간 (지방증)에서부터 지방간질환, 쓸개즙정제(간으로부터 담즙 분비 차단됨을 특징), 섬유증 및 궁극적인 간경화(Stewart S.F. and Day C.P, 2003, Journal of Hepatology, 38: 2-13)에 이르기까지 다양하다. 지방간은 절제에 의해 원래 상태로 돌아갈 수 있지만, 꾸준히 음주하는 환자, 특히 지방간질환이 존재하는 환자에서는 섬유증 및 간경화로 진행될 위험 인자이다. Alcoholic liver disease (ALD) is the most common cause of cirrhosis in the West and is currently one of the ten most common causes of death. In the United States, ALD infects more than about 2 million people or nearly 1% of the population. The incidence of milder forms of ALD may be substantially greater because many patients do not seek any medical attention because they do not feel symptoms. The range of ALD ranges from fatty liver (fatosis), which is common in non-traditional drinkers, to fatty liver disease, bile tablets (characterized by bile secretion from the liver), fibrosis and ultimate cirrhosis (Stewart SF and Day CP, 2003, Journal of Hepatology) , 38: 2-13). Fatty liver can return to its original state by resection, but is a risk factor for progression to fibrosis and cirrhosis in patients who are constantly drinking, especially those with fatty liver disease.
비-알코올성 지방간질환(NAFLD)은 광범위한 간 손상, 즉 간단한 지방증에서부터 지방간질환, 쓸개즙정체, 항진성 섬유증 및 간경화에 이르기까지 다양한 것을 지칭한다. 지방간질환(비-알코올성 지방간질환)은 NAFLD의 범위내의 단계로만 표시된다(Anguilo P., 2002, N Engl. J. Med., 346: 1221-1231). 병리학적 특징은 알코올-유도성 간 손상의 병리학적 특징과 유사하지만, 이것은 알코올을 남용하지 않는 환자에서만 생긴다. NAFLD는 부차적인 원인에 기인한 간염에 의하거나 간염에 의하지 않는 지방증과는 구별되어야하는데, 이것은 이들 상태가 분명히 상이한 병원체 및 결과를 갖기 때문이다. 지방간질환(지방증)의 부차적 원인은 영양(예컨대 단백질-칼로리 영양 이상, 기아, 총 비경구적 영양, 급속한 체중 감소, 비만으로 인한 위장관 수술), 약물(예컨대 글루코코르티코이드, 합성 에스트로겐, 아스피린, 칼슘-채널 차단제, 테트라사이클린, 발프로익산, 코카인, 항바이러스제, 피알유리딘, 인터페론 α, 메토트렉세이트, 지도부딘), 대사제 또는 유전제(예컨대 지방이상증, 베타지질단백장애, 웨버-크리스티안 질환, 갈락토오스혈증, 글리코겐 저장 장애, 임신성 급성 지방간) 및 당뇨병, 비만 또는 고지혈증과 같은 기타 원인이 있다(Anguilo P., 2002, N. Engl. J. Med., 346: 1221-1231; MacSween R.N.M. et al., 2002, Pathology of the Liver. Fourth Edition. Churchill Livingstone, Elsevier Science). Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) refers to a wide variety of liver damage, ranging from simple fattyosis to fatty liver disease, cholestasis, antifungal fibrosis and cirrhosis. Fatty liver disease (non-alcoholic fatty liver disease) is expressed only in stages within the range of NAFLD (Anguilo P., 2002, N Engl. J. Med., 346: 1221-1231). Pathological characteristics are similar to those of alcohol-induced liver injury, but this occurs only in patients who do not abuse alcohol. NAFLD should be distinguished from hepatitis due to secondary causes or from steatosis without hepatitis, since these conditions clearly have different pathogens and outcomes. Secondary causes of fatty liver disease (fatosis) include nutrition (eg protein-calorie malnutrition, starvation, total parenteral nutrition, rapid weight loss, gastrointestinal surgery due to obesity), drugs (eg glucocorticoids, synthetic estrogens, aspirin, calcium-channels) Blockers, tetracyclines, valproic acid, cocaine, antiviral agents, pialuridine, interferon α, methotrexate, zidobudine), metabolic or genetic agents (such as dyslipidemia, beta-lipoprotein disorders, Weber-Christian disease, galactosemia, glycogen storage Disorders, gestational acute fatty liver) and other causes such as diabetes, obesity or hyperlipidemia (Anguilo P., 2002, N. Engl. J. Med., 346: 1221-1231; MacSween RNM et al., 2002, Pathology of the Liver.Fourth Edition.Churchill Livingstone, Elsevier Science).
만성 간질환이 유행하고 있음에도 불구하고 이러한 부류의 대부분의 질환에 유효한 요법이 존재하지 않고 있다. Despite the prevalence of chronic liver disease, no effective therapy exists for most diseases of this class.
다수의 선천성 및 후천성 간질환은 간세포 중간체 필라멘트(IF) 세포골격의 변형과 관련된다. 가장 흔한 IF-관련 변형의 하나는 말로리 소체(MB)로서, 이것은 알코올성 지방간질환 및 비-알코올성(AH 및 NASH), 만성 쓸개즙 정체, 구리 중독 및 기타 대사성 간질환뿐만 아니라 일부 간세포 종양(HCC)에서 간세포에서 형성된다. MB는 주성분으로 미스폴딩된(misfolded) 응집 케라틴뿐만 아니라 중첩되지 않은(unfolded) 단백질 반응에 관련된 몇 개의 단백질(HSP27, HSP70, p62 및 유비퀴틴)로 구성된다. 단백질의 미스폴딩은 전형적으로 세포 스트레스, 특히 산화적 스트레스의 상황에서 단백질 변형의 결과로서 생긴다. MB의 화학적 조성은 케라틴이 스트레스 상황에서 미스폴딩에 대한 바람직한 표적이며 또 MB는 미스폴딩된 케라틴에 대한 세포 방어 반응의 결과로 간주될 수 있음을 나타낸다(Denk et al., 2000, J. Hepatol., 32: 689-702). Many congenital and acquired liver diseases are associated with modifications of the hepatocyte intermediate filament (IF) cytoskeleton. One of the most common IF-related modifications is Mallory bodies (MB), which is used in some hepatocellular tumors (HCC) as well as alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic (AH and NASH), chronic cholestasis, copper poisoning and other metabolic liver diseases. It is formed in hepatocytes. MB consists of several proteins (HSP27, HSP70, p62 and ubiquitin) involved in the unfolded protein reaction as well as the misfolded aggregated keratin as the main component. Misfolding of proteins typically occurs as a result of protein modification in the context of cellular stress, particularly oxidative stress. The chemical composition of MB indicates that keratin is a preferred target for misfolding in stress situations and that MB can be considered as a result of a cellular defense response to misfolded keratin (Denk et al., 2000, J. Hepatol. , 32: 689-702).
가장 심각한 비-바이러스성 만성 간질환, 알코올성 지방간질환 및 비-알코올성 지방간질환(ASH 및 NASH)은 높은 빈도로 간경화, 간 부전 및 간암(예컨대 HCC)을 초래한다. ASH 및 NASH는 진단 병리학 실험실에서 형태 평가에 의해서는 구별할 수 없다. 그러나 섬유증, 염증 및 간세포 형태 변화에 기인한 증가된 지방배치는 더욱 심각한 상태를 나타낸다. ASH 및 NASH에서의 세포 변화는 증가된 크기(팽창 현상) 및 세포내 응집물(예컨대 MB)의 존재를 포함하며, 이러한 간세포 병리학의 범위는 이들 상태를 진단할 수 있는 것으로 여겨진다. The most severe non-viral chronic liver disease, alcoholic fatty liver disease, and non-alcoholic fatty liver disease (ASH and NASH) cause high frequency cirrhosis, liver failure and liver cancer (such as HCC). ASH and NASH are indistinguishable by morphology evaluation in diagnostic pathology laboratories. However, increased fat placement due to fibrosis, inflammation and hepatocellular morphology presents a more serious condition. Cellular changes in ASH and NASH include increased size (expansion) and the presence of intracellular aggregates (such as MB), and it is believed that this range of hepatocellular pathology is capable of diagnosing these conditions.
전체적으로, ASH 및 NASH에 대한 특수한 치료법이 존재하지 않으므로 생검을 통한 확정적 진단은 환자에서 이 질환의 치료에 영향을 줄 것 같지 않다. Overall, definitive diagnosis via biopsy is unlikely to affect the treatment of this disease in patients as there are no special treatments for ASH and NASH.
간암은 공업화된 서구에서는 비교적 일반적이지 않지만, 전세계적으로는 주요한 암 원인이다. 많은 다른 유형의 암과는 달리, 간암에 걸려서 죽는 사람의 숫자는 증가하고 있다. Liver cancer is relatively common in the industrialized West, but is a major cause of cancer worldwide. Unlike many other types of cancer, the number of people who die from liver cancer is increasing.
전세계적으로 보아, HCC와 같은 일차 간암(primary liver cancer)은 가장 흔한 악성 암에 속하며 매년 약 100만명이 사망한다(Bruix, J. et al., 2004, Cancer Cell (5): 215-219). Worldwide, primary liver cancer, such as HCC, is one of the most common malignant cancers and kills about one million people each year (Bruix, J. et al., 2004, Cancer Cell (5): 215-219). .
간암의 주요 위험 인자는 바이러스, 알코올 섭취, 아플라톡신 곰팡이에 감염된 식품 및 대사 장애이다. 알코올중독 및 만성 B 및 C형 간염 비율은 증가 일로에 있다. 따라서 간암 비율도 점점 증가할 전망이며, 이는 이 분야에서 새로운 요법에 대한 필요성을 강조하고 있다. The major risk factors for liver cancer are viruses, alcohol intake, food affected by aflatoxin fungi and metabolic disorders. Alcoholism and chronic hepatitis B and C rates are on the rise. Thus, the rate of liver cancer is also expected to increase gradually, highlighting the need for new therapies in this area.
일차 간암은 치료하기 어렵다. 암의 외과적 제거 및 간 이식은 소형 암에 한정되고 진단시 암이 보통 진행 단계이기 때문에 대부분의 환자에 대해 적용할 수 있는 선택이 아니다. 수술하기에 적합하지 않은 종양에는 때때로 화학요법이 이용되지만, 어떠한 이점도 오래가지 않는다. 따라서, 일차 간암의 생존율은 극히 낮다. 통상적인 요법은 일반적으로 간암 치료에 효과적이지 않은 것으로 밝혀졌다. Primary liver cancer is difficult to treat. Surgical removal and liver transplantation of cancer is limited to small cancers and is not an applicable option for most patients because cancer is usually an advanced stage at diagnosis. Tumors are sometimes used for tumors that are not suitable for surgery, but no benefit lasts long. Therefore, the survival rate of primary liver cancer is extremely low. Conventional therapies have generally been found to be ineffective in treating liver cancer.
예컨대 HCC의 경우, 절제술 및 이식을 제외하고는 효과적인 치료법이 없지만, 이들 요법은 초기 단계의 HCC에만 적용할 수 있을 뿐이고, 기증 간의 입수에 의해 제한되고 또 환자에게 심각한 위험과 관련된다. 또한 이들 요법은 비용도 아주 많이 든다. 이들 암은 화학요법제와의 반응이 극히 불량한데, 이는 주로 해독 및 유해 화합물을 수송하는 정상적인 간 작용에 기인한 것으로 보인다. 화학색전술, 냉동요법 및 에탄올 주입법과 같은 몇 개의 다른 치료법이 실험 상에 있고 이들 효능은 아직 확립되어 있지 않다. For example, in the case of HCC, there are no effective therapies except for resection and transplantation, but these therapies are only applicable to early stage HCC and are limited by the availability between donations and are associated with serious risk to the patient. These therapies are also very expensive. These cancers have extremely poor reactions with chemotherapeutic agents, most likely due to normal liver action to transport detoxification and harmful compounds. Several other therapies such as chemoembolization, cryotherapy and ethanol infusion are on the test and their efficacy is not yet established.
따라서 지금까지는 간질환 및 기타 상피암을 치료할 수 있는 만족스런 요법이 개발되어 있지 않은 상태이다. Thus, satisfactory therapies for treating liver disease and other epithelial cancers have not been developed until now.
다양한 산화방지제는 알킬렌 쇄를 통하여 친유성 양이온에 공유결합되는 것에 의해 미토콘드리아를 표적으로 할 수 있음은 이미 공지되어 있다(Smith R.A.J. et al., 1999, Eur J. Biochem., 263: 709-716, 및 Kelso G.F. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 4588-4596; James A.M. et al., 2005, J. Biol. Chem., 280: 21295-21312). 이러한 방법은 일정하지 않게 분산되기보다는 세포 내의 자유 라디칼 및 반응성 산소 종의 일차 생산 부위로 산화방지제가 향하게 한다. It is already known that various antioxidants can target mitochondria by covalently binding to lipophilic cations through alkylene chains (Smith RAJ et al., 1999, Eur J. Biochem., 263: 709-716). And Kelso GF et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 4588-4596; James AM et al., 2005, J. Biol. Chem., 280: 21295-21312. This method directs the antioxidant to the primary production site of free radicals and reactive oxygen species in the cell rather than dispersing inconsistently.
특히, 비타민 E 및 조효소 Q10 유도체(미국특허 6,331,532호; WO 99/26954, WO2005/016322 및 WO2005/016323) 또는 글루타치온 퍼옥시다아제 유사약(WO 2004/014927)이 트리페닐 포스포늄 이온에 결합되는 것에 의해 미토콘드리아에 표적화되는 것은 개시된 바 있다. 시험관내 실험에 의하면 [2-(3,4-디히드로-6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸-2H-1-벤조피란-2-일)에틸]-트리페닐포스포늄 브로마이드 (Mito Vit E) 및 미토퀴놀[10-(3,6-디히드록시-4,6-디메톡시-2-메틸페닐)데실]트리페닐포스포늄 브로마이드 및 미토퀴논[10-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-시클로헥사디엔-1-일)데실]트리데실포스포늄 브로마이드(MitoQ)의 혼합물(Kelso G.F. et al., 인용문 중 참고 및 Smith R.A.J. et al., 인용문 중 참고) 또는 음이온이 메탄술포네이트인 MitoQ 화합물(James A.M. et al., 2005, J. Biol. Chem., 280: 21295-21312; WO 2005/016322 및 WO2005/016323)은 분리된 세포에서 미토콘드리아에 의해 급속하게 또 선택적으로 축적됨을 나타낸다. In particular, vitamin E and coenzyme Q 10 derivatives (US Pat. Nos. 6,331,532; WO 99/26954, WO2005 / 016322 and WO2005 / 016323) or glutathione peroxidase analogs (WO 2004/014927) are bound to triphenyl phosphonium ions. Targeting to mitochondria has been disclosed. In vitro experiments showed [2- (3,4-dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-1-benzopyran-2-yl) ethyl] -triphenylphosphonium Bromide (Mito Vit E) and mitoquinol [10- (3,6-dihydroxy-4,6-dimethoxy-2-methylphenyl) decyl] triphenylphosphonium bromide and mitoquinone [10- (4,5- Mixture of dimethoxy-2-methyl-3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-yl) decyl] tridecylphosphonium bromide (MitoQ) (Kelso GF et al., See citation and Smith RAJ et al., See citation) or MitoQ compounds (an James AM et al., 2005, J. Biol. Chem., 280: 21295-21312; WO 2005/016322 and WO2005 / 016323) wherein the anion is methanesulfonate It rapidly and selectively accumulates by mitochondria in isolated cells.
또한 페닐-t-부틸니트론(MitoPBN)의 스핀 트랩의 미토콘드리아-표적화된 유도체도 개발되었다(Smith R.A.J., Bioenergetics Group Colloquim, 2003, 679th Meeting of the Biochemical Society: 1295-1299). Mitochondrial-targeted derivatives of spin traps of phenyl-t-butylnitron (MitoPBN) have also been developed (Smith R.A.J., Bioenergetics Group Colloquim, 2003, 679th Meeting of the Biochemical Society: 1295-1299).
중요하게는 미토콘드리아에 의한 이들 산화방지제의 축적은 표적화되지 않은 산화방지제에 비하여 더욱 효과적으로 산화적 손상으로부터 자신을 보호하였으며, 이는 생활성 분자가 미토콘드리아내에 축적하는 것이 자신의 효능을 증가시키는 반면에 유해한 부작용은 감소시키는 것을 나타낸다(Murphy M.P. 및 Smith R.A.J., 2000, Adv. Drug. Delivery Rev., 41: 235-250). Importantly, the accumulation of these antioxidants by the mitochondria protected themselves from oxidative damage more effectively than untargeted antioxidants, while the harmful side effects of biomolecule accumulation in the mitochondria increased their efficacy. Indicates reduction (Murphy MP and Smith RAJ, 2000, Adv. Drug. Delivery Rev., 41: 235-250).
또한 간단한 알킬트리페닐포스포늄 양이온 TPMP, Mito Vit E 및 MitoQ는 장시간에 걸쳐 마우스에 안전하게 공급되어 뇌, 심장, 간 및 근육에서 치료적으로 효과적인 농도를 생성할 수 있음이 밝혀졌다(Smith R.A. et al., 2003, PNAS, 100(9): 5407-5412). It has also been found that simple alkyltriphenylphosphonium cations TPMP, Mito Vit E and MitoQ can be safely supplied to mice over long periods of time to produce therapeutically effective concentrations in the brain, heart, liver and muscle (Smith RA et al. , 2003, PNAS, 100 (9): 5407-5412).
이들 화합물의 공업적 적용(미국특허 6,331,532호, WO 99/26954 또는 WO 2004/014927, WO2005/016322 및 WO 2005/016323)은 파킨슨병, 프리드리히 운동부조화, 윌슨병, 미토콘드리아 DNA 돌연변이와 관련된 질환, 당뇨병, 모터 뉴런 질환, 중풍, 심장발작, 장기 이식 및 수술에서 염증 및 허혈성 재관류 조직 손상, 및 노화와 관련된 비-특이적 정력 손상과 같은 신경퇴행성 질환과 관련된 미토콘드리아 산화적 스트레스 증가를 방지하기 위해 사용될 수 있는 것으로 주장되어 있다. 또한 이들 화합물을 이식하는 동안 장기를 보호하고, 수술중 생기는 허혈성 재관류 손상을 완화시키며, 중풍 및 심장 발작에 따른 세포 손상을 감소시키기 위한 예방제로서 또는 뇌허혈에 걸린 조산아에게 투여되는 예방제로서 사용하는 것은 상기 언급한 특허문헌에서 주장된 바 있다. Industrial applications of these compounds (US Pat. Nos. 6,331,532, WO 99/26954 or WO 2004/014927, WO2005 / 016322 and WO 2005/016323) have shown Parkinson's disease, Friedrich's dyskinesia, Wilson's disease, diseases associated with mitochondrial DNA mutations, diabetes Can be used to prevent increased mitochondrial oxidative stress associated with neurodegenerative diseases such as motor neuron disease, stroke, heart attack, inflammatory and ischemic reperfusion tissue damage, and non-specific energetic damage associated with aging in organ transplantation and surgery It is claimed to exist. It is also recommended that these compounds be used as a preventive agent to protect organs during transplantation, to mitigate ischemic reperfusion injury during surgery, to reduce cellular damage following stroke and heart attack or as a preventive agent administered to premature infants with cerebral ischemia. It has been claimed in the patent document mentioned.
알코올성 간염(AH)의 치료에서 산화방지제 요법의 잠재적 가치에 대한 관심은 산화적 스트레스가 알코올-매개 간독성에서 주요 메카니즘임을 나타내는 증거가 점점 증가한 결과로 인하여 증대되었다(Stewart S.F. and Day C.P., 2003, Journal of Hepatology, 38: 2-13). 이들 고려사항은 최근 심각한 AH에 걸린 환자에서 산화방지제 보충 효과를 조사하는 몇몇 시험에 이르게 되었다(예컨대 Philips M. et al., 2001, Journal of Hepatology, 34: 250A). 대부분의 최근 연구에서(Stewart S.F. et al., 2002, Journal of Hepatolology, 36:16) 활성 그룹은 N-아세틸시스테인을 1주일에 걸쳐 부하용량 150 mg/kg 복용한 다음 100 mg/kg/일 복용하고 또 비타민 A-E, 비오틴, 셀렌, 아연, 망간, 구리, 마그네슘, 엽산 및 조효소 Q를 매일 6개월간 복용하였다. 이러한 산화방지제 요법은 단독으로 또는 스테로이드와 조합되어도 아무런 이점을 나타내지 않는다. 요컨대, 지금까지 얻을 수 있는 데이터를 기준하면, 고 복용량의 산화방지제 요법은 심각한 AH에 걸린 환자에서 생존 이점을 부여하지 않는다(Stewart S.F. and Day C.P., 인용문 중 참고). Interest in the potential value of antioxidant therapies in the treatment of alcoholic hepatitis (AH) has been augmented by the growing evidence that oxidative stress is a major mechanism in alcohol-mediated hepatotoxicity (Stewart SF and Day CP, 2003, Journal of Hepatology, 38: 2-13). These considerations have recently led to several trials investigating the effects of antioxidant supplementation in patients with severe AH (eg Philips M. et al., 2001, Journal of Hepatology, 34: 250A). In most recent studies (Stewart SF et al., 2002, Journal of Hepatolology, 36:16), the active group took N-acetylcysteine at a dose of 150 mg / kg over a week followed by 100 mg / kg / day Vitamin AE, biotin, selenium, zinc, manganese, copper, magnesium, folic acid and coenzyme Q were taken daily for 6 months. Such antioxidant therapy shows no benefit either alone or in combination with steroids. In sum, based on the data available to date, high doses of antioxidant therapy do not confer survival benefits in patients with severe AH (see Stewart S.F. and Day C.P., citations).
산화적 스트레스는 비-알코올성 지방간질환(NAFLD)의 발병기전에 관여하는 것으로 알려져 있다. 콜린 결핍 규정식을 섭취한 쥐를 이용한 연구에서, 광범위한 산화적 상황에서 라디칼 반응의 증식을 차단하는 것에 의해 반응성 산소 종(reactive oxygen species: ROS)과 반응하는 것으로 알려진 비타민 E는 지방간의 발생을 방지하지도 않았고 산화적 스트레스를 감소시키지도 않았다(Oliveira C.P. et al., 2003, Nutr. J., 2(1): 9). Oxidative stress is known to be involved in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). In studies using rats fed the choline deficiency diet, vitamin E, known to react with reactive oxygen species (ROS) by blocking the proliferation of radical reactions in a wide range of oxidative situations, prevents the development of fatty liver Neither did it reduce oxidative stress (Oliveira CP et al., 2003, Nutr. J., 2 (1): 9).
간경화에 걸린 환자 및 알파-토코페롤 처리된 C형 간염 바이러스(HCV) 감염된 환자(VitE 군)에 대한 연구에서, 간기능의 향상이나 간 종양형성의 억제도 나타나지 않았고 누적생존의 향상도 나타내지 않았다(Tagaki H. et al., 2003, Int. J. Vitam Nutr. Res., 73(6): 411-5). In studies of patients with cirrhosis and patients infected with hepatitis C virus (HCV) treated with alpha-tocopherol (VitE group), there was no improvement in liver function or inhibition of liver tumorigenesis and no improvement in cumulative survival (Tagaki). H. et al., 2003, Int. J. Vitam Nutr. Res., 73 (6): 411-5).
앞의 알파-인터페론 경로, N-아세틸 시스테인의 경구 투여(1200 mg/일) 및 비타민 E(600 mg/일)에 반응하지 않았던 생검 확인된 만성 C형 간염에 걸린 120명의 환자의 임의의 멀티센터 연구는 알파-인터페론 단독의 재치료의 불량한 효능을 개선시키지 않았다(Ideo, G., et al., 1999, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11 (11): 1203-7). Any multicenter of 120 patients with chronic hepatitis C confirmed biopsies that did not respond to the previous alpha-interferon pathway, oral administration of N-acetyl cysteine (1200 mg / day) and vitamin E (600 mg / day) The study did not improve the poor efficacy of retreatment with alpha-interferon alone (Ideo, G., et al., 1999, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11 (11): 1203-7).
발명의 요약 Summary of the Invention
본 발명은 간질환 및/또는 상피암의 치료 또는 예방을 위해 산화방지제 잔기에 공유결합된 친유성 양이온을 포함하는 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제 화합물의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to the use of mitochondrially targeted antioxidant compounds comprising a lipophilic cation covalently bound to an antioxidant moiety for the treatment or prevention of liver disease and / or epithelial cancer.
상세한 설명 details
놀랍게도 비타민 E 유도체, 조효소 Q10 또는 글루타민 퍼옥사이드 유사약과 같은 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 사용은 간질환 및/또는 상피암의 치료와 예방에 유용한 것으로 밝혀졌다. Surprisingly, the use of mitochondrially targeted antioxidants such as vitamin E derivatives, coenzyme Q 10 or glutamine peroxide analogs have been found to be useful in the treatment and prevention of liver disease and / or epithelial cancer.
가장 넓은 요지로서, 본 발명은 미토콘드리아 막을 통하여 수송되어 완전한 미토콘드리아 세포내에 축적될 수 있는 산화방지제 잔기에 공유결합된 친유성 양이온을 포함하는, 간질환 및/또는 상피암을 치료 및 예방하기 위한 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제를 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 화합물은 미토콘드리아에서 산화적 스트레스(또는 자유 라디칼)에 기인한 세포 손상을 방지한다. In its broadest aspect, the present invention provides mitochondrial treatment and prevention for liver disease and / or epithelial cancer, comprising lipophilic cations covalently bound to antioxidant residues that can be transported through the mitochondrial membrane and accumulate in complete mitochondrial cells. Provide targeted antioxidants. In particular, the compounds according to the invention prevent cell damage due to oxidative stress (or free radicals) in the mitochondria.
본 발명에 따른 용어 "간질환"은 간의 해부, 생리학, 대사 및/또는 유전 활동에 영향을 주며 또 단기적으로, 일시적으로, 만성적으로 또는 영구적으로 병리학적 방식으로 전체적으로 또는 그 일부로서 새로운 간 세포의 생성 및/또는 간의 재생에 영향을 주는 모든 종류의 장애를 지칭하고 포함한다. The term “liver disease” according to the invention affects the anatomy, physiology, metabolism and / or genetic activity of the liver and in the short term, temporarily, chronically or permanently, in whole or in part in a pathological manner of new liver cells. It refers to and includes all kinds of disorders affecting production and / or regeneration of the liver.
특히 알코올에 의해 유발된 질환(예컨대 ASH), 비-알코올성 지방간 변화(NASH를 비롯한 NAFLD와 같은), 영양-매개 간 손상(예컨대 기아), 다른 독성 간 손상(예컨대 비제한적으로 아세트아미노펜(파라세타몰), 염소화된 탄화수소(예컨대 CCl4), 아미오다론(코르다론), 발프로에이트, 테트라시클린(정맥투여만), 이소니아시드(Drug-induced liver disease 2004. Lazerow SK, Abdi MS, Lewis JH. Curr Opin Gastroenterol., 2005, 21(3): 283-292) 또는 예컨대 아플라톡신(바람직하게는 B1 아플라톡신)을 함유하는 버섯 섭취 또는 특정 금속(예컨대 구리 또는 카드뮴) 복용 또는 천연 약물(우유 엉겅퀴, 떡갈나무 덩쿨, 카와-카와(Kawa-Kawa)와 같은 동종요법)에 사용된 허브 제품의 섭취와 같은 급성 또는 만성 간질환을 초래할 수 있는 식품 중독; 빌리루빈 대사의 간섭, 간염 유사 증후, 쓸개즙정체, 육아종 병반, 간내 혈관 병반 및 경화와 같은 약물에 의해 유도된 비특이적 간염), 외상 및 수술(예컨대 프링글 조작), 방사선-매개 간 손상(방사성요법에 의해 유발된 바와 같은)을 포함한다. In particular alcohol-induced diseases (such as ASH), non-alcoholic fatty liver changes (such as NAFLD including NASH), nutrition-mediated liver damage (such as starvation), and other toxic liver damage (such as but not limited to acetaminophen (paracetamol) Chlorinated hydrocarbons (such as CCl 4 ), amiodarone (cordarone), valproate, tetracycline (venous only), isoniaside (Drug-induced liver disease 2004. Lazerow SK, Abdi MS, Lewis JH.Curr Opin Gastroenterol., 2005, 21 (3): 283-292) or ingesting mushrooms containing aflatoxins (preferably B1 aflatoxins) or taking certain metals (such as copper or cadmium) or natural drugs (milk thistles, oak vines) Food poisoning, which can lead to acute or chronic liver disease, such as ingestion of herbal products used in homeopathic therapy, such as Kawa-Kawa; interference with bilirubin metabolism, hepatitis-like symptoms, cholestasis, and granulation Includes mediated liver injury (such as that caused by radiation therapy) - a non-specific hepatitis), trauma and surgery (e.g., Pringle operation), radiation induced by drugs, such as lesions, intrahepatic vascular lesions and curing.
간질환은 감염성 간질환[예컨대 B염 간염 바이러스(HBV) 및 C형 간염 바이러스(HCV) 감염에 의해 유발됨] 및 자동면역-매개 간질환(예컨대 자동면역 간염)을 포함하는 것으로 이해된다. 패혈증에 의한 간 손상도 포함한다. Liver diseases are understood to include infectious liver diseases (such as caused by hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV) infection) and autoimmune-mediated liver disease (such as autoimmune hepatitis). It also includes liver damage caused by sepsis.
간질환은 또한 유전적 간질환(혈색소침착증 및 알파 항트립신 결핍증과 같은) 및 기타 유전된 대사성 간질환[예컨대 지방간질환(MSH)]을 포함하는 것으로 이해된다. Liver diseases are also understood to include genetic liver diseases (such as hemochromatosis and alpha antitrypsin deficiency) and other inherited metabolic liver diseases (eg fatty liver disease (MSH)).
치료될 간질환의 바람직한 예는 알코올성 간질환(ALD), 비-알코올성 지방간질환(NAFLD), 지방증, 쓸개즙정체, 경화증, 급성 및 만성 간염, 혈색소침착증 및 알파 1 항트립신 결핍증을 포함한다. Preferred examples of liver disease to be treated include alcoholic liver disease (ALD), non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), steatosis, cholestasis, sclerosis, acute and chronic hepatitis, hemochromatosis and
본 발명의 의미에서 본 발명에 따른 용어 "간질환"은 또한 종양(일차 간 신생물) 및 간의 종양 유사 병반(초점성 결절성 과증식, FNH와 같은)을 포함한다. The term “liver disease” according to the invention in the sense of the present invention also encompasses tumors (primary liver neoplasia) and tumor-like lesions of the liver (such as focal nodular hyperproliferation, FNH).
간질환은 또한 양성 간 신생물(예컨대 간세포 샘종) 뿐만아니라 간암, 예컨대 간세포 종양(HCC)과 같은 간 신생성 질환을 포함하는 것으로 이해된다. HCC는 또한 세포내 단백질성 봉입체를 특징으로 하는 간암, 간세포 지방증을 특징으로 하는 HCC 및 섬유층판 HCC를 비롯한 상술한 질환의 서브타입을 포함한다. 예컨대, 증가된 간세포 세포 크기(대형 세포 변화)를 특징으로 하는 병반 및 감소된 간세포 세포 크기(소형 세포 변화)를 특징으로 하는 병반 뿐만 아니라 마크로 재생성(과증식성) 결절도 전암성 병반에 포함된다(Anthony P. in MacSween et al., eds. 2001, Pathology of the Liver, Churchill Livingstone, Edinburgh, UK). Liver diseases are also understood to include benign liver neoplasms (such as hepatocellular adenomas) as well as liver neoplastic diseases such as liver cancer such as hepatocellular tumors (HCC). HCC also includes subtypes of the above-mentioned diseases, including hepatic cancer characterized by intracellular proteinaceous inclusion bodies, HCC characterized by hepatocellular steatosis, and fibrous lamellar HCC. For example, macroplastic regeneration (hyperproliferative) nodules as well as lesions characterized by increased hepatocyte cell size (large cell change) and lesions characterized by reduced hepatocyte cell size (small cell change) are included in precancerous lesions ( Anthony P. in MacSween et al., Eds. 2001, Pathology of the Liver, Churchill Livingstone, Edinburgh, UK).
본 발명의 의미 내에서 용어 "상피암"은 간 이외의 장기, 예컨대 폐, 신장, 췌장, 전립선, 피부 및 유방으로부터 선택되는 장기의 종양 및 위, 신장 및 결장과 같은 위장관 계의 종양을 포함한다. 본 발명에 따른 용어 "상피암"은 조직의 상피세포 성분이 변형되어 당업자에게 일반적으로 공지된 표준 진단 과정에 따라 확인된 악성 종양을 초래하는 장기의 질환을 지칭한다. The term "epithelial cancer" within the meaning of the present invention includes tumors of organs other than the liver, such as the lungs, kidneys, pancreas, prostate, skin and breast, and tumors of the gastrointestinal system such as the stomach, kidneys and colon. The term "epithelial cancer" according to the present invention refers to a disease of organs in which the epithelial cell component of the tissue is modified resulting in malignant tumors identified according to standard diagnostic procedures generally known to those skilled in the art.
바람직한 구체예는 알코올성 간질환, 비-알코올성 지방간질환, 지방증, 쓸개즙 정체, 간경화, 영양-매개 간 손상, 독소 간 손상, 감염성 간질환, 패혈증에서 간 손상, 자동면역-매개 간질환, 혈색소침착증, 알파1 항트립신 결핍, 방사선-매개 간손상, 간암, 양성 간 신생물 및 초점성 결절성 과증식으로 구성된 군으로부터 선택된 간질환을 치료 및 예방함에 있어서 산화방지제 잔기에 공유 결합된 친유성 양이온을 포함하는 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제 화합물의 용도를 나타낸다. Preferred embodiments include alcoholic liver disease, non-alcoholic fatty liver disease, steatosis, cholestasis, cirrhosis, nutrition-mediated liver injury, toxin liver injury, infectious liver disease, liver damage in sepsis, autoimmune-mediated liver disease, hemochromatosis, Mitochondria comprising lipophilic cations covalently bound to antioxidant residues in the treatment and prevention of liver diseases selected from the group consisting of alpha1 antitrypsin deficiency, radiation-mediated liver injury, liver cancer, benign liver neoplasia and focal nodular hyperplasia By using the targeted antioxidant compound.
다른 구체예는 알코올성 간질환, 비-알코올성 지방간질환, 지방증, 쓸개즙 정체, 간경화, 영양-매개 간 손상, 독소 간 손상, 감염성 간질환, 패혈증에서 간 손상, 자동면역-매개 간질환, 혈색소침착증, 알파1 항트립신 결핍, 방사선-매개 간손상으로 구성된 군으로부터 선택된 간질환을 치료 및 예방함에 있어서 산화방지제에 공유 결합된 친유성 양이온을 포함하는 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제 화합물의 용도를 나타낸다. Other embodiments include alcoholic liver disease, non-alcoholic fatty liver disease, steatosis, cholestasis, cirrhosis, nutrition-mediated liver injury, toxin liver injury, infectious liver disease, liver damage in sepsis, autoimmune-mediated liver disease, hemochromatosis, Indicates the use of mitochondrially targeted antioxidant compounds comprising lipophilic cations covalently bound to antioxidants in the treatment and prevention of liver diseases selected from the group consisting of alpha1 antitrypsin deficiency, radiation-mediated liver injury.
본 발명은 간질환 및 상피암을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서 산화방지제 잔기에 공유 결합된 친유성 양이온을 포함하는 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제 화합물의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to the use of mitochondrially targeted antioxidant compounds comprising a lipophilic cation covalently bound to an antioxidant moiety in the manufacture of a medicament for treating or preventing liver disease and epithelial cancer.
바람직한 구체예는 알코올성 간질환, 비-알코올성 지방간질환, 지방증, 쓸개즙 정체, 간경화, 영양-매개 간 손상, 독소 간 손상, 감염성 간질환, 패혈증에서 간 손상, 자동면역-매개 간질환, 혈색소침착증, 알파1 항트립신 결핍증, 방사선-매개 간손상, 간암, 양성 간 신생물 및 초점성 결절성 과증식으로 구성된 군으로부터 선택된 간질환을 치료 및 예방함에 있어서 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 용도를 나타낸다. Preferred embodiments include alcoholic liver disease, non-alcoholic fatty liver disease, steatosis, cholestasis, cirrhosis, nutrition-mediated liver injury, toxin liver injury, infectious liver disease, liver damage in sepsis, autoimmune-mediated liver disease, hemochromatosis, The use of mitochondrially targeted antioxidants according to the invention in the treatment and prevention of liver diseases selected from the group consisting of alpha1 antitrypsin deficiency, radiation-mediated liver injury, liver cancer, benign liver neoplasia and focal nodular hyperplasia Indicates.
다른 바람직한 구체예는 알코올성 간질환, 비-알코올성 지방간질환, 지방증, 쓸개즙 정체, 간경화, 영양-매개 간 손상, 독소 간 손상, 감염성 간질환, 패혈증에서 간 손상, 자동면역-매개 간질환, 혈색소침착증, 알파1 항트립신 결핍증, 방사선-매개 간손상, 간암으로 구성된 군으로부터 선택된 간질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 제조에서 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 용도이다. Other preferred embodiments include alcoholic liver disease, non-alcoholic fatty liver disease, steatosis, cholestasis, liver cirrhosis, nutrition-mediated liver injury, toxin liver injury, infectious liver disease, liver damage in sepsis, autoimmune-mediated liver disease, hemochromatosis The use of mitochondrially targeted antioxidants according to the invention in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of a liver disease selected from the group consisting of
다른 바람직한 구체예는 간질환이 알코올성 간질환 또는 비-알코올성 지방간질환인 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 용도이다. Another preferred embodiment is the use of a mitochondrially targeted antioxidant according to the invention wherein the liver disease is an alcoholic liver disease or a non-alcoholic fatty liver disease.
더욱 바람직한 구체예는 간질환이 알코올성 지방간 질환 또는 비-알코올성 지방간질환인 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 용도이다. A more preferred embodiment is the use of a mitochondrially targeted antioxidant according to the invention wherein the liver disease is an alcoholic fatty liver disease or a non-alcoholic fatty liver disease.
다른 바람직한 구체예는 간질환이 알코올성 지방간질환인 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 용도이다. Another preferred embodiment is the use of a mitochondrially targeted antioxidant according to the invention wherein the liver disease is an alcoholic fatty liver disease.
다른 바람직한 구체예는 간질환이 비-알코올성 지방간 질환인 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 용도이다. Another preferred embodiment is the use of a mitochondrially targeted antioxidant according to the invention wherein the liver disease is a non-alcoholic fatty liver disease.
본 발명의 의미 내에서 용어 "본 발명에 따른 질환"은 상기 정의된 바와 같은 간질환 및 상피암을 포함한다. The term "disease according to the invention" within the meaning of the present invention includes liver disease and epithelial cancer as defined above.
바람직한 구체예는 친유성 양이온이 트리페닐포스포늄 양이온인 본 발명에 따른 질환의 치료 또는 예방을 위한 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제 화합물의 용도를 나타낸다. Preferred embodiments indicate the use of mitochondrially targeted antioxidant compounds for the treatment or prevention of diseases according to the invention wherein the lipophilic cation is a triphenylphosphonium cation.
본 발명에 따라 산화방지제에 공유 결합될 수 있는 다른 친유성 양이온은 트리벤질 또는 트리페닐 암모늄 양이온 또는 트리벤질 또는 치환된 트리페닐 포스포늄 양이온을 포함한다. Other lipophilic cations that may be covalently bound to antioxidants in accordance with the present invention include tribenzyl or triphenyl ammonium cations or tribenzyl or substituted triphenyl phosphonium cations.
다른 바람직한 구체예로서 본 발명에 따른 상기 미토콘드리아적으로 표적화된 화합물은 화학식 P(Ph)3 +XR·Z- (식중, X는 연결기이고, Z-는 음이온이며 또 R은 산화방지제 잔기임)를 가지며 또 상기 친유성 양이온은 하기 화학식으로 나타낸 바와 같은 트리페닐포스포늄 양이온을 나타낸다: A compound wherein the mitochondrial enemy targeting in accordance with the invention In another preferred embodiment of the formula P (Ph) 3 + XR · Z - a - (the anion is again R is an antioxidant moiety wherein, X is a linking group, Z) And said lipophilic cation represents a triphenylphosphonium cation as represented by the formula:
연결 기로서 X는 탄소 사슬, 1 이상의 탄소 고리, 또는 이들의 조합일 수 있고 또 1 이상의 탄소원자가 산소에 의해 치환(에테르 또는 에스테르 형성)되거나 및/또는 질소에 의해 치환(아민 또는 아미드 형성)된 이러한 사슬 또는 고리일 수 있다. As the linking group, X may be a carbon chain, one or more carbon rings, or a combination thereof and one or more carbon atoms are substituted by oxygen (ether or ester formation) and / or by nitrogen (amine or amide formation) It may be such a chain or a ring.
탄소사슬은 일반적으로 알킬렌 기이지만, 1 이상의 이중결합 또는 삼중결합을 포함하는 탄소사슬도 본 발명의 범위 내에 속한다. 1 이상의 치환기(옥소, 히드록실, 카르복시산 또는 카르복사미드 기와 같은) 및/또는 비치환 또는 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기로부터 선택된 1 이상의 측쇄 또는 분지를 포함하는 탄소사슬도 포함된다. Carbon chains are generally alkylene groups, but carbon chains comprising one or more double or triple bonds are also within the scope of the present invention. Also included are carbon chains comprising one or more substituents (such as oxo, hydroxyl, carboxylic acid or carboxamide groups) and / or one or more side chains or branches selected from unsubstituted or substituted alkyl, alkenyl or alkynyl groups.
바람직하게는, X는 C1-C30, 보다 바람직하게는 C1-C20, 가장 바람직하게는 C1-C15 탄소사슬이다. 바람직하게는, X는 (CH2)n 이며, 이때 n은 1 내지 20의 정수, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 15이다. Preferably, X is C 1 -C 30 , more preferably C 1 -C 20 , most preferably C 1 -C 15 carbon chain. Preferably, X is (CH 2 ) n , where n is an integer from 1 to 20, more preferably from about 1 to about 15.
일부 특히 바람직한 구체예로서, 연결 기 X는 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌 또는 데실렌 기이다. In some particularly preferred embodiments, the linking group X is an ethylene, propylene, butylene, pentylene or decylene group.
일개 특히 바람직한 구체예에서 산화방지제 잔기 R은 퀴논이다. 다른 바람직한 구체예에서 산화방지제 R 잔기는 퀴놀이다. 퀴논 및 상응하는 퀴놀은 이들이 환원 및 산화에 의해 각각 서로 전환되기 때문에 등가물이다. In one particularly preferred embodiment the antioxidant residue R is quinone. In another preferred embodiment the antioxidant R residue is quinol. Quinones and corresponding quinols are equivalents because they are converted to each other by reduction and oxidation, respectively.
다른 구체예에서 산화방지제 잔기 R은 비타민 E 및 비타민 E 유도체, 사슬 파괴 산화방지제, 부틸화된 히드록시아니솔, 부틸화된 히드록시톨루엔, 유도화된 풀러렌을 포함한 일반적 라디칼 파괴제, 5,5-디메틸피롤린 N-옥사이드의 유도체를 포함한 스핀 트랩, t-부틸니트로소벤젠, α-페닐-t부틸니트론 및 관련 화합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. In another embodiment the antioxidant residue R is a general radical destroyer including vitamin E and vitamin E derivatives, chain breakdown antioxidants, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, induced fullerenes, 5,5- Spin traps comprising derivatives of dimethylpyrroline N-oxide, t-butylnitrosobenzene, α-phenyl-tbutylnitron and related compounds.
다른 바람직한 구체예로서, 산화방지제 잔기 R은 비타민 E 또는 비타민 E 유도체이다. In another preferred embodiment, the antioxidant residue R is a vitamin E or vitamin E derivative.
다른 바람직한 구체예로서 산화방지제 잔기 R은 부틸화된 히드록시아니솔 또는 부틸화된 히드록시톨루엔이다. In another preferred embodiment the antioxidant residue R is butylated hydroxyanisole or butylated hydroxytoluene.
더욱 바람직한 구체예로서 산화방지제 잔기 R은 유도화된 풀러렌이다. In a more preferred embodiment the antioxidant residue R is derivatized fullerene.
일부 특히 바람직한 구체예로서 산화방지제 잔기 R은 5,5-디메틸피롤린 N-옥사이드, t-부틸니트로소벤젠, α-페닐-t부틸니트론 및 그의 유도체이다. In some particularly preferred embodiments the antioxidant residue R is 5,5-dimethylpyrroline N-oxide, t-butylnitrosobenzene, α-phenyl-tbutylnitron and derivatives thereof.
바람직하게는, Z-는 약학적으로 허용되는 음이온이다. 이러한 약학적으로 허용되는 음이온은 유기산 또는 무기산으로부터 형성된다. 적합한 무기산은 예컨대 염화수소산, 브롬화수소산과 같은 할로겐 산, 황산 또는 인산이다. 적합한 유기 산은 예컨대 카르복시산, 포스폰산, 술폰산 또는 술팜산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아미노산, 예컨대 글루탐산 또는 아스파탐산, 말레산, 히드록시말레산, 메틸말레산, 시클로헥산카르복시산, 아다만탄카르복시산, 벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 만델린산, 신남산, 알칸 술폰산, 예컨대 메탄- 또는 에탄-술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 에탄-1,2-디술폰산, 아릴술폰산, 예컨대 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 1,5-나프탈렌-디술폰산 또는 2-, 3- 또는 4-메틸벤젠술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산, N-시클로헥실술팜산, N-메틸-, N-에틸- 또는 N-프로필-술팜산 또는 기타 유기 양성자산, 예컨대 아스코르브산이다. Preferably, Z − is a pharmaceutically acceptable anion. Such pharmaceutically acceptable anions are formed from organic or inorganic acids. Suitable inorganic acids are, for example, hydrochloric acid, halogen acids such as hydrobromic acid, sulfuric acid or phosphoric acid. Suitable organic acids are for example carboxylic acids, phosphonic acids, sulfonic acids or sulfamic acids such as acetic acid, propionic acid, octanoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid, glycolic acid, lactic acid, fumaric acid, succinic acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid , Malic acid, tartaric acid, citric acid, amino acids such as glutamic acid or aspartamic acid, maleic acid, hydroxymaleic acid, methylmaleic acid, cyclohexanecarboxylic acid, adamantanecarboxylic acid, benzoic acid, salicylic acid, 4-aminosalicylic acid, phthalic acid, phenylacetic acid, Mandelic acid, cinnamic acid, alkanesulfonic acid such as methane- or ethane-sulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, ethane-1,2-disulfonic acid, arylsulfonic acid such as benzenesulfonic acid, 2-naphthalenesulfonic acid, 1,5- Naphthalene-disulfonic acid or 2-, 3- or 4-methylbenzenesulfonic acid, methyl sulfuric acid, ethyl sulfuric acid, dodecyl sulfuric acid, N-cyclohexyl sulfamic acid, N-methyl-, N-ethyl- or N-propyl-sulfamic acid Or other organic amount Sex assets such as ascorbic acid.
일개 바람직한 구체예로서 Z-는 할라이드이다. 다른 바람직한 구체예로서 Z-는 브로마이드이다. In one preferred embodiment Z − is a halide. In another preferred embodiment Z − is bromide.
다른 바람직한 구체예로서, Z-는 알칸- 또는 아릴술폰산의 음이온이다. 일개의 특히 바람직한 구체예로서 Z-는 메탄술포네이트이다. In another preferred embodiment, Z − is an anion of alkane- or arylsulfonic acid. In one particularly preferred embodiment Z − is methanesulfonate.
다른 특히 바람직한 구체예로서, 간질환 및/또는 상피암의 치료 및 예방에 유용한 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제와 모든 그의 입체이성질체는 다음 화학식을 갖는다: In another particularly preferred embodiment, the mitochondrially targeted antioxidants and all stereoisomers thereof useful for the treatment and prevention of liver disease and / or epithelial cancer have the formula:
식중에서, Z-는 약학적으로 허용되는 음이온, 바람직하게는 Br- 이다. 이 화합물을 "Mito Vit E"라 칭한다. Wherein Z − is a pharmaceutically acceptable anion, preferably Br − . This compound is called "Mito Vit E".
다른 바람직한 구체예로서 본 발명에 따른 질환의 치료 및 예방에 유용한 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제는 다음 화학식을 갖는다: In another preferred embodiment the mitochondrially targeted antioxidants useful for the treatment and prevention of the diseases according to the invention have the formula:
식중에서, Z-는 약학적으로 허용되는 음이온, 바람직하게는 할로겐이고, m은 0 내지 3의 정수이며, 각 Y는 독립적으로 전자 공여 및 수용 특성을 갖는 기, 사슬 및 지방족 및 방향족 고리로부터 선택되며, (C)n 은 1 이상의 이중결합 또는 삼중결합을 경우에 따라 갖고 또 경우에 따라 1 이상의 치환기 및/또는 비치환 또는 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 측쇄를 갖는 탄소 사슬이며 또 n은 1 내지 20의 정수임. Wherein Z − is a pharmaceutically acceptable anion, preferably halogen, m is an integer from 0 to 3, and each Y is independently selected from groups, chains and aliphatic and aromatic rings having electron donating and accepting properties (C) n is a carbon chain which optionally has at least one double bond or triple bond and optionally has at least one substituent and / or unsubstituted or substituted alkyl, alkenyl or alkynyl side chain and n is An integer from 1 to 20.
바람직하게는, 각 Y는 독립적으로 알콕시, 알킬티오, 알킬, 할로알킬, 할로, 아미노, 니트로, 경우에 따라 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 선택되며, 또는 m 이 2 또는 3이면, 2개의 Y기는 이들이 부착된 탄소원자와 함께 합쳐져서 아릴 고리에 융합된 지방족 또는 방향족 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 보다 바람직하게는 각 Y는 독립적으로 메톡시 및 메틸로부터 선택된다. Preferably, each Y is independently selected from the group consisting of alkoxy, alkylthio, alkyl, haloalkyl, halo, amino, nitro, optionally substituted aryl, or if m is 2 or 3, two Y groups They combine with the attached carbon atoms to form an aliphatic or aromatic carbocyclic or heterocyclic ring fused to an aryl ring. More preferably each Y is independently selected from methoxy and methyl.
바람직하게는, (C)n 은 화학식 (CH2)n 의 알킬 사슬이다. Preferably, (C) n is an alkyl chain of formula (CH 2 ) n .
특히 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제는 다음 화학식을 갖는다: In a particularly preferred embodiment, the mitochondrially targeted antioxidants according to the invention have the formula:
식중에서, In the food,
Z- 는 약학적으로 허용되는 음이온, 바람직하게는 Br-임. 상기 화합물은 "미토퀴놀"로 불리거나 또는 상기 화합물의 산화된 형태(화학식의 히드로퀴논이 퀴논임)로서 "미토퀴논"으로 불린다. 다양한 양의 미토퀴놀 및 미토퀴논의 혼합물을 "MitoQ"라 칭한다. Z − is a pharmaceutically acceptable anion, preferably Br − . The compound is called "mitoquinol" or "mitoquinone" as the oxidized form of the compound (hydroquinone of the formula is quinone). Mixtures of various amounts of mitoquinol and mitoquinone are referred to as "MitoQ".
더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제는 하기 화학식을 갖는다: More preferably, mitochondrially targeted antioxidants according to the invention have the formula:
식중에서, 약학적으로 허용되는 음이온 Z- 는 메탄술포네이트이다. 이 구체예로서 다양한 양의 미토퀴놀 및 미토퀴논의 혼합물을 "MitoS"라 칭한다. In the formula, the pharmaceutically acceptable anion Z − is methanesulfonate. In this embodiment, a mixture of various amounts of mitoquinol and mitoquinone is referred to as "MitoS".
본 발명에 따른 또한 바람직한 구체예는 하기 화학식의 스핀 트랩 페닐-t-부틸니트론의 미토콘드리아적으로 표적화된 유도체를 나타내며, 이후 "MitoPBN"이라 칭한다: Further preferred embodiments according to the invention represent mitochondrially targeted derivatives of spin trap phenyl-t-butylnitrone of the formula: hereinafter referred to as "MitoPBN":
본 발명에 따른 다른 구체예로서, 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제는 셀렌 유기 화합물과 같은 글루타치온 퍼옥시다아제 유사약, 즉 1 이상의 셀렌 원자를 포함하는 유기 화합물이다. 셀렌 유기 글루타치온 퍼옥시다아제 유사약의 바람직한 종류는 벤즈이소셀렌아졸론, 디아릴 디셀레나이드 및 디아릴 셀레나이드를 포함한다. In another embodiment according to the invention, the mitochondrially targeted antioxidant is a glutathione peroxidase analog, such as a selenium organic compound, ie an organic compound comprising at least one selenium atom. Preferred classes of selenium organic glutathione peroxidase analogs include benzisoselenazolones, diaryl diselenides and diaryl selenides.
특히 글루타치온 퍼옥사이드 유사약 잔기는 이후 "Ebelsen"(2-페닐-벤조[d]이소셀렌아졸-3-온)로 칭하는 하기 화학식의 것이다: In particular, the glutathione peroxide mimetic moiety is of the formula hereinafter referred to as "Ebelsen" (2-phenyl-benzo [d] isoselenazol-3-one):
본 발명의 바람직한 화합물은 다음 화학식을 갖는다: Preferred compounds of the present invention have the formula:
식중에서, Z- 는 약학적으로 허용되는 음이온, 바람직하게는 Br- 이며 또 L은 단당류이다. Wherein Z − is a pharmaceutically acceptable anion, preferably Br − and L is a monosaccharide.
특히 바람직한 본 발명에 따른 구체예는 하기 화학식을 갖는다: Particularly preferred embodiments according to the invention have the formula:
식중에서, Z- 및 (C)n 은 상기 정의한 바와 같고, W는 O, S 또는 NH이며, 바람직하게는 O 또는 S이고, 또 n은 1 내지 20, 보다 바람직하게는 3 내지 6이다. Wherein Z − and (C) n are as defined above, W is O, S or NH, preferably O or S, and n is 1 to 20, more preferably 3 to 6.
다른 구체예로서, 본 발명은 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제 유효량을 생리학적 식염수 용액, 탈염 수, 안정화제(β-시클로덱스트린, 바람직하게는 1:2 비율) 및/또는 단백질분해효소(proteinase) 억제제와 같은 1 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 간질환 및/또는 상피암으로 고통받는 환자를 치료 및/또는 예방하기에 적합한 약학적 조성물을 제공한다. In another embodiment, the present invention provides an effective amount of a mitochondrial targeted antioxidant according to the present invention to a physiological saline solution, demineralized water, stabilizer (β-cyclodextrin, preferably 1: 2 ratio) and / or proteolysis. Provided is a pharmaceutical composition suitable for treating and / or preventing a patient suffering from liver disease and / or epithelial cancer, including with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents, such as enzymease inhibitors.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "약학적으로 허용되는"은 건강한 의약적 판단 범위 내에서 관심을 갖고 있는 피검체(바람직하게는 사람)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제나 복합증을 유발하지 않고 합당한 이점/위험비가 균형이 잡힌 화합물, 성분, 물질, 조성물, 투여량, 형태 등을 의미한다. 각 담체, 희석제, 부형제 등은 제형의 다른 성분과 조화를 이룰 수 있는 의미에서 "허용성"이어야 한다. As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” is suitable for use in contact with the tissues of a subject (preferably human) of interest within the scope of healthy medicinal judgments, with excessive toxicity, irritation , Compound, ingredient, substance, composition, dosage, form, etc., having a reasonable benefit / risk ratio balanced without causing an allergic reaction or other problem or complication. Each carrier, diluent, excipient, etc. must be "acceptable" in the sense of being compatible with the other ingredients of the formulation.
다른 구체예로서, 본 발명은 간질환 및/또는 상피암 환자에게 상기 정의한 바와 같은 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제를 투여하는 단계를 포함하는, 산화적 스트레스 감소에 의해 도움을 받을 간질환 및/또는 상피암 환자를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. In another embodiment, the invention is a liver disease and / or epithelial cancer that will be assisted by oxidative stress reduction comprising administering to a liver disease and / or epithelial cancer patient a mitochondrially targeted antioxidant as defined above. Provided are methods for treating or preventing a patient.
본 발명의 의미 내에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 1 이상의 질환에 걸린 환자를 치유시키거나 및/또는 일시적, 단기간(수 시간 내지 수일 정도), 장기간(수 주, 수 개월 또는 수년) 동안 상기 질환과 관련된 1 이상의 증상을 갖는 환자의 생리학적 상태를 향상시키는 처리를 의미하며, 상기 생리학적 상태의 향상은 대조 환자와 비교하여 전체적 효과가 현저한 증상 향상을 나타내는 한 그 정도의 일정하거나, 증가하거나, 감소하거나, 연속적인 변동 또는 진동일 수 있다. The term "treatment" within the meaning of the present invention is intended to cure a patient with one or more diseases according to the present invention and / or for a temporary, short term (a few hours to several days), long term (weeks, months or years). Means a treatment that improves the physiological condition of a patient with one or more symptoms associated with the disease, wherein the improvement in the physiological condition is as constant or increased as long as the overall effect indicates a marked improvement in symptoms as compared to the control patient. Or decrease, or may be continuous fluctuations or vibrations.
또한 간질환 및/또는 상피암의 치료와 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 일반적으로 인간 또는 동물(예컨대 수의과적 적용)의 치료 및 처치에 관한 것으로, 일부 소망하는 치료 효과는 상태의 진행을 억제함으로써 얻을 수 있고 또 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중지, 상태의 완화 및 상태의 치유를 포함한다. In addition, the term “treatment” as used herein in connection with the treatment of liver disease and / or epithelial cancer generally relates to the treatment and treatment of humans or animals (such as veterinary applications), with some desired therapeutic effect being the progression of the condition. Can be obtained by suppressing the rate of progression, and the rate of progression, the rate of progression, the relaxation of the state and the healing of the state.
본 발명에 따른 용어 "치료"는 예컨대 순차적인 또는 동시적인 2 이상의 치료 또는 요법이 조합된 조합 치료 및 요법을 포함한다. 예방적 수단으로서 치료(즉, 예방법)도 또한 포함된다. The term "treatment" according to the present invention includes combination treatments and therapies, for example, combining two or more treatments or therapies sequentially or simultaneously. Treatment also includes prophylactic measures (ie prophylaxis).
본 발명에 따른 치료는 당업자에게 일반적으로 공지된 방식, 예컨대 본 발명에 따른 약학적 조성물의 경구 투여 또는 정맥 주사에 의해 실시할 수 있다. Treatment according to the invention can be carried out in a manner generally known to those skilled in the art, such as by oral administration or intravenous injection of the pharmaceutical composition according to the invention.
치료 효능 및 독성, 예컨대 ED50 및 LD50은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 과정에 의해 측정한다. 치료 및 독성 효과 사이의 투여 비는 치료 지수이며 LD50/ED50 로 표시될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약학적 조성물이 바람직하다. 투여는 치료할 환자 개인의 나이, 체중 및 상태 뿐만 아니라 투여 경로, 투여 형태 및 복약 계획 및 소망하는 결과에 맞게 선택해야 하며, 정확한 투약량은 의사가 결정해야 한다. Therapeutic efficacy and toxicity, such as ED 50 and LD 50 , are measured by standard pharmaceutical procedures in cell culture or experimental animals. The dose ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and can be expressed as LD 50 / ED 50 . Pharmaceutical compositions that exhibit large therapeutic indices are preferred. Dosing should be selected based on the age, weight and condition of the individual to be treated, as well as the route of administration, dosage form and medication plan and the desired outcome, and the exact dosage should be determined by the physician.
실제 투약량은 처리할 질환의 성질 및 심각성에 따라 달라지며 또 의사의 분별력 범위에서 이루어지며 또 본 발명의 특정 상황에 대해 소망하는 치료 효과를 내기 위한 투약량의 적정에 의해 변화될 수 있다. 그러나, 개별 투여당 약 0.1 내지 500 mg/kg, 바람직하게는 약 0.1 내지 100 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mg/kg의 활성성분을 포함하는 약학적 조성물이 치료 처리에 적합하다. The actual dosage depends on the nature and severity of the disease to be treated and is within the discretion of the physician and may be varied by titration of the dosage to produce the desired therapeutic effect for the particular situation of the invention. However, pharmaceutical compositions comprising from about 0.1 to 500 mg / kg, preferably from about 0.1 to 100 mg / kg, most preferably from about 0.1 to 10 mg / kg of active ingredient per individual dose are suitable for therapeutic treatment. .
일반적으로, 본 발명에 따른 적합한 투여량은 치료할 환자의 체중 킬로그램당 하루에 약 0.1 mg 내지 약 250 mg 범위이다. In general, suitable dosages according to the invention range from about 0.1 mg to about 250 mg per kilogram of body weight of the patient to be treated.
활성성분은 하루에 1회 또는 수회 투여될 수 있다. 특정 경우 만족스런 결과는 0.1 mg/kg을 정맥 주사(i.v.) 및 1 mg/kg 경구투여(p.o.)로 아주 낮은 투여량일 때 얻을 수 있다. 바람직한 범위는 0.1 mg/kg/일 내지 약 10 mg/kg/일 i.v. 및 1 mg/kg/일 내지 약 100 mg/kg/일 p.o.이다.The active ingredient may be administered once or several times a day. In certain cases satisfactory results can be obtained with very low doses of 0.1 mg / kg intravenously (i.v.) and 1 mg / kg orally (p.o.). Preferred ranges are from 0.1 mg / kg / day to about 10 mg / kg / day i.v. And 1 mg / kg / day to about 100 mg / kg / day p.o.
또한 본 발명은 종래 기술에 공지된 표준 방법을 이용하여 활성 화합물을 적합한 약학적 담체와 함께 혼합하거나 용해시키는 것을 포함하는 간질환 및/또는 상피암의 치료 및/또는 예방하는데 유용한 본 발명에 따른 산화방지제 화합물을 함유하는 의약의 제조에 관한 것이다. 이러한 방법은 활성 화합물을 1 이상의 액세사리 성분을 포함하는 담체와 혼합시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 제제는 활성 화합물을 담체(예컨대 액체 담체, 미세하게 분쇄된 고형 담체)와 균일하고 긴밀하게 혼합한 다음 필요한 경우 그 생성물을 성형하는 것에 의해 제조한다. 본 발명에 사용되는 적합한 담체, 희석제 및 부형제는 표준 약학적 문헌에서 찾아 볼 수 있다(예컨대 Handbook for Pharmaceutical Additives, 2001, 2nd edition, eds. M. Ash and I. Ash). The invention also provides an antioxidant according to the invention useful for the treatment and / or prevention of liver disease and / or epithelial cancer comprising mixing or dissolving the active compound with a suitable pharmaceutical carrier using standard methods known in the art. It relates to the manufacture of a medicament containing a compound. Such methods include mixing the active compound with a carrier comprising at least one accessory component. In general, the preparations according to the invention are prepared by uniformly and intimately mixing the active compounds with a carrier (such as a liquid carrier, a finely divided solid carrier) and then molding the product if necessary. Suitable carriers, diluents and excipients for use in the present invention can be found in standard pharmaceutical literature (eg Handbook for Pharmaceutical Additives, 2001, 2nd edition, eds. M. Ash and I. Ash).
본 발명에 따른 산화방지제 화합물, 예컨대 비타민 E의 유도체, 조효소 Q10 또는 글루타민 퍼옥시다아제 유사약은 미국특허 6,331,532호, WO 99/26954호, WO 2004/014927호 또는 WO 2003/016323호에 기재된 화합물을 제조하기 위한 공지 방법에 따라 합성할 수 있다. Antioxidant compounds according to the invention, such as derivatives of vitamin E, coenzyme Q 10 or glutamine peroxidase analogues, can be prepared by the compounds described in US Pat. No. 6,331,532, WO 99/26954, WO 2004/014927 or WO 2003/016323. It can synthesize | combine according to the well-known method for manufacturing.
본 발명의 조성물, 방법 및 공정에는 다양한 변형이 가해질 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부한 특허청구범위 및 이들의 상당물의 범위에 속하는 한 이러한 변형과 변이를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 명세서에 참고문헌 목록에 포함된다. It will be appreciated by those skilled in the art that various modifications can be made to the compositions, methods and processes of the present invention. Accordingly, it is to be understood that the invention includes such modifications and variations as long as they come within the scope of the appended claims and their equivalents. All references cited herein are hereby incorporated by reference.
미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제, 예컨대 비타민 E의 유도체, 조효소 Q10 또는 글루타민 퍼옥시다아제 유사약의 본 발명에 따른 간질환 치료 및/또는 예방에서의 효과를 평가하기 위하여, 문맥(글리슨의 트라이아스) 주변의 염증 세포와 같은 형태학적 변형의 존재 및 간세포 손상(괴사, 세포골격의 파괴(실시예 3, 도 1) 및 간세포의 팽창, 조밀 케라틴 중간체 필라멘트(IF) 네트워크의 형성, 케라틴 IF의 밀도 감소 및 다양한 선천성 및 후천성 간질환에서 가장 빈번한 IF-관련 세포골격 변형 중의 하나를 나타내는 말로리 소체(MB)의 존재를 본 발명에 따른 산화방지제에 의해 처리함으로써 또는 처리없이 평가하였다(실시예 2 및 3). In order to evaluate the effect of mitochondrially targeted antioxidants such as derivatives of vitamin E, coenzyme Q 10 or glutamine peroxidase analogs in the treatment and / or prevention of liver disease according to the invention, the context (Gliason Trias) Presence of morphological modifications such as inflammatory cells and hepatocellular damage (necrosis, destruction of the cytoskeleton (Example 3, FIG. 1) and swelling of hepatocytes, formation of dense keratin intermediate filament (IF) networks, reduction in the density of keratin IF and The presence of Mallory bodies (MB), which represents one of the most frequent IF-related cytoskeletal modifications in various congenital and acquired liver diseases, was evaluated by treatment with or without treatment according to the present invention (Examples 2 and 3).
MB를 비롯한 형태학적 변형은 정진균성 약물 그리세오풀빈(GF) 또는 포르피로게닉제 3,5-디에톡시카르보닐-1,4-디히드로콜리딘(DDC)에 의한 만성 중독에 의해 마우스에서 재현될 수 있다(Denk H. et al., 1975, Lab. Invest: 773-776; Tsunoo C. et al., 1987, J. Hepatol., 5: 85-97). MB 형성은 DDC- 또는 GF 함유 규정식을 섭취함으로써 마우스 간에서 유도될 수 있다(실시예 1 참조). 메틸 라디칼에 의해 유도된 산화적 손상은 DCC 또는 GF-섭취한 동물 및 ASH 또는 NASH를 갖는 사람의 간에서 일반적인 병리 원리이며, 에탄올의 사이토크롬 P450-매개 산화 뿐만 아니라 아세트알데히드 및 자유 지방산 고부하에 의해 유발된 미토콘드리아성 손상에 의해 생성된 자유 라디칼은 중심 특징이다(Lieber C.S., 2000, J. Hepatol., 32: 113-128; Anguilo P., 2002, N Engl. J. Med., 346: 1221-1231). Morphological modifications, including MB, are reproduced in mice by chronic intoxication with the fungal drug griseofulvin (GF) or
또한 DDC- 또는 GF 섭취 마우스에서 IF 케라틴 세포골격뿐만아니라 MB의 화학조성의 변화는, 동일하지 않다면, 인간 ASH 및 NASH에서 발견되는 변화와 아주 유사하다(Denk H. et al., 2000, J. Hepatol., 32: 689-702). 이와 관련하여, 알코올-함유 규정식 섭취를 기본으로 하는 알코올성 간질환에 대한 다른 마우스 모델은 지방 대사의 방해를 나타내며 또 어는 정도 인간의 ASH의 염증을 나타내지만 케라틴 IF 세포골격의 변형은 나타내지 않으며 MB 형성도 초래하지 않는다. In addition, changes in the chemical composition of MB as well as the IF keratin cytoskeleton in DDC- or GF-fed mice are very similar to those found in human ASH and NASH, if not identical (Denk H. et al., 2000, J. Hepatol., 32: 689-702). In this regard, other mouse models for alcoholic liver disease based on alcohol-containing diet ingestion show obstruction of fat metabolism and to some extent inflammation of human ASH, but no modification of keratin IF cytoskeleton and MB. It does not result in formation.
실험(실시예 2)의 일개 유형에서, 핵주변 세포질 영역에 전형적으로 위치하는 대형 MB의 외관은 통상의 조직면역화학(헤모크실린 및 에아오신 염색) 또는 p62 단백질에 대한 항체 SMI 31을 사용한 면역형광 현미경 표준 방법을 이용하여 6 내지 10주간의 중독시 시험된 마우스에서 검출하였다(Zatloukal K. et al., 2002, Am J Pathol. 160 (1): 255-63). p62는 원래 p56lck의 SH2 도메인의 포스포티로신-독립적 리간드로서 또 세포질 비-프로테아좀 유비퀴틴-결합 단백질로서 확인되었다(Vadlamudi R.K. et al., 1996, J. Biol. Chem., 271: 20235-20237). 세포 스트레스 감응에서 p62의 일반적 역할은, p62 발현이 다양한 스트레스 자극, 특히 산화적 스트레스에 의해 증가되었기 때문에 암시되었다(Ishii T. et al., 1996, Biochem Biophys.Res Comm., 226: 456-460). In one type of experiment (Example 2), the appearance of large MBs, typically located in the periplasmic cytoplasmic region, is characterized by conventional tissue immunochemistry (hemoxillin and eosin staining) or immunization using antibody SMI 31 against p62 protein. Detection was performed in mice tested at 6-10 weeks of intoxication using fluorescence microscopy standard methods (Zatloukal K. et al., 2002, Am J Pathol. 160 (1): 255-63). p62 was originally identified as a phosphotyrosine-independent ligand of the SH2 domain of p56 lck and as a cytoplasmic non-proteasome ubiquitin-binding protein (Vadlamudi RK et al., 1996, J. Biol. Chem., 271: 20235- 20237). The general role of p62 in cellular stress response was implied because p62 expression was increased by various stress stimuli, in particular oxidative stress (Ishii T. et al., 1996, Biochem Biophys. Res Comm., 226: 456-460 ).
중독으로부터 회복하는 4주에 세포질 케라틴 필라멘트를 갖지 않는 간세포 군이 있지만 여전히 데스모좀과 조합하여 세포 주변에서 MB의 잔류량 소량을 함유한다. 마우스를 GF 또는 DDC에 다시 노출시키면, 다수의 MB가 24 내지 72시간 내에 다시 나타난다(Stumptner C. et al., 2001, J. Hepatol., 34: 665-675). 이것은 재중독이 중지되면, 알레르기 반응과 유사하게 독성 기억 효과로서, MB 형성을 향상시켰다. At 4 weeks of recovery from intoxication there is a group of hepatocytes that do not have cytoplasmic keratin filaments but still contain a small amount of MB around the cell in combination with the desmosome. When the mouse is reexposed to GF or DDC, multiple MBs reappear within 24 to 72 hours (Stumptner C. et al., 2001, J. Hepatol., 34: 665-675). This, when re-addiction ceased, enhanced MB formation as a toxic memory effect, similar to an allergic reaction.
초기 단계의 DDC 또는 GF 중독된 마우스 간에서 형태적 변화의 진행에 대한 본 발명에 따른 산화방지제의 효과를 평가하기 위하여, 양성 대조 동물군(GF 또는 DDC 에만 3 내지 7일 노출)을 3 내지 7일 동안 Mito Q(미토퀴놀[10-(3,6-디히드록시-4,5-디메톡시-2-메틸페닐)데실]트리페닐포스포늄 브로마이드 및 미토퀴논[10-(4,6-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-시클로헥사디엔-1-일)데실]트리페닐포스포늄 브로마이드) 또는 Mito Vit E [2-(3,4-디히드로-6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸-2H-1-벤조피란-2-일)에틸]-트리페닐포스포늄 브로마이드)에 의해 처리된 DDC- 또는 GF 중독된 마우스와 비교하였다. 시험된 마우스는 본 발명에 따른 산화방지제 화합물, 예컨대 Mito Q 또는 Mito Vit E를 포함하는 복강내 주사액(i.p.) 또는 정맥(i.v.) (꼬리 정맥) 주사액에 처리되었고, 또 이들 마우스를 부형제-주사된 대조용 마우스(산화방지제의 용해도를 유지하기 위하여 충분한 DMSO가 보충된 PBS) 및 다른 적합한 대조용 마우스와 비교하였다(실시예 3). In order to assess the effect of the antioxidant according to the invention on the progression of morphological changes in early stage DDC or GF addicted mice livers, a positive control animal group (3-7 days exposure only to GF or DDC) was subjected to 3-7 days. Mito Q (mitoquinol [10- (3,6-dihydroxy-4,5-dimethoxy-2-methylphenyl) decyl] triphenylphosphonium bromide and mitoquinone [10- (4,6-dimethoxy) -2-methyl-3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-yl) decyl] triphenylphosphonium bromide) or Mito Vit E [2- (3,4-dihydro-6-hydride Compared to DDC- or GF addicted mice treated with Roxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-1-benzopyran-2-yl) ethyl] -triphenylphosphonium bromide). Mice tested were treated with intraperitoneal injection (ip) or intravenous (iv) (tail vein) injections comprising an antioxidant compound according to the invention, such as Mito Q or Mito Vit E, and these mice were excipient-injected. Control mice (PBS supplemented with sufficient DMSO to maintain the solubility of the antioxidant) and other suitable control mice (Example 3).
또한, MitoS (미토퀴놀[10-(3,6-디히드록시-4,5-디메톡시-2-메틸페닐)데실]트리페닐포스포늄 메탄 술포네이트 및 미토퀴논 [10-(4,6-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-시클로헥사디엔-1-일)데실]트리페닐포스포늄 메탄 술포네이트의 혼합물 또는 Mito Vit E와 같은 MitoQ 또는 MitoQ 유도체가 규정식에 보충될 수 있다. 투여량은 물 또는 액체 규정식 소비 및 마우스 체중을 측정함으로써 결정한다(Smith R.A. J. et al., 2003, PNAS, 100(9): 5407-5412). MitoS (mitoquinol [10- (3,6-dihydroxy-4,5-dimethoxy-2-methylphenyl) decyl] triphenylphosphonium methane sulfonate and mitoquinone [10- (4,6-dimeth) A mixture of methoxy-2-methyl-3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-yl) decyl] triphenylphosphonium methane sulfonate or a MitoQ or MitoQ derivative such as Mito Vit E are incorporated into the diet. Dosage is determined by measuring water or liquid diet consumption and mouse weight (Smith RAJ et al., 2003, PNAS, 100 (9): 5407-5412).
다른 유형의 실험으로, DDC- 또는 GF 중독된 동물 군을 본 발명에 따른 산화방지제(예컨대 Mito Q 또는 Mito S)로 3 내지 7일간 처리한 다음 DDC 또는 GF에만 3 내지 7일간 노출시킨 대조 군과 비교하였다(실시예 3). In another type of experiment, a control group treated with DDC- or GF addicted animals with an antioxidant according to the invention (such as Mito Q or Mito S) for 3 to 7 days and then exposed to DDC or GF only for 3 to 7 days, Comparison was made (Example 3).
다른 실험으로, 3 내지 12 mg/kg의 Mito Q를 DDC 중독된 마우스에게 3일간 동시에 복강 투여하고 대조 동물군과 비교하였다. 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 효과를 단시간 실험으로 평가하기 위하여, 문맥(글리슨의 트리아스) 주변에 염증 세포의 존재(부재) 및 세포 팽창 및/또는 말로리 소체 분석(DDC 또는 GF에 대한 장기간 농출에 전형적임) 대신 괴사, 세포골격의 파괴(도 2 및 3 참조)와 같은 간세포 손상 정도를 적합한 대조군과 비교하였다(도 1 내지 3 참조). 세포 팽창 및 말로리 소체는 DDC에 단시간 노출될 때 통계적 평가가 가능한 정도로 형성되지 않기 때문에 이들 실험에 적합하지 않다. In another experiment, 3-12 mg / kg of Mito Q was intraperitoneally administered to DDC-addicted mice for 3 days and compared with control animals. In order to evaluate the effect of mitochondrially targeted antioxidants according to the present invention in a short time experiment, the presence (absence) of inflammatory cells and portal expansion and / or Mallory body analysis (DDC or GF) around the context (trias of Gleason) Hepatocellular damage, such as necrosis, destruction of the cytoskeleton (see FIGS. 2 and 3), was compared with a suitable control (typical for long-term harvesting) (see FIGS. 1-3). Cell expansion and Mallory bodies are not suitable for these experiments because they do not form to the extent that statistical evaluation is possible when exposed to DDC for a short time.
전체적으로, Mito Q 처리하에서 굴모양혈관(sinusoid)에 의해 경계를 이룬 간세포 스트랜드로 표시되는 정상적인 구조가 다시 관측된다. 간세포의 형태는 핵의 크기 및 형태와 세포질의 구조 면에서 정상이다. 또한 염증성 세포(예컨대 중성구, 림프구, 포식세포, 대식세포)의 개수는 본 발명에 따른 산화방지제 처리시 현저히 감소되었다(도 1 내지 도 3). In total, normal structures, represented by hepatocyte strands bounded by sinusoids under Mito Q treatment, are again observed. Hepatocyte morphology is normal in size and shape of the nucleus and in the structure of the cytoplasm. In addition, the number of inflammatory cells (eg, neutrophils, lymphocytes, phagocytes, macrophages) was significantly reduced upon the antioxidant treatment according to the present invention (FIGS. 1 to 3).
DDC로 중독된 마우스를 사용하여 8 내지 10주간 장기간 실험하는 경우, 처리된 동물의 간 샘플에서 세포 팽창 및/또는 말로리 소체(MB)의 존재를 측정하고 대조 동물군과 비교하였다(실시예 3, 도 4 내지 6). For long term experiments using mice intoxicated with DDC for 8 to 10 weeks, the presence of cell swelling and / or Mallory bodies (MB) in liver samples of treated animals was measured and compared with control animals (Example 3, 4-6).
DDC 또는 GF로 10주 중독시 만성 간 대사질환 및 상피암을 치료 및/또는 예방함에 있어서 이들 산화방지제의 효과를 측정하기 위하여, 시험 마우스에 본 발명에 따른 산화방지제 화합물, 예컨대 Mito Q, Mito S 또는 Mito Vit E를 포함하는 주사액을 7일간 복강 주사 또는 정맥 주사(꼬리 정맥)하고 부형제-주사된 대조군 마우스 및 기타 적합한 대조군과 비교하였다(실시예 3 참조). To determine the effectiveness of these antioxidants in the treatment and / or prevention of chronic liver metabolic diseases and epithelial cancer upon 10 weeks of intoxication with DDC or GF, test mice were tested for antioxidant compounds such as Mito Q, Mito S or Injections containing Mito Vit E were intraperitoneally or intravenously (tail vein) for 7 days and compared with excipient-injected control mice and other suitable controls (see Example 3).
다르게는, 10주간 DDC 중독시킨 후, 시험 동물에 Mito Q(1.25 mg/kg)을 7일간 2회(7일 중 제1일 및 제4일에) 복강 주사하고 통상적인 조직학에 의해 분석하였다(Standard haematoxylin/eosin staining according to Luna L.G., 1968, Manual of Histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology, 3rd edition, McGraw Hill, New York). 세포 팽창 정도 및 말로리 소체 개수는 적합한 대조군과 비교할 때 DDC에 중독된 Mito Q 처리된 동물에서 현저히 감소되었다 (실시예 3, 도 4 내지 6 참조). Alternatively, after 10 weeks of DDC poisoning, the test animals were intraperitoneally injected with Mito Q (1.25 mg / kg) twice for 7 days (on
다른 실험으로, 마시는 수돗물을 통하여 DDC 또는 GF로 8 내지 10주 중독된 마우스에 Mito Q, Mito S 또는 Mito Vit E를 7 내지 14일간 공급하였다(실시예 3). In another experiment, Mito Q, Mito S or Mito Vit E was fed for 7 to 14 days to mice poisoned 8 to 10 weeks with DDC or GF via drinking tap water (Example 3).
다른 실험으로서, 6주간 DDC- 또는 GF 중독된 마우스에 10 내지 50%의 최대 허용 투여량의 Mito Q, Mito Q 또는 Mito VitE를 사용하여 4주간 Mito Q, Mito S 또는 Mito Vit E로 동시에 처리함으로써 본 발명에 따른 산화방지제를 투여한 다음 DDC 또는 GF만으로 10주간 중독된 대조 동물군과 비교하였다(실시예 3 참조). As another experiment, 6-week DDC- or GF addicted mice were treated simultaneously with Mito Q, Mito S or Mito Vit E for 4 weeks using Mito Q, Mito Q or Mito VitE at a maximum tolerated dose of 10-50%. The antioxidant according to the present invention was administered and then compared to a control animal group intoxicated with DDC or GF for 10 weeks (see Example 3).
다른 실험으로서, DDC 또는 GF로 10주간 중독된 마우스를 4주간 회복시켰다. 이 실험에서 독성 기억 효과(DDC 또는 GF 중독에 24 내지 72시간 재노출시킨 결과)는 본 발명에 따른 산화방지제로 동시 치료하는 것에 의해 감소되거나 제거되었다. As another experiment, mice poisoned for 10 weeks with DDC or GF were recovered for 4 weeks. In this experiment the toxic memory effect (resulting from 24 to 72 hours of re-exposure to DDC or GF poisoning) was reduced or eliminated by simultaneous treatment with the antioxidant according to the present invention.
간질환에서 본 발명에 따른 산화방지제의 예방 효과를 평가하기 위하여, DDC- 또는 GF 섭취한 일군의 마우스에 10 내지 50%의 최대 허용 투여량의 Mito Q, Mito S 또는 Mito Vit E를 동시 처리하고 DDC 또는 GF에만 10주간 처리된 대조 동물 군과 비교하였다(실시예 3). To evaluate the prophylactic effect of the antioxidant according to the invention in liver disease, a group of mice ingested with DDC- or GF was co-treated with Mito Q, Mito S or Mito Vit E at a maximum allowable dose of 10-50%. Compared to the control animal group treated with DDC or GF only for 10 weeks (Example 3).
다르게는, DDC 또는 GF로 24 내지 74시간 동안 중독된 다음 4주간 동안 초기 회복 기간 내에 Mito Q, Mito S 또는 Mito Vit E를 투여하며, 이때 처리된 마우스는 DDC- 또는 GF 노출에 2.5개월 노출된 후 산화방지제로 처리되지 않은 대조 동물과 비교하였다. Alternatively, poisoned with DDC or GF for 24 to 74 hours and then administered Mito Q, Mito S or Mito Vit E within the initial recovery period for 4 weeks, wherein treated mice were exposed to 2.5 months of DDC- or GF exposure. It was then compared to control animals that were not treated with antioxidants.
산화방지제, 예컨대 조효소 Q의 유도체, 비타민 E 또는 글루타치온 퍼옥시다아제 유사약의 투여는 형태적 비정상, 예컨대 간세포 팽창, 잘못 폴딩된 단백질의 세포내 봉입물 및 DDC- 또는 GF 중독된 동물의 간에서 MB의 현저한 감소를 제공한다. 이들 결과(실시예 3, 도 1 내지 6)는 이러한 세포 손상이 본 발명에 따른 산화방지제 화합물의 미토콘트리아적으로 표적화에 의해 감소됨을 보여준다. DDC- 또는 GF 중독된 마우스 모델은 NASH 또는 ASH에 걸린 환자에서 관찰된 것과 유사하고 산화방지제, 예컨대 조효소 Q10의 유도체 및 비타민 E의 본 발명에 따른 질환의 치료 또는 예방에서의 역할을 연구하기 위한 강력한 생체내 및 시험관내 시스템을 제공한다. Administration of antioxidants, such as derivatives of coenzyme Q, vitamin E or glutathione peroxidase analogs, may cause morphological abnormalities such as hepatocellular expansion, intracellular inclusions of misfolded proteins and MB in livers of DDC- or GF addicted animals. Provide a significant reduction. These results (Examples 3, FIGS. 1-6) show that such cellular damage is reduced by mitochondrially targeting of antioxidant compounds according to the present invention. DDC- or GF addicted mouse models are similar to those observed in patients with NASH or ASH and are intended to study the role of antioxidants such as coenzyme Q 10 derivatives and vitamin E in the treatment or prevention of the diseases according to the invention. Provides robust in vivo and in vitro systems.
미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제를 사용하여 본 발명에 따른 간질환에 걸린 인간 환자를 치료 및/또는 예방하는 것은 간 병리원인을 현저히 감소시키므로 상기 질환의 치료제로서 치료 및/또는 예방 효과를 제공한다. Treatment and / or prevention of human patients with liver disease according to the invention using mitochondrially targeted antioxidants significantly reduces the cause of liver pathology and thus provides a therapeutic and / or prophylactic effect as a therapeutic agent for the disease.
본 발명에 따른 산화방지제를 사용하거나 사용하지 않고서 대조용 및 DDC-중독된 마우스를 치료함에 있어서 산화적 스트레스를 평가하기 위하여, 분리된 간 미토콘드리아(모든 시험된 동물 군은 실시예 3에서 준비과정에 따라서 준비하였다)에서 토코페롤 퀴논(TQ) 함량(Gille L. et al., 2004, Biochemic. Pharmacology, 68: 373-381)을 실시하였다. 마우스 간 미토콘드리아는 Staniek K 및 Nohl H, 1999, Biochem. et Biophys. Acta, 1413: 70-80; Mela L. and Sietz S., 1979, Methods in Enzymology, Academic Press Inc.: 39-46의 변형 수순에 따라 준비하였고 TQ 함량은 단백질 및 사이토크롬 농도를 비롯한 몇 개 변수 및 착물 I(NADH 탈수소효소), 착물 II(숙시네이트 탈수소효소), 착물 III(사이토크롬 bc1) 및 착물 IV (사이토크롬 옥시다아제)의 활성 시험에 의해 정상화된다. 전체적으로, 이들 실험은 Mito Q로 처리된 마우스 및 대조용 동물과 비교할 때 DDC 중독된 마우스에서 상승된 TQ 양을 나타낸다(실시예 4). In order to assess oxidative stress in treating control and DDC-addicted mice with or without the antioxidant according to the invention, isolated liver mitochondria (all tested animal groups were prepared in preparation in Example 3). Thus prepared) tocopherol quinone (TQ) content (Gille L. et al., 2004, Biochemic. Pharmacology, 68: 373-381). Mouse liver mitochondria are described in Staniek K and Nohl H, 1999, Biochem. et Biophys. Acta, 1413: 70-80; Mela L. and Sietz S., 1979, Methods in Enzymology, Academic Press Inc .: Prepared according to the modification procedure of 39-46 and the TQ content is based on several variables and complex I (NADH dehydrogenase), including protein and cytochrome concentrations. , Complex II (succinate dehydrogenase), complex III (cytochrome bc1) and complex IV (cytochrome oxidase) are normalized by activity tests. Overall, these experiments show elevated TQ amounts in DDC addicted mice as compared to mice treated with Mito Q and control animals (Example 4).
산화적 스트레스에 의해 유도된 단백질을 평가하기 위한 다른 실험으로서, DDC 중독되고 동시에 Mito Q로 단시간 노출(3일, 실시예 5)된 마우스로부터 유도된 추출물을 사용하여 헤모옥시게나아제(HO-1) 발현양의 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다. HO-1 (반응성 산소 종(ROS)에 의해 유도된 것으로 공지됨, Suematsu M. and Ishimura Y., 2000. Hepatology, 31(1): 3-6)의 DDC-유도 과발현의 현저한 감소는 산화적 스트레스가 본 발명에 따른 산화방지제에 의해 간에서 현저하게 감소된 것을 제시한다(실시예 5, 도 7). As another experiment for evaluating proteins induced by oxidative stress, hemooxygenase (HO-1) was used using extracts derived from mice that were DDC addicted and concurrently exposed to Mito Q for short time (3 days, Example 5). ) Western blot analysis of the amount of expression was performed. Significant reduction in DDC-induced overexpression of HO-1 (known to be induced by reactive oxygen species (ROS), Suematsu M. and Ishimura Y., 2000. Hepatology, 31 (1): 3-6) is oxidative It is shown that the stress is significantly reduced in the liver by the antioxidant according to the invention (Example 5, Figure 7).
또한 간세포 손상에 대한 민감한 마커를 나타내는 지방산 결합 단백질(FABP)의 단백질 발현양(Monbaliu D. et al., 2005, Transplant Proc., 37(1): 413-416)은 대조 군과 비교할 때 DDC 중독된 마우스에서 FABP 단백질의 현자한 감소를 나타낸다. 상기 동물 군의 Mito Q 처리하에서, FABP 단백질 발현은 거의 대조 마우스 FABP 발현 값에 미치고 있으므로, 이는 본 발명에 따른 질환의 치료 또는 예방에서 Mito Q의 효과를 다시 보여 주는 것이다(실시예 5). The amount of protein expression of fatty acid binding protein (FABP) (Monbaliu D. et al., 2005, Transplant Proc., 37 (1): 413-416), which represents a sensitive marker for hepatocellular damage, was also associated with DDC poisoning when compared to the control group. Mice exhibited a wise reduction of FABP protein. Under the Mito Q treatment of this animal group, FABP protein expression almost reached control mouse FABP expression values, which again demonstrates the effect of Mito Q in the treatment or prevention of the diseases according to the invention (Example 5).
DDC- 또는 GF 중독된 마우스 대 대조용 마우스에서 본 발명에 따른 산화방지제의 효과를 확인하기 위한 실험으로서, 간의 특정 효소의 혈청 양은 간 손상 및 특히 본 발명에 따른 몇 가지 질환의 특징적인 섬유증의 정도를 제공하는 Actitest (바이오프리딕티브 제조, 프랑스 Houilles 소재)로서 모니터링한다(실시예 6 참조). a2-마크로글로불린, 하프토글로빈, γ-글루타밀 트랜스펩티다아제, 전체 빌리루빈, 아포리포단백질 A1 및 알라닌 아미노트랜스퍼라아제의 혈청 양은 DDC- 또는 GF 처리된, 대조용으로부터 측정하며 상응하는 DDC- 또는 GF 처리된 동물은 Poynard, et al., 2003, Hepatology 38: 481-492에 기재된 방법을 이용하여 실시예 3에 따른 일반적인 시각표에 따라서 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제에 노출된다. As an experiment to confirm the effect of the antioxidant according to the invention in DDC- or GF addicted mice versus control mice, the serum levels of certain enzymes of the liver are characterized by the extent of liver damage and fibrosis characteristic of several diseases according to the invention in particular. It is monitored as Actitest (Biopredictive, Houilles, France) which provides (see Example 6). Serum amounts of a 2 -macroglobulin, haptoglobin, γ-glutamyl transpeptidase, total bilirubin, apolipoprotein A1 and alanine aminotransferase are measured from controls treated with DDC- or GF and corresponding DDC- or GF treated animals are exposed to mitochondrially targeted antioxidants according to the general timeline according to Example 3 using the method described in Poynard, et al., 2003, Hepatology 38: 481-492.
간 손상, 특히 섬유증의 측도로서 인간의 혈청을 사용하여 실시한 Actitest는 본 발명에 따른 산화방지제를 사용하여 상기 질병에 걸린 환자를 치료한 효과를 모니터링하기 위해 유사하게 이용될 수 있다. Actitest performed using human serum as a measure of liver damage, especially fibrosis, can similarly be used to monitor the effectiveness of treating patients with the disease using the antioxidants according to the invention.
다르게는, 다양한 시험 동물 군으로부터 얻은 혈청에서 다음과 같은 간 손상을 나타내는 변수, 예컨대 빌리루빈, 알라닌-아미노트랜스퍼라아제(ALT/GPT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(ASAT/GOT) 및 글루타메이트 탈수소효소(GLDH)는 시판되는 키트를 이용한 임상적 진단법으로 기준 수순에 따라 측정하였다(실시예 6). 본 발명에 따른 화합물로 처리된 동물에서 혈청 간 효소의 감소(예컨대 알라닌- 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 도 8 참조)는 처리된 샘플에서 간 손상의 감소를 나타내며 또 본 발명에 따른 질환에서 이들 화합물의 치료 효능에 대한 지지를 제공한다. Alternatively, variables indicative of liver damage in serum from various test animal groups such as bilirubin, alanine-aminotransferase (ALT / GPT), aspartate aminotransferase (ASAT / GOT) and glutamate dehydrogenase (GLDH) was measured according to the standard procedure in a clinical diagnostic method using a commercially available kit (Example 6). Reduction of serum liver enzymes (such as alanine- and aspartate aminotransferases, see FIG. 8) in animals treated with the compounds according to the invention indicates a reduction in liver damage in the treated samples and these in diseases according to the invention. Provide support for the therapeutic efficacy of the compounds.
반응성 산소 종(ROS)의 생산을 평가하기 위하여, 예컨대 표준 수법(Brandes RP et al., Free Radic Biol Med. 2002; 32 (11): 1116-1122)에 따른 대조용 및 DDC- 및 GF 중독된 동물로부터 제조된 간 분비물(예컨대 냉동 부분)의 디히드로에티듐(DHE) 염색을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 DDC- 또는 GF 중독된 동물의 간에서 생체내 ROS 생산 유도를 허용하므로 본 발명에 따른 질병에 걸린 환자에서의 관찰과 유사하다(실시예 7). DDC- 또는 GF 공급된 마우스에서 ROS 형성을 평가하는 다른 방법은 루시게닌 화학발광 분석법(Goerlach A. et al., 2000, Circ Res., 87(1): 26-32)을 포함한다. To assess the production of reactive oxygen species (ROS), for example, control and DDC- and GF addicted according to standard techniques (Brandes RP et al., Free Radic Biol Med. 2002; 32 (11): 1116-1122). Dihydroethidium (DHE) staining of liver secretions (such as frozen portions) prepared from animals can be used. This method is similar to the observation in patients with disease according to the invention as it allows induction of ROS production in vivo in the liver of DDC- or GF addicted animals (Example 7). Other methods of assessing ROS formation in DDC- or GF fed mice include Lucigenin chemiluminescence assay (Goerlach A. et al., 2000, Circ Res., 87 (1): 26-32).
이 실험은 DDC- 또는 GF-공급된 동물을 본 발명에 따른 표적화된 산화방지제로 처리하는 것을 포함한다(실시예 6). 시험 동물의 DDC- 또는 GF-중독 및 산화방지제를 사용한 이들의 치료에 대한 일반적인 시기 및 투여량은 형태적 비정상을 측정하기 위해 사용되는 실험방법, 예컨대 실시예 3에 따른 DDC- 또는 GF-중독된 동물의 간에서 미스폴딩(misfolding)된 단백질 및 MB의 세포내 봉입물에 대해 사용된 실험 방법과 동일하다. This experiment involved treating DDC- or GF-fed animals with the targeted antioxidant according to the invention (Example 6). The general timing and dosage of test animals for their treatment with DDC- or GF-addiction and antioxidants is determined by the method used to determine morphological abnormalities, such as DDC- or GF-addiction according to Example 3. It is identical to the experimental method used for intracellular inclusions of proteins and MBs that were misfolded in the liver of the animal.
실시예 7에 따른 일반적 수순을 이용하여 산화방지제, 예컨대 비타민 E의 유도체, 조효소 Q10 또는 글루타민 퍼옥시다아제 유사약을 적용하면 ROS 형성을 현저히 감소시키므로 본 발명에 따른 간질환에서 치료 효과를 볼 수 있다(실시예 8). Application of antioxidants, such as derivatives of vitamin E, coenzyme Q 10 or glutamine peroxidase analogs, using the general procedure according to Example 7 significantly reduces ROS formation, thus providing therapeutic effects in liver diseases according to the present invention. (Example 8).
경우에 따라, 간암 세포주(예컨대 HepG2 또는 Hep3B), 간세포 암종으로부터 유도된 SNU-398 세포주 (ATCC No. CRL-2233, 독일 LGC 프로모켐 제조), HUH-7 인간 암종 세포(Japanese collection of Research Biosources JCRB 0403) 또는 Tib-73 마우스 배아 세포주(American Type collection, BAL/c 마우스로부터 유도된 ATCC TIB 73=BNL CL2, 미국 매릴랜드)를 이용하는 시험관내 실험은 DDC 중독시 간세포에서 ROS 생산의 측정을 가능하게 한다(실시예 9). 글루타치온 합성 억제제 L-부티오닌-(S, R)-술폭심(BSO)은 내생 산화적 스트레스를 상승시키기 위하여 적용될 수 있다(Kito M. et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun., 291(4): 861-867). If desired, liver cancer cell lines (such as HepG2 or Hep3B), SNU-398 cell lines derived from hepatocellular carcinoma (ATCC No. CRL-2233, manufactured by LGC Promochem, HUH-7 human carcinoma cells (Japanese collection of Research Biosources JCRB) 0403) or in vitro experiments with Tib-73 mouse embryonic cell line (ATCC TIB 73 = BNL CL2 derived from BAL / c mice, Maryland, USA) allow measurement of ROS production in hepatocytes upon DDC poisoning. (Example 9). Glutathione synthesis inhibitor L-butionine- (S, R) -sulfoxime (BSO) may be applied to increase endogenous oxidative stress (Kito M. et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun., 291 ( 4): 861-867).
분화된 세포주에서 ROS 생산을 측정하기 위하여 CoCl2는 미토콘드리아에 영향을 주는 것으로 최근 밝혀졌기 때문에(Jung JY and Kim WJ., 2004, Neurosci Lett., 371: 85-90), HepG2 (ATT No. HB-8065, 미국 매릴랜드)는 100 μM CoCl2 (시그마)에 의해 자극될 수 있다(Bel Aiba RS., et al., 2004, Biol. Chem. 385: 249-57). Since CoCl 2 has recently been shown to affect mitochondria to measure ROS production in differentiated cell lines (Jung JY and Kim WJ., 2004, Neurosci Lett., 371: 85-90), HepG2 (ATT No. HB -8065, Maryland, USA) can be stimulated by 100 μΜ CoCl 2 (Sigma) (Bel Aiba RS., Et al., 2004, Biol. Chem. 385: 249-57).
배양 세포 (뿐만 아니라 분리된 세포 소기관 또는 전체 조직)에서 잘 확립된 다른 방법은 Chem Biol Interact. 2000 Jul 14; 127(3): 201-217에 따른 안티마이신 A(도 10)에 의해 또는 로테논에 의해 유도된 ROS 생산을 루시게닌 화학발광 분석법(Goerlach A. et al., 2000, Circ Res., 87(1): 26-32)을 이용하여 측정하도록 허용한다. Other well established methods in cultured cells (as well as isolated organelles or whole tissues) are described in Chem Biol Interact. 2000 Jul 14; ROS production induced by antimycin A (FIG. 10) or by rotenone according to 127 (3): 201-217 by Lucigenin chemiluminescence assay (Goerlach A. et al., 2000, Circ Res., 87 ( 1): Allow measurement using 26-32).
DDC(농도 = 50 ㎍/ml 배지), BSO (100 μM 이하) 또는 안티마이신 A(또는 로테논) 또는 CoCl2 (100 μM )에 의해 3일 이하 동안 중독된 간세포 배양액은 시험관내에서 ROS 생산 유도를 나타내므로, 본 발명에 따른 질병에 걸린 환자에서의 관찰과 유사한 다른 적합한 모델을 제공한다. Hepatocyte cultures intoxicated for less than 3 days by DDC (concentration = 50 μg / ml medium), BSO (up to 100 μM) or antimycin A (or rotenone) or CoCl 2 (100 μM) induce ROS production in vitro Thus, another suitable model similar to the observation in a diseased patient according to the present invention is provided.
실시예 9에 따른 표준 수순을 적용함으로써, DDC, BSO, 안티마이신(또는 로테논) 또는 CoCl2 (100 μM)에 의해 중독되고 동시에 Mito Q 또는 Mito Vit E(Jauslin M. L. et al., 2003, FASEB J., (13): 1972-4에 따라 Mito Q의 경우 EC50 = 0.51 nM 또 Mito Vit E의 경우 EC50 = 461 nM에 상응하는 농도)에 의해 처리되거나 또는 나중에 0.5 내지 10 μM 농도 범위로 처리된 분화된 세포주(예컨대 간암 세포)는 ROS 형성이 현저히 감소되었고, 따라서 본 발명에 따른 간질환에서 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 치료 효과를 확인할 수 있다(도 9, 실시예 10 참조). By applying the standard procedure according to Example 9, it is poisoned by DDC, BSO, antimycin (or rotenone) or CoCl 2 (100 μM) and at the same time Mito Q or Mito Vit E (Jauslin ML et al., 2003, FASEB J., (13): according to 1972-4, a concentration corresponding to EC 50 = 0.51 nM for Mito Q and EC 50 = 461 nM for Mito Vit E) or later in a concentration range of 0.5 to 10 μM. Treated differentiated cell lines (such as liver cancer cells) significantly reduced ROS formation, thus confirming the therapeutic effect of mitochondrially targeted antioxidants in liver disease according to the present invention (see FIG. 9, Example 10).
MB는 일차 담관성 간경화증 및 일차 경화쓸개관염과 같은 만성 쓸개즙정체에서 발견된다. 만성 쓸개즙정체 상태를 치료 및/또는 예방함에 있어서 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 효과를 측정하기 위하여, DCC- 또는 GF 중독된 마우스에 대해 상기 기재한 처리 수법(실시예 3)을 실시하였다. 회복된 약물-처리된 동물은 Mito Q 및 Mito Vit E와 함께 또는 사용하지 않고 보통의 담즙 관 결찰(CBDL)처리시키거나 또는 담즙산(CA)-보충된 규정식을 7일간 공급(Fickert P. et al. 2002, Am. J. of Pathology, 161 (6): 2019-2026)하고 적합한 대조군과 비교하였다. MB is found in chronic cholestasis, such as primary cholangiocytosis and primary sclerotic cholangitis. In order to measure the effect of mitochondrially targeted antioxidants according to the invention in treating and / or preventing chronic cholestatic conditions, the treatment described above for DCC- or GF addicted mice (Example 3) Was carried out. The recovered drug-treated animals were treated with normal bile duct ligation (CBDL) or with bile acid (CA) -supplemented diet for 7 days with or without Mito Q and Mito Vit E (Fickert P. et. al. 2002, Am. J. of Pathology, 161 (6): 2019-2026) and compared with a suitable control.
간 섬유증 및 경화증의 치료 및/또는 예방에서 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 효과를 측정하기 위한 일반적 수법은 본 발명에 따른 산화방지제 처리된 마우스 또는 렛트 모델에서 사염화탄소(CCl4)-유도된 간 손상(Arias I.M. et al., 1982, The Liver Biology and Pathobiology. Raven Press, New York)을 적용한다. A general technique for determining the effect of mitochondrially targeted antioxidants in the treatment and / or prevention of liver fibrosis and sclerosis is carbon tetrachloride (CCl 4 ) -induced liver injury in an antioxidant treated mouse or rat model according to the present invention. (Arias IM et al., 1982, The Liver Biology and Pathobiology.Raven Press, New York).
상기 DDC- 또는 GF 중독된 마우스에 대해 상기 기재한 처리 방법을 따라서 상피암의 치료 및/또는 예방에서 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 효과를 측정하기 위하여, 인간 상피 세포 암 이종 이식편(누드 마우스 종양 이종이식편, 예컨대 미국 찰스 리버스 라보라토리스가 제조한 CD1 nu/nu 마우스)을 갖는 면역보상된 마우스를 이용한다. 종래 기술(Li K. et al., 2003, Cancer Res., 63(13): 3593-3597)에 공지된 표준 방법에 따라 피하로 이종이식된 종양은 결장 샘암종, 침습적 관상 유방암, 소형 및 비소형 세포 폐암, 전립선 암, 췌장암 및 위암을 포함하며, 이들에 한정되지 않는다. In order to measure the effect of mitochondrially targeted antioxidants according to the invention on the treatment and / or prevention of epithelial cancer according to the treatment methods described above for the DDC- or GF addicted mice, a human epithelial cell carcinoma xenograft ( Immunocompensated mice with nude mouse tumor xenografts, such as CD1 nu / nu mice manufactured by Charles River Laboratories, USA, are used. Tumors xenografted subcutaneously according to standard methods known in the prior art (Li K. et al., 2003, Cancer Res., 63 (13): 3593-3597) are colon adenocarcinomas, invasive coronary breast cancers, small and non-small. Cell lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer and gastric cancer.
이러한 마우스의 치료는 종양 생장의 감소, 종양 괴사 향상 및 종양 이종이식편의 혈관화 감소를 나타낸다. 유사하게, 누드 마우스 종양 이종이식편에서 ROS의 양도 상기와 같이 모니터링하며 본 발명에 따른 산화방지제로 처리된 이종이식편 종양에서 감소되었다(실시예 11). Treatment of these mice shows reduced tumor growth, improved tumor necrosis and reduced vascularization of tumor xenografts. Similarly, the amount of ROS in nude mouse tumor xenografts was also monitored and reduced in xenograft tumors treated with the antioxidant according to the invention (Example 11).
간질환 및 간 및 기타 상피암의 치료 또는 예방 기술과 비교하여, 본 발명에 따른 치료 방법은 놀랍게도 향상되고, 지속적이며 보다 효과적인 치료법을 제공한다. Compared with the treatment or prophylaxis techniques of liver disease and liver and other epithelial cancers, the treatment method according to the present invention is surprisingly improved and provides a continuous and more effective treatment.
본 발명은 이하의 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하며 본 발명의 바람직한 구체예 및 특징은 이들에 한정되지 않는다. The present invention will be described in detail with reference to the following drawings and examples, and preferred embodiments and features of the present invention are not limited thereto.
도 1 1 내지 도To 3: 3: DDCDDC 에 단시간(3일) 노출될 때 마우스 간에서 간세포 손상 정도에 대한 Of hepatocellular damage in mouse liver when exposed to short time (3 days) MitoMito Q의 효과 Q effect
도 1: 정상 간은 스트랜드 상으로 대부분 배열된 간세포를 특징으로 하며, 간세포의 이들 스트랜드 사이에 위치한 중앙 정맥(삼각형) 및 굴모양 혈관(C, 원래는 백색이며 적혈구세포를 나타내는 몇 개의 적색 반점 있음)으로 배향된다. 간세포의 핵(A, H&E 염색시 원래 청색)는 크고, 응축되지 않으며 대부분 1개의 뚜렷한 핵소체, 세포질(B로 표시, H&E 염색시 비교적 균일한 분홍색으로 염색됨)을 나타낸다. 문맥(아스테리스크 표시) 주변의 림프구 또는 과립구를 갖는 삼출액은 검출되지 않았다(200 x 배율). Figure 1: Normal livers are characterized by hepatocytes arranged mostly on strands, with central veins (triangles) and oyster-shaped blood vessels (C, originally white, located between these strands of hepatocytes, with several red spots representing red blood cells). Oriented). The nuclei of hepatocytes (originally blue in A, H & E staining) are large, non-condensing and mostly show one distinct nucleolus, cytoplasm (marked B, stained relatively uniform pink in H & E staining). No exudates with lymphocytes or granulocytes around the portal vein (Asterisk display) were detected (200 × magnification).
도 2: DDC로 3일간 중독된 후 간의 구조는 심각하게 손상된다: 간세포의 규칙적 배열은 손상된다. 특히 문맥 (아스테리스크로 표시) 주변에서 림프구 및 과립구의 삼출이 관찰되었다(화살표 표시). 간세포는 상이한 세포 손상 정도를 나타낸다: 세포는 다른 세포와 접촉하면 접촉을 잃고, 핵은 농축되며 세포질은 세포자살의 표지로 청색-분홍색을 나타낸다. 세포 크기 증가(팽창) 및 세포질은 불균일하고, 사이토케라틴의 덩어리가 보일 수 있다. 또한, 세포는 괴사의 표시로서 형질막 을 손실한다. A, B, C는 도 1과 동일하다. 문맥(아스테리스크로 표시) 주변에서 염증성 세포(화살표 표시) 및 손상된 간세포(세포 경계가 불분명, 세포 팽창)가 검출된다. 프로토포르피린(소형 갈색 점)의 침착은 프로토햄 페릴라아제 상의 DDC- 특정 효과를 나타낸다. A, B, C는 도 1과 동일하다 (배율: 400x). Figure 2: After 3 days of poisoning with DDC, the structure of the liver is severely impaired: the regular array of hepatocytes is impaired. In particular, effusion of lymphocytes and granulocytes was observed around the portal vein (marked with asterisk) (arrows). Hepatocytes show different degrees of cellular damage: the cells lose contact when in contact with other cells, the nucleus is concentrated and the cytoplasm is blue-pink as a marker of apoptosis. Cell size increase (expansion) and cytoplasm are heterogeneous, and clumps of cytokeratin may be seen. In addition, cells lose the plasma membrane as an indication of necrosis. A, B, and C are the same as in FIG. Inflammatory cells (marked with arrows) and damaged hepatocytes (clear cell boundaries, cell expansion) are detected around the portal vein (marked with asterisk). Deposition of protoporphyrins (small brown spots) shows DDC-specific effects on protoham perillase. A, B, and C are the same as in Fig. 1 (magnification: 400x).
도 3: Mito Q(PBS/1% DMSO(6 mg/kg에 상응하는 225 nmol/동물/일)중의 Mito Q)로 동시 처리한 후, 굴모양혈관에 의해 경계가 진 간세포 스트랜드와 함께 정상 구조를 다시 볼 수 있다. 간세포의 형태는 핵의 크기와 형태 및 세포질의 구조 면에서 정상이다(실시예 3). 문맥(아스테리스크로 표시) 주변에서 염증성 세포 부재; 세포 팽윤 및 프로토포르피린의 침착을 약간 나타내는 것을 제외하고는 간세포는 정상으로 보인다. A, B, C는 도 1 및 2와 동일하다(배율: 400 x). Figure 3: Normal structure with hepatocyte strand bound by oyster blood vessels after co-treatment with Mito Q (Mito Q in PBS / 1% DMSO (225 nmol / animal / day corresponding to 6 mg / kg)) You can see it again. Hepatocyte morphology is normal in terms of nucleus size and morphology and cytoplasmic structure (Example 3). Absence of inflammatory cells around the portal vein (marked as asterisk); Hepatocytes appear normal except for a slight indication of cell swelling and protoporphyrin deposition. A, B, and C are the same as in Figs. 1 and 2 (magnification: 400 ×).
도 4 4 내지 도To 6: 6: DDCDDC 에 장시간(10주) 노출될 때 마우스 간에서 간세포 손상 정도에 대한 Of hepatocellular injury in mouse liver after prolonged exposure (10 weeks) MitoQMitoq 의 효과 Effect
도 4: DDC-중독되지 않은 정상 마우스(연령: 4개월)에서 일반적으로 간 구조는 도 1A에 도시한 DDC-중독되지 않은 어린 마우스의 간 구조와 유사하다(A = 핵, B =세포질, C = 굴모양 혈관). 문맥(아스테리스크 표시) 주변에 염증은 없고 간 세포는 스트랜드 형으로 배열된다. 이러한 세포의 세포질은 규칙적으로 염색되며 균일한 크기이다; 세포의 팽창이나 말로리 소체 형성은 보이지 않는다(배율: 400x). Figure 4: In normal non-DDC-addicted mice (age: 4 months), liver structure is generally similar to that of non-DDC-addicted young mice shown in Figure 1A (A = nucleus, B = cytoplasm, C = Oyster vessel). There is no inflammation around the portal vein (asterisk mark) and the liver cells are arranged in strand form. The cytoplasm of these cells is regularly stained and of uniform size; No expansion of the cells or formation of malorisomes was seen (magnification: 400 ×).
도 5: 구조는 도 1 내지 4에 도시된 것과 동일하며(참고 A = 핵(원래 청색), B = 세포질(원래 분홍색), C = 굴모양혈관 (원래 붉은 점을 갖는 백색)) 또 D 원래 갈색은 담즘 도관에서 색소(주로 프로토포르피린)을 나타낸다. DDC에 의해 10주간 중독된 다음 DDC없이 1주간 회복한 후, 간세포의 배열은 여전히 방해된다. 간세포는 세포구조의 파괴에서부터 세포 팽창 및 말로리 소체의 형성(화살)에 이르는 다양한 세포 손상 정도를 나타낸다. 담즙 도관에서 특히 프로토포르피린의 축적이 나타났다(화살머리표), 배율: 400x. Figure 5: The structure is the same as shown in Figures 1-4 (reference A = nucleus (original blue), B = cytoplasm (original pink), C = oyster-shaped vessel (white with original red dot)) and D original Brown represents pigment (primarily protoporphyrin) in the dulce conduit. After 10 weeks of poisoning by DDC and then recovery for 1 week without DDC, the arrangement of hepatocytes is still disturbed. Hepatocytes exhibit varying degrees of cellular damage, from disruption of cell structure to cell expansion and the formation of arrowhead bodies (arrows). The accumulation of protoporphyrin was especially seen in the bile duct (arrowhead), magnification: 400 ×.
도 6: 10주간의 DDC 중독 후, 회복기(DDC 없이 1주간) 처리를 2회의 MitoQ 주사로 실시하였다. 회복하는 동안 향상은 현저하다; 간세포 형태 변화는 극히 적었다. 다수의 간세포는 정상으로 보이며 세포 팽창 및/또는 말로리 소체 형성은 존재하지 않았다. 문맥(아스테리스크 표시) 주변의 담즙 도관에서 프로토포르피린의 축적은 현저히 감소되었다. 구조는 도 1 내지 5에서와 동일하였다(참조 A = 핵 (원래 청색), B = 세포질 (원래 분홍색), C = 동굴형 혈관(적색 점을 갖는 원래 백색) 및 원래 갈색인 D는 색소(주로 프로토포르피린)임). 배율: 400x. Figure 6: After 10 weeks of DDC poisoning, recovery phase (1 week without DDC) treatment was performed with two MitoQ injections. The improvement is remarkable during recovery; Hepatocellular morphology changes were minimal. Many hepatocytes appear normal and there was no cell expansion and / or malorisome formation. The accumulation of protoporphyrins in the bile ducts around the portal vein (Asterisk mark) was significantly reduced. The structure was the same as in FIGS. 1-5 (reference A = nucleus (original blue), B = cytoplasm (original pink), C = cavernous vessels (original white with red spots) and D, originally brown, pigment (mainly Protoporphyrin). Magnification: 400x.
도 7: Figure 7: MitoQMitoq 로 처리된 Treated with DDCDDC 중독된 마우스에서 In poisoned mouse 헤목시게나아제(HO-1)의Of hemoxigenase (HO-1) 유도 형태의 발현 Expression of the induced form
HO-1 (32 kDa, 화살표로 표시)의 웨스턴 블럿 분석은 DDC 중독(레인 번호 4, 5, 6, DDC를 갖는 용매 대조용)에서 현저한 유도를 나타내는 반면에, MitoQ에 의한 처리(레인 7, 8 = DDC 없이 112 nmol/kg MitoQ 및 레인 9, 10 = DDC와 함께 112 nmol/kg MitoQ)는 HO-1 단백질 발현의 강한 감소를 초래한다. 레인 번호 1 내지 3은 DDC없이 용매 대조용을 나타낸다. 저 분자량 단백질 마커(22, 36, 55, 64, 98 및 148 kDa)를 사용한다. Western blot analysis of HO-1 (32 kDa, indicated by arrows) shows significant induction in DDC intoxication (
케미마저(Chemimager) 5500 소프트웨어(알파 이노테크 제조)를 이용하여 구 성적으로 발현된 동형체 HO-2(36 kDa)와 대조적으로 레인 1 내지 10의 HO-1 단백질 발현을 정상화하기 위하여, DDC 중독된 마우스로 표시되는 대조군과 비교할 때 MitoQ로 처리된 DDC 중독 동물에서 HO-1의 7배 감소를 나타내었다. 전체적으로, DDC 중독된 마우스(3일간)는 매일 PBS/1% DMSO 중의 MitoQ로 복강 주사되어 분석되며 적합한 대조군과 비교한다. DDC poisoning to normalize HO-1 protein expression in lanes 1-10 in contrast to homologous HO-2 (36 kDa) constitutively expressed using Chemimager 5500 software (Alpha Innotech) A 7-fold reduction in HO-1 was seen in DDC-addicted animals treated with MitoQ when compared to the control indicated by mice. In total, DDC poisoned mice (3 days) are analyzed by intraperitoneal injection with MitoQ in PBS / 1% DMSO daily and compared with the appropriate control.
도 8: Figure 8: DDCDDC 중독된 마우스의 동시 Simultaneous Addication of Mice MitoQMitoq 처리하에서 혈청 변수 Serum Variables Under Treatment
다양한 동물 군으로부터 얻은 혈청에서 간 손상을 나타내는 혈청 간 효소의 활성, 즉 빌리루빈, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT/GPT; 백색 막대로 표시한 다이아그램), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (ASAT/GOT 흑색 막대로 표시한 다이아그램)은 히타치/로췌 917 분석기 상에서 시중에서 구입할 수 있는 키트(No: 11552414; 11876805216; 11876848216, 모두 스위스의 로췌 아게로부터 구입)를 이용함으로써 임상적 진단의 표준 수순을 따라서 결정한다. Activity of serum liver enzymes showing hepatic damage in serum from various animal groups, ie bilirubin, alanine aminotransferase (ALT / GPT; diagram as white bar), aspartate aminotransferase (ASAT / GOT black) Bar diagrams) are determined according to the standard procedure for clinical diagnosis by using a commercially available kit (No: 11552414; 11876805216; 11876848216, all purchased from Loch Ague, Switzerland) on the Hitachi / Lactin 917 Analyzer. .
레인: 1 및 2는 DDC 중독되지 않은 동물 군 및 DDC 중독된 마우스를 나타낸다. 레인 3 내지 5는 3-, 6- 및 12 mg/kg의 농도로 DDC 중독된(3일) 및 동시에 MitoQ 처리된 동물을 나타낸다. 효소 활성의 가장 현저한 감소는 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT/GPT, 백색 막대로 표시), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST/GOT, 흑색 막대)를 나타내는 한편, 빌리루빈 활성은 어떤 변화를 나타내지 않는다(데이터 나타내지 않음). Lanes: 1 and 2 represent non-DDC addicted animal groups and DDC addicted mice.
도 9: Figure 9:
MitoQMitoq
에 의해 동시 처리된 Concurrently processed by
HepG2
5μM MitoQ는 자극되지 않은 세포에서 기저 ROS 생산을 감소시킬 수 있다. (레인 2 참조). CoCl2-유도된 ROS 생산 (100 μM CoCl2)은 5 μM MitoQ에 의해 감소되었다. 이들 결과는 5 μM MitoQ는 HepG2 세포에서 기저 및 CoCl2 자극된 ROS 수준을 현저히 감소시킨다(실시예 10). "A"(레인 4, 5, 6)는 HepG2 세포가 CoCl2 에 의해 자극된 것임을 의미한다. X축은 MitoQ [ μM]의 농도 범위를 나타내고 y축은 상대적 DCF 형광[%]를 나타낸다. *P < 0.05 대 자극되지 않은 (0 μM MitoQ); #p< 0.05 대 CoCl2.5 μM MitoQ can reduce basal ROS production in unstimulated cells. (See lane 2). CoCl 2 -induced ROS production (100 μM CoCl 2 ) was reduced by 5 μM MitoQ. These results show that 5 μM MitoQ significantly reduces basal and CoCl 2 stimulated ROS levels in HepG2 cells (Example 10). "A" (
도 10: Figure 10:
루시게닌
HUH-7 세포를 6개 플레이트에서 배양하고 37℃ 에서 3시간 동안 DMEM (Gibco 제조)에 용해된 0 내지 1000 nmol 농도 범위의 MitoQ를 동시에 사용하거나 사용하지 않고 농도 0 내지 25μM (0, 1 및 5 μM)의 안티마이신 A에 의해 자극시켰다. 초산화물 및 루시게닌 사이의 광 반응을 검출하였다. X축은 MitoQ [nM]의 농도를 나타내고 y축은 세포 계수기로 측정한 세포 수로 규준화한 후 분당 평균 개수[cpm]로 표시한 화학발광 신호이다. 전체적으로, 이 다이아그램은 ROS 형성의 현저한 감소를 나타내므로, 이는 본 발명에 따른 간질환에서 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 치료 이점을 확인시켜 준다. HUH-7 cells were cultured in 6 plates and concentrations from 0 to 25 μM (0, 1 and 5 with or without simultaneous use of MitoQ in the 0 to 1000 nmol concentration range dissolved in DMEM (manufactured by Gibco) for 3 hours at 37 ° C. stimulation with antimycin A of μM). The light reaction between superoxide and lucigenin was detected. The x-axis represents the concentration of MitoQ [nM] and the y-axis is the chemiluminescent signal expressed as the average number per minute [cpm] after normalizing with the number of cells measured by a cell counter. Overall, this diagram shows a marked decrease in ROS formation, which confirms the therapeutic benefit of mitochondrially targeted antioxidants in liver disease according to the present invention.
실시예Example 1 : 말로리 소체 1: Mallory body (MB)의(MB) of 실험 유도 Experiment induction
MB는 다양한 마우스 균주의 만성 중독에 의해 마우스 간에서 유도될 수 있다: 예컨대 웅성 스위스 알비노 마우스: 3,5-디에톡시카르보닐-1,4-디히드로콜리딘 (1,4-디히드로-2,4,6-트리메틸피리딘-3,6-디탄산 디에틸 에스테르, DDC, Cat. no. 13703-0, 시그마-알드리히 제조, 슈타인하임, 독일) 또는 그리세오플빈(Griseofulvin)(GF, Cat. no. 85,644-4, 시그마-알드리히 제조)에 의해 처리된 균주 Him OF1 SPF (인스티튜트 오브 라보라토리 애니멀 리서치, 유니버시티 오브 비엔나, 힘버그, 오스트리아). MB can be induced in mouse liver by chronic poisoning of various mouse strains: for example male Swiss albino mice: 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocolidine (1,4-dihydro-2 , 4,6-trimethylpyridine-3,6-dicarbonate diethyl ester, DDC, Cat.no. 13703-0, manufactured by Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) or Griseofulvin (GF Strain Him OF1 SPF (Institut of Laboratories Animal Research, University of Vienna, Himburg, Austria) processed by Cat. No. 85,644-4, manufactured by Sigma-Aldrich.
2.5% GF 또는 0.1% DDC를 함유하는 기준 규정식(Sniff Spezialdiaten GmbH 제조, 조에스트, 독일)은 Sniff에 의해 펠릿으로 생산되었다. A reference diet containing 2.5% GF or 0.1% DDC (manufactured by Sniff Spezialdiaten GmbH, Joest, Germany) was produced into pellets by Sniff.
12시간 낮-밤 주기를 갖는 멸균 분리기 또는 통상의 우리에 동물을 두었다. 이들 동물에 National Academy of Sciences에 의해 제조되고 National Institute of Health; NIH publication 86-23, 1985 개정에 의해 출판된 "Guide for the Care and Use of Laboratory Aminals"에 개략적으로 기재된 기준에 따라 무통 관리를 받았다. Animals were placed in sterile separators or conventional cages with a 12 hour day-night cycle. These animals are manufactured by the National Academy of Sciences and are available from the National Institute of Health; It was painlessly administered according to the criteria outlined in "Guide for the Care and Use of Laboratory Aminals," published by NIH publication 86-23, revised 1985.
마우스(8주령)은 2.5 개월간 0.1% DDC 또는 2.5% GF를 함유하는 기준 규정식을 공급받았다. Mice (8 weeks old) received a standard diet containing 0.1% DDC or 2.5% GF for 2.5 months.
마우스 간은 먼저 간세포의 팽창 및 조밀한 케라틴 IF 네트워크 형성에 의해 먼저 DDC- 또는 GF 중독에 반응한다. 6주간의 중독 후, 팽창된 간세포는 감소된 케라틴 IF 밀도를 나타내고 또 초기 MB는 케라틴 IF 네트워크와 관련된 미세한 과립 으로 관찰될 수 있다. 계속된 중독은 핵주위 세포질 영역에 위치하는 대형 MB의 존재를 초래한다. 대형 MB를 함유하는 대부분의 간세포는 현저하게 감소된 또는 검출되지 않을 정도로 세포질 IF 케라틴 네트워크를 감소시킨다. 중독 중지시, MB는 몇 주내에 사라진다. 중독으로부터 4주간의 회복에서, 세포질 케라틴 필라멘트를 갖지 않지만 결합체(desmosome)와 조합된 세포 주변에는 잔여량의 MB를 함유하는 간세포 군이 있다. 이러한 마우스를 다시 DDC 또는 GF에 노출시키면, 24 내지 72시간 이내에 다수의 MB가 나타난다(Stumptner C. et al., 2001, J. Hepatol., 34: 665-675). 이는 재중독이 차단될 때, 알레르기 반응과 유사하게 독성 기억 효과로서 MB의 형성을 향상시킨다. Mouse liver first responds to DDC- or GF poisoning by swelling hepatocytes and forming a dense keratin IF network. After 6 weeks of intoxication, expanded hepatocytes show reduced keratin IF density and early MB can be observed as fine granules associated with the keratin IF network. Continued intoxication results in the presence of large MBs located in the cytoplasmic cytoplasmic region. Most hepatocytes containing large MBs reduce the cytoplasmic IF keratin network to a significantly reduced or undetectable level. Upon intoxication, MB disappears within a few weeks. At 4 weeks of recovery from intoxication, there is a group of hepatocytes that do not have cytoplasmic keratin filaments but contain a residual amount of MB around the cells combined with the desmosome. When these mice are again exposed to DDC or GF, multiple MBs appear within 24 to 72 hours (Stumptner C. et al., 2001, J. Hepatol., 34: 665-675). This improves the formation of MB as a toxic memory effect, similar to an allergic reaction when re-addiction is blocked.
목척추 탈구에 의해 상이한 중독 시점에서 마우스를 치사시키고 간을 면역혈광용 액체 질소로 미리 냉각된 메틸부탄으로 즉각 스냅-냉동시키거나 또는 통상의 조직 및 면역조직화학용 4% 완충된 포르알데히드에 고정시킨다. Mice are killed at different time points of intoxication by lumbar spine dislocation and the liver is immediately snap-frozen with methylbutane pre-cooled with liquid nitrogen for immunoglobulin or fixed in 4% buffered formaldehyde for conventional tissues and immunohistochemistry. .
실시예Example 2: 간 변형의 평가; 말로리 소체( 2: evaluation of liver deformation; Mallory body ( MBMB )의 검출 ) Detection
실시예 1에 따라 제조한 간 샘플을 헤마톡실린 및 에오신(Luna L.G., 1968, Manual of Histologic staining methods of the ArmedForces Institute of Pathology, 3rd edition, McGraw Hill, New York)에 의해 간단한 조직 염색에 사용하였다. 또한 단일-라벨 면역조직화학 또는 이중-라벨 면역형광 현미경법을 실시하여 시험된 동물에서 MB를 검출하였다. Liver samples prepared according to Example 1 were used for simple tissue staining by hematoxylin and eosin (Luna LG, 1968, Manual of Histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology, 3rd edition, McGraw Hill, New York). . Single-label immunohistochemistry or double-label immunofluorescence microscopy was also performed to detect MB in the animals tested.
A) 파라핀-매립된 부분 상에서 단일-라벨 면역조직화학: 부분(4 ㎛ 두께)을 크실렌 중에서 탈파라핀화하고 등급 에탄올(100%, 90%, 80%, 70%, 50% 에탄올) 및 PBS(50 mM 인산칼륨, 150 mM NaCl, pH 8.0-8.5)으로 재수화시킨다. 항원 회수를 위하여, 재수화된 부분을 0.1% 프로테아제 유형 XXIV (시그마 슈타인하임, 독일)과 함께 실온에서 10분간 배양하고(유비퀴틴 다코 일차 항체의 경우) 또는 10 mM 시트레이트 완충액, pH 6.0에서 10분간 750W의 마이크로웨이브(에너지 제어하는 통상의 가정용 마이크로웨이브 오븐)에 의해 배양한다(폴리클로날 K8/18 항체 50K160의 경우, 모노클로날 K8 항체 K8.8[Neomarkers], 모노클로날 K18 항체 DC-10 [Neomarkers] 및 p62PC: p62의 C-말단 펩티드에 대한 폴리클로날 기니아 돼지 항체; 마트로우카 케이. 등, 2002, Am. J. Pathol., 160: 255-263). PBS로 세척한 후, 메탄올중 1% H2O2 (머크)에서 10분간 배양함으로써 내생 퍼옥시다아제를 차단한 다음 PBS 로 세척하였다. 다음 단계로 상기 부분을 습도실(Nunc)내 일차 항체와 실온에서 60분간 배양한 다음 PBS로 3회 세척하였다. 이어 상기 부분을 PBS로 1:1 희석된 Multi Link Swine 항-염소, 마우스, 토끼 면역글로불린 (Dako)과 함께 실온에서 30분간 배양한 다음 PBS로 3회 세척하고 또 스트렙트애비딘 비오틴 꽃양배추 퍼옥시아다제 착물 ABC/HRP (Dako; Sol A 1:100 및 Sol B 1:100 PBS중)과 함께 30분간 배양하였다. 다르게는, PBS로 1:100 희석된 퍼옥시다아제-결합된 토끼 항 기니아피그 면역글로불린 이차 항체(Dako)와 함께 30분간 배양한 다음 PBS로 3회 세척하였다. 이어 증폭 희석액(TSATM Biotin System, NEN, 미국 매사추세츠 보스톤) 중의 비오티닐 티라미드 용액 1:50을 5분간 적용함으로써 티라미드 증폭을 실시하고, PBS로 3회 세척한 다음 스트렙트애비딘-퍼옥시다아제 용액(PBS 중의 1:100)과 30분 간 배양하였다. A) Single-label immunohistochemistry on paraffin-embedded portions: Deparaffinize portions (4 μm thick) in xylene, grade ethanol (100%, 90%, 80%, 70%, 50% ethanol) and PBS ( 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 8.0-8.5). For antigen recovery, the rehydrated portion was incubated with 0.1% protease type XXIV (Sigma Steinheim, Germany) for 10 minutes at room temperature (for ubiquitin daco primary antibody) or 10 minutes in 10 mM citrate buffer, pH 6.0. Incubate with 750 W microwave (energy controlled conventional home microwave oven) (for polyclonal K8 / 18 antibody 50K160, monoclonal K8 antibody K8.8 [Neomarkers], monoclonal K18 antibody DC- 10 [Neomarkers] and p62PC: polyclonal guinea pig antibodies against the C-terminal peptide of p62; Matroka K. et al., 2002, Am. J. Pathol., 160: 255-263). After washing with PBS, the endogenous peroxidase was blocked by incubating for 10 minutes in 1% H 2 O 2 (Merck) in methanol and then washed with PBS. The next step was incubated for 60 minutes at room temperature with the primary antibody in a humidity chamber (Nunc) and then washed three times with PBS. Subsequently, the portion was incubated for 30 minutes at room temperature with Multi Link Swine anti-goat, mouse, and rabbit immunoglobulin (Dako) diluted 1: 1 with PBS, washed three times with PBS, and further treated with Streptavidin biotin cauliflower pu. Incubate with oxidase complex ABC / HRP (Dako; in Sol A 1: 100 and Sol B 1: 100 PBS) for 30 minutes. Alternatively, the cells were incubated with peroxidase-bound rabbit anti guinea pig immunoglobulin secondary antibody (Dako) diluted 1: 100 in PBS for 30 minutes and then washed three times with PBS. Then, tyramide amplification was performed by applying biotinyl tyramide solution 1:50 in amplification diluent (TSA ™ Biotin System, NEN, Boston, Mass.) For 5 minutes, washed three times with PBS, and then streptavidin-per Incubated with oxidase solution (1: 100 in PBS) for 30 minutes.
TSATM Biotin System을 사용하여 P62CT 항체 결합을 검출하였다. 유비퀴틴 및 K8/18 항체의 반응성은 ABComplex 시스템(Dako)를 이용하여 검출하며, 수돗물로 헹군 다음 커버 슬립의 부분에 봉입제(mounting medium) Aquatex® (Merck 제조)을 적용하였다. P62CT antibody binding was detected using the TSA ™ Biotin System. Reactivity of ubiquitin and K8 / 18 antibody and detected using a ABComplex system (Dako), was applied to a sealed portion of the cover slip, and then rinsed with tap water the (mounting medium) Aquatex ® (Merck Ltd.).
발색을 위하여, 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC, Dako 제조)과 함께 5분간 배양한 다음 PBS로 3회 세척하고 Mayr의 헤마라운(haemalaun)으로 대조염색한 다음 수돗물로 헹구고 커버 슬립에 AquatexR (Merck 제조)를 봉입하였다. For color development, incubate with 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC, manufactured by Dako) for 5 minutes, wash three times with PBS, counterstain with Mayr's haemalaun, rinse with tap water and cover slip. Aquatex R (manufactured by Merck) was enclosed in the flask.
B) 냉동 부분 상에서 이중-라벨 면역형광 현미경법: Cryocut(냉동절단기)(Leica CM3050, Leica, Nussloch, 독일)를 이용하여 냉동부분(3 ㎛ 두께)을 절단하고 공기 건조시키고 또 -20℃, 아세톤 중에 10분간 고정하였다. 다르게는 (특히 핵 구조의 보존이 필요한 경우) 상기 부분을 PBS-완충된 4% 포름알데히드 중, 실온에서 15분간 고정시킨 다음 -20℃에서 5분간 아세톤 고정하였다. 이 부분을 고정 후 공기 건조시키거나 또는 PBS로 헹군다. B) Double-label immunofluorescence microscopy on the frozen portion: The frozen portion (3 μm thick) was cut and air dried using Cryocut (Freezer) (Leica CM3050, Leica, Nussloch, Germany) and dried at -20 ° C., acetone. Fixed for 10 minutes. Alternatively (particularly where preservation of the nuclear structure is needed) the part was fixed in PBS-buffered 4% formaldehyde for 15 minutes at room temperature followed by acetone for 5 minutes at -20 ° C. This part is fixed and then air dried or rinsed with PBS.
이어, 제1 일차 항체 p62CT (p62의 C-말단 펩티드 서열에 대한 폴리클로날 기니아 피그 항체)(Zatlouka K. et al., Am. J. Pathol., 2002, 160: 255-263), K8에 대한 항체(Ks 8.7, Progen, 독일 하이델베르크), K18 (Ks 18.04, 프로겐), K8/18 (50K 160) 및 유비퀴틴(ID Labs Inc., 캐나다 눈크 로실데)을 습실(Bioassay plate, Nunc, 덴마크 로실데), 실온에서 30분간 적용하였다. 다르게는, 항체를 철 야로 4℃에서 도포한 다음 PBS로 3회 5분간 세척하였다. Then, the first primary antibody p62CT (polyclonal guinea pig antibody against the C-terminal peptide sequence of p62) (Zatlouka K. et al., Am. J. Pathol., 2002, 160: 255-263), K8 Antibodies (Ks 8.7, Progen, Heidelberg, Germany), K18 (Ks 18.04, Progen), K8 / 18 (50K 160) and ubiquitin (ID Labs Inc., Nuncrosilde, Canada) were wetted in Bioassay plate, Nunc, Denmark Rosilde), and applied at room temperature for 30 minutes. Alternatively, the antibody was applied overnight at 4 ° C. and washed three times with PBS for 5 minutes.
다음 단계로 제1 이차 항체를 습실내 실온에서 30분간 광 보호하에서 적용한 다음 PBS로 5분간 3회 세척하였다. 광 보호하 습실내 실온에서 30분간 제2 일차 항체를 적용한 다음 PBS로 5분간 3회 세척한다. 광보호하 습실내 실온에서 30분간 제2 이차 항체를 적용한 다음 PBS로 5분간 3회 세척한다. 마지막 항체 배양 후, 슬라이드를 증류수로 세척한 다음 에탄올로 수초 세척한 다음 공기 건조시킨다. In the next step, the first secondary antibody was applied under light protection for 30 minutes at room temperature in a wet room and then washed three times with PBS for 5 minutes. Apply a second primary antibody for 30 minutes at room temperature in a light protected room, then wash three times with PBS for 5 minutes. Apply a second secondary antibody for 30 minutes at room temperature in a photoprotective chamber and then wash three times with PBS for 5 minutes. After the last antibody incubation, the slides are washed with distilled water followed by several seconds with ethanol and then air dried.
사용되는 이차 항체는 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-결합된 염소 항-마우스 IgG (Zymed, 미국 캘리포니아 샌프란시스코) 또는 Alexa 488 nm-결합된 염소 항-마우스 IgG (Molecular Probes, 네덜란드 라이덴) 및 테트라메틸렌로다민 이소티오시아네이트 (TRITC)- 또는 FTTC-결합된 돼지 항-토끼 Ig (Dako, 덴마크 글로스트럽) 및 TRITC-결합된 토끼 항 기니아 피그 Ig (Dako)이다. Secondary antibodies used are, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC) -linked goat anti-mouse IgG (Zymed, San Francisco, CA) or Alexa 488 nm-linked goat anti-mouse IgG (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) And tetramethylenerodamine isothiocyanate (TRITC)-or FTTC-linked porcine anti-rabbit Ig (Dako, Danish Glosstrop) and TRITC-linked rabbit anti guinea pig Ig (Dako).
마지막으로, 시편을 Mowiol (17% mowiol 4-88 [Calbiochem Nr. 475904], PBS 중의 34% 글리세롤) 또는 기타 시중에서 입수할 수 있는 봉입제와 봉입된다. Finally, the specimen is enclosed with Mowiol (17% mowiol 4-88 [Calbiochem Nr. 475904], 34% glycerol in PBS) or other commercially available encapsulants.
모든 항체를 PBS로 희석시키고 별도로 순차적으로 배양한다. 플루오로크롬-결합된 항체를 16,000 x g에서 5분간 원심분리하여 슬라이드에 적용하기 전에 응집물을 제거한다. 음성 대조를 위하여, 제1 항체를 PBS, 전-면역 혈청 또는 동위원소-매칭된 면역글로불린으로 교체한다. All antibodies are diluted in PBS and incubated separately sequentially. The fluorochrome-bound antibody is centrifuged at 16,000 x g for 5 minutes to remove aggregates before applying to the slides. For negative control, the first antibody is replaced with PBS, pre-immune serum or isotope-matched immunoglobulins.
면역형광 시편은 레이저 주사 현미경 (LSM510 레이저-주사 현미경, 독일 오버코켄 자이스)에 의해 분석하였다. 공동-국소화 분석을 위해(듀얼 라벨링) 멀티트랙 양식을 이용하여 상을 얻는다. 합쳐진 사진은 녹색/적색 슈도-색으로 나타나며 공동-국소화 부위에서는 황색이 나타난다. 슬라이드를 +4℃에서 광으로부터 보호하면서 저장한다. Immunofluorescence specimens were analyzed by a laser scanning microscope (LSM510 laser-scanning microscope, Obercoken Zeiss, Germany). Awards are obtained using a multitrack form for co-localization analysis (dual labeling). The combined picture appears green / red pseudo-color and yellow at the co-localization site. Store slides at + 4 ° C. while protecting them from light.
실시예Example 3: 간 병리학에 대한 본 발명에 따른 산화방지제의 효과 3: effect of antioxidant according to the invention on liver pathology
DDC- 또는 GF 중독된 마우스 간에서 형태학적 변형의 후퇴에 대한 본 발명에 따른 산화방지제의 영향을 평가하기 위하여 양성 대조 동물군(DDC 또는 GF에만 3 내지 7일간 노출)을 DDC- 또는 GF 중독되고 미토퀴놀 [10-(3,6-디히드록시-4,5-디메톡시-2-메틸페닐)데실]트리페닐포스포늄 브로마이드 및 미토퀴논 [10-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-시클로헥사디엔-1-일)데실]-트리데실포스포늄 브로마이드 (Key Organics Ltd 제공, 영국 런던 소재)의 혼합물 또는 Mito Vit E [2-(3,4-디히드로-6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸-2H-1-벤조피란-2-일)에틸]-트리페닐포스포늄 브로마이드 (Key Organics Ltd 제공, 영국 런던 소재)와 3 내지 7일간 더 처리된 마우스와 비교하였다. To assess the effect of the antioxidant according to the invention on the regression of morphological modifications in DDC- or GF addicted mouse livers, a positive control animal group (3-7 days exposure only to DDC or GF) was subjected to DDC- or GF poisoning. Mitoquinol [10- (3,6-dihydroxy-4,5-dimethoxy-2-methylphenyl) decyl] triphenylphosphonium bromide and mitoquinone [10- (4,5-dimethoxy-2-methyl- 3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-yl) decyl] -tridecylphosphonium bromide (provided by Key Organics Ltd, London, UK) or Mito Vit E [2- (3,4 -Dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-1-benzopyran-2-yl) ethyl] -triphenylphosphonium bromide from Key Organics Ltd, London, UK Compared to mice treated for 3-7 more days.
주사하기 위해, MitoQ 또는 Mito Vit E를 충분한 DMSO (바람직하게는 1%)가 보충된 PBS 에 용해시켜 산화방지제의 용해도를 유지시킨다. 마우스 쌍에 복강 주사 또는 정맥 주사(꼬리 정맥)하고 부형제-주입된 대조군과 비교하였다. 이들은 Smith R.A. J et al., 2003, PNAS, 100 (9): 5407-5412에 따라 20 mg의 MitoQ/kg/일 (750 nmol) 및 6 mg의 Mito Vit E/kg/일 (300 nmol)의 최대 허용량에 상응한다. For injection, MitoQ or Mito Vit E is dissolved in PBS supplemented with sufficient DMSO (preferably 1%) to maintain the solubility of the antioxidant. Mice were intraperitoneally or intravenously injected (tail vein) and compared with excipient-injected controls. These are Smith R.A. J et al., 2003, PNAS, 100 (9): at a maximum allowable dose of 20 mg MitoQ / kg / day (750 nmol) and 6 mg Mito Vit E / kg / day (300 nmol) according to 5407-5412. Corresponds.
MitoS (미토퀴놀 [10-(3,6-디히드록시-4,5-디메톡시-2-메틸페닐)데실]트리페닐포스포늄 메탄 술포네이트 및 미토퀴논 [10-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-시클로헥사디엔-1-일)데실]-트리데실포스포늄 메탄 술포네이트 또는 Mito Vit E의 혼합물)과 같은 MitoQ 또는 MitoQ 유도체를 규정식에 보충시켰다. 투여량은 물 또는 액체 규정식 소비 및 마우스 체중을 측정함으로써 결정한다. 마우스에게는 어떠한 독성 징후없이 Smith R.A., J. et al., 2003, PNAS, 100(9): 5407-5412에 따라서 500μM 또는 1 mM MitoQ 또는 MitoS (최대 허용 투여량 232 μmol/kg/일 또는 346 μmol/kg/일, 각각 500 μM 및 1 mM 규정식에 대해 154 및 230 mg/kg/일에 상응함) 또는 500μM Mito Vit E (최대 허용 투여량 105 μmol/kg/일, 60 mg의 Mito Vit E/kg/일에 상응함)과 함께 3 내지 7일간 음용수를 공급한다. MitoS (mitoquinol [10- (3,6-dihydroxy-4,5-dimethoxy-2-methylphenyl) decyl] triphenylphosphonium methane sulfonate and mitoquinone [10- (4,5-dimethoxy- MitoQ or MitoQ derivatives such as 2-methyl-3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-yl) decyl] -tridecylphosphonium methane sulfonate or a mixture of Mito Vit E) Supplemented. Dosage is determined by measuring water or liquid dietary consumption and mouse weight. Mice have no indication of toxicity, 500 μM or 1 mM MitoQ or MitoS (maximum permissible dose of 232 μmol / kg / day or 346 μmol according to Smith RA, J. et al., 2003, PNAS, 100 (9): 5407-5412 / kg / day, corresponding to 154 and 230 mg / kg / day for 500 μM and 1 mM diets respectively or 500 μM Mito Vit E (maximum permissible dose 105 μmol / kg / day, 60 mg of Mito Vit E corresponding to kg / day) for 3 to 7 days of drinking water.
다른 시험으로서 DDC- 또는 GF 중독된 동물군에게 Mito Q(MitoS) 또는 Mito Vit E를 3 내지 7일간 동시에 부가하고 DDC 또는 GF에만 3 내지 7일간 노출된 대조군과 비교하였다. As another test, the DDC- or GF addicted animals were simultaneously added Mito Q (MitoS) or Mito Vit E for 3-7 days and compared with controls exposed to DDC or GF only for 3-7 days.
다른 실험으로서 PBS 중의 1% DMSO에 용해된 3 내지 12 mg/kg의 Mito Q를 DDC 중독된 마우스에게 3일간 동시에 복강 투여하고 대조 동물과 비교하였다(양성 대조군은 DDC 중독된 마우스를 나타내는 반면에 음성 대조군은 DDC 중독되지 않고 부형제-주입된 동물임). As another experiment, 3-12 mg / kg of Mito Q dissolved in 1% DMSO in PBS was intraperitoneally administered to DDC-addicted mice for 3 days and compared with control animals (positive control indicates negative while DDC-addicted mice) Control group is an excipient-injected animal without DDC poisoning).
본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 효과를 이들 단시간 실험으로 실질적으로 평가하기 위하여, 문맥(글리슨의 트리아스) 주변에 염증성 세포의 존재(또는 부재) 및 괴사, 세포 팽윤 대신 세포골격의 파괴(도 2 및 3 참조) 및/또는 말로리 소체 분석(DCC 또는 GF에 장기간 노출될 때 전형적임)을 양성 대조군과 비교하였다. 세포 팽창 및 말로리 소체는 이들이 DDC에 단시간 노출될 때 형성되지 않는 사실로 인하여 통계 평가가 가능할 정도로 형성되지는 않는다. In order to substantially evaluate the effects of mitochondrial targeted antioxidants according to the present invention in these short-term experiments, the presence (or absence) of inflammatory cells and the necrosis of the cytoskeleton instead of necrosis, cell swelling around the portal veins (trias of Gleason) Destruction (see FIGS. 2 and 3) and / or Mallory bodies analysis (typical when prolonged exposure to DCC or GF) was compared to a positive control. Cell expansion and Mallory bodies are not formed to the extent that statistical evaluation is possible due to the fact that they do not form upon short exposure to DDC.
전체적으로, Mito Q 처리하에서 굴모양 혈관에 의해 경계를 한 간세포의 스트랜드로 표시되는 정상 구조가 다시 보인다. 간세포의 형태는 핵의 크기와 형태 및 세포질의 구조 면에서 정상이다. 또한 염증성 세포의 개수(예컨대 중성구, 림프구)는 본 발명에 따른 산화방지제 처리시 현저하게 감소된다. In total, the normal structure, represented by strands of hepatocytes bounded by oyster blood vessels under Mito Q treatment, is seen again. Hepatocyte morphology is normal in size and shape of the nucleus and in the structure of the cytoplasm. In addition, the number of inflammatory cells (eg neutrophils, lymphocytes) is significantly reduced upon treatment with the antioxidant according to the invention.
DDC에 중독된 마우스를 사용하여 장기간 실험할 때(8-10주), 처리된 동물의 간 샘플에서 세포 팽창 및/또는 말로리 소체(MB)의 존재(또는 부재)를 결정하고 대조 동물군과 비교한다. In long-term experiments using mice addicted to DDC (8-10 weeks), determine the presence (or absence) of cell swelling and / or malorisomes (MB) in liver samples of treated animals and compare with control animals do.
일개 실험으로, DDC 또는 GF에 의해 10주간 중독되면, 시험 동물에 Mito Vit E 또는 Mito Q(또는 MitoS)를 7일간 몇 쌍의 마우스에게 복강주사 또는 정맥주사(꼬리 정맥)하고 부형제-주입된 대조군과 비교한다. In one experiment, when poisoned by DDC or GF for 10 weeks, test animals were intraperitoneally or intravenously injected (tail vein) with a pair of mice for 7 days with Mito Vit E or Mito Q (or MitoS) and excipient-injected controls. Compare with
다른 실험으로서, DDC에 의해 10주간 중독된 후 시험 동물에 MitoQ (1.25 mg/kg)를 7일 동안 2회 복강주사(상응하는 주의 제1일 및 제4일)하고 통상의 조직학에 따라 분석한다(Luna L.G., 1968, Manual of Histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology, 3rd edition, McGraw Hill, New York). 세포 팽창 정도 및 말로리 소체의 개수는 적합한 대조군과 비교할 때 DDC로 중독된 MitoQ 처리된 동물에서 현저하게 감소한다(도 4 내지 6). As another experiment, MitoQ (1.25 mg / kg) is intraperitoneally injected (
다른 실험으로서, DDC 또는 GF에 의해 8-10주간 중독된 마우스에 MitoQ (MitoS) 또는 Mito Vit E를 음용수를 통하여 7 내지 14일간 공급한다. As another experiment, mice poisoned for 8-10 weeks by DDC or GF are fed MitoQ (MitoS) or Mito Vit E through drinking water for 7-14 days.
다른 실험으로서 DDC 또는 GF에 의해 6주간 중독된 마우스에 10 내지 50%의 최대 허용 투여량의 Mito Vit E 또는 MitoQ (MitoS)를 사용하여 4주간 DDC 또는 GF 와 동시에 투여하고 DDC 또는 GF만으로 10주간 중독된 대조 동물군과 비교한다. As another experiment, mice that were poisoned for 6 weeks by DDC or GF were administered simultaneously with DDC or GF for 4 weeks using Mito Vit E or MitoQ (MitoS) at a maximum allowable dose of 10-50% and for 10 weeks with DDC or GF alone. Compare to toxic control animals.
다른 실험으로서, DDC 또는 GF로 10주간 중독된 마우스를 4주간 회복처리시킨다. 이어 DDC 또는 GF로 다시 중독시키고 Mito Vit E 또는 MitoQ/MitoS로 처리하면 독성 기억 효과(DDC 또는 GF 중독에 24 내지 72시간 동안 다시 노출된 결과)는 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제와의 처리에 의해 감소되거나 제거된다. As another experiment, mice intoxicated with DDC or GF for 10 weeks are recovered for 4 weeks. Subsequent re-addiction with DDC or GF and treatment with Mito Vit E or MitoQ / MitoS resulted in a toxic memory effect (resulting in 24-72 hours of re-exposure to DDC or GF poisoning) by treatment with mitochondrially targeted antioxidants. Reduced or eliminated.
간질환에서 산화방지제의 예방 효과를 평가하기 위하여, DDC- 또는 GF 공급된 일군의 마우스에 10 내지 50%의 최대 허용 투여량의 MitoQ, MitoS 또는 Mito Vit E를 동시에 투여한 다음 DDC- 또는 GF에만 10주간 중독된 대조 동물군과 비교한다. To assess the prophylactic effect of antioxidants in liver disease, a group of mice fed DDC- or GF were simultaneously administered a maximum allowable dose of 10 to 50% of MitoQ, MitoS or Mito Vit E followed by DDC- or GF only. Compare to control animals poisoned for 10 weeks.
1개 실험으로서 MitoQ, MitoS 또는 Mito Vit E를 초기 회복 기간(4주) 동안 투여한 다음 DDC 또는 GF에 24 내지 72시간 동안 중독시키고 처리되지 않은 대조 동물군과 비교한다. As one experiment, MitoQ, MitoS or Mito Vit E is administered during the initial recovery period (4 weeks) and then addicted to DDC or GF for 24 to 72 hours and compared with the untreated control animals.
당업자들이라면 일반적 수법의 다양한 변형이 가능함을 숙지하고 있을 것이다. Those skilled in the art will appreciate that various modifications of the general scheme are possible.
전체적으로, DDC 또는 GF에 의한 단시간 및 장시간 중독시, 모두 눈에 띄는 간 변형이 간질환 및/또는 상피암의 치료 또는 예방을 위해 사용된 본 발명의 산화방지제의 적용에 의해 현저히 완화되거나 감소된다. Overall, in both short and long term poisoning by DDC or GF, noticeable liver modifications are significantly alleviated or reduced by the application of the antioxidants of the invention used for the treatment or prevention of liver disease and / or epithelial cancer.
실시예Example 4: 본 발명에 따른 산화방지제를 처리하거나 처리하지 않고 4: with or without treatment of antioxidant according to the invention DDCDDC 중독된 마우스로부터 분리한 미토콘드리아에서 In mitochondria isolated from poisoned mice 산화적Oxidative 스트레스(토코페롤 퀴논 함량의 측정)의 측정 Determination of Stress (Measurement of Tocopherol Quinone Content)
4.1. 마우스 간 미토콘드리아(4.1. Mouse liver mitochondria ( MLMMLM )의 분리 ) Separation
렛트 심장 미토콘드리아(Staniek K. and Nohl H., 1999, Biochem. et Biophys. Acta, 1413: 70-80; Mela L. and Sietz S., 1979, Methods in Enzymology, Academic Press Inc.: 39-46)에 대한 방법을 실시예 3에 따른 다양한 동물 군으로부터 분리한 마우스 간(렛트 간에 대하여 약 10 중량%)에 대하여 적용하였다. 간의 분리는 4℃에서 실시하였다. 각 간을 조작내고 액체 질소(N2)에서 충격-냉동시켜 저장하였다. 준비 완충액(0.3 M 수크로오스, 1mM EDTA, 20 mM 트리에탄올아민 pH 7.4에 더하여 토코페롤 산화를 방지하기 위하여 10 mg/L BHT (디-tert-부틸-히드록시톨루엔) 및 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(Fe 킬레이터))에서 해동시킨 후, 조직을 소형 조각으로 절단하고, 준비 완충액으로 4회 세척한 다음 15 ml 완충액에서 포터 피스틸(Potter pistil)에 의해 5회 균질화하고, 30 ml로 희석시킨 다음 570 g에서 10분간 원심분리시켰다. 상층액을 2층의 치즈천을 통하여 여과하였다. 미토콘드리아는 7400 g에서 10분 동안 펠릿화되며, 30 ml 완충액에 손으로 재현탁시키고 상기와 같이 재펠릿화한 다음 세척하고 마지막으로 약 200 ml 완충액에 재현탁시켰다. 단백질 농도는 뷰렛법(BSA를 표준으로 사용, 이중 측정을 위해 적어도 200 mg 단백질 필요)으로 측정하여 예상 수율 3 내지 6 mg을 얻었다. Lett Heart Mitochondria (Staniek K. and Nohl H., 1999, Biochem. Et Biophys. Acta, 1413: 70-80; Mela L. and Sietz S., 1979, Methods in Enzymology, Academic Press Inc .: 39-46) The method for was applied to mouse liver (about 10% by weight relative to rat liver) isolated from the various animal groups according to Example 3. Separation of the liver was carried out at 4 ℃. Each liver was operated and stored by shock-freezing in liquid nitrogen (N 2 ). Preparation buffer (0.3 M sucrose, 1 mM EDTA, 20 mM triethanolamine pH 7.4 in addition to 10 mg / L BHT (di-tert-butyl-hydroxytoluene) and 1 mM diethylenetriaminepentaacetic acid to prevent tocopherol oxidation After thawing in Fe chelator), the tissue is cut into small pieces, washed four times with prep buffer, homogenized five times with Potter pistil in 15 ml buffer, diluted to 30 ml Centrifuged at 570 g for 10 minutes. The supernatant was filtered through two layers of cheese cloth. Mitochondria were pelleted at 7400 g for 10 minutes, resuspended by hand in 30 ml buffer, repellet as above, washed and finally resuspended in about 200 ml buffer. Protein concentration was measured by the Burette method (using BSA as standard, at least 200 mg protein for double determination) to obtain the expected yield of 3-6 mg.
정상화 목적으로, 사이토크롬 농도는 0.2%(w/v) Triton X-100 (amico DW2000 포토미터, 이중 결정을 위해 약 0.5-1 mg 미토콘드리아 단백질 필요)(Williams J. N., Jr., 1964, Archives of Biochemistry and Biophysics, 107: 537-543)의 막을 용해화시킨 후 환원된 디티오나이트에서 공기 산화된 차이 스펙트럼(difference spectrum)을 차감하여 산출하였다; 건강한 미토콘드리아에서 Cyt(a + a3), Cyt c, Cyt c1 및 Cyt b의 예상 농도는 렛트 간 미토콘드리아로부터 외삽된 값으로 각각 0.1-0.3 nmol/mg 단백질이다(Wakabayashi T. et al., 2000, Pathology International, 50: 20-33). For normalization purposes, the cytochrome concentration is 0.2% (w / v) Triton X-100 (amico DW2000 photometer, requires about 0.5-1 mg mitochondrial protein for double crystals) (Williams JN, Jr., 1964, Archives of Biochemistry and Biophysics, 107: 537-543) and then calculated by subtracting the air oxidized difference spectrum from reduced dithionite; The expected concentrations of Cyt (a + a 3 ), Cyt c, Cyt c 1, and Cyt b in healthy mitochondria are extrapolated from the rat liver mitochondria, 0.1-0.3 nmol / mg protein, respectively (Wakabayashi T. et al., 2000 , Pathology International, 50: 20-33).
대조군으로서, 모든 세포 막을 함유하는 조 균질물 등분량(제1 균질화 후)를 유지해야 한다. 가장 가벼운 분획(마이크로좀)을 포함하는 전체 막은 165 000 g에서 Murias M. et al., 2005, iochemical Pharmacology, 69: 903-912에 따라 40분 동안 (한외원심분리)에서 펠릿화되며 5 mL 예비 완충액으로 세척하고 재현탁시킨 다음 마지막으로 약 200 mL 완충액에서 재현탁시킨다. 단백질 농도는 다음과 같이 측정한다. As a control, crude homogenous equivalents (after first homogenization) containing all cell membranes should be maintained. The whole membrane containing the lightest fraction (microsome) is pelleted in 165 000 g for 40 minutes (ultracentrifugation) according to Murias M. et al., 2005, iochemical Pharmacology, 69: 903-912, and 5 mL preparative. Wash with buffer and resuspend and finally resuspend in about 200 mL buffer. Protein concentration is measured as follows.
4.2. 토코페롤 퀴논(4.2. Tocopherol Quinone ( TQTQ )의 분석 ) Analysis
전체 MLM(단락 4.1 참조)이 사용될 수 있다. 1 ml H2O에서 2-5 mg 단백질(미토콘드리아, 전체 막 또는 다양한 분획)의 양을 5 mM SDS 및 2 nmol UQ6 (유비퀴논-6, 내부 기준)과 혼합하고 3 ml 혐기성 에탄올/헥산(2:5)을 사용하여 추출하였다. 아르곤 하에서 유기 상을 증발시키고 그 잔류물을 120 ml 에탄올에 용해시켰다. C18 칼럼을 갖는 Waters LC1 모듈 상에서 HPLC 분석(샘플당 이중 분석)에 대해 40 ml를 사용하였다. 퀴논 및 토코페롤은 에탄올/메탄올/아세토니트릴/HClO4 (400:300:300:1) 중의 50 mM NaClO4 을 사용하여 1ml/분으로 용출시키고 광학적으로(TQ의 경우 268 nm, UQ6 및 내생 UQ9 및 UQ10의 경우 275 nm) 또는 전기화학적으로(+0.6V, 토코페롤 및 퀴놀의 경우) Gille L. et al., 2004, Biochemical Pharmacology, 68: 373-381에 따라서 검출하였다; 건강한 미토콘드리아에서 예상된 TQ 함량은 코토페롤 또는 유비퀴논에 대하여 1-5% 이다(Gille L. et al., 2004, Biochemical Pharmacology, 68: 373-381). The full MLM (see paragraph 4.1) may be used. The amount of 2-5 mg protein (mitochondria, whole membrane or various fractions) in 1 ml H 2 O was mixed with 5 mM SDS and 2 nmol UQ 6 (ubiquinone-6, internal reference) and 3 ml anaerobic ethanol / hexane ( 2: 5). The organic phase was evaporated under argon and the residue was dissolved in 120 ml ethanol. 40 ml was used for HPLC analysis (dual analysis per sample) on a Waters LC1 module with a C18 column. Quinones and tocopherols were eluted at 1 ml / min with 50 mM NaClO 4 in ethanol / methanol / acetonitrile / HClO 4 (400: 300: 300: 1) and optically (268 nm for TQ, 268 nm, UQ 6). And 275 nm for endogenous UQ 9 and UQ 10 ) or electrochemically (+0.6 V, for tocopherol and quinol) according to Gille L. et al., 2004, Biochemical Pharmacology, 68: 373-381; The expected TQ content in healthy mitochondria is 1-5% relative to cotoperol or ubiquinone (Gille L. et al., 2004, Biochemical Pharmacology, 68: 373-381).
전체적으로, 이들 시험은 대조군 및 본 발명에 따른 산화방지제로 처리된 DDC 마우스와 비교하여 DDC 중독된 마우스의 미토콘드리아에서 상승된 TQ 수준을 나타낸다. Overall, these tests show elevated TQ levels in mitochondria of DDC addicted mice compared to control and DDC mice treated with antioxidants according to the present invention.
4.3. 마우스 간 미토콘드리아(4.3. Mouse liver mitochondria ( MLMMLM )에서 부가적 효소 Additional enzyme) 착물의Complex 분석 analysis
다양한 군의 동물로부터 유도한 MLM(실시예 3의 순서 참조)을 냉동시키고 2-3회 해동시켜 막을 파괴시켜서 Fato R. et al., 1996, Biochemistry, 35: 2705-2716에 따른 다양한 시약(이하 참조)에 접근하도록 하였다. 광도계 분석은 25℃(Aminco DW2000 이중 파장 광도계)에서 실시될 수 있으며, 분석당 약 5-20 mg의 미토콘드리아 단백질이 필요하다. MLMs derived from various groups of animals (see the sequence of Example 3) were frozen and thawed 2-3 times to break the membranes, thereby reducing various membranes according to Fato R. et al., 1996, Biochemistry, 35: 2705-2716 (See reference). Photometric analysis can be performed at 25 ° C. (Aminco DW2000 dual wavelength photometer) and requires about 5-20 mg of mitochondrial protein per assay.
a) 아코니타제(초산화물 손상에 대한 마커)(James A.M. et al., 2005, JBC, 2005년 3월 23일 공고, Manuscript M501527200). 분석은 0.6 mM MnCl2, 5mM Na 시트 레이트, 0.2 mM NADP+, 0.1% Triton X-100 0.4 U/mL 이소시트레이트 탈수소효소 및 50 mM Tris pH 7.4를 함유한다. NADPH 생성은 340 내지 410 nm에서 실시된다; 건강한 미토콘드리아에서 예상 활성은 Senft A.P. et al., 2002, Toxicology and Applied Pharmacology 178: 15-21에 따른 분리된 미토콘드리아 mg에 대하여 약 60 nmol/분이다. a) Aconitase (marker for superoxide damage) (James AM et al., 2005, JBC, March 23, 2005, Manuscript M501527200). The assay contains 0.6 mM MnCl 2 , 5 mM Na citrate, 0.2 mM NADP + , 0.1% Triton X-100 0.4 U / mL isocitrate dehydrogenase and 50 mM Tris pH 7.4. NADPH production is carried out at 340-410 nm; The expected activity in healthy mitochondria is about 60 nmol / min for isolated mitochondria mg according to Senft AP et al., 2002, Toxicology and Applied Pharmacology 178: 15-21.
b) 착물 I(NADH 탈수소효소)(Estornell E. et al., 1993, FEBS, 332, No. 1, 2: 127-131로부터 변성): 이 분석은 0.1 mM NADH, 0.05 mM 데실유비퀴논, 2 mM KCN, 20 mM 안티마이신 A 및 20 mM 트리스 pH 7.5를 함유한다. NADH 분해는 340 내지 410 nm에서 실시된다. 2mg/mL 로테논에 의한 억제는 비특이적 퀴논 환원을 보정한다; 건강한 미토콘드리아에서 예상 활성은 Stuart J. A. et al., 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745 및 Barreto M.C., 2003, Toxicology Letters, 146: 37-47에 따라 약 100-300 nmol/(분.mg)이다. b) Complex I (NADH dehydrogenase) (denatured from Estornell E. et al., 1993, FEBS, 332, No. 1, 2: 127-131): this assay is 0.1 mM NADH, 0.05 mM decylubiquinone, 2 It contains mM KCN, 20 mM antimycin A and 20 mM Tris pH 7.5. NADH digestion is carried out at 340-410 nm. Inhibition with 2 mg / mL rotenone corrects for nonspecific quinone reduction; Expected activity in healthy mitochondria is about 100-300 nmol / (min. According to Stuart JA et al., 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745 and Barreto MC, 2003, Toxicology Letters, 146: 37-47. mg).
c) 착물 II(숙시네이트 탈수소효소)(Gille 2001에 의해 변성): 이 분석은 2 mM 숙시네이트, 0.05 mM 데실유비퀴논, 2 mM KCN, 20 mM 안티마이신 A 및 20 mM 트리스 pH 7.5를 함유한다. 퀴논 분해는 275 -320 nm에서 실시된다. 25 mM 말로네이트에 의한 억제는 비특이적 퀴논 환원을 보정한다; 건강한 미토콘드리아에서 예상 활성은 Barreto M.C., 2003, Toxicology Letters, 146: 37-47에 따라 분리된 미노콘드리아 mg당 약 70-100 nmol/분 이다. c) Complex II (Succinate Dehydrogenase) (modified by Gilille 2001): This assay contains 2 mM succinate, 0.05 mM decylubiquinone, 2 mM KCN, 20 mM antimycin A and 20 mM Tris pH 7.5 . Quinone decomposition is carried out at 275 -320 nm. Inhibition by 25 mM malonate corrects for nonspecific quinone reduction; The expected activity in healthy mitochondria is about 70-100 nmol / min per mg of minochondria isolated according to Barreto M.C., 2003, Toxicology Letters, 146: 37-47.
d) 착물 III(사이토크롬 be1)(Stuart J.A. et al., 2005, Feee Radical Biology & Medicine, 38: 737-745에 의해 변형). 이 분석은 0.05 mM 데실유비퀴놀 (디티오나이트 환원 및 헥산 추출에 의해 데실유비퀴논으로부터 제조), 15 mM Cyt c, mM KCN 및 20 mM 트리스 pH 7.5를 함유한다. Cyt c 환원은 550 - 540 nm에서 실시된다. 20 mM 안티마이신 A에 의한 억제는 비특이적 퀴놀 산화를 보정한다; 건강한 미토콘드리아에서 예상 활성은 Stuart J. A. et al., 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745에 따라 분리된 미토콘드리아 mg당 약 80 nmol/분 이다. d) Complex III (cytochrome be 1 ) (modified by Stuart JA et al., 2005, Feee Radical Biology & Medicine, 38: 737-745). This assay contains 0.05 mM decylubiquinol (prepared from decylubiquinone by dithionite reduction and hexane extraction), 15 mM Cyt c, mM KCN and 20 mM Tris pH 7.5. Cyt c reduction is carried out at 550-540 nm. Inhibition by 20 mM antimycin A corrects for nonspecific quinol oxidation; The expected activity in healthy mitochondria is about 80 nmol / min per mg of mitochondria isolated according to Stuart JA et al., 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745.
e) 착물 IV(사이토크롬 옥시다아제)(Stuart J.A. et al., 2005, Feee Radical Biology & Medicine, 38: 737-745에 의해 변형). 이 분석은 15 mM 환원된 Cyt c (디티오나이트 환원 및 과량의 디티오나이트의 공기 산화에 의해 제조) 및 20 mM 트리스 pH 7.5를 함유한다. Cyt c 산화는 550 - 540 nm에서 실시된다. 건강한 미토콘드리아에서 활성: 분리된 미토콘드리아(Stuart J. A. et al., 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745) mg당 약 1 nmol/분이다. e) Complex IV (cytochrome oxidase) (modified by Stuart J.A. et al., 2005, Feee Radical Biology & Medicine, 38: 737-745). This assay contains 15 mM reduced Cyt c (prepared by dithionite reduction and air oxidation of excess dithionite) and 20 mM Tris pH 7.5. Cyt c oxidation is carried out at 550-540 nm. Activity in healthy mitochondria: about 1 nmol / min per mg of isolated mitochondria (Stuart J. A. et al., 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745).
실시예Example 5: 산화성 스트레스 유도된 단백질( 5: oxidative stress induced protein ( 헤목시게나아제Hemoxigenase I)의 평가 I) evaluation
산화적 스트레스(Suematsu M. and Ishimura Y., 2000, Hepatology, 31(1): 3-6)에 의해 유도되는 것으로 공지된 헤목시게나아제 1(HO-1) 단백질 발현을 평가하기 위하여, DDC 중독되고 3일간 MitoQ (PBS 중의 1% DMSO에 희석)로 3일간 동시 처리된 마우스 또는 부형제만으로 처리된 마우스(실시예 3의 순수 참조)로부터 추출한 단백질을 사용하여 표준 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다. In order to assess the expression of hemoxigenase 1 (HO-1) protein known to be induced by oxidative stress (Suematsu M. and Ishimura Y., 2000, Hepatology, 31 (1): 3-6), DDC poisoning Standard Western blot analysis was performed using proteins extracted from mice treated with mice only or excipients (coated in Example 3 purely) or mice co-treated with MitoQ (diluted in 1% DMSO in PBS) for 3 days.
간 조직을 얼음 냉각되고 2 ㎍/ml 로이펩틴, 2 ㎍/ml 펩스타틴, 2 ㎍/ml 아 프로티닌, 1 mM 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSE) 및 2 mM 디티오트레이톨이 보충된 RIPA-완충액(50mM 트리스- HCL pH 7.4, 250mM NaCl, 0.1% SDS, 1% 데옥시콜레이트, 1% NP-40)에 재현탁시키긴 다음 얼음상에서 초음파처리(5초간 2 버스트(burst))를 통하여 균질화시켰다. 얼음상에서 20분간 배양한 후, 용해물을 4℃ 에서 15분간 13 000 rpm으로 마이크로원심분리에 의해 2회 원심분리 처리하여 투명하게 하고 상층액을 수집하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 사용한 브라드포드 분석법(Biorad)에 의해 측정하였다. 동량의 단백질(전형적으로 10-30 ㎍)를 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고 세미드라이-블로팅(TE 70, Amersham 제조)을 통하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막 (Hybond-P, Amersham 제조)에 전기영동처리시켰다. 실온에서 블로킹 용액[TBS-T (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20 포함한 3mM KCl) 중의 5% 우유]에서 1시간 동안 차단시킨 다음 일차 항체 용액(TBS-T/1% 우유에서 제조)와 함께 4℃에서 철야로 교반하면서 배양하였다. 이하의 항원에 특이적인 항체를 사용하였다: 구성적으로 발현된 동형체 HO-2 (36 kDa) 및 β-액틴(1:5000, 시그마 제조)와 교차반응하는 HO-1 (희석: 1: 1000; 스트레스 유전자). 일차 항체 용액을 제거하고 TBS-T에 의해 몇 회 세척한 후, 막을 HRP(꽃양배추 퍼옥시다아제)-결합된 이차 항체(토끼 항-마우스, 1:1000; Dako 제조)와 실온에서 1시간 동안 배양하였다. TBS-T로 수차례 세척한 후, 화학발광(ECL, Amersham 제조) 및 X-선 필름(도 7)에 노출시키는 것에 의해 검출을 실시한다. 밴드의 크기는 ChemImager 5500 소프트웨어(알파 이노테크 제조)를 이용하여 농도계측적으로 분석할 수 있고 또 각 신호는 상응하는 HO-2 (DDC 중독된 동물 군과 비교할 때 Mito Q 처리시 HO-1의 7배 감소를 나타냄) 또는 다르게는 β-액틴으로 정상화된다. Liver tissue was ice cooled and RIPA supplemented with 2 μg / ml leupeptin, 2 μg / ml pepstatin, 2 μg / ml aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride (PMSE) and 2 mM dithiothreitol Resuspend in buffer (50 mM Tris-HCL pH 7.4, 250 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% deoxycholate, 1% NP-40) and then sonicate on ice (2 bursts for 5 seconds). Homogenized. After 20 minutes of incubation on ice, the lysate was made clear by centrifugation twice by microcentrifugation at 13 000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes, and the supernatant was collected. Protein concentration was determined by the Bradford assay (Biorad) using bovine serum albumin as standard. Equal amounts of protein (typically 10-30 μg) were separated on a 12% SDS-PAGE gel and subjected to semidry-blotting (TE 70, made by Amersham) polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Hybond-P, Electrophoresis). Blocking at room temperature for 1 h in blocking solution [5% milk in TBS-T (3 mM KCl with 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20)] and then the primary antibody solution (TBS-T / Incubated with stirring overnight at 4 ° C.). Antibodies specific for the following antigens were used: HO-1 (dilution: 1: 1000) that cross reacts with constitutively expressed isoforms HO-2 (36 kDa) and β-actin (1: 5000, manufactured by Sigma) ; Stress genes). After removing the primary antibody solution and washing several times with TBS-T, the membranes were incubated with HRP (Cabbali peroxidase) -bound secondary antibody (Rabbit anti-mouse, 1: 1000; manufactured by Dako) for 1 hour at room temperature. It was. After washing several times with TBS-T, detection is performed by exposure to chemiluminescence (ECL, manufactured by Amersham) and X-ray film (FIG. 7). The size of the bands can be analyzed by densitometry using ChemImager 5500 software (made by Alpha Innotech) and each signal can be analyzed by HO-1 when treated with Mito Q when compared to the corresponding HO-2 (DDC-addicted animal group). 7-fold reduction) or otherwise normalized to β-actin.
MitoQ 처리하에서 헤목시게나아제의 DDC 유도 과발현의 현저한 감소(도 7)는 산화적 스트레스가 본 발명에 따른 산화방지제에 의해 현저히 감소됨을 의미한다. Significant reduction in DDC induced overexpression of hemoxigenase under MitoQ treatment (FIG. 7) means that oxidative stress is significantly reduced by the antioxidant according to the invention.
장시간 실험에서, DCC 중독(Stumptner C. et al., 2001, Journal of Hepatology, 34: 665-675) 동안 마우스에서 증가된 것으로 알려진 사이토케라틴 8및/또는 (N)ASH 환자에서 감소된 것으로 보고된 카탈라아제의 단백질 발현 양을 평가할 수 있다(Videla L. A. et al., 2004, Clinical Science, 106: 261-268). In long-term trials reported reduction in
간세포 손상(Monbaliu D. et al., 2005, Transplant Proc. 37(1): 413-416)에 대한 민감한 마커를 나타내는 지방산 결합 단백질(FABP)의 단백질 반현 양을 측정하였다. 웨스턴 블럿 분석은 정상 마우스와 비교할 때 DDC 중독된 마우스에서 FABP 단백질의 현저한 감소를 나타낸다. 또한 DDC 중독된 동물의 MitoQ 처리하에서 FABP는 거의 대조용 마우스 FABP 단백질 발현 값에 도달하는데(대조용은 부형제만으로 처리된 중독되지 않은 동물군을 나타냄, 실시예 3 참조), 이는 본 발명에 따른 질병의 치료 또는 예방에서 MitoQ의 효과를 제시한다. Protein refraction of fatty acid binding protein (FABP) indicating a sensitive marker for hepatocyte damage (Monbaliu D. et al., 2005, Transplant Proc. 37 (1): 413-416) was measured. Western blot analysis shows a significant decrease in FABP protein in DDC addicted mice as compared to normal mice. Also, under MitoQ treatment of DDC-addicted animals, FABP reached almost control mouse FABP protein expression values (control represents the non-addicted animal group treated with excipients only, see Example 3), which is a disease according to the present invention. The effectiveness of MitoQ in the treatment or prevention of the disease
본 발명에 따른 산화방지제로 처리된 DDC 중독된 마우스로부터 유도된 냉동미세절단기 부분에서 세포자살 세포의 양은 종래 기술에 공지된 항 카스파아제 3 면역조직화학적 기준 방법에 의해 반-정량화(Brekken et al., 2003, The Journal of Clinical Investigation, 111, 4: 487-495)될 수 있고 또 적합한 대조군과 비교 할 수 있다. The amount of apoptotic cells in the frozen microcutter portion derived from DDC addicted mice treated with antioxidants according to the present invention was semi-quantified by
또한 산화방지제로 처리된 DDC 중독 마우스의 균질물에서 프로토포르피린 수준은 형광 분석법(Stumptner C. et al., 2001, Journal of Hepatology, 34: 665-675)을 이용하여 측정할 수 있고 또 적합한 대조군과 비교하였다. In addition, protoporphyrin levels in homogenates of DDC poisoned mice treated with antioxidants can be measured using fluorescence assays (Stumptner C. et al., 2001, Journal of Hepatology, 34: 665-675). Compared.
실시예Example 6: 혈액 변수에 대한 본 발명에 따른 산화방지제의 효과의 평가 6: evaluation of the effect of the antioxidant according to the invention on blood parameters
간 특이적 효소의 혈청 수준은 본 발명에 따른 간 손상의 정도를 제공하는 Actitest(Biopredictive, Houilles, France)로 모니터링하였다. a2-마크로글로불린, 합토글로빈, γ-글루타밀 트랜스펩티다아제, 전체 빌리루빈, 아포리포프로테인 A1 및 알라닌 아미노트랜스퍼라아제의 혈청 수준은 DDC- 또는 GF 중독된, 대조용 및 상응하는 DDC- 또는 GF 노출되고 표적화된 산화방지제로 처리된 동물로부터 Poynard, et al., 2003, Hepatology 38: 481-492에 기재된 방법과 실시예 3에 따른 일반적 시각표를 따라서 측정하였다. Serum levels of liver specific enzymes were monitored by Actitest (Biopredictive, Houilles, France) providing the extent of liver damage in accordance with the present invention. Serum levels of a 2 -macroglobulin, haptoglobin, γ-glutamyl transpeptidase, total bilirubin, apolipoprotein A1, and alanine aminotransferase were determined to be DDC- or GF addicted, control and corresponding DDC- or GF. Animals treated with exposed and targeted antioxidants were measured following the method described in Poynard, et al., 2003, Hepatology 38: 481-492 and the general timeline according to Example 3.
간 손상의 정도, 특히 섬유증의 정도로 인간 혈청을 사용하여 실시한 Actitest는 본 발명에 따른 산화방지제를 사용하여 이들 질환에 걸린 환자의 치료 효과를 모니터링하기 위해 유사하게 적용될 수 있다. Actitest conducted using human serum to the extent of liver damage, in particular to the degree of fibrosis, can similarly be applied to monitor the therapeutic effect of patients with these diseases using the antioxidants according to the invention.
간 손상을 나타내는 변수에 따른 다양한 시험 동물 군으로부터 얻은 혈청에서, 빌리루빈, 알라민 아미노트랜스퍼라아제(ALT/GPT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 (ASAT/GOT) 및 글루타메이트 탈수소효소(GLDH)는 Hitachi/Roche 917 분석기 상에서 시판되는 키트(번호: 11552414; 11876805216; 11876848216; 119299992, 모 두 스위스 Roche AG 제조)를 이용한 임상적 진단법으로 표준 수순에 따라서 측정하였다. In serum from various test animal groups according to variables indicative of liver damage, bilirubin, alumina aminotransferase (ALT / GPT), aspartate aminotransferase (ASAT / GOT) and glutamate dehydrogenase (GLDH) were hitachi / Clinical diagnostics using a kit commercially available on the Roche 917 analyzer (No. 11552414; 11876805216; 11876848216; 119299992, all manufactured by Roche AG, Switzerland) was determined according to standard procedures.
본 발명에 따른 화합물로 처리된 동물(예컨대 알라닌- 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 도 8 참조)에서 혈청 간 효소의 감소는 그러한 처리된 샘플에서 간 손상의 감소를 나타내며 또 본 발명에 따른 질환에서 상기 화합물의 치료 효과에 대한 지지를 제공한다. In animals treated with a compound according to the invention (eg alanine- and aspartate aminotransferase, see FIG. 8), a decrease in serum liver enzymes indicates a reduction in liver damage in such treated samples and in a disease according to the invention. Provide support for the therapeutic effects of the compounds.
실시예Example 7: 조직 분획에서 반응성 산소 종( 7: reactive oxygen species in the tissue fraction ( ROSROS )의 측정 ) Measurement
DDC- 또는 GF 중독 조직으로부터 얻은 간 시편 및 대조용 조직에서 ROS의 생성을 검출하기 위하여, 디히드로에티듐(DHE, Molecular Probes)을 이용하는 형광 사진용현미경법을 표준 방법에 따라 실시하였다(예컨대 Brandes R.P. et al., 2002, Free Radic Biol Med.; 32(11); 1116-1122). DHE는 세포에 자유로이 투과될 수 있고 또 O2 존재하에서 에티듐으로 산화되며, 핵에서 DNA와 인터칼레이팅함으로써 그 안에 연행된다. 에티듐은 488 nm에서 여기되고 610nm에서 발광 스펙트럼을 갖는다. In order to detect the production of ROS in liver specimens and control tissues obtained from DDC- or GF intoxicated tissues, fluorescence microscopy using dihydroethidium (DHE, Molecular Probes) was performed according to standard methods (eg Brandes). RP et al., 2002, Free Radic Biol Med .; 32 (11); 1116-1122). DHE can be freely permeable to cells and oxidized to ethidium in the presence of O 2 and entrained therein by intercalating with DNA in the nucleus. Ethidium is excited at 488 nm and has an emission spectrum at 610 nm.
간 샘플을 OTC 조직 테크(Sakura Finetek Europe, Zoeterwonde, 네덜란드)에 매립하고 액체 질소-냉각 이소펜탄을 이용하여 냉동시켰다. 샘플을 부분(5㎛-30㎛)로 절단하고 유리 슬라이드 상에 위치시킨다. 디히드로에티듐(5-20 μmol/L)을 각 조직 부분에 인가하였다. 슬라이드를 광보호된 습식, 37℃에서 30분간 배양한 다음 37℃에서 완충 염수액(PBS)으로 세척(2-3회)하였다. 상기 부분에 커버슬립을 씌운다. DHE의 상은 형광 현미경 또는 585 nm 장시간 통과 여과기를 이용한 레이저 주사 공촛점 영상을 이용하여 얻는다. Liver samples were embedded in OTC tissue tech (Sakura Finetek Europe, Zoeterwonde, The Netherlands) and frozen using liquid nitrogen-cooled isopentane. The sample is cut into portions (5 μm-30 μm) and placed on a glass slide. Dihydroethidium (5-20 μmol / L) was applied to each tissue portion. Slides were incubated for 30 min at 37 ° C. in wet, photoprotected and washed (2-3 times) with buffered saline (PBS) at 37 ° C. Cover the part with a cover slip. Images of DHE are obtained using fluorescence microscopy or laser scanning confocal images using a 585 nm long time pass filter.
이 기술분야에서 확립된 다른 방법은 루시게닌 화학발광 분석법(Goerlach A. et al., 2000, Circ Res., 87(1): 26-32)을 이용하여 대조용 간 조직에 대한 DDC- 또는 GF 중독 조직에서 ROS 생산을 측정을 가능하게 한다. 간 조직의 시편을 1 ml의 50 mmol/L HEPES (pH 7.4), 135 mmol/L NaCl, 1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L KCl, 5.5 mmol/L 글루코오스 및 5 μmol/L 루시게닌을 전자 수용체로 함유하는 바이얼에서 균질화시켰다. 초산화물 및 루시게닌 사이의 광 반응은 화학발광 판독기를 이용하여 검출하였다. 화학발광 신호는 15 내지 30분간에 걸쳐 측정한 평균 카운트/분/mg 건조 조직으로 표시된다. 화학발광 신호 데이터는 시편 없이 관찰된 백그라운드 화학발광치를 뺀 후 표시된다. Another method established in the art is DDC- or GF for control liver tissue using Lucigenin chemiluminescence assay (Goerlach A. et al., 2000, Circ Res., 87 (1): 26-32). Enables measurement of ROS production in poisoned tissues. Specimens of liver tissue were prepared with 1 ml of 50 mmol / L HEPES (pH 7.4), 135 mmol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MgCl 2 , 5 mmol / L KCl, 5.5 mmol / L glucose and Homogenized in a vial containing 5 μmol / L lucigenin as the electron acceptor. The photoreaction between superoxide and lucigenin was detected using a chemiluminescent reader. Chemiluminescent signals are expressed as mean counts / minute / mg dry tissue measured over 15-30 minutes. Chemiluminescent signal data is displayed after subtracting background chemiluminescence values observed without specimens.
이러한 방법은 DDC- 또는 GF 중독 마우스로부터 유도된 간에서 ROS의 증가를 나타내므로, 본 발명에 따른 질환에 걸린 환자에서 관찰과 유사하다. This method is similar to that observed in patients with the disease according to the invention, as it shows an increase in ROS in the liver derived from DDC- or GF addicted mice.
실시예Example 8: 8: DDCDDC 또는 or GFGF 에 노출된 마우스에서 반응성 산소 종(Reactive mice in mice exposed to 산화적Oxidative 손상)의 감소에 대한 본 발명에 따른 산화방지제의 효과 Effect of the antioxidant according to the invention on the reduction of damage)
시험 동물의 DDC- 또는 GF 중독 및 산화방지제를 사용한 측정에 대한 시각표및 투여 계획에 대한 일반적 방법은 형태학적 비정상을 측정하기 위해 이용한 실험 과정과 동일하다(실시예 3참조). The timeline for dosing with DDC- or GF poisoning and antioxidants in test animals and the general method for dosing schedule are the same as the experimental procedure used to determine morphological abnormalities (see Example 3).
본 발명에 따른 산화방지제, 예컨대 비타민 E의 유도체, 조효소 Q10 또는 글 루타민 퍼옥시다아제 유사약의 투여는 DDC 또는 GF에 노출된 간에서 ROS 수준의 현저한 감소를 제공한다. 이 결과는 또한 간 손상에서 ROS의 영향을 나타내며 또 이러한 손상은 MitoQ/MitoS 또는 Mito Vit E 를 미토콘드리아, 즉 ROS의 주요 세포 공급원에 표적으로 하는 것에 의해 감소될 수 있음을 나타낸다. 표적화된 산화방지제로 처리시 실시예 7에 따른 방법으로 측정한 ROS 수준의 감소는 본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 예시한다. Administration of antioxidants according to the invention, such as derivatives of vitamin E, coenzyme Q 10 or glutamine peroxidase analogues, provide a significant reduction in ROS levels in livers exposed to DDC or GF. This result also indicates the effect of ROS on liver damage and indicates that such damage can be reduced by targeting MitoQ / MitoS or Mito Vit E to the mitochondria, a major cell source of ROS. The decrease in ROS levels measured by the method according to Example 7 when treated with a targeted antioxidant illustrates the therapeutic efficacy of the compounds according to the invention.
실시예Example 9: 간 세포주에서 반응성 산소 종( 9: reactive oxygen species in liver cell lines ROSROS )의 측정 ) Measurement
간암 세포주(예컨대 HepG2 또는 Hep3B), SNU-398 간세포 암종-유도 세포주 (ATCC No. CRL-2233, LGC promochem, Germany), HUH-7 인간 암종-유도 세포주(Japanese coleection of Research Biosources JCRB 0403) 또는 Tib-73 마우스 배아 간 세포주(ATCC TIB 73 = BAL/c 마우스로부터 유도된 BNL CL2, 미국 매릴랜드)를 적용하는 간단한 실험은 DDC 중독시 이들 세포에서 ROS 생산 측정을 가능하게 한다. 글루타치온 합성 억제제 L-부티오닌-(S,R)-술폭시민(BSO)은 내생 산화적 스트레스를 상승시키기 위해 적용된다(Kito M. et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun., 291(4): 861-867). Liver cancer cell line (eg HepG2 or Hep3B), SNU-398 hepatocellular carcinoma-induced cell line (ATCC No. CRL-2233, LGC promochem, Germany), HUH-7 human carcinoma-induced cell line (Japanese coleection of Research Biosources JCRB 0403) or Tib A simple experiment applying the -73 mouse embryonic liver cell line (ATCC TIB 73 = BNL CL2 derived from BAL / c mice, Maryland, USA) allows measurement of ROS production in these cells upon DDC poisoning. Glutathione synthesis inhibitor L-butionine- (S, R) -sulfoxymin (BSO) is applied to increase endogenous oxidative stress (Kito M. et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun., 291 (4) ): 861-867).
CoCl2 는 분화된 세포주에서 ROS 생산을 측정하기 위하여 미토콘드리아(Jung JY and Kim WJ., 2004, Neurosci Lett., 371:85-90)에 영향을 주는 것으로 최근 알려져 있기 때문에, HepG2는 100 μM CoCl2 (시그마 제조)(Bel Aiba RS, et al., 2004, Biol Chem. 385: 249-57)에 의해 자극될 수 있다. CoCl 2 is to measure the mitochondrial ROS production in differentiated cell lines: Since known to affect the (Jung JY and Kim WJ, 2004 , Neurosci Lett, 371.. 85-90) recently, HepG2 is 100 μM CoCl 2 (Manufactured by Sigma) (Bel Aiba RS, et al., 2004, Biol Chem. 385: 249-57).
배양 세포 (뿐만 아니라 분리된 세포 소기관 또는 전체 조직) 상에서 잘 확립된 다른 방법은 Chem Biol Interact. 2000 Jul 14; 127(3): 201-217에 따른 안티마이신 A(도 10) 또는 루시게닌 화학발광 분석법(Goerlach A. et al., 2000, Circ Res., 87(1): 26-32)을 이용한 로테논에 의해 유도된 ROS 생산의 측정을 가능하게 한다. Other well established methods on cultured cells (as well as isolated organelles or whole tissues) are described in Chem Biol Interact. 2000 Jul 14; Rotenone using antimycin A (FIG. 10) or lucigenin chemiluminescence assay (Goerlach A. et al., 2000, Circ Res., 87 (1): 26-32) according to 127 (3): 201-217 Enables measurement of ROS production induced by
예컨대 간암세포주에서 ROS 생산을 측정하기 위하여, 실시예 8에 따른 표준 실험 방법을 이용한다. 시험된 간암세포는 배양배지(10% FCS(Gibco)가 보충된 DMEM) 중 96-웰 플레이트에서 80% 콘플루언시까지 생장시킨 다음 HBSS로 세척하고 37℃에서 DHE(10-50μM)와 함께 암소에서 10분간 배양하였다. 세포를 Hank 평형 염 용액(HBSS, Gibco)으로 2회 세척하여 과량의 염료를 제거한다. 형광 현미경(Olympus, Hamburg, Germany)로 형광을 모니터링하였다. For example, to measure ROS production in liver cancer cell lines, standard experimental methods according to Example 8 are used. Tested liver cancer cells were grown to 80% confluency in 96-well plates in culture medium (DMEM supplemented with 10% FCS (Gibco)) and then washed with HBSS and with DHE (10-50 μM) at 37 ° C. Incubate for 10 minutes in the dark. Cells are washed twice with Hank balance salt solution (HBSS, Gibco) to remove excess dye. Fluorescence was monitored by fluorescence microscopy (Olympus, Hamburg, Germany).
다르게는, ROS의 생성은 형광 디클로로플루오로세인(DCF; Djordjevic T. et al., 2004, Antioxidants & Redox Signaling, 6: 713-720)으로 변환되는 플루오로프로브 5-(및 -6)-클로로메틸-2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트 아세티 에스테르 (CM-H2DCFDA, Molecular Probes, Goettingen, Germnay)를 이용하여 측정하였다. 마이크로플레이트 판독기(Tecan, Crailsheim, Germany)를 이용하여 DCF 형광을 측정하기 위하여, 세포(예컨대 HepG2, Hep3B 또는 SNU-398)를 96-웰 플레이트에서 80% 콘플루언시까지 생장시켰다. 이 세포를 Hank 평형 염 용액(HBSS, Gibco)으로 2회 세척하고 NO의 형성을 방지하기 위하여 37℃ 에서 N-ω-니트로-L- 아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME, 10 μM)에 용해된 CM-H2DCFDA(8.5μM) 에 의해 암소에서 10분간 동안 배양하였다. HBSS로 수 회 세척하여 과량의 염료를 제거한 후, 480 nm 여기 및 540 nm 발광 파장을 이용함으로써 형광을 모니터링하였다. DCF 형광은 제조자(Biosource, Nivelles, Belgium)의 지시에 따라 Alamar Blue 시험을 이용하여 생존가능한 세포의 수로 표준화되었다. 간단히, 세포는 37℃ 에서 포스페이트-완충된 염수(PBS), pH 7.4 중의 Almar Blue와 함께 배양하여 충분히 산화된(blue) 형태에서 환원된(적색) 형태로 변화됨을 나타낸다. 흡광은 580 nm 파장에서 측정하였다. Alternatively, the production of ROS is fluoroprobe 5- (and -6) -chloro converted to fluorescent dichlorofluorosane (DCF; Djordjevic T. et al., 2004, Antioxidants & Redox Signaling, 6: 713-720). It was measured using methyl-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate ester (CM-H 2 DCFDA, Molecular Probes, Goettingen, Germnay). To measure DCF fluorescence using a microplate reader (Tecan, Crailsheim, Germany), cells (eg HepG2, Hep3B or SNU-398) were grown to 80% confluency in 96-well plates. The cells were washed twice with Hank balanced salt solution (HBSS, Gibco) and CM dissolved in N-ω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 10 μM) at 37 ° C to prevent NO formation. Incubated for 10 min in the dark with -H 2 DCFDA (8.5 μM). After washing several times with HBSS to remove excess dye, fluorescence was monitored by using 480 nm excitation and 540 nm emission wavelengths. DCF fluorescence was normalized to the number of viable cells using the Alamar Blue test according to the manufacturer's instructions (Biosource, Nivelles, Belgium). Briefly, cells are incubated with Almar Blue in phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 at 37 ° C. to show a change from fully oxidized (blue) to reduced (red) form. Absorbance was measured at 580 nm wavelength.
경우에 따라, ROS 생산은 CM-H2DCFDA 염색된 세포의 플로우 사이토메트리 분석에 의해 평가하였다. 세포를 분리하고 트립신처리에 의해 수집하고, 원심분리에 의해 수거하고 HBSS에 1 x 106 세포/ml 농도로 재현탁시켰다. 자극 전에 37℃에서 암소에서 8.5μM의 CM-H2DCFDA를 세포에 부가하였다. DCF 형광은 플로우 사이토미터(Partec, Muenster, Germany)에서 480 nm 여기 및 540nm 방출 파장을 이용하여 10,000개 세포를 분석함으로써 모니터링하였다. If desired, ROS production was assessed by flow cytometry analysis of CM-H 2 DCFDA stained cells. Cells were separated and collected by trypsinization, harvested by centrifugation and resuspended in HBSS at a concentration of 1 × 10 6 cells / ml. 8.5 μM of CM-H 2 DCFDA was added to the cells in the dark at 37 ° C. prior to stimulation. DCF fluorescence was monitored by analyzing 10,000 cells using 480 nm excitation and 540 nm emission wavelengths in a flow cytometer (Partec, Muenster, Germany).
DDC (EC50 = 50 μg/ml의 배지) 또는 100 μM의 BSO에 의해 보충된 배양 배지(DMEM 및 10% FCS, Gibco)에서 72시간 이하 동안 배양된 간암세포주는 본 발명에 따른 질환에 걸린 환자에서의 관찰과 유사한 다른 시험관내 모델이다. Liver cancer cell lines cultured for up to 72 hours in culture medium supplemented with DDC (EC 50 = 50 μg / ml medium) or 100 μM of BSO (DMEM and 10% FCS, Gibco) patients with disease according to the invention Another in vitro model similar to the observation in.
실시예Example 10: 10: DDCDDC -, -, BSOBSO -, -, 안티마이신Antimycin A- (또는 A- (or 로테논Rotenon -) 중독된 또는 -) Addicted or CoClCoCl 22 유도된 Induced 배양배지에서In culture medium 산화적Oxidative 손상의 감소에 대한 본 발명에 따른 산화방지제의 효과 Effect of the antioxidant according to the invention on the reduction of damage
실시예 9에 따른 시각표의 일반적 전략과 표준 수법을 이용하여, DDC 또는 BSO 중독되고 동시에 MitoQ/MitoS 또는 Mito Vit E(Jauslin M.L. et al., 2003, FASEB J., 2003, (13): 1972-1974에 따라서 MitoQ의 경우 EC50 = 0.51 nM 및 Mito Vit E의 경우 EC50 = 416 nM에 상응하는 농도)에 의해 동시에 처리된 인간 세포주는 ROS 형성에서 현저한 감소를 제공한다. Using the general strategy and standard techniques of timetables according to Example 9, DDC or BSO addicted and simultaneously MitoQ / MitoS or Mito Vit E (Jauslin ML et al., 2003, FASEB J., 2003, (13): 1972- According to 1974, human cell lines simultaneously treated with EC 50 = 0.51 nM for MitoQ and EC 50 = 416 nM for Mito Vit E) provide a significant reduction in ROS formation.
다른 실험으로서, 100μM CoCl2 (시그마 제조)에 의해 자극된 HepG2를 사용하였다(Bel Aiba R.S. et al., 2004, Biol Chem. 385: 249-57). 실시예 9에 기재된 실험 과정을 따라서, HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 실험하기 전 16시간 동안 혈청은 제공하지 않는다. HepG2를 HBSS (Hank의 평형 염 용액, Gibco)로 1회 세척하고 0.5 내지 10 μM 농도의 MitoQ 또는 상응하는 양의 DMSO(시그마 제조)와 배양하였다. 15분 후 DCF를 세포에 부가하고(최종 농도 8μM) 또 세포를 염료와 함께 10분간 배양하였다. 부하후 매질을 제거하고 MitoQ 및 CoCl2 (100μM)를 함유하는 신선한 HBSS를 부가한다. 0, 10, 20 및 30분 후 플레이트-판독기(Tecan Safire)에서 형광을 측정하였다(Djordjevic T, et al., 2005, Free Radic Biol Med. 38: 616-30). As another experiment, HepG2 stimulated with 100 μM CoCl 2 (manufactured by Sigma) was used (Bel Aiba RS et al., 2004, Biol Chem. 385: 249-57). Following the experimental procedure described in Example 9, HepG2 cells were plated in 96-well plates and serum was not provided for 16 hours prior to testing. HepG2 was washed once with HBSS (Hank's equilibrium salt solution, Gibco) and incubated with MitoQ or corresponding amount of DMSO (manufactured by Sigma) at a concentration of 0.5-10 μM. After 15 minutes DCF was added to the cells (
5μM MitoQ로 처리된 미자극 세포는 기저 ROS 생산 감소를 나타낸다. CoCl2- 자극된 ROS 생산(100μM CoCl2)은 5μM MitoQ에 의해 현저히 감소되었으며, 이는 본 발명에 따른 산화방지제가 이들 세포에서 기저 및 CoCl2-자극된 ROS 수준을 현저히 감소시킴을 의미한다(도 9).Unstimulated cells treated with 5 μM MitoQ showed a decrease in basal ROS production. CoCl 2 -stimulated ROS production (100 μM CoCl 2 ) was significantly reduced by 5 μM MitoQ, meaning that the antioxidant according to the present invention significantly reduced basal and CoCl 2 -stimulated ROS levels in these cells (FIG. 9).
다른 방법은 루시게닌 화학발광법(실시예 9에서와 같은 실험 설비)을 이용하여 예컨대 HUH-7 또는 Tib-73에서 안티마이신 A 또는 로테논에 의해 유도된 ROS 생산의 측정을 가능하게 한다. HUH-7 세포는 6개 웰 플레이트에서 배양되며 37℃ 에서 3시간 동안, 0-25μM 농도(바람직하게는 0, 1 및 5μM)의 안티마이신 A를 사용하여 자극되고 DMEM(Gibco)에 용해된 0 내지 1000 nmol 농도 범위의 Mito Q(또는 MitoS)에 의해 동시에 자극되거나 자극되지 않는다. 3회 연속 세척한 후 세포를 1 ml의 50 mmol/L HEPES (pH 7.4), 135 mmol/L NaCl, 1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L KCl, 5.5 mmol/L 글루코오스 및 5μmol/L 루시게닌을 전극 수용체로 함유하는 플레이트에 균형화시킨다. 초산화물과 루시게닌 사이의 광 반응은 화학발광 판독기(Lumistar, BMG 라보라토리스, 독일)를 이용하여 검출하였다. 화학발광 신호는 평균 카운트/분으로 표시되며 또 세포 계수기에 측정된 바와 같이 세포 수로 정상화된다(Casy Technology Instrument, Scharfe-System, Germany). Another method enables the measurement of ROS production induced by antimycin A or rotenone, such as in HUH-7 or Tib-73 using lucigenin chemiluminescence (experimental equipment as in Example 9). HUH-7 cells were cultured in 6 well plates and stimulated with antimycin A at 0-25 μM concentrations (preferably 0, 1 and 5 μM) and dissolved in DMEM (Gibco) for 3 hours at 37 ° C. It is not stimulated or stimulated simultaneously by Mito Q (or MitoS) in the range of from 1000 nmol. After three successive washes, the cells were washed with 1 ml of 50 mmol / L HEPES (pH 7.4), 135 mmol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MgCl 2 , 5 mmol / L KCl, 5.5 mmol / Balance the plates containing L glucose and 5 μmol / L lucigenin as electrode receptor. The photoreaction between superoxide and lucigenin was detected using a chemiluminescent reader (Lumistar, BMG Laboratories, Germany). Chemiluminescent signals are expressed in average counts / minute and normalized to cell number as measured by a cell counter (Casy Technology Instrument, Scharfe-System, Germany).
전체적으로, 이들 실험은 ROS 형성에서 현저한 감소를 나타내며(도 10), 따라서 본 발명에 따른 간질환에서 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 치료 효과를 확인할 수 있다. Overall, these experiments show a significant decrease in ROS formation (FIG. 10), thus confirming the therapeutic effect of mitochondrially targeted antioxidants in liver disease according to the present invention.
실시예Example 11: 누드 마우스에서 산화방지제 화합물의 효과의 평가 11: Evaluation of the Effect of Antioxidant Compounds in Nude Mice
상피암의 치료 및/또는 예방에서 본 발명에 따른 미토콘드리아적으로 표적화된 산화방지제의 효과를 측정하기 위한 일반적인 전략은 인간 상피세포 암 이종이식편(누드 마우스 종양 이종이식편은 예컨대 미국 찰스 리버스 라보라토리즈가 공급하는 CD1 nu/nu 마우스에 적용됨)을 가지고 있는 면역보상된 마우스를 적용하는 이외는 DDC- 또는 GF 중독된 마우스(실시예 2 내지 7에 따름)에 대하여 상기 기재한 치료 수법을 따른다. 표준 방법(Li K. et al., 2003, Cancer Res., 63(13): 3593-3597)에 따라 피하적으로 이종이식된 종양 세포주 또는 일차 종양은 직장 샘암종, 침습적 관상 유방암, 소형 및 비소형 세포 폐암, 전립선 종양, 췌장 종양 및 위 종양을 포함한다. A general strategy for measuring the effect of mitochondrial targeted antioxidants according to the invention in the treatment and / or prevention of epithelial cancer is that human epithelial cancer xenografts (nude mouse tumor xenografts are supplied by, for example, Charles River Laboratories, USA). Except for the application of immunocompensated mice with CD1 nu / nu mice), the treatment regime described above is followed for DDC- or GF addicted mice (according to Examples 2-7). Tumor cell lines or primary tumors subcutaneously xenografted according to standard methods (Li K. et al., 2003, Cancer Res., 63 (13): 3593-3597) are rectal adenocarcinomas, invasive coronary breast cancers, small and non-small. Cell lung cancer, prostate tumor, pancreatic tumor and gastric tumor.
종양-유도된 세포주(DMEM/10% FBS에서 생장)는 로그-상 생장에서 수집하며, PBS로 2회 세척하고 1 ml PBS (2.5 x 107 세포/ml)에 재현탁시키고 누드 마우스(Hsd:athymic nu/nu, Harlan Winkelamnn; 6 내지 6주령)의 우측에 5 x 106 세포/마우스 (0.2 ml)로 피하 주사하였다. 종양 생장은 지시된 기간(세포 유형에 따라 다름) 마다 하루 걸러 모니터링하였다. 종양 크기는 피부 표면 상의 2개의 수직 직경 및 높이에 의해 결정하였다. Tumor-induced cell lines (growing in DMEM / 10% FBS) are collected in log-phase growth, washed twice with PBS, resuspended in 1 ml PBS (2.5 × 10 7 cells / ml) and nude mice (Hsd: Subcutaneous injection of 5 x 10 6 cells / mouse (0.2 ml) to the right of athymic nu / nu, Harlan Winkelamnn; 6-6 weeks old). Tumor growth was monitored every other day for the indicated period (depending on cell type). Tumor size was determined by two vertical diameters and heights on the skin surface.
MitoQ (MitoS)에 의한 마우스 처리는 종양 생장을 감소시키고, 종양의 괴사를 증가시키며 종양 이종이식편의 혈관화를 감소시킨다. 유사하게, 누드 마우스 종양 이종이식편에서 ROS의 수준은 상술한 바와 같이 모니터링하며 본 발명에 따른 산화방지제에 처리된 이종이식편 종양에서는 감소되었다. Mouse treatment with MitoQ (MitoS) reduces tumor growth, increases tumor necrosis and reduces vascularization of tumor xenografts. Similarly, the level of ROS in nude mouse tumor xenografts was monitored as described above and decreased in xenograft tumors treated with the antioxidant according to the invention.
본 발명의 조성 및 방법에 대해서는 다양한 변형이 가능함은 당업자들이 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위 및 이들의 등가범위에 속하는 한 이러한 변형 및 변이를 모두 포함하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 예시된 모든 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. It will be appreciated by those skilled in the art that various modifications are possible to the compositions and methods of the present invention. Accordingly, the invention is to be understood as including all such modifications and variations as long as they fall within the scope of the appended claims and their equivalents. All documents exemplified herein are incorporated herein by reference.
Claims (31)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020067025659A KR20070030815A (en) | 2004-07-13 | 2005-07-12 | Use of mitochondrially targeted antioxidant in the treatment of liver diseases and epithelial cancers |
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EP04103318.4 | 2004-07-13 | ||
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017034288A1 (en) * | 2015-08-25 | 2017-03-02 | (주) 씨유스킨 | Cosmetic composition for preventing or ameliorating skin damage caused by ultraviolet light |
WO2021125800A1 (en) * | 2019-12-16 | 2021-06-24 | 울산과학기술원 | Compound for inhibiting angiogenesis factor, and use thereof |
-
2005
- 2005-07-12 KR KR1020067025659A patent/KR20070030815A/en not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2017034288A1 (en) * | 2015-08-25 | 2017-03-02 | (주) 씨유스킨 | Cosmetic composition for preventing or ameliorating skin damage caused by ultraviolet light |
WO2021125800A1 (en) * | 2019-12-16 | 2021-06-24 | 울산과학기술원 | Compound for inhibiting angiogenesis factor, and use thereof |
CN114901290A (en) * | 2019-12-16 | 2022-08-12 | 蔚山科学技术院 | Compound for inhibiting angiogenesis factor and application thereof |
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