KR20070023323A

KR20070023323A - 리보자임의 자가분해 활성을 경감한 바이-엡타자임의디자인과 이의 센서 또는 바이오칩에의 응용방법

Info

Publication number: KR20070023323A
Application number: KR1020050077800A
Authority: KR
Inventors: 김병기; 김용권; 이윤식; 조수형; 김지은; 김민수; 이상명
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-08-24
Filing date: 2005-08-24
Publication date: 2007-02-28
Also published as: KR100688426B1

Abstract

본 발명은 바이오 물질을 응용한 센서의 개발과 이를 바이오 칩 및 미세유체 칩 시스템으로 응용한 것으로 생체 물질의 센싱(sensing), 감지, 진단 및 유전자 치료분야에 속한다.

엡타머와 리보자임의 결합체인 엡타자임을 개발함에 있어, 기존 연구에서 개발된 엡타자임에서는 목적 물질의 부재시, 자가 분해 반응을 보였으나, 본 발명에서는 목적 물질이 있는 경우에만 리보자임의 자가 분해 반응이 생기도록 스템(stem) I 과 스템 III 내에 엡타머를 함께 퓨전(fusion)하는 디자인을 제작함으로써, 보다 더 민감하고 활성이 좋은 바이-엡타자임의 디자인 방법을 개발하였다. 이를 사용하여 다중채널의 미세 유체칩 시스템 내에서 형광을 통하여 실시간으로 단백질, 세포 및 생체물질 등을 감지하고, 감지한 물질을 다시 질량분석기를 통해 이중적으로 확인하는 신규 엡타자임 칩 시스템을 개발한 것이다.

본 발명의 용도는 시그날 노이즈 없이 생체물질을 감지하고 진단하는 바이오센서를 개발하는 것으로서, 우선 이를 통해 특정 물질을 감지할 수 있는 센서로 사용될 수 있으며, 이를 바이오 칩 내지 미세유체 칩에 적용할 때 형광 및 질량분석기를 통해 이차원적 분석이 가능하여 실시간으로 진단 및 분석 등에 이용할 수 있다.

또한 개발된 디자인을 통해 외부의 물질에 의해 특정 유전자를 절단 할 수 있는 유전자 치료의 연구에도 효과적으로 적용이 가능하다.

리보자임, 엡타머, 엡타자임, 바이-엡타자임, 바이오칩

Description

리보자임의 자가분해 활성을 경감한 바이-엡타자임의 디자인과 이의 센서 또는 바이오칩에의 응용방법{DESIGN OF BIAPTAZYME WITHOUT SELF-CLEAVAGE ACTIVITY OF RIBOZYME AND ITS APPLICATION TO BIOSENSOR OR BIOCHIP DEVELOPMENT}

도 1 은 리보자임과 엡타머를 결합하여 엡타자임을 만들 때 리보자임의 스템(stem) I 과 스템 III 두 부분에 목적물질(단백질, 펩타이드, 세포, 저분자 물질 및 독성물질 등)과 친화력 있는 엡타머 부분을 삽입함으로써, 목적 물질이 없을 때 자가분해로 인한 엡타자임의 영점(블랭크) 활성을 제거하기 위한 바이-엡타자임의 구조의 모식도 이다.

도 2 는 개발된 바이-엡타자임을 미세유체 칩 구동시스템에 응용하여 목적물질(단백질, 펩타이드, 세포, 저분자 물질 및 독성물질 등)을 분석하는 과정의 모식도이다. 이는 비드(bead)에 고정화 된 바이-엡타자임을 사용하여 형광 및 질량 분석기를 이용한 이차원적 분석 방법이다. (가) 에서는 목적 단백질을 넣은 경우 비드에 고정화 되어 있는 바이-엡타자임에 상기 단백질이 결합하게 되고, (나) 에서 형광(fluorescence) 과 형광흡수자(quencher) 가 수식된 기질을 주입하면 바이-엡타자임에 결합하여 (다) 와 같은 기질분해 반응이 일어나게 됨으로써 형광이 관찰된다. 연이어 단백질 분해 효소를 넣게 되면 결합되어 있는 단백질이 펩타이드로 분해되면서 바로 질량 분석기를 사용하여 분석이 가능하다.

도 3 은 바이-엡타자임을 사용하여, 단백질의 농도에 따른 활성의 변화를 시간에 따라 관찰하였다. 좌측 그림은 C형 간염 바이러스 복제효소(replicase)의 농도에 따른 형광의 변화이고, 우측 그림은 C형 간염 바이러스 헬리케이즈(helicase)의 농도에 따른 형광의 변화이다.

도 4 는 다양한 단백질 중 바이-엡타자임들의 목적 물질(단백질, 펩타이드, 세포, 저분자 물질 및 독성물질 등)에 대한 특이적 기능을 확인한 것이다. 좌측 그림은 C형 간염 바이러스 복제효소(replicase)에 대한 바이-엡타자임의 활성을, 비교단백질인 BSA, 난알부민(ovalbumin), C형 간염 바이러스 헬리케이즈(helicase), 목적 단백질이 포함된 혼합단백질과 비교하였으며, 우측 그림은 C형 간염 바이러스 헬리케이즈(helicase)에 대한 바이-엡타자임의 활성을 비교 단백질과 함께 관찰하였다.

도 5 는 다중 미세 유체 칩의 도면으로 상판과 최 하단의 하판은 유리로 되어 있으며, 비드 충진을 위해 식각(etching)된 중간 판은 이들의 접착을 위해 실리콘으로 되어 있다. 전체적으로는 5 개의 채널로 이루어져 있으며, 비드 및 샘플의 유입과 출입을 위해 각각 채널 끝에 구멍을 가지고 있다.

도 6 은 실시간 형광 분석을 위하여, 제작된 다중 채널 미세 유체 칩의 다중 초점 현미경의 장착 구조이다.

도 7 은 다중 미세 유체 칩내로 C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 바이-엡타자임 고정화 비드를 유입 한 후, 각각 0 nM, 100 nM, 500 nM, 1000 nM 의 C형 간염 바이러스 헬리케이즈를 흘려준 후, 기질과 반응시켜 10 분 후 다중 초점 형광 현미경으로 관찰한 그림과 형광의 세기를 그래프로 나타낸 것이다.

도 8 은 다중 미세 유체 칩 내로 C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 바이-엡타자임 고정화 비드를 유입 한 후, 특이성을 측정하기 위해, 500 nM BSA, 난알부민, C형 간염 바이러스 복제효소, C형 간염 바이러스 헬리케이즈와 이들의 혼합물들을 주입하여 동시에 다중 초점 형광 현미경을 통하여 측정한 결과이다.

도 9 는 도 7 에서 목적 물질의 농도에 따라 반응시킨 후, 형광의 관찰 후, 트립신을 주입하여 분해되어 나오는 펩타이드를 매트릭스 보조 레이저 탈착 비행시간형 질량분석기 (MALDI-TOF) 를 사용하여 분석한 그림이며, 별표(*)는 C형 간염 바이러스 헬리케이즈 단백질에 해당하는 펩타이드를 의미한다.

본 발명은 엡타자임의 영점(블랭크) 활성이 없는 바이 엡타자임을 디자인하고, 이의 센서 및 바이오칩에 이를 응용함으로써, 생체물질(단백질, 펩타이드, 세포, 저분자 물질 및 독성물질 등)의 분석 및 진단과 치료를 위한 시스템 개발에 응용하고자 하는데 그 목적이 있다.

리보자임은 RNA 로 이루어진 활성을 가지는 효소로서, RNA 의 특정 염기 서열을 인지하여 그 부위를 자를 수도 있고, 이어 붙일 수도 있는 기능이 있다. 이러한 다양한 리보자임 중에서 매우 작으면서도, 그 활성이 높은 리보자임중에 하나가 해머헤드(hammerhead) 리보자임이다. 해머헤드 리보자임은 스템 I, II, III (stem I, II, III) 으로 이루어져 있으며, 금속 이온의 도움으로 활성을 띠어, RNA 기질을 자르거나, 다시 붙이는 활성을 지니고 있다. 일반적으로 특히 스템 중 스템 II 부분이 구조적으로 효소의 활성에 매우 중요한 영향을 끼치는 것으로 알려져 있어서 기존에 스템 II 부분의 서열이나 길이를 조절함으로써, 리보자임의 활성을 증가시키는 연구가 진행되고 있다.

이와 더불어 특정 생체 물질에 대해 높은 친화력을 가지는 RNA/DNA 로 이루어진 엡타머(US5459015, US5475096)라는 물질이 in vitro 진화(evolution) 방법에 의해 개발되었고, 이 방법을 통해 엡타머는 항체와 같은 역할을 수행하여 왔으며, 수많은 응용이 되고 있다.

리보자임과 엡타머의 특징을 결합함으로써 엡타자임이라는 새로운 기능성 RNA 가 탄생하게 되었는데, 이는 기존에 개발된 엡타머를 리보자임의 스템 II 지역과 서로 결합시켜, 엡타머의 목적물질에 의해 리보자임의 활성을 증가시키도록 유도함으로써, 목적물질을 감지하거나 또는 역으로 리보자임의 활성을 증가시키기 위한 방편으로 개발된 것이다(미국 특허 제 5,663,065 호, Tang, et al,(1997)).

엡타머와 리보자임의 결합체인 엡타자임을 통하여 바이오 센서의 개발을 위한 목적물질로서는, 저분자 물질 (Koizumi,M.,(1999), Robertson,M.P.(2000)), 고분자 물질(Robertson,M.P.(2001)) 및 단백질 (Hartig,J.S., (2002)) 에 이르기까지 다양한 물질들이 있으며, 이들에 대하여 상기 엡타자임을 통한 바이오 센서가 개발되어 왔다. 이런 퓨전(fusion) 방법 이외에도, 리보자임의 스템 II 와 연결된 루프(loop) 부분을 무작위화(randomization)하여, in vitro 진화 방법으로 그 목적 물질의 활성을 증가시키는 리보자임을 찾아내는 방법도 사용되고 있다.

종래 제조되어 왔던 엡타자임의 경우, 목적 물질이 존재 하지 않는 경우에 있어서도 자가 분해 반응을 일으킴으로써 엡타자임의 영점(블랭크) 활성이 존재하며, 이로 인해 상대적으로 리보자임의 활성이 감소된다는 문제가 발생하였다. 이를 극복하기 위하여 엡타머와 리보자임의 연결 부분을 무작위화하여, 이를 in vitro 선택(selection) 에 의해 엡타자임만 존재할 때에 있어서 자가 분해 반응이 없는 엡타자임을 찾아내는 방법이 사용되었다(Soukup, G. A, (1999)). 또다른 방법으로서는 처음부터 in vitro 선택 방법으로 리보자임을 고정하고, 수많은 RNA 라이브러리(library)로부터 자가 분해활성이 없는 엡타자임을 선택하는 방법이 제안되었다(Robertson, M.P.,1999).

그러나, 상기 방법을 통하여 종전의 리보자임의 영점(블랭크) 활성의 문제를 특수한 목적 물질에 대한 경우에 대해서는 해결할 수 있으나, 이는 극소수의 경우에만 적용이 되며 이미 밝혀진 엡타머를 사용하여 엡타자임을 만드는 경우에는 사용할 수 없으며, 새롭게 다시 엡타자임을 개발하여야 하는 문제가 있고, 또한 제조과정에 걸리는 수개월이 걸리기 때문에, 상기 방법은 일반적으로 사용될 수 없다는 문제점이 있다. 그러나 엡타머와 리보자임을 퓨전하는 방식을 사용하는 경우, 제조 시간을 줄일 수 있으며, 현재까지 다양한 엡타머들이 개발되었기 때문에 수많은 엡타자임 센서를 개발할 수 있다. 이러한 퓨전방식의 엡타자임 중 목적 물질에 상관없이 자가 분해의 방지가 가능한, 일반적인 엡타자임의 구조를 발견할 수 있다면, 이는 실로 센서 개발에 필요한 막대한 노력과 시간 및 비용을 줄일 수 있는 방법일 것이다. 그러나 이렇게 만들어진 엡타자임들도, 목적 물질의 부재에도 자가 분해가 소량 일어남으로써 엡타자임의 영점(블랭크) 활성이 존재한다는 문제가 있다. 따라서, 이를 해결하기 위해 이러한 엡타자임의 영점(블랭크) 활성을 줄일 수 있는 새로운 디자인의 퓨전형태가 필요하다.

이러한 엡타자임이 개발된다면, 이를 바이오 센서에서부터 바이오 칩이나 미세유체 칩 시스템 및 유전자 치료 도구 등 에 응용할 수 있을 것이다. 지금까지는 바이오 칩을 이용하여 생체물질을 분석하기 위해, 기본적으로는 항체를 이용한 방법이 널리 사용되었다. 그러나 이를 위해서는 효소나 형광물질이 수식되어 있는 2 차 항체가 필수적으로 필요하며, 분석을 위해 각 단계 마다 오랜 반응시간과 세척시간이 필요하고, 온도에 민감한 항체를 상온에서 오랜 기간 사용할 경우, 단백질의 변성이 유도될 수도 있기에, 항체를 이용한 방법은 많은 문제점을 가지고 있다. 또한, 형광을 이용한 분석방법 이외의 방법으로서 최근 많이 사용되고 있는 질량 분석기를 이용한 분석방법이 있는데, 이를 위해서는 리간드에 결합되어 있는 항원을 용출해야할 필요가 있다. 이를 위해 항체를 사용하는 경우에 있어서는, 극도의 pH, 높은 염, 세정제(detergent)와 같은 강한 자극적인 용출체를 사용하게 되는데, 이로 인하여 항체 리간드 및 항원의 성질이 변할 수도 있으며, 이를 분석하기 위하여 연달아 필수적으로 사용되는 단백질 분해효소의 처리에도 영향을 미치게 된다. 또한, 질량분석기로 분석하기 위해서는, 용출액 내에 들어있는 불순물들로 인하여 부가적인 용출액의 정제과정이 필수적으로 요구된다.

이와 같은 문제점들을 해결하기 하기 위하여, 바이오 칩이나 미세유체 칩 시스템에 응용되고 있는 리간드로써, DNA 또는 RNA 엡타머가 사용되고 있다 (Deng, Q. (2003), Buchanan, D.D.etc.(2003), Cho, S. etc. (2004)). 이경우, 리간드는, 항체와 같은 단백질이 아닌, 뉴클레오티드이므로, 열이나 직접적인 단백질 분해 효소에 의해 바로 용출이 가능하므로 이의 분석을 위해 별도의 분리과정이 필요없고, 리간드의 변성없이 사용할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 다양한 항원에 대해서 항체와 비슷하거나 높은 친화력을 가지고 있는 엡타머를 바이오 칩에 사용할 경우, 시간적 소모를 줄일 수 있을 뿐만 아니라 더욱 민감한 감지가 가능하다. 이를 통해 엡타자임의 자가 분해 반응이 일어나는 기질의 양 끝에 주개(donor) 형광물질과 받개(acceptor) 형광 물질을 각각 수식함으로써, 실시간으로 이들의 반응을 관찰할 수 있는데, 이들의 장점은 항체와 달리 2차 항체가 필요하지 않으며, 기질에 의해 직접적으로 항원의 존재를 실시간으로 수 분 내에 관찰할 수 있으며, 기질의 양에 따라 시그널을 증폭 할 수 있어서 미량의 시약에 대해서도 민감하게 감지할 수 있다는 것이다. 단, 이들의 단점은 이전에도 언급한 바 있지만, 엡타머 또는 엡타자임 센서에서, 항원이 없을 경우에도 자가 분해 반응이 소량 일어남으로써 엡타자임의 영점(블랭크) 활성을 유발할 수 있다는 것이다.

본 발명은 엡타머를 리보자임과 퓨전하여 목적 물질에 대한 친화도 및 활성도를 가지며, 자가 분해 활성을 보이는 리보자임의 엡타자임을 새로이 디자인 하여, 목적 물질의 부재시 자가 분해 반응이 일어나지 않고, 목적 물질이 존재하는 경우에만 높은 자가 분해 반응이 일어나는, 새로운 알로스테릭 바이-엡타자임(Allosteric Biaptazyme)의 구조를 제공한다.

또한, 본 발명은 디자인된 바이-엡타자임을 사용하여 이를 바이오 칩 및 미세유체 구동칩 시스템으로의 응용을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로서, 당업자라면 누구나 그 의미를 쉽게 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서는 이하에서 간략히 설명하기로 한다.

① 엡타머; 특정 물질에 대해 친화력을 가지고 있는 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드이다.

② 리보자임 : RNA 로 이루어져 효소와 같은 활성을 지니고 있는 물질로서 다양한 종류가 있으나, 본 발명에서는 크기가 작으며, 활성이 좋은 해머헤드(hammerhead) 리보자임을 사용하였다. 특히 해머헤드 리보자임은 자가 분해 반응의 활성을 지니고 있다.

③ 엡타자임 : 엡타머와 리보자임의 합성어로 두가지의 기능을 모두 가지고 있는 형태로서, 목적물질이 엡타머에 붙게 되면 리보자임 부분의 활성이 증대되는 기능을 가지고 있다.

④ 프렛 분석(FRET assay) : 프렛(FRET) 은 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence resonance energy transfer) 의 약자로서, 형광을 내는 색소(dye)와 형광의 발광 파장의 빛을 흡수하는 화학물질이 근접한 곳에 있으면 형광의 발광을 억제하며, 다시 적정 이상의 거리에 있을 때는 형광을 발광하게 되는 메커니즘을 이용한 방법으로서, 본 발명에서는 기질의 분해정도를 이를 통하여 분석하였다.

1) 바이-엡타자임의 디자인 및 개발

① 엡타머와 리보자임의 퓨전을 통한 바이-엡타자임의 설계

엡타머를 퓨전시, 기존의 엡타머의 영역 중 우선 목적 물질과 결합 부위를 선택하여야 한다. 또한 결합 후 엡타머 영역 부분의 구조가 변하거나 리보자임의 다른 부분과 상호작용을 하지 않아야 하므로, 연결할 마감 부분을 스템(stem)으로 처리하여, 보다 더 안정한 구조를 이루도록 한다. 바이-엡타자임은 리보자임의 스템 I 과 스템 III 두 부분의 중간에 엡타머를 연결하는 구조이다(도 1). 우선 기본 리보자임의 구조에, 상기 엡타머 결합부분의 서열을 삽입해 보고, 이를 확인하기 위해 두 개의 RNA 가닥(strand) 의 상호 작용에 의한 구조(structure)를 예상할 수 있는 RNA 2차 구조 예상 프로그램, [RNA structure 4.1 version (Mathews, H. 1999)] 을 사용하여, 이들의 구조의 유지를 확인한다. 만약 리보자임 또는 엡타머의 구조의 변형이 일어나면, 연결 부위의 스템 길이 또는 기질의 개수를 조금씩 변화시켜 안정된 구조를 찾아낸다. 이때, 리보자임과 엡타머의 퓨전시, 연결 stem 이 너무 길면 (> 6) 구조가 변할 수 없을 정도로 너무 강한 결합을 하게 되고, stem 의 길이가 너무 짧으면 (< 4) 너무 약하게 결합하여 안정한 구조를 이루는 것이 힘들기 때문에, 연결고리부분의 RNA 의 수를 4 내지 6 정도로 제한하여, 적당한 길이로 조절해야 한다. 그리고 퓨전할 때의 엡타머의 삽입 위치가 매우 중요한데, 이를 삽입할 때, 기질과 리보자임의 상호 작용(complementary reaction) 시, 이의 길이가 모두 동등 내지 비슷하게 등분되어야 한다. 즉, 바이-엡타자임의 경우, 리보자임의 모두 4 부위에서 기질과 상호작용을 하여 활성을 띠게 되는데, 이때 4 부분의 각각의 수가 비슷해야 한다. 또한, 기질의 길이가 너무 길어지게 되면 안정화되어 자가분해 반응이 일어날 수 있으므로, 전체기질의 길이가 염기 10-25 머(mer) 안팎으로 지정하고, 이를 비슷한 상보적인 짝으로 등분하여 나눈다.

② 바이-엡타자임의 RNA 구조 생성 예측 후, DNA 서열로부터 RNA 의 생산

DNA 서열을 합성시, RNA 를 제조 할 수 있도록 5 프라이머(primer) 와 바이 엡타자임 DNA 서열의 앞 부분에 T7 프로모터(promoter) 영역의 서열을 포함해준다. 각각 5 프라이머와 3 프라이머를 합성하고 이것을 가지고 PCR 을 통해 이중 가닥 DNA 를 증폭 시키고, 이를 페놀/클로르포름으로 추출하고, 에탄올 침전방법을 사용하여 정제를 한 후, DEPC 에 녹여, DNA 농도를 측정한다. 그 후 DNA 를 in vitro 전사(transcription) 하여, RNA 로 전사하게 한 후, DNAse 로 처리하고, 이를 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전 시킨다. 그 후 유레아/PAGE 겔을 사용하여 원하는 크기의 RNA 만을 정제, 용출하여, 다시 정제과정을 되풀이 하여 얻어낸다.

③ 바이-엡타자임을 통한 목적 물질 감지

생성된 바이-엡타자임을 통해 목적물질에 대한 활성 변화를 관찰하기 위하여, 본 발명에서는 프렛 분석(FRET assay)을 사용하였다. 기질의 5 쪽에는 형 광 색소(dye)를 수식하였고, 3 쪽에는 형광 색소를 흡수 할 수 있는 형광 흡수자(quencher) 를 수식하였다. 우선 기질이 들어가는 순간에 활성이 시작되므로, 우선 바이-엡타자임과 목적 물질을 반응시키고, 그 다음 기질을 넣자마자 시간에 따라 형광의 변화를 볼 수 있다.

2) 바이-엡타자임을 사용한 바이오 칩 및 미세유체 칩 시스템으로의 응용

또한 본 발명은 바이-엡타자임을 이용하여 미세유체 칩에서 실시간으로 다중의 시료를 감지하고 분석하는 응용을 포함하고 있다. 우선 다중채널 미세유체 칩의 디자인 및 제작 단계, 바이-엡타자임을 고정화하기 위한 비드의 제조과정, 특히 다중 형광 현미경(confocal microscopy)과 질량 분석기의 이중 분석을 통한 시스템 내의 프로토콜(protocol) 및 분석 방법에 관한 내용으로 구성되어 있다.

① 바이-엡타자임 도입한 미세유체 칩 시스템내에서의 생체물질 분석

1) 에서 개발된 바이-엡타자임의 끝에 기능기를 도입하여 비드에 고정화 시킨 후, 이를 미세 튜브를 통해 바이오 칩 또는 미세유체 칩내로 주입한다. 이때, 칩 내부에는 필터가 내장되어 있어서 비드는 빠지지 않고 용액만 외부로 나오게 된다. 이어서, 분석하고자 하는 생체 물질을 비드가 채워져 있는 곳으로 미세 주사기(syringe) 펌프를 사용하여 외부의 압력을 가하며서 주입하여 반응시킨다. 다음 완충용액을 사용하여 반응하지 않은 용액을 외부로 밀어내고, 또한 칩 내부 및 비드를 세척한다. 그 후, 양 끝에 형광과 형광 흡수자가 붙어 있는 기질을 주입하여 비드가 채워진 필터로 밀어넣어 반응시킨다. 주입으로부터 시 간에 따른 형광의 세기를 다중 초점 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 관찰한다. 실시간으로 관찰한 후, 형광이 보이는 비드가 채워져 있는 라인에, 단백질의 경우 단백질 분해효소를 주입하여 방치한 후, 이 용액을 출구로 빼내어 바로 질량분석기로 측정한다. 이러한 분석 방법에 대한 그림은 도 2 에 나타내었다.

실시예 1

1) 엡타자임의 영점(블랭크) 활성이 없는 바이-엡타자임의 디자인

① C형 간염 바이러스 복제효소( replicase ) 와 C형 간염 바이러스 헬리케이즈(helicase) 에 대한 바이 - 엡타자임의 개발

C형 간염 바이러스 복제효소와 C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 엡타머 중, 이들과 단백질의 결합 부위를 우선 조사한 후, 이들의 최소 부위를 선택하였다. 또한, RNA 2 차 구조를 예상하여 최소 부위를 엡타머 부위의 구조 안정성에 대하여 확증하였다. 그 후, 리보자임의 스템 I 과 스템 II 부분의 중간 부위에 이들을 각각 삽입하였다. 이때 사용한 기질의 염기수가 총 16 머(mer) 인데, 이 중 중간의 1 머 는 리보자임에 의해 절단되는 부위이므로, 기질과의 상호작용(complementary)할 수 있는 수는, 총 15 머 가 되었다. 이를 균등하게 나누어 4 - 4 - 4 - 3 비가 되도록 각각 엡타머 영역을 리보자임에 삽입하였고, 이의 구조적 안정성을 고려하기 위해 RNA 2차 구조 예상 프로그램을 통하여 구조의 안정성을 확인하였다. C형 간염 바이러스 복제효소에 대한 바이-엡타자임의 서열은 qCGACCGACTGATGATGAGCGAAAGCGAAACCCAGGCGCCACATTG TGAGGGGCGCCACGG 이고, C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 DNA 서열은 TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCAGGGCAGTAGTGTATAGGCCCACCGACTGATGATGAGCGAAAGCGAAACCCAGCCAGTAGTGTATAGGGCACGG 이었다. 이들은 T7 프로모터를 가지고 있는 5' 프라이머와 3' 프라이머를 이용하여, PCR 을 진행하여 증폭시켰다. 페놀/클로로포름 과 에탄올 침전으로 정제 한 후, T7 RNA 중합효소(polymerase) (Promega, WI, USA) 와 NTP, RNase 저해제(inhibitor), T7 RNA 중합효소 완충용액, DTT 5 mM 을 사용하여 37 ℃ 에서 4 시간 동안 반응시켰다. 생성된 모든 RNA 로부터 남아있는 DNA를 제거하기 위해 DNase 를 처리 한 후, 다시 정제 과정을 거쳐서 DEPC 에 녹였다. 상기와 같이 만들어진 RNA 를, 8 M 유레아(urea) 를 포함한 6 % PAGE 을 통하여 분리 한 후, 다시 정제과정을 통하게 하였다. 그리고 DEPC 에 녹인 후 사용 전까지 -80 ℃ 에서 보관하였다.

② 프렛 분석(FRET assay)을 사용한 목적 단백질에 따른 바이-엡타자임의 활성 변화

목적 단백질에 따른 바이-엡타자임의 활성을 관찰하기 위하여, 기질 양쪽에 각각 6-카르복시플루오레신(6-carboxyfluorescein; (6-Fam)) 과 4-디메틸아미노아조벤젠-4'-술포닐 클로라이드 (답실(dabcyl)) 을 붙여서 6-Fam-CCGGGGUCUCGGGGCC-답실 의, 16 머 의 합성 RNA 를 사용하였다.

우선, 바이-엡타자임의 구조를 이루게 하기 위하여, 80 ℃ 에서 3 분 동안 두었다가, 상온에서 10 분간 방치한 후, 1 M 의 C형 간염 바이러스 복제효소와 C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 바이-엡타자임을 10 mM 트리스(Tris)-HCl, 100 mM KCl 및 10 mM MgCl₂ (pH 7.6) 조건의 반응 용액에서, 그들의 목적 단백질과 반응시켰다. 반응 후 1 M 의 기질을 넣자마자 형광분광광도계로 형광을 측정하였다. 그 결과, C형 간염 바이러스 복제효소와 C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 바이-엡타자임이, 단백질의 농도가 50 nM 부터 증가하면서 이들의 활성이 선형적으로 증가함을 보였고, 거의 기질을 넣자마자 상기 활성이 보이기 시작했다(도 3). 이때, 도 3 의 좌편이 C형 간염 바이러스 복제효소에 대한 바이-엡타자임이며, 우편이 C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 바이-엡타자임의 활성을 나타내는 것이었다. 특히 단백질을 넣지 않은 경우, 즉 0 nM 의 복제효소와 헬리케이즈의 경우 5 분이 지나도, 이들의 형광 변화가 없었다. 즉, 이는 바이-엡타자임의 경우 목적물질의 부재시, 그들의 자가 분해 활성을 전혀 보이지 않는다는 것을 의미하였다.

③ 바이-엡타자임의 목적 단백질에 대한 특이성 조사

엡타자임의 영점(블랭크) 활성이 없는 바이-엡타자임의 타 물질에 대한 특이성을 살펴보았다. 이를 위해 200 nM 의 BSA, 난알부민(ovalbumin), C형 간염 바이러스 복제효소 또는 C형 간염 바이러스 헬리케이즈, 그리고 이들의 혼합물에 대한 바이-엡타자임의 특이한 활성을 유지하는지를 측정 1 분 후 확인하였다. 그 결과, 도 5 의 위 그림인 C형 간염 바이러스 복제효소 바이-엡타자임의 경우, 그들의 목적 물질인 복제효소에서만 활성을 보이고, 혼합물의 경우에서도 거의 비 슷한 활성을 나타냈다. 도 4 의 아래 그림인 C형 간염 바이러스 헬리케이즈의 경우에서도 마찬가지로, 그의 활성은 목적물질에서만 나타냄을 확인하였다.

2) 바이-엡타자임을 도입한 미세유체 칩 시스템으로부터 이차원적 단백질 분석

① 다중채널 미세유체 칩의 제작

다중채널 미세유체 칩은 마이크로 머시닝(MEMS: micro electro mechanical system) 기술에 의하여 제작되었다. 도 5 는 제작된 다중채널 미세유체 칩의 입체 구조를 나타내었다. 특히 주입된 마이크로 비드(microbead)를 채널 중간에 포획하기 위한 출구 쪽에 필터를 형성하였다. 다중초점현미경(confocal microscopy)에서 형광 분석을 위해 조사한 레이저(laser)에 대한 투과성을 고려하여, 유리-실리콘-유리 3 층 구조로 제작하였다. 제작 과정으로서, 우선 하단부의 유리 기판을 실리콘 웨이퍼와 양극 접합(silicon-glass anodic bonding) 수행 한 후, 접합된 실리콘 웨이퍼가 적절한 높이를 갖도록, 약 90 ℃ 의 40 % (v/v) 수산화칼륨(KOH))을 사용한 습식 식각(wet-etching) 및 표면을 매끄럽게 하기 위한 폴리싱(CMP: chemical mechanical polishing)을 수행하였다. 접합 및 박막 공정된 실리콘-유리 구조에 감광성 폴리머(photoresist)막을 형성하고 사진공정(photo-lithography)을 사용하여 패턴을 형성한 후, 실리콘 표면이 드러난 패턴만을 선택적으로 실리콘 수직 식각하여 (silicon deep reactive-ion- etching(RIE) system) 채널을 형성한다. 상단부의 유리층에 주입구과 출구를 모래 분사 공법 (powder-blasting)을 사용하여 형성하고, 이를 다시 제작된 실리콘-유리 하단 구조체와 양극 접합을 수행하였다. 도 6 은 제작된 미세 유체 칩 내 형광을 통한 반응의 여부를 보기위해 다중초점 현미경에 칩을 장착한 모식도이다.

② C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 바이 - 엡타자임을 도입한 미세유체 칩 시스템내로부터 형광을 통한 정량 분석

우선 C형 간염 바이러스 헬리케이즈에 대한 RNA 바이-엡타자임을 PCR 과 in vitro 전사에 의해서 얻은 후, 이의 3' 끝부분에 아민 작용기로 표지(labeling)한 후, 앞서 제작 한 비드와 포스페이트 완충용액 (pH 8.0, 50 mM)에서, 상온에서 3 시간 동안 반응시켰다. 외부 주사기(syringe) 압력을 가하여 200 pmol 의 바이-엡타자임의 고정화되어 있는 각각의 동일한 양의 비드를 주사기 각각의 칩 내부로 주입하여, 비드 필터 내로 채웠다. 용액을 밖으로 모두 내보내고 이어서, 100 nM, 200 nM, 300 nM, 500 nM 의 단백질 농도를 달리하여 각각의 채널내로 동량을 주입하였다. 비드를 모두 각각의 용액으로 채운 후, 10 분 후, 이들의 형광의 세기를 다중 초점 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. C형 간염 바이러스 헬리케이즈의 경우, 도 7 에서 보는 바와 같이, 각각 농도의 증가에 따라 y = 0.0487 x + 0.1184 (r² = 96%, x = C형 간염 바이러스 헬리케이즈 농도 (nM) 및 y = 평균 형광도(average fluorescence intensity))의 식에 따라서 선형적으로 형광의 증가를 볼 수 있었다.

③ 미세유체 칩 내에서 목적 단백질에 대한 바이- 엡타자임의 특이성

바이-엡타자임을 도입한, 미세 유체 칩 시스템이 실제로 단백질을 특이적으로 감지 할 수 있는지를, 다른 단백질의 경우 및 이들의 혼합물의 존재 하에서, 이들의 형광 세기를 비교하였다. 도 8 의 경우, 목적 단백질인 500 nM 의 C형 간염 바이러스 헬리케이즈와 동량의 BSA, 난알부민(ovalbumin), C형 간염 바이러스 복제효소, 및 이들 모두를 합한 단백질 10 μl 를 동시에 주입하여, 10분 후 이들의 형광을 비교하였다. 그 결과, C형 간염 바이러스 헬리케이즈의 존재에서만, 형광이 뚜렷하게 나타나며 특히 혼합 단백질의 경우 거의 순수한 C형 간염 바이러스 헬리케이즈의 경우와 비슷한 경향을 볼 수 있었다. 이를 통해, 실제로 혈액이나 복합 생체 물질로부터 바이-엡타자임을 이용한 상기와 같은 시스템이, 실시간으로 목적 물질의 특이적인 분석이 가능하게 함이 증명되었다.

④ 질량 분석기를 이용한 칩으로부터 용출된 C형 간염 바이러스 헬리케이즈의 분석

형광에 의해 관찰된 단백질의 여부를 더욱 정확하게 정성 분석하기 위하여, 각각의 비드를 세척한 후 비드 채널 안으로 트립신 단백질 분해 효소를 주입하였다. 단백질이 바이-엡타자임에 결합되어 있는 경우, 이들은 트립신에 의해 분해가 되어 질량 분석기로 이들의 단백질 서열을 유추해 낼 수 있을 것이고, 바이-엡타자임에 대해 친화력이 없는 단백질이 있는 경우에는 어떠한 단백질도 감지되지 않았다. 도 9 에서 같이 농도의 증가에 따라 질량 분석기로 분석되는 목적 단백질의 분해된 형태인 펩타이드가 많이 관찰됨을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 형광분석을 통한, 농도에 대한 형광의 선형적인 경향과 그 패턴이 유사하였다. 또한, BSA 나 난알부민, C형 간염 바이러스 복제효소와 같은 다른 단백질과 반응한 경우, 트립신 에 의해 분해된 펩타이드는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, 형광을 통한 특이성 결과와 동일한 것으로서, 이 두 가지 방법을 함께 사용함으로써 진단 및 감지 등에 있어서 더욱 데이터의 신뢰성을 높일 수 있게 되었다.

자가 분해 반응이 일어나는 종전의 엡타자임과는 달리 시그날 노이즈가 없는 본 센서의 발명을 통하여, 보다 더 정확하고 빠르게 분석 및 진단에 이용될 수 있으며, 이를 적용하여 바이오 칩과 미세 유체 칩 구동 시스템에 응용함으로써 빠른 시간 내에 목적 물질을 분석할 수 있는 효과를 볼 수 있다. 특히, 형광분석 및 질량분석을 통한 멀티 감지 시스템을 함께 진행할 수 있기 때문에 분석의 신뢰도를 높일 수 있다.

또한 리보자임을 통한 목적 유전자의 기능을 억제하는 연구 및 유전자 치료 분야에 이 엡타자임을 도입함으로써, 더욱 활성이 좋고, 노이즈를 줄일 수 있는 시스템을 구축하는데 응용할 수 있다.

Claims

리보자임의 스템(stem) I 과 스템 III 을 포함하는 복수의 스템에, 엡타머 또는 외부의 다른 서열의 DNA 또는 RNA 를 단일 또는 복수개 삽입하여, 엡타자임의 영점(블랭크) 활성이 없고, 구조적으로 안정한 엡타자임을 디자인하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법에 의하여 제조된 바이-엡타자임 중 스템 I 과 스템 III 에 동일 또는 상이한 종류의 엡타머 서열을 삽입하여, 한 개 이상의 다른 목적 생체물질(단백질, 펩타이드, 세포, 암 마커,저분자 물질 및 독성물질 등)을 동시에 측정 또는 검출하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 엡타자임 중 동일한 엡타머 서열을 삽입하였을 때 스템 II 에 퓨전(fusion)한 단일 엡타머를 사용하는 엡타자임보다 목적 생체물질에 대한 결합 반응성이 민감하고, 엡타머의 목적물질의 농도에 대한 선형구간이 넓은 엡타자임을 디자인 할 수 있는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 디자인 및 유사서열을 바이오 칩, 센서, 유전자 조절, 생체 내 유전자치료 및 미세유체 칩 시스템에 이용하는 방법.
제 1 항, 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 바이-엡타자임을 비드 혹은 표면 에 고정화하여 단백질, 펩타이드, 세포, 저분자 물질 및 독성물질 등을 감지하는 방법.
제 1 항에 있어서, 바이-엡타자임의 디자인 시, 바이-엡타자임과 기질의 상보적인 서열을 이루는 염기짝의 길이가 2 내지 20 머(mer) 이고, 짧은 길이의 상보적인 서열이 기질의 서열 안에 총 3 개 이상이 되도록 설계한 엡타자임 및 그와 유사한 구조.
제 2 항에 있어서, 특히 C형 간염 바이러스 복제효소(replicase) 및 C형 간염 바이러스 헬리케이즈(helicase) 에 대한 엡타자임을 단백질의 감지, 분석 및 C 형 간염, 암 등의 진단 및 예후 감지에 사용하는 방법.
제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 생체물질의 감지를 위해 형광분석 및 질량분석기를 사용하여 단백질, 펩타이드, 세포, 암 마커(marker), 저분자 물질 및 독성물질 등을 이중으로 분석 및 검증하는 방법.
제 4 항에 있어서, 화학물질에 대한 내성을 가지면서 유압에 강하고 다중초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 직접적인 감지를 위한 투명한 칩의 제작을 위해, 유리-실리콘-유리의 3 층 접합 구조를 사용하는 방법.