KR20070026601A - 간 질환 관련 방법 및 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자의 간 질환 상태 또는 진행의 진단에 도움을 주기 위해, 혈청 및 혈장 마커 값을 비롯한 복수의 혈액 마커 값을 사용하는 진단 방법, 키트 및 시스템, 그리고 관련 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다. 또한, 본 발명은 혈청 및 혈장 마커 값을 비롯한 혈액 마커 값을 이용하여, (1) 간 질환의 치료에 유용한 활성 성분을 선별하고; (2) 간 질환의 소인이 있거나 간 질환을 앓고 있는 환자의 치료 방법의 선택에 도움을 주며; (3) 환자 1인 이상의 간 질환의 상태 또는 진행을 모니터하는데 유용한 임상 프로그램의 설계에 도움을 주는, 방법 및 시스템, 그리고 관련 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다.

간 질환, 혈액 마커, 진단 방법, 진단 키트, 진단 시스템

Description

간 질환 관련 방법 및 시스템{Liver disease-related methods and systems}

본 출원은 2004년 6월 15일에 출원된 미국 특허원 제10/868,437호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 환자의 간 질환 상태 또는 진행의 진단에 도움을 주기 위해, 혈청 및 혈장 마커 값을 비롯한 복수의 혈액 마커 값을 사용하는 진단 방법, 키트 및 시스템, 그리고 관련 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다.

또한, 본 발명은 혈청 및 혈장 마커 값을 비롯한 혈액 마커 값을 이용하여, (1) 간 질환의 치료에 유용한 활성 성분을 선별하고; (2) 간 질환의 소인이 있거나 간 질환을 앓고 있는 환자의 치료 방법의 선택에 도움을 주며; (3) 환자 1인 이상의 간 질환의 상태 또는 진행을 모니터하는데 유용한 임상 프로그램의 설계에 도움을 주는, 방법 및 시스템, 그리고 관련 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다.

간의 진행성 섬유증 질환은 전세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이다. 간 섬유증의 발병 과정은 간 성상 세포(지방세포, 또는 지방 축적 또는 Ito 세포라고 도 불림) 및 과량의 세포외 기질 단백질을 합성하여 분비하는 다른 간 세포외 기질 생산 세포(즉, 문맥 근육섬유아세포 및 섬유아세포)의 증식 및 활성화에 결정적으로 좌우된다(1). 이 과정은 모든 병인의 간 질환에 공통적이다. 만성 바이러스 B형 및 C형 간염, 알코올성 간 질환, 비알코올성 지방간 질환, 및 자가면역 및 유전적 간 질환은 모두 진행성 간 섬유증의 공통적인 최종 경로와 결과적인 간경화증 발생을 수반한다.

간 섬유증은 결절이 아직 발생하지 않은 만성 손상에 대한 반응으로 나타나는 세포외 기질의 가역적인 축적이지만, 간경화증은 기질의 두꺼운 띠가 실질을 완전히 둘러싸서 결절을 형성하여, 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 비가역성으로서, 그 발병 과정의 임상적으로 중요한 단계임을 암시한다. 간경화증은 간 부전, 간암 및 사망의 위험도 증가와 관련이 있다. 결과적으로, 임의의 간 질환 치료법은 유효해지기 위하여 위험이 있는 환자의 조기 식별 및 모니터링을 필요로 하는 가역적인 질환(섬유증) 환자를 대상으로 하는 것이어야 한다(2).

간 섬유증의 진단은 일반적으로 간 생검의 조직 분석을 통해 이루어진다. 단독 생검은 진단, 예후 및 적당한 치료의 결정에 많은 정보를 제공할 수 있다(1A; 2A). 간 섬유증 검출에 있어서 대용 마커의 역할에 대해서는 아직 구축된 바가 없다. 따라서, 간 생검은 현재 간 섬유증의 "대조-표준" 지표로서 간주되고 있다.

하지만, 생검 수득은 비용이 많이 들고(3A), 통증(4A), 출혈 또는 사망(5A;6A)을 수반하기도 한다. 생검 과정은 시간 소모적이며 노동 집약적인 과정이다. 간 생검의 빈번한 반복은 치료에 대한 반응이나 질환 전개의 모니터에 생검 반 복을 필요로 할 수 있지만, 상기와 같은 모든 이유들로 인해 환자 및 의사에게 똑같이 환영받지 못하는 것으로 생각된다.

또한, 바늘 생검의 작은 크기와 많은 간 질환의 확산 본성으로 인하여, 생검이 환자 질환 상태를 사실상 대표하는 결과를 제공하지 못하는 경우도 있다(7A). 생검의 조직 분석은 경험과 기술을 필요로 하지만, 주관적이며 관찰자내 변이 및 관찰자간 변이가 있기 쉽다(8A; 9A).

따라서, 간 섬유증의 대용 마커의 동정은 상당한 임상적 필요를 요구하고 있다. 이러한 마커는 생검 대신에 섬유증 정도를 추정하는데 사용될 수 있고, 또는 섬유증의 진행 또는 퇴행 및 생활 방식의 변화, 또는 항섬유성 치료법, 항바이러스성 치료법 또는 다른 치료법에 대한 반응을 추적하기 위하여 단독 간 생검과 함께 사용될 수 있다. 이러한 마커들은 자동화될 수 있고 환자에게 거의 중단함이 없이 반복적으로 수행될 수 있는 정확하고 재현가능한 검사를 기반으로 할 수 있는 것이 이상적이다.

기질 합성 또는 분해 산물, 및 이러한 과정에 관여하는 효소들에 대한 혈청 분석은 수많은 연구에서 간 섬유증의 대용 마커로서 연구되었다(10A-19A). 하지만, 각 분석의 일부가 간경화증(20A; 21A), 알코올성 간 질환(히알루론산)(22A) 또는 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 경미한 섬유증(YKL-40)(23A)의 검출에 가능성을 보여주기는 했지만, 일반적으로 이러한 마커들의 진단 성능은 실망스러운 것이었다. 또한 항바이러스 치료법에 기인하는 간 조직학의 변화를 나타내는 다른 마커에 대해서도 보고된 바 있다(11A; 24A; 25A).

생검 및 혈청 마커는 다른 사물을 비교한다. 즉, 혈청 모수(parameter)들은 간의 동적 과정을 특징으로 나타내지만, 생검은 일정 시점의 섬유성 징후를 특징으로 나타낸다. 섬유성 조직이 전개되기 이전의 간에는 매우 활성적인 섬유성 과정이 존재할 수 있다. 이에 반해, 섬유성 활성이 정지되거나 일시적으로 중단된 간에는 섬유성 조직의 커다란 군집이 존재할 수 있다.

또 다른 시도는 다양한 병도의 섬유증을 평가할 수 있는 알고리듬을 만들기 위하여 다수의 혈청 마커를 조합하는 방법이다. 만성 C형 간염(CHC)(18A; 26A) 및 만성 B형 간염에서는, 양성 예측값(PPV)가 80%인 유의적인 섬유증을 검출할 수 있는 5가지 모수가 동정된 바 있다. 하지만, 이러한 시도는 약 50%의 환자에 존재하는 섬유증의 병도를 측정하지 못했고, 후속된 독립 확인 시험에서 그 마커들의 유용성이 의심되었다(Rossi, et al., Clinical Chemistry, 49(3): 450-4, 2003 Mar.).

종래 연구에서는 세포외 기질 단백질(또는 이의 절단 단편)의 혈청 농도가 간 섬유증의 병도 및 진행을 평가하는데 사용될 수 있음을 암시했다(미국 특허 5,316,914 및 EP 0 283 779). 여러 가지 혈청 마커가 연구되었고, 간 생검과 간 질환의 병도 간의 상관관계가 밝혀졌다(6). 간 섬유증의 평가에 사용된 일부 마커는 PIIINP, 라미닌(Laminin), 히알루로난(Hyaluronan), 콜라겐 IV, TIMP-1, 테나신(Tenascin), MMP-2 및 피브로넥틴이다. 이러한 마커들이 측정되었고, 이들의 간 섬유증 평가능이 확인되었다. 그럼에도 불구하고, 진단 마커들의 진단 정확도 또는 특이성이, 임상적 유용성이 충분한 섬유증 점수(score)를 예측하는데 적당한 것은 전혀 없었다.

간단한 생물학적 지수 PGA(프로트롬빈 시간(PT), 혈청 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(GGT), 아포리포프로테인 A1(Apo A1)을 포함한다)의 진단 값을 증가시키기 위한 노력으로 마커 조합이 사용되었고, 애주가의 알코올성 간 질환의 진단에 있어서 지수 PGAA(PGA 지수에 알파-2-마크로글로불린(A₂M)을 포함한다)가 개시된 바 있다(7,8). 하지만, 이러한 PGA 및 PGAA 지수가 단독 혈청 마커(9,10)와 조합되더라도, 이러한 혈청 마커들이 신뢰할 수 있는 간 질환 평가 수단이 되지는 못했다.

근래에는, α₂-마크로글로불린, α₂-글루불린(또는 합토글로빈), γ-글로불린, 아포리포프로테인-A1, γ-글루타밀-트랜스펩티다제 및 총 빌리루빈이 간 섬유증의 상태를 평가하는데 함께 사용되었다(11). 이로부터 유도된 마커 알고리듬은 심각하거나 비교적 약한 섬유증의 동정 또는 배제를 위한 섬유증 스펙트럼 양단의 진단능은 강력한 것으로 나타났다. 하지만, 이 알고리듬은 섬유증 정도가 중간인 환자의 동정에는 유용한 진단 기구가 되지 못했다.

필레트 등(Pilette, et al., J.Hepatol., Vol. 28, No. 3, 1998, pages 439-446(Chemical Abstracts, Vol.130, No. 7, February 15, 1999)(Columbus, Ohio, U.S.; abtracts no. 78389))(이하, "필레트"라 한다)은 간 섬유증의 조직병리학적 평가를 목적으로, 수학 알고리듬을 사용하여 진단 마커인 히알루로네이트, 프로콜라겐 Ill의 N-말단 펩타이드 및 다른 혈청 마커들의 상관관계를 개시했다. 필레트는 간 섬유증을 평가하는 최상의 형태측정법을 확인했으나, 오로지 히알루론산을 사용한 것보다 우수한 진단 시스템 또는 방법을 수득하기 위하여 마커를 알고리듬식으로 조합하지 않았다.

게초 등(Guechot, et al., Clinical Chemistry, Vol. 42, No. 4(April 1996) pp. 558-563(XP002 1 49459 Winston; U.S.)(이하 "게초"라 함)은 간 질환을 평가하는 혈청 마커로서 히알루론산과 PIIINP의 성능을 비교 평가했다. 하지만, 게초는 임의의 두 마커를 단독으로 사용하는 것보다 우수한 결과를 제공할 수 있는 간 섬유증의 혈청 마커 기반 평가 수단을 수득하기 위해 히알루론산 및 PIIINP의 결과를 조합하는 시도를 수행한 바는 없다.

따라서, 환자의 간 질환의 상태 또는 진행을 측정하는데 도움을 주기 위해, 혈장 또는 혈청 마커와 같은 2종 이상의 간 질환 관련 혈액 마커를 이용하는, 정확하고 재현성이 있으며 컴퓨터 실행가능한 방법, 시스템, 키트 및 매체의 개발은 여전히 필요한 상황이다. 이러한 방법, 시스템, 키트 및 매체는 건강관리자들이 환자를 위험한 생검 처리 없이 2 이상의 시점에서 환자의 간 질환의 상태 또는 진행을 확인할 수 있게 해준다.

또한, 상기 방법, 시스템, 키트 및 매체는 간 질환 관련 임상 실험의 설계 또는 모니터링, 및 간 질환의 치료에 유용한 인자(agent)의 선별에 유용한 것으로 입증되었다.

발명의 개요

본 발명은 환자의 간 질환 상태 또는 진행의 진단에 도움을 주기 위해 혈청 및 혈장 마커 값을 비롯한 복수의 혈액 마커 값을 이용하는 진단 방법, 키트 및 시스템, 그리고 관련 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다.

또한, 본 발명은 혈청 및 혈장 마커 값을 비롯한 혈액 마커 값을 이용하여, (1) 간 질환의 치료에 유용한 활성 성분을 선별하고; (2) 간 질환의 소인이 있거나 간 질환을 앓고 있는 환자의 치료 방법의 선택에 도움을 주며; (3) 환자 1인 이상의 간 질환의 상태 또는 진행을 모니터하는데 유용한 임상 프로그램의 설계에 도움을 주는, 방법 및 시스템, 그리고 관련 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다.

본 발명은 간 질환의 관리 또는 원격 진단의 문제를 용이하게 하고 2 이상의 시점에서 간 질환의 상태 또는 진행을 모니터링하는 건강관리자에게 도움을 준다. 중요한 것은, 본 발명은 건강관리 결정자에게 부정확하고 위험할 가능성이 있는 간 생검의 대안을 제공한다.

본 발명은 2 이상의 간 질환 관련 마커 값을 이용하는 컴퓨터 실행가능 알고리듬 방법을 제공한다. 본 발명의 예측값은 간 질환의 상태 또는 진행을 모니터한 임상 연구에서 입증되었다. 이러한 임상 실험들은 분석이 불연속 시점에서 수행되었다는 점에서 단면적 기준에 입각하여, 그리고 분석이 2 이상의 시점에서 수행되었다는 점에서 장기적으로 본 발명을 입증했다.

따라서, 본 발명은

(a) 세포외 기질 합성(섬유발생) 및 세포외 기질 분해(섬유분해)의 동적 과정을 측정하고;

(b) 간 섬유증 조직학적 점수의 예측을 통해 간 조직에서 일어나는 동적 변 화 및 섬유증의 정도를 반영하는 결과를 수득하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 특히 간 생검이 매우 위험할 수 있는 환자의 진단 치료를 돕는데 매우 유용하다. 이러한 환자들은 응고병증을 앓고 있거나, 생검 실시를 반대하거나, 또는 전문적인 조직병리학 처리를 받을 수 없는 환자이다. 또한, 본 발명은 유전적 혈색소침착증, 1차 담관성간경화증 및 1차 경화담관염과 같은 만성 간 질환과 관련 있는 간 섬유증을 평가하는 건강관리 결정자에 의해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 섬유증이 불균일하게 분포되어 있을 수 있고 표본오차가 유의적인 문제를 일으키는 경우에 특히 유용하다.

일 양태에서, 본 발명은 1 이상의 시점에서 각 시점의 예측값을 측정하되, 그 예측값의 1 이상의 시점에서의 비교와 비교 데이터 세트가 환자 간 질환의 상태 또는 진행을 확인하는 건강관리 결정자에 의해 이용되고, 상기 환자 예측값이 2 이상의 혈액 마커, 예컨대 2 이상의 혈장 또는 혈청 마커, 및 경우에 따라 1 이상의 보조 마커에 대한 데이터를, 대조 간 조직병리학적 마커 및 혈액 마커, 예컨대 혈장 또는 혈청 마커 데이터를 상호연관시켜 유도한 선형 또는 비선형 함수 알고리듬에 입력하여 계산하여, 환자의 간 질환의 상태 또는 진행의 진단을 돕는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

"비교 데이터 세트"는 조직병리학적 상태의 임의의 질적 또는 양적 표시를 반영하는 임의의 데이터를 포함할 수 있다. 일 양태에 따르면, 비교 데이터 세트는 조직병리학적 상태와 관련된 1 이상의 수치 값, 또는 수치 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비교 데이터 세트는 정수 0 내지 5와 같은 다양한 정수 세트를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 6개 정수의 다른 그룹화가 간 질환의 다른 상태와 관련이 있는, 예컨대 0-1은 약한 질환 상태와 관련이 있을 수 있고, 2-3은 중간 질환 상태와 관련이 있을 수 있으며, 4-5는 심각한 질환 상태와 관련이 있을 수 있다. 따라서, 비교 데이터 세트는 구축된 간 생검 채점 시스템, 예컨대 슈어(Scheuer) 채점 시스템(0-4) 및 변형된 조직 활성("HAI") 섬유증 점수(이삭 점수)(0-6)와 관련이 있을 수 있다.

바람직한 양태에 따르면, 혈액 마커는 다음 중 적어도 2 이상 중에서 선택되는 혈청 마커이다: N-말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신, 라미닌, 히알루로난, MMP-2, TIMP-1, MMP-9/TIMP-1 복합체, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST). 보조 마커에는 환자의 체중, 성별, 연령 및 트랜스아미나제 농도가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 선형 또는 비선형 함수 알고리듬은 판별함수 분석 또는 비모수 회귀 분석을 사용하여 대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커, 예컨대 혈장 및 혈청 마커의 데이터를 상호연관시킴으로써 유도한다. 대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커 데이터, 예컨대 혈장 및 혈청 마커 데이터는 섬유발생 또는 섬유분해를 나타내는 데이터, 상승된 간 질환 혈청 마커 또는 다른 간 질환 임상 증후군을 포함할 수 있다.

일 양태에 따르면, 대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커 데이터, 예컨대 혈장 및 혈청 마커 데이터는 진단받는 환자 이외의 1 이상의 피험자에 관한 데이터에 기 초한다. 다른 양태에 따르면, 대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커 데이터, 예컨대 혈장 및 혈청 마커 데이터는 종래 진단받은 환자로부터 수득한 데이터에 기초하며, 경우에 따라서는 1 이상의 다른 피험자로부터 수득한 데이터에 기초하기도 한다.

일 양태에 따르면, 선형 또는 비선형 함수 알고리듬은

(a) 피험자 제1 그룹의 혈액 마커 데이터, 예컨대 혈장 또는 혈청 마커 데이터 및 조직병리학적 데이터를 함유하는 데이터 세트를 컴파일링하는 단계;

(b) 분석 방법론의 적용을 통해 상기 컴파일링된 데이터 세트로부터 선형 또는 비선형 함수 알고리듬을 유도하는 단계;

(c) 피험자 제2 그룹의 혈액 마커 데이터, 예컨대 혈장 또는 혈청 마커 데이터 값을 함유하는 데이터를 상기 단계 (b)에서 유도된 알고리듬에 입력하여 피험자 제2 그룹의 확인 생검 점수 값을 계산하는 단계; 및

(d) 단계 (c)에서 계산된 확인 생검 점수 값을 상기 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 비교하는 단계; 및

(e) 단계 (c)에서 측정된 확인 생검 점수가 임상적으로 허용되는 관용 수준 내에서 상기 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 상호연관이 없다면, 그러한 관용이 충족될 때까지 다음과 같은 조작, 즉 (i) (1) 상기 피험자 제1 그룹의 데이터 세트를 변경하고, (2) 상기 분석 방법론을 변경하는 것을 포함하는 기본에 근거하여 알고리듬을 변형시키는 단계, (ii) 상기 피험자 제2 그룹의 혈액 마커 데이터, 예컨대 혈장 또는 혈청 마커 데이터 값을 포함하는 데이터를 상기 변형된 알고리듬에 입력하여 피험자 제2 그룹의 확인 생검 점수값을 계산하는 단계, (iii) 상기 변형된 알고리듬을 사용하여 계산한 확인 생검 점수 값이 임상적으로 허용되는 관용 수준 내에서 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 상호연관이 있는지의 여부를 평가하는 단계를 수행하는 단계

에 의해 대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커 데이터, 예컨대 혈장 및 혈청 마커 데이터를 상호연관시킴으로써 유도되는 것이다.

상기 분석 방법론은 판별함수 분석 및 비모수 회귀 분석을 포함하는 통계 기술뿐만 아니라 분류 수형도(classification tree) 또는 신경망(neural network)과 같은 기술을 포함할 수 있다.

다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 명세서에 기술된 방식으로 유도된 선형 또는 비선형 함수 알고리듬을 특유하게 동정하는 적어도 하나의 코드를 함유하는 마이크로프로세서에 의해 판독될 수 있는 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 데이터 구조를 제공한다.

다른 양태에 따르면, 본 발명은

(a) 마이크로프로세서에 의해 판독될 수 있고 본 명세서에 기술된 방식으로 유도된 선형 또는 비선형 함수 알고리듬을 특유하게 동정하는 적어도 하나의 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 데이터 구조; 및

(b) 환자의 혈청 마커 값을 검출하고 측정하는 하나 이상의 면역분석을 포함하는 진단 키트를 제공한다.

다른 양태에 따르면, 본 발명은 조성물로 치료된 환자의 간 질환 상태 또는 진행을 진단하는데 유용한 데이터를 평가하는 것을 포함하여, 상기 조성물이 간 질 환의 치료에 유용한지의 여부를 측정하는 컴퓨터 실행가능 방법 및 시스템으로서,

(a) 상기 진단은 각 시점마다의 예측값을 하나 이상의 시점에서 알고리듬식으로 측정하여 건강관리자에 의해 결정되어지고;

(b) 하나 이상의 시점에서 상기 예측값과 비교 데이터 세트의 비교가 환자 간 질환의 상태 또는 진행을 확인하기 위해 건강관리자에 의해 사용되며;

(c) 환자 예측값은 대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커 데이터, 예컨대 혈장 또는 혈청 마커 데이터를 상호연관시켜 유도한 선형 또는 비선형 함수 알고리듬에 2 이상의 혈액 마커, 예컨대 혈장 또는 혈청 마커의 데이터를 입력하여 계산하는 것이 특징인, 컴퓨터 실행가능 방법 및 시스템을 제공한다.

또한, 전술한 본 발명의 방법, 시스템 및 키트는 (1) 간 질환에 걸릴 소인이 있거나 간 질환을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 결정하고, (2) 환자 1인 이상의 간 질환의 상태 또는 진행을 모니터링하는데 유용한 임상 프로그램을 설계하기 위하여, 건강관리자에 의해 사용될 수 있다.

이러한 본 발명의 관점 및 여타 다른 관점은 이하 발명의 상세한 설명을 통해 추가 설명될 것이다.

도 1은 본 발명의 상세한 설명에서 참고한 ELF 연구용 피험자 모집 및 참가 일정을 도시한 흐름도이다.

도 2a는 판별점수에 대항하여 누적 p 점수를 도시한 그래프로서, 본 발명에 따른 방법에 의해 확인된 슈어 단계 점수의 누적 분포를 나타낸다.

도 2b는 판별점수에 대항하여 누적 p 점수를 도시한 그래프로서, 본 발명에 따른 방법에 의해 확인된 이삭(Ishak) 단계 점수의 누적 분포를 나타낸다.

도 3a는 본 발명에 따라 측정된 수신기 작동 특성 곡선-슈어 변형 채점 시스템 확인 데이터를 도시한 것이다.

도 3b는 본 발명에 따라 측정된 수신기 작동 특성 곡선-이삭 변형 채점 시스템 확인 데이터를 도시한 것이다.

도 4는 본 발명에 따라 측정된 슈어 섬유증 점수 대 판별점수를 보여주는 확인 데이터 세트(G_v)의 박스-위스커 플롯을 도시한 것이다.

도 5는 사람 TIMP1 mRNA의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 도시한 것이다.

도 6은 사람 MMP2 mRNA의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 2)을 도시한 것이다.

도 7은 사람 MMP9 mRNA의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3)을 도시한 것이다.

본 명세서에 사용된 다음 용어들은 각각 다음과 같은 의미를 갖는 것이다.

"항체"는 환자의 진단용 혈청 마커 에피토프에 결합하는, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함하는 임의의 항체 또는 이의 임의의 단편을 의미한다. 모노클로날 항체 및/또는 폴리클로날 항체가 본 발명의 방법 및 시스템에 사용되기도 한다. 본 명세서에 사용된 "항체" 또는 이와 유사한 용어는 모노클로날 또는 폴리클로날성인 전체 면역글로불린은 물론 상기 마커에 특이적으로 결합하는 면역반응성 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 F(v)도 포함한다. 또한, "항체"란 용어는 결합 단백질, 구체적으로 히알루론산 결합 단백질(HABP)도 포함한다. 바람직한 혈청 마커 항체는 이하에 설명되어진다.

본 발명의 분석에 사용된 사람 체액 시료는 환자의 진단 마커를 함유하는 임의의 시료, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 또는 기관지 폐포 세척액(BAL) 또는 임의의 다른 체액일 수 있다. 전형적으로, 혈청 또는 혈장 시료가 사용된다.

본 발명에 사용된 항체는 당업계에 일반적으로 공지된 기술로 제조될 수 있으며, 전형적으로 마커 시료에 대해 분리된 자연 발생의 단백질로서, 재조합 발현된 단백질로서 또는 자연 단백질의 항원부를 나타내는 합성 펩타이드로서 생성된다. 제2 항체는 검출기, 예컨대 알칼리 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 형광 염료 또는 진단 분석에서 생체분자의 검출에 일반적으로 유용한 임의의 다른 표지 잔기(labelling moiety)에 접합되어 있다. 접합체는 당업계에 일반적으로 공지된 기술에 의해 제조된다.

"면역분석"은 생물학적 시료를 혈청 마커에 결합하는 항체와 반응시키되, 이 반응을 상기 항체와 혈청 마커간에 면역복합체를 형성시키는 시간과 조건 하에 수행하여 상기 생물학적 시료 중에 환자의 진단용 혈청 마커의 존재를 측정한다. 그 다음, 상기 면역복합체의 정량 측정을 수행한다.

일 변형에서, 사용된 항체는 포유동물(예, 토끼, 염소, 마우스, 돼지 등)에게 혈청 마커인 면역원, 혈청 마커의 면역원성 단편 또는 항혈청 마커 결합성 이디오타입(idiotypic) 항체를 투여하여 생산한 항체이다. 다른 유용한 면역분석에서는 일반적인 혈청 마커 결합 항체의 사용(이 항체가 전술한 면역원 중 하나에 대해 유발되는지의 여부에 관계없이)을 특징으로 하기도 한다. 또한, 혈청 마커에 결합하는 제2 항체를 이용하고, 두 항체 중 하나는 고정되고 다른 하나는 표지되는, 샌드위치 면역분석 형식이 사용될 수도 있다.

바람직한 면역분석은 표지되고 제1 항체에 결합하는 제2 항체를 이용하여, 혈청 마커와 혈청 마커 결합 항체 사이의 고정된 복합체를 검출한다. 또는, 제1 변형은 제2 항체가 혈청 마커에도 결합하는 샌드위치 형식을 특징으로 한다. 샌드위치 면역분석 절차에서, 혈청 마커 결합 항체는 불용성 물질에 부착된 포획(capture) 항체일 수 있고 제2 혈청 마커 결합 항체는 표지 항체일 수 있다. 전술한 샌드위치 면역분석 절차는 이하에 설명되는 항체에도 사용될 수 있다.

본 발명에 사용된 분석은 소변, 혈장, 혈청, 복막액 또는 림프액을 비롯한 시료에 존재하는 혈액 마커, 예컨대 혈장 또는 혈청 마커를 측정하는데 사용될 수 있다. 혈청 마커 검출용 면역분석 키트도 본 발명에 사용될 수 있으며, 혈청 마커 결합 항체 및 생물학적 시료에 존재하는 혈청 마커에 대한 상기 항체의 결합하는 측정하는 수단을 포함한다. 바람직한 양태에 따르면, 키트는 전술한 경쟁 항원 또는 제2 항체 중 하나를 포함한다.

"비교 데이터 세트"는 앞에서 정의한 바와 같다.

"대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커 데이트" 및 "조직병리학적 데이터"는 섬유발생 또는 섬유분해, 계면 간염, 괴사, 염증, 괴사염증, 상승된 간 질환 혈청 마커 또는 다른 간 질환 임상 증후군을 표시하는 혈청 또는 혈장 데이터를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉, 대조 간 조직병리학적 및 혈청 마커 데이터에는 슈어 점수(0-4) 및 HAI 점수(이삭 점수)(0-6)를 사용하는 1 이상의 간 생검 검사의 적용을 반영하는 데이터를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 대조 간 조직병리학적 및 혈청 마커 데이터는 변형 이삭 점수(HAI) A - 계면 간염(0-4), 변형 이삭 점수(HAI) B - 융합 괴사(0-6), 변형 이삭 점수(HAI) C - 반점성 괴사(0-4) 및 변형 이삭 점수(HAI) D - 문맥 염증(0-4)에 관한 것일 수 있다.

이러한 시스템은 물론 적용가능한 다른 채점 시스템은 당해 기술분야의 숙련된 자에게 공지되어 있다[예컨대, Scheuer et al., "Liver Biopsy Interpretation" (W.B. Saunders 2000); Scheuer, J. Hepatol. 1991; 13: 372-374; Ishak, et al., J.Hepatol. 1995; 22: 696-699]. 알코올성 간 질환과 같은 질환에서 섬유증 패턴과 관련된 차이로 인하여 비바이러스성 간 질환 증례에서의 점수를 매기기 위한 목적에는 채점 시스템의 변형이 필요할 수 있다.

"대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커 데이터"는 상기와 같은 모든 변형된 점수 및 채점 시스템으로부터 결정된 데이터 반영값을 포함한다.

대조 간 조직병리학적 및 혈액 마커, 예컨대 혈장 및 혈청 마커 데이터 역시, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)와 같은 트랜스아미나제의 상승된 혈청 농도를 반영하는 데이터, 및 황달과 같은 증후군의 질적 또는 양적 평가값을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

"확인(validation) 생검 점수"는 간 조직병리학적 및 혈청 마커 데이터 값을 알고리듬에 입력하여 측정한 값이다.

"판별 함수 분석"은 2 이상의 자연 발생의 상호 배타적 그룹을 상호 판별하는 변수를 측정하는데 사용되는 기술이다. 판별 함수 분석의 기본 사상은 상호 독립적이거나 독립적이지 않을 수 있는 예측 변수 세트에 관해서 차이가 있는 그룹인지의 여부를 측정한 다음, 그 변수들을 사용하여 그룹 자격(예, 새로운 증례의 그룹)을 예측하는 것이다.

판별 함수 분석은 범주 변수(2 이상의 상호 배타적인 수준)인 결과 변수를 가지고 개시한다. 이 모델은 그 수준들이 ANOVA(분산 분석)와 같이 연속적 또는 범주적(바람직하게는 연속적)일 수 있는 예측 변수 세트에 의해 판별될 수 있을 것으로 간주하며, ANOVA와 같이 기본 판별 함수가 선형인 것으로 간주한다. 판별 분석은 "분배 변분" 하지 않는다. 예측 변수 세트 간에는 정준 상관 분석을 하고, 이 상관을 이용하여 모든 수준의 결과 변수에 대한 모든 예측 변수의 총 변분 백분율을 설명하는 고유함수를 확립한다.

이러한 분석 결과는 결과 변수의 수준에 상관없이 "판별 점수"를 산출하기 위해 예측 변수의 조합을 이용하는 선형 판별 함수(고유함수)의 세트이다. 총 변분 백분율은 각 함수마다 제공된다. 또한, 각 고유함수마다, 예측 변수의 조합에 기초한 판별 점수를 각 결과 변수 수준 내에서 나타내는 피셔 판별 함수 세트가 발생된다.

일반적으로, 그룹간 판별에 기여하는 변수(들)을 찾기 위한 연구에는 여러 변수가 포함된다. 이러한 경우에, 총 분산 및 공분산 행렬이 수득된다. 이와 유사하게, 컴파일링된 그룹내 분산 및 공분산 행렬이 수득될 수 있다. 이러한 두 행렬을 다변량 F 검정을 통해 비교하여 그룹 간에 임의의 유의적인 차이(모든 변수에 대하여)가 존재하는지의 여부를 측정한다. 이러한 절차는 다변량 분산 분석(multivariate analysis of variance) 또는 MANOVA와 동일하다. MANOVA에서와 같이, 먼저 다변량 검정을 수행하고, 통계적으로 유의적인 값이 나오면 그룹간에 유의적으로 상이한 평균을 나타내는 변수를 조사한다.

1 이상의 정량 변수 및 관찰 그룹을 규정하는 분류 변수를 함유하는 관찰 세트에 따라서, 판별 절차는 각 관찰을 하나의 그룹으로 분류하는 판별 기준을 제공한다. 판별 기준의 양호한 "수행" 방식의 사상을 얻기 위해서는, 다른 증례(선험적으로), 즉 판별 기준을 평가하는데 사용되지 않았던 증례를 분류할 필요성이 있다. 새로운 증례의 분류는 특별히 판별 기준의 예측 효력을 평가할 수 있게 해준다.

유도된 기준을 확인하기 위하여, 다른 데이터 세트에 대해 그 분류가 적용될 수 있다. 판별 기준을 유도하는데 사용된 데이터 세트는 소위 훈련 또는 조정 데이터 세트 또는 환자 훈련 코오트(cohort)라 불리는 것이다. 판별 기준의 성능을 확인하는데 사용된 데이터 세트는 소위 확인 데이터 세트 또는 확인 코오트라 불리는 것이다.

판별 기준(함수 또는 알고리듬)은 일반화 제곱 거리(generalized squared distance)의 측도를 측정한다. 이러한 거리는 컴파일링된 공분산 행렬에 기초한다. 마할라노비스 또는 유클리드 거리는 근접도(proximity)를 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 거리는 결과 수준의 그룹화를 동정하고, 이로써 변수 수준의 가능한 감소량을 측정하는데 사용될 수 있다.

"컴파일링된 공분산 행렬"은 분석의 각 아집단에 대한 공분산 행렬의 성분을 함께 추가하여 만든 수치 행렬이다.

"예측변수"는 종속 또는 반응 변수 또는 "예측값"를 수득하기 위한 함수에 적용될 수 있는 임의의 변수이다. 본 발명의 일 양태에서, 예측값은 2 이상의 환자 혈액 마커(예컨대, 혈장 마커 또는 혈청 마커)의 판별 함수 분석을 통해 측정된 판별 점수일 수 있다. 예를 들어, 선형 모델은 다음과 같이 종속(또는 반응) 변수 Y와 예측 변수 세트, X들 사이의 관계(선형)를 구체화한다: Y = b₀ + b₁X₁ + b₂X₂ + ... + b_kX_k

이 방정식에서, b₀은 절편의 회귀 계수이고 b_i 값은 데이터로부터 계산된 회귀 계수(변수 1에서 k에 대한)이다.

"분류 수형도"는 범주 종속 변수 그룹에 속하는 증례 또는 객체의 자격을 하나 이상의 예측 변수들에 대한 치수로부터 예측하는데 사용된다. 분류 수형도 분석은 소위 데이터 마이닝(Data Mining)에 사용되는 주요 기술 중 하나이다. 분류 수형도의 목표는 범주 종속 변수의 반응을 예측 또는 설명하는 것이며, 이러한 목표에 따라 이용가능한 기술은 판별 분석, 군집 분석, 비모수 통계학 및 비선형 추정의 더욱 전통적인 방법들에 사용된 기술과 공통된 것이 많다.

분류 수형도의 유연성은 옵션 분석으로서 매우 바람직하게 사용될 수 있게 하지만, 더욱 전통적인 방법을 제외시키기 위한 용도에 권장된다고 말할 수는 없다. 실제, 더욱 전통적인 방법들이 전형적으로 더욱 엄중한 이론 및 분포 가정이 가능하다면, 전통적인 방법들이 바람직할 수 있다. 하지만, 전통적인 방법들이 실패한다면 분류 수형도는 탐색적 기술로서 또는 최후 수단으로서, 많은 연구자들의 의견에 따르면 능가할 것이 없다. 분류 수형도는 의학(진단), 컴퓨터 과학(데이터 구조), 식물학(분류) 및 심리학(결정 이론)과 같은 다양한 응용 분야에 널리 사용된다. 분류 수형도는 쉽게 도식으로 현시될 수 있어, 오로지 엄밀한 수치 해석만이 가능한 경우보다 더 해석하기가 용이하도록 도와준다.

"신경망"은 뇌의 인지 체계 및 신경학적 기능에서 학습 과정(가설적) 후 모델링되고, 기존 데이터로부터 소위 학습 과정을 수행한 후 다른 관찰들(같거나 다른 변수)로부터 새로운 관찰들(특정 변수)을 예측할 수 있는 분석 기술이다. 신경망은 상기 데이터 마이닝 기술 중 하나이다. 제1 단계는 특정 망 아키텍처(각각 특정 수의 "뉴런(neuron)"으로 이루어진 특정 수의 "층"을 포함한다)를 설계하는 것이다. 이러한 망의 크기와 구조는 조사되는 현상의 본성(예, 표면적인 복잡도)과 부합해야 한다. 이러한 특성은 초기에는 잘 알지 못한 것이 분명하기 때문에 이 작업은 쉽지 않고 종종 많은 "시험과 오차"를 수반한다.

신경망은 그 다음 "훈련" 과정으로 처리된다. 이 단계에서 컴퓨터 메모리는 입력(변수) 수에 대한 반복 과정을, "훈련"이 수행된 시료 데이터를 최적으로 예측하기 위해 망의 가중치를 조정하는데 응용하는 뉴런으로서 작용한다. 기존 데이터 세트에 대한 학습 단계 후 새로운 망이 준비되면 예측값을 얻는데 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 신경망은 치료 장치의 하나 이상의 개인용 또는 메인프레임 컴퓨터 또는 전산화된 지점의 메모리를 포함할 수 있다.

"컴퓨터"는 특별한 컴퓨터 하드웨어 시스템과 특별한 소프트웨어 구동 시스템의 조합을 의미한다. 본 발명의 컴퓨터 또는 전산 시스템은 휴대용 전산기를 함유할 수 있다. 유용한 하드웨어 시스템의 예에는 임의의 형식의 적당한 데이터 프로세서를 보유한 하드웨어가 포함된다. "컴퓨터"란 용어는 또한 DOS, Windows®, OS/2® 또는 Linux®과 같은 운영 체계를 보유한 개인용 컴퓨터(PC); 매킨토시® 컴퓨터; 운영 체계가 JAVA®-OS인 컴퓨터; 그래픽 워크스테이션, 예컨대 Sun Microsystems® 및 Silicon Graphics®의 컴퓨터, AIX® 또는 SOLARIS®(Sun Microsystems®)와 같은 UNIX 운영 체계의 일부 버전을 보유한 다른 컴퓨터; 신(thin) 버전의 운영 체계로서 콘트롤 스케줄러를 실행하는 내장형 컴퓨터, 휴대용 장치; 공지되고 이용가능한 운영 체계를 특징으로 하는 다른 임의의 장치; 뿐만 아니라 일부 형식의 데이터 프로세서와 관련 메모리를 보유한 장치의 임의의 종류를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명은 개인용 컴퓨터에서 실행되는 컴퓨터 프로그램의 컴퓨터 실행가능 명령의 일반적인 상황에서 설명하고 있지만, 당업자라면, 본 발명이 다른 프로그램 모듈과도 함께 실행될 수 있다는 것을 잘 알 것이다. 일반적으로, 프로그램 모듈에는 특정 작업을 수행하거나 특정 추상적 데이터형을 실행하는 루틴, 프로그램, 컴포넌트 및 데이터 구조가 포함된다. 더욱이, 당업자라면 본 발명이 다른 컴퓨터 시스템 구성, 예컨대 휴대용 장치, 멀티프로세서 시스템, 마이크로프로세서 기반 또는 프로그램가능 가전 제품, 미니컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터 등에 의해서도 실시될 수 있다는 것을 잘 알 것이다. 또한, 본 발명은 통신망을 통해 연결된 원격 처리 장치에 의해 작업이 수행되는 분산 컴퓨팅 환경에서도 실시될 수 있다. 분산 컴퓨팅 환경에서 프로그램 모듈은 국부 및 원격 메모리 저장 장치에 위치할 수 있다.

본 발명을 구현하는 시스템의 순수 예시적 예에는 처리 장치, 시스템 메모리 및 이러한 시스템 메모리를 포함하는 각종 시스템 부품을 처리 장치에 연결시키는 시스템 버스를 포함하는 통상의 개인용 컴퓨터가 있다. 상기 시스템 버스는 메모리 버스 또는 메모리 콘트롤러, 주변장치 버스 및 다양한 임의의 통상적인 버스 아키텍처, 예를 들면 PCI, VESA, Micorchannel, ISA 및 EISA 등을 사용하는 국부 버스를 비롯한 임의의 여러 형식의 버스 구조일 수 있다. 상기 시스템 메모리는 읽기 전용 메모리(ROM) 및 램(RAM)을 포함한다. 시동 동안과 같이, 개인용 컴퓨터 내에서 소자들 사이의 정보 전달을 돕는 기본 루틴을 함유하는 기본 입출력 체계(BIOS)는 ROM에 저장되어 있다.

개인용 컴퓨터는 추가로 하드 디스크 드라이브, 분리성 디스크에 쓰기용 또는 읽기용의 자기 디스크 드라이브, 및 CD-ROM 디스크 읽기용 또는 다른 광학 매체에 읽기용 또는 쓰기용의 광학 디스크 드라이브를 포함한다. 상기 하드 디스크 드라이브, 자기 디스크 드라이브 및 광학 디스크 드라이브는 각각 하드 디스크 드라이브 인터페이스, 자기 디스크 드라이브 인터페이스 및 광학 디스크 드라이브 인터페이스에 의해 시스템 버스에 연결된다. 이러한 드라이브들과 이들의 관련 컴퓨터 판독가능 매체는 개인 컴퓨터용의 비휘발성 데이터 저장, 데이터 구조, 컴퓨터 실행가능 명령 등을 제공한다. 전술한 설명에서 컴퓨터 판독가능 매체는 하드 디스크, 분리성 자기 디스크 및 CD를 의미하지만, 컴퓨터에 의해 판독가능한 다른 형식의 매체, 예컨대 자기 카세트, 플래시 메모리 카드, 디지털 비디오 디스크, 베르누이 카트리지 등도 전형적인 운영 환경에서 사용될 수 있다는 것을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.

드라이브 RAM에는 운영 체계, 1가지 이상의 응용 프로그램, 다른 프로그램 모듈 및 프로그램 데이터를 비롯한 다수의 프로그램 모듈이 저장되어 있을 수 있다. 사용자는 마우스와 같은 위치지정 도구 및 키보드를 통해 개인 컴퓨터에 명령과 정보를 입력할 수 있다. 다른 입력 장치로는 마이크로폰, 조이스틱, 게임 패드, 위성 접시, 스캐너 등이 포함될 수 있다. 이러한 입력 장치는 물론 다른 입력 장치는 종종 시스템 버스에 연결된 직렬 포트 인터페이스를 통해 처리 장치에 연결되지만, 병렬 포트, 게임 포트 또는 유니버설 직렬 버스(USB)와 같은 다른 인터페이스를 통해 연결되기도 한다. 모니터 또는 다른 종류의 디스플레이 장치도 또한 인터페이스, 예컨대 비디오 어댑터를 통해 시스템 버스에 연결된다. 개인용 컴퓨터는 모니터 외에도 다른 주변 출력 장치(제시 안됨), 예컨대 스피커 및 프린터 등을 함유하는 것이 일반적이다.

개인용 컴퓨터는 하나 이상의 원격 컴퓨터, 예컨대 원격 컴퓨터에 논리적 접속을 이용하는 통신망 환경에서 운영될 수 있다. 원격 컴퓨터는 서버, 라우터, 대등 장치 또는 다른 일반 통신망 노드일 수 있고, 전형적으로 개인용 컴퓨터와 관하여 기술된 많은 소자 또는 모든 소자들을 포함한다. 논리적 접속은 근거리 통신망(LAN) 및 광역통신망(WAN)을 포함한다. 이러한 통신망 환경은 사무실, 기업 컴퓨터망(예, 병원 컴퓨터), 인트라넷 및 인터넷에서 일반적이다.

개인용 컴퓨터는 LAN 통신망 환경에서 사용될 때에는 통신망 인터페이스 또는 어댑터를 통해 근거리 통신망에 연결될 수 있다. WAN 통신망 환경에서 사용될 때에는 개인용 컴퓨터는 일반적으로 인터넷과 같은 광역 통신망 상에서 통신을 구축할 수 있는 모뎀이나 다른 수단을 함유한다. 내장형이거나 외장형인 모뎀은 직렬 포트 인터페이스를 통해 시스템 버스에 연결된다. 통신망 환경에서, 개인용 컴퓨터에 상대적으로 서술되는 프로그램 모듈 또는 이의 일부는 원격 메모리 저장 장치에 저장되어 있을 수 있다. 제시된 통신망 접속은 예시적인 것이며, 컴퓨터 사이에 통신 링크를 구축하는 다른 수단이 사용될 수도 있음은 자명한 것이다.

순수 예시용인 본 발명에 따른 구현 플랫폼 하나는 사용자 인터페이스로서 마이크로소프트 윈도우즈와 Paradox를 비롯한 임의의 다양한 데이터베이스 관리 소프트웨어를 구비한, 주 메모리 용량이 적어도 8메가바이트이고 하드 디스크 드라이브 용량이 기가바이트인 IBM 호환형 개인용 컴퓨터에서 구현되는 시스템이다. 예측 함수를 구현하는 응용 소프트웨어는 다양한 임의의 언어, 예컨대 C++(이에 국한되지 않는다)로 쓰여질 수 있고, 이하에 규정되는 바와 같은 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된다. 사용자는 마우스와 같은 위치지정 도구 및 키보드를 통해 개인용 컴퓨터에 환자의 진단 마커를 나타내는 명령 및 정보를 입력한다.

바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 이하에 설명되는 바와 같이 유도된 예측 함수 및 값을 특별히 식별하는 적어도 하나의 코드를 함유하는 마이크로프로세서에 의해 판독되기 위해, 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 데이터 구조를 제공한다. 바람직한 컴퓨터 사용가능 매체의 예에는 비휘발성 하드코드식 매체, 예컨대 읽기 전용 메모리(ROM) 또는 전기적 소거 및 프로그램 가능 읽기용 메모리(EEPROM), 플로피 디스크, 하드 디스크 드라이브 및 CD-ROM과 같은 기록가능식 매체, 및 디지털 및 아날로그 통신 링크와 같은 전송형 매체가 있다.

"데이터 구조"는 관련 데이터 요소들의 수집물과 함께 각 요소들 간의 관계를 나타내는 연산 세트를 함유할 수 있다. 데이터 구조는 데이터 조직 및 컴퓨터와 같은 장치 내의 데이터 저장 공간 배당을 반영하는 것으로 생각될 수 있다.

즉, 데이터 구조는 일반적으로 메모리에 알고리듬 효율을 높이기 위한 대기 행렬, 스택, 연결 목록, 힙, 사전 및 트리와 같은 정보 조직 또는 개인 이름과 주소와 같은 개념적 유니티를 포함할 수 있다. 또한, 목록의 길이 또는 서브트리의 노드 수와 같은 가외 정보를 포함할 수도 있다. 데이터 구조는 대부분의 데이터에 대한 접속이 매우 느릴 때에도 효율적인 외장형 데이터 구조, 예컨대 디스크 상의 데이터 구조일 수 있다. 데이터 구조는 능동 데이터 구조와는 대조적으로, 외부 스레드 또는 처리에 의해서만 변경되는 수동 데이터 구조일 수 있다. 능동 또는 기능성 데이터 구조는 내부 연산을 수행하여 흔히 더 일반적인 다른 데이터 구조의 외부 행동을 제시하는, 관련 스레드 또는 프로세스를 보유한다. 또한, 데이터 구조는 최신 버전외에도 구버전이 검색될 수 있는, 구버전을 보존하는 영속 데이터 구조일 수 있다. 데이터 구조는 동일한 데이터 구조의 더 작거나 간단한 인스턴스로 부분적으로 구성된 순환적 데이터 구조일 수 있다. 또한, 데이터 구조는 추상적 데이터형, 즉 임의의 특정 구현과 관계없이 정확하게 정해진 데이터값 세트 및 관련 연산일 수 있다.

이러한 데이터 구조의 예들은 본 명세서에 예시된 모든 구체예들과 마찬가지로 단지 예시한 것뿐이며, 한정되는 것이 아니다.

본 발명의 진단 시스템은 치료 적용 지점에서 유용한 휴대용 장치를 포함하거나 또는 환자 치료 지점에서 떨어진 위치에서 원격으로 작동되는 시스템일 수도 있다. 어떠한 경우든지, 상기 시스템은 본 명세서에 기술된 알고리듬 또는 다른 분석 기술에 따라 본 발명의 진단 방법을 구현하는데 유용한 임의의 언어로 프로그래밍된 동반 소프트웨어를 포함할 수 있다.

"치료 검사 지점"은 적은 시간의 틀에서 수행될 수 있는 실시간 진단 검사를 의미하는 것으로서, 그 검사가 본 시스템을 이용하지 않는 비교 검사보다 더 빠르게 수행되는 것이다. 치료 검사 지점은 신속하게, 현장에서, 예컨대 진료실에서, 침대곁에서, 통계 실험실에서, 응급실에서 또는 다른 이러한 현장, 특히 신속히 정확한 결과가 요구되는 곳에서 수행될 수 있다. 따라서, 환자가 존재할 수 있으나, 이러한 존재가 반드시 필요한 것은 아니다. 치료 지점에는 응급실, 수술실, 병원 실험실 및 다른 임상 실험실, 진료실, 현장에서 또는 신속하고 정확한 결과가 요구되는 임의의 상황을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

"환자"란 용어는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람을 의미한다.

"건강관리자" 또는 "건강관리 결정자"는 환자를 진단 또는 치료하거나 환자의 진단이나 치료를 도울 자격이 있는 임의의 개체를 포함한다. 간 질환의 치료에 유용한 신약을 개발하는 상황이라면, 건강관리자는 환자를 진단 또는 치료하거나 환자의 진단이나 치료를 도울 자격이 없는 개체일 수도 있다.

"혈액 마커", "혈액 마커들" 및 "혈액 마커, 예컨대 혈장 및 혈청 마커"란 표현은 혈청 마커들, N 말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신, 라미닌, 히알루로난, MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. "혈액 마커, 예컨대 혈장 및 혈청 마커"는 "간 질환 혈청 마커 유전자 폴리펩타이드"로 표현되기도 한다. "보조 마커"에는 환자 체중, 성별, 연령 및 환자 혈청내 트랜스아미나제, 예컨대 알라닌-아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 농도가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

"간 질환"은 간 섬유발생 또는 섬유분해와 관련 있는 임의의 질환을 포함한다. 이러한 질환에는 간경화증, 알코올성 간질환, 간 지방증, 지방간염, 비알코올성 지방간염과 같은 비알코올성 간 질환, B형 간염 및 C형 간염 감염과 같은 바이러스 감염이 원인인 간 질환, 주혈흡충증과 같은 다른 병원균에 대한 반응, 유전 혈색소침착증, 1차 담관성간경화증 및 1차 경화 담관염, 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 반응 및 담관 폐쇄증과 같은 선천성 장애를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

"확인 코오트 마커 점수 값"은 훈련받은 코오트로부터 수득한 판별 가중치와 확인 코오트에 속하는 각 환자의 마커 값의 선형 조합으로부터 유래되는 수치 점수를 의미한다.

"환자 진단 마커 컷오프 값"은 소정의 민감도 또는 특이성이 달성된 조합 마커 중의 한 마커의 값을 의미한다. "수신기 작동 특성 곡선-슈어 변형 채점 시스템 확인 데이터": 이분화 슈어 채점 시스템에 기초하여 확인 코오트에서 수득된 데이터를 사용하여 작도한 수신기 작동 특성 곡선. "수신기 작동 특성 곡선-이삭 변형 채점 시스템 확인 데이터": 이분화 이삭 채점 시스템에 기초하여 확인 코오트에서 수득된 데이터를 사용하여 작도한 수신기 작동 특성 곡선.

"음성 예측력(NPV)": 마커 값(또는 마커 값 세트)이 소정 컷오프 이상으로 상승되지 않은 경우에 질환을 앓지 않을 확률.

"양성예측력(PPV)": 마커 값(또는 마커 값 세트)이 소정 컷오프 이상으로 상승된 경우에 질환을 앓고 있을 확률.

"수신기 작동 특성 곡선(ROC)": 질환자 코오트 및 비질환자 코오트에서의 1-특이성 값과 마커 민감도 분포 사이의 함수 관계를 나타낸 그래프.

"그래프 곡선 아래 면적(AUC)"은 수신기 작동 특성 곡선 아래의 면적을 나타내는 수치이다. 이 수치가 1에 가까울수록 질환 코오트와 비질환 코오트 사이를 판별하는 마커 값이 커진다.

"맥니머 카이제곱 검정(McNemar χ² test)"은 상호연관 있는 두 비율(공통 분자와 다른 분모를 분담하는 비율)이 서로 크게 다른 경우에 측정하는데 사용되는 통계 검사이다.

"비모수 회귀 분석"은 각 변수 분포 또는 각 변수 추정의 오차에 관한 가정을 거의 또는 전혀 하지 못하는 이변량 데이터 선에 적합하게 하는 일군의 통계 기술이다. 그 예에는 틸(Theil) 위치 추정량, 패싱-바블록(Passing-Bablok) 회귀, 및 데밍(Deming) 회귀가 있다.

"컷오프 값"은 특정 민감도 또는 특이성을 한정하는 마커(또는 마커 세트)의 수치 값이다.

간의 섬유증을 평가하는 현행 대조 표준 기술은 간생검이다. 생검 시, 간에서 무작위로 채취한 조직 시료는 절편화되어 전문가에 의해 현미경 조사된다.

간 생검 시에는 다음과 같은 기원이 불확실한 문제점을 비롯하여 다양한 문제점이 있다: 간에 존재하는 섬유증 분포(군집을 이룬 섬유증이 존재하면 바늘이 간 적중 영역에 섬유증이 없을 수도 있다), 시료 표본의 손상(예, 조직 재료가 충분하지 않은 경우) 및 병리학자의 주관성. 더욱이, 간의 섬유성 상태는 일반적으로 점수를 사용하여 설명하는데, 채점 체계가 많이 다르고 아마도 호환되지 않는다(예, 슈어 점수, 이삭 점수 등). 예를 들어, 2명의 다른 병리학자는 동일한 환자의 동일한 생검 시료를 2가지 다른 채점 시스템을 이용하여 2가지 다른 시점에서 점수를 매길 수 있다. 이러한 경우에, 2명의 병리학자가 동일한 결과를 제시할 평가 합계는 36% 내지 46%에 그친다.

뉴클레오타이드 서열과 관련하여 "동등한"이란 용어는 기능적으로 동등한 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 동등한 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 상이한 서열을 포함하는, 예컨대 대립유전자 변형체이며, 따라서 유전자 코드의 축퇴로 인해 상이한 서열을 포함할 수도 있다. 또한, "동등한"은 혈액(예, 혈청) 마커 단백질의 포유동물 동족체 아미노산 서열과 기능적으로 동등하지만 아미노산 서열은 다른, 예컨대 적어도 하나, 30개, 20개, 10개, 7개, 5개 또는 3개 이하의 차이, 예컨대 치환, 첨가 또는 결실을 보유하는 아미노산 서열을 의미하는 데에도 사용된다.

본 명세서에 사용된, "간 질환 혈청 마커 유전자"란 표현은 (1) 본 발명에서 동정된 간 질환 혈청 마커 단백질을 비롯한 간 질환 혈액(예, 혈청) 마커 단백질을 암호하고; (2) 엑손 및 (경우에 따라) 인트론 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임에 결합되어 있는 핵산을 의미한다. "간 질환 혈청 마커 유전자"는 경우에 따라 관련 또는 무관련 염색체 유전자 등에서 유래되는 인트론 서열을 포함하기도 하지만, 엑손 서열을 포함하는 것이다. "인트론"이란 용어는 단백질로 해독되지 않고 일반적으로 엑손 사이에서 발견되는, 제공된 유전자에 존재하는 DNA 서열을 의미한다. 유전자는 추가로 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인헨서 등을 포함할 수도 있다. "간 질환 혈청 마커 유전자"는 본 발명의 서열번호 1 내지 3의 서열과 상보성이거나, 동등하거나 또는 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

"상동성", "동족체", "상동성인" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 폴리펩타이드 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 의미하는 것으로서, 동일성이 더 엄격한 비교 표현이다. 상동성 및 동일성은 각각 비교를 위해 정렬될 수 있는 각 서열에서 위치를 비교하여 측정할 수 있다. 비교된 서열의 위치에 동일한 염기 또는 아미노산이 존재하면 그 분자들은 그 위치에서 동일한 것이다. 핵산 서열 사이의 상동성, 유사성 또는 동일성의 정도는 핵산 서열 간에 공유된 위치에서 동일하거나 정합하는(matching) 뉴클레오타이드 수의 함수이다.

"동일률(percent idential)"은 두 아미노산 서열 또는 두 뉴클레오타이드 서열 간의 서열 동일성을 의미한다. 동일성은 각각 비교 목적으로 정렬된 각 서열의 위치를 비교하여 결정할 수 있다. 비교된 서열의 동등 위치에 동일한 염기 또는 아미노산이 존재하는 경우에 그 분자들은 그 위치에서 동일한 것이다. 이와 같이 동등 부위에 동일하거나 유사한 아미노산 잔기(예컨대, 입체적 배치 및/또는 전자적 특성이 유사한 잔기)가 존재한다면, 이러한 분자는 그 위치에서 상동성(유사성)이라 할 수 있다. 상동성, 유사성 또는 동일성 백분율이란 표현은 비교된 서열에 공유된 위치에서 동일하거나 유사한 아미노산 수의 함수를 의미한다. FASTA, BLAST 또는 ENTREZE를 비롯한 다양한 정렬 알고리듬 및/또는 프로그램이 사용될 수 있다. FASTA 및 BLAST는 GCG 서열 분석 패키지(University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 일부로서 입수할 수 있고, 디폴트 세팅값 등을 이용하여 사용될 수 있다. ENTREZ는 국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Betheda, Md.)에서 입수할 수 있다. 일 양태에 따르면, 두 서열의 동일성 백분율은 갭 가중치가 1인, 예컨대 두 서열 사이에 하나의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 부정합이 존재한다면 각 아미노산 갭이 가중되는 GCG 프로그램에 의해 측정될 수 있다. 서열 동일성을 측정하는 다른 기술도 당업계에 공지되고 기술되어 있다.

본 발명에 사용되는 바람직한 핵산은 간 질환 혈청 마커 유전자의 포유동물 상동체의 핵산 서열과 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 80% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 90%, 보다 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 동일하거나 상보성인 서열을 보유한다. 본 발명에 사용되는 특히 바람직한 핵산은 간 질환 혈액(예, 혈청) 마커 유전자의 포유동물 상동체의 핵산 서열과 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 80% 동일하고 더욱 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 동일하거나 상보성인 서열을 보유한다.

면역분석법

N 말단 프로콜라겐 III 폴리펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신, 라미닌, 히알루로난, MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체의 농도를 검출 및 측정하기 위하여 혈청 면역분석법을 선택했다. 면역기억 동안 수집한 다른 진단 마커로는 체중, 성별 및 연령, 그리고 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)와 같은 트랜스아미나제의 농도가 있다.

(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신, 라미닌, 히알루로난, MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1의 농도는 샌드위치 면역분석법을 이용하여 측정했다. 일 양태에 따르면, 본 발명의 면역분석법은 사람 체액 시료와 두 항체의 반응을 포함하며, 여기서 포획 항체는 마커의 한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이러한 복합체를 검출하기 위해, 다른 에피토프 특이성을 보유한 제2 항체가 사용된다. 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하지만, 폴리클로날 항체도 사용될 수 있다. 이러한 분석법에 사용되는 두 항체는 분석 단백질에 특이적으로 결합한다.

사람 체액에서 수득된 환자 진단 마커의 농도를 측정한 뒤, 섬유증 정도를 평가하기 위한 방법과 시스템을 유도했다.

다양한 혈청 마커의 검출에 사용될 수 있는 항체의 공급원 및 제조방법은 다음과 같다.

혈청 분석에 사용된 대표적인 항마커 항체

대표적인 항원 공급원

대표적인 뉴클레오타이드 서열

간 섬유증의 혈청 마커를 검출하는데 사용된 항체 쌍

HA에 대항하여 어떠한 항체도 생산하지 않기 때문에, 상기 표에 인용된 참고문헌에 따라 소의 코 연골에서 분리한 특이적인 HA 결합 단백질(HABP)을 HA 분석에 사용했다. HA는 고도로 반복적인 구조를 갖고 있고, HA 특이적 코어 단백질은 샌드위치 분석 형식에 사용될 수 있다. FITC 접합된 코어 단백질의 포획 및 검출을 위하여, 알칼리 포스파타제 표지된 모노클로날 항비오틴과 함께 비오틴화된 코어 단백질을 사용했다.

콜라겐 IV의 분석에는 바이오디자인 제품인 폴리클로날 항체(T59106R)(Biodesign Catalog No.: T59106R) 유래의 폴리클로날 항체와 함께 후지 제품인 모노클로날 항체(IV-4H12)(수탁번호 FERM BP-2847)를 사용했다. 모든 분석법은 자성 입자 분리 기술을 이용한 이종 면역분석법이다.

PIIINP 분석에는 훽스트사제 모노클로날 항체(수탁번호 ECCAC 87042308)와 함께, 부타페스트 조약하에 미국모식균배양수집소(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2004년 5월 24일자로 기탁한 바이엘 모노클로날 항체(ATCC PTA- )를 사용했다.

콜라겐 VI, 라미닌 및 테나신 검출용 항체는 전술한 표에 기재된 공급원에서 입수한 상기 혈청 마커에 상응하는 항원을 수득하고, 이러한 항원을 이하에 상세히 설명되는 하이브리도마 발생 프로토콜에 따라 혈청 마커로서 사용하여 제조할 수 있다.

TIMP-1, MMP-2 및 MMP-9의 검출용 항체는 (1) 이하에 상세히 설명되는 폴리뉴클레오타이드 발현 프로토콜에 따라 상기 표에 기재된 마커 mRNA 서열에 상보적인 DNA 서열을 발현시켜 상기 마커의 항원들을 생산한 다음; (2) 이러한 항원을 이하에 상세히 설명되는 하이브리도마 발생 프로토콜에 따라 혈청 마커로서 사용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 발생 프로토콜 및 폴리뉴클레오타이드 발현 프로토콜의 인용은 이하에 제시된 인용문 편에 각각 기재하였다.

폴리뉴클레오타이드 발현:

도 5는 사람 TIMP1 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다(서열번호 1).

도 6은 사람 MMP2 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다(서열번호 2).

도 7은 사람 MMP9 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다(서열번호 3).

이러한 간 질환 혈청 마커 유전자 및 여타 마커 유전자의 발현을 위해서는 상기 유전자들을 전사에 필요한 요소들과 삽입된 암호 서열의 해독에 필요한 요소들을 함유하는 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열과 적당한 전사 및 해독 조절 요소를 함유하는 발현 벡터의 작제에는 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합이 있다. 이러한 기술들은 예를 들어 문헌[Sambrook et al.(3) 및 Ausubel et al.(4)]에 설명되어 있다.

간질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열의 삽입 및 발현에는 다양한 발현 벡터/숙주계가 이용될 수 있다. 그 예에는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충세포계; 바이러스 발현 벡터(예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 발현 벡터(Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물세포계; 또는 동물세포계가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

조절 요소 또는 조절 서열은 전사 및 해독을 수행하기 위하여 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 인헨서, 프로모터, 5' 및 3' 비해독 영역이다. 이러한 요소들은 강도와 특이성이 다양할 수 있다. 사용된 벡터계와 숙주에 따라서, 구성형 및 유도형 프로모터를 비롯한 적당한 전사 및 해독 요소의 임의의 수가 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아계에서 클로닝하는 경우에는, BLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, LaJolla, Calif.)의 하이브리드 lacZ 프로모터 또는 pSPORT1 플라스미드(Life Technologies) 등과 같은 유도형 프로모터가 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터는 곤충 세포에 사용될 수 있다. 식물 세포의 게놈 유래의 프로모터 또는 인헨서(예, 열충격, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스 유래의 프로모터 또는 인헨서(예, 바이러스 프로모터 또는 리더 서열)는 벡터에 클로닝될 수 있다. 포유동물 세포계에는, 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터가 바람직하다. "간 섬유증 유전자"를 암호하는 뉴클레오타이드 서열의 복수 카피를 함유하는 세포주를 제조하고자 하는 경우에는 SV40 또는 EBV를 기반으로 한 벡터가 적당한 선택성 마커와 함께 사용될 수 있다.

박테리아 및 효모 발현계 :

박테리아계에서는 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드의 목적 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 유도를 위해 다량의 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드가 필요한 경우에는 융합 단백질의 발현 수준이 높은 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터에는 다기능성 대장균 클로닝 및 발현 벡터, 예컨대 BLUESCRIPT(Stratagene)가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. BLUESCRIPT 벡터에서 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열은 하이브리드 단백질이 생산되도록 아미노 말단 Met의 서열 및 후속 β-갈락토시다제의 7개 잔기와 프레임에 따라 벡터에 결찰될 수 있다. pIN 벡터(Van Heeke & Schuster (17)] 또는 pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.) 역시 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와 융합 단백질로서 이종 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 용해성이어서, 글루타치온 아가로스 비드에 대한 흡착 후 유리 글루타치온의 존재 하에서의 용출을 통해 세포 용해물로부터 쉽게 정제할 수 있다. 이러한 발현계에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되어 당해의 클로닝된 폴리펩타이드를 마음대로 GST 잔기로부터 방출시킬 수 있다.

효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서는 구성형 또는 유도형 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH를 함유하는 다수의 벡터가 사용될 수 있다. 이에 관해서는 문헌[Ausubel et al.(4) 및 Grant et al.(18)]을 참조할 수 있다.

식물 및 곤충 발현계 :

식물 발현 벡터가 사용되면 간질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열의 발현은 임의의 다양한 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터를 단독으로 사용하거나 TMV의 오메가 리더 서열과 함께 사용될 수 있다[Takamatsu(19)]. 또는 RUBISCO의 작은 서브유닛 또는 열충격 프로모터와 같은 식물 프로모터가 사용될 수도 있다[Coruzzi et al.(19); Broglie et al.(21); Winter et al.(22)]. 이러한 작제물은 직접 DNA 형질전환 또는 병원균 매개 형질감염에 의해 식물 세포로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 입수용이한 다수의 평론지[예, Hobbs or Murray, in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(23)]에 설명되어 있다.

곤충계도 역시 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 하나의 발현계로서 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵폴리헤드린형성 바이러스(AcNPV)은 스포토프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플러시아 라베(Trichoplusia larvae)에서 이종 유전자 발현용 벡터로서 사용된다. 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열은 바이러스의 비필수 영역, 예컨대 폴리헤드린 유전자에 클로닝되어 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 배치될 수 있다. 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성화하고 외피 단백질이 결실된 재조합 바이러스를 생산하게 할 것이다. 이러한 재조합 바이러스는 간질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 S. 프루지페르다 세포 또는 트리코플러시아 라베를 감염시키는데 사용될 수 있다[Engelhard et al.(24)].

포유동물 발현계 :

다수의 바이러스 기반 발현계는 포유동물 숙주 세포에서 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터로서 아데노바이러스가 사용되는 경우에는 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열을, 후기 프로모터와 삼원성 리더 서열을 함유하는 아데노바이러스 전사/해독 복합체에 결찰시킬 수 있다. 상기 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역으로 삽입시키면, 감염된 숙주 세포에서 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 생육성 바이러스를 수득할 수 있다[Logan & Shenk(25)]. 필요하다면, 루스 육종 바이러스(RSV) 인헨서와 같은 전사 인헨서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.

사람 합성 염색체(HAC)는 또한 플라스미드에 함유되어 발현될 수 있는 DNA의 더 큰 단편을 전달하는데 사용될 수 있다. 6M 내지 10M의 HAC가 작제되어 통상의 전달 방법을 통해(예, 리포좀, 다양이온 아미노 중합체 또는 소포) 세포로 전달된다.

간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열의 해독율을 더 높이기 위해서는 특이적인 개시 시그널이 사용될 수 있다. 이러한 시그널에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 있다. 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열, 이의 개시 코돈 및 상류(upstream) 서열이 적당한 발현 벡터에 삽입된 경우에는 추가 전사 또는 해독 조절 시그널이 필요하지 않을 수도 있다. 하지만, 암호 서열이나 이의 단편만이 삽입된 경우에는 외인성 해독 조절 시그널(ATG 개시 코돈을 포함한다)이 제공되어야 한다. 이러한 개시 코돈은 전 삽입체가 해독되게 하기 위해서는 정확한 리딩 프레임에 있어야 한다. 외인성 해독 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원, 천연 및 합성물일 수 있다. 발현 효율은 사용되는 특정 세포계에 적당한 인헨서의 삽입으로 증강될 수 있다[Scharf et al.(26)].

숙주 세포:

숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 변형하거나 발현된 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 원하는 방식으로 가공하는 능력에 따라 선택할 수 있다. 폴리펩타이드의 이러한 변형에는 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 폴리펩타이드의 "프리프로" 형태를 절단하는 해독후 가공도 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 해독후 활성의 특이적인 세포 기구류 및 특징적인 기작을 보유한 여러 숙주 세포가 미국모식균배양수집소(ATCC; 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에서 입수용이하며 이종 단백질의 정확한 변형 및 가공이 보장되도록 선택할 수 있다.

안정된 발현은 재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산에 바람직하다. P를 들어, 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기원 및/또는 내인성 발현 요소 및 선택성 마커 유전자를 동일 벡터에 또는 다른 벡터에 함유할 수 있는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 벡터 도입 후, 세포는 선택 배지로 이동되기 전에 영양강화 배지에서 12일 동안 증식시킬 수 있다. 선택성 마커의 목적은 선택 내성을 부여하는 것이며, 그 존재는 도입된 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드 유전자 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 가능하게 해준다. 안정적으로 형질전환된 세포의 내성 클론은 세포 종류에 적당한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다. 예컨대, 문헌[R.I. Freshney(27)] 참조.

형질전환된 세포주의 회수에는 임의의 수의 선택계가 사용될 수 있다. 이러한 선택계에는 tk^- 또는 aprt^- 세포에서 각각 이용될 수 있는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제[Wigler et al.(28)] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Lowy et al.(29)] 유전자가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 선택 기준으로서 항대사산물, 항생제 또는 제초제 내성이 사용될 수 있다. 예를 들어, dhfr은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하고[Wigler et al.(30)], npt는 아미노글리코사이드, 네오마이신 및 G418에 대한 내성을 부여하며[Colbere-Garapin et al.,(31)], als 및 pat는 각각 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 부여한다. 또 다른 선택성 유전자도 개시되어 있다. 예를 들어, trpB는 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용할 수 있게 하고, hisD는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용할 수 있게 한다[Hartman & Mulligan(32)]. 안토시아닌, β-글루쿠로니다제와 이의 기질 GUS, 및 루시퍼라제와 이의 기질 루시페린과 같은 가시성 마커는 형질전환체의 동정 및 특정 벡터계에 귀속적인 일시적 또는 안정적 단백질 발현 양의 정량분석에 사용될 수 있다[Rhodes et al.(33)].

발현 및 유전자 산물의 검출:

마커 유전자 발현의 존재가 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드 유전자의 존재도 암시하지만, 그 유전자의 존재 및 발현이 확인되어야 할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열이 마커 유전자 서열 안에 삽입된다면, 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열을 함유하는 형질전환된 세포는 마커 유전자 기능의 부재를 통해 확인될 수 있다. 또는, 단일 프로모터의 조절 하에 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열과 마커 유전자를 직렬로 배치할 수도 있다. 유도 또는 선택에 대한 반응에 따른 마커 유전자의 발현은 일반적으로 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드의 발현을 나타낸다.

대안적으로, 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 함유하고 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 공지된 다양한 절차를 통해 동정할 수 있다. 이러한 절차에는 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 위한 막, 용액 또는 칩 기반 기술을 포함하는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생물학적 검정법 또는 면역분석법이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재는 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드의 프로브 또는 단편을 이용한 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 또는 증폭을 통해 검출할 수 있다. 핵산 증폭 기반 분석법은 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 함유하는 형질전환체를 검출하기 위한, 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열 중에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드의 사용을 수반한다.

상기 폴리펩타이드에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 이용하여 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드의 발현을 검출 및 측정하는 다양한 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다. 그 예에는 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사선면역분석법(RIA) 및 형광 활성화 세포분리법(FACS)가 있다. 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드에 존재하는 2개의 불간섭 에피토프들에 반응성인 모노클로날 항체를 이용한 2부위 모노클로날 기반 면역분석법이 사용되거나, 또는 경쟁적 결합 분석법이 이용될 수 있다. 이러한 분석법 및 다른 분석법은 문헌[Hampton et al.(34) 및 Maddox et al.(35)]에 기술되어 있다.

다양한 표지 및 접합 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다. 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드의 관련 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리드화 프로브 또는 PCR 프로브의 제조 방법에는 올리고 표지법(oligo labeling), 닉(nick) 해독, 말단 표지법(end-labeling) 또는 표지된 뉴클레오타이드를 이용한 PCR 증폭법이 있다. 또는, 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열을 mRNA 프로브 생산용 벡터에 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 공지되어 있고, 시중에서 입수할 수 있으며, 표지된 뉴클레오타이드와 적당한 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7, T3 또는 SP6을 첨가하여 시험관내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용할 수 있다. 이러한 절차들은 다양한 시중에서 입수용이한 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Promega 및 US Biochemical)를 이용하여 수행할 수 있다. 용이한 검출에 사용될 수 있는 적당한 리포터 분자 또는 표지에는 방사능핵종, 효소 및 형광성, 화학발광성 또는 발색성 인자, 뿐만 아니라 기질, 공동인자, 억제제, 자성 입자 등이 있다.

폴리펩타이드의 발현 및 정제:

간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양물로부터 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건 하에서 배양될 수 있다. 형질전환된 세포에 의해 생산된 폴리펩타이드는 서열 및/또는 사용된 벡터에 따라 분비되거나 세포내 저장될 수 있다. 당업자라면 잘 알듯이, 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포막을 통해 용해성 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드의 분비를 유도하거나 또는 막에 결합된 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드의 막 삽입을 유도하는 시그널 서열을 함유하도록 설계될 수 있다.

앞에서 논의한 바와 같이, 용해성 단백질의 정제를 용이하게 하는 폴리펩타이드 도메인을 암호하는 뉴클레오타이드 서열에 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열의 결합에는 다른 작제물이 사용될 수 있다. 상기 정제 용이성 도메인에는 고정된 금속에 정제될 수 있게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트성 펩타이드, 고정된 면역글로불린에 정제될 수 있게 하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 신장/친화도 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash.)에 이용된 도메인이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 용이한 정제를 위하여, 정제 도메인과 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드 사이에 Xa 인자 또는 엔테로키나제(Invitrogen, San Diego, CA)에 특이적인 서열과 같은 절단성 링커 서열도 혼입될 수 있다. 이러한 하나의 발현 벡터는 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드와 티오레독신 또는 엔테로키나제 절단 부위 앞의 6개의 히스티딘 잔기를 함유하는 융합 단백질을 발현시킨다. 상기 히스티딘 잔기는 문헌[Porath et al.(36)]에 기술된 바와 같이 IMAC(고정된 금속 이온 친화도 크로마토그래피)에 의한 정제를 용이하게 하는 반면, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 "간 섬유증 유전자" 폴리펩타이드의 정제 수단을 제공한다. 융합 단백질을 함유하는 벡터는 문헌[Kroll et al.(37)]에 개시되어 있다.

화학적 합성:

간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드를 암호하는 서열은 당업계에 공지된 화학적 방법[Caruthers et al.(38) 및 Horn et al.(39) 참조]에 따라 완전하게 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 또는, 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드 자체는 고상법[Merrifield(40) 및 Roberge et al.(41)]을 이용한 직접 펩타이드 합성법과 같이, 그 아미노산 서열을 합성하는 화학적 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 자동 합성법은 예컨대 Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)를 사용하여 달성할 수 있다. 경우에 따라, 간 섬유증 혈청 마커 폴리펩타이드의 단편을 각각 합성하고, 전장 분자를 생산하는 화학적 방법을 이용하여 결합시킬 수도 있다.

새로 합성된 펩타이드는 정제용 고성능 액체크로마토그래피[Creighton(42)]로 실질적으로 정제할 수 있다. 합성 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열분석[예, 에드만 분해법: Creighton(42) 참조]을 통해 확인할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 변형체 또는 융합 단백질을 제조하기 위하여, 상기 간 질환 혈청 마커 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 임의의 부분을 직접 합성법으로 변조하고(하거나) 다른 단백질 유래의 서열과 화학적 방법으로 결합시킬 수도 있다.

하이브리도마 발생 프로토콜

단계 I: 면역화

BALB/c 마우스 및 스위스 웹스터 마우스(그룹 당 5마리)를, 완전 프로인트 보조제(CFA)에 유화시킨 앞서 동정된 간 질환 혈청 마커 중 하나(다른 용량)를 복강내 면역접종한 뒤, 불완전 프로인트 보조제에 유화시킨 면역원을 3회 추가접종(2주 간격으로)했다. 각 추가접종후마다 마우스의 혈액을 채취하고 ELISA로 혈청의 면역원에 대한 역가를 측정했다. 역가가 가장 높은 마우스를 융합에 사용했다.

단계 II: 세포 융합 및 하이브리도마 선발

융합에 선택된 마우스에게 앞서 면역접종에서 사용했던 항원을 동일 용량으로 추가접종했다. 이러한 추가접종은 비장절제술 및 세포융합 전 4일전에 수행했다. 항원 제조물은 보조제 없이 복강내 투여했다.

융합 당일에 마우스를 살처분하고, 비장을 무균적으로 분리했다. 이 비장을 집게로 저미고 체를 통해 걸러냈다. 세포를 이스코브스 변형 이글 배지(IMDM)로 2회 세척하고 혈구계로 계수했다.

마우스 골수종 세포주 P3x63Ag8.653은 정치식 대수기 배양물로부터 분리하여 IMDM으로 세척하고 혈구계를 사용하여 계수했다.

골수종 세포와 비장 세포를 1:5의 비율로 혼합하고 원심분리했다. 상청액은 제거했다. 세포 펠릿을 튜브 바닥에서 가볍게 두드려 부드럽게 재현탁시켰다. 50% PEG(MW1450) 용액 1ml를 30초에 걸쳐서 적가했다. 펠릿을 피펫을 사용하여 30초 동안 부드럽게 혼합했다. 그 결과 수득되는 세포 현탁액을 이후 30초 동안 교란되지 않게 방치했다. IMDM 5ml를 90초 동안에 걸쳐서 첨가하고 그 다음 5ml를 즉시 첨가했다. 그 결과 수득되는 세포 현탁액을 5분 동안 교란되지 않게 방치했다. 이러한 세포 현탁액을 회전탈수시키고, 펠릿을 HAT 배지(10% FBA, 2mM L-글루타민, 0.6% 2-머캅토에탄올(0.04% 용액), 하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 및 10% 오리젠 성장 인자를 함유하는 IMDM)에 재현탁시켰다. 세포를 1ml당 5E5 세포로 재현탁시켰다. 이러한 세포를 96웰 평판에 평판배양했다. 각 웰에 세포 200㎕ 또는 2E5을 첨가했다.

평판을 습도 100%, CO₂ 7% 대기, 37℃에서 항온배양했다. 융합 7일 후, 배지를 제거하고 10% FBS, 2mM L-글루타민, 0.6% 2-머캅토에탄올 스톡(0.04%), 하이포크산틴 및 티미딘을 함유하는 IMDM으로 교체했다. 일반적으로, 융합 후 약 7일째 하이브리도마의 증식 콜로니가 현미경 관찰되었다. 이러한 콜로니의 육안 관찰은 융합 후 약 10 내지 14일째 가능했다.

융합 후 10 내지 14일째, 하이브리도마 증식 콜로니가 존재하는 웰로부터 상청액을 채취했다. 이 상청액의 부피는 약 150 내지 200㎕였고, 1ml당 항체 10 내지 100㎍을 함유했다. 이 상청액을 혈청 선별에 사용했던 동일한 분석법을 사용하여 특이적 항체에 대해 검사했다. 양성 하이브리도마 콜로니는 96웰 평판에서 24웰 평판으로 이동시켰다. 3 내지 5일 후, 24웰 평판의 상청액을 특이적 항체의 존재를 확인하기 위해 검사했다. 24웰 평판 중 한 웰에서 수득된 상청액의 부피는 약 2ml이고 1ml당 10 내지 100㎍의 항체를 함유했다. 양성 웰의 세포를 T25 및 T75 플라스크에서 팽창시켰다. T75 플라스크 유래의 세포는 동결시켰다. 또한, 양성 웰의 세포는 한계 희석으로 클로닝했다. 하이브리도마 세포를 1웰당 0.25세포의 밀도 또는 4웰당 1세포의 밀도로 96웰 평판에 평판배양했다. 증식 콜로니는 10 내지 14일 후에 처음 하이브리도마 선발에 사용했던 것과 같은 분석법(들)을 사용하여 검사했다. 양성 클론은 증대되고 동결되었다.

단계 III: 생산

하이브리도마 세포를 T162 플라스크까지 팽창시킨 다음, 세포 상청액을 생산하기 위하여 회전병에 옮겨 담았다. 이 회전병에서 세포를 약 2주 동안, 생육성이 10% 미만일 때까지 증식시켰다. 배양 상청액은 정제하기 위하여 상기 회전병으로부터 수거했다.

면역분석법의 간단한 설명

모든 항체 분석법은 바이엘 Immuno 1 시스템 형식의 불균질 ELISA형 분석법을 사용했다. 이 시스템은 플루오레세인(fluorescein) 표지된 포획 항체(R1) 및 알칼리 포스파타제 표지된 태그 항체(R2)를 이용한다. 항체 접합체는 생리적 완충액에 2 내지 50mg/L의 농도로 용해했다. 면역반응성 시약은 분석될 항원을 함유하는 환자 시료의 고정량과 항온배양된다. 환자 시료는 항상 반응 큐벳에 먼저 피펫주입하고, 그 다음 30초 후에 R1을 주입한다. R2는 보통 R1 첨가 후 30초 내지 20분 후에 첨가한다. 이러한 혼합물을 최대 20분 동안 항온배양하지만, 다른 양태의 면역분석법에서는 이보다 길거나 짧은 항온배양 시간이 필요할 수도 있다. 그 다음, 면역자성 입자가 혼합물에 첨가된다. 상기 입자는 산화철 함유 폴리아크릴아미드 비드로 구성되어 있고, 항플루오레세인 항체가 입자 표면에 접합되어 있다. 이러한 입자는 Bayer HealthCare Diagnostics에서 시판되고 있다.

상기 항원과 R1 및 R2 접합체로 구성된 샌드위치 면역복합체와 면역자성 입자의 항온배양 시, 샌드위치 면역복합체는 R1 항체의 플루오레세인 표지를 통하여 면역자성 입자 상의 항플루오레세인 항체에 의해 포획된다. 형성된 초복합체는 외부 자기장에 의해 침전된다. 결합되지 않은 모든 물질, 특히 R2 알칼리성 포스파타제 접합체는 세척으로 제거한다. 세척된 복합체는 그 다음 p-니트로페놀 포스페이트 용액에 재현탁된다. 발색률은 항원의 양에 비례하는 큐벳에 남아 있는 포스파타제의 양에 비례한다. 정략분석은 3차 입체 회귀 또는 로드바드(Rodbard) 적합 분석에 의해 작도된 6점 보정 곡선 또는 보정 곡선을 기록하여 달성한다.

(a) 분석 성능

각 분석법의 성능은 별도로 측정했다. 각 면역분석법마다 민감도 및 특이성, 분석내 및 분석간 변동, 간섭, 선형성 및 병행성을 측정했다. 모든 분석법은 높은 임상 화학 기준을 만족시키는 것으로 나타났다. 18세에서 75세에 이르는 건강한 피험자 남성 및 여성 모두에서 수득된 결과 범위는 "정상" 값으로 측정되었다. 따라서, 상기 분석법을 다양한 병리학적 장애가 있는 피험자에게 적용했다.

(b) 통계학적 배경

1021명의 피험자에 대하여 간 섬유증을 관찰 연구("유럽 간 섬유증" 또는 "ELF" 연구)하고, 수득되는 데이터를 분석했다. 사용한 간 섬유증 채점 시스템은 다음과 같다:

- 슈어 점수(0-4),

- 변형된 이삭 점수(HAI) A - 계면 간염(0-4),

- 변형된 이삭 점수(HAI) B - 융합 괴사(0-6),

- 변형 이삭 점수(HAI) C - 반점성 괴사(0-4),

- 변형 이삭 점수(HAI) D - 문맥 염증(0-4),

- 변형 HAI 점수(이삭 점수)(0-6).

단계식 판별 분석을 수행했다; 해당 채점 형식에 주된 영향을 미치는 혈청 모수의 함수는 이하 표 1에 정리했다.

채점 형식	대용 모수
슈어 점수:	In(TIMP-1)	In(콜라겐 VI/히알루로난)	In(히알루로난/라미닌)
변형 이삭 점수 A - 계면 간염:	In(TIMP-1)	In(콜라겐 VI/히알루로난)	In(콜라겐 VI/테나신)
변형 이삭 점수 B - 융합 괴사:	In(히알루로난)	In(콜라겐 VI/MMP-2)
변형 이삭 점수 C - 반점성 괴사:	In(히알루로난)	In(MMP-9/TIMP-1/복합 테나신)
변형 이삭 점수 D - 문맥 염증:	In(라미닌)	In(콜라겐 VI/TIMP-1)
변형 이삭 점수 - 단계:	In(TIMP-1)	In(콜라겐 VI/히알루로난)	In(히알루로난/라미닌)

해당 판별 분석은 생검 점수의 계산과 예측에 사용된 선형 판별 함수를 산출했다. 유도된 알고리듬은 공지된 모든 채점 시스템(예, 슈어 점수, 이삭 점수, 메타비르 점수, 루드빅 점수, HAI 점수)에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 알고리듬은 환자의 생검 점수(예, 점수 0, 1, 2, 3,...)를 예측하거나 또는 환자가 속한 점수 그룹(카테고리)을 예측하는데(예컨대, 약한 섬유증; 점수 0 내지 1) 사용할 수 있다.

사용된 판별 함수는 N-말단 프로콜라겐 III 폴리펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신, 라미닌, 히알루로난, MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체뿐만 아니라 환자의 연령, 성별 및 트랜스아미나제 수준, 가장 특히 ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제), AST(아스파테이트 아미노트랜스퍼라제) 및 GLDH(글루타메이트 탈수소효소) 수준과 함께 이들의 수치 요소, 즉 승수 및 피가수 또는 이의 조합으로 이루어진 목록 중에서 선택되는 마커의 조합을 포함하며, 이 때 수치 요소의 값은 -1000에서 +1000ng/ml 범위이다.

본 명세서에 제시된 값은 다른 표시가 없는 한 나노그램/ml(ng/ml) 단위이다. 당업자라면, 이러한 값을 임의의 다른 유용한 단위로 쉽게 전환할 수 있으며, 따라서 본 명세서에 개시된 알고리듬에 사용된 값은 변경될 수 있다.

여러 채점 점수를 사용하여 확인되는 생검 점수의 예측은 여러 수치 요소로 조합된 연령, 성별 및 트랜스아미나제 값과 함께 마커 PIIINP, 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신, 라미닌, 히알루로난, MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체의 여러 조합을 이용하는 여러 알고리듬을 개발해야만 했다.

판별 함수는 비교하기 위한 조직병리학적 점수만큼 많은 다른 함수의 배열로서 구성되거나(알고리듬 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1b, 2b, 3b, 4b, 5b, 6b 참조) 또는 종종 로지스틱 회귀라 불리는 단독 판별 함수로서 구성된다(알고리듬 4a, 5a, 6a, 4c, 5c, 6c, 7, 7a, 8, 8a, 9, 10, 11, 12). 판별 함수는 본래 계산된 생물마커 유래의 간 점수를 제공하지만 로지스틱 회귀는 이원 결과를 평가하는 도구로서 또는 마커 점수를 계산하는 도구로서의 용도에 따라 하나 또는 다수의 컷오프값을 필요로 한다. 판별 함수는 마커 점수를 제공하기 위해서 질환 등급이 하나씩 감소하는 만큼 많은 다른 컷오프 값을 필요로 한다.

조직병리학적 점수를 계산하기 위해서, 각 혈청 마커 또는 다른 모수의 결과는 판별 점수를 계산하는 각 방정식에 가산되어야 한다. 여러 판별 함수의 세트를 이용하는 모델인 경우에, 각 함수는 다른 점수를 나타낸다. 각 값들을 가산하여 계산 시 최고의 수치 판별 점수를 제공하는 함수는 이에 관련된 질환 점수를 생물마커 유래의 계산된 간 질환 점수로서 제공한다.

(c) 슈어 점수의 알고리듬

다음 알고리듬 1 내지 6 및 4a 내지 6a는 간 질환이 있는 환자 그룹의 혈청 마커 농도와 슈어 채점 시스템을 통해 평가된 생검을 상호 관련시켜 계산했다. 모든 알고리듬은 환자 1 그룹(마커 발견 코오트) 유래의 병리학 점수와 마커 결과를 이용하여 수득하여, 다른 환자 그룹(확인 코오트)의 생검 점수(계산된 점수)를 예측하는데 사용했다. 계산된 점수는 한 병리학자에 의해 측정된 점수(사례 B), 3명의 병리학자의 일치 점수(사례 C) 및 모든 병리학자들의 점수를 포함하는 범위(사례 A)와 비교했다. 알고리듬의 검정력을 평가하기 위하여 카파 값을 계산했다. 새로운 진단학 방법(민감도, 특이성, 양성 예측값(PPV), 음성 예측값(NPV) 및 수신기 작동 특성 분석 곡선 아래 면적(ROC AUC))의 검정력을 평가하는데 일반적으로 사용되는 기준을 이용할 수 있기 위하여, 조직 분석 유래의 간 질환 점수 및 혈청 마커 알고리듬 유래의 계산된 점수를, 점수 0 내지 1을 음성 판독, 점수 2 내지 4를 양성 판독이라 한 2개의 카테고리로 분류했다. 따라서, 두 방법에서 수득되는 참 양성, 참 음성, 거짓 음성 및 거짓 양성이란 표현의 일치가 평가되어 각 알고리듬의 민감도, 특이성, NPV, PPV 및 ROC AUC를 수득할 수 있다. 알고리듬 4a, 5a, 6a를 참조할 수 있다. 모든 경우마다, 생검 결과는 각각의 다른 알고리듬을 평가하는 금본위제로서 사용되었다.

알고리듬에 사용된 약어:

약어	마커
Col IV 또는 COL_IV:	콜라겐 제IV형
Col VI 또는 COL_VI:	콜라겐 제VI형
Hya 또는 HYA 또는 HA:	히알루론산
TIMP-1 또는 TIMP1:	메탈로프로테인아제 제1형의 조직 억제제
Lam 또는 LAM:	라미닌
PIIINP:	프로콜라겐 제III형의 아미노말단 프로펩타이드
MMP2:	기질 메탈로프로테인아제 제2형
MMP9 또는 MMP9/TIMP1:	기질 금속단백질가분해효소 제 9형(MMP9); 및 MMP와 TIMP-1 복합체(MMP9/TIMP1)
Ten 또는 TEN:	테나신
CRATIO:	콜라겐 제IV형의 분석값(ng/ml)/콜라겐 제VI형의 분석값

알고리듬 1: (히알루론산, 라미닌 및 TIMP-1과 Col VI을 이용한다)

알고리듬 2: (히알루론산, 라미닌, TIMP-1과 Col VI을 이용한다)

알고리듬 3: (히알루론산, ColIV 및 PIIINP와 Col VI을 이용한다)

알고리듬 4: (히알루론산, 라미닌 및 TIMP-1과 Col VI을 이용한다)

알고리듬 4a: (히알루론산, 라미닌 및 TIMP-1과 Col VI을 이용하는 이원 알고리듬)

알고리듬 5: (히알루론산, Col IV, PIIINP, MMP2와 Col VI을 이용한다)

알고리듬 5a(히알루론산, Col IV, PIIINP, MMP2와 Col VI을 이용하는 이원 알고리듬)

알고리듬 6(Col IV, PIIINP, TIMP-1과 히알루론산을 이용한다)

알고리듬 6a(Col IV, PIIINP, TIMP-1과 히알루론산을 이용한 이원 결과)

이하 표 2는 알고리듬 1, 2 및 3의 진단학적 성능을 보여준다. 컬럼 C는 3명의 병리학자의 일치 점수와 소정 알고리듬의 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 A는 3명의 다른 병리학자에 의해 보고된 점수 범위와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 B는 연구 핵심 병리학자(병리학자 1인)에 의해 보고된 점수와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 정리한 것이다. 적중률(hit rate)은 마커 기반 알고리듬과 병리학자의 슈어 점수가 동일한 것으로 기록된 점수 백분율이다. 카파값은 결과 그룹 간의 일치를 기록한 것이고, L_카파 및 U_카파는 카파 값의 하위 및 상위 신뢰 범위(95% CI)이며, NPV는 이분화 채점 시스템의 음성 예측값이고, PPV는 이분화 채점 시스템의 양성 예측값이다.

표 3은 알고리듬 4, 5 및 6의 진단학적 성능을 보여준다. 컬럼 C는 3명의 병리학자의 일치 점수와 소정 알고리듬의 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 A는 3명의 다른 병리학자에 의해 보고된 점수 범위와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 B는 연구 핵심 병리학자(병리학자 1인)에 의해 보고된 점수와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 정리한 것이다. 적중률(hit rate)은 마커 기반 알고리듬과 병리학자의 슈어 점수가 동일한 것으로 기록된 점수 백분율이다. 카파값은 결과 그룹 간의 일치를 기록한 것이고, L_카파 및 U_카파는 카파 값의 하위 및 상위 신뢰 범위(95% CI)이며, NPV는 이분화 채점 시스템의 음성 예측값이고, PPV는 이분화 채점 시스템의 양성 예측값이다.

(d) 이삭 점수의 알고리듬

다음 알고리듬 1b, 2b, 3b, 4b, 5b, 6b, 4c, 5c 및 6c는 간 질환이 있는 환자 그룹의 혈청 마커 농도와 이삭 채점 시스템을 통해 평가된 생검을 상호 관련시켜 계산했다.

모든 알고리듬은 환자 1 그룹(마커 발견 코오트) 유래의 병리학 점수와 마커 결과를 이용하여 수득하여, 다른 환자 그룹(확인 코오트)의 생검 점수(계산된 점수)를 예측하는데 사용했다. 계산된 점수는 한 병리학자에 의해 측정된 점수(사례 B), 3명의 병리학자의 일치 점수(사례 C) 및 모든 병리학자들의 점수를 포함하는 범위(사례 A)와 비교했다. 알고리듬의 검정력을 평가하기 위하여 카파 값을 계산했다.

새로운 진단학 방법(민감도, 특이성, 양성 예측값(PPV), 음성 예측값(NPV) 및 수신기 작동 특성 분석 곡선 아래 면적)의 검정력을 평가하는데 일반적으로 사용되는 기준을 이용할 수 있기 위하여, 조직 분석 유래의 간 질환 점수 및 혈청 마커 알고리듬 유래의 계산된 점수를, 점수 0 내지 2를 음성 판독, 점수 3 내지 6을 양성 판독이라 한 2개의 카테고리로 분류했다(이삭 점수). 따라서, 두 방법에서 수득되는 참 양성, 참 음성, 거짓 음성 및 거짓 양성이란 표현의 일치가 평가되어 각 알고리듬의 민감도, 특이성, NPV, PPV 및 ROC AUC를 수득할 수 있다. 알고리듬 4a, 5a, 6a를 참조할 수 있다. 모든 경우마다, 생검 결과는 각각의 다른 알고리듬을 평가하는 금본위제로서 사용되었다.

알고리듬 1b: (히알루론산, 라미닌 및 TIMP-1과 Col VI을 이용한다)

알고리듬 2b: (히알루론산, 라미닌, TIMP-1과 Col VI을 이용한다)

알고리듬 3b: (히알루론산, ColIV 및 PIIINP와 Col VI을 이용한다)

알고리듬 4b: (히알루론산, 라미닌 및 TIMP-1과 Col VI을 이용한다)

알고리듬 4c: (히알루론산, 라미닌 및 TIMP-1과 Col VI을 이용하는 이원 결과)

알고리듬 5b: (히알루론산, Col IV, PIIINP, MMP2와 Col VI을 이용한다)

알고리듬 5c(히알루론산, Col IV, PIIINP, MMP2와 Col VI을 이용하는 이원 결과)

알고리듬 6b(Col IV, PIIINP, TIMP-1과 히알루론산을 이용한다)

알고리듬 6c(Col IV, PIIINP, TIMP-1과 히알루론산을 이용한 이원 결과)

이하 표 4는 알고리듬 1a, 2a 및 3a의 진단학적 성능을 보여준다. 컬럼 C는 3명의 병리학자의 일치 점수와 소정 알고리듬의 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 A는 3명의 다른 병리학자에 의해 보고된 점수 범위와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 B는 연구 핵심 병리학자(병리학자 1인)에 의해 보고된 점수와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 정리한 것이다. 적중률(hit rate)은 마커 기반 알고리듬과 병리학자의 슈어 점수가 동일한 것으로 기록된 점수 백분율이다.

카파값은 결과 그룹 간의 일치를 기록한 것이고, L_카파 및 U_카파는 카파 값의 하위 및 상위 신뢰 범위(95% CI)이며, NPV는 이분화 채점 시스템의 음성 예측값이고, PPV는 이분화 채점 시스템의 양성 예측값이다.

이하의 표 5는 알고리듬 4b, 5b 및 6b의 진단학적 성능을 보여준다. 컬럼 C는 3명의 병리학자의 일치 점수와 소정 알고리듬의 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 A는 3명의 다른 병리학자에 의해 보고된 점수 범위와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 B는 연구 핵심 병리학자(병리학자 1인)에 의해 보고된 점수와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 정리한 것이다. 적중률(hit rate)은 마커 기반 알고리듬과 병리학자의 슈어 점수가 동일한 것으로 기록된 점수 백분율이다. 카파값은 결과 그룹 간의 일치를 기록한 것이고, L_카파 및 U_카파는 카파 값의 하위 및 상위 신뢰 범위(95% CI)이며, NPV는 이분화 채점 시스템의 음성 예측값이고, PPV는 이분화 채점 시스템의 양성 예측값이다. 모든 표에서, "이원 결과"는 마커 점수가 그룹화되어 하위 마커 그룹을 "음성"으로, 상위 마커 그룹을 "양성"으로 표시한 것을 의미한다. 이러한 접근법에 따르면, 이원 또는 이분화 결과는 통계학적 분석을 민감도, 특이성, NPV, PPV 및 ROC AUC를 통하여 표현할 수 있게 된다.

(e) 슈어 점수의 수신기 작동 특성(ROC) 곡선

환자를 슈어 점수의 무질병/약한 섬유증(점수 0-1) 및 중간/심각한 섬유증(점수 2-4) 카테고리로 그룹화하고 이분화 결과의 알고리듬을 계산하여 다음과 같은 결과를 제공했다:

알고리듬 7:

알고리듬 8:

이러한 알고리듬을 사용하여 슈어 점수의 무질병/약한 섬유증(점수 0-1) 및 중간/심각한 섬유증(점수 2-4) 카테고리에 대한 수신기 작동 특성 곡선을 계산했다. 계산된 점수를 단독 병리학자에 의해 측정된 점수(사례 B), 3명의 병리학자의 일치 점수(사례 C) 및 모든 병리학자의 결과가 포함되는 범위(사례 A)와 비교했다. 곡선 아래의 면역(AUC) 값을 계산했다.

표 6은 알고리듬 7 및 8의 진단학적 성능을 보여준다. 컬럼 C는 3명의 병리학자의 일치 점수와 소정 알고리듬의 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 A는 3명의 다른 병리학자에 의해 보고된 점수 범위와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 B는 연구 핵심 병리학자(병리학자 1인)에 의해 보고된 점수와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 정리한 것이다. 이 표에서, "이원 결과"는 마커 점수가 그룹화되어 점수 0 및 1의 그룹을 "음성"으로, 점수 2 내지 4의 그룹을 "양성"(슈어)으로 표시한 것을 의미한다. AUC는 수신기 작동 특성 분석에 따른 곡선 아래의 면적을 나타낸다. N은 조사된 피험자의 수이다.

(f) 이삭 점수의 수신기 작동 특성(ROC) 곡선

환자를 이삭 점수의 무질병/약한 섬유증(점수 0-2) 및 중간/심각한 섬유증(점수 3-6) 카테고리로 그룹화하고 이분화 결과의 알고리듬을 계산하여 다음과 같은 결과를 제공했다:

알고리듬 7a:

알고리듬 8a:

이러한 알고리듬을 사용하여 이삭 점수의 무질병/약한 섬유증(점수 0-2) 및 중간/심각한 섬유증(점수 3-6) 카테고리에 대한 수신기 작동 특성 곡선을 계산했다. 계산된 점수를 단독 병리학자에 의해 측정된 점수(사례 B), 3명의 병리학자의 일치 점수(사례 C) 및 모든 병리학자의 결과가 포함되는 범위(사례 A)와 비교했다. 곡선 아래의 면역(AUC) 값을 계산하여 표 7에 제시했다.

표 7은 알고리듬 7a 및 8a의 진단학적 성능을 보여준다. 컬럼 C는 3명의 병리학자의 일치 점수와 소정 알고리듬의 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 A는 3명의 다른 병리학자에 의해 보고된 점수 범위와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 기록한 것이다. 컬럼 B는 연구 핵심 병리학자(병리학자 1인)에 의해 보고된 점수와 상기 마커 기반 결과 사이의 비교 결과를 정리한 것이다. 이 표에서, "이원 결과"는 마커 점수가 그룹화되어 점수 0 내지 2의 그룹을 "음성"으로, 점수 3 내지 6의 그룹을 "양성"(이삭)으로 표시한 것을 의미한다. AUC는 수신기 작동 특성 분석에 따른 곡선 아래의 면적을 나타낸다. N은 조사된 피험자의 수이다.

그룹화된 점수 및 복수 마커

간 섬유증 혈청 마커 PIIINP, 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신, 라미닌, 히알루로난, MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체와 함께 연령, 성별 및 트랜스아미나제 값은 또한 이삭 점수를 다음과 같은 3개의 그룹으로 나누어 무질병/약한 섬유증, 중간 섬유증 및 심각한 섬유증 그룹으로 환자를 분류하는데 유용하다: 그룹 1 이삭 점수 0 및 1; 그룹: 이삭 점수 2, 3 및 4; 및 그룹 3: 이삭 점수 5 및 6. 히알루론산, PIIINP, MMP2, 콜라겐 IV 및 TIMP-1와 같은 각 마커의 농도가 간 섬유증의 병도와 상관성이 있을지라도 마커 조합이 더욱 분명한 진단학적 성능을 제공한다. 본 연구의 이러한 양태는 그룹화된 점수를 통해 평가했을 때 간 섬유증의 병도와 단독 마커의 상관성이 나타나지만, 알고리듬 9, 10 및 11은 하나 이상의 마커를 알고리듬에 조합하여 사용했을 때 달성될 수 있는 개량을 보여주는 좋은 예이다.

히알루론산

히알루론산은 과거 기록을 보면 간 섬유증의 단계와 상관성이 매우 깊다. 따라서, 다른 모든 알고리듬의 개발에서 사용했던 훈련받은 코오트를 대상으로 히알루론산의 판별 함수(자연 로그 단위)를 수득했다. 판별 점수(D _HA )는 다음과 같다:

D _HA = -3.97+1.016Ln(HA)

생검 기록과 판별 검수의 비교 검사는 이삭 점수가 다음과 같이 그룹화되어야 한다는 것을 암시했다:

이삭 점수	질병 상태
0-1	무질병 또는 약한 섬유증
2-4	중간 섬유증
5-6	심각한 섬유증

이러한 방식에 따른 이삭 시스템의 변형으로, 훈련 세트의 판별 함수는 다음과 같이 변형되었다:

D _HA = -3.70+0.992Ln(HA)

모든 마커의 확인에 사용된 확인 세트를 통한 히알루론산 마커 결과의 처리는 이 마커 단독에 의해서도 3 그룹으로 분명하게 분리될 수 있음을 나타낸다. 컷오프값은 심각한/중간 섬유증의 검출에 85% 민감도를 달성하는 것으로 채택했다. 이러한 그룹을 무질병/약한 섬유증 그룹과 분리하는 특이성을 계산했다. 이하의 표 7a는 각 특이성과 컷오프값을 보여준다.

무질병 또는 약한 섬유증과 비교되는 특이성을 보유한 85% 민감도의 컷오프 히알루론산

질병 상태	컷오프	특이성
심각한 섬유증	-0.135	43.1%
중간 섬유증	-1.23	22.9%

프로콜라겐 제3형( PIIINP )의 아미노말단 프로펩타이드

훈련받은 코오트에서 측정된 이 마커의 판별 함수는 다음과 같이 측정되었다.

D _PIIINP = -2.657+1.646*Ln(PIIINP)

확인 그룹의 PIIINP 농도로 부터 유도된 판별 점수를 계산해 보면, 그룹 간의 분명한 차이가 있는 것으로 나타났다. 85% 민감도 수준에서 무질병/약한 섬유증과 중간 섬유증 및 심각한 섬유증 간을 각각 분리하는 마커 PIIINP의 특이성은 이하 표 7b에 정리했다.

무질병 또는 약한 섬유증과 비교되는 특이성을 보유한 85% 민감도의 컷오프 PIIINP

질병 상태	컷오프	특이성
심각한 섬유증	-0.135	65.3%
중간 섬유증	-0.855	30.5%

기질 메탈로프로테인아제 제2형( MMP2 )

다시 훈련 코오프에서 측정된 이 분석의 판별 함수는 다음과 같다:

D _MMP2 = -15.0+2.354Ln(MMP2)

확인 그룹의 MMP2 농도로 유도된 판별 점수를 계산해 보면, 그룹 간의 분명한 차이가 있는 것으로 나타났다. 85% 민감도 수준에서 무질병/약한 섬유증과 중간 섬유증 및 심각한 섬유증 간을 각각 분리하는 마커 MMP2의 특이성은 이하 표 7c에 정리했다.

무질병/약한 섬유증과 비교되는 특이성을 보유한 85% 민감도의 컷오프 MMP2

질병 상태	컷오프	특이성
심각한 섬유증	-0.276	43.3%
중간 섬유증	-0.664	12.7%

콜라겐 IV

훈련받은 코오트에서 판정된 바와 같이, 제IV형 콜라겐의 판별 점수는 다음과 같다:

D _Col4 = -11.341+2.273Ln(콜라겐IV)

확인 그룹의 콜라겐 IV 농도로 유도된 판별 점수를 계산해 보면, 그룹 간의 분명한 차이가 있는 것으로 나타났다. 85% 민감도 수준에서 무질병/약한 섬유증과 중간 섬유증 및 심각한 섬유증 간을 각각 분리하는 마커 콜라겐 IV의 특이성은 이하 표 7d에 정리했다.

무질병 또는 약한 섬유증과 비교되는 특이성을 보유한 85% 민감도의 컷오프 콜라겐 IV

질병 상태	컷오프	특이성
심각한 섬유증	-0.421	52.6%
중간 섬유증	-0.887	22.6%

메탈로프로테인아제 제I형( TIMP -1)의 조직 억제제

그룹화된 이삭 카테고리를 유의적으로 판별한 다른 유일한 단독 마커는 TIMP-1이었다. 이 판별 함수는 다음과 같다.

D _TIMP1 = -13.289+2.036*Ln(TIMP-1)

확인 그룹의 콜라겐 IV 농도로 유도된 판별 점수를 계산해 보면, 그룹 간의 분명한 차이가 있는 것으로 나타났다. 85% 민감도 수준에서 무질병/약한 섬유증과 중간 섬유증 및 심각한 섬유증 간을 각각 분리하는 마커 TIMP-1의 특이성은 이하 표 7e에 정리했다.

무질병 또는 약한 섬유증과 비교되는 특이성을 보유한 85% 민감도의 컷오프 TIMP-1

질병 상태	컷오프	특이성
심각한 섬유증	-0.673	34.1%
중간 섬유증	-1.014	21.1%

(h) 복수 마커

본 연구의 양태는 하나 이상의 혈청 마커를 진단학적 알고리듬에 조합함으로써 개선이 달성될 수 있음을 보여주는 것이다.

알고리듬 9는 PIIINP와 콜라겐 IV를 포함한다. 마커 발현 코오트에서 유래된 판별 함수는 다음과 같다:

D _M1 = -7.522+1.21Ln(콜라겐 IV)+0.947Ln(PIIINP)

확인 그룹의 알고리듬 9로부터 유도된 판별 점수를 계산해 보면, 그룹 간의 분명한 차이가 있는 것으로 나타났다. 85% 민감도 수준에서 무질병/약한 섬유증과 중간 섬유증 및 심각한 섬유증 간을 각각 분리하는 알고리듬 9에서 수득된 특이성은 이하 표 7f에 정리했다.

무질병 또는 약한 섬유증과 비교되는 특이성을 보유한 85% 민감도의 컷오프 알고리듬 9

질병 상태	컷오프	특이성
심각한 섬유증	-0.074	71.9%
중간 섬유증	-0.862	24.8%

심각한 질병에 대한 알고리듬 9와 PIIINP 단독의 특이성 비교는 숫자상으로 85% 민감도 수준에서의 특이성 증가가 현저한 것으로 나타나지만, 상관 비율에 대한 McNemar 검사는 그 증가가 0.05 수준으로 유의적이지 않음을 시사한다. 정확히 0.07의 p가 유의값쪽임을 유념한다. 알고리듬 9는 이삭 점수에서 유도된 모든 단독 마커를 능가하는 것으로 나타나지만 0.1 수준에서 유의적이었다. 중간 질병 그룹의 비교에서는 특이성의 유의적인 증가가 없었다.

알고리듬 10

히알루론산을 마커 발견 코오트와 알고리듬 9에 첨가하여 다음과 같은 판별 함수를 수득했다:(알고리듬 10)

D _ModelII = -6.704+0.749Ln(콜라겐 IV)+0.607Ln(히알루론산) + 0.436Ln(PIIINP)

확인 그룹에서 알고리듬 10으로부터 유도된 판별 점수를 계산해 보면, 그룹 간의 분명한 차이가 있는 것으로 나타났다. 85% 민감도 수준에서 무질병/약한 섬유증과 중간 섬유증 및 심각한 섬유증 간을 각각 분리하는 알고리듬 10의 특이성은 이하 표 7g에 정리했다.

무질병 또는 약한 섬유증과 비교되는 특이성을 보유한 85% 민감도의 컷오프 알고리듬 10

질병 상태	컷오프	특이성
심각한 섬유증	-0.080	79.3%
중간 섬유증	-0.919	31.4%

McNemar χ²은 매우 유의적이어서, 알고리듬 10의 특이성이 PIIINP 단독 또는 다른 임의의 단독 마커보다 훨씬 우수하다는 것을 보여준다. 또한, 알고리듬 10은 0.05 유의 수준만큼 알고리듬 9보다 우수했다.

알고리듬 11( PIIINP , 콜라겐 IV, 히알루론산 및 MMP2 )

확인 그룹에서 알고리듬 11로부터 유도된 판별 점수를 계산해 보면, 그룹 간의 분명한 차이가 있는 것으로 나타났다. 85% 민감도 수준에서 무질병/약한 섬유증과 중간 섬유증 및 심각한 섬유증 간을 각각 분리하는 알고리듬 11에 의해 달성된 특이성은 이하 표 7h에 정리했다.

무질병 또는 약한 섬유증과 비교되는 특이성을 보유한 85% 민감도의 컷오프 알고리듬 11

질병 상태	컷오프	특이성
심각한 섬유증	-0.229	80.6%
중간 섬유증	-0.662	32.5%

알고리듬 11인 단독 마커 각각의 결과와 비교했을 때 85% 민감도 수준에서 특이성 개선을 보여주지만, 알고리듬 10에 비해 알고리듬 11의 개선은 조사된 시료 크기의 유의 수준에 미치지 못했다: McNemar χ²=2.18, p=0.14. 민감도에 미치지 못한 다른 모든 성능의 개선에 대해서는 일단 더 큰 환자 코오트를 연구해봐야 할 가능성이 크다.

2. 간 질환의 진행에 대한 추적 모니터링

85명의 환자를 대상으로 연구 초기와 말기에 채취한 간 생검을 가지고 2년동안 모니터했다. 혈청은 모든 환자로부터 연구 중에 1 내지 8회의 다른 시점에서 채취했다.

마커 유래의 계산된 병리상태 점수는 다음과 같은 로지스틱 회귀로부터 계산했다:

D= -10.06+0.814Ln(CRATIO)+0.640Ln(히알로론)+0.639Ln(MMP2)

+0.431Ln(P3NP) (알고리듬 12)

알고리듬 12에서,CRATIOsms 콜라겐 VI과 콜라겐 IV의 혈청 수치의 비를 의미한다.

다음 표 8은 분석 확인 코오트의 환자로부터 수득한 판별 점수(알고리듬 12)가 이의 대응 조직병리학 점수를 중심으로 군집을 형성하는 방식을 정리한 것이다:

각 점수를 판정하기 위한 컷오프값은 분리될 대응 판별 점수의 평균을 취하여 수립했다. 계산된 간 질환 점수를 사용하여 비모수 회귀 계산으로 기울기(질병의 병도 vs. 시간; 회귀 계수의 테일 추정량)를 수득했다. 95% 신뢰 구간은 각 기울기마다 계산했고, 각 기울기마다 정의된 신뢰 변수 ν는 다음과 같은 값이다:

기울기 > 0이고 95% CI가 0을 함유하지 않으면 1(양성)

기울기의 95% CI가 0을 함유하면 ν=0

기울기가 <0이고 95% CI가 0을 함유하지 않으면 -1(음성)

따라서, ω는 다음과 같이 정의된다:

이삭 점수가 2 이상의 수준으로 감소하면 -1(개선)

이삭 점수가 ±1이면 ω=0(변화 없음)

이삭 점수가 2 이상의 수준으로 증가하면 1(진행)

이러한 2가지 정의를 사용하면 85명 환자들의 결과에 대한 3개씩의 일치 표가 만들어져, 다음 표 9에 제시된 바와 같은 결과가 수득된다.

표 9는 질병이 진행(병리 상태로 측정)된 12명의 환자들에서는 감소되는 판별 점수를 나타내는 환자가 전혀 없음을 보여준다. 또한, 질병이 개선된 환자 중에서도 1명만이 양성 기울기를 나타냈다. 종합하면, 일치는 0.1 수준에서도 유의적이어서, 간 질환의 진행 및 퇴행을 추적 모니터하는 혈청 마커계 알고리듬의 능력을 입증해 준다.

다기관("ELF") 연구의 추가 분석

ELF 연구에서 수집한 데이터는 데이터 통계 분석의 대안 접근법을 사용하여 재분석했다.

ELF 연구에서 본 발명에 따른 양태의 성능은 널리 승인된 2가지 조직학적 단계결정(staging) 시스템과 비교했다. 조직학적 단계결정 방법은 결점이 있는 가정을 기반으로 한다는 것은 자명하다. 우선, 모든 단계결정 시스템은 섬유증의 범위를 "무질병"에서 "경화증"까지 나타내는 단계를 구분하기 위하여 병리학자가 생검 결과에 카테고리 값을 지정해야 한다. 상기 범위의 병리 상태는 연속 가변 점수로 더욱 정확하게 표현되어야 할 것이다. 둘째, 슈어 및 이삭의 조직학적 단계결정 시스템은 모두 단계 간에 진행의 선형성을 당연하게 생각하지만, 단계 4가 반드시 단계 2의 2배만큼 악화된 것은 아니라는 것은 잘 알려져 있다(30A; 31A).

이러한 2번째 가정을 해결하기 위하여, 본 발명의 양태는 섬유증의 범위를 따라 알고리듬 점수의 분포를 측정하는데 사용하여, 점수가 조직학적 질병 병도와 차이가 나는 방식을 조사했다. 종래 대용 마커 연구에서는 조직학적 단계를 통한 진행이 선형이라는 가정과 전문가의 의견에 기초하여 "무 섬유증 또는 약한 섬유증" 및 "중간 섬유증 또는 심각한 섬유증"이라는 2 그룹으로 조직학적 단계를 임의로 이분화했다. 그 다음, 이와 같이 이분화된 단계를 사용하여 조직학 성능과 혈청 마커 점수를 비교했다.

본 분석에서는 간 조직학적 단계의 그룹화 및 이 단계와 마커 점수의 상관성에 대하여 어떠한 가정도 필요없다. 마커 데이터를 플롯팅하면, 슈어 단계 2 및 3과 이삭 단계 3 및 4 사이의 지점에서 조직학적 단계의 이분화와 상관성이 있는 분명한 경계선이 있는 2개의 자연적 그룹이 나타난다. 이러한 데이터는 상기 단계의 변화가 질병 진행에 있어서 생물학적으로 유의적인 단계 지점임을 시사한다.

구체적으로, 9가지 혈청 섬유증 마커의 수준과 간 섬유증 사이의 관계는 앞서 설명한 ELF 연구에서 13개 센터에서 만성 간 질환의 연구의 일부로서 1,021명의 피험자로부터 수득한 간 생검의 조직 검사를 통해 평가했다. 본 연구에서의 환자 모집은 도 1에 제시한 바와 같다.

ELF 연구에서, 피험자는 만성 간 질환 조사를 위한 간 생검을 받아서 6개월 이상 지속된 생화학적 간 기능 검사에서 비정상이라는 판정을 받았다면 적격자로 간주했다. 추가 적격 기준은 알려준 동의 의사를 제공할 능력, 18세 이상 내지 75세 미만의 연령이다. 이 연령 범위 외의 환자, 간외 섬유증과 관련된 임의의 장애, 예컨대 류마티스, 신장병 또는 폐병 등을 보유한 환자; 심혈관 질환 또는 암 보유 환자; 대상부전의 징후가 있는 진행성 경화증(Child-Pugh 등급 C) 환자; 규칙적인 아스피린 복용자; 또는 간세포 암종 또는 약물 유도성 간 질환 보유 환자는 본 연구에서 제외했다.

모집된 1,021 피험자 중에서 각 진단 카테고리에 사용된 피험자 수는 다음과 같다: 만성 C형 간염 496; 알코올성 간 질환 64; 1차 담관성간경화증 또는 1차 경화담관염 53; 지방간 61; B형 간염 61; 간 이식후 재발 질병 48; 자가면역 간염 45; 혈색소침착증 32; 잠복성 간경화증 19; B형 및 C형 간염 4; 기타(미지 병인의 육아종병 및 정상인 포함) 138. 남자는 피험자의 63%였고, 평균 연령은 44.1세였으며, 표준 편차는 12.8년, 범위는 19-25년이었다. GA, GT, GV 또는 형태계측 그룹의 피험자들 간에 큰 차이는 없었다.

혈청 시료는 통상의 혈액 검사외에도 간 생검 시에 수득했고 즉시 처리했다. 바이엘 IMMUNO 1™ 시스템을 이용하여 진행할 9가지 다른 면역분석을 개발했다. 앞서 설명한 바이엘 Immuno 1 시스템 형식의 불균질 ELISA형 분석을 사용했다. 분자 표적의 전체 패널을 간 섬유증과 관련된 기본 기작의 지식에 기초하여 기질 합성 또는 분해의 대용 마커로 선택했다. 본 분석에 사용항 항체 쌍과 이의 공급원은 앞서 여러 간 섬유증 점수들을 판별하는 변수를 측정하는 판별 함수 분석의 사용과 관련하여 설명한 항체 쌍 및 공급원과 같은 것을 사용했다. 불확정적인 것으로 간주되는 혈청 마커 점수는 없었다.

모든 생검마다 1명의 핵심 병리학자(A)가 부분적으로 분석했다. 임상적 세부사항 또는 생화학적 시료는 45명의 피험자에서 완전하지 못했고, 나머지 976가지 생검 중 55개는 부정확한 길이(<12mm) 또는 너무 적은 수의 문맥관으로 인해 완전한 조직 분석에는 부적당한 것으로 간주되었다. 생검, 혈청 시료 및 임상적 세부사항은 그룹 G_A를 구성하는 최종 분석에 포함된 921명의 피험자에서 입수할 수 있었다.

3명의 간 전문 병리학자가 본 연구에 참여했다. 핵심 병리학자(A)는 슈어(27) 및 이삭(28) 단계결정 시스템을 사용하여 921개 생검을 평가했다. 만성 바이러스 또는 면역 간염 이외의 다른 증상에 대해서는 섬유증의 분포를 반영하는 다른 기준 설명을 사용했다(예, 알코올성 및 비알코올성 지방간염에서는 주위세정맥 및 주위세포 섬유증이 문맥 및 문맥주위 섬유증을 대신했다). 이 그룹은 G_A로 표시했고, 이 그룹의 시료로부터 검사 세트 및 확인 세트를 수득했다. 병리학자 A 및 B는 본 연구에서 나타낸 만성 간 질환의 범위를 반영하는 별도의 "지도 수행(coaching)" 세트의 슬라이드를 사용하여 연구 생검 재료를 평가하기 전에 먼저 각 채점 방식을 일치시켰다. 병리학자 C는 이삭 및 슈어 시스템에 대한 기술을 동일하게 A 및 B로서 나타냈지만 "지도 수행" 없이 생검의 단계를 결정했다. 병리학자 A는 G_c로 표시한 620명의 "콘센서스 세트"를 비롯한 921개 생검 모두를 다시 단계결정했고, 병리학자 B 및 C도 각각 단계결정했다. 각 섬유증 단계(슈어 0-4 및 이삭 0-6)를 기록했다.

이러한 방식으로 4가지 시리즈의 단계결정 세트가 수득되었다. 핵심 병리학자의 결과는 R_A1 및 R_A2로 표시하고, 병리학자 B의 결과는 R_B로, 병리학자 C의 결과는 R_C로 표시했다. 이러한 단계결정의 결과 비교는 관찰자내 변이(R_A1 대 R_A2), 연구 세팅을 반영하는 "지도 수행된" 병리학자 간의 관찰자간 변이(R_A1 대 R_B) 및 각각 연구하지만 공통 채점 시스템을 사용하는 전문 간 병리학자 사이의 관찰자간 변이(R_A1 대 R_C, 및 R_B 대 R_C)를 조사할 수 있게 한다. 이러한 비교 중 후자 비교는 임상 실습에 속하는 상황을 정확하게 반영한다.

(a) 분석 기술

혈청 마커를 조합한 알고리듬을 얻기 위하여, 생검 조사된 921명의 환자 그룹 중에서 400명의 증례 그룹(G_T)을 무작위로 선발했다. 알고리듬에 첨가 시 그룹 간의 일반적인 전체 거리가 증가한다면 그 마커를 포함시켜 알고리듬을 만들었다. 임상 화학 및 혈액학 검사 결과도 이러한 방식으로 검사했다. 최적 알고리듬을 선택한 후, 이 알고리듬의 성능을, 병리학자 A가 정한 단계결정법을 사용하여 확인 그룹(G_v)으로 표시한 G_A의 나머지 521개 생검 세트에서 확인했다. 조직학적 섬유증 단계를 구별하는 능력에 관한 상기 알고리듬의 성능 특성의 분석은, 하위 조직학적 섬유증 단계와 상위 단계를 보유한 증례 사이를 구별하는 구분점을 동정하는데 사용했고, 결과적으로 간 섬유증의 참 생물학적 진행 결과를 반영할 수 있는 이원 결과를 수득했다. 이러한 접근법은 섬유증 진행의 선형성에 대한 가정을 피할 수 있게 했다. 이 알고리듬의 성능의 재현성은 병리학자 B와 C에 의해 정해진 생검 단계들에 대한 알고리듬의 성능을 측정하여 평가했다.

형태계측식 이미지 분석은 콘트론(Kontron) 이미지 분석기 및 836개의 적당한 생검을 피코 시리어스 레드/패스트 그린(Pico Sirius Red/Fast Green)으로 염색한 후 검출되는 총 간 조직의 백분율로서 섬유증 면적을 측정하기 위해 시야를 편집하는 상호작용성 프로그램을 사용하여 수행했다. 섬유성 조직에 대해 양성으로 염색된 전 구역의 백분율을 각 증례마다 측정했고 평균 값을 구했다(20A).

응용 통계학 방법에는 분산 분석(ANOVA), 판별 분석 및 이원 그룹화된 생검 단계용 로지스틱 회귀 분석이 포함된다. 카파 통계량은 병리학자 간의 일치를 측정하기 위해 계산했다. 민감도, 특이성, 양성 예측값(PPV), 음성 예측값(NPV) 및 이원 결과의 보급성은 ROC 분석을 이용하여 평가했다.모든 분석은 SPSS® 소프트웨어 패키지(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행했다.

(b) 결과

모든 증례에서 슈어 단계결정에 대한 병리학자들간의 일치성은 이삭 단계결정을 능가했다. 병리학자 A에 의해 수행된 두 세트(R_A1 및 R_A2)의 단계결정 간의 일치율이 높았다(카파값, 슈어에 대해서는 >0.9, 이삭에 대해서는 0.76).

본 연구의 1차 목표는 조직학적 섬유증을 유의적으로 동정하는 혈청 마커의 능력을 조사하는 것이었다. G_T 및 G_v에서 각 마커의 평균, 중위값 및 평균 표준오차(SEM)를 측정했다. 다변량 ANOVA는 함께 선택한 모든 마커들마다 그룹 차이가 없음을 시사했다(호텔링의 T= 0.01, F=1.14, df1=9, df2=911, p=0.33). 연합 각 t 검정의 검사 결과, 임의의 각 마커마다 그룹 간에 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다. 카이제곱 분석은 각 그룹마다 병인학적 중지점에 차이가 없는 것으로 나타났다(가능도 비 카이제곱 = 6.34, df=6, p=0.38)(데이터는 제시하지 않았다).

혈청 마커를 조합한 알고리듬은 각 채점 시스템마다 평가하여 G_T 그룹의 생검 단계들마다 판별하는 능력을 평가했다.

히알루론산, 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 라미닌, 프로콜라겐 III의 아미노말단 펩타이드(PIIINP), 메탈로프로테인아제 1의 조직 억제제(TIMP-1) 및 기질 메탈로프로테인아제 2(MMP-2)를 다양한 조합으로 포함하는 알고리듬에 의해서 유사한 성능 특성이 발견되었다. 이외에, 다른 혈청 마커, 간 기능 검사를 비롯한 임상 화학 검사 또는 혈소판 수 및 프로트롬빈 시간을 비롯한 혈액학적 지표의 부가는 알고리듬의 성능을 개선시키지 않았다.

본 발명은 생검 그룹을 총 단계 범위(슈어 단계 0-4, 이삭 단계 0-6)에 걸쳐 최대한 분리하는 알고리듬의 결과를 제공한다. 모든 유사 조합의 결과는 각 등급 내의 생검 단계를 이분화할 수 있음을 시사했다. 도 2a는 슈어 단계결정 시스템에서 3 마커의 "최량 적합" 모델의 누적 분포를 보여주는 것이다. 도 2b는 이삭 시스템에서 상기 모델의 누적 분포를 보여주는 것이다. 이 모델은 히알루론산, 프로콜라겐 III의 아미노말단 펩타이드(PIIINP), 메탈로프로테인아제 1의 조직 억제제(TIMP-1) 및 연령의 값을 포함하고 있다. 이 알고리듬의 식은 다음과 같다.

본 분석에 사용된 알고리듬의 식은 다음과 같다:

슈어 :

이삭:

이때,

Z= -0.196ㆍln(연령) + 0.959ㆍln(히알루론산) + 0.761ㆍln(PIIINP) + 0.539ㆍln(TIMP1) - 8.92

분포 조사는 이삭 단계 3 또는 슈어 단계 2에서의 자연 분리를 시사했다. 이러한 결과는 각 시스템에서 단계 간에 일반화된 거리를 조사하여 실증되었고(데이터는 제시하지 않았다), 그 결과 슈어 0-2, 이삭 0-3 및 슈어 3-4, 이삭 4-6에 각각 해당하는 "무질병/약한 섬유증" 및 "중간/심각한 섬유증"이라는 2개의 카테고리가 수득되었다(도 4 참조). 앞서 제시한 모델에 각 시스템의 이분화 단계가 적합하도록 하기 위해 로지스틱 회귀를 사용했다. 로지스틱 점수는 검사 그룹(G_T)과 확인 그룹(G_v)에 속하는 환자들에서 수득했다. 표 10(a)는 각 그룹마다 측정된 각 이분화 시스템의 AUC를 제시한 것이다. 두 시스템의 AUC는 동일한 결과를 나타냈다. G_v 코오트에서 슈어 시스템의 경우, AUC는 0.804; SE=0.023; p<0.0001; 95% CI=0.758 내지 0.851이고; 이삭 시스템의 경우 AUC는 0.804; SE=0.023; p<0.00001; 95% CI=0.758 내지 0.850이었다.

도 1을 살펴보면, 중앙 수평선은 중위값이고, 새김선 영역은 중위값의 예상 95% CI를 나타낸다. 말단선은 25^th 및 75^th 백분위수이다. 대시선은 데이터의 "허용 범위"를 나타낸다. + 및 ○은 잠재적인 "영역외 결과"를 표시한다. 플롯팅된 데이터는 슈어 단계 0-2 및 3-4의 생검 판별 점수의 분포를 나타낸다.

특정 만성 간 질환에서 상기 알고리듬의 성능을 평가했다. 이 코오트에서 가장 일반적인 3가지 간 장애에 대한 AUC를 슈어 및 이삭 단계 시스템 각각에서 측정하여 표 10(a) 및 10(b)에 정리했다. 이 데이터는 다른 종류의 만성 간 질환을 보유한 환자들의 전체 코오트 중에서 400개의 검사 시료(GT) 및 521개의 확인 시료(GV)들; 및 C형 간염, 비알코올성 지방 간 질환 및 알코올성 간 질환 환자들의 검사 및 확인 시료들에 대한 이분화 결과(슈어에서는 0,1,2:3,4, 및 이삭에서는 0,1,2,3:4,5,6)를 검출하는 상기 알고리듬의 성능을 나타낸다. 수신기 작동 특성 곡선, 표준오차(SE), 관련 p값 및 AUC의 95% 신뢰 구간도 나타냈다.

슈어 단계결정 시스템에 의하면, C형 간염에서는 AUC=0.773; SE=0.0386; p<0.0001; 95% CI=0.697 내지 0.848이고; NAFLD에서는 AUC=0.870; SE=0.104; p<0.0002; 95% CI=0.666 내지 1.000이며; 알코올성 간 질환(ALD)에서는 AUC=0.944; SE=0.0555; p<0.0001; 95% CI=0.836 내지 1.000이다.

표 11a 및 표 11b는 이삭(11a) 및 슈어(11b) 시스템마다 다른 점수 역치에서의 확인(G_v) 곡선의 특정 좌표를 보여주고 있다.

표에는 G_v 코오트에서의 ROC 곡선의 특정 좌표를 제시했다. 일정 범위의 알고리듬 역치 점수에 대하여 민감도, 특이성, 양성예측값 및 음성예측값을 계산했다. 또한, 성능 특성은, 병리학자 A에 의해 단계결정된 일련의 시료 중에서 유의적 섬유증 검출 시 90% 민감도를 제공한 점수인, 0.102의 알고리듬 역치 점수를 사용하여 병리학자 B와 C에 의해 지정된 단계들과 비교된 알고리듬으로 제시했다. 데이터는 이삭 단계결정(12a) 및 슈어 단계결정(12b) 시스템과 비교하여 제시했다.

민감도 및 특이성 외에, 양성 예측값 및 음성 예측값도 제시했다. 슈어 단계 3 또는 4 섬유증 검출의 민감도는 역치 알고리듬 점수 0.102에서 90%이어서 NPV=92%였다. 특이성은 역치 점수 0.82에서 99%이어서 PPV=90%였다. 이삭 단계 4-6의 대응 값은 역치 0.102에서 90% 및 92%였다.

알고리듬의 성능은 역치 점수 0.102를 사용하여 다른 두 병리학자에 의해 지정된 생검 단계와 비교하여 평가했다. 슈어 단계 3 또는 4의 섬유증 검출의 특이성은 역치 알고리듬 점수 0.102에서 B는 86.7%, C는 86.5%이어서, NPV는 각각 90.9% 및 91.7%였다. 역치 알고리듬 점수 0.102에서 이삭 단계의 대응 값은 B는 민감도=87.7%; NPV=90.2%이고, C는 민감도=89.3%; NPV=92.2%였다.

병리학자 A에 의해 단계결정된 G_v 코오트에서 나타나는 3가지 주요 만성 간 질환, 만성 C형 간염(CHC), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 알코올성 간 질환(ALD)에서 알고리듬의 성능 결과는 표 12a 및 12b에 제시했다. 이 표에는 90% 초과하는 결과를 제공하는 알고리듬 점수 역치에서의 ROC 좌표, 민감도, 특이성 및 음성 예측값이 제시되어 있다.

상기 표에는 G_v 코오트에서의 ROC 곡선의 특정 좌표를 제시했다. 일정 범위의 알고리듬 점수에 대하여 민감도, 특이성, 양성예측값 및 음성예측값이 계산되었다. 데이터는 이삭 단계결정(12a) 및 슈어 단계결정(12b) 시스템과 비교하여 제시했다. 각 경우마다 표 (a)는 슈어 단계결정 시스템을 나타내고, (b)는 이삭 단계결정 시스템을 나타낸다. 0.065의 역치값에서 이삭 섬유증 단계 4-6의 민감도는 100%이고, 음성 예측값은 100%였다.

슈어 시스템에 의한 NAFLD 비교에서, 섬유증 단계 3 또는 4는, 0.375의 알고리듬 점수 역치 값을 사용하면 민감도 89%, 특이성 96%, PPV 80%, NPV 98%였다. 알코올성 간 질환에서는 슈어 섬유증 단계 3 또는 4를 검출하는데 있어서 0.087의 역치 점수를 사용하면 민감도 100%, NPV 100%인 반면, 0.431의 역치값을 사용하면 민감도 93.3%, 특이성 100%, PPV 100%, NPV 85.7%였다.

통상적으로, 임상가와 병리학자는 간 섬유증을 슈어 단계 0,1; 2,3; 및 4에 해당하는 "약한", "중간" 및 "심각한" 섬유증의 3 카테고리로 나눈다. 약한 섬유증에서 중간 섬유증으로의 전이는 흔히 질병 진행의 유의적 단계로서 알려져 있어서 환자 관리 시 결정에 영향을 미치고 예후 진단에 의미가 있는 이정표이다. 이에 따라, 단계 0,1,2 및 3,4 사이의 알고리듬 판별 점수 분포에 기초한 이분화보다는 슈어 단계 0,1 및 2,3,4 사이의 이분화를 사용하여 데이터를 분석했다.

그 결과, 비슷한 수준의 성능이 나타났다. 중간/심각한 섬유증을 검출하는 데 있어서 90% 민감도를 나타내는 결과는 슈어 단계 0,1; 2,3,4(A) 및 0,1,2:3,4(B) 이분화 각각에 대하여 다음 표 13에 제시했다. 또한, 90% 민감도(C)로 단계 4 섬유증(경화증)을 검출하는 능력에 대해서도 데이터를 분석했다.

표 13의 데이터는 다른 종류의 만성 간 질환 환자의 전체 코오트에서 채취한 400개의 검사 시료(G_T) 및 521개의 확인 시료(G_V)의 이분화 결과(슈어 시스템에서의 A=0,1: 2-4, B=0,1,2:3,4 및 C=0,1,2,3:4)를 검출하는 데 있어서 알고리듬의 성능을 나타낸 것이다. 제시된 결과에는 수신기 작동 특성 곡선의 곡선아래 면적(AUC), 관련 표준 오차 및 p값과 95% 신뢰 구간이 포함되었다. 섬유증 검출의 민감도 및 특이성은 특정 판별 점수 역치값(DST)에 제공했다. "A"는 중간 및 심각한 간 섬유증으로부터 약한 섬유증을 구분하는데 통상적으로 사용된 이분화를 나타낸다. "B"는 코오트의 점수 분포 분석으로부터 얻어진 약한 섬유증과 중간 섬유증 간의 차이를 나타내는 제안된 이분화이다. "C"는 심각한 섬유증/경화증과 약한/중간 섬유증 간의 차이를 나타낸다.

(d) 결론

ELF 연구 분석은 간 섬유증의 혈청 마커를 조합한 본 발명의 양태가 일정 범위의 만성 간 질환을 보유한 환자들의 유의적인 간 섬유증을 90%의 민감도로 동정하는데 사용될 수 있음을 입증한다. 본 발명은 3명의 다른 병리학자의 채점 방식을 비교했을 때 유사한 수준의 민감도를 제공했고, 이는 다른 세팅에서도 유사한 정확도로 이용될 수 있음을 예증한다.

본 발명의 양태는 전문 병리학자들간의 일치 수준, 이미지 분석과의 일치 수준, 섬유증 각 마커의 성능 및 본 발명자들의 임상 실습에서 접하는 가장 일반적인 증상 중 3가지를 비롯한 만성 간 질환의 범위를 진단하는데 있어서의 본 발명의 성능을 평가하여 확인했다.

검사된 환자 코오트에는 다양한 범위의 만성 간 질환을 앓고 있는 환자가 포함되었다. 이러한 코오트를 평가하는 본 발명에 따른 양태의 성능은 다양한 범위의 간 장애 중에서 유의적인 정도의 섬유증을 보유한 환자를 동정하는데 사용될 수 있음을 보여주었다. 알고리듬의 역치 점수의 변화에 따른 민감도 및 특이성의 변화는 본 발명이 사용된 검사 역치에 따라 유의적인 간 섬유증의 존재 여부를 검출하는데 있어서 높은 정확도로 사용될 수 있음을 나타낸다.

더욱이, 본 발명의 결과는 진행성 만성 간 질환을 보유한 환자의 섬유증 억제를 지향하는 치료 시술을 모니터링하는데 유용하다는 것을 나타낸다. 간 섬유증이 가역적 공정이라는 인식은 항섬유증 치료법의 개발에 상당한 영향을 미쳤다. 항섬유증 약물의 평가는 효능을 측정하는 연구자들이 사용하는 진단 검사에 따라 달라질 수 있다. 간 생검의 반복적이고 빈번한 사용은 윤리적 또는 실용적이지 못하다. 또한, 생검은 표본 오차 및 해석의 변화도 겪기 쉽다. 본 발명은 새로운 항섬유증 치료법의 평가에 사용되는 결과 척도로서 조직학적 단계의 변화를 평가하는 더욱 실용적이고 허용성인 대안을 제공한다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 양태들이 생활 양식의 변화에 대한 질병 진행 또는 반응, 예컨대 C형 간염 또는 알코올성 간 질환에서 알코올 흡수의 감소, 및 NAFLD 및 C형 간염에서 체중 감소 등을 모니터링하는 데에도 유용하다는 것을 확인했다.

전술한 결과들은 본 발명의 양태가 간학의 임상 실습에서 접하는 3가지 주요 질환인 C형 간염, NAFLD 및 알코올 간 질환의 상태 및 진행의 진단에 있어서 특히 양호한 능력이 있음을 보여준다. 이러한 각 질환에서, 적당한 검사 역치를 선택하면 90%를 초과하는 PPV 또는 NPV가 수득될 수 있고, 이것은 본 발명이 상기 장애가 있는 환자들의 유의적인 섬유증의 존재를 확인하거나 논박하는 임상 실습에 있어서 상당히 유용하다는 것을 시사한다.

C형 간염에 대한 최근 연구에서는 쉽게 이용할 수 있는 생화학 및 혈액학 검사를 조합한 지표들의 유사한 수준의 성능이 보고되었다[Forns, et al., Hepatology 2002; 36: 986-992; Wai, et al., Hepatology 38, 518-526, 2003]. 이러한 연구는 섬유증이 유의적이 되는 시점에 대한 가정을 하게 했고, 검사 세트의 데이터 분석으로부터 섬유증의 단계 시점을 얻기내기 보다는 이변량 로지스틱 회귀를 이용하여 알고리듬을 유도했다.

C형 간염의 상태 또는 진행을 진단하는데 있어서, 본 발명은 항바이러스 치료법의 잠재적 이점과 시기를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명자들의 분석들은 비알코올성 지방 간 질환 환자에서 본 발명이 유의적인 섬유증 없이 비교적 양성인 지방증을 보유한 대다수의 환자로부터 유의적인 섬유증의 위험이 있는 소수의 환자를 구분하는데 사용될 수 있음을 보여준다.

알코올성 간 질환 환자의 경우에는, 본 발명자들이 검사한 결과에 따르면 본 발명의 양태가 민감도와 특이성이 100%에 달하는 최고 수준의 성능을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

이러한 데이터들은 본 발명의 양태가 유의적인 섬유증의 위험이 있는 환자들의 동정은 물론 간 섬유증이 거의 없는 알코올성 간 질환을 보유한 대부분의 환자들의 동정에도 사용될 수 있음을 시사한다.

참고 문헌:

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cttgtgctct tccctggaga 120 cctgagaacc aatctcaccg acaggcagct ggcagaggaa tacctgtacc gctatggtta 180 cactcgggtg gcagagatgc gtggagagtc gaaatctctg gggcctgcgc tgctgcttct 240 ccagaagcaa ctgtccctgc ccgagaccgg tgagctggat agcgccacgc tgaaggccat 300 gcgaacccca cggtgcgggg tcccagacct gggcagattc caaacctttg agggcgacct 360 caagtggcac caccacaaca tcacctattg gatccaaaac tactcggaag acttgccgcg 420 ggcggtgatt gacgacgcct ttgcccgcgc cttcgcactg tggagcgcgg tgacgccgct 480 caccttcact cgcgtgtaca gccgggacgc agacatcgtc atccagtttg gtgtcgcgga 540 gcacggagac gggtatccct tcgacgggaa ggacgggctc ctggcacacg cctttcctcc 600 tggccccggc attcagggag acgcccattt cgacgatgac gagttgtggt ccctgggcaa 660 gggcgtcgtg gttccaactc ggtttggaaa cgcagatggc gcggcctgcc acttcccctt 720 catcttcgag ggccgctcct actctgcctg caccaccgac ggtcgctccg acggcttgcc 780 ctggtgcagt accacggcca actacgacac cgacgaccgg tttggcttct gccccagcga 840 gagactctac acccgggacg gcaatgctga tgggaaaccc tgccagtttc cattcatctt 900 ccaaggccaa tcctactccg cctgcaccac ggacggtcgc tccgacggct accgctggtg 960 cgccaccacc gccaactacg accgggacaa gctcttcggc ttctgcccga cccgagctga 1020 ctcgacggtg atggggggca actcggcggg ggagctgtgc gtcttcccct tcactttcct 1080 gggtaaggag tactcgacct gtaccagcga gggccgcgga gatgggcgcc tctggtgcgc 1140 taccacctcg aactttgaca gcgacaagaa gtggggcttc tgcccggacc aaggatacag 1200 tttgttcctc gtggcggcgc atgagttcgg ccacgcgctg ggcttagatc attcctcagt 1260 gccggaggcg ctcatgtacc ctatgtaccg cttcactgag gggcccccct tgcataagga 1320 cgacgtgaat ggcatccggc acctctatgg tcctcgccct gaacctgagc cacggcctcc 1380 aaccaccacc acaccgcagc ccacggctcc cccgacggtc tgccccaccg gaccccccac 1440 tgtccacccc tcagagcgcc ccacagctgg ccccacaggt cccccctcag ctggccccac 1500 aggtcccccc actgctggcc cttctacggc cactactgtg cctttgagtc cggtggacga 1560 tgcctgcaac gtgaacatct tcgacgccat cgcggagatt gggaaccagc tgtatttgtt 1620 caaggatggg aagtactggc gattctctga gggcaggggg agccggccgc agggcccctt 1680 ccttatcgcc gacaagtggc ccgcgctgcc ccgcaagctg gactcggtct ttgaggagcc 1740 gctctccaag aagcttttct tcttctctgg gcgccaggtg tgggtgtaca caggcgcgtc 1800 ggtgctgggc ccgaggcgtc tggacaagct gggcctggga gccgacgtgg cccaggtgac 1860 cggggccctc cggagtggca gggggaagat gctgctgttc agcgggcggc gcctctggag 1920 gttcgacgtg aaggcgcaga tggtggatcc ccggagcgcc agcgaggtgg accggatgtt 1980 ccccggggtg cctttggaca cgcacgacgt cttccagtac cgagagaaag cctatttctg 2040 ccaggaccgc ttctactggc gcgtgagttc ccggagtgag ttgaaccagg tggaccaagt 2100 gggctacgtg acctatgaca tcctgcagtg ccctgaggac tagggctccc gtcctgcttt 2160 gcagtgccat gtaaatcccc actgggacca accctgggga aggagccagt ttgccggata 2220 caaactggta ttctgttctg gaggaaaggg aggagtggag gtgggctggg ccctctcttc 2280 tcacctttgt tttttgttgg agtgtttcta ataaacttgg attctctaac cttt 2334

Claims (34)

1 이상의 시점에서 각 시점의 예측값을 측정하되, 그 예측값의 1 이상의 시점에서의 비교와 비교 데이터 세트가 환자 간 질환의 상태 또는 진행을 확인하는데 이용되고, 상기 환자 예측값이 2 이상의 혈액 마커 및 경우에 따라 1 이상의 보조 마커의 값을 반영하는 데이터를 대조 간 조직병리학적 데이터 및 혈액 마커 데이터를 상호연관시켜 유도한 선형 또는 비선형 함수 알고리듬에 입력하여 계산하여, 환자의 간 질환의 상태 또는 진행의 진단을 보조함을 포함하는 방법.

제1항에 있어서, 비교 데이터 세트는 간 질환과 관련 있는 1 이상의 수치 값, 또는 수치 값의 범위를 포함하고, 혈액 마커는 혈청 마커인 방법.

제3항에 있어서, 비교 데이터 세트는 다음과 같은 검사, 즉, 슈어(Scheuer) 점수(0-4), 변형 이삭(Ishak) 점수 (HAI) A - 계면 간염(0-4), 변형 이삭 점수(HAI) B - 융합 괴사(0-6), 변형 이삭 점수(HAI) C - 반점성 괴사(0-4) 및 변형 이삭 점수(HAI) D - 문맥 염증(0-4) 및 변형 HAI 점수(이삭 점수)(0-6) 중 하나 이상의 검사에 의해 측정된 값에 상응하는 값을 포함하는 방법.

제1항에 있어서, 혈액 마커는 다음과 같은 마커, 즉 N-말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신(Tenascin), 라미 닌(Laminin), 히알루로난(Hyaluronan), MMP-2, TIMP-1, MMP-9/TIMP-1 복합체, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 중 2 이상의 마커 중에서 선택되는 혈청 마커인 방법.

제4항에 있어서, 예측 값은 2 이상의 혈액 마커 값과 경우에 따라 환자의 체중, 성별, 연령 및 혈청 트랜스아미나제 농도로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1 이상의 보조 마커의 값을 반영하는 데이터를 입력하여 계산하는 방법.

제1항에 있어서, 선형 또는 비선형 함수 알고리듬은 판별함수 분석 또는 비모수 회귀 분석을 사용하여 대조 간 조직병리학적 데이터 및 혈액 마커 데이터를 상호연관시킴으로써 유도되는 방법.

제6항에 있어서, 대조 간 조직병리학적 데이터 및 혈액 마커 데이터가 섬유발생 또는 섬유분해, 간 질환을 나타내는 상승된 혈청 마커 수준 또는 다른 간 질환 임상 증상을 나타내는 데이터를 포함하는 방법.

제7항에 있어서, 대조 간 조직병리학적 데이터 및 혈액 마커 데이터는 환자 이외의 다른 1 이상의 피험자에서 측정된 데이터를 기초로 하는 방법.

제7항에 있어서, 대조 간 조직병리학적 데이터 및 혈액 마커 데이터는 환자 에 관한 데이터를 기초로 하는 방법.

제9항에 있어서, 대조 간 조직병리학적 데이터 및 혈액 마커 데이터는 환자 및 환자 이외의 1인 이상의 피험자에 관한 데이터를 기초로 하는 방법.

제1항에 있어서, 선형 또는 비선형 함수 알고리듬은

(a) 피험자 제1 그룹의 혈액 마커 및 조직병리학적 데이터를 포함하는 데이터 세트를 컴파일링하는 단계;

(b) 판별 함수 분석, 비모수 회귀 분석, 분류 수형도(classification tree) 및 신경망(neural network)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 분석 방법론의 적용을 통해 상기 컴파일링된 데이터 세트로부터 선형 또는 비선형 함수 알고리듬을 유도하는 단계;

(c) 피험자 제2 그룹의 혈액 마커 값을 포함하는 데이터를 상기 단계 (b)에서 유도된 알고리듬에 입력하여 피험자 제2 그룹의 확인(validation) 생검 점수 값을 계산하는 단계;

(d) 단계 (c)에서 계산된 확인 생검 점수 값을 상기 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 비교하는 단계; 및

(e) 단계 (c)에서 측정된 확인 생검 점수가 임상적으로 허용되는 관용 수준 내에서 상기 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 상호연관이 없다면, 그러한 관용이 충족될 때까지 다음과 같은 조작, 즉 (i) (1) 상기 피험자 제1 그룹의 데이터 세트를 변경하고, (2) 상기 분석 방법론을 변경 또는 변화시키는 것을 포함하는 기준(들)에 근거하여 알고리듬을 변형시키는 단계, (ii) 상기 피험자 제2 그룹의 혈액 마커 값을 포함하는 데이터를 상기 변형된 알고리듬에 입력하여 피험자 제2 그룹의 확인 생검 점수값을 계산하는 단계, (iii) 상기 변형된 알고리듬을 사용하여 계산한 확인 생검 점수 값이 임상적으로 허용되는 관용 수준 내에서 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 상호연관이 있는지의 여부를 평가하는 단계를 수행하는 단계

에 의해 유도되는 방법.

제11항에 있어서, 알고리듬은 판별함수 분석 또는 신경망의 적용을 통해 유도되고 혈액 마커 값은 혈청 마커 값인 방법.

제1항에 있어서, 환자 예측값은 2 이상의 시점에서 측정되는 방법.

제13항에 있어서, 2 이상의 시점에서 측정된 환자 예측값이 환자의 간 질환의 상태 또는 진행을 확인하기 위하여 비교되는 방법.

제13항에 있어서, 환자 예측값이 판별 점수이고, 판별 점수 하나 이상이 각 시점에서 측정되며, 최고의 판별 점수가 각 시점의 예측값으로서 선택되는 방법.

제5항에 있어서, 트랜스아미나제 농도가 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트-아미노트랜스퍼라제(AST)의 농도를 포함하는 방법.

제12항에 있어서, 선형 또는 비선형 함수 알고리듬이 신경망을 사용하여 유도되는 방법.

다음과 같은 혈청 마커, 즉 N-말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신(Tenascin), 라미닌(Laminin), 히알루로난(Hyaluronan), MMP-2, TIMP-1, MMP-9/TIMP-1 복합체, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 중 적어도 2 이상의 마커의 농도 값에 의해 정의된 선형 또는 비선형 함수 알고리듬을 나타내는 데이터를 함유한 데이터 영역을 포함하는 데이터 구조가 저장되어 있는 컴퓨터 판독가능 매체.

제18항에 있어서, 선형 또는 비선형 함수 알고리듬이

(a) 피험자 제1 그룹의 혈액 마커 및 조직병리학적 데이터를 포함하는 데이터 세트를 컴파일링하는 단계;

(b) 판별 함수 분석, 비모수 회귀 분석, 분류 수형도(classification tree) 및 신경망(neural network)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 분석 방법론의 적용을 통해 상기 컴파일링된 데이터 세트로부터 선형 또는 비선형 함수 알고리듬을 유도하는 단계;

(c) 피험자 제2 그룹의 혈액 마커 값을 포함하는 데이터를 상기 단계 (b)에서 유도된 알고리듬에 입력하여 피험자 제2 그룹의 확인 생검 점수 값을 계산하는 단계;

(d) 단계 (c)에서 계산된 확인 생검 점수 값을 상기 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 비교하는 단계; 및

(e) 단계 (c)에서 측정된 확인 생검 점수가 임상적으로 허용되는 관용 수준 내에서 상기 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 상호연관이 없다면, 그러한 관용이 충족될 때까지 다음과 같은 조작, 즉 (i) (1) 상기 피험자 제1 그룹의 데이터 세트를 변경하고, (2) 상기 분석 방법론을 변경 또는 변화시키는 것을 포함하는 기준(들)에 근거하여 알고리듬을 변형시키는 단계, (ii) 상기 피험자 제2 그룹의 혈액 마커 값을 포함하는 데이터를 상기 변형된 알고리듬에 입력하여 피험자 제2 그룹의 확인 생검 점수값을 계산하는 단계, (iii) 상기 변형된 알고리듬을 사용하여 계산한 확인 생검 점수 값이 임상적으로 허용되는 관용 수준 내에서 피험자 제2 그룹의 간 조직병리학적 점수와 상호연관이 있는지의 여부를 평가하는 단계를 수행하는 단계

에 의해 유도되는 것이 특징인 컴퓨터 판독가능 매체.

다음과 같은 혈청 마커, 즉 N-말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신(Tenascin), 라미닌(Laminin), 히알루로난(Hyaluronan), MMP-2, TIMP-1, MMP-9/TIMP-1 복합체, 알라닌 아미노트랜스퍼라 제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 중 2 이상의 마커의 농도 값에 의해 정의된 선형 또는 비선형 함수 알고리듬을 특유하게 동정하는 적어도 하나의 코드를 포함하고 마이크로프로세서에 의해 판독될 수 있는 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 데이터 구조.

제1항에 따라 예측 함수 및 예측 함수 유래의 값을 특유하게 동정하는 하나 이상의 코드를 포함하고 마이크로프로세서에 의해 판독될 수 있는 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 데이터 구조.

(a) 마이크로프로세서에 의해 판독될 수 있고 제1항에 따른 예측 함수 및 예측 함수 유래의 값을 특유하게 동정하는 하나 이상의 코드를 함유하는 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 데이터 구조; 및

(b) N-말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신(Tenascin), 라미닌(Laminin), 히알루로난(Hyaluronan), MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체 중 적어도 2종 이상의 환자 내 농도를 포함하는 환자의 진단 마커의 값을 검출하고 측정하는 하나 이상의 면역분석을 포함하는 진단 키트.

제22항에 있어서, 컴퓨터 판독가능 매체가 ROM, EEPROM, 플로피 디스크, 하드 디스크 드라이브, CD-ROM 또는 디지털 또는 아날로그 통신 링크인 진단 키트.

제22항에 있어서, 제1항에 따른 예측 함수 및 예측 함수 유래의 값을 동정하는 지침서를 포함하는 진단 키트.

(a) 제1항에 따라 예측 함수 및 예측 함수 유래의 값을 특유하게 동정하는 명령; 및

(b) N-말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신(Tenascin), 라미닌(Laminin), 히알루로난(Hyaluronan), MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체 중 적어도 2 이상의 환자 내 농도를 포함하는 환자의 진단 마커의 값을 검출하고 측정하는 하나 이상의 면역분석을 포함하는 진단 키트.

(a) 마이크로프로세서에 의해 판독될 수 있고 제1항에 따른 예측 함수 및 예측 함수 유래의 값을 특유하게 동정하는 하나 이상의 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 데이터 구조; 및

(b) N-말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신(Tenascin), 라미닌(Laminin), 히알루로난(Hyaluronan), MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체 중 적어도 2종 이상의 환자 내 농도를 포함하는 환자의 진단 마커의 값을 검출하고 측정하는 하나 이상의 면역분석을 포함하는 진단 시스템.

제26항에 있어서, 시스템이 치료 지점 또는 원격 시스템인 진단 시스템.

제26항에 있어서, 시스템이 추가로 N-말단 프로콜라겐 III 프로펩타이드(PIIINP), 콜라겐 IV, 콜라겐 VI, 테나신(Tenascin), 라미닌(Laminin), 히알루로난(Hyaluronan), MMP-2, TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-1 복합체 중 적어도 2종 이상의 환자 내 농도를 입력하는 수단을 포함하는 진단 시스템.

제26항에 있어서, 시스템이 프로세서, 메모리, 입력 장치 및 디스플레이를 함유하는 진단 시스템.

제26항에 있어서, 프로세서가 마이크로프로세서인 진단 시스템.

제1항에 기재된 방법으로 1 이상의 시점에서 측정한 2종 이상의 환자 예측값을 평가하여 환자의 간 질환 상태 또는 진행의 진단을 보조함을 포함하는 방법.

제31항에 있어서, 환자 예측값을 기초로 하여 환자의 치료 과정의 선택을 보조함을 포함하는 것이 특징인 방법.

제31항에 있어서, 환자 예측값을 기초로 하여 환자를 1 이상의 질병 카테고리로의 분류를 보조함을 포함하는 것이 특징인 방법.

간 질환을 앓고 있는 환자에게 간 질환의 치료에 유용한 화합물을 투여하는 단계 및 그 다음 제1항에 기재된 방법에 따라 측정된 환자 예측값을 평가하는 단계를 포함하여, 간 질환의 치료에 유용한 화합물을 평가함을 포함하는 방법.

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