KR20070017358A - 레날라제(모노아민 산화효소 ｃ)의 검출, 분리 및 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레날라제(renalase)로도 알려진 포유동물의 모노아민 산화효소 C(Monoamine Oxidase C, MAO-C)의 동정, 분리 및 이용에 관한 것이다.

레날라제, 모노아민 산화효소

Description

레날라제(모노아민 산화효소 Ｃ)의 검출, 분리 및 이용{Detection, Isolation and Uses of Renalase(Monoamine Oxidase C)}

관련출원의 상호참조

본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라, 2004년 3월 19일에 출원된 미합중국 가특허출원 제 60/554,552호 및 2004년 10월 1일에 출원된 미합중국 가특허출원 제 60/615,452호의 우선권이 있으며, 양 출원 모두 본 명세서에 전체가 구체적으로 기재되어 있다.

재정지원 연구와 개발

본 발명은 부분적으로 미합중국 정부(NIH 수여번호 K08 DK 0291702)로부터 받은 기금에 의해 지원받았고, 따라서 미합중국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 가질 수 있다.

체액과 전해질 대사의 조절은 신장의 주된 기능이다. 혈액은 사구체(glomerulus)를 통해 신장으로 들어가며, 사구체여과(glomerular filtration)라는 과정을 통해 세포와 단백질이 걸러지고, 혈장(plasma)과 동일한 이온 조성을 갖는 액체가 생성된다. 이어서, 사구체 여과액은 일련의 뚜렷이 구별되는 요세관 분절(tubular segment)들을 통해 이동되며, 점진적으로 부피와 이온조성을 변형시킨다. 물리적 힘, 국소 및 순환 호르몬들을 포함하여 사구체여과를 조절하는 다수의 요인들이 알려져 있다(참조: Brenner et al. 1976). 마찬가지로, 신장의 요세관 재흡수 및 분비도 다소 복잡한 조절 과정들에 의해 변형된다.

신장은 적혈구 선조(progenitor) 및 전구체(precursor)의 증식과 최종 분화를 위해 필요한 적혈구 질량의 주된 결정요인인 에리트로포이에틴(erythropoietin)의 주된 원천이므로, 내분비기관으로도 작용한다(참조: Line et al., 1985; Jacobs et al., 1985). 게다가 신장은 레닌(renin) 분비에 가장 중요한 부위로 여겨지고 있다. 혈류의 감소, 증가된 교감 자극(sympathetic stimulation) 또는 원위 세관(distal tubule)으로의 나트륨 수송의 감소는 안지오텐시노겐(angiotensinogen)을 안지오텐신 I(angiotensin I)으로 절단하는 효소인 레닌의 분비를 자극할 수 있다. 레닌-안지오텐신 시스템은 체액과 전해질 대사, 혈압 및 심장 기능의 핵심적인 조절인자이다.

신장에 의해 수행되는 이러한 많은 기능들 중에서, 신장의 내분비 기능에 대한 이해의 중요성은 에리트로포이에틴의 발견에 의해 강조되었다. 신장이 레닌과 에리트로포이에틴의 분비 이상의 복잡한 내분비 기능들을 가짐을 암시하는 증거들이 있다. 이전에 밝혀지지 않은 신장에 의해 분비되는 단백질/호르몬들의 동정은 신장생리학의 더 완전한 이해를 제공할 뿐만 아니라, 말기신장병(end-stage renal disease, ESRD)을 가진 환자들의 치료법을 상당히 개선시킬 수 있을 것이다.

말기신장병으로 발전한 환자들은 복막 또는 혈액투석 등의 신장보상요법(replacement therapy)이나 신장이식 중 어느 하나로 치료된다. 말기신장병 환자를 위한 혈액투석 등의 현재의 신장보상요법이 현재까지 유일하게 성공한 장기적 생체 외(ex vivo) 기관 대용요법이다. 생명연장에 있어서 투석방법의 성공에도 불구하고, 이 요법과 관련된 이환률(morbidity)과 사망률이 바람직스럽지 못하게 높고, 대부분의 환자들은 질적으로 열악한 삶으로 고통받는다(참조: Humes et al., 1995; Wolfe et al. 1999). 예를 들면, 이 환자들은 고혈압, 무증상 좌심실기능장애(asymptomatic left ventricular dysfunction) 등의 심장혈관병, 이 중에서 가장 흔한 사망 원인인 만성울혈성 심장기능상실(chronic congestive heart failure)과 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 유병율(prevalence)을 증가시켜 왔다. 이에 대한 명확한 원인이 완전히 밝혀지지 않았지만, 일반적으로 천연 기관(natural organ)의 중요한 기능들을 모사하는 과정의 실패로 여겨진다. 그 과정은 혈액으로부터 나온 여분의 물과 용해성 노폐물을 제거하기 위해 체외의 “인공신장(artificial kidney)”을 이용하지만, 천연 기관의 중요한 흡수, 대사, 내분비 및 면역 기능들은 모사하지 않는다.

ESRD를 가진 환자들이 심장혈관병으로 발전할 상당히 높은 위험에 처해 있다 는 것이 잘 보고 되어져 있고, 위험은 증가된 산화스트레스(oxidaive stress)(참조: Oberge et al. 2004) 및 높아진 교감신경긴장(sympathetic tone)(참조: Koomans et al., 2004; Joles et al., 2004)과 관련되어 있는 것으로 보인다. 다양한 단백질/호르몬들이 ESRD에 관련되어 있다는 사실에도 불구하고, 매우 적은 수의 ESRD 관련 인자들이 동정되고 특징지어졌다. 그럼에도 불구하고, 이러한 인자들의 동정은 ESRD 및 관련된 혈관질환의 치료 또는 신장에서 분비되는 단백질/호르몬의 진단과 치료법의 발전에 결정적이다. 따라서, ESRD와 관련된 인자들의 동정과 특성화에 대한 장기적 필요성이 대두된다.

모노아민산화효소(Monoamine Oxidase, MAO)는 생물기원의(biogenic) 아민을 그것의 대응하는 알데히드로 전환시키는 플라빈-아데노신-디뉴클레오티드(flavin-adenosine-dinucleotide, FAD) 함유 효소이다. MAO는 두 가지의 아이소형(isoform)(MAO-A(서열번호 11)와 MAO-B(서열번호 13)으로 존재하고, 이것들은 70%이상의 서열동일성과, 도파민, 세로토닌 및 노르에피네프린(2,3) 등의 신경전달물질들의 대사에 있어 구별되지만 일부 중복되는(overlapping) 기질특이성을 보이는 분리된 유전자의 산물들이다. MAO-A와 MAO-B 모두 많은 수의 신경학적 장애(neurological disorder)들과 관련되고, 파킨슨병과 우울증 치료제의 표적이다(4). 포유동물의 MAO들은 미토콘드리아 외막에 붙어 있으며, 시스테인 잔기의 8α-thioether 결합을 통해 단백질에 공유결합 한 FAD 분자를 가진다(5). 이들은 조직의존적(tissue-dependent)이고 연령의존적(age-dependent)인 방식으로 발현되고, 광범위한 임상적 및 약학적 연구들의 대상이 되어 왔다.

MAO-A와 MAO-B는 미토콘드리아 외막에 카르복실 말단을 통해 고정된다(참조: Binda et al., 2002). 이들은 일부 중복되는(overlapping) 기질특이성을 갖고 에피네프린, 노르에피네프린, 세로토닌 및 도파민 등의 신경전달물질을 대사하고, 파르길린(pargyline)과 클로길린(clorgyline)에 의해 특이적으로 저해된다. 알려진 또 다른 FAD 함유 산화효소인 폴리아민 산화효소(polyamine oxidase, PAO)는 스퍼민(spermine), 스퍼미딘(spermidine)을 대사하는 세포내 산화효소이며, 세포성장을 조절한다(참조: Jalkanen et al., 2001). 사람 MAO-B의 결정구조는 3.0A의 해상도에서 규명되었고, 시스테인 곁사슬에 공유결합한 FAD 보조인자(cofactor)를 가진 이량체(dimer)인 것으로 밝혀졌다(참조: Binda et al., 2002). MAO-A와 MAO-B는 X염색체 상의 인접하지만 분리되어 있는 유전자들에 의해 암호화되어 있으며, 70% 이상의 서열동일성과 신경전달물질의 대사에 있어 구별되지만 일부 중복되는 기질특이성을 나타낸다.

MAO-A와 MAO-B는 조직분포, 구조 및 기질특이성이 다르다. MAO-A는 세로토닌, 옥토파민, 아드레날린 및 노르아드레날린에 대해 더 높은 친화력을 갖는 반면, MAO-B에 대한 자연형 기질들은 페닐에틸아민(phenylethylamine)과 티라민(tyramine)이다. 도파민은 양 아이소형(isoform) 모두에 의해 산화되는 것으로 여겨진다. MAO-A와 MAO-B는 뇌를 포함하여 여러 기관들에 넓게 분포되어 있다(참조: A.M.Cesura and A.Pletscher, Prog. Drug Research, 1992, 38, 171-297). 뇌의 MAO-B 활성은 나이가 들어감에 따라 증가하는 것으로 보인다. 이러한 증가는 노화와 관련된 신경아교증(gliosis)에 기인한다(참조: C.J.Fowler et al., J. Neural. Transm., 1980, 49, 1-20). 게다가, MAO-B 활성은 알츠하이머병을 가진 환자들의 뇌에서 훨씬 더 높고(참조: P.Dostert et al., Biochem. Pharmacol.,1989, 38, 555-561), 노인성 반(senile plaques) 주위의 성상교세포(astrocyte)에서 더 높게 발현되는 것으로 밝혀졌다(참조: Saura et al., Neuroscience, 1994, 70, 755-774). 이러한 관계에서, MAO에 의한 일차 모노아민들의 산화적 탈아민화(deamination)는 NH, 알데히드 및 HO, 기존의 또는 잠재적인 독성 물질들을 생산하므로, 치매와 파킨슨병의 치료를 위한 선택적 MAO-B 저해제의 이용에 대한 이론적 근거가 있다는 것이 제시되었다. MAO-B의 저해는 도파민의 효소활성의 감소를 야기하여 도파민신경세포들에 있어서 신경전달물질의 가용성(availability)의 지연을 야기한다. 연령과 알츠하이머 및 파킨슨병과 관련된 퇴행(degeneration) 과정은 증가된 MAO 활성과 그 결과 MAO-B에 의해 증가된 HO의 생성에 기인한 산화적 스트레스 때문일 수도 있다. 따라서, MAO-B 저해제들은 산소 라디칼(radical)들의 생성을 감소시키고. 뇌에서의 모노아민들의 수준을 증가시킴으로써 작용할 수 있다.

상기 언급한 신경학적 장애들에 MAO-B가 관련되었다면, 이 효소활성을 조절할 강력하고 선택적인 저해제들을 얻는 것은 상당히 중요하다. 일부 알려진 MAO-B 저해제들의 약물학(pharmacology)은 예를 들면 [D.Bentue-Ferrer et al. in CNS Drugs, 1996, 6, 217-236]에서 논의된다. 비가역적이고 비 선택적인 MAO 저해제의 활성은 다른 약물들과의 상호작용에 대한 가능성뿐만 아니라, 음식의 티라민(tyramine)이 섭취되었을 경우 고혈압 위기(hypertensive crisis)를 초래할 위험 이 있어 식이요법의 주의(dietary precaution)를 준수할 필요가 있다는 주된 제한이 있는 반면(참조: D.M.Gardner et al., J. Clin. Psychiatry, 1996, 57, 99-104), 이러한 유해사례(adverse event)들은 가역적이고 선택적인 MAO 저해제들, 특히 MAO-B와는 관련이 적다.

MAO 저해제는 MAO 활성을 저해함으로써 모노아민과 다른 뇌 영역 및 신체에서의 그것들의 (도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌을 포함하여)신경전달물질 방출의 수준을 조절할 수 있다. 따라서, MAO 저해제는 신경내분비(neuroendocrine) 기능, 호흡, 기분, 운동 조절 및 기능, 초점 및 주의력, 집중력, 기억력 및 인식, 물질남용(substance abuse) 기작의 조절에 영향을 줄 수 있다. MAO 저해제는 주의력, 인식력, 식욕, 물질남용, 기억력, 심혈관 기능, 추체외로(extrapyramidal) 기능, 고통과 위장관 운동(gastrointestinal motility) 및 그 기능에 영향을 주는 것으로 알려졌다. 뇌에서의 MAO의 분포는 광범위하고, 바닥핵(basal ganglia), 대뇌피질(cerebral cortex), 변연계(limbic system) 그리고 중뇌 및 후뇌 핵을 포함한다. 주변 조직에서의 분포는 근육, 위장관, 심장혈관계, 자율신경절(autonomic ganglia), 간 및 내분비계를 포함한다.

다른 저해제들에 의한 MAO 저해는 뇌와 신체에서의 모노아민 함량을 증가시키는 것으로 보인다. 신체에서의 모노아민 수준의 조절은, 우울, 불안(anxiety), 스트레스 장애, 기억력과 신경내분비 문제, 심기능장애(cardiac dysfunction), 위장장애(gastrointestinal disturbances), 섭식장애(eating disorders), 고혈압, 파킨슨병, 기억장애와 관련된 병 및 금단증상(withdrawal symptoms)을 포함한 다양한 병 상태(states)에 유효한 것으로 보인다.

담배연기가 모노아민 산화효소(MAO)에 대한 비가역적 저해 효과를 가질 수 있다는 사실이 주장되었다. 볼튼(Boulton) 등은, "Biogenic Amine Addcuts, Monoamine Oxidase Inhibitors, and Smoking, "Lancet, 1(8577):114-155(Jan. 16. 1988)에서 담배연기의 MAO 저해 특성은 파킨슨병에 대한 흡연의 방어활동(protective action)을 설명하는데 도움이 될 수 있음을 보고했고, 흡연을 심하게 하는 정신장애를 가진 환자들은 이례적인 비율의 흡연유발 장애들을 경험하지 않는다는 것 역시 관찰되었다. MAO 저해제로서 흡연이 파킨슨병을 일으키는 도파민의(dopaminergic) 신경독성을 방지할 수 있다는 것과, 흡연의 MAO 저해 성질이 정신병 환자들의 항우울 효과를 나타낼 수 있음이 주장되었다.

발명의 요약

본 발명에 앞서, MAO-A와 MAO-B는 사람에서 동정된 유일한 두 모노아민 산화효소이다. 사람의 지놈 데이터베이스를 이용하여 사람의 신규한 분비단백질(secretory protein)들을 동정하고 특정하려는 시도 속에, 본 발명자들은 새로운 모노아민 산화효소를 동정하였다. 본원 발명은 노르에피네프린, 도파민 및 에피네프린 등의 생물의 모노아민들을 대사하는 모노아민 산화효소의 분비형(secretory form)의 동정과 특정한 결과를 개시한다. 새롭게 동정된 모노아민 산화효소는 사람의 모노아민을 대사하는 것으로 동정된 세 번째 효소이므로, 본 발명자들은 이것 을 'MAO-C'로 명명하였다. 이것은 신장에서 분비되는 단백질이므로, 선택적으로 ‘레날라제(renalase)’로도 명명된다. MAO-C 또는 레날라제는 모노아민 산화효소족의 새로운 구축물(construct)이므로, 이 효소 역시 MAO-A나 MAO-B와 같이 뇌에서 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

본원 발명은 카테콜아민(catecholamine)의 조절과 관련된 신규한 단백질인, 레날라제로 명명된 신규한 포유동물 모노아민 산화효소(MAO)를 암호화하는 핵산(서열번호 2)에 관한 것이다. 사람 레날라제의 핵산서열은 사람 MAO-A의 것(서열번호 10)과 27.7%, MAO-B의 것(서열번호 12)과 38.2%의 상동성이 있다. 레날라제는 아미노산 수준에서 MAO-A 및 MAO-B와 각각 13%, 12%의 동일성(identity)을 갖는다. 그것은 또한 MAO-A 및 MAO-B의 것과 구별되는 기질특이성과 저해제 분포(inhibitor profile)를 가지며, 이것은 레날라제가 전혀 새로운 종류의 독특한 FAD함유 모노아민 산화효소임을 보여준다.

사람의 레날라제 유전자는 10번 염색체상에 있고, 9개의 엑손(exon)을 가지며, 약 300Kb에 달한다. 사람 레날라제 유전자는 플라빈아데노신디뉴클레오티드(FAD)함유 영역(domain)과 아미노 산화효소(amino oxidase) 영역에 이은 아미노말단신호서열(amino-terminal signal sequence)을 갖는 342개의 아미노산 단백질을 암호화한다. 조직 노던블랏팅(tissue Northern blotting) 연구는 분석된 다른 모든 조직에서의 훨씬 낮은 수준과 함께 신장에서의 강한 레날라제 발현을 보여주었다. 제자리 혼성법(in situ hybridization)은 근위(proximal) 및 원위 세관(distal tubule)에서의 레날라제의 높은 발현수준을 보여주었다.

레날라제는 시험관내(in vitro) 전사(transcription) 및 번역(translation) 실험에서 높게 발현되었다. 사람 레날라제 cDNA는 약 38kDa의 분자량을 가진 단백질을 생산하도록 번역되었고, 이것은 예상된 단백질 크기와 일치한다. 형질전이된(transfected) HEK293 세포들의 적응용배지(conditioned medium)를 이용한 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 연구는 레날라제가 분비단백질임을 보여준다. 레날라제는 건강한 개체의 5-10mg/l 농도의 혈장에 나타난다.

말기신장병(ESRD)은 증가된 카테콜아민 수준과 관련되어 있으며, 이는 예를 들어 무증상 좌심실기능장애(asymptomatic left ventricular dysfunction), 만성울혈성 심장기능상실(chronic congestive heart failure) 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 포함하여 수많은 상태(condition), 질병(disease) 및 장애(disorder)를 차례로 유발한다. 이러한 상태, 질병 및 장애들은 ESRD 환자들의 흔한 사망원인이다.

레날라제는 도파민>에피네프린>노르에피네프린의 순서로 카테콜아민을 대사한다. ESRD 환자에게서 레날라제는 거의 찾아볼 수 없다. 따라서, ESRD 환자의 레날라제 수준의 소멸이나 감소는 적어도 부분적으로는 카테콜아민 수준 증가의 원인이 되고, 이는 ESRD 환자들의 흔한 사망원인인 심장혈관병을 유발한다.

게다가, 레날라제 수준과 신장기능과의 상관관계는 레날라제를 신장병, 특히 Intensive Care Unit setting에서 흔히 발생하는 급성 요세관괴사(acute tubular necrosis)에 대한 진단마커(diagnostic marker)로서의 이상적인 후보물질이 되게 한다. 레날라제의 생물학적 중요성과 그것의 잠재적인 임상적 관련성이 본 명세서 에서 더 논의될 것이다.

본 발명은 신장에 의해 혈액으로 분비되는 신규한 FAD의존 아민 산화효소를 제공한다. 그것은 순환(circulating) 카테콜아민을 대사하며, 특히 혈압과 심장박동수의 강력한 조절인자이다. 게다가, 이것의 ESRD 환자 혈장에서의 감소는 이 환자 집단에서 잘 보고 된 교감신경긴장 및 심장혈관 위험의 증가와 인과관계가 있다. 레날라제의 동정은 심장혈관 생리학의 더 구체적 이해증진에 있어 중요한 단계일 뿐 아니라, 신장병 및/또는 심장병 및 관련된 합병증을 가진 환자들의 적절한 치료를 제공하기 위한 탐색에 있어서도 중요한 단계이다.

본 발명은 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 약 40% 또는 그 이상의 서열동일성을 공유하는, 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 포함한다.

본 발명은 서열번호 1의 핵산잔기 24부터 1049까지의 핵산서열과 적어도 약 40% 또는 그 이상의 서열동일성을 공유하는, 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 포함한다.

본 발명의 한 측면에 의하면, 핵산은 그것에 공유결합으로 연결된 태그(tag) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 핵산은 그것에 작동가능하도록 연결된 프로모터/조절서열을 특정하는 핵산을 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 서열번호 1과 적어도 약 40% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는, 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 서열번호 1과 적어도 약 40% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는, 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 포함한다.

본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 또는 그것의 단편, 안티센스 방향이 되는 상보적인 핵산에 상보적인 분리된 핵산을 포함한다.

본 발명의 한 측면에 의하면, 본 발명의 핵산은 사람 레날라제 서열(서열번호 1)을 갖는 핵산에 상보적인 핵산과 적어도 약 40% 또는 그 이상의 동일성을 공유한다.

본 발명은 분리된 포유동물의 레날라제 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 약 15% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 포유동물의 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 잔기 24부터 342의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 약 15% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩티드도 역시 포함한다.

본 발명은 포유동물의 레날라제 또는 그것의 단편과 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 그 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 또는 합성 항체일 수 있다.

본 발명은 서열번호 1과 적어도 약 40% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는, 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 분리된 포유동물 레날라제 폴리펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 세포 내에서 사람 레날라제의 발현을 감소시키거나 저해하는 화합물의 동정방법을 포함한다. 이 방법은 레날라제가 발현되는 세포를 화합물과 접촉시키는 단계 및 그 화합물과 접촉한 세포에서의 사람 레날라제 발현수준을 다른 조건이 동일한 세포에서의 사람 레날라제 발현수준과 비교하는 단계를 포함하며, 화합물과 접촉하지 않은, 다른 것이 동일한 세포에서의 사람 레날라제 발현수준과 비교하여, 화합물과 접촉시킨 세포에서의 사람 레날라제의 더 낮은 수준의 발현은 그 화합물이 세포에서의 사람 레날라제 발현을 저해한다는 것을 나타낸다. 본 발명의 한 측면에 의하면, 본 발명은 이러한 방법에 의해 동정된 화합물을 포함하며, 이러한 화합물은 사람 레날라제의 길항제(antagonist)이다.

본 발명은 세포에서 사람 레날라제 발현을 증진시키거나 증가시키는 화합물을 동정하는 방법도 역시 포함한다. 이 방법은 레날라제가 발현되는 세포를 화합물과 접촉시키는 단계 및 그 화합물과 접촉한 세포에서의 사람 레날라제 발현수준을 다른 조건이 동일한 세포에서의 사람 레날라제 발현수준과 비교하는 단계를 포함하며, 화합물과 접촉하지 않은, 다른 것이 동일한 세포에서의 사람 레날라제 발현수준과 비교하여, 화합물과 접촉시킨 세포에서의 사람 레날라제의 더 높은 수준의 발현은 그 화합물이 세포에서의 사람 레날라제 발현을 증진시키거나 증가시킨다는 것을 나타낸다. 본 발명의 한 측면에 의하면, 본 발명은 이러한 방법에 의해 동정된 화합물을 포함하며, 이러한 화합물은 사람 레날라제의 작용제(agonist)이다.

본 발명은 사람 레날라제의 발현에 의해 매개되는 상태, 장애 또는 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 사람 레날라제의 발현에 의해 매개되는 상태, 장애 또는 질병으로 고통 받는 환자에게 사람 레날라제의 발현을 저해 또는 감소시킬 정도의 양의 저해제를 투여하는 단계 및 그것에 의해, 사람 레날라제의 발현이 매개하는 상태, 장애 또는 질병을 치료하는 단계를 포함한다.

본 발명의 조성물과 방법들은 사람을 포함한 생물체의 혈관, 심장, 신장, 신경 및/또는 내분비계와 관련된 상태, 장애 또는 질병을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 한 측면에 의하면, 상태, 장애 또는 질병은 ESRD, 만성신장병, 고혈압, 무증상 좌심실기능장애(asymptomatic left ventricular dysfunction), 만성울혈성 심장기능상실(chronic congestive heart failure), 심박장애(cardiac rhythm disturbances) 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 등의 심장혈관병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 레날라제 저해제는 사람 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산 또는 그것의 단편, 안티센스 방향이 되는 상보적 핵산에 상보적인 분리된 핵산을 포함한다.

본 발명은 레날라제를 투여함으로써 포유동물의 고혈압을 치료하는 방법을 포함하는 포유동물의 고혈압 치료방법을 포함한다.

이에 제한되는 것은 아니나, 치매, 알츠하이머병, 정신분열증, 정신병(psychosis), 우울증, 두통, 편두통 또는 긴장두통(tension headache) 및 간질을 포함한 중추신경계(CNS)와 관련된 상태, 장애 또는 질병의 치료법; 및 정신병 양상(psychotic features), 긴장증 양상(catatonic features), 우울증 양상(melancholic features), 비정형적 양상(atypical features), 산후발병(postpartum onset)을 갖거나 갖지 않는, 양극성 우울증(bipolar depression), 단극성 우울증(unipolar depression), 단일(single) 또는 재발(recurrent) 주요우울삽화(major depressive episode)를 포함한 주요 우울장애(depressive disorder) 등 중추신경계 장애의 치료 및/또는 예방법, 불안 및 공황장애의 치료법 역시 고려된다. 주요우울장애(major depressive disorder)라는 용어 안에 포함되는 다른 기분장애(mood disorder)들은 조기 또는 지연 발병(early or late onset)을 갖고, 비통상적인 양상을 갖거나 갖지 않는 기분저하장애(dysthymic disorder), 신경우울증(neurotic depression), 외상후 스트레스장애(post traumatic stress disorder) 및 사회공포(social phobia); 조기 또는 지연 발병을 갖는 알츠하이머형 치매(dementia of Alzheimer's type), 알콜, 암페타민(amphetamine), 코카인, 환각제(hallucinogen), 흡입제(inhalant), 아편양제제(opiod), 페사이클리딘(phecyclidine), 진정제(sedative), 수면제(hypnotic), 항불안제(anxiolytic) 및 다른 물질들에 의해 유발된 장애들을 포함한다.

나아가, 본 발명은 레날라제의 변형된 발현과 관련된 질병, 장애 또는 상태로 고통 받는 환자를 식별하는 방법을 포함한다. 이 방법은 사람의 레날라제 발현수준을 탐지하는 단계 및 상기 환자의 레날라제 발현수준을 레날라제의 변형된 발현과 관련된 질병, 장애 또는 상태로 고통받지 않는 평범한 사람의 레날라제 발현수 준과 비교하는 단계 및 그로부터 레날라제의 변형된 발현과 관련된 질병, 장애 또는 상태로 고통 받는 환자를 탐색하는 단계를 포함한다.

후술하는 발명의 상세한 설명뿐만 아니라, 전술한 발명의 요약은 첨부된 도면과 관련하여 파악할 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명하기 위해, 도면들이 바람직한 실시예로 제시되었지만, 본 발명이 도시된 간략한 배열과 수단들에 제한되는 것은 아니다.

도 1a는 탐침으로서 MGC12474 클론을 사용한 사람 조직의 노던블럿 분석결과이다.

도 2b는 레날라제에서 검출된 잠재적인 구조적 모티브를 도시한다: FAD: 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드, SP: 신호 펩티드.

도 1c는 MAO-A와 비교한 사람의 레날라제의 축퇴된 아미노산 서열이다.

도 1d는 레날라제 다클론 항체를 이용한, 래드 조직의 웨스턴 블럿 분석결과이다.

도 2a는 사람의 레날라제의 cDNA와 축퇴된 아미노산 서열을 나타낸다.

박스로 표시된 아미노산 잔기 1-16은 신호 펩티드를 암호화하는 것을 나타낸다.

도 2b는 레날라제의 유전자 구조를 도시한다.

도 2c는 사람의 MAO-A, MAO-B 및 MAO-C간의 배열이다.

도 3a-3d는 사람의 신장 및 심장에서 레날라제의 세포내의 위치를 도시한다.

도 3a는 사람 신장의 제자리 혼성화(in situ hybridization) 분석결과이다; 좌측패널: 안티센스 탐침, 200x 배율, 흰 화살표는 사구체(glomerulus)를 나타내고, 검은 화살표는 근위 세관(proximal tubule)을 나타낸다; 우측패널: 대조군인 센스 탐침, 100x 배율

도 3b는 사람 심장의 제자리 혼성화 분석(in situ hybridization analysis) 결과이다; 좌측패널: 안티센스 탐침, 200x 배율, 흰 화살표는 혈관을 나타내고, 검은 화살표는 심실의 근세포(ventricular myocyte)를 나타낸다; 우측패널: 대조군인 센스 탐침

도 3C는 사람 신장의 면역위치화 분석(immunolocalization)의 사진이다; 좌측패널: 항-레날라제 항체, 630x 배율, 검은 화살표는 근위 세관(proximal tubule)을 나타낸다; 우측패널: 면역화되기 이전의 혈청

도 3d는 사람 심장의 면역위치화 분석(immunolocalization)의 사진이다; 좌측패널: 항-레날라제 항체, 630x 배율, 흰 화살표는 혈관을 나타내고, 검은 화살표는 심실의 근세포(ventricular myocyte)를 나타낸다; 우측패널: 면역화되기 이전의 혈청

도 4a 내지 4c는 HEK293 세포에서 래트 레날라제-HA-태그 융합 단백질의 발현을 나타낸다.

도 4a는 레날라제의 발현 TAP 단편의 구조를 도시한다.

도 4b는 GST-레날나제 융합단백질의 제조 및 순수분리를 도시하는 그림이다. 박테리아 용해물로부터의 단백질(100ug)과 순수분리된 GST-레날나제(10ug)는 쿠마시 블루로 염색된 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리된다. 레인 A: 박테리아 용해물; 레인 B: 순수분리된 레날라제 단백질.

도 4c는 레날라제 활성의 결정을 나타낸다. 순수분리된 GST-레날나제 융합단백질(각 반응당 10ug)이 각각의 분석에 사용되었다. 아미노 산화효소 활성은 도파민 또는 노르에피네프린(최종농도 2mM)과 30분동안 반응시킨 후의 임의 형광 유닛(arbitrary fluorescence units)/단백질 10ug로 표시된다. 컬럼 1: 도파민 및 노르에피네프린으로 처리된 대조군 단백질(GST); 컬럼 2: 노르에피네프린으로 처리된 GST-레날나제; 컬럼 3: 도파민으로 처리된 GST-레날나제.

도 5a 내지 5b는 레날라제가 분비된 단백질임을 나타낸다.

도 5a는 레날라제 cDNA로 일시적으로 형질전환된 HEK293 세포의 배양배지에서 레날라제의 검출을 도시하는 사진이다.

도 5b는 항-레날라제 항체를 이용한 사람의 혈장의 웨스턴 블럿 분석결과를 도시하는 그림으로서, 정상은 정상적인 신장기능을 갖는 개체이고, 대조군은 재조합 레날라제이며, ESRD는 혈액투석(hemodialysis)을 받는 말기 신장병 환자를 나타낸다.

도 6a 내지 6c는 레날라제의 효소활성 및 기능을 나타낸다.

도 6a에서, GST-레날나제 융합단백질 10ug이 각 분석에 사용되었고; 아민 산 화효소 활성은 임의 형광 유닛(arbitrary fluorescence unit)/단백질 10ug로 표시되며; 기질(2mM)을 30분동안 반응시켰다.

도 6a와 같이, 도 6b에서; 1uM 클로길린(chlorgyline)과 1uM 파르길린(pargyline)이 사용되었다.

도 6c는 친화 순수분리된 사람 레날라제를 나타내는 그림이다. 단백질은 항-레날라제 항체를 이용하여 사람의 소변에서 분리되었다; 레인 1: 사람의 소변, 레인 2: 2차 항체단독인 대조군.

도 7a 내지 7g는 레날라제의 혈류역학적 효과(hemodymanic effects)를 도시한다; 화살표는 레날라제 주입의 시간을 나타내고, 시간적 변화는 분이며, 심박은 분당 비트수(bpm)로 측정되고, 수축(systolic) 및 확장시(diastolic)의 관상혈관압력은 수은주(mmHg)로 표시되었다.

도 7a는 몸무게g 당 4ug의 IV 일시(bolus) 주사 전후의 심장반응을 나타낸다; 화살표는 레날라제 주사시간을 나타낸다; Vp=좌심실압; HR=심박; dP/dt=좌심실압에서의 변화율, 심수축성(cardiac contractility)의 측정.

도 7b는 레날라제 주사 전후의 압력-부피 커브이다.

도 7c는 도 7a의 일부확대도이다(화살표 참조). HR=심박, Vp: 좌심실압

도 7d는 심수축성상의 레날라제 도스-반응 커브(renalase dose-response curve)이다.

도 7e는 평균 관상압력상의 레날라제 도스-반응 커브(renalase dose-response curve)이다.

도 7f는 혈장 에피네프린상의 레날라제 활성의 시간에 따른 변화이다.

도 7g는 혈장 노르에피네프린상의 레날라제 활성의 시간에 따른 변화이다.

각 출판물 또는 특허출원이 특별히 개별적으로 인용문헌으로서 포함되는 수준으로, 본 명세서에 개시된 모든 출판물 및 특허출원은 인용문헌으로 포함되었다.

하기의 설명은 본 발명의 이해에 유용한 정보를 포함한다. 본 명세서에서 제공된 모든 정보가 본 발명에 대한 선행기술문헌 또는 관련정보로 간주되거나, 또는 특별히 또는 절대적으로 참조된 모든 출판물이 선행기술문헌으로 간주되지는 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 일반적으로 본 명세서에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명에 속하는 당업자에 의하여 이해되도록 동일한 의미를 갖는다. 비록, 본 명세서에 기술된 것과 동일하거나 또는 동등한 수준의 모든 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법과 재료를 기재되었다.

본 명세서에 개시된 데이타는 수용체 반응을 배제하지 않고, 레날라제가 그중에서도 특히 신장, 심장 및 혈관의 기능을 위한 중요한 매개체인 노르에피네프린, 도파민 및 에피네프린 등의 순환하는 카테콜아민의 분해기능을 담당함을 나타낸다. 또한, 본 명세서에서 충분히 설명하였듯이, 레날라제는 서로 다른 조직 및/또는 기관의 기능을 조절하는 호르몬으로서 역할을 수행한다. 아울러, 그의 기능이 카테콜아민에 의하여 부분적으로 매개되는 것처럼 신경계를 포함할 수도 있다. 따라서, 예를 들어 충분한 양의 레날라제가 생산되지 않는 환자에게 레날라제가 제공될 수 있다. 레날라제의 동정은 고혈압을 치료/예방하기 위한 말기 신장병(ESRD), 무증상 좌심실 기능장애(asymptomatic left ventricular dysfunction), 만성 울혈성 심장기능상실(chronic congestive heart failure) 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 등의 심혈관질환 간의 치료와 진단의 발달에 중요한 관련성을 갖는다.

빈혈을 나타내는 열병환자에 폭 넓게 사용되는 재조합 단백질인 에리트로포이에틴(EPO)과 유사하게, 레날라제는 분비되는 단백질이고, 신장에서 발현된다. 레날라제의 또 다른 고정적 특징은 EPO와 같이 ESRD를 갖는 환자에게서 실질적으로 검출되지 않는 반면, 레날라제는 약 5-10mg/L의 농도로 건강한 개체의 혈액에서 발현된다.

본 명세서에 개시된 데이터는 카테콜아민을 대사하는 새로운 효소의 존재를 나타낸다. MAO의 패러다임을 확장시키는 것에 더하여, 이러한 새로운 발견은 예를 들어 ESRD 환자를 위한 중요한 임상적 관련성을 갖는다. 레날라제의 수준을 레날라제 기질(즉, 카테콜아민)의 과도한 수준을 감소시키도록 보충하는 전략은 ESRF 환자를 치료하는 이론적인 접근이다. 더욱이, 신장 기능의 상태를 고려함이 없이, 카테콜아민의 과도한 수준에 의하여 유래되는 어떠한 다른 질병도 레날라제의 공급 또는 보충량의 추가를 통하여 치료될 수 있다.

변형된 방법으로, 레날라제는 감소된 교감신경긴장(sympathetic tone)을 갖는 환자에서 순환하는 카테콜아민 수준을 향상시키기 위한 약물의 목표로서 사용될 수 있고, 이에 따라, 특정한 심혈관 합병증의 결과를 증가시킨다. 부적절한 부작용의 결과로서 또한 현재의 MAO 저해제가 모르고 레날라제를 목적으로 할 수 있는 것처럼, 또한, 레날라제는 MAO-A 또는 MAO-B에 더욱 특이적인 약물의 설계를 허용할 수도 있다.

레날라제의 동정 및 특성규명은 교감신경성 자극을 증가시키는 급격한 감정적 스트레스에 의하여 촉진될 수 있는 만성 심장기능상실(chronic heart failure, CHF), 심근경색증(myocardial infarction, MI), 심장 리듬 장애(cardiac rhythm disturbances) 등의 심혈관 질환의 병태생리학(pathophysiology)에서 레날라제 및 그들의 역할의 추가적인 연구를 위한 기틀을 제공한다(참조: Wittstein et al., (2005) Neurohumoral features of myocardial stunning due to sudden emotional skess, New England Journal of Medicine, 352, 539-548). 아마도 더욱 중요하게는, MAO-A 및 MAO-B와 같이, 레날라제는 사람의 교감신경성 활성을 조절하기 위한 잠재적으로 유용한 목표로서 제공될 수도 있을 것이다.

그의 잠재적인 치료역할 이외에도, 레날라제는 급성 신장 기능상실(즉, 급성 세뇨관 괴사(tubular necrosis), 또는 ATN, 신장의 허혈상태)을 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, 신장이 적절한 기능을 수행하지 못하는 환자는 레날라제를 낮은 수준으로 소유한다.

또한, 본 발명은 심혈관, 심장, 신장 및 상태와 관련된 정신상태, 레날라제의 유전자 발현 및 효소활성의 측정값에 근거한 장애 및 질환에 대한 민감성을 진단하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 고혈압, 무증상 좌심실 기능장애, 만성 울혈성심장기능상실, 심근경색증, 심장 리듬 장애 및 죽상동맥경화증 등의 심혈관 상태 장애 및 질환; 우울증(depression) 및 불안증(anxiety) 등의 정신상태 장애 및 질환; 및, 폐 고혈압(pulmonary hypertension) 등의 심장상태 장애 및 질환은 레날라제 유전자 발현수준, 레날라제 단백질 수준 및/또는 레날라제 효소활성의 정도에 의하여 모두 진단, 평가 및 감시될 수 있다. 예를 들어, 레날라제 유전자의 감소된 발현은 증대된 교감신경성 증세(output)와 관련된 장애를 위한 진단 마커가 될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법은 수축 고혈압(systolic hypertension), 고립형 수축 고혈압(isolated systolic hypertension) 및 당뇨성 고혈압(diabetic hypertension)을 포함하는 고혈압을 치료, 예방, 경감 또는 개선시키는데 사용될 수 있다. 더욱이, 동일한 장점이 더욱 보기드문 고혈압 장애인 폐 고혈압을 위해 사용될 것으로 예상된다. 폐 고혈압은 폐 동맥(심장에서 폐로 전달되는 혈관)에서 압력이 정상수준 이상으로 증대되어, 위독해질 수도 있는 보기드문 폐의 혈관 장애이다. 당뇨성 고혈압 및 고립형 수축 고혈압에서 시스템적인 혈압의 상승을 수반하는 폐에서의 상승된 혈압의 발달에서의 유사성은, 유사한 작용기작이 관여함을 시사한다.

정의

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 다음의 각 용어들은 이 장에서 서로 연관되어 의미를 갖는다.

본 명세서에서 “a” 및 “an” 등의 관사는 하나 또는 그 이상(즉, 적어도 하나)을 의미한다. 예를 들어, “인자(an element)”는 하나 또는 그 이상의 인자를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “인접한(adjacent)”이라는 용어는, 사이에 뉴클레오티드가 끼어들지 않고 다른 뉴클레오티드 서열에 직접 붙은 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들어, 두 뉴클레오티드가 결합되어 5'-AAAAATTT-3'나 5'-TTTAAAAA-3'이 된 경우에는, 5개 뉴클레오티드(pentanucleotide) 5'-AAAAA-3'는 3개 뉴클레오티드(trinucleotide) 5'-TTT-3'와 인접하지만, 두 뉴클레오티드가 결합되어 5'-AAAAACTTT-3'가 된 경우에는 그렇지 않다.

본 명세서에서 사용된 아미노산들은, 다음 표에서 보듯이 그것의 완전한 명칭 또는 그것에 대응하는 3문자 코드(3-letter code)나 1문자 코드(1-letter code)에 의해 표시된다.

아미노산	3문자 코드	1문자 코드
Aspartic Acid	Asp	D
Glutamic Acid	Glu	E
Lysine	Lys	K
Arginine	Arg	R
Histidine	His	H
Tyrosine	Tyr	Y
Cysteine	Cys	C
Asparagine	Asn	N
Glutamine	Gln	Q
Serine	Ser	S
Threonine	Thr	T
Glycine	Gly	G
Alanine	Ala	A
Valine	Val	V
Leucine	Leu	L
Isoleucine	Ile	I
Methionine	Met	M
Proline	Pro	P
Phenylalanine	Phe	F
Tryptophan	Trp	W

본 명세서에서 사용된 질병(disease), 장애(disorder) 또는 상태(condition)를 “완화시킨다(alleviate)”는 병, 장애, 상태의 하나 또는 그 이상의 증상들의 경중도를 감소시키는 것을 의미한다. 이것은, 이에 제한되는 것은 아니나, 세포나 조직(예를 들면, 평활근 세포, 폐 조직, 동맥)에서 발현되는 레날라제의 수준을 증가시키거나, 이전 또는 치료법이 없는 환자의 레날라제 수준과 비교하여 환자의 레날라제 수준을 감소시키거나 증가시키는 것 등을 포함할 수 있다.

"안티센스(antisense)"는 특히 단백질을 암호화하는 이중사슬 DNA분자의 비-암호화 사슬(non-coding strand)의 핵산서열이나 비-암호화 사슬에 대체적으로 상동성(homologous)인 서열을 의미한다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 안티센스 서열은 단백질을 암호화하는 이중사슬 DNA분자 서열에 상보적이다. 안티센스 서열이 반드시 DNA 분자의 암호화 사슬(coding strand)의 암호화 영역에만 상보적이어야 하는 것은 아니다. 안티센스 서열은 단백질을 암호화하는 DNA분자의 암호화 사슬에 대해 지정된 조절서열(regulatory sequence)에 상보적일 수도 있으며, 그 조절서열은 암호화 서열의 발현을 조절한다.

본 명세서에서 사용된 “투여기(applicator)”라는 용어는, 이에 제한되는 것은 아니나, 피하주사기(hypodermic syringe), 피펫, 기관지경(bronchoscope), 흡입기 등을 포함한 레날라제 핵산, 단백질 및/또는 본 발명의 조성물을 포유동물에 투여하기 위한 도구를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “생물학적 시료(biological sample)”라는 용어는, 레날라제의 발현수준, 존재하는 레날라제 단백질의 수준, 또는 둘 다를 측정하기 위해 사용될 수 있는, 동물로부터 얻어지는 시료를 의미한다. 상기 시료는, 이에 제한되는 것은 아니나, 혈관(예를 들면, 목동맥, 대동맥 등) 시료, 폐 조직 시료, 평활근조직세포(SMC) 시료를 포함한다.

“레날라제를 암호화하는 핵산의 일부나 전체에 상보적(complementary to a portion or all of the nucleic acid encoding renalase)”이라는 것은 레날라제 단백질을 암호화하지 않는 핵산서열을 의미한다. 세포에서 발현되는 서열은 오히려 레날라제 단백질을 암호화하는 핵산의 비-암호화 사슬과 동일하여, 레날라제 단백질을 암호화하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 “상보적(complementary)”과 “안티센스(antisense)”라는 용어는 완전히 동의어는 아니다. “안티센스”는 특별히 단백질을 암호화하는 이중사슬 DNA분자의 비-암호화 사슬의 핵산서열이나 비-암호화 사슬에 대체적으로 상동성인 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 “상보적”은 두 개의 핵산, 예를 들면 두 DNA분자들 사이의 소단위체 서열 상보성(subunit sequence complementarity)이라는 넓은 개념을 의미한다. 양 분자들의 뉴클레오티드 위치가 일반적으로 서로 염기짝짓기(base pairing) 할 수 있는 뉴클레오티드들에 의해 채워졌을 경우, 핵산들은 그 위치에서 서로 상보적이라고 간주된다.

따라서, 분자들 각각에 대응하는 위치들의 상당수(최소한 50%)가 일반적으로 서로 염기짝짓기 하는 뉴클레오티드들(예를 들면, A:T, G:C 뉴클레오티드 쌍들)에 의해 채워진 경우, 두 핵산들은 서로 상보적이다. 본 명세서에서 정의된 안티센스 서열은 단백질을 암호화하는 이중사슬 DNA분자 서열에 상보적이다. 안티센스 서열이 반드시 DNA분자의 암호화 사슬의 암호화 영역에만 상보적이어야 하는 것은 아니다. 안티센스 서열은 단백질을 암호화하는 DNA 분자의 암호화 사슬에 대해 지정된 조절서열에 상보적일 수도 있으며, 그 조절서열은 암호화 서열의 발현을 조절한다.

유전자의 “암호화 영역(coding region)”은 전자의 전사로 생성된 mRNA 분자의 암호화 영역에 각각 상동성이거나 상보적인 유전자의 암호화 사슬의 뉴클레오티드 잔기들과 유전자의 비-암호화 사슬의 뉴클레오티드들로 구성된다.

mRNA 분자의 “암호화 영역(coding region)” 역시 mRNA 분자의 번역과정에서 tRNA 분자의 안티코돈 부분과 짝지어지거나 정지코돈을 암호화하는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 잔기들로 구성된다. 따라서, 호화 영역은 mRNA 분자에 의해 암호화된 성숙한 단백질에서 발견되지 않는 아미노산 잔기들(예를 들면, 단백질 외부수송 신호(export signal) 서열의 아미노산 잔기들)에 대응하는 뉴클레오티드 잔기들을 포함할 수 있다.

“암호화(encoding)”는 유전자, cDNA, 또는 mRNA 등의 폴리뉴클레오티드들에서 뉴클레오티드들(즉, rRNA, tRNA, mRNA)의 특정(defined) 서열이나 아미노산의 특정 서열 중 하나와 거기서 기인한 생물학적 특성들을 갖는 생물학적 과정(process)에서 다른 중합체(polymer)들과 거대분자들의 합성을 위한 주형으로 역할하는 뉴클레오티드 특정 서열의 고유한 성질을 의미한다. 따라서, 세포나 다른 생물학적 시스템에서 유전자에 대응하는 mRNA의 전사와 번역이 단백질을 생산한다면, 그 유전자는 그 단백질을 암호화하는 것이다. mRNA 서열과 동일하고 보통 서열목록으로 제공되는 뉴클레오티드 서열인 암호화 사슬과 유전자나 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-암호화 사슬 모두 그 유전자나 cDNA의 단백질이나 다른 산물을 암호화하는 것으로 의미될 수 있다.

달리 특정되지 않는 한, “아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence encoding an amino acid sequence)”은 각각의 축퇴형(degenerate version)의 같은 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. 단백질과 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열들은 인트론(intron)들을 포함할 수 있다.

“발현벡터(expression vector)”는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연결된 발현 조절서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현벡터는 발현을 위해 충분한 시스작용 인자(cis-acting element)들을 포함하며, 발현을 위한 다른 인자들은 숙주세포나 시험관내(in vitro) 발현시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현벡터들은 재조합 폴리뉴클레오티드를 삽입시키는 코스미드(cosmid), 플라스미드(예를 들면, 네이키드(naked) 또는 리포좀에 함입된), 및 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 관련 바이러스들)와 같이 당업계에 알려진 모든 것들을 포함한다.

본 명세서에서 본 발명의 바이러스 유전자치료 벡터와 비교하여 사용된 “복제불능(replication defective)”이라는 용어는 바이러스 벡터가 독립적으로 더 복제하고 그것의 지놈(genome)을 패키징할 수 없는 것을 의미한다. 예를 들어, 대상 세포가 rAAV 비리온(virion)에 감염되었을 때, 이종의(heterologous) 유전자는 감염된 세포에서 발현되나, 감염된 세포에 AAV rep과 cap 유전자, 부수적인 기능 유전자들은 없으므로 rAAV는 복제할 수 없다.

본 명세서에서 사용된 “레트로바이러스 전달벡터(retroviral transfer vector)”는 전이유전자(transgene)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 나아가 벡터의 패키징에 필요한 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 발현벡터를 의미한다. 바람직하게는, 레트로바이러스 전달벡터 역시 세포에서 전이유전자를 발현시키는데 필요한 서열들을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 “패키징시스템(packaging system)”은 재조합 바이러스를 패키징하는 것과 관련된 바이러스 단백질들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 한 세트의 바이러스 구축물(construct)들을 의미한다. 통상적으로 패키징시스템의 구축물은 궁극적으로 패키지 세포 속으로 통합된다.

본 명세서에서 사용된 “제 2세대(second generation)” 렌티바이러스 벡터시스템(lentiviral vector system)은 보조(accessory) 유전자인 vif, vpr, vpu, nef 들이 결실되거나(deleted) 불활성화된(inactivated) 것과 같이, 기능적인 보조 유전자들이 결여된 렌티바이러스 패키징시스템을 의미한다(예를 들어, Zufferey et al., 1997, Nat. Biotechnol., 15:871-875 참조).

본 명세서에서 사용된 “제 3세대(third generation)” 렌티바이러스 벡터시스템은 제 2세대 벡터시스템의 특성을 갖고, 나아가 tat 유전자가 결실되거나 불활성화된 것과 같이, 기능적인 tat 유전자가 결여된 렌티바이러스 패키징시스템을 의미한다. 통상적으로, rev를 암호화하는 유전자는 분리된 발현 구축물에서 제공된다(예를 들어, Dull et al., 1998, J. Virol., 72(11):8463-8471 참조).

본 명세서에서 사용된 “위형(pseudotyped)”은 야생형의 외피(native envelope) 단백질을 이종이거나 기능적으로 변형된 막 단백질로 치환한 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “생체 외 투여(ex vivo administration)”는 개체(subject)에서 1차 세포(primary cell)를 추출하고, 형질도입되거나(transduced), 감염되거나(infected), 형질전이된(transfected) 재조합 세포를 만들기 위해, 그 세포에 벡터가 투여되고, 그 재조합 세포들이 같거나 다른 개체에 다시 투여되는 과정을 의미한다.

만약 두 영역(region)들이 서로 인접하거나 1000뉴클레오티드 잔기를 넘지 않게, 바람직하게는 100뉴클레오티드 잔기를 넘지 않게 떨어져 있다면, 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 영역은 올리고뉴클레오티드의 두 번째 영역의 “인접하여 위치한다(flank)”고 할 수 있다.

본 명세서에서 핵산서열이나 핵산분자에 사용된 “단편(fragment)”이라는 용어는, 참조 전장(reference full length) 핵산서열이나 핵산분자의 절편(segment)이나 일부(portion)로서, 참조 핵산서열이나 핵산분자의 전장보다 짧은 경우를 의미한다. 단편 핵산서열이나 핵산분자의 예는, 각각 전장 레날라제 cDNA 서열이나 분자의 절편이나 일부이다. 단편 핵산서열이나 핵산분자의 또 다른 예는, 각각 전장 지놈 레날라제 DＮA 서열이나 분자의 절편이나 일부이다. 단편은 자연형 또는 야생형의 cDNA나 유전자의 전장보다 짧은 어떠한 길이도 될 수 있다. 단편의 예들은 길이가 적어도 약 20, 적어도 약 50, 적어도 약 50에서 약 100, 적어도 약 100에서 약 200, 적어도 약 200에서 약 300, 적어도 약 300에서 약 350, 적어도 약 350에서 약 500, 적어도 약 500에서 약 600, 적어도 약 600에서 약 650, 적어도 약 650에서 약 800, 또는 적어도 약 800에서 약 1000인 뉴클레오티드들의 핵산들을 포함한다.

본 명세서에서 아미노산서열이나 아미노산분자에 사용된 “단편(fragment)”이라는 용어는 참조 전장 아미노산서열이나 아미노산분자의 절편이나 일부(portion)로서, 단편은 참조 아미노산서열이나 아미노산분자의 전장보다 짧다. 단편 아미노산서열이나 아미노산분자의 예는, 각각 전장 레날라제 cDNA 서열이나 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 절편이나 일부이다. 단편 아미노산산서열이나 아미노산분자의 또 다른 예는, 각각 전장 지놈 레날라제 DＮA 서열이나 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 절편이나 일부이다. 단편은 자연형의 또는 야생형의 cDNA나 유전자에 의해 암호화된 전장 폴리펩티드보다 짧은 어떠한 길이의 폴리펩티드도 될 수 있다. 단편의 예들은 길이가 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220,적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 또는 적어도 약 340 아미노산인 아미노산들을 포함한다.

“지놈 DNA(genomic DNA)”는 유전자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 사슬이다. 예를 들면, 염색체의 단편과 포유류 mRNA의 역전사에 의해 얻어진 cDNA 모두 지놈 DNA들이다.

본 명세서에서 사용된 “상동의(homologous)”은 예를 들면, 두 중합 분자들(polymeric molecule) 사이, 두 핵산 분자들 사이, 두 DNA 분자들 사이, 두 RNA 분자들 사이 또는 두 폴리펩티드 분자들 사이의 소단위체 서열 유사성을 의미한다. 두 분자들 모두의 소단위체 위치가 같은 단량 소단위체(monomeric subunit)에 의해 채워졌다면, 예를 들어 두 DNA 분자들 각각의 한 위치가 아데닌에 의해 채워졌다면, 이들은 그 위치에서 상동성이다. 두 서열들 간의 상동성(homology)은 짝이 되는 또는 상동성인 위치들의 수와 직접적 상관관계가 있다. 예를 들어, 두 화합물 서열 위치들의 절반(예컨대 길이가 10개 소단위체인 중합체에서 5개의 위치들)이 상동성이면 두 서열들은 50% 상동이고, 서열위치의 90%(예컨대 10개 중 9개)가 짝지어지거나 상동성이면 두 서열들은 90% 상동을 공유한다. 예를 들어, 3‘ATTGCC5'와 3’TATGGC'는 50% 상동을 공유한다.

본 명세서에서 사용된 “상동성(homology)”은 “동일성(identity)”과 동의어로 사용된다. 게다가, “상동성”이나 “동일성”이라는 용어들이 본 명세서에서 핵산과 단백질을 의미하기 위해 사용되는 경우, 그것은 핵산과 아미노산 서열 수준 모두에 상동이나 동일성이 적용되도록 해석되어야 한다. 만약, 두 올리고뉴클레오티드들이 서로 적어도 약 60%, 보다 바람직하게는 적어도 약 65%, 좀 더 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80% 및 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 상보적 결합(annealing)이 가능한 조건에서 결합할 경우, 첫 번째 올리고뉴클레오티드는 두 번째 올리고뉴클레오티드와 “고도의 엄밀도(high stringency)” 또는 “고도로 엄격한 조건(under high stringency condition)”으로 결합한다. 두 올리고뉴클레오티드가 결합하는데 이용되는 조건의 엄밀도(stringency)는, 다른 인자들 중에서, 온도, 결합매체(annealing medium)의 이온강도, 반응시간, 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 G-C 함량 및 두 올리고뉴클레오티드의 예상되는 비상동(non-homology) 정도와 함수관계에 있다. 결합조건의 엄밀도를 조절하는 방법은 알려져 있다(예를 들어, Sambrook et al ., 1989, In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 참조).

두 뉴클레오티드나 아미노산 서열들 간의 동일성백분율은 수학적 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 두 서열들을 비교하는데 유용한 수학적 알고리즘은 칼린(Karlin)과 알츠출(Altschul)의 알고리즘(참조: 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:2264-2268), 칼린(Karlin)과 알츠출(Altschul)의 변형(참조: 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:5873-5877)이다. 이 알고리즘은 알츠출(Altschul) 등의 NBLAST와 XBLAST 프로그램에 삽입되었고(참조: 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410), 예를 들어 NIH(National Institute of Health) NLM(National Library of Medicine)의 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트의 BLAST사이트에서 접속될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 핵산에 상동성인 뉴클레오티드 서열들을 얻기 위해, BLAST 뉴클레오티드 검색이 NBLAST 프로그램(NCBI 웹사이트에서 “blasn”으로 지정)으로 수행될 수 있으며, 다음 파라미터(parameter)들을 사용한다: gap penalty=5, gap extension penalty=2, mismatch penalty=3, match reward=1, expectation value 10.0, word size=11. 본 명세서에서 기술된 단백질 분자들에 상동성인 아미노산 서열들을 얻기 위해, BLAST 단백질 검색이 XBLAST 프로그램(NCBI 웹사이트에서 “blasn”으로 지정)이나 NCBI "blastp"프로그램으로 수행될 수 있으며, 다음 파라미터: expectation 10.0 와 BLOSUM62 scoring matrix가 이용된다.

비교목적으로 간극 정렬(gapped alignment)을 얻기 위해서는 간극(gapped) BLAST가 알츠출(Altschul) 등의 문헌(1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)에 기술된 대로 이용될 수 있다. 분자들(동일 문헌 참조) 사이의 먼 유연관계(distant relationship)와 공통 패턴을 공유하는 분자들 사이의 유연관계를 탐지하는 반복 검색을 수행하기 위해, PSI-Blast 나 PHI-Blast가 선택적으로 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, PSI-Blast, PHI-Blast 프로그램들을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어 XBLAST, NBLAST)의 초기 파라미터들은 NIH NLM의 NCBI 웹사이트에서 이용할 수 있다.

두 서열들 간의 동일성백분율은 상기 언급한 것과 유사한 기술을 이용하여 간극을 허용하거나 허용함이 없이 결정될 수 있다. 동일성백분율을 계산할 때, 통상적으로 정확한 짝지음(match)들이 세어진다.

본 명세서에서 사용된 “유전자(gene)”와 “재조합 유전자(recombinant gene)”라는 용어는, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 개방해독틀(open reading frame)을 포함하는 핵산 분자들을 의미한다. 이러한 자연형 대립유전자 변이(allelic variation)들은 주어진 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 통상적으로 1-5% 변이를 초래할 수 있다. 선택적인 대립유전자는 다수의 다른 개체들에서 목적하는 유전자를 서열결정함으로써 동정될 수 있다. 이것은 다양한 개체들에서 같은 유전자좌(locus)를 동정하기 위한 혼성화 탐침(hybridization probe)들을 이용함으로써 쉽게 수행될 수 있다. 자연적인 대립유전자 변이의 결과이며 기능적인 활성을 변경시키지 않는 뉴클레오티드 변이들 전부나 일부와 그로부터 기인하는 아미노산 다형태(polymorphism)나 변이들은 본 발명의 범주 내로 의도된다.

나아가, 본 명세서에서 기술된 마우스(mouse) 단백질들의 것과 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는 다른 종들(상동기관(homolog))의 본 발명의 단백질들을 암호화하는 핵산분자들은 본 발명의 범주 내에 있다. 자연적인 대립유전자 변이체(variant)와 본 발명의 cDNA 상동기관에 대응하는 핵산 분자들은 마우스 핵산 분자들에 대한 그들의 동일성(identity)에 근거하여, 엄격한 혼성화 조건 하에서 표준 혼성화 기술에 따라, 마우스의 cDNA, 그것의 일부(portion)를 혼성화 탐침으로 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 랫트 레날라제 단백질을 암호화하는 핵산의 상동성은 랫트 및/또는 인간 레날라제의 전부나 일부분을 암호화하는 핵산 분자와의 고도로 엄격한 조건 하에서의 혼성화에 근거하여 분리될 수 있다.

“분리된 핵산(isolated nucleic acid)”은 자연형 상태에서 그것에 인접하여 위치하는 서열들로부터 분리된 핵산 절편이나 단편, 예를 들어 일반적으로 단편에 인접하는 서열들로부터 제거된 DNA 단편, 자연형 지놈에서 단편(fragment)에 인접한 서열들을 의미한다. 이 용어는 RNA, DNA 등의 핵산 또는 단백질을 자연적으로 수반하는 다른 구축물로부터 충분히 정제된 핵산에도 적용된다. 그러므로, 이 용어는 예를 들면 벡터, 자발복제 플라스미드(autonomously replicating plasmid)나 바이러스, 원핵생물이나 진핵생물의 지놈 DNA에 삽입된 또는 다른 서열들과 독립적으로 분리된 분자(예를 들어 PCR이나 제한효소 처리에 의해 생성된 cDNA나 지놈 또는 cDNA 단편)로 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 추가적인 폴리펩티드 서열을 암호화하는 혼성 유전자의 일부인 재조합 DNA도 역시 포함한다.

본 명세서에 개시된 핵산 염기들에 대해 다음 약어가 사용된다. “A”는 아데노신(adenosine)을, “C”는 시티딘(cytidine)을, “G”는 구아노신(guanosine)을, “T”는 티미딘(thymidine)을, “U”는 유리딘(uridine)을 의미한다.

두 폴리뉴클레오티드를 “작동가능하도록 연결된(operably linked)”이라고 기술한 것은 단일사슬이나 이중사슬 핵산의 일부가 두 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 그것을 다른 것에 기초해 특징짓게 하는 생리적 효과를 가할 수 있는 방식으로 핵산 일부 안에 배열된 두 폴리뉴클레오티드들을 포함한 것을 의미한다. 예를 들면, 유전자의 암호화 영역에 작동가능하도록 연결된 프로모터는 암호화 영역의 전사를 촉진할 수 있다. 바람직하게는 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산이 프로모터/조절서열을 더 포함할 경우, 프로모터/조절서열은 세포에서 목적하는 단백질의 발현을 이끌도록 목적하는 단백질 암호화 서열의 5‘말단에 위치한다. 그와 함께 목적하는 단백질과 그것의 프로모터/조절서열을 암호화하는 핵산은 "전이유전자(transgene)"를 포함한다. 두 개의 폴리펩티드들이 작동가능하도록 연결되기 위해 반드시 서로 인접해 있을 필요는 없다.

본 명세서에서 사용된 “프로모터/조절서열(promoter/regulatory sequence)”이라는 용어는, 프로모터/조절서열에 작동가능하도록 연결된 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 핵산서열을 의미한다. 경우에 따라서, 이 서열은 핵심 프로모터 서열이고, 다른 경우에는 이 서열은 인핸서 서열과 유전자 산물의 발현에 필요한 다른 조절인자들 역시 포함할 수 있다. 예를 들면, 프로모터/조절서열은 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.

“지속성(constitutive)” 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하도록 연결될 때, 유전자 산물이 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건 하에서 살아 있는 사람 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.

“유도성(inducible)” 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하도록 연결될 때, 프로모터에 대응하는 유도인자(inducer)가 세포에 존재할 때만 살아 있는 사람 세포에서 유전자 산물이 충분히 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.

“조직특이적(tissue-specific)” 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하도록 연결될 때, 그 세포가 프로모터에 대응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 산물이 살아 있는 사람 세포에서 충분히 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.

“폴리아데닐화 서열(polyadenylation sequence)”은 전사된 mRNA 서열에 폴리 A 꼬리(poly A tail)를 부가시키는 폴리뉴클레오티드 서열이다.

“폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 핵산의 단일 사슬이나 평행(parallel)과 역평행(anti-parallel) 사슬들을 의미한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 단일사슬이나 이중사슬 핵산 중 어느 하나가 될 수 있다.

“핵산(nucleic acid)”이란 용어는 통상적으로 큰 폴리뉴클레오티드들을 의미한다.

“올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)”란 용어는 통상적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 일반적으로 약 50 뉴클레오티드보다 크지 않은 것들을 의미한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열에 의해 표시될 때(즉, A,T,G,C), 이것은 “T”가 “U”로 치환된 RNA 서열(즉, A,U,G,C) 역시 포함한다.

본 명세서에서는 폴리뉴클레오티드 서열을 기술하기 위해 통상적인 표기법이 사용된다: 단일 사슬 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단이 5’ 말단; 이중사슬 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5’방향으로 의미된다.

인접한 RNA 전사체에 대해 뉴클레오티드가 부가되는 5’에서 3’으로의 방향은 전사방향으로 의미된다. mRNA 등의 서열을 갖는 DNA 사슬은 “암호화 사슬(coding strand)”로 의미된다; DNA 상의 기준점에 대해 5’에 위치한 DNA 사슬 상의 서열은 “상류서열(upstream sequence)”로 의미된다; DNA 상의 기준점에 대해 3’에 있는 DNA 사슬 상의 서열은 “하류서열(downstream sequence)”로 의미된다.

본 명세서에서 사용된 “치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)”이란 용어는 상태(condition), 장애(disorder) 또는 질병(disease)을 치료하는데 효과적인 약물(agent)의 양을 의미한다.

폴리뉴클레오티드의 “일부(portion)”는 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 20개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들을 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 일부는 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있음을 알 수 있다. “프라이머(primer)”는 지정된 폴리뉴클레오티드 주형에 특이적으로 혼성화할 수 있고 상보적인 폴리뉴클레오티드 합성의 시작점을 제공하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 합성은 폴리뉴클레오티드 프라이머가 합성이 유발되는 조건, 즉 뉴클레오티드, 상보적인 폴리뉴클레오티드 주형, DNA 중합효소 등의 중합효소를 위한 인자가 있는 조건하에 위치할 때 일어난다. 프라이머는 통상적으로 단일사슬이지만 이중사슬일 수도 있다. 프라이머들은 통상적으로 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)이지만, 다양한 종류의 합성 그리고 자연형의 프라이머들이 많은 응용에 유용하다. 프라이머는 합성개시를 위한 자리를 제공하기 위해 그것이 혼성화하도록 설계된 주형에 상보적이지만, 그 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우, 주형에 대한 프라이머의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄밀도(stringency)에 달려 있다. 프라이머들은 예를 들어, 발색성(chromogenic), 방사성(radioactive) 또는 형광성(fluorescent) 부분에 의해 표지되고, 탐지할 수 있는 부위(moiety)로 사용될 수 있다.

“탐침(probe)”은 다른 폴리뉴클레오티드의 지정된 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 탐침은 상보적 폴리뉴클레오티드 목표물에 특이적으로 혼성화하지만 주형의 정확한 상보적 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우 탐침의 목표물에 대한 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄밀도에 달려 있다. 탐침들은 예를 들어, 발색성, 방사성, 또는 형광성 부분에 의해 표지되고, 탐지할 수 있는 일부로 사용될 수 있다.

“레날라제 저해제(renalase inhibitor)”는 세포나 조직에서의 레날라제 수준을 다른 조건이 동일한, 그 화합물이 없는 세포나 조직에서의 레날라제 수준과 비교할 때 탐지될 수 있는 정도로 저해하는 화합물을 의미한다. 레날라제의 수준은, 이에 제한되는 것은 아니나, 분자를 암호화하는 핵산의 발현 수준, 탐지할 수 있는 레날라제의 수준 및/또는 레날라제 활성수준을 포함한다. 레날라제 저해제들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 화학 합성물, 조효소, 항체, 리보자임(ribozyme), 안티센스(antisense) 분자, 핵산 등을 포함한다.

“재조합 폴리뉴클레오티드(recombinant polynucleotide)”는 자연적으로는 서로 결합하지 않는 서열들을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 증폭되거나 조립된(assembled) 재조합 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터에 삽입될 수 있고, 그 벡터는 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는데 이용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 비-암호화 기능(non-coding function)(예를 들면, 프로모터, 복제기원, 리보좀 결합부위 등) 역시 제공할 수 있다.

“재조합 폴리펩티드(recombinant polypeptide)”는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산되는 것이다.

“폴리펩티드(Polypeptide)”는 자연적으로 발생하는 구조적 변이체들 및 펩티드 결합들로 연결된 자연적으로 발생하지 않는 그것의 합성 유사체들과 연관되고, 자연적으로 발생하는 구조적 변이체들 및 자연적으로 발생하지 않는 그것의 합성 유사체들과 연관된 아미노산 잔기들을 포함하는 중합체를 의미한다. 합성 폴리펩티드들은, 예를 들면 폴리펩티드 자동합성기를 이용하여 합성될 수 있다.

“단백질(protein)”이란 용어는 통상적으로 큰 폴리펩티드들을 의미한다.

“펩티드(peptide)”라는 용어는 통상적으로 짧은 폴리펩티드들을 의미한다. 본 명세서에서는 폴리펩티드 서열들을 묘사하기 위해 통상적인 표기법이 사용된다: 폴리펩티드 서열의 왼쪽 끝은 아미노 말단이다; 폴리펩티드 서열의 오른쪽 끝은 카르복실 말단이다.

본 명세서에서 사용된 “레날라제(renalase)”라는 용어는 도파민, 노르에피네프린, 에피네프린 등의 생체에서 발생하는 모노아민(monoamine)들을 대사하는 신장에 의해 분비되는 신규한 모노아민 산화효소(monoamine oxidase)를 의미한다. 본 명세서에 개시된 레날라제 분자들은 본 명세서에 개시된 다른 폴리펩티드들과 고도의 및/또는 상당한 서열 동일성을 갖는 것들을 포함하는 부류의 분자들이다. 더 구체적으로, 추정되는 레날라제는 서열번호 1의 서열을 갖는 핵산과 적어도 약 40%의 서열 동일성을 공유할 것이다. 보다 바람직하게는, 레날라제를 암호화하는 핵산은 본 명세서에 개시된 서열번호 1과 적어도 약 45% 동일성 또는 적어도 약 50% 동일성 또는 적어도 약 55% 동일성 또는 적어도 약 60% 또는 적어도 약 65% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 좀 더 바람직하게는 핵산은 서열번호 1이다.

“레날라제(renalase)”라는 용어는 레날라제 아이소형(renalase isoform)들도 포함한다. 레날라제 유전자는 사람 지놈의 10번 염색체 상의 310188bp에 달하는 9개의 엑손(exon)들을 포함한다. 본 명세서에 개시된 레날라제 클론(clone)(서열번호 1, GenBank accession number: BC005364)은 1,2,3,4,5,6,8번 엑손을 포함하는 유전자이다. 사람 지놈 데이터베이스에서 보듯이, 적어도 두 개의 추가적인 레날라제 단백질의 선택적 스플라이싱 형태(alternatively-spliced form)가 있다. 하나의 선택적 스플라이싱 형태는 GenBank accession number AK002080(서열번호 3)과 NM_018363(서열번호 4)로서 사람 지놈 데이터베이스의 클론에 의해 식별되는 1,2,3,4,5,6,9번 엑손을 포함한다. 또 다른 선택적 스플라이싱 형태는 GenBank accession number BX648154(서열번호 5)로서, 사람 지놈 데이터베이스의 클론에 의해 식별되는 5,6,7,8번 엑손을 포함한다.

달리 지시되지 않는 한, “레날라제(renalase)”는 모든 알려진 레날라제(예를 들면, 랫트 레날라제, 사람 레날라제), 및 이에 제한되는 것은 아니나 마우스와 침팬지 레날라제를 포함하여, 본 명세서에 개시된 레날라제의 특성들 및/또는 물리적 특징을 갖는 발견될 레날라제를 포함한다.

“제한효소 부위(restriction site)”는 제한효소(restriction endonuclease)에 의해 인식되는 이중사슬 핵산의 부위를 의미한다. 만약, 핵산과 제한효소가 접촉될 때 제한효소가 그 부분에서 핵산의 양 사슬들을 절단할 수 있을 때, 이중사슬 핵산의 부분은 제한효소에 의해 “인식된다(recognized)”고 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 “특이적으로 결합한다(specifically binds)”라는 용어는, 예를 들면 단백질, 핵산, 항체 등과 같이 특정 분자를 인식하고 결합하지만, 시료의 다른 분자들은 충분히 인식하거나 결합하지 않는 화합물들을 의미한다.

만약 두 올리고뉴클레오티드들이 서로 적어도 약 70%, 적어도 약 73%, 더 바람직하게는 적어도 약 75%, 좀 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 좀 더 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 상보적 결합(annealing)이 가능한 조건에서 결합할 경우, 첫 번째 올리고뉴클레오티드는 두 번째 올리고뉴클레오티드와 “고도의 엄밀도(high stringency)”로 결합한다. 두 올리고뉴클레오티드가 결합하는데 이용되는 조건의 엄밀도는, 다른 인자들 중에서, 온도, 결합매질(annealing medium)의 이온 강도, 반응시간, 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 G-C 함량 및 두 올리고뉴클레오티드의 예상되는 비상동(non-homology) 정도와 함수관계에 있다. 결합조건의 엄밀도를 조절하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook et al ., 1989, In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 참조).

본 명세서에서 사용된 “전이유전자(transgene)”라는 용어는 외인성(exogenous) 핵산서열이 형질전환 세포나 포유동물에 의해 암호화되는 경우의 상기 외인성 핵산서열을 의미한다.

“재조합 세포(recombinant cell)”는 전이유전자를 포함하는 세포이다. 이러한 세포는 진핵세포이거나 원핵세포일 수 있다. 형질전환 세포는, 이에 제한되는 것은 아니나, 전이유전자를 포함하는 배 줄기세포(embryonic stem cell), 전이유전자를 포함하는 형질전환 ES 세포로부터 나온 키메라 포유동물로부터 얻어진 세포, 형질전환 포유동물, 그것의 태아 또는 태반조직으로부터 얻어진 세포, 및 전이유전자를 포함하는 원핵세포도 역시 포함한다.

“외인성 핵산(exogenous nucleic acid)”이라는 용어는 핵산을 세포나 동물에 용이하게 주입할 목적으로 개발된 기술을 이용하여 세포나 동물에 주입된 핵산을 의미한다. “태그(tag)” 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 목적하는 단백질에 연결될 때, 단백질을 위치시키거나, 세포 추출물(extract)로부터 정제하거나, 결합측정(binding assay)에 사용하기 위해 고정화시키거나, 그렇지 않으면 그것의 생물학적 특성 및/또는 기능을 연구하는데 사용하기 위해 이용될 수 있는 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “형질전환 포유동물(transgenic mammal)”이라는 용어는 그것의 세포들이 외인성 핵산을 포함하는 포유동물을 의미한다. 외인성 핵산은 포유동물의 지놈에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 “치료(treat)”는 ESRD, 고혈압, 심장혈관병, 정신병 등의 환자에 의해 경험되는 증상들의 빈도(frequency), 파급(extent), 중증도(severity) 및/또는 지속시간(duration)의 감소를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “벡터(vector)”라는 용어는 외인성 핵산을 암호화하는 플라스미드나 바이러스를 의미한다. 이 용어는 예를 들어, 폴리리신(polylysine) 화합물 등과 같이 핵산의 비리온(virion)이나 세포로의 수송을 용이하게 하는 비플라스미드와 비바이러스 화합물들을 포함하는 것으로도 해석되어야 한다. 벡터는 레날라제 단백질이나 포유동물의 레날라제를 암호화하는 핵산의 환자로의 수송을 위한 운반수단으로서 적합한 바이러스 벡터나 같은 목적에 적합한 비-바이러스 벡터일 수 있다.

DNA의 세포와 조직으로의 수송을 위한 바이러스와 비-바이러스 벡터들의 예들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 마 등의 문헌(Ma et al.)( 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 94:12744-12746)에 기술되어 있다. 바이러스 벡터의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 재조합 백시니아(vaccinia) 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 아데노 관련 바이러스, 재조합 조류수두바이러스(avian pox virus) 등을 포함한다(참조: Cranage et al., 1986, EMBO J. 5:3057-3063; 국제특허공개 WO94/17810, 1994년 8월 14일 공개; 국제특허공개 WO94/23744, 1994년 10얼 27일 공개). 비-바이러스 벡터들의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 리포좀, DNA의 폴리아민 유도체 등이 있다.

본 명세서에서 사용된 “녹-아웃 표적벡터(knock-out targeting vector)”라는 용어는 또 다른 핵산서열에 의해 결실 및/또는 치환될 목적하는 표적 서열에 인접하는 핵산 부분에 각각이 상보적인 두 개의 핵산서열을 포함하는 벡터를 의미한다. 따라서, 두 핵산서열들은 상동성 재조합(homologous recombination) 과정에 의해 제거될 표적 서열에 인접한다.

본 명세서에서 사용된 “만성신장병(chronic kidney disease)”이라는 용어는 60mL/min/1.73㎡ 이하의 GFR(glomerular filtration rate) 감소가 있거나 없는, 신장 손상이 있거나 없는 구조적 또는 기능적 이상에 의해 정의되는 3개월간의 신장 손상을 의미한다. GFR은 신장의 혈액을 여과하는 능력의 측정이며, 연속적인 척도이다. GFR은 혈청크레아티닌, 체중, 나이를 이용하여 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 “말기신장병(end stage renal disease, ESRD)”이라는 용어는 노폐물을 분비하고, 오줌을 농축하고, 전해질을 순환시키는 신장 기능의 완전한 또는 거의 완전한 상실을 의미한다. ESRD는 신장이 영구히 그 능력의 10% 미만으로 기능하게 될 때까지 만성신부전증(chronic renal failure)이 진행될 때 발생한다. 이 시점에서는 신장 기능이 너무 낮아져서 투석이나 신장이식 없이는 합병증이 다양해지고 심각해져, 체액과 체내 노폐물들의 축적으로 사망하게 될 것이다.

개시

Ⅰ. 분리된 핵산

A. 센스( sense ) 핵산

본 발명은 포유동물의 신장에서 발현되는 분자인 레날라제를 암호화하는, 서열번호 1의 서열을 갖는 적어도 하나의 핵산과 적어도 약 40% 동일성(identity)을 공유하는 분리된 핵산 또는 그것의 단편(fragment)을 포함한다. 선택적으로, 핵산은 본 명세서에 개시된 서열번호 1과 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 상동성을 갖는다. 본 발명의 한 가지 실시예에 따르면, 핵산서열이나 분자는 서열번호 1의 서열에 의해 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 15% 이상의 상동성을 공유하는 포유동물 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산 또는 그것의 단편을 포함한다. 정렬(alignment) 실험결과, 레날라제가 모노아민 산화효소 A와 13.2%의 아미노산 동일성을 갖는다는 것을 밝혔다.

바람직하게는, 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산에 의해 암호화된 단백질은 서열번호 2와 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 상동성을 갖는다. 본 발명의 한 가지 실시예에 따르면, 레날라제 폴리펩티드는 서열번호 2를 제공하는 핵산에 의해 암호화된다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 서열번호 1의 핵산은 37.8kDa의 분자량 계산치(calculated molecule mass)를 갖는 342 아미노산을 포함하는 사람 레날라제 단백질을 생산하기 위해 번역될 수 있다.

본 발명은 전적으로 본 명세서에 개시된 핵산과 아미노산 서열에만 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 개시에 의해, 다른 종의 포유동물들(예를 들어, 유인원(ape), 긴팔원숭이(gibbon), 소(bovine), 양(ovine), 말(equine), 돼지(porcine), 개(canine), 고양이(feline), 쥐(murine) 등)에 존재하는 레날라제 폴리펩티드들을 암호화하는 다른 핵산들도, 본 명세서의 랫트와 본 명세서에 개시된 레날라제 폴리펩티드를 암호화하는 사람 레날라제의 분리에 관한 실험예 부분에 기재된 절차(예를 들면, 지놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리의 탐색) 및 당업계에 잘 알려진(예를 들면, mRNA 시료를 이용하는 역전사 PCR) 또는 개발될 절차들에 따라 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.

나아가, 절차들의 일부는, 예를 들어 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)과 오스벨 등의 문헌(Ausubel et al.)(1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York)에 기술된 것과 같이 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 방법론을 이용하여, 레날라제의 돌연변이체, 유도체, 변이체들을 제조하는데 이용될 수 있을 것이다.

폴리펩티드를 암호화하는 DNA서열을 변경함으로써 단백질이나 폴리펩티드에서 아미노산 변화를 가하기 위한 절차들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상술한 책들에도 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 태그(tag) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 공유결합하는, 포유동물 레날라제를 암호화하는 핵산을 포함한다. 즉, 본 발명은, 태그 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열이 적어도 하나의 사람 레날라제를 암호화하는 핵산에 공유결합하는 키메라 핵산을 포함한다. 이러한 태그 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 녹색형광단백질(green fluorescent protein, (GFP), 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 태그 폴리펩티드(influenza virus hemagglutinin tag polypeptide), myc, myc-pyruvate kinase, myc-PK), His, 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), FLAG 태그 폴리펩티드, HA 태그 폴리펩티드 및 글루타치온-S-트란스퍼라제(glutathione-S-transferase(GST) 태그 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 본 발명이 상기의 태그 폴리펩티드들을 암호화하는 핵산에만 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이 태그 폴리펩티드과 실질적으로 유사한 방식으로 기능할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 어떠한 핵산서열 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 태그 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산은 세포, 조직(예를 들어, 혈관, 뼈 등), 및/또는 생체 전체(예를 들어, 양서류(amphibian) 및/또는 포유류 배(embryo) 등) 내에 레날라제를 위치시키고(localize), 세포에서 분비된 경우 레날라제를 탐지하고, 세포에서의 레날라제의 역할을 연구하는데 사용될 수 있다. 나아가, 태그 폴리펩티드의 부가는, 본 발명의 단백질이 쉽게 생산되고 정제되는 것과 같이 “태그된(tagged)” 단백질의 분리와 정제를 용이하게 한다.

B. 안티센스 ( antisense ) 핵산

어떤 상황에서는 레날라제의 발현을 저해하는 것이 바람직할 수 있으므로, 본 발명은 레날라제의 발현저해에 유용한 조성물(composition)들을 포함한다. 따라서, 본 발명은 포유동물 레날라제를 암호화하는 전장 핵산이나 그 일부에 상보적인 분리된 핵산을 특징으로 하며, 이 핵산은 전사에 대해 안티센스 방향(antisense orientation)에 있다. 안티센스 핵산은 서열번호 1 또는 그 단편과 적어도 약 40%의 상동성을 갖는 핵산에 상보적이다. 다른 실시예들에서, 안티센스 핵산은, 서열번호 1 또는 그 단편의 서열을 갖는 포유동물 레날라제를 암호화하는 핵산의 일부나 전장에 상보적인, 전사에 대해 안티센스 방향인 핵산에 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%의 상동성을 갖는다. 가장 바람직하게는, 핵산이 서열번호 1이나 그 단편인 핵산의 일부나 전장에 상보적이다. 이러한 안티센스 핵산은 신장 발현(레날라제) 분자의 발현, 기능 또는 둘 다를 저해시킨다.

나아가, 레날라제를 암호화하는 핵산의 전부나 일부에 상보적인 안티센스 핵산은, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 제자리 혼성화법(in situ hybridization)을 이용하여, 세포, 조직 및/또는 생체에서의 레날라제 mRNA 발현을 탐지하는데 이용될 수 있다. 따라서, 당업자라면, 본 명세서에 개시된 바에 근거하여, 본 발명이 레날라제 발현을 확인할 탐침으로 사용될 수 있는 안티센스 핵산들을 포함한다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 안티센스 분자들은 합성방법으로 만들어져 세포에 제공될 수 있을 것이다. 쉽게 합성되어 표적세포에 주입될 수 있으므로, 약 10 과 약 30 사이의 안티센스 올리고머, 더 바람직하게는 약 15 뉴클레오티드가 바람직하다. 본 발명에서 고려된 합성 안티센스 분자들은, 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드에 비해 생물학적 활성을 개선한, 당업계에 알려진 올리고뉴클레이드 유도체들을 포함한다(참조: Cohen, 전게서; Tullis, 1991, 미합중국 특허 제 5,023,243호(본 명세서 참고문헌 란에 기재)).

Ⅱ. 분리된 폴리펩티드

A. 폴리펩티드, 그 유사체( analog ) 및 변형( modification )

본 발명은 포유동물 레날라제를 포함하는 분리된 폴리펩티드도 역시 포함한다. 본 발명의 한 가지 실시예에 따르면, 포유동물 레날라제를 포함하는 분리된 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 적어도 약 15% 상동성을 갖는다. 다른 실시예들에서, 포유동물 레날라제를 포함하는 분리된 폴리펩티드는 랫트 레날라제에 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%,적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 상동성을 갖는다. 본 발명의 한 가지 실시예에 따르면, 포유동물 레날라제를 포함하는 분리된 폴리펩티드는 랫트 레날라제의 것이다. 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 포유동물 레날라제 분자를 포함하는 분리된 폴리펩티드는 서열번호 2이다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 것과 같이 레날라제를 포함하는 단백질이나 펩티드의 유사체도 제공한다. 유사체들은, 보존적인(conservative) 아미노산 서열차이나 서열에 영향을 주지 않는 변형 또는 양자 모두에 의해, 자연적으로 발생한 단백질이나 펩티드들과 다를 수 있다. 예를 들면, 보존적 아미노산 변경이 생길 수 있고, 이는 단백질이나 펩티드의 1차 서열을 변경시키기는 하지만, 일반적으로 그것의 기능은 변경되지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 통상적으로 다음 그룹들 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 페닐알라닌, 티로신.

(일반적으로 1차 서열을 변경하지 않는) 변형들은 생체 내(in vivo) 또는 시험관 내(in vitro)의, 예를 들어 아세틸화나 카르복실화 등의 화학적 유도체를 포함한다. 또한, 예를 들어 합성 및 변형 또는 더 변형하는 단계 동안 폴리펩티드의 당화패턴(glycosylation pattern)을 변형시키는 것; 포유동물의 당화 또는 탈당화(deglycosylating) 효소와 같이 당화에 영향을 미치는 효소에 폴리펩티드를 노출시키는 것들에 의해 발생하는 당화의 변형도 포함된다. 또한, 예를 들어 인티로신(phosphotyrosine), 인세린(phosphoserine), 인트레오닌(phosphothreonine)과 같이 인함유(phosphorylated) 아미노산 잔기를 갖는 서열들도 포함된다.

또한, 단백질 가수분해에 대한 저항성을 향상시키거나 용해성을 최적화하거나 치료제로서 더 적합하게 하기 위해, 일반적인 분자생물학적 기법들을 이용하여 변형시킨 폴리펩티드들도 포함된다. 이러한 폴리펩티드의 유사체는, 예를 들어 D-아미노산 또는 비자연적으로 발생하는 합성 아미노산과 같이 자연적으로 발생하는 L-아미노산이 아닌 잔기들을 포함하는 것들을 포함한다. 본 발명의 펩티드는 본 명세서에서 열거된 구체적 실시예에 의해 생산된 것에 제한되지 않는다.

본 발명은 본 발명의 펩티드(또는 그것을 암호화하는 DNA)의 “돌연변이(mutatnt)”, “유도체(derivative)”, “변이체(variant)”를 포함하는 것으로도 해석되어져야 하며, 돌연변이, 유도체, 변이체는, 하나 또는 그 이상의 아미노산(또는 그것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해서는 하나 또는 그 이상의 염기짝들)이 변경되어, 그 결과로 생기는 펩티드(또는 DNA)가 본 명세서에 열거된 서열과 동일하지는 않지만, 본 발명의 레날라제 펩티드의 생물학적/생화학적 특성을 갖고 있다는 점에서, 본 명세서에 개시된 펩티드 등의 생물학적 특성을 갖는 레날라제 펩티드이다.

나아가, 본 발명은 레날라제 아이소형(isoform) 및 자연적으로 발생하는 변이체나 재조합적으로 유도되는 레날라제 서열의 돌연변이를 포함하는 것으로 해석되어져야 하며, 변이체나 돌연변이는 그것에 의해 암호화 된 단백질이 본 발명의 전장(full-length) 클론보다 많거나 적은 또는 동등한 생물학적 활성을 갖게 한다.

B. 세포로부터의 폴리펩티드 생산 및 분리

본 명세서의 다른 부분에서 설명되었듯이, 본 발명은 레날라제를 생산하는 세포에서 레날라제 폴리펩티드를 생산하고 분리하는 방법에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 세포가 자라는 세포배지로부터 레날라제를 생산 및 분리하는 방법 역시 고려한다.

상기 방법들에 사용될 수 있는 세포들은 자연적으로 레날라제를 생산하는 세포 및 레날라제를 생산하도록 돌연변이되거나(mutated) 변형되거나(altered) 처리된(treated) 세포들을 포함한다. 이 세포들은 이러한 유형의 세포에 통상적인 양의 레날라제를 생산하는 것들 및 레날라제를 과잉생산하는 세포들을 포함한다. 레날라제를 자연적으로 생산하지 않거나 적은 양의 레날라제를 생산하는 세포는, 세포나 그것이 자라는 배지로부터의 그것의 분리에 물리적으로 및/또는 경제적으로 실제적인 양의 레날라제를 생산하도록 돌연변이되거나 변형되거나 처리될 수 있다.

일단 세포에서 생산된 경우, 레날라제는 단백질 분리 분야의 당업자에 잘 알려진 단백질 분리 기술들을 이용하여, 세포 및/또는 그들의 성장배지로부터 분리될 수 있다. 바람직하거나 필요하다면, 분리된 레날라제는 단백질 정제 분야의 당업자에게 잘 알려진 정제 기술을 이용하여 더 정제될 수 있다.

C. 체액( bodily fluid )으로부터의 폴리펩티드의 정제

본 발명은 동물, 특히 포유동물의 체액으로부터 레날라제 폴리펩티드를 정제하는 방법에 관한 것이기도 하다. 레날라제를 생산하는 동물은 그것의 체액으로부터 레날라제를 정제하는데 사용될 수 있다. 적합한 동물의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 마우스, 랫트, 말, 돼지, 개, 원숭이, 소 및 사람을 포함한다.

단편(fragment), 상동성 폴리펩티드(homologous polypeptide), 뮤테인(mutein), 유사체(analog), 유도체(derivative) 및 융합단백질(fusion protein)을 포함한 폴리펩티드의 정제는 잘 알려져 있고, 당업자의 기술 범위 내이다(예를 들어, Scopes, Protein Purification, 2d ed. (1987) 참조). 화학적으로 합성된 펩티드의 정제는 예를 들어 HPLC에 의해 쉽게 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 체액으로부터 레날라제 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 체액은, 이에 제한되는 것은 아니나, 혈액(blood), 혈청(serum), 혈장(plasma), 타액(saliva), 오줌(urine), 림프액(lymph fluid), 전혈(whole blood), 척수액 조직배양배지(spinal fluid tissue culture medium) 및 세포추출액(cellular extracts)을 포함한다. 체액으로부터의 레날라제 정제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 이온교환크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 리간드결합 친화성크로마토그래피, 젤투과크로마토그래피를 단독 또는 조합하여 수행하는 절차를 포함하여, 당업계에 알려진 어떠한 단백질 정제법에 의해서도 수행될 수 있다.

본 발명의 한 측면은, 안정화제의 존재 또는 부존재하에서 본 발명의 분리된 단백질을 순수(pure) 또는 실질적으로 순수한 형태로 제공하는 것이다. 안정화제는 단백질 관련 물질과 그렇지 않은 물질 모두를 포함하며, 당업계에 잘 알려진 것이다. 알부민과 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같이 안정화제는 알려져 있고, 사용할 수 있게 상품화되어 있다.

본 발명의 분리된 단백질이 백신 및 대치요법(replacement therapy)과 같이 치료제로 사용될 때 높은 수준의 순도가 선호되기는 하지만, 본 발명의 분리된 단백질은 낮은 순도에서도 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 부분적으로 정제된 단백질은 실험동물에서 항체를 생산하기 위한 면역원(immunogen)으로 사용될 수 있다.

D. 폴리펩티드의 활성

본 발명은 나아가 효소 활성을 위한 보조인자(cofactor)를 포함하는 약학조성물(pharmaceutical composition)을 제공한다. 본 명세서의 다른 부분에서 더 완전하게 기술되듯이, 레날라제는 그것의 기능을 발휘하기 위해 보조인자인 FAD(flavin-adenosine-dinucleotide)를 필요로 하는 FAD 함유 효소이다. 본 발명이 개시되면, FAD와 실질적으로 유사한 방식으로 기능을 수행하며 당업계에 잘 알려진 것과 같은 다른 효소 보조인자들이 레날라제 활성을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 이러한 보조인자들은, 이에 제한되는 것은 아니나, FAD 유사체(analog), NAD(nicotinamide adenine dinucleotide), NADP(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 티아민 피로인산염(thiamine pyrophosphate), FAD(flavin-adenosine-dinucleotide), FMN(flavin mononucleotide), 인산 피리독살(pyridoxal phosphate), 조효소 A(coenzyme A), 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate), ATP(adenosine triphosphate), GTP(guanosine triphosphate) 및 SAM(S-adenosyl methionine), 금속이온(metal ion), 헴(heme) 그룹 등의 금속 포르피린(metal porphyrin), 비오틴(biotin), α2-마이크로글로불린(α2-microglobulin), 티아민 피로인산염(thiamine pyrophosphate,) 조효소 A(coenxyme A), 인산 피리독살(pyridoxal phosphate), 조효소 B12, 비오시틴(biocytine), 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate) 및 리포산(lipoic acid)을 포함한다.

레날라제 활성은 동질다합체(homomultimer)나 이질다합체(heteromultimer)의 형성에 의해 조절될 수도 있다. 동질다합체는 셋 또는 그 이상의 동일한 소단위체(subunit)로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 반면에, 중합체 폴리펩티드(multimeric polypeptide)는 이질이합체(heterodimer), 즉 두 개의 다른 소단위체로 구성된 폴리펩티드이거나 적어도 두 개의 소단위체가 다른, 셋 또는 그 이상의 소단위체로 이루어진 이질다합체일 수 있다. 예를 들면, 중합체 폴리펩티드는 "단일(single)" 다합체 폴리펩티드를 형성하는 복수의 소단위체로 구성되거나 또는 차례로 단인자(monomeric) 및/또는 중합체(multimeric) 폴리펩티드일 수 있는, 작동가능하도록 연관된 복수의 폴리펩티드의 복합체로 구성된다.

동종이합체(homodimer)나 동질다합체(homomultimer)는 몇 개의 동일한 폴리펩티드 소단위체의 자연발생적 연관(association)에 의해 형성될 수 있다. 이질이합체(heterodimer)나 이질다합체(heteromultimer)는 몇 개의 다른 폴리펩티드 소단위체의 자연발생적 연관에 의해 형성될 수 있다. 레날라제는 이합(dimer) 또는 다중이합(multidimer) 복합체(complex)를 형성한다는 증거가 있다(참조: 도 6C). 레날라제의 이합체화(dimerization)나 중합체화(multimerizaion)는 효소활성에 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 레날라제 이합체나 중합체의 붕괴나 안정화는 다양한 치료목적에 특히 유용할 것이다.

E. 폴리펩티드의 이용

핵산 및 그것에 의해 암호화된 펩티드는 세포에서의 레날라제 기능을 밝히는데 유용한 도구이다. 나아가, 포유동물의 레날라제 분자를 구성하는 핵산과 아미노산은, 예를 들면 레날라제 발현에 영향을 미치는 화합물을 동정하는 것 등에 사용될 수 있는 유용한 표적이며, 고혈압, 신장병, 심장병 등에 대한 잠재적 치료제 후보물질이다. 핵산, 그것에 의해 암호화된 단백질 또는 둘 다는 포유동물의 레날라제 발현이나 활성을 증가 또는 감소시키기 위해 포유동물에 투여될 수 있다. 이것은, 포유동물에서의 레날라제의 저발현 또는 과발현(under or overexpression)이 건강한 포유동물의 일반적인 레날라제 발현과 비교한 레날라제의 변경된 발현과 관련된 병 또는 상태를 매개하는 상황에서 유용할 수 있다. 레날라제 발현이나 활성을 조절하는 것에 의해 영향받고 그로 인해 치료적 이점을 제공할 수 있는, 이러한 상태는 이에 제한되는 것은 아니나, 고혈압, 신장병, 심장병 등을 포함한다. 이것은, 본 명세서의 다른 곳에서 더 완전히 기술되듯이, 랫트에서 레날라제의 주입(infusion)이 혈압과 심장박동수를 낮추는 결과를 보였기 때문이다.

추가적으로 본 발명의 핵산과 아미노산은 레날라제 작용의 연구, 치료를 위한 새로운 진단 및 치료법의 확인 및 다른 것들 중에서 레날라제의 세포에서의 역할을 밝히는 데 유용한 도구가 되는, 재조합 세포 및 사람을 제외한 형질전환 포유동물을 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 형질전환 동물은 상태들과 관련된 신장 및 혈관병을 연구하는데 이용될 수 있다.

나아가, 본 발명의 핵산 및 아미노산은, ESRD(말기신장병), 고혈압, 심장병, 신장병, 심장혈관병 등의 중증도(severity) 및 예후(prognosis)를 평가하기 위해, 유전자발현수준이나 단백질 발현수준의 어느 하나를 측정함으로써 진단학적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 ESRD, 고혈압, 심장혈관병 등의 예방을 위한 요법의 효능을 측정하기 위한 측정법의 개발에도 유용하다. 즉, 본 발명의 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 레날라제 발현에 관한 다양한 치료들의 효과를 탐지하고, 그로부터, 이에 제한되는 것은 아니나, ESRD, 고혈압, 심장병, 신장병 및 심장혈관병에 대한 치료효능의 측정 등의 요법들의 효율을 확인하는데 이용될 수 있다.

F. 폴리펩티드의 소분자 저해제

본 명세서에 개시된 항체, 리보자임(ribozyme), RNAi(interfering RNA's) 및 안티센스 핵산분자에 더하여, 본 발명은 나아가 레날라제 활성을 조절하기 위해 소분자들을 이용하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 “잠재적 소분자 저해제(potential small molecule inhibitor)”라는 용어는 선택된 단백질에 결합하지만, 효소의 생물학적 활성을 저해하는 능력(예를 들면, 효소의 촉매속도(catalytic rate)를 감소시키는 것)은 아직 시험되지 않은 작은 분자를 의미한다. 이러한 저해적 특성이 확인되면, 그 소분자는 “소분자 저해제(small molecule inhibitor)” 또는 더 일반적으로 “저해제(inhibitor)”가 될 수 있다.

“소분자(small molecule)”이라는 용어는, 분자량이 약 5000 달톤(Daltons(5kD))과 같거나 적은 또는 약 3kD보다 적은 또는 약 2kD보다 적은 또는 약 1kD보다 적은 화합물을 의미한다. 일부 실시예들에서는 약 700Da과 같거나 적은 분자량을 가진 소분자가 바람직하다.

본 발명의 실시예에서 나타나듯이, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 등 본 발명의 단백질과 핵산은 카테콜아민(catecholamine)의 대사와 관련되어 있다. 단백질 또는 단백질의 최소한 하나의 활성의 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist) 등의 발현을 조절하거나 하향조절(down-regulation)하는 소분자는 단백질의 기능 및 활성과 관련된 생물학적 및 병리학적 과정들을 조절하는데 이용될 수 있다.

병리학적 과정(pathological process)은 해로운 효과를 발생시키는 생물학적 과정의 범주를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 단백질에 대한 비발현 또는 발현의 하향조절은 ESRD 등의 특정 질병과 관련되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용되었듯이, 소분자 저해제는, 그 물질이 그 과정의 정도나 중증도를 감소시킬 때, 병리학적 과정을 조절한다고 한다. 예를 들어, 어떤 방식으로 본 발명의 단백질 발현이나 적어도 하나의 활성을 감소 또는 조절하는 물질의 투여에 의해 병은 예방되거나 그 진전이 조절될 수 있다.

본원 발명의 소분자 저해제는 단독으로 또는 특별한 병리학적 과정(pathological process)을 조절하는 물질과 조합하여 제공될 수 있다. 본 명세서에서 사용되었듯이, 두 개의 소분자는, 두 소분자들이 동시에 투여되거나 물질들이 동시에 작용하는 것 등의 방식으로 독립적으로 투여될 때 조합으로 투여된다(administered in combination)고 한다.

본 발명의 소분자 저해제는 비-경구(parenteral), 피하(subcutaneous), 정맥(intravenous), 근육 내(intramuscular), 복막 내(intraperitoneal), 피부경유(transdermal) 또는 볼(buccal) 경로를 거쳐 투여될 수 있다. 선택적으로 또는 동시적으로 경구투여가 가능하다. 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 몸무게, 만약 있다면, 동시 치료의 종류, 치료 빈도 및 목적하는 효능의 성격에 달려 있다.

Ⅲ. 벡터( vector )

A. 시험관 내( in vitro ) 발현을 위한 벡터

다른 관련된 측면에 의하면, 본 발명은, 프로모터/조절서열을 포함하는 핵산에 작동가능하도록 연결되어 핵산이 적절하게 핵산에 의해 암호화된 단백질의 발현을 지시할 수 있게 하는, 포유동물 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산을 포함한다. 따라서, 본 발명은 발현벡터 및 외부 DNA(exogenous DNA)를, 예를 들어 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌(1989, 전게서) 및 오스벨 등의 문헌(Ausubel et al.)(1997, 전게서)에 기술된 것 등의 동시에 외부 DNA가 발현되는 세포로 주입시키는 방법을 포함한다.

일반적으로, 레날라제를 발현하지 않거나 태그 폴리펩티드와 융합되어 레날라제를 발현시키지 않는 세포에서, 단독의 또는 탐지가능한 태그 폴리펩티드와 융합된 레날라제의 발현은, 플라스미드, 바이러스 또는 벡터가 삽입된 세포에서 표지를 갖거나 갖지 않은 단백질의 발현을 이끌도록 하는 프로모터/조절서열에 작동가능하도록 연결된 목적하는 핵산을 포함하는 다른 유형의 벡터에 의해 수행될 수 있다. 유전자의 지속성 발현(constitutive expression)을 이끄는 데 유용한 많은 프로모터/조절서열이 당업계에서 입수가능하고, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 라우스육종바이러스(rous sarcoma virus) 프로모터 뿐 아니라, 본 명세서에 기술된 실험예에 사용된 사이토메가바이러스 조기발현 프로모터 인핸서(cytomegalovirus immediate early promoter enhancer) 서열, SV40 조기 프로모터(early promoter) 등을 포함한다. 게다가, 레날라제를 암호화하는 핵산의 유도성(inducible) 및 조직특이적(tissue specific) 발현은 태그(tag)를 갖거나 갖지 않는 레날라제를 암호화하는 핵산을, 유도성 또는 조직특이적 프로모터/조절서열의 조절하에 있도록 위치시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 목적에 유용한 조직특이적 또는 유도성 프로모터/조절서열의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, MMTV LTR 유도성 프로모터 및 SV40 후기(late) 인핸서/프로모터를 포함한다. 게다가, 금속, 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 등의 유도제에 의하여 유도되는 당업계에 잘 알려진 프로모터 역시 본 발명에 고려되었다. 따라서, 본 발명이, 알려지든 알려지지 않았든, 그것에 작동가능하도록 연결된 목적하는 단백질의 발현을 이끌 수 있는 어떠한 프로모터/조절서열의 이용도 포함한다는 것이 인정될 것이다.

벡터를 이용한 레날라제의 발현은 많은 양의 재조합적으로 생산된 단백질의 분리를 가능하게 한다. 나아가, 결핍되거나 감소하는 레날라제 발현수준이 그 발현과 관계된 질병, 장애 또는 상태를 야기하는 곳에서, 프로모터/조절서열에 의한 레날라제의 발현은, 이에 제한되는 것은 아니나, 레날라제가 제공되는 유전자치료를 포함하는 유용한 치료법을 제공할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 레날라제가 제공되는 유전자치료를 포함하여, 레날라제를 투여하는 것이, 레날라제의 발현 및 단백질수준의 증가 또는 감소된 단백질 활성과 관련된 병, 장애 또는 상태에 대한 유용한 치료법이 될 수 있다. 따라서, 효과적인 치료법을 제공하는데 레날라제의 발현 및/또는 활성을 감소 및 증가시키는 것 모두 유용할 수 있으므로, 본 발명은 레날라제의 발현, 번역 및/또는 활성을 저해하는 방법 뿐 아니라, 레날라제 발현, 단백질 수준 및/또는 활성을 증가시키는 것과 관련된 방법도 역시 포함한다.

특정한 플라스미드 벡터나 다른 DNA 벡터의 선택은 본 발명의 제한요소가 아니며, 다양한 종류의 벡터가 당업계에 잘 알려져 있다. 나아가, 특정 프로모터/조절서열을 선택하고, 그 프로모터/조절서열을 목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하도록 연결하는 것은 당업자라면 누구나 할 수 있는 범위에 있다. 이러한 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 샘브룩(Sambrook)의 전게서 및 오스벨(Ausubel)의 전게서에 기술되어져 있다.

따라서, 본 발명은 포유동물의 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 목적하는 핵산의 벡터 내로의 주입(incorporation) 및 벡터의 선택은 예를 들면, 샘브룩 등(Sambrook et al)의 전게서 및 오스벨 등(Ausubel et al )의 전게서에 기술된 것과 같이, 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명은 이러한 벡터를 포함하는 세포, 바이러스, 프로바이러스 등도 역시 포함한다. 벡터 및/또는 외부 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 샘브룩 등(Sambrook et al )의 전게서 및 오스벨 등(Ausubel et al )의 전게서 참조).

레날라제를 암호화하는 핵산은 다양한 플라스미드 벡터로 클로닝될 수 있다. 그러나, 본 발명은 플라스미드나 특정 벡터에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 대신에 본 발명은 쉽게 이용할 수 있고/있거나 당업계에 잘 알려진 수많은 벡터들 및 벡터가 전혀 없는 경우를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

B. 생체 내( in vivo ) 및 생체 외( ex vivo ) 발현을 위한 벡터

레날라제 폴리펩티드는, 본 발명과 일치하여 이러한 폴리펩티드의 생체 내(in vivo)에서의 발현을 통해서도 이용될 수 있으며, 이는 종종 “유전자 치료(gene therapy)”라 불린다.

따라서, 예를 들면 환자의 세포는 생체 외(ex vivo)에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 가지고 변형(engineered)될 수 있으며, 변형된 세포는 폴리펩티드에 의해 치료되도록 환자에 제공된다. 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 의해 알 수 있음이 명백하다. 예를 들면, 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 가진 레트로바이러스 플라스미드 벡터의 이용에 의해 변형될 수 있다.

마찬가지로, 세포는 폴리펩티드의 생체 내의 발현을 위해, 예를 들면 당업계에 알려진 방법으로 생체 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 패키징 세포(packaging cell)는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 갖는 레트로바이러스 플라스미드 벡터로 형질도입되어, 패키징 세포가 목적하는 유전자를 포함하는 감염성 바이러스 입자를 생산한다. 이러한 생산자 세포는, 생체 내에서의 세포변형 및 폴리펩티드의 발현을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 투여하기 위한 방법들은, 당업자라면 본 발명으로부터 알 수 있음이 명백하다.

본 발명은, 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드나 단백질을 암호화하는 서열 및 자가절단서열(self processing cleavage sequence)을 포함하는 구축물을 세포 내로 도입하여 단백질을 발현시키기 위한 다양한 벡터의 이용을 고려한다. 발현벡터의 수많은 예들은 당업계에 알려져 있고, 바이러스나 비-바이러스 기원일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 비-바이러스 유전자 전달 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드, 리포좀, 핵산/리포좀 복합체, 양이온 지질 등을 포함한다.

바이러스 벡터는 효율적으로 세포를 형질전환시키고, 그것들의 DNA를 숙주세포 안으로 도입시킬 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 만들 때, 비-필수적 유전자는 목적하는 단백질이나 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로 대체된다. 대표적인 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스(lentiviral) 벡터 포함), 아데노바이러스(adenoviral, Ad)) 벡터 및 그것의 복제경쟁(replication competent), 복제결핍(replication deficient) 및 겉레스(gutless) 형태, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안바이러스(simian virus) 40(SV-40) 벡터, 소 유두종바이러스(bovine papilloma) 벡터, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr) 벡터, 허피스바이러스 벡터, 우두바이러스(vaccinia) 벡터, Molony 마우스백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia) 벡터, Harvey 마우스육종 바이러스(Harvey murine sarcoma virus) 벡터, 마우스유암 바이러스(murine mammary tumor virus) 벡터, 라우스육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 벡터 및 비-바이러스 플라스미드와 같이 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 포함한다.

벡터는 통상적으로 복제기원을 갖고 있고, 추가적으로 벡터가 동정되고(identified), 선택(selected)될 수 있는 “마커(marker)” 또는 “선택마커(selectable marker)” 기능을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 어떠한 선택마커도 사용될 수 있지만, 재조합 벡터에 사용을 위한 선택마커는 일반적으로 당업계에 알려져 있고, 적절한 선택마커의 선택은 숙주세포에 달려 있다. 항생제나 다른 독소에 대한 저항성을 주는 단백질을 암호화하는 선택마커 유전자의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 암피실린(ampicillin), 메토트렉세이트(methotrexate), 테트라사이클린(tetracycline), 네오마이신(neomycine)(참조: Southern et al ., J., J. Mol. Appl. Genet., 1(4):327-41(1982)), 마이코페놀산(mycophenolic acid)(참조: Mulligan et al., Science, 209:1422-7(1980)), 퓨로마이신(puromycin), 제오마이신(zeomycin), 히그로마이신(hygromycin)(참조: Sugden et al ., Mol. Cell Biol., 5(2):410-3(1985)) 및 G418을 포함한다. 당업자라면 이해하듯이, 발현벡터는 통상적으로, 발현될 암호화서열에 적절하게 리보솜 결합부위, RNA 스플라이스(splice) 부위, 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 부위 및 전사 종결서열(transcriptional terminator sequence) 뿐만 아니라, 복제기원, 암호화서열 또는 발현될 서열에 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함한다.

벡터나 다른 DNA서열에 대해 “재조합(recombinant)”이라는 것은 통상적으로, 분리될 때 작동가능하도록 연결되지 않거나 자연에서 발견되지 않는 DNA 서열의 작동가능한 연결을 의미한다. 조절(발현 및/또는 제어(control))서열은, 발현 및/또는 제어서열이 핵산서열의 전사와 번역을 적절히 조절하는 경우에, 서열을 암호화하는 핵산에 작동가능하도록 연결되어 있다. 따라서, 발현 및/또는 제어서열은 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 전사종결자(transcription terminator), 암호화서열의 5‘에 있는 시작코돈(즉, ATG), 인트론(intron)에 대한 스플라이싱(splicing) 신호 및 정지코돈을 포함할 수 있다.

아데노바이러스 유전자치료 벡터는 강한 일시적 발현, 뛰어난 적정농도(titer) 및 생체 내에서 분열 및 비-분열 세포를 형질전환 시키는 능력을 보이는 것으로 알려졌다(참조: Hitt et al., Adv in Virus Res., 55:479-505, 2000). 본 발명의 재조합 Ad 벡터는: (1) 벡터가 복제불능 아데노비리온(replication-defective Ad virion)에 삽입되도록 하는 패키징 부위; (2) 목적하는 둘 또는 그 이상의 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 암호화서열 및 (3) 단독의 또는 추가적인 단백분해 절단부위(proteolytic cleavage site)와 조합한 자가절단부위(self-processing cleavage site)를 암호화하는 서열을 포함한다. 감염성 비리온(virion)으로의 함입(incorporation)에 필요하거나 도움이 되는 다른 인자들은 5′ 및 3′ Ad ITR, E2 유전자, E4 유전자 및 선택적으로 E3 유전자의 일부를 포함한다.

본 발명의 재조합 Ad 벡터를 캡슐화하는 복제불능 아데노비리온(replication-defective Ad virion)은, Ad 패키징 세포 및 패키징 기술을 이용하는 당업계에 알려진 표준기술에 의해 만들어진다. 이러한 방법들의 예는, 예를 들면 미합중국 특허 제 5,872,005호에서 확인된다. 둘 또는 그 이상의 목적하는 폴리펩티드나 단백질에 대한 암호화서열은 일반적으로 바이러스 지놈의 결실된 E3부위에서 아데노바이러스 속으로 삽입된다. 본 발명의 실제적 이용을 위해 바람직한 아데노바이러스 벡터는 하나 또는 그 이상의 야생형(wild-type) Ad 유전자 산물, 예를 들어 E1a, E1b, E2, E3 및 E4를 발현하지 않는다. 바람직한 실시예는 통상적으로 E, E2A, E4 및 선택적으로 E3 유전자 영역의 기능을 보충하는 패키징 세포주와 함께 사용되는 비리온이다(예를 들어, 미합중국 특허 제 5,872,005, 5,994,106, 6,133,028 및 6,127,175호를 참고). 따라서, 본 명세서에서 사용된 “아데노바이러스(adenovirus)” 및 “아데노바이러스 입자(adenovirus particle)”은 바이러스 그 자체 또는 그 유도체를 의미하며, 달리 지시하지 않는 한, 자연적으로 발생하는 형태 및 재조합 형태의 모든 혈청형(serotype), 아형(subtype) 및 양자 모두를 포함한다. 이러한 아데노바이러스는 야생형일 수도 당업계에 알려지거나 본 명세서에 개시된 다양한 방법으로 변형된 것일 수도 있다. 이러한 변형은 감염성 바이러스를 만들기 위하여 입자에 패키지 된 아데노바이러스 지놈에 대한 변형을 포함한다. 이러한 변형은, E1a, E1b, E2a, E2b, E3 또는 E4 암호화부위에서의 하나 또는 그 이상의 결실과 같이 당업계에 알려진 결실을 포함한다. 대표적인 패키징 및 생산자 세포는 293, A549 또는 HeLa 세포에서 나온다. 아데노바이러스 벡터는 당업계에 알려진 표준기술을 이용하여 정제되고 이용할 수 있는 형태로 된다.

아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus(AAV))는 염색체 통합(integration)에 의해 잠복성(latently) 세포 감염을 할 수 있는, 헬퍼-의존적(helper-dependent) 사람 파르보바이러스(parvovirus)이다. 그것의 염색체에 통합할 수 있는 능력 및 비병원성 때문에, AAV는 사람 유전자치료 벡터로서 상당한 잠재력이 있다. 본 발명의 실제적 이용을 위해 rAAV 비리온은 당업자에게 알려진 표준방법을 이용하여 생산되고, 전사 방향에서 작동가능하도록 연결된 구축물처럼 전사개시, 종결서열 및 목적하는 암호화서열을 포함하는 조절서열을 포함하도록 구성된다. 더 구체적으로, 본 발명의 재조합 AAV 벡터는: (1) 벡터가 복제불능 AAV 비리온(replication-defective AAV virion)으로 삽입되게 하는 패키징 부위; (2) 목적하는 둘 또는 그 이상의 단백질이나 폴리펩티드에 대한 암호화서열; (3) 단독의 또는 추가적인 단백분해 절단부위와 조합으로 자가절단부위(self-processing cleavage site)를 암호화하는 서열을 포함한다. 본 발명의 실제적 이용을 위한 AAV 벡터는 전사방향에 있어 작동가능하도록 연결된 구축물처럼 전사개시 및 종결서열을 포함하는 조절서열로 구성된다. 이 구축물들은 기능적인 AAV ITR 서열의 5′ 및 3′ 말단의 측면에 위치한다. “기능적인 AAV ITR 서열(functional AAV ITR sequence)”은 ITR 서열이 위기상황(rescue), 복제 및 AAV 비리온의 패키징을 위해 의도된 대로 기능하는 것을 의미한다.

재조합 AAV 벡터는, 그것들이 표적세포에서 목적하는, 선택된 재조합 단백질이나 폴리펩티드의 발현 및 생산을 이끌 수 있다는 점에서도 역시 특징지어진다. 따라서, 재조합 벡터는, 적어도 단백질막으로 싸는 것(encapsidation)에 필수적인 모든 AAV 서열 및 재조합 AAV(rAAV) 비리온의 감염을 위한 물리적 구조로 구성된다. 따라서, 본 발명의 벡터에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열(예를 들면, Kotin, Hum. Gene Ther., 5:793-801, 1994 참조)을 가질 필요가 없으며, 뉴클레오티드의 삽입(insertion), 결실(deletion) 또는 치환(substitution)에 의해 변형되거나, 여러 AAV 혈청형의 일부로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니나, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 등을 포함하여, 아데노 관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. 바람직한 rAAV 발현벡터는 전부 또는 일부 결실된 야생형 REP 및 CAP 유전자를 갖지만, 기능적인 측면에 위치하는 ITR 서열은 유지된다.

통상적으로, AAV 발현벡터는, AAV 헬퍼구성물(helper construct)의 도입(introduction)에 따라 생산세포(producer cell) 속으로 주입되며, 헬퍼구성물은 생산자 세포 내에서 발현될 수 있고, AAV 발현벡터에 없는 AAV 헬퍼(helper)의 기능을 보충하는 AAV 암호화부위를 포함한다. 본 명세서에 사용된 “AAV 도움기능(AAV helper function)”라는 용어는, rAAV 벡터에서 사라진 AAV 바이러스 기능을 보충하기 위해 숙주 세포에서 발현될 수 있는 AAV 암호화부위를 의미한다. 통상적으로, AAV 도움기능은 AAV rep 암호화부위 및 AAV cap 암호화부위를 포함한다. 헬퍼구성물은 큰 Rep 단백질(Rep78 및 Rep68)의 발현을 하향조절(down regulate)하도록 설계될 수 있고, 통상적으로, 미합중국 특허 제 6,548,286호에 기술되듯이, ATG부터 ACG까지 p5에 이은 시작코돈을 돌연변이시킨다.

AAV 발현벡터의 생산세포로의 도입은 통상적으로 헬퍼바이러스(helper virus) 및/또는 추가적인 벡터의 생산세포로의 도입을 따르며, 헬퍼바이러스 및/또는 추가적인 벡터는 효율적인 rAAV 바이러스 생산을 지원할 수 있는 보조기능(accessory function)들을 제공한다.

“보조기능(accessory function)”은 복제를 위해 AAV가 필요로 하나, AAV 비리온 자체에 의해서는 제공되지 않는 기능들을 의미한다. 따라서, 이러한 보조기능 및 인자들은, 숙주 세포, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 허피스 심플렉스바이러스(herpes simplex virus) 또는 유두(vaccinia) 바이러스) 또는 같은 세포에서 함께 발현되는 발현벡터에 의해 제공되어야 한다. 일반적으로, 아데노바이러스의 E1A 및 E1B, E2A, E4 및 VA 암호화부위가 AAV 복제 및 패키징에 필요한 보조기능들을 지원하는데 이용된다(참조: Matsushita et al., Gene Therapy 5:938[1998]).

그 후 생산세포는 rAAV를 생산하기 위해 배양된다. 이 단계는 표준 방법론에 의해 수행된다. 본 발명의 재조합 AAV 벡터를 캡슐화하는(encapsulating) 복제불능 AAV 비리온(replication-defective AAV virion)은, AAV 패키징세포(packaging cell)와 패키징 기술을 이용한 당업계에 알려진 표준기술에 의해 만들어진다. 이러한 방법들의 예는, 예를 들면 미합중국 특허 제 5,436,146, 5,753,500, 6,040,183, 6,093,570 및 6,548,286호에서 찾아볼 수 있다. 나아가, 패키징을 위한 조성물 및 방법은 왕 등의 문헌(Wang et al., US 2002/0168342)에 기술되어 있고, 이 기술들은 당업자의 지식범위 내이다. AAV 벡터와 AAV 헬퍼구성물(helper construct) 모두 하나 또는 그 이상의 선택적인 마커 유전자를 포함하도록 구성될 수 있다. 적절한 선택배지에 항생제 저항성 또는 민감성을 주는 선택 마커유전자는 일반적으로 당업계에 알려져 있다.

“AAV 비리온(AAV virion)”이라는 용어는, “야생형(wild-type)”(wt) AAV 바이러스 입자(AAV 캡시드(capsid) 단백질 막(coat)과 관련된 선형(linear), 단사슬(single-stranded) AAV 핵산 지놈 포함)와 같이, 완전한 바이러스 입자를 의미한다. 반면에, “재조합 AAV 비리온(recombinant AAV virion)” 및 “rAAV 비리온(rAAV virion)”은 AAV ITR의 양 옆에 위치한 목적하는 이종유래 DNA 서열을 포함하는 감염성 바이러스 입자를 의미한다.

본 발명을 실시함에 있어, rAAV 비리온을 생산하기 위한 숙주세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 미생물 및 효모를 포함한다. 숙주세포는, AAV 벡터 지놈이 안정하게 유지되고 패키징되는 숙주세포나 생산세포에서 AAV rep 및 cap 유전자가 안정하게 유지되는 패키징 세포가 될 수도 있다. 대표적인 패키징 및 생산 세포는 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래된다. AAV 벡터는 당업계의 표준기술을 이용하여 정제되고 이용가능한 형태로 된다.

레트로바이러스벡터 역시 유전자전달을 위한 흔한 도구이다(참조: Miller, Nature 357:455-460, 1992). 레트로바이러스 벡터 및 더 특별하게 렌티바이러스(lentiviral) 벡터는 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 “레트로바이러스(retrovirus)” 또는 “레트로바이러스 벡터(retroviral vector)”라는 용어는 각각 “렌티바이러스(lentivirus)” 및 “렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)”를 포함하는 것을 의미한다. 레트로바이러스 벡터는, 넓은 범위의 표적 세포의 지놈 내로 목적하는 유전자를 안정하게 도입하는데 적합한 운반체(delivery vehicle)임이 실험을 통해 밝혀졌다. 레트로바이러스 벡터의, 재배열되지 않은(unrearranged), 싱글 카피(single copy) 전이유전자를 세포 내로 전달하는 능력은, 레트로바이러스 벡터가 유전자를 세포내로 전달하는데 적합하게 만든다. 나아가, 레트로바이러스는 레트로바이러스 막 당단백질(retroviral envelope glycoprotein)이 숙주세포의 세포 표면 수용체(cell surface receptor)에 특이적으로 결합함으로써 숙주세포 내로 들어간다. 결과적으로, 암호화된 자연형(native) 막단백질이 그것과 다른 세포 특이성을 갖는(예를 들어, 자연형 막단백질과 비교하여 다른 세포표면 수용체에 결합하는) 이종유래(heterologous) 막단백질로 대체되는 위형(pseudotyped) 레트로바이러스 벡터도 역시 본 발명의 실시에 유용함을 알 수 있다. 특정 표적 세포에 대한 하나 또는 그 이상의 표적 단백질 암호화 서열을 암호화하는 레트로바이러스 벡터의 전달을 지시하는 능력은 본 발명의 실행에 바람직하다.

예를 들어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 전이유전자 서열 및 하나 또는 그 이상의 패키징 인자를 포함하는 레트로바이러스 패키징 벡터를 포함하는 레트로바이러스 전달 벡터를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 특히, 본 발명은 위형(pseudotyped) 레트로바이러스를 생산하기 위한 이종유래 또는 기능적으로 변형된 막단백질을 암호화하는 위형 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명의 레트로바이러스 벡터의 핵심 서열은, 예를 들어 스퍼머바이러스(spumaviruse) 및 렌티바이러스(lentiviruse) 뿐 아니라, B, C 및 D형 레트로바이러스를 포함한 다양한 종류의 레트로바이러스로부터 쉽게 유래될 수 있다(참조: RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). 본 발명의 조성물 및 방법의 이용에 적합한 레트로바이러스의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 렌티바이러스를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 이용에 적합한 다른 레트로바이러스는, 이에 제한되는 것은 아니나, 조류백혈구증 바이러스(Avian Leukosis Virus), 소백혈병바이러스(Bovine Leukemia Virus), 마우스백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus), 밍크세포 포커스유도바이러스(Mink-Cell Focus-Inducing Virus), 마우스육종 바이러스(Murine Sarcoma Virus), 조류망상내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis virus) 및 라우스육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)를 포함한다. 바람직한 마우스백혈병 바이러스는 4070A 및 1504A(참조: Hartley 및 Rowe, J. Virol., 19:19-25, 1976), Abelson(ATCC No. VR-999), Friend(ATCC No. VR-245), Graffi, Gross(ATCC No. VR-590), Kirsten, Harvey Sarcoma Virus 및 Rauscher(ATCC No. VR-998) 및 Moloney Murine Leukemia Virus(ATCC No. VR-190)를 포함한다. 이 레트로바이러스는 American Type Culture Collection("ATCC"; Rockville, Md.) 등의 기탁기관(depository)이나 종균협회(collection)로부터 용이하게 입수할 수 있고, 흔히 이용할 수 있는 기술을 이용하여 알려진 출처로부터 분리될 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 레트로바이러스 벡터서열은 렌티바이러스로부터 유래된다. 바람직한 렌티바이러스는 사람 면역결핍바이러스(immunodeficiency virus), 예를 들어 유형(type) 1 또는 2(즉, 이전에 HTLV-Ⅲ(lymphadenopathy associated virus 3) 및 AIDS(acquired immune deficiency syndrome) 관련 바이러스(ARV)로 불리던 HIV-1 또는 HIV-2) 또는 동정되고, AIDS 또는 AIDS 유사 병과 연관된 또 다른 HIV-1 또는 HIV-2 관련 바이러스이다. 다른 렌티바이러스는 염소 비스나/매디 바이러스(sheep Visna/maedi virus), FIV(feline immunodeficiency virus), 소 렌티바이러스(bovine lentivirus), SIV(simian immunodeficiency virus), EIAV(equine infectious anemia virus) 및 CAEV(caprine arthritis-encephalitis virus)를 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법의 이용에 적합한 레트로바이러스의 다양한 속(genus) 및 균주(strain)들은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Fields Virology, Third Edition, edited by B. N. Fields et al., Lippincott-Raven Publishers(1996), Chapter58, Retroviridae: The Viruses and Their Replication, Classification, pp. 1768-1771 참조).

본 발명의 패키징 시스템은 적어도 두 개의 패키징 벡터를 포함하며, 첫 번째 패키징 벡터는 gag, pol 또는 gag 및 pol 유전자를 포함하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 두 번째 패키징 벡터는 이종유래 또는 기능적으로 변형된 막 유전자를 포함하는 두 번째 뉴클레오티드서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 레트로바이러스 인자는 HIV 등의 렌티바이러스로부터 유래된다. 바람직하게는, 벡터는 기능적인 tat 유전자 및/또는 기능적인 보조유전자(vif, vpr, vpu, vpx, nef)가 결핍되어 있다. 더 바람직한 실시예에서, 그 시스템은 rev 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세 번째 패키징 벡터를 포함한다. 패키징 시스템은 첫 번째, 두 번째 및 선택적으로 세 번째 뉴클레오티드서열을 포함하는 패키징 세포의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명은 다양한 형태의 시스템에 적용가능하며, 당업자는 다른 레트로바이러스 그룹간에 공유하는 공통 인자를 알 수 있을 것이다. 본 명세서의 기술은 대표적 예로 렌티바이러스 시스템을 사용한다. 그러나, 모든 레트로바이러스는 표면 투영(projection)을 가진 막 비리온 및 하나의 선형(linear), 양성센스 단사슬 RNA(positive-sense single stranded RNA), 이합체(dimer)로 구성된 지놈 및 공통 단백질인 gag, pol 및 env을 포함하는 특징을 공유한다.

렌티바이러스는, env 유전자에 의해 암호화된 막 당단백질 SU(gp120) 및 TM(gp41); gag 유전자에 의해 암호화된 CA(p24), MA(p17) 및 NC(p7-11); pol 유전자에 의해 암호화된 RT, PR 및 IN을 포함하여, 여러 구조 비리온 단백질을 공통적으로 공유한다. HIV-1 및 HIV-2는 바이러스 RNA의 합성 및 변형의 조절 및 다른 복제기능과 관련된 보조 및 다른 단백질들을 포함한다. vif, vpr, vpu/vpx 및 nef 유전자에 의해 암호화된 보조(accessory)단백질은 재조합시스템으로부터 생략(또는 불활성화)될 수 있다. 게다가, tat 및 rev 는 예를 들어 돌연변이(mutation) 또는 결실(deletion)에 의해 생략 또는 불활성화될 수 있다.

1세대 렌티바이러스 벡터 패키징시스템은 gag/pol 및 env를 위한 분리된 패키징 구축물(construct)을 제공하며, 통상적으로 안전을 위해 이종유래 또는 기능적으로 변형된 막단백질을 이용한다. 2세대 렌티바이러스 벡터 시스템에서는, 보조유전자, vif, vpr, vpu 및 nef 는 결실되거나 불활성화된다. 3세대 렌티바이러스 벡터 시스템은 본 발명의 실행을 위해 선호되며, tat 유전자가 결실되거나 불활성화(예를 들어, 돌연변이를 통해)된 것을 포함한다.

tat에 의해 일반적으로 제공되는 전사의 조절에 대한 보상(compensation)은, 사람 사이토메갈로바이러스 즉시 초기(cytomegalovirus immediate early, HCMV-IE) 인핸서/프로모터 등의 강력한 지속성(constitutive) 프로모터의 이용에 의해 제공될 수 있다. 다른 프로모터/인핸서는 지속성 프로모터 활성의 강도, 표적 조직에 대한 특이성(예를 들어, 간 특이적 프로모터) 또는 당업계에서 이해되는 발현에 대한 바람직한 조절과 관련된 다른 인자에 근거하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예에서는 조절 발현을 위해 tet 등의 유도성(inducible) 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. rev를 암호화하는 유전자는 바람직하게는 분리된 발현 구축물에서 제공되어, 통상적인 3세대 렌티바이러스 벡터시스템은 각각 하나씩 gagpol, rev, 막(envelope) 및 전달(transfer) 벡터와 같이 4개의 플라스미드와 관련된다. 사용되는 패키징 시스템의 세대와 무관하게, gag 및 pol은 단일 구축물이나 분리된 구축물에 의해 제공될 수 있다.

통상적으로 패키징 벡터는 패키징 세포 안에 포함되며, 형질전이(transfection), 형질도입(transduction) 또는 감염(infection)을 통해 세포 내로 도입된다. 형질전이, 형질도입 또는 감염의 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 레트로바이러스/렌티바이러스 전달 벡터는, 생산세포 또는 세포주를 만들기 위해 형질전이, 형질전환 또는 감염을 통해 패키징 세포주로 도입될 수 있다.

본 발명의 패키징 벡터는, 예를 들어 인산화 칼슘법, 리포펙션(lipofection)법 또는 전기천공법을 포함한 표준방법에 의해 사람 세포나 세포주로 도입될 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 패키징 벡터는, 적절한 약의 존재하의 선택 및 클론의 분리에 이어, neo, DHFR, Gin 합성효소 또는 ADA 등의 우점 선택마커(dominant selectable marker)와 함께 세포 내로 도입된다. 선택마커 유전자는 패키징 벡터에 의해 암호화된 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.

패키징 기능이 적합한 패키징 세포에 의해 발현되도록 구성된, 안정한 세포주가 알려져 있다. 예를 들어, 패키징 세포를 기술하는 미합중국 특허 제 5,686,279호; 및 Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1996)93:11400-11406를 참조하라. 나아가, 안정한 세포주 생산에 대한 기술은 [Dull et al., 1998, J. Virology 72(11):8463-8471] 및 [Zufferey et al., 1998, J. Virology 72(12):9873-9880]에서 찾을 수 있다.

[Zufferey et al., 1997, Nature Biotechnology, 15:871-875]는 HIV-1 막 유전자를 포함한 pol의 3‘ 서열이 결실된 렌티바이러스 패키징 플라스미드를 개시한다. 구축물(construct)은 tat 및 rev 서열을 포함하고, 3’ LTR은 폴리(poly) A 서열로 대체된다. 5‘LTR 및 psi 서열은 유도성(inducible) 등의 또 다른 프로모터에 의해 대체된다. 예를 들어, CMV 프로모터나 그것의 유도체가 사용될 수 있다.

바람직한 패키징 벡터는 렌티바이러스 단백질 발현 및 안정성을 높이기 위하여 패키징 기능들에 추가적인 변화를 가질 수 있다. 예를 들면, gag의 상류(upstream)에 있는 모든 HIV 서열이 제거될 수 있다. 또한, 막의 하류(downstream) 서열도 제거될 수 있다. 게다가, RNA의 스플라이싱(splicing) 및 번역(translation)을 증강시키기 위해 벡터를 변형시키는 단계를 취할 수 있다.

선택적으로, [Dull et al., J. Virology 72(11):8463-8471, 1998]에 기술된 것과 같이 조건적(conditional) 패키징 시스템이 사용된다. 또한, 자가불활성 벡터(self-inactivating vector(SIN))의 사용이 선호되며, 이것은 예를 들어 [Zufferey et al., 1998, J. Virology, 72(12):9873-9880]에 기술된 대로, HIV-1 LTR(long terminal repeat)의 결실에 의해 벡터의 생체안정성(biosafety)을 향상시킨다. 유도성 벡터(inducible vector)도 tet 유도성 LTR을 통하는 것과 같은 방법으로 이용될 수 있다.

허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus, HSV)는 신경세포에 대한 지향성(tropism) 때문에 신경계 장애의 치료에 있어 상당한 관심을 불러일으켰으나, 이 벡터는 그것의 넓은 숙주범위 때문에 다른 조직에도 역시 이용될 수 있다. HSV를 매력적인 벡터로 만드는 또 다른 원인은 지놈 크기와 구성이다. HSV는 크기 때문에, 다양한 유전자나 발현 카세트의 혼입(incorporation)이 다른 더 작은 바이러스 시스템보다 문제를 덜 일으킨다. 게다가, 다양한 성능(temporal, strength 등)을 갖는 다른 바이러스 조절서열의 이용이 다른 시스템보다 더 넓은 범위의 발현조절을 가능하게 한다. 그 바이러스가 상대적으로 적은 접합(spliced) 메시지를 갖고, 나아가 유전적 조작이 쉽다는 것도 장점의 하나이다.

HSV는 상대적으로 조작하기 쉽고, 높은 농도(titer)로 자랄 수 있다. 따라서, 충분한 MOI를 달성하는데 필요한 부피의 관점에서도 반복 투여(dosing)의 필요를 줄인다는 점에서도, 전달은 문제가 덜 된다. 유전자치료 벡터로서 HSV의 검토를 위해서는 글로리소 등의 문헌(Glorioso et al.(1995))을 참조하라. 당업자라면 벡터로서 HSV를 사용하는 잘 알려진 기술에 친숙할 것이다.

유두(vaccinia) 바이러스 벡터는, 제작의 용이성, 상대적으로 높은 수준의 발현, 넓은 숙주범위 및 큰 용량의 DNA를 전달할 수 있기 때문에, 광범위하게 사용되어져 왔다. 유두 바이러스는 표지된(marked) "A-T" 선호(preference)를 나타내는 약 186kb의 선형(linear), 이중사슬(double-stranded) DNA 지놈을 갖는다. 약 10.5kb의 역방위말단반복(inverted terminal repeat)이 지놈 측면에 위치한다. 대부분의 필수유전자(essential gene)는 중심부에 위치하는 것으로 보이고, 폭스바이러스(poxvirus) 사이에서 가장 높게 보존되어 있다. 유두바이러스의 추정되는 개방해독틀(open reading frame)의 수는 150 내지 200이다. 양 쪽 사슬 모두 암호화되어 있지만, 해독틀의 광범위한 중복(overlap)은 흔하지 않다.

다른 바이러스 벡터도 본 발명에서 구축물로 이용될 수 있다. 예를 들면, 폭스바이러스 등의 바이러스에서 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 베네주엘라 말 뇌염바이러스(VEE)의 분자적으로 클론된 균주는, 이종유래 바이러스 단백질의 발현을 위한 복제 수행 백신 벡터(replication competent vaccine vector)로서 유전적으로 정제되었다(참조: Davis et al., 1996). 연구에 의해 VEE 감염이 잠재적인 CTL 반응을 자극한다는 것이 설명되었고, VEE가 면역화에 매우 유용한 벡터가 될 수 있음이 제안되었다(참조: Caley et al., 1997). 본 발명에서는 VEE 바이러스가 수지상 세포(dendritic cell)를 표적으로 하는데 유용할 수 있다는 것이 고려되었다.

폴리뉴클레오티드는 특정 결합 리간드를 발현하도록 변형된 바이러스 벡터 안에 있을 수 있다. 따라서, 바이러스 입자는 표적세포의 인식수용체에 특이적으로 결합하여, 그 내용물을 세포에 전달한다. 레트로바이러스 벡터의 특이적 표적화(targeting)가 가능하도록 설계된 새로운 접근법은, 바이러스 막에 락토스(lactose) 잔기를 화학적 추가하는 레트로바이러스의 화학적 변형에 근거하여 발전되었다. 이 변형은 시알로당단백질(sialoglycoprotein) 수용체를 거치는 간세포(hepatocyte)의 특이적 감염을 가능하게 할 수 있다.

레트로바이러스 막단백질 및 특이적 세포수용체에 대한 비오틴화(biotinylated) 체가 사용되는 재조합 레트로바이러스를 표적화하는 또 다른 접근법이 설계되었다. 항체는 스트렙타비딘(streptavidin)을 사용하여 비오틴(biotin) 구축물를 거쳐 짝지어진다(참조: Roux et al., 1989). 이들은 주조직적합복합체 클래스 Ⅰ 및 Ⅱ 항원(major histocompatibility complex classⅠ and class Ⅱ antigen)에 대한 항체를 이용하여, 시험관 내에서 이코트로픽(ecotropic) 바이러스와 함께 그 표면 항원을 가진 다양한 사람 세포의 감염을 설명하였다(참조: Roux et al., 1989).

본 발명을 실행하는데 사용되는 벡터는, 예를 들어, CMV 즉시 초기 프로모터(Cytomegalovirus immediate early promoter), RSV LTR, MoMLV LTR 및 PGK 프로모터; mTTR, TK, HBV, hAAT를 포함한 조직 또는 세포형 특이 프로모터, 조절 또는 유도 프로모터, 인핸서 등의 지속성 프로모터 등의 이종유래 조절서열을 포함할 것이다. 바람직한 프로모터는 LSP 프로모터(Ⅲ et al., Blood Coagul. Fibrinolysis, 8S2:23-30, 1997), EF1-알파 프로모터(참조: Kim et al., Gene, 91(2):217-23, 1990 및 Guo et al., Gene Ther., 3(9):802-10, 1996)를 포함한다. 가장 바람직한 프로모터는 연장인자(elongation factor) 1-알파(EF1a) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase)-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 즉시초기 유전자(cytomegalovirus immediate early gene(CMV)) 프로모터, 키메라 간 특이적(chimeric liver-specific) 프로모터(LSPs), 사이토메갈로바이러스 인핸서/치킨 베타-엑틴(cytomegalovirus enhancer/chicken beta-actin(CAG)) 프로모터, 테트라사이클린 반응(tetracycline responsive) 프로모터(TRE), 트란스티레틴(transthyretin) 프로모터(TTR), 원숭이 바이러스(simian virus) 40(SV40) 프로모터 및 CK6 프로모터를 포함한다. 이들 및 수많은 추가적인 프로모터의 서열은 당업계에 알려져 있다. 관련된 서열은 공공 데이터베이스에서 용이하게 입수할 수 있고, 본 발명의 실시를 위한 벡터에 삽입될 수 있다.

본 발명은 목적하는 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드나 단백질에 대한 암호화서열의 발현을 조절하기 위한 유전자 조절시스템의 포함도 고려한다. 유전자 조절시스템은 특정 유전자나 유전자들의 조절된 발현에 유용하다. 한 가지 대표적인 접근법에서, 유전자 조절시스템 또는 스위치는 리간드 결합 영역, 전사 활성 영역 및 DNA 결합 영역을 갖는 키메라 전사인자를 포함한다. 그 영역들은 사실상 어떠한 출처에서도 얻을 수 있고, 신규한 단백질을 얻기 위해 다양한 방식의 조합이 될 수 있다. 조절가능한 유전자시스템은 키메라 전사인자와 상호반응하는 DNA 반응 인자도 포함한다. 이 인자는 조절될 유전자에 인접하여 위치한다.

본 발명을 실행하는데 사용되는 대표적인 유전자 조절시스템은 초파리 탈피호르몬 시스템(Drosophila ecdysone system)(참조: Yao et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 93:3346(1996)), 봄빅스(bombyx) 탈피호르몬 시스템(참조: Suhr et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 95:7999(1998)), 유도인자(inducer)로 RU486을 사용하는 Valentis GendSwitch.RTM. 합성프로게스테론 수용체 시스템(참조: Osterwalder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 98(22):12596-601(2001)); 테트라사이클린(Tc) 또는 예를 들어 표적의 전사를 조절하는(켜거나 끄는) 독시사이클린(doxycycline) 등의 유사체(analogue) 등의 작은 분자를 사용하는 Tet.TM..& RevTet.TM. Systems(BD Biosciences Clontech)(참조: Knott et al., Biotechniques, 32(4):796, 798, 800(2002)); 각각이 전사활성인자 또는 DNA 결합 단백질 어느 하나에 결합되는 두 세포간(intracelluar) 분자를 접합하기 위한 작은 분자의 이용에 근거한 ARIAD Regualtion Technology를 포함한다. 이 구축물들이 접합될 때, 목적하는 유전자의 전사가 활성화된다. Ariad는 두 개의 주요 시스템을 갖는다: 하나는 동종이합체화(homodimerization)에 근거하고, 다른 하나는 이질이합체화(heterodimerization)에 근거하며(참조: Rivera et al., Nature Med., 2(9):1028-1032(1996); Ye et al., Science, 283:88-91(2000)), 어느 하나는 본 발명의 벡터에 통합될 수 있다.

본 발명의 실행에 이용되는 바람직한 유전자조절시스템은 ARIAD Regulation Technology 및 Tet. TM. & RevTet. TM. Systems이다.

C. 비-바이러스 벡터( non - viral vector )

본 발명에서는 발현벡터의 세포내로의 전달을 위한 몇가지 비-바이러스 방법 역시 고려된다. 이것은 인산칼슘침전법(calcium phosphate precipitation)(참조: Graham 및 Van Der Eb, 1973; Chen 및 Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-dextran법(참조: Gopal, 1985), 전기천공법(electroporation)(참조: Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), 직접 미세주입법(direct microinjection)(참조: Harland 및 Weintraub, 1985), DNA-로딩 리포좀(DNA-loaded liposome)법(참조: Nicolau 및 Sene, 1982; Fraley et al., 1979) 및 리포펙타민-DNA복합체(liofectamine-DNA complex)법, 세포 음파분쇄법(cell sonication)(참조: Fechheimer et al., 1987), 고속미세분사(high velocity microprojectile)를 이용한 유전자 폭격법(gene bombardment)(참조: Yang et al., 1990), 다양이온(polycation)법(참조: Bousssif et al., 1995) 및 수용체 매개 형질전이법(receptor-mediated transfection)(참조: Wu 및 Wu, 1987; Wu 및 Wu, 1988)를 포함한다. 이 기술들 중 일부는 생체 내 또는 생체 외 사용을 위해 성공적으로 개량될 수 있다. 당업자라면 비-바이러스 벡터의 사용을 적합하게 하는 기술에 친숙할 것이며, 본 명세서에 개시되어 있지 않은 비-바이러스 벡터 유형도 본 발명에 의해 고려됨을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 발현 카세트는 리포좀이나 지질제제 에 포획될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중막(phospholipid bilayer membrane) 및 내부의 수성매질(aqueous medium)에 의해 특징지어지는 소낭성(vesicular) 구조이다. 다층(multilamellar) 리포좀은 수성매질에 의해 분리된 다수의 지질층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자연발생적으로 형성된다. 지질구축물은 폐쇄구조(closed structure)를 형성하기 전에 스스로 재배열(self-rearrangement)하며, 지질 이중층사이의 물과 용해된 용질을 포획한다(참조: Ghosh 및 Bachhawat, 1991). 리포펙타민(lipofectamine)으로 복합체를 형성한 유전자 구축물 역시 고려된다(Gibco BRL). 당업자라면 리포좀과 지질제제를 이용하는 기술들에 친숙할 것이다.

지질을 기반으로 하는 비-바이러스 제제는 아데노바이러스 유전자치료의 대안을 제공한다. 많은 세포배양 연구가 지질 기초 비-바이러스 유전자 전달을 보고하였으나, 지질 기반 제제를 통한 체계적인 유전자 전달은 한계가 있었다. 비-바이러스 지질 기반 유전자 전달의 주된 제한은 비-바이러스 운반체를 포함한 양이온 지질(cationic lipid)의 독성이다. 리포좀의 생체 내 독성은 부분적으로 생체 외 및 생체 내 유전자 전달 결과 사이의 차이를 설명한다. 이 모순된 결과에 기여하는 또 다른 요인은 혈청 단백질의 존재 및 부재 하에서 리포좀의 안정성 차이이다. 리포좀과 혈청 단백질 사이의 상호작용은 리포좀의 안정성 특성에 극적인 영향을 미친다(참조: Yang 및 Huang, 1997). 양이온 리포좀은 음으로 하전된 혈청단백질을 유인하거나 결합한다. 혈청단백질로 도포된 리포좀은 용해되거나, 순환으로부터 이들을 제거하는 마크로파아지(macrophage)에 의해 포식된다. 현재의 생체 내 리포좀 전달방법은, 순환에서의 양이온 지질과 관련된 독성 및 안정성 문제를 피하기 위해, 피하(subcutaneous), 피부내(intradermal) 또는 두개내(intracranial) 주사를 이용한다. 시험관 내(참조: Felgner et al., 1987)와 생체 내 유전자 전달의 효율차이는 리포좀과 혈장 단백질사이의 상호작용에 원인이 있다(참조: Zhu et al., 1993; Solodin et al., 1995; Thierry et al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996).

지질제제의 생산은 흔히 초음파처리 또는 (Ⅰ) 역상증발(reverse phase evaporation) (Ⅱ) 탈수-재수화(dehydration-rehydration) (Ⅲ) 계면활성제 투석(detergent dialysis) 및 (Ⅳ) 박층 수화(thin film hydration)에 이은 리포좀 혼합물의 연속분출(serial extrusion)에 의해 수행된다. 일단 생산되면, 지질구조는 순환시 독성이거나(화학요법) 불안정한(핵산) 화합물을 캡슐화하는데 사용될 수 있다. 리포좀 캡슐화는 더 낮은 독성과 이러한 화합물에 대한 더 긴 혈청 반감기를 가져온다(참조: Gabizon et al., 1990). 수많은 병의 치료법이 통상적인 치료법을 증강시키거나 새로운 치료법, 특히 과증식 질병(hyperproliferative disease)의 치료법을 만드는데 지질 기초 유전자전달 전략을 사용한다.

D. 단백질 또는 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 핵산 구축물의 세포내로의 전달

이종유래 단백질이나 폴리펩티드를 암호화하는 서열 및, 자가처리 절단부위(self-processing cleavage site) 단독 또는 추가적인 단백질 분해 절단부위를 암호화하는 서열과 조합인 형태로 자가처리 절단부위를 포함하는 본 발명에 사용되는 벡터 구축물은, 세포, 예를 들어 생체 내에서 체세포에 의한 이종유래 암호화서열의 발현을 위해 또는 시험관 내 또는 생체 내에서 벡터-형질전환 세포에 의해 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 벡터 구축물은 당업계에 알려진 표준방법을 이용하여 시험관 내 또는 생체 외에서 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 인산칼슘을 이용한 형질도입법, 배양세포로의 미세주입법(microinjection)(참조: Capecchi, Cell 22:479-488(1980)), 전기천공법(electroporation)(참조: Shigekawa et al., BioTechn., 6:742-751(1988)), 리포좀 매개 유전자전달(참조: Mannino et al., BioTechn., 6:682-690(1988)), 지질 매개 형질전환(참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:7413-7417(1987)) 및 고속미세분사체(high-velocity microprojectile)를 이용하는 핵산전달법(참조: Klein et al., Nature 327:70-73(1987))을 포함한다.

시험관 내 또는 생체 외 발현을 위해, 기능 단백질을 발현하는데 효과적인 어떠한 세포도 사용될 수 있다. 단백질 발현에 사용되는 수많은 세포 및 세포주의 예가 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 원핵세포 및 곤충세포가 발현을 위해 사용될 수 있다. 게다가, 효모 등의 진핵미생물도 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 원핵, 곤충 및 효모 시스템에서의 발현은 일반적으로 당업계에 알려져 있고, 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 단백질이나 폴리펩티드의 발현에 적합하게 조절될 수 있다.

또한, 발현에 유용한 대표적인 숙주세포는 섬유모세포(fibroblast cell), 양, 말, 마우스, 소, 곤충 세포 등 사람이 아닌 포유동물 세포 등의 포유동물 세포를 포함한다. 포유동물 세포의 구체적 예는 COS 세포, VERO 세포, HeLa 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 293세포, NSO 세포, 3T3 섬유모세포, W138 세포, BHK 세포, HEPG2 세포, DUX 세포 및 MDCK 세포를 포함한다.

숙주세포는 통상적인 영양배지에서 배양되며, 프로모터 유도, 형질전환체의 선별 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자의 증폭에 적합하게 변형된다. 포유동물 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상용화되어 있는 Ham's F10(Sigma), Minimal Essential Medium(MEM, Sigma), RPMI 1640(Sigma) 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Sigma) 등의 배지가 통상적으로 숙주세포를 배양하는데 적합하다. 주어진 배지는 일반적으로 필요한 만큼의 호르몬 및/또는 다른 성장인자(인슐린, 트랜스페린(transferrin) 또는 상피성장인자(epidermal growth factor) 등), 염(염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산 등), 완충제(HEPES 등), 뉴클레오시드(아데노신 및 티미딘 등), 항생제, 미량원소(trace element) 및 글루코스나 동등한 에너지원으로 보충된다. 또 다른 필요한 보충제가 당업자에게 알려진 적절한 농도에서 포함될 수도 있다. 일반적으로, 온도, pH 등과 같이 특정 세포주에 적절한 배양조건은, 예를 들어 “http://www.atcc.org/SearchCatalogs/AllCollections.cfm”에서 입수할 수 있는 수많은 세포주의 배양을 위한 배양조건의 제안과 더불어 당업계에 널리 알려져 있다.

본 발명의 벡터는, 동물모델이나 환자에서 두개 또는 그 이상의 단백질이나 폴리펩티드를 발현시키기 위해 자가절단서열(self processing cleavage sequence)을 통해 연결된 다양한 유전자들을 전달하기 위하여, 다양한 경로(예를 들어, 피부(intradermally), 정맥(intravenously), 종양(intratumorally), 뇌, 문맥(intraportally), 복막(intraperitoneally), 근육(intramuscularly), 방광 등)를 경유하여 생체 내에서 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라 치료 단백질은 국부적으로(예를 들어, 뇌 또는 방광에서) 또는 전신에서(투여의 다른 경로) 그 효과를 나타낸다. 본 발명의 벡터의 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 개방해독틀의 5‘의 조직특이적 프로모터의 이용은 벡터에 의해 암호화된 두개 또는 그 이상의 단백질이나 폴리펩티드의 조직특이적 발현을 이루기 위해 사용될 수 있다.

전이유전자를 운반하는 재조합 벡터를 시험관내, 생체 외 또는 생체 내에서 표적 세포로 도입시키는 다양한 방법들이 앞서 기술되어 있고, 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명은 치료법, 백신 및 본 발명의 재조합 벡터로 표적 세포를 형질전환시키는 항암치료법을 제공한다.

예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터의 생체 내(in vivo) 전달은, 이에 제한되는 것은 아니나, 뇌, 간, 혈관, 근육, 심장, 폐 및 피부를 포함한 다양한 종류의 기관을 표적으로 할 수 있다.

생체 외(ex vivo) 유전자 전달의 경우에는, 표적세포가 숙주로부터 제거되고, 본 발명의 재조합 벡터 및 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 실험실에서 유전적으로 변형된다.

본 발명의 재조합 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 방법을 포함한 통상적인 투여방법을 이용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 재조합벡터는 액체용액, 현탁액, 미세소낭(microvesicle), 리포좀 및 주사가능한(injectable) 또는 주입가능한(infusible) 용액 등의 다양한 형태의 제제로 제공될 수 있다. 바람직한 형태는 투약방법과 치료용도에 달려 있다. 전달경로에 적합한 형태는 관련업계의 당업자로부터 일반적으로 알 수 있는 지식을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다.

생체 내 재조합 단백질 및 폴리펩티드 생산에 본 발명의 재조합 벡터를 사용하는 것의 많은 이점들에는, 환자에게 둘 또는 그 이상의 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 ORF의 장기적이고 지속적인 발현을 위한 단일 벡터의 투여; 생물학적 활성을 갖는 둘 또는 그 이상의 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 ORF의 생체 내 발현; 및, 사람 세포에서 생산된 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 자연적인 전사후변형(post-translational modification)을 포함한다.

한 가지 바람직한 측면은 재조합 단백질 및 폴리펩티드의 시험관내 생산을 위한 본 발명의 재조합벡터 구축물의 이용이다. 재조합 단백질 생산을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 자가처리 절단부위를 함유한 본 발명의 벡터 구축물은 이러한 표준방법을 이용하여 재조합 단백질 및 폴리펩티드의 발현에 이용될 수 있다.

본 발명의 한 가지 대표적인 측면에 의하면, 벡터의 세포로의 도입(introduction) 또는 투여(administration)는 다음 단계의 하나 또는 그 이상 에 따른다:

(1) 재조합 단백질이나 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선별하는 조건하에서 형질전이된 세포를 배양하는 단계;

(2) 재조합 단백질이나 폴리펩티드의 발현을 확인하는 단계; 및,

(3) 재조합 단백질이나 폴리펩티드를 수득하는 단계.

본 명세서에서 상술한 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 유도하는 레트로바이러스는, 이에 제한되는 것은 아니나, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus), 지라괴사 바이러스(spleen necrosis virus), 라우스육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), 하비육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류백혈구증 바이러스(Avian Leukosis Virus), 긴팔원숭이백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), 사람면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 아데노바이러스(adenovirus), 골수증식육종 바이라스(Myeloproliferative Sarcoma Virus) 및 유방종양(mammary tumor) 바이러스 등의 레트로바이러스를 포함한다. 본 발명의 한 가지 실시예에 따르면, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스에서 유래된다.

벡터는 하나 또는 그 이상의 프로모터를 포함한다. 사용할 수 있는 적합한 프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터; 및 [Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, No.9, 980-990(1989)]에 기술된 사이토메갈로바이러스(cytomegalo virus(CMV)) 프로모터 또는 다른 프로모터(예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 히스톤, polⅢ 및 베타-액틴(beta-actin) 프로모터를 포함한 진핵세포 프로모터 등의 세포 프로모터)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나아제(TK) 프로모터 및 B19 파보바이러스(parvovirus) 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터의 선택은 본 명세서에 기술된 바로부터 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열은 적절한 프로모터에 의해 조절된다. 사용될 수 있는 적절한 프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 아데노바이러스 주요 후기(adenoviral major late) 프로모터 등의 아데노바이러스 프로모터; 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 등의 이종유래 프로모터; 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus(RSV)) 프로모터; MMT 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터 등의 유도성 프로모터; 열충격 프로모터(heat shock promoter); 알부민(albumin) 프로모터; ApoAI 프로모터; 사람 글로빈(globin) 프로모터; 허피스 심플렉스 티미딘키나아제(Herpes Simplex thymidine kinase) 프로모터 등의 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터; 레트로바이러스 LTR(상술한 변형된 레트로바이러스 LTR 포함); 베타-액틴(β-actin) 프로모터; 및 사람 성장호르몬 프로모터를 포함한다. 프로모터는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절하는 자연(native) 프로모터도 될 수 있다.

레트로바이러스 플라스미드 벡터는 생산세포주(producer cell line)를 형성하기 위해 패키징 세포주를 형질전환시키는데 사용된다. 형질전이될 패키징 세포의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 및 [Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, pgs.5-14(1990)(전체는 본 명세서의 참고문헌란 참조)]에 기술된 DAN 세포주를 포함한다. 벡터는 당업계에 알려진 어떠한 방법을 통해서도 패키징 세포를 형질전환시킬 수 있다. 이러한 방법들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 전기천공법(electroporation), 리포좀법 및 CaPO₄ 침전법을 포함한다. 한 가지 다른 방법에 따르면, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 리포좀에 캡슐화되거나, 지질과 짝지을 수 있고, 그 후 숙주로 투여된다.

생산세포주는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터입자를 생산한다. 이러한 레트로바이러스 벡터입자는 시험관 내 또는 생체 내에서 진핵세포를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 형질전환된 진핵세포는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열을 발현시킬 것이다. 형질전환될 진핵세포는, 이에 제한되는 것은 아니나, 조혈간세포(hematopoietic stem cell), 간세포(hepatocyte), 섬유모세포(fibroblast), 근육모세포(myoblast), 각질세포(keratinocyte), 내피세포(endothelial cell), 기관지상피세포(bronchial epithelial cell) 뿐만 아니라, 배아줄기세포, 배암종 세포(embryonic carcinoma cell)를 포함한다.

Ⅳ. 외래도입 암호화 핵산 분자를 포함하는 숙주세포

본 발명은 또한 레날라제 단백질을 암호화하는 핵산분자로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 숙주세포는 원핵 또는 진핵세포 중 하나가 될 수 있다. 본 발명의 단백질 발현에 유용한 진핵세포는, 세포주가 세포배양법과 친화적이고, 발현벡터의 증식 및 유전자산물의 발현과 친화적인 한, 제한되지 않는다. 바람직한 진핵 숙주세포는, 이에 제한되지 않으나, 효모, 곤충 및 포유동물 세포, 바람직하게는 마우스, 랫트, 원숭이나 사람 세포주와 같이 척추동물 세포 및 다른 불멸의(immortalized) 세포주를 포함한다. 바람직한 진핵 숙주세포는 ATCC로부터 CCL61로 입수가능한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, ATCC로부터 CRL1658로 입수가능한 NIH 스위스 마우스 배(embryo)세포 NIH/3T3, 아기햄스터 신장세포(BHK) 등의 진핵 조직배양 세포주 및 다른 불멸의 세포주를 포함한다.

어떠한 원핵 숙주세포라도 본 발명의 단백질을 암호화하는 rDNA 분자를 발현하는데 이용될 수 있다. 바람직한 원핵 숙주세포는 대장균(E. coli )이다.

본 발명의 rDNA 분자를 가진 적절한 세포 숙주의 형질전환은, 통상적으로 사용되는 벡터의 유형 및 사용되는 숙주시스템에 의존하는 잘 알려진 방법에 의해 수행된다. 원핵 숙주세포의 형질전환에 관하여는, 전기천공법 및 염처리법이 통상적으로 이용된다(예를 들어, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69:2110, 1972; 및 Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mammal, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, NY(1982) 참조). rDNA를 포함하는 벡터를 가진 척추동물 세포의 형질전환에 관하여는, 전기천공법, 양이온 지질법 또는 염처리법이 통상적으로 사용된다(예를 들어, Graham et al., Virol., 52:456, 1973; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:1373-76, 1979 참조).

성공적으로 형질전환된 세포, 즉 본 발명의 rDNA 분자를 포함하는 세포는 선택마커의 선택을 포함한 잘 알려진 기술들에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 rDNA의 도입으로부터 나온 세포들은 단일 콜로니(single colony)를 생산하기 위해 클로닝될 수 있다. 그 콜로니로부터 세포가 획득, 용해되고, rDNA의 존재를 확인하기 위해 [Southern, J. Mol . Biol ., 98:503, 1975] 또는 [Berent et al., Biotech., 3:208, 1985]에 기술된 것과 같은 방법으로, 그것의 DNA 함량을 조사하거나 그 세포로부터 생성된 단백질이 면역학적 방법을 거쳐 측정될 수 있다.

Ⅴ. 안티센스 분자, 리보자임 및 간섭( interfering ) RNA

본 발명은 또한 세포내 대사에서 레날라제의 역할을 명확히 하는데 유용한 모델인, 안티센스 핵산을 포함하는 재조합세포를 포함한다. 즉, 풍선도자-손상 혈관(balloon-injured vessel) 및, 더 구체적으로 그것의 외막(adventitia)에서의 레날라제의 증가된 발현은 레날라제가 음성 리모델링(negative remodeling) 및 동맥재협착(arterial restenosis)과 관련된 세포증식과 관련됨을 나타낸다. 따라서, 레날라제에 상보적이나 안티센스 방향(orientation)의 안티센스 핵산을 포함하는 형질전환 세포는 레날라제의 작용기작 및 그것의 세포에서의 역할에 대한 연구 및 레날라제 발현 효과를 개선하는 치료제를 동정하는 유용한 도구이다.

당업자라면 본 명세서에 개시된 내용에 근거하여, 레날라제를 암호화하는 핵산에 상보적인 안티센스 핵산이 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있고, 그 세포가 레날라제의 기능을 연구하고 유용한 치료제 및 진단법을 확인하기 위해 레날라제의 변경된 발현이 미치는 영향을 결정하는 연구에 사용될 수 있음을 알 수 있을 것이다.

나아가, 세포에서의 레날라제 발현 및/또는 활성을 감소시키는 방법은, 증가된 레날라제 발현, 세포 또는 그것으로부터 분비된 증가된 레날라제 단백질 수준 및/또는 증가된 레날라제 활성에 의해 매개되거나 이와 관련된 병, 장애 또는 상태에 유용한 진단 및/또는 치료를 제공할 수 있다.

당업자라면 세포의 레날라제 mRNA 및/또는 단백질 수준을 낮추는 한 가지 방법이 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 저해하는 것이라는 것을 이해할 것이다. 레날라제 발현은 예를 들어, 안티센스 분자를 이용하여 저해될 수 있고, 또한 예를 들어, 위아니(Wianny) 및 커니카-고에츠(Kernicka-Goetz)의 문헌(참조: 2000, Nature Cell Biol., 2:70-75)에 기술된 대로 리보자임 또는 이중사슬 RNA를 이용하여서도 저해될 수 있다.

RNA 간섭(RNAi)은 이중사슬 RNA(dsRNA)의 다양한 범위의 생물체 및 세포로의 도입이 상보적인 mRNA의 분해를 야기하는 현상이다. 세포에서, 긴 dsRNA는 Dicer로 알려진 리보핵산분해효소(ribonuclease)에 의해 짧은 21-25개 뉴클레오티드의 작은 간섭 RNA, 즉 siRNA로 잘려진다. siRNA는 이어서 단백질 구축물과 결합하여 RNA-유도 잠재성 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)가 되고, 그 과정에서 풀리게 된다. 그 후, 활성 RISC는 상보적 전사체(transcript)에 siRNA 안티센스 사슬과 mRNA 사이의 염기짝짓기(base pairing)에 의해 결합한다. 결합한 mRNA는 잘려지고, mRNA의 서열특이적 분해는 유전자발현의 무의미(gene silencing)를 초래한다. 예를 들어, 미합중국 특허 제 6,506,559; Fire et al., Nature(1998), 391(19):306-311; Timmons et al., Nature(1998), 395:854; Montgomery et al., TIG(1998), 14(7):255-258; David R. Engelke, Ed., RNA Interference(RNAi) Nuts & Bolts of RNAi Technology, DNA Press(2003); 및 Gregory J. Hannon, Ed., RNAi A Guide to Gene Silencing, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2003) 참조하라. 따라서, 본 발명 역시 RNAi 기술을 이용하여 레날라제를 암호화하는 유전자의 발현을 무의미하게 만드는(silencing) 방법을 포함한다.

안티센스 분자와 유전자 발현을 저해하기 위한 그것의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Cohen, 1989, In: Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhibition of Gene Expression, CRC Press 참조). 안티센스 핵산은 적어도 특정 mRNA 분자에 상보적인, 본 명세서의 다른 곳에서 정의된 대로, DNA나 RNA분자이다(참조: Weintraub, 1990, Scientific American, 262:40). 세포에서 안티센스 핵산은 그에 대응하는 mRNA와 혼성화하여 이중사슬 분자를 형성하며, 그것에 의해 유전자의 번역을 저해한다.

유전자의 번역을 저해하기 위한 안티센스 방법의 사용은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, Marcus-Sakura(1988, Anal. Biochem., 172:289)에 기술되어져 있다. 이러한 안티센스 분자는, 이노우에(Inoue)의 문헌(참조: 1993, 미합중국 특허 제 5,190,931호)에서 알 수 있듯이, 안티센스 분자를 암호화하는 DNA를 사용한 유전적 발현을 거쳐 세포에 제공될 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 안티센스 분자는 합성적으로 만들어져서 세포에 제공될 수 있다. 쉽게 합성되고 표적세포에 도입될 수 있으므로, 약 10부터 약 30개사이의 안티센스 올리고머 및 더 바람직하게는 약 15개의 뉴클레오티드가 바람직하다. 본 발명에서 합성 안티센스 분자는, 당업계에 알려진, 변형되지 않은 올리고튜클레오티드와 비교하여, 생물학적 활성을 향상시킨 올리고뉴클레오티드 유도체를 포함한다(Cohen, 전게서; Tullis, 1991, 미합중국 특허 제 5,023,243호, 전체는 본 명세서의 참고문헌란 참조).

리보자임 및 그것의 유전자발현 저해를 위한 이용 역시 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Cech et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:17479-17482; Hampel et al., 1989, Biochemistry, 28:4929-4933; Eckstein et al., 국제특허공개 WO92/07065; Altman et al., 미합중국 특허 제 5,168,053호, 전체는 본 명세서의 참고문헌란 참조). 리보자임은 DNA 제한효소(restriction endonuclease)와 유사한 방식으로, 다른 단일사슬 RNA를 특이적으로 절단하는 능력을 갖는 RNA 분자이다. 이 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 변형을 통해, 분자들은 RNA 분자에서 특이적 뉴클레오티드 서열을 인식하도록 변형되어, 그것을 절단할 수 있다(참조: Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn., 260:3030). 이 접근법의 주된 장점은, 그것들이 서열특이적이므로, 단지 특별한 서열을 갖는 mRNA만 불활성화 된다는 것이다.

리보자임은 테트라히메나형(tetrahymena-type)(참조: Hasselhoff, 1988, Nature, 334:585) 및 망치머리형(hammerhead-type)의 두 가지 기본유형이 있다. 망치머리형 리보자임은 11-18개 염기의 서열을 인식하는 반면, 테트라히메나형 리보자임은 4개 염기의 서열을 인식한다. 서열이 길수록, 표적 mRNA 종에서 서열이 배타적으로 발생할 가능성이 더 커진다. 따라서, 망치머리형 리보자임이 특정 mRNA 종을 불활성화시키는데 있어서 테트라히메나형 리보자임보다 선호되고, 18개 염기 인식서열이 다양한 무관한 mRNA 분자에서 무작위로 발생할 수 있는 더 짧은 인식서열보다 바람직하다.

레날라제의 발현을 저해하는데 유용한 리보자임은 표적서열을 레날라제 또는 서열번호 1과 적어도 약 33%의 동일성을 갖는 레날라제의 mRNA 서열에 상보적인 기본 리보자임 구조에 삽입함으로써 설계된다. 바람직하게는, 그 서열은 서열번호 1과 적어도 약 35%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 더 바람직하게는 적어도 약 45%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 50%, 더 바람직하게는 적어도 약 55%, 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더 바람직하게는 적어도 약 65%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 70%, 더 바람직하게는 적어도 약 75%, 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 더 바람직하게는 적어도 약 85%, 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 상동성(homologous)을 갖는다. 레날라제를 표적으로 하는 리보자임은 상업적으로 시판되는 시약(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 이용하여 합성되거나, 또는 그것들을 암호화하는 DNA로부터 유전적으로 발현될 수 있다.

Ⅴ. 재조합 세포 및 사람이 아닌 형질전환 포유동물

본 발명은, 그 중에서도 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산, 그것에 상보적인 안티센스 핵산, 레날라제에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 핵산 등을 포함하는 재조합 세포를 포함한다. 한 측면에 의하면, 재조합세포는 일시적으로 레날라제를 암호화하는 핵산의 일부분을 암호화하는 벡터(예를 들어, 플라스미드 등)로 형질전이될 수 있다. 핵산은 세포 지놈에 통합될 필요가 없으며, 세포에서 발현될 필요도 없다. 나아가, 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있고, 본 발명은 특정 세포주나 세포형에 국한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 세포는, 이에 제한되는 것은 아니나, 섬유모세포(fibroblast), 마우스 줄기세포, 양서류 난모세포, 골모세포(osteoblast), 평활근세포(smooth muscle cell), 내피세포(endothelial cell) 등을 포함한다.

본 발명의 한 측면에 의하면, 포유동물 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 재조합 세포는 사람이 아닌 형질전환 포유동물을 생산하는데 사용된다. 즉, 본 발명의 외래 핵산 또는 본 명세서에서 언급되듯이 “전이유전자(transgene)”는 세포 내로 도입되고, 세포는 사람이 아닌 형질전환 포유동물을 생산하기 위해 사용된다. 전이유전자가 도입되는 세포는 바람직하게는 배아줄기(ES)세포이다. 그러나, 본 발명은, 본 발명의 전이유전자를 포함하는 ES 세포나 형질전환 동물을 생산하는데 이용되는 세포에 전적으로 국한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 본 발명의 형질전환 세포는, 이에 제한되는 것은 아니나, 전이유전자를 포함하는 형질전환 동물로부터 유래된 세포, 형질전환 ES 세포로부터 유래된 키메라 동물로부터 유래된 전이유전자를 포함하는 세포 및 사람이 아닌 형질전환 포유동물을 생산하는데 이용되거나 이용되지 않는 전이유전자를 포함한 다른 것들을 포함한다.

나아가, 전이유전자를 포함한, 즉 재조합 세포의 목적이 형질전환 포유동물의 생산에만 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 오히려, 본 발명은 포유동물의 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 원핵세포 및 진핵세포를 제한없이 포함하여, 포유동물 레날라제를 암호화하는 핵산이 도입될 어떠한 세포 유형도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

세포가 진핵세포라면, 그 세포는, 본 발명의 전이유전자가 그 안으로 도입되고, 그 목적하는 유전자에 의해 암호화된 단백질이 더 이상 그것으로부터 발현되지 않는 경우, 이득이 얻어질 수 있는 어떤 진핵세포라도 포함될 수 있다. 이러한 이득은, 목적하는 유전자의 발현결핍이 실험실에서 시험관 내 방법으로 연구되거나 세포가 있는 포유동물 내에서 연구될 수 있는 시스템, 도입된 유전자 결실을 포함한 세포가 연구, 진단 및 치료 도구로 사용될 수 있는 시스템 및 예를 들어, ESRD 및 고혈압을 포함한 포유동물의 선택된 병 상태에 대한 새로운 진단 및 치료 도구의 개발에 유용한 동물모델이 생산되는 시스템이 제공된다는 요소를 포함할 수 있다.

선택적으로, 본 발명은, 본 발명의 전이유전자가 그 안으로 도입되고, 목적하는 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 세포에서 이전에 존재하거나 발현되지 않은 곳이나 전이유전자가 도입되기 전과 다른 수준이나 상황 하에서 현재 발현되는 곳에서 발현될 경우, 이득이 얻어지는 진핵세포를 포함한다. 이러한 이득은, 목적하는 유전자의 발현이 실험실에서 시험관 내 방법으로 연구되거나 세포가 있는 포유동물 내에서 연구될 수 있는 시스템, 도입된 유전자를 포함한 세포가 연구, 진단 및 치료 도구로 사용될 수 있는 시스템 및 예를 들어, ESRD 및 고혈압을 포함한 포유동물의 선택된 병 상태에 대한 새로운 진단 및 치료 도구의 개발에 유용한 동물모델이 생산되는 시스템이 제공된다는 요소를 포함할 수 있다.

레날라제를 암호화하는 분리된 핵산을 발현하는 이러한 세포는, 레날라제의 낮은 수준의 발현 및/또는 활성과 관련된 병, 장애 또는 상태를 치료하거나 경감시키기 위해 높은 수준의 레날라제가 유용할 수 있는 세포, 조직 또는 동물 개체 전체에 레날라제를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 병, 장애 또는 상태는, 이에 제한되는 것은 아니나, ESRD, 고혈압, 심장혈관병을 포함할 수 있다. 레날라제의 추가적인 발현으로 혈압을 낮출 수 있다. 따라서, 본 발명은 레날라제 발현, 번역 및/또는 활성을 증가시키거나 유도하기 위해 레날라제를 발현시키는, 레날라제 발현, 단백질 수준 및/또는 활성의 증가가 병, 장애 또는 상태를 치료 또는 경감하는데 유용한 세포를 포함한다.

당업자라면, 본 명세서에 개시된 바에 근거하여, 본 발명의 “녹-인(knock-in)” 또는 “녹-아웃(knock-out)” 벡터는, 각각 치환되거나(replaced) 결실될(deleted) 핵산의 두 부위에 상동성이 있는 적어도 두 개의 서열을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 두 서열들은 그 유전자의 양옆에 위치하는 서열들과 상동성이 있다; 즉, 한 서열은 레날라제를 암호화하는 핵산의 암호화서열의 5‘ 부위 또는 그 근처와 상동성이 있고, 나머지 서열은 첫 번째 것으로부터 더 하류(downstream)이다. 당업자라면, 본 명세서에 개시된 바에 근거하여, 본 발명이 특정한 인접한 핵산서열(flanking nucleic acid sequence)에 국한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 그 대신에, 표적벡터는 각각 포유동물 지놈으로부터 또는 안으로 레날라제를 암호화하는 핵산 또는 그것의 단편의 일부나 전부를 제거하거나(즉, “녹-아웃” 벡터), 도입하는(즉, “녹-인” 벡터) 두 개의 서열을 포함할 수 있다. 표적벡터의 결정적 특징은, 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 결실(deletion)/삽입(insertion)이 일어나게 하여, 레날라제를 암호화하는 핵산의 전부나 일부가 포유동물 염색체 상의 위치에서 결실되거나 그 위치로 삽입되게 하기 위하여, 그것이 반대 방향을 향해, 즉 “녹-아웃”벡터의 경우 레날라제 ORF의 5’ 과 3’ 말단에 위치한 두 서열의 충분한 부위를 포함한다는 것이다.

전이유전자 및 녹-인 및 녹-아웃 표적 벡터의 설계는 당업계에 잘 알려져 있고, 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌(참조: 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 오스벨 등의 문헌(Ausubel et al.)(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) 등의 논문들에 기술되어 있다. 표적벡터에 사용될 레날라제 암호화부위에 인접한 또는 그 범위 내의 상류(upstream) 및 하류(downstream) 부위는 알려진 방법 및 랫트 및 사람 레날라제 모두의 핵산 및 아미노산 서열을 포함하여 본 명세서에 개시된 바에 의하여 쉽게 선별될 수 있다. 이 서열들에 의해, 당업자라면 본 발명의 전이유전자 및 녹-아웃 벡터를 제작할 수 있을 것이다.

나아가 본 발명은, 예를 들어 neo 유전자를 암호화하는 핵산 등의 선택마커를 암호화하는 핵산을 포함하며, 그것에 의해, 레날라제를 암호화하는 핵산이나 그것의 일부가 결실되고, G418의 존재하에 성장할 수 있는 그 세포의 능력에 의해 네오마이신 저항성 유전자로 치환된 형질전환 세포의 선별을 가능하게 하는 녹-아웃 표적 벡터를 포함한다. 그러나, 본 발명이 선택마커로 네오마이신 저항성에 국한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 당업계에 잘 알려진 다른 선택마커가, 레날라제 유전자가 치환 및/또는 불활성화되고, 선택된 선택마커를 암호화하는 핵산에 의해 치환된 재조합세포를 선별하는 녹-아웃 표적벡터에 사용될 수 있다. 선별하고 선택마커를 벡터에 삽입시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌(참조: 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 오스벨 등의 문헌(Ausubel et al.)(참조: 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)에 기재되어 있다.

본 발명은, 본 명세서에 기술된 대로, 외래 핵산이 지놈의 목적하는 부위에 삽입되어, 목적하는 외래 표적 유전자의 암호화부위가 결실된, 사람이 아닌 형질전환 포유동물, 즉 녹-아웃 형질전환 포유동물을 포함한다. 나아가, 본 발명은 레날라제를 암호화하는 외래 핵산이 지놈의 한 위치에 삽입된, 사람이 아닌 형질전환 포유동물, 즉 “녹-인” 형질전환 포유동물을 포함한다. 삽입된 녹-인 전이유전자는, 예를 들어, 태그(tag) 폴리펩티드, 일반적으로 세포에 존재하지 않거나 통상적으로 레날라제에 작동가능하도록 연결되지 않는, 레날라제를 암호화하는 핵산에 작동가능하도록 연결된 프로모터/조절 영역을 암호화하는 다양한 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명의 사람이 아닌 형질전환 포유동물의 생산은 바람직하게는 지금부터 기술되는 방법을 사용하여 수행된다. 그러나, 본 발명이 전적으로 이 방법의 사용에만 국한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 즉, 목적하는 녹-아웃 포유동물을 만들기 위해 다른 방법들이 사용될 수 있다. 바람직한 사람이 아닌 형질전환 포유동물의 생산방법에서, 본 발명의 전이유전자를 포함하는 ES 세포가 생산되고, 그 세포는 나기(Nagy) 및 로산(Rossant)의 문헌(1993, In: Gene Targeting, A Practical Approach, pp.146-179, Joyner ed., IRL Press)에 기술된 것과 같이, 녹-아웃 동물을 생산하는데 필수적으로 사용된다. ES 세포는, 그것들이 숙주 배반포(blastocyst)에 주입되어 배 의(embryonic) 환경으로 돌아가거나 할구(blastomere) 단계의 배와 뭉친 경우, 보통의 배아세포(embryonic cell)처럼 활동한다. 그렇게 되돌아간 경우, 세포는 배의 모든 계통을 따라 분화될 완전한 잠재력을 가진다. 따라서, ES 세포를 얻고, 거기에 목적하는 DNA를 도입하고, 목적하는 DNA가 발현될 수 있는 성숙한 포유동물 세포로 분화시키기 위해 그 세포를 배의 환경으로 되돌리는 것이 가능하다.

형질전환 마우스의 생산을 위한 명확한 프로토콜은 나기(Nagy) 및 로산(Rossant)의 문헌(참조: 1993, In: Gene Targeting, A Practical Approach, Joyner ed., IRL Press, pp.146-179)에 개시되어 있고, 그에 따라 본 명세서에서는 반복기술하지 않는다. 목적하는 DNA를 도입하기 위한 ES 세포의 형질전이 또는 형질전환은, 예를 들어 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 오스벨 등(Ausubel et al.)의 문헌(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)에 기술된 것과 같은 표준 프로토콜을 이용하여 수행된다. 바람직하게는, 본 발명의 전이유전자 안에 포함된 목적하는 DNA는 ES 세포로 전기천공(electroporated)되며, 그 세포는 소리노 등(Soriano et al.)의 문헌(1991, Cell 64:693-702)에 기술된 대로 증식된다.

분리된 핵산의 포유동물의 수정란(fertilized egg)으로의 도입은 형질전환 기술분야에서의 표준기술들에 의해 수행된다(참조: Hogan et al., 1986, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). 가장 보편적으로는, 핵산은 미세주입법(microinjection)으로 배(embryo)에 도입된다.

핵산이 일단 수정란에 도입되면, 수정란은 짧은 시간 동안 배양된 후, 예를 들어, 호간 등(Hogan et al.)의 문헌(참조: 1986, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)에 기술된 대로, 수정란이 얻어지는 같은 종의 가임신한(pseudopregnanat) 포유동물로 전달된다. 통상적으로, 실험마다 많은 수정란이 주입되고, 그 중 약 3분의 2가 살아남는다. 그 후 약 20개의 생존가능한 수정란들이 가임신한 동물들로 전달되고, 보통 4 내지 10개의 전달된 수정란들이 살아 있는 새끼로 분화할 것이다.

어떠한 포유동물의 레날라제 유전자도, 본 명세서에 기술된, 그 포유동물 레날라제 유전자의 전부나 일부의 결실을 포함하는 전이유전자가 삽입되는 형질전환 포유동물 또는 형질전환 세포를 생산하는 방법에 이용될 수 있다.

본 발명의 형질전환 포유동물은 포유동물의 어떤 종도 가능하다. 따라서, 본 발명은 키메라 핵산을 암호화하는, 마우스, 햄스터, 랫트, 토끼, 돼지, 양 및 소를 포함하는 형질전환 포유동물의 생산을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에 기술된 형질전환 마우스를 생산하는 방법은 다른 포유동물 종을 이용하는 경우에도 유추될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 형질전환 포유동물은 설치류(rodent)이며, 더 바람직하게는 마우스이다. 예를 들어, 루카리넨 등의 문헌(Lukkarinen et al.)(1997, Stroke 28:639-645)은 형질전환 마우스의 생산을 가능하게 하는 유전자 구축물들은 랫트를 포함한 다른 형질전환 설치류의 생산도 가능하게 한다는 것을 깨닫게 한다. 마찬가지로, 한 종의 동물의 유전자좌(genetic locus)에서의 널리자이고스(nullizygous) 돌연변이는 그 종과 높은 상동성이 있는 유전자좌를 갖는 다른 종의 동물에서도 반복될 수 있다.

본 발명의 형질전환 동물을 동정하기 위해, 새끼들은 서던블랏혼성화, PCR 및/또는 RT-PCR 등의 표준기술을 이용하여 분리된 핵산의 존재를 검사받는다. 포유동물의 세포 및 조직에서의 핵산발현은 본 명세서에 기술된 통상적인 기술을 이용하여서도 측정된다. 나아가, 만약 단백질이 분비된다면, 예를 들어 웨스턴블랏 분석 또는 당업계에 잘 알려진 단백질 탐지의 표준기술을 이용하여, 형질전환 동물의 순환하는 혈액 속의 레날라제의 존재 또는 부존재가 결정될 수 있다.

본 명세서에서 “형질전환 세포(transgenic cell)”라는 용어로도 사용되는, 본 발명의 형질전환 포유동물로부터 얻어진 세포는, 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 레날라제(+/-) 및 (-/-)의 사람이 아닌 형질전환 포유동물로부터 얻어진 세포도 포함하며, ESRD, 고혈압, 심장혈관 질환 및 레날라제 발현수준의 변경과 관련된 다른 질병, 장애 또는 상태 등의 레날라제 발현수준의 변경과 관련된 것으로 생각되는 포유동물의 병 및 증상(symptom)을 모델링(modeling)하는데 유용한 시스템이다.

특별히 적합한 세포는, 본 명세서에 기술된 사람이 아닌 녹-아웃 또는 녹-인 형질전환 포유동물의 조직으로부터 유래된, 다양한 조직에서 레날라제 유전자를 포함하는 전이유전자가 발현되거나, 레날라제 발현이 저해되는 세포이다. 예를 들어, 이러한 세포가 유래되는 세포 유형은, 섬유모세포 및 (1) 레날라제 (+/+), (+/-) 및 (-/-)의 사람이 아닌 형질전환되어 태어난 포유동물, (2) 레날라제 (+/+), (-/-) 또는 (+/-)의 동물 태아, 및 (3) 레날라제 (+/+), (-/-) 및 (+/-)의 태아 및 살아서 태어난(liveborn) 포유동물로부터 얻은 태반세포주(placental cell line)와 유사한 세포들을 포함한다.

본 발명의 개시에 의해, 당업자라면 레날라제 단백질 수준의 감소, 레날라제 활성 수준의 감소 또는 양자 모두를 포함하는 세포는, 이에 제한되는 것은 아니나, 레날라제 발현 저해제(예를 들어, 안티센스 또는 리보자임 분자)를 발현하는 세포를 포함한다는 것을 이해할 것이다.

이에 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에 기술된 형질전환 마우스 등의 마우스로부터 얻어지는 세포를 포함하여, 포유동물로부터 포유동물세포를 수득하는 배양에서 포유동물 세포를 유지하는 유용한 방법 및 조성물은 당업계에 잘 알려져 있다.

선택적으로, 레날라제를 발현하는 재조합 세포는, 재조합세포를 투여함으로써 단백질을 세포, 조직 및/또는 동물에 투여하는 생체 외 및 생체 내 요법으로 투여될 수 있다. 이외에도, 상기 재조합세포는 레날라제 리간드 및 레날라제 신호경로(signaling pathway)의 발견에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합세포는, 레날라제가 세포 이동(migration), 외섬유화(adventitial fibrosis), 동맥재협착(arterial restenosis), 음성 리모델링(negative remodeling) 등에 관여할 것으로 가정되므로, 증가되거나 감소한 레날라제 수준이 세포의 항상성(homeostasis) 및 증식(proliferation) 및/또는 이동(migration)에 미치는 영향을 연구하는데 이용될 수 있다.

세포가 레날라제를 발현하지 않거나 생물학적 활성이 없도록 감소 또는 변경된 발현을 하도록 변형된 본 발명의 재조합 세포는, 동물 자신의 세포(예를 들어, 섬유모세포 등) 또는 동계의 짝이 맞는 수여자(syngeneic matched donor)의 것의 어느 하나가 본 명세서의 다른 곳에 기술된 방법(예를 들어, 재조합세포에서 레날라제 발현 및/또는 단백질 수준의 감소를 가져오는 안티센스 핵산 또는 녹-아웃 벡터의 삽입)으로 변형되고, 그 재조합 세포가 수증동물에게 투여되는 생체 외 및 생체 내 세포치료에도 이용될 수 있다. 이러한 방법으로, 레날라제를 감소된 수준으로 발현하는 재조합 세포가 그 자신의 세포가 증가된 수준의 레날라제를 발현하는 동물에 투여됨으로써, 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 증가된 레날라제 발현과 관련되거나 그에 매개되는 병, 장애 또는 상태를 치료하거나 감소시킬 수 있다.

외섬유화(adventitial fibrosis), 동맥재협착(arterial restenosis) 등을 야기시키기 쉽게 하는, 예를 들어 레날라제 녹-아웃 마우스 등의 본 발명의 형질전환 포유동물은 이러한 병의 발병기전 및 그것에 있어 레날라제의 잠재적 역할을 연구하는데 이용될 수 있다.

나아가, 형질전환 포유동물 및/또는 본 발명의 세포는 레날라제의 세포하 국소화(subcellular localization)의 심도있는 연구에 이용될 수 있을 것이다. 또한, 형질전환 포유동물(+/- 및 -/-의 살아서 태어난 및 태아 모두) 및/또는 본 발명의 세포는, 세포에서 그것의 영향을 매개하기 위해 레날라제와 결합하는 수용체 및/또는 리간드 뿐만 아니라, 레날라제 작용의 표적을 명확히 하기 위해 카테콜아민 순환에 있어서의 레날라제의 역할을 연구하는데 이용될 수 있다.

Ⅵ. 항체

본 발명은 레날라제에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편도 포함한다. 본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 레날라제에 특이적으로 결합하는 항체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 사람 레날라제 또는 그것의 면역원성(immunogenic) 부위 등의 본 발명의 부위와 결합할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 한 가지 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 랫트 레날라제를 표적으로 한다.

다클론항체는 당업계에 잘 알려진 표준적인 면역기술에 따라 토끼를 면역시킴으로써 생산된다(참조: Harlow et al., 1998, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). 이러한 기술에는, 말토스 결합 단백질 또는 글루타치온(GSH) 태그 폴리펩티드 부위 및/또는 부분 등의 또 다른 단백질 부위를 포함하는 키메라 단백질로 동물을 면역시켜, 레날라제 부위가 면역원성(예를 들어, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin(KLH))과 접합된 레날라제) 및 각각의 설치류 및/또는 사람 레날라제 아미노산 잔기를 포함하는 부위를 갖는 것을 포함한다. 키메라 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니나, pMAL-2 또는 pCMX와 같이 이 목적에 적합한 플라스미드 벡터에 레날라제를 암호화하는 적절한 핵산(예를 들어, 서열번호 1)을 클로닝함으로써 생산된다.

그러나, 본 발명은 전적으로 이러한 항체 또는 단백질 항원의 부위에만 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 본 발명은 본 명세서의 다른 곳에서 정의되듯이, 랫트 및 사람 레날라제, 또는 그것의 일부에 대한 다른 항체를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 나아가, 본 발명은 항체, 그중에서도 특히 레날라제와 결합하는 것을 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 이들은, 조직에서 레날라제를 국소화(localizing)하는 면역조직화학염색(immunohistochemical staining) 및 적어도 레날라제 일부를 암호화하는 핵산으로 일시적으로 형질전이시킨 세포의 면역형광 현미경검사법(immunofluorescence microscopy)에서 웨스턴블랏에 나타나는 레날라제와 결합할 수 있다.

본 명세서의 개시에 의해, 당업자라면 항체가 단백질의 어느 부위하고도 특이적으로 결합할 수 있고, 전장(full-length) 단백질은 그것에 특이적인 항체를 생산하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 본 발명이 면역원으로 전장 단백질만을 사용하는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 본 발명은 포유동물 레날라제와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 단백질의 면역성 부위를 이용하는 것을 포함한다. 즉, 본 발명은 레날라제 단백질의 면역원 부위 또는 항원결정기(antigenic determinant)를 이용하여 동물을 면역시키는 것을 포함한다. 항체는 이에 제한되는 것은 아니나, 토끼 또는 마우스 등의 동물을 본 발명의 단백질 또는 그것의 일부로 면역화시킴으로써 또는 적어도 레날라제의 일부 또는 예를 들어, 적절한 레날라제 아미노산 잔기를 포함하는 부위와 공유결합하는 말토스 결합 단백질 태그 폴리펩티드 부위를 포함하는, 태그 폴리펩티드 부위를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 단백질을 이용하여 동물을 면역화시킴으로써 생산될 수 있다. 본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 이 단백질의 더 작은 단편도 레날라제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 분리된 레날라제 폴리펩티드의 다양한 부위가 레날라제의 매우 보존된(conserved) 부위 또는 폴리펩티드의 비-보존적인 부위의 어느 하나에 항체를 만드는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서의 다른 곳에 기술되듯이, 레날라제는, 이에 제한되는 것은 아니나, N 말단으로부터의 잠정 신호펩티드(putative signal peptide), FAD 결합 영역(약 4에서 35까지의 아미노산 잔기); 아민 산화효소 영역(약 75부터 339까지의 아미노산 잔기)을 포함한 다양한 보존 영역(domain)를 포함한다.

일단 레날라제 서열 및 단백질의 다양한 보존적 및 비-보존적 영역을 국소화하는 상세한 분석이 주어지면, 당업자는 본 명세서에 개시된 방법 뿐 아니라 당업계에 잘 알려지거나 개발될 방법들을 이용하여 포유동물 레날라제 폴리펩티드의 다양한 부위에 특이적인 항체를 얻는 방법을 이해할 수 있을 것이다.

아울러, 본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 목적하는 단백질의 비-보존적 부위가 다양한 생물체 사이에서 보존된 매우 보존적인 부위보다 더 면역원성(immunogenic)이 될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 비-보존적 면역원성 부위를 이용한 면역은 비-보존적 부위에 특이적인 항체를 생산하여 하나 또는 그 이상의 보존 부위를 공유할 수 있는 다른 단백질과 교차반응(cross-reaction)하지 않는 항체를 생산할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 각각의 레날라제 분자의 비-보존적 부위가, 그 레날라제에만 특이적이고 다른 레날라제나 다른 단백질과 비-특이적으로 교차반응하지 않는 항체를 생산할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

선택적으로, 본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 하나 또는 그 이상의 레날라제 분자 사이에 보존적인 부위를 이용하여 개발된 항체가 하나 또는 그 이상의 레날라제 분자에 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는데 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 보존적인 단백질 영역과 특이적으로 결합하는, 그렇지 않으면 단백질의 다른 부위보다 덜 면역원성이었을, 항체를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 단백질 단편을 분자(예를 들어, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌(keyhole-limpet hemocyanin) 등)에 연결(conjugating)하고, 그것에 의해 단백질 영역에 면역원성을 부여하거나, 어쥬번트(adjuvant)(예를 들어, 퓨루언트(Freund)의 완전(complete) 및/또는 불완전(incomplete) 어쥬번트 등)의 사용 또는 양자 모두에 의한다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 레날라제를 인식하는 항체 및 모든 레날라제와 특이적으로 결합하는 항체를 위시하여, 하나 이상의 레날라제와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 레날라제의 어느 부위가 보존된 영역을 공유하는 다른 단백질과 덜 상동성인지 알 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명은 특정 영역에만 한정되지는 않는다. 그 대신, 당업자라면 본 발명의 레날라제 단백질의 다른 비-보존적 부위가 본 명세서에 개시된 대로 본 발명의 항체를 생산하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 본 발명이 레날라제 활성을 중성화 및/또는 저해하는(예를 들어, 필요한 레날라제 수용체/리간드 상호작용을 저해함으로써), 이에 제한되는 것은 아니나, 다양한 종(예를 들어, 마우스 레날라제)의 레날라제 뿐 아니라, 사람 레날라제를 포함한 하나 또는 그 이상의 레날라제를 인식할 수 있는 항체를 포함한다는 것을 알 수 있을 것이다.

본 발명이 전적으로 본 명세서에 개시된 항체나 본 발명의 단백질의 특정 면역원성 부위에만 국한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 본 발명은 본 명세서의 다른 곳에서 그 용어가 정의되듯이, 레날라제 또는 그것의 일부 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 약 15%의 상동성을 공유하는 단백질에 대한 다른 항체를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 폴리펩티드는 사람 레날라제에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는다. 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 포유동물 레날라제에 특이적인 항체와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 사람 레날라제이다.

본 발명은 다클론, 단클론, 합성 항체 등을 포함한다. 본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 본 발명의 항체의 결정적 특징은 레날라제와 특이적으로 결합하는 항체라는 것을 이해할 것이다. 즉, 본 발명의 항체는, 당업계에 잘 알려진 표준방법을 사용한 세포의 면역염색(immunostaining) 및/또는 레날라제의 면역침전(immunoprecipitation)에서의 웨스턴블랏에서 레날라제에 결합하는 항체에 의해 설명되듯이, 레날라제 또는 그것의 단편(예를 들어, 면역원성 부위 또는 그것의 항원결정기)을 인식한다.

본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 항체가 세포 내의 연관된 단백질을 국소화하고, 세포 내 과정에서 그것에 의해 인식되는 항원의 역할을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 게다가 항체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 웨스턴블랏팅 및 효소면역측정법(ELISA) 등의 잘 알려진 방법들을 이용하여, 생물학적 시료에 존재하는 단백질의 양을 탐지하거나 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여, 그것들의 동족 항원을 면역침전 및/또는 면역-친화 정제하는데 이용될 수 있다.

게다가, 항체는 세포에서의 레날라제 수준을 감소시키는데 이용될 수 있고, 그에 따라 세포에서의 레날라제의 영향을 저해한다. 따라서, 항체를 동물의 세포나 조직 또는 동물 그 자체에 투여함으로써, 필수적인 레날라제 수용체/리간드 상호작용은 저해되어 레날라제-매개 시그널링(signaling)의 효과 역시 저해된다. 본 명세서의 개시에 근거하여, 당업자라면 항-레날라제 항체를 이용한 탐지할 수 있는 레날라제 리간드/수용체 상호작용의 저해효과에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 세포의 감소된 증식, 감소된 세포이동, 감소된 음성 모델링, 감소된 외섬유화, 감소된 동맥협착증, 기관이나 개체에서의 감소된 섬유화, 감소된 골화(ossification) 또는 뼈형성 등을 포함한다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

다클론 항체의 생산은 목적하는 동물에 항원을 주입하고, 그것으로부터 항원에 특이적으로 결합하는 항체를, 예를 들어 할로우 등(Harlow et al.)의 문헌(1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)에 기재된 것과 같은 표준항체 생산방법을 이용하여 분리함으로써 수행된다.

전장 또는 단백질이나 펩티드의 펩티드 단편을 표적으로 하는 단클론 항체는 예를 들어 할로우 등(Harlow et al.)의 문헌(1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) 및 투지스키 등(Tuszynski et al.)의 문헌(1988, Blood, 72:109-115)에 기술된 것과 같은 잘 알려진 단클론 항체 제조방법을 이용하여 만들어 질 수 있다. 목적하는 펩티드의 양은 화학합성기술을 이용하여 합성될 수도 있다. 선택적으로, 목적하는 펩티드를 암호화하는 DNA는 많은 양의 펩티드 생산에 적합한 세포에서 클로닝되고, 적절한 프로모터 서열로부터 발현될 수 있다. 펩티드를 표적으로 하는 단클론 항체는 본 명세서에서 참조된 표준 방법을 이용하여 펩티드로 면역된 마우스로부터 생산될 수 있다.

본 명세서에 기술된 방법을 이용하여 획득된 단클론 항체를 암호화하는 핵산은, 당업계에서 입수가능한, 예를 들어 라이트 등(Wright et al.)의 문헌(1992, Critical Rev. Immunol., 12:125-168) 및 본 명세서에서 인용된 참고문헌에 기재된 기술을 이용하여 클로닝되고, 서열이 결정될 수 있다.

나아가, 본 발명의 항체는, 예를 들어 라이트 등(Wright et al.)의 문헌(전게서) 및 본 명세서에서 인용된 참고문헌 및 구 증(Gu et al.)의 문헌(1997, Thrombosis and Hematocyst., 77:755-759)에 개시된 기술 및 항체를 인체에 적응시키는 당업계에 잘 알려지거나 개발될 다른 방법들을 이용하여, “인간화(humanized)”될 수 있다.

파아지 항체 라이브러리(phage antibody library)를 만들기 위해, cDNA 라이브러리가 먼저, 예를 들어 목적하는 항체와 같이 파아지 표면에서 발현될 목적하는 단백질을 발현시킬 세포, 예를 들어 하이브리도마(hybridoma), 에서 분리된 mRNA로부터 얻어진다. mRNA의 cDNA 복사본은 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 생산된다. 면역글로블린(immunoglobulin) 단편을 지정하는 cDNA는 PCR에 의해 얻어지고, 생성되는 DNA는 적절한 박테리오파아지 벡터로 클로닝되어 면역글로블린 유전자를 지정하는 DNA를 포함하는 박테리오파아지 DNA 라이브러리를 만든다. 이종유래 DNA를 포함하는 박테리오파아지 라이브러리를 만드는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌(전게서)에 기술되어 있다.

목적하는 항체를 암호화하는 박테리오파아지는, 예를 들어 그 항체가 표적으로 하는 항원과 같이 그것의 대응하는 결합 단백질에 결합 가능한 방식으로, 단백질이 그것의 표면에 드러나도록 변형될 수 있다. 따라서, 특정 항체를 발현하는 박테리오파아지가 대응하는 항원을 발현하는 세포의 존재하에 배양될 때, 박테리오파아지는 세포에 결합될 것이다. 항체를 발현하지 않는 박테리오파아지는 세포에 결합하지 않을 것이다. 이러한 패닝(panning) 기술들은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 라이트 등(Wright et al.)의 문헌(전게서)에 기술되어 있다.

상술한 것과 같은 방법은 M13박테리오파아지 display를 사용하여 사람 항체의 생산을 위해 개발되었다(참조: Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191-280). 필수적으로, cDNA 라이브러리는 항체생산 세포 군집으로부터 획득된 mRNA로부터 생산된다. 그 mRNA는 재배열된 면역글로블린 유전자를 암호화하여, cDNA가 같은 것을 암호화한다. 증폭된 cDNA는, 표면에 사람 Fab 단편을 발현시키는 파아지 라이브러리를 만드는 M13 발현벡터에 클론된다. 목적하는 항체를 표시하는 파아지는 결합하는 항원에 의해 선별되고, 용해성 사람 Fab 면역글로블린을 생산하기 위해 박테리아에서 증식된다. 따라서, 통상적인 단클론 항체 합성과 대조적으로, 이 방법은 사람 면역글로블린을 발현하는 세포와 달리 사람 면역글로블린을 암호화하는 DNA를 불멸하게 한다.

방금 소개된 방법은 항체 분자의 Fab 부위를 암호화하는 파아지의 생산을 기술한다. 그러나, 본 발명이 Fab 항체를 암호화하는 파아지의 생산에만 전적으로 국한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 단사슬(single chain) 항체(scFv/파아지(phage) 항체 라이브러리)를 암호화하는 파아지도 본 발명에 포함된다. Fab 분자는 전체 Ig 경사슬(light chain)을 포함한다. 즉, 그것은 경사슬의 가변(variable) 및 불변(constant) 영역을 모두 포함하나, 단지 가변영역 및 중사슬(heavy chain)의 첫 번째 불변영역영역(CH1)을 포함한다. 단사슬 항체 분자는 Ig Fv 단편을 포함하는 단백질의 단사슬을 포함한다. Ig Fv 단편은 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변영역만 포함하여, 불변영역는 갖지 않는다. scFv DNA를 포함하는 파아지 라이브러리는 마르크스(Marks et al.) 등의 문헌(1991, J. Mol. Biol., 222:581-597)에 기술된 방법에 따라 생산될 수 있다. 목적하는 항체의 분리를 위하여 이와 같이 생성된 파아지의 패닝(panning)은 Fab DNA를 포함하는 파아지 라이브러리를 위해 기술된 것과 유사한 방식으로 수행된다.

본 발명은 거의 모든 가능한 특이적 성질들(specificities)을 포함하도록 중사슬 및 경사슬의 가변영역이 합성될 수 있는 합성 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 것으로도 해석되어야 한다(참조: Barbas, 1995, Nature Medicine, 1:837-839; de Kruif et al. 1995, J. Mol. Biol., 248:97-105).

VII . 조성물

본 발명은 포유동물의 레날라제를 암호화하는 핵산 또는 그 일부에 상보적이며, 전사와 안티센스 방향인 분리된 핵산을 포함하는 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명은, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 분리된 포유동물의 레날라제 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

또한, 본 발명은 레날라제에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명은 포유류의 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 조성물도 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

상기 조성물은 세포, 조직 또는 동물에 레날라제를 투여하는데 사용될 수 있으며, 세포, 조직 또는 동물에서 레날라제의 발현을 억제하는데 사용될 수도 있다. 상기 조성물은 세포, 조직 또는 동물에서 레날라제의 발현 또는 단백질의 수준(level)을 감소 또는 증가시키는 것과 같은 레날라제 발현의 변경으로 인하여 매개되는(mediated) 질병, 장애 또는 상태를 치료하는데 유용하므로, 동물에 유익하다. 즉, 생체내의 질병, 장애 또는 상태가 레날라제 발현 정도 또는 단백질 수준(level)의 변경에 의하거나 이와 관련되어 매개되는 경우에 있어서, 상기 조성물은 위와 같은 레날라제의 발현이나 단백질 수준을 조정하기 위하여 사용될 수 있다.

포유동물에 투여하기 위하여, 단백질 또는 단백질을 암호화하는 핵산 및/또는 그것의 전부 또는 일부에 대하여 상보적인 안티센스 핵산 등은 예를 들면, 약 pH 7.8의 HEPES 완충용액과 같은 약학적으로 허용되는 담체내에 현탁될 수 있다.

다른 유용한 약학적으로 허용되는 담체로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 글리세롤, 물, 염수, 에탄올 및 인산 등 유기산의 염 등 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 이와 같은 약학적으로 허용되는 담체들의 예는 Reminton's Pharmaceutical Sciences(1991, Mack Publication Co., New Jersey)를 통하여 당업자에게 알려져 있다.

약학적 조성물은 무균의 주사가능한 수성 또는 유성의 현탁액이나 용액 상태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액이나 용액은 이미 공지된 기술에 의하여 제제화될 수 있으며, 유효성분에 더하여 본 명세서에 기술된 분산제, 습윤제 또는 현탁제와 같은 추가 성분 등을 포함할 수 있다. 이와 같은 무균의 주사가능한 제제는 예를 들면, 물 또는 1,3-부탄디올 등의 무독성 비경구성의 희석제나 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 그 외에 사용가능한 희석제와 용매로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 링거액(Ringer's solution), 등장성(isotonic) 염화나트륨 용액 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드 등의 불휘발성유를 포함한다.

본 발명의 방법에서 유용하게 사용될 수 있는 약학적 조성물은 경구, 직장, 질, 비경구, 국부, 폐, 코, 구강, 눈 또는 다른 투여 가능한 경로에 사용될 수 있는 제제로 투여, 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 그 외의 예상되는 제제로는, 투사(projected) 나노입자, 리포좀 제제, 유효성분을 포함하는 재봉합된(resealed) 적혈구 및 면역제제 등을 포함한다.

본 명세서에서 “나노입자(nanoparticle)”라는 용어는, 1 내지 100 나노미터의 지름을 갖는 범위 내에서 어떠한 크기, 모양(shape) 또는 형태를 갖는 입자로 정의된다. 나노입자는 분리된(discrete) 유전체 또는 하나 또는 그 이상의 전도성 껍질(shell) 층으로 둘러싸인 반전도성 중심부(core section)를 갖는 나노입자인 “나노껍질(nanoshell)”일 수도 있다. “나노껍질”은 중심/껍질로 분리된 구조를 지닌 특성을 갖는 나노입자의 하위개념이다. 나노껍질과 나노입자는 모두 DNA, RNA 등과 같이 음전하를 갖는 분자에 결합하기 위한 도판트(dopant)를 포함한다. 일반적으로 사용되는 예로서, 양전하를 갖는 도판트는 Pr³, Er³ 및 Nd³ 를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 “껍질(shell)”이라는 용어는 일반적으로 최소한 하나의 중심의 일부를 둘러싸는 하나 또는 그 이상의 껍질을 의미한다. 몇 개의 중심은 더 큰 나노껍질로 통합된다. 본 발명의 한가지 실시예에 의하면, 나노입자는 일반적인 방법으로 동물에 투여된다.

본 명세서에서 사용되는 나노입자의 “전달(delivering)"이라는 용어는, 예를 들어 정맥내부 등의 목표 지점에서, 세포에 접촉할 수 있는 입자의 수를 최대화하기 위한, 목표 지점에 부착되었거나, 옆에 있거나, 또는 충분히 가까이 있는 나노입자의 위치를 설명하기 위하여 사용된다.

본 발명의 조성물은 나노입자 내부, 나노입자 방향 또는 나노입자 근처에 결합한 핵산서열을 포함한다. 상기 결합한 나노입자는 핵산서열을 내피 세포 등의 다양한 생물학적 목표물에 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 한가지 실시예에 따르면, 유전자 발현을 위한 프로모터의 제어하에 있는 핵산 유전자 등의 핵산은, 양전하를 띄도록 도핑되어(doped) 있는 나노중심부(nanocore)에 부착되어 있으며, 나노중심부는 목적하는 세포 등의 리간드 목표물에 특이적인 표적 리간드(targeting ligand)를 포함하는 껍질에 둘러싸이게 된다.

본 발명의 한 실시예는 나노입자 내부 또는 나노입자 방향에 결합한 핵산서열과 관련된다. 나노입자는 “나노입자 전구체(precursor)"의 조합에 의하여 만들어진다. 핵산서열은 일반적으로, 생물학적 표적 내부로 전달하기 위하여 선택된 어떠한 핵산서열도 될 수 있다. 핵산서열은 DNA, RNA, PNA 또는 합성되거나 변경된 핵산서열 등이 될 수 있다. 본 발명의 한가지 실시예에 의하면, 핵산서열은 인간의 레날라제를 암호화하는 DNA 서열이다(GenBank Accession No. BC 005364). 상기 DNA 서열은 자연적으로 발생한 서열일 수도 있고, 자연적으로 발생한 서열이 변경된 것일 수도 있으며, 합성된 서열일 수도 있다. 본 발명의 한가지 실시예에 의하면, 표적으로 하는 숙주(target host)의 코돈 사용 비율을 최대화하기 위하여 핵산이 변형된다. 자연계에 존재하는 서열은 사람, 원숭이, 소, 돼지, 말, 고양이, 랫트, 마우스, 곰, 토끼, 사슴, 어류, 양 또는 그 외의 동물의 서열이다. 상기 서열은 특정 서열이 추가되거나 삭제되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, DNA 서열은 제한효소 부위를 제거하거나, 일반적인 절단이나 변이 부위를 제거하거나, 나노중심부로의 결합을 최대화하도록 변형될 수 있다. 상기 서열은 단백질 분할 부위의 전사, 번역, 국소화(localization), 제거나 절단 및/또는 프로세싱(processing) 부위의 추가 및 글리코실화 부위의 추가나 제거에 도움이 되는 추가적인 서열을 포함하도록 더욱 변형될 수도 있다.

본 발명의 한가지 실시예에 따르면, 나노입자 전구체는 나노입자 고분자에 결합된 핵산서열을 포함한다. 나노입자 전구체와 핵산간의 결합은 비공유 결합이거나 공유결합일 수 있다. 나노입자 고분자는, 결합으로 인하여 나노입자가 될 수 있는 모든 고분자일 수 있다. 예를 들어, 핵산서열은 첫 번째 고분자에 비공유 결합을 할 수 있다. 이러한 첫 번째 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, "PEI") 등의 DNA 결합 양이온성 고분자일 수 있다. 첫 번째 고분자는 두 번째 고분자에 공유결합할 수 있다. 두 번째 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 친수성 고분자일 수 있다. 예를 들어, 두 번째 고분자는 PEI의 일차 아민 부위에 공액(conjugated)될 수 있다.

상기 친수성 고분자는 항체와 같은 리간드에 결합할 수 있다. 항체는 다클론 항체이거나 단클론 항체일 수 있으며, 단클론 항체가 바람직하다. 상기 항체는 생물학적 수용체나 세포에서 발현된 다른 단백질에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 렉틴형(lectin-like) 산화 저밀도 리포단백질(LDL) 수용체-1, Lox-1 에 결합할 수 있다. 항체는 결합력은 우수하지만, 입체 부피가 비교적 크다. 작은 항체 조각이나 그 외의 결합 펩티드 또는 분자 등이 본 발명의 많은 실시예에서 리간드로 사용될 수 있다.

나노입자 전구체가 스스로 결합되면, 핵산 분자는 형성된 나노입자내부로 캡슐화되며, 항체나 리간드가 나노입자의 표면에 존재하게 된다. 캡슐화된 핵산 분자는 주위 환경, 효소, 가수분해 또는 다른 분해 작용 등에 의한 분해로부터 부분적으로 또는 전체적으로 보호된다.

결합된 나노입자는 일반적으로 약 1nm 내지 1000nm 의 평균 지름을 갖는다. 더욱 한정된 지름의 범위로는, 약 10nm 내지 250nm 와 약 40nm 내지 100nm 를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시예는 결합된 나노입자에 관한 것이다. 나노입자는 용액내에서 결합된 나노입자 전구체에 의하여 제조된다. 결합된 나노입자는 나노입자의 내부 부피내의 핵산서열과, 나노입자의 외부 표면에 존재하는 항체 또는 다른 결합 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 나노입자는 어떠한 모양도 가능하며, 구형이 바람직하다. 항체가 그것의 자연적인 목표물에 결합할 수 있도록, 항체는 자연적인 형태를 유지하는 것이 바람직하다.

결합된 나노입자는 용액에 들어 있거나, 건조되어 있거나, 리포좀내에 들어있는 것과 같은 다양한 제제로 존재할 수 있다. 제형의 구체적인 예로는, 풀러린(fullerene) 나노입자, 양전하로 하전된 고분자인 폴리에텔렌이민(PEI)과 덱스트란 설페이트(DS)를 포함하고 안정화제로서 아연을 사용하는 수용액성 나노입자, 칼슘 포스페이트 나노입자, 히드로- 또는 플루오로탄소 말단(tail)을 포함하는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄에서 유도된 말단-치환(end-capped) 올리고머; 공액된 폴리(아미노폴리(에틸렌글리콜)시아노아크릴레이트-co-헥사데실시아노아크릴레이트(poly(H(2)NPEGCA-co-HDCA)

나노입자, 폴리(D,L-락타이드-co-글리코라이드)(PLGA)로부터 만들어지는 생분해성 나노입자, 및 수용성이고 생분해성인 폴리포스포에스테르, 폴리(2-아미노에틸 프로필렌 포스페이트)(PPE-EA) 나노입자를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면들은 결합된 나노입자의 제조방법과 관련된다. 상기 방법은 고분자 공액체의 제조, 나노입자를 형성하기 위한 고분자 공액체와 핵산의 접촉을 포함한다. 상기 고분자 공액체는 첫 번째 고분자, 두 번째 고분자 및 리간드를 포함한다. 첫 번째 고분자는 핵산에 비공유 결합의 방식으로 결합하는 것이 바람직하다. 바람직한 첫 번째 고분자는 폴리에틸렌이민("PEI") 등의 DNA 결합 양이온성 고분자이고, 두 번째 고분자는 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 등의 친수성 고분자이며, 바람직한 리간드는 항체이다.

고분자 공액체 부분은 공유 결합으로 이루어지는 것이 바람직하다. 고분자 공액체의 구체적인 결합 순서는 바뀔 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 고분자와 두 번째 고분자가 결합한 다음에 리간드가 결합될 수 있다. 또한, 두 번째 고분자와 리간드가 결합한 다음에 첫 번째 고분자가 결합될 수 있다. 상기 방법은 접촉 과정 이후에 행해지는 분리 과정 또는 정제 과정을 추가로 포함할 수 있다. 상술한 결합 나노입자는 다양하게 응용될 수 있다. 상기 나노입자는 실험실 조건(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 투여에 사용될 수 있다.

본 발명은 미결정질(microcrystalline)의 형태로 레날라제의 약학적 조성물을 제공한다. 단백질 결정을 수득하는 다양한 방법들이 개발되어 왔으며, 이에는 자유계면 확산방법(free interface diffusion method)(참조: Salemme, F. R.(1972) Arch. Biochem. Biophys., 151: 553-539), 현적(hanging drop) 또는 좌적(sitting drop)에서의 증기확산(vapor diffusion) 방법(참조: McPherson, A. (1982) Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley and Son, New York, pp 82-127), 및 액체 투석법(참조: Bailey, K. (1940) Nature, 145: 934-935) 등이 있다. 비결정질 단백질과 비교하면, 결정질 단백질은 안정성의 측면과 경구와 비경구를 통한 단백질 전달을 가능하게 하는 단백질의 농도의 측면에 있어서 매우 향상된 효과를 나타낸다. 몇 가지 사례에서, 분자의 특정 결정질 형태는 더 우수한 생물 활성을 갖고, 더 빨리 용해되며, 분해가 덜되고, 더 정제하기 쉽다.

단백질, 당단백질, 효소, 항체, 호르몬 및 펩티드의 결정 또는 결정 제제는 인간과 동물로의 생물학적 전달을 위해 캡슐화될 수 있다. 단백질을 결정화하는 것, 약학적 성분이나 첨가제를 이용하고 선택적으로 조성물을 만들기 위해 그것들을 고분자 담체에 캡슐화하여 안정화된 제제를 만드는 것, 및 치료용 단백질과 백신의 전달을 포함하는 생의학적 응용을 위한 단백질 결정 제제와 조성물을 사용하는 것 등은 종래 기술로 잘 알려져 있다. 예를 들어 미합중국 특허 제 6,541,606호에는, 조성물을 형성하기 위하여 고분자 담체를 포함하는 매질(matrix)내로 단백질 결정 또는 결정 제제가 캡슐화되는 것이 개시되어 있다. 상기 제제와 조성물은 단백질 본래의 생물학적 활성 3차구조의 보존을 강화하고, 활성 단백질이 필요한 장소와 시간에 천천히 방출할 수 있도록 하는 저장 공간을 형성한다. 이러한 고분자 담체는 생체적합성이고 생체분해성인 고분자를 포함한다. 생물학적 활성을 지닌 단백질은 그 다음에 제어된 방법으로 일정시간 동안 방출되며, 이는 특정 캡슐화 기술, 고분자 형성, 결정 구조, 결정의 용해도, 결정의 가교(crosslinking) 및 제제화시 사용된 조건 등에 의하여 결정된다.

본 발명의 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 경구, 직장, 질, 비경구, 국부, 폐, 코, 구강 및 눈을 통한 투여 경로와 같은 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여 경로는 당업자에게 자명할 것이며, 치료하는 질병의 종류와 진행 정도, 치료하는 동물이나 사람 환자의 종류와 나이 등의 요소들에 의존적이다.

본 발명의 방법에서 유용한 약학적 조성물은 경구 고형 제제, 안약, 좌약, 에어로졸, 국부성 또는 다른 비슷한 제제를 통해 전신으로(systemically) 투여 가능하다. 약학적 조성물은 헤파란 설페이트(heparan sulfate)나 그것의 생물학적 등가물 등의 화합물 뿐 아니라, 약제 투여를 강화하고 용이하게 하는 것으로 알려진 약학적으로 허용된 담체와 다른 성분들을 포함할 수 있다. 나노입자, 리포좀, 재봉합된(resealed) 적혈구 및 면역 시스템을 이용한 다른 제제들도, 본 발명의 방법에 의하여 레날라제 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 투여하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법을 사용하는 화합물은 동맥 재협착증(arterial restenosis), 후천성 섬유증(advential fibrosis), 기관이나 조직내의 섬유증, 음성 리모델링(negative remodeling) 등을 치료하기 위하여 제제화되거나 포유동물 내로 투여될 수 있는 바, 이하에서 설명하기로 한다. 본 발명은 유효성분으로서 동맥의 재협착증, 후천성 섬유증, 음성 리모델링 등을 치료하는데 유용한 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 제조와 사용을 포함한다. 약학적 조성물은 개체에 투여하기 적합한 형태의 유효성분만을 포함할 수 있고, 또한 약학적 조성물은 유효성분과 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용된 담체, 하나 또는 그 이상의 보조성분, 또는 이들의 결합을 포함할 수 있다. 유효성분은 종래 기술에 잘 알려져 있듯이, 생리학적으로 허용가능한 양이온이나 음이온의 결합의 형태처럼 생리학적으로 허용가능한 에스테르나 염의 형태로 약학적 조성물 내에 존재한다.

본 명세서에서 사용되는 “약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)”라는 용어는 유효성분이 결합될 수 있고, 결합된 후에 개체에 유효성분을 투여하는데 사용할 수 있는 화학적 조성물을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 “생리학적으로 허용가능한(physiologically acceptable)” 에스테르나 염이라는 용어는 조성물이 투여되는 개체에 해롭지 않은 약학적 조성물의 다른 성분들과 적합한(compatible) 유효성분의 에스테르나 염의 형태를 의미한다.

본 명세서에 기재된 약학적 조성물의 제제는 약물학 분야에서 알려져 있거나, 이후 개발될 어떠한 방법을 통해서도 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조방법은 유효성분을 담체 내부나 하나 또는 그 이상의 보조성분 내부로 회합시키는 단계, 및 그 후 필요하거나 바람직한 경우에 제조물을 목적하는 1회 또는 다회 분량 단위로 형성하거나 포장하는 단계를 포함한다.

본 명세서에 기술된 약학적 조성물은 원칙적으로, 사람에 대하여 인정 기준에 따른(ethical) 투여에 적합한 약학적 조성물을 나타내지만, 당업자라면 일반적으로 이러한 조성물이 모든 종류의 동물에 투어하기에 적합하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 다양한 동물에 투여할 수 있도록 사람에 투여하기 적합한 약학적 조성물을 변형시키는 것은 공지되어 있으며, 통상의 지식을 가진 수의약리학자라면 일반적인 실험만으로도 이러한 변형을 설계하고 수행할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여가 예상되는 개체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 인간 및 다른 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 및 개 등의 상업적 관련이 있는 포유동물을 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 약학적 조성물은 경구, 직장, 질, 비경구, 국부, 폐, 코, 구강, 안약, 내포막(intrathecal) 또는 다른 투여 경로에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 다른 예상되는 제제는 투사된(projected) 나노입자, 리포좀 형태의 제제 및 재봉합된(resealed) 적혈구와 면역제제를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 1회 단위 투여량 또는 복수개의 1회 단위 투여량의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 여기서 사용된 “단위 투여량(unit dose)”이란 미리 정해진 유효성분을 포함하는 약학적 조성물의 개별적 분량이다. 유효성분의 양은 일반적으로 개체에 투여되는 유효성분의 투여량 또는 이러한 투여량의 1/2이나 1/3과 같은 투여량의 단순한 일부량이다.

본 발명의 약학적 조성물내의 유효성분, 약학적으로 허용되는 담체 및 기타 부가적인 성분들의 상대적인 분량은, 투여되는 개체, 크기 및 상태에 의존적이며, 조성물의 투여경로에 더욱 의존적이다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w)의 유효성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분에 더하여, 하나 또는 그 이상의 부가적인 약학적으로 활성을 가지는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 예상가능한 부가적인 약물은 항구토제(anti-emetic) 및 시아나이드(cyanide)와 시아네이트 스케빈저(cyanate scavenger) 등의 스케빈저를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물의 제어방출 제제 또는 서방형 제제는 통상적인 기술에 의하여 제조될 수 있다. 경구 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물의 한 제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 미리 정해진 양의 유효성분을 포함하는 정제(tablet), 경질 또는 연질 캡슐, 카세제(cachet), 트로키제(troche) 또는 구중정(lozenge)을 포함하는 개별적 고형 복용 개체로서 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 경구 투여에 적합한 다른 제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 분말 또는 과립형 제제, 수성 또는 유성 현탁액, 수성 또는 유성 용액, 또는 에멀젼을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 “유성(oily)” 액체는 탄소를 함유하는 액체 분자를 포함하며, 물보다 덜 극성을 나타내는 것이다. 예를 들어, 유효성분을 포함하는 정제는, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 부가적인 성분과 함께, 유효성분을 압축 또는 성형하여 제조된다. 압축 정제(compressed tablet)는 적절한 장치내에서, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 결합제, 윤활제, 부형제, 계면활성제 및 분산제와 혼합된 유효성분을, 분말 또는 과립 제조와 같은 유동형태(free-flowing form)로 압축하여 제조될 수 있다. 성형 정제(molded tablet)는 적절한 장치내에서, 유효성분, 약학적으로 허용되는 담체 및 이들을 습윤시키기에 충분한 최소한의 액체의 혼합물을 성형시켜 제조될 수 있다. 정제의 제조에 사용되는 약학적으로 허용되는 부형제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 비활성 희석제, 과립 및 분해제(granulating and disintegrating agent), 결합제 및 윤활제 등을 포함한다. 공지된 분산제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 감자 전분 및 소듐 전분 글리콜레이트(sodium starch glycollate)를 포함한다. 공지된 계면활성제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 소듐 로릴 설페이트(sodium lauryl sulphate)를 포함한다. 공지된 희석제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 락토스, 미결정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 칼슘 포스페이트, 칼슘 하이드로젠 포스페이트(calcuim hydrogen phosphate) 및 소듐 포스페이트를 포함한다. 공지된 과립 및 분해제는, 옥수수 전분 및 알긴산(alginic acid)을 포함한다. 공지된 결합제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 젤라틴, 아카시아, 기-젤라틴화된 옥수수 전분(pre-gelatinized maize starch), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose)를 포함한다. 공지된 윤활제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 스테아린산(stearic acid), 실리카(silica) 및 활석(talc)을 포함한다.

정제는 코팅되지 않을 수도 있으며, 개체의 위장 내의 관에서 분해를 지연시켜 유효성분의 지속적 배출과 흡수를 가능하게 하도록 공지된 방법을 통해 코팅될 수도 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트(glyceryl monostearate)나 글리세릴 다이스테아레이트(glyceryl distearate) 등의 물질이 정제를 코팅하기 위해 사용될 수 있다. 더 예를 들면, 미합중국 특허 제 4,256,108; 4,160,452; 및 4,265,874 호에 개시된 삼투성-제어방출(osmotically-controlled release) 정제를 제조하기 위한 방법으로 정제를 코팅할 수 있다.

유효성분을 포함하는 경질 캡슐은 젤라틴과 같이 생리학적 분해가능한 조성물을 이용해 만들어질 수 있다. 이러한 경질 캡슐은 유효성분을 포함하며, 예를 들어 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린(kaolin) 등의 비활성 고형 희석제를 포함하는 부가적인 성분을 추가로 포함할 수 있다. 유효성분을 포함하는 연질 젤라틴 캡슐은 젤라틴 등의 생리학적 분해가능한 조성물을 이용해 만들어질 수 있다. 이러한 연질 캡슐은 유효성분을 포함하며, 유효성분은 물 또는 땅콩유, 액체 파라핀, 올리브유 등의 유성 매개체와 혼합될 수 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물의 액상 제제는 액상 형태, 또는 사용전에 물이나 다른 매개체를 이용하여 액상이 될 수 있도록 건조 제품 형태로 제조, 포장 및 판매될 수 있다.

액상 현탁액은 수성 또는 유성 운반체(vehicle)내에서 유효성분을 현탁시키기 위한 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 수성 운반체는, 예를 들어, 물과 등장성 염수를 포함한다. 유성 운반체는, 예를 들어, 아몬드유(almond oil), 유성 에스테르(oily ester), 낙화생유(arachis oil), 참깨유(sesame oil), 또는 코코넛유(coconut oil) 등의 식물성 기름, 분별된(fractionated) 식물성기름, 및 액상 파라핀 등의 광유(mineral oil)를 포함한다. 액상 현탁액은, 이에 제한되는 것은 아니나, 현탁제, 분산 또는 습윤제, 유화제(emulsifying agent), 완화제(demulcent), 방부제, 완충제, 염, 향료, 착색제, 및 감미료(sweetening agent) 등에서 하나 또는 그 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다. 공지된 현탁제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 솔비톨(sorbitol) 시럽, 수화된 식용 지방, 소듐 알기네이트(sodium alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 트래거캔스 검(gum tragacanth), 아카시아 검(gum acacia) 및 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 등을 포함한다. 공지된 분산 또는 습윤제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 레시틴, 알킬렌 옥사이드가 지방산, 긴사슬 지방성 알콜, 지방산 및 헥시톨에서 유도된 부분 에스테르(partial ester) 또는 지방산 및 헥시톨 무수물에서 유도된 부분 에스테르(예를 들어, 각각 폴리에틸렌 스테아레이트, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트 및 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트)와 함께 축합된 생성물 등의 자연 발생 인지질(phosphatide)을 포함한다. 공지된 유화제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 공지된 방부제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 메틸, 에틸 또는 n-프로필-파라-히드록시벤조에이트, 아스코르빈산 및 솔빈산을 포함한다. 공지된 감미료는 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 솔비톨, 수크로스 및 사카린 등을 포함한다. 유성 현탁액을 위한 공지된 농화제(thickening agent)는 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀(hard paraffin) 및 세틸알콜을 포함한다.

수성 또는 유성 용매내의 유효성분의 액상 용액은 본질적으로 액상 현탁액의 제조방법 등으로 만들어지나, 유효성분이 용매내에서 현탁되지 않고 용해되는 점에서 기본적인 차이가 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 액상 용액은 액상 현탁액에서 설명된 각 성분들을 포함할 수 있으나, 용매내에서 유효성분의 용해를 돕기 위해서 현탁제가 반드시 필요하지는 않다. 수성 용매는 예를 들어, 물 및 등장성 염수를 포함한다. 유성 용매는 예를 들어, 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알콜, 낙화생유(arachis oil), 올리브유, 참깨유(sesame oil), 또는 코코넛유(coconut oil) 등의 식물성 기름, 분별된(fractionated) 식물성 기름 및 액상 파라핀 등의 광유(mineral oil)를 포함한다.

본 발명의 약학적 제제의 분말 및 과립형 제제는 당업계에 공지된 기술로 제조될 수 있다. 이러한 제제들은 예를 들어, 정제의 형태, 캡슐에 적재된 형태, 또는 수성이나 유성 운반체를 가하여 제조한 수성이나 유성의 현탁액 또는 용액의 형태로 개체에 직접 투여될 수 있다. 이러한 각각의 제제들은 하나 또는 그 이상의 분산 또는 습윤제, 현탁제 및 방부제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이러한 제제에는 충전제, 감미료, 향료 및 착색제 등의 부가적인 부형제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 물-내-기름(oil-in-water) 또는 기름-내-물(water-in-oil) 에멀션 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 유성상(oily phase)은 올리브유, 낙화생유, 액상 파라핀 등의 광유 또는 이들이 결합된 것과 같은 식물성 기름일 수 있다. 이러한 성분들은 아카시아 검 또는 트래거캔스 검 등의 자연발생 검, 콩 또는 레시틴 인지질 등의 자연발생 인지질, 솔비탄 모노올레산염 등의 지방산과 헥시톨 무수물의 결합으로 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레산염 등의상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 에멀션은 예를 들어, 감미료 또는 향료를 포함하는 보조성분들을 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 직장 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 좌약, 정체성 관장제(retention enema preparation) 및 직장 또는 결장 관주(irrigation)를 위한 용액 형태로 존재할 수 있다.

좌약 제제는 유효성분이 실온(즉, 대략 20⁰C)에서 고체이고 개체의 직장내의 온도(즉, 건강한 사람의 경우 대략 37⁰C)에서는 액체인 비자극성(non-irritating)의 약학적으로 허용되는 부형제와 결합하여 만들어질 수 있다. 적절한 약학적으로 허용되는 부형제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 및 다양한 글리세리드를 포함한다. 좌약 제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 산화방지제 및 방부제를 포함하는 다양한 보조성분을 추가로 포함할 수 있다.

정체성 관장제 또는 직장 또는 결장 관주(irrigation)용 용액은 유효성분이 약학적으로 허용되는 액상 담체와 결합하여 만들어질 수 있다. 종래 기술로 잘 알려진 바와 같이, 개체의 직장 조직에 적합한 전달 장치를 통하여 투여되거나, 이러한 형태로 포장될 수 있다. 관장제는 산화방지제 및 방부제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 보조성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 좌약, 탐폰이나 세정제( douche preparation) 등의 함침(impregnation)되거나 코팅된 질내 삽입 용구, 또는 질세정(irrigation)용 젤, 크림 또는 용액의 형태로 존재할 수 있다.

화학 조성물로 물질을 함침시키거나 코팅하는 방법은 공지된 기술이며, 이러한 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 화학 조성물을 표면위에 증착시키거나 결합시키는 방법, 물질의 합성과정에서 화학 조성물을 물질의 구조내로 혼합시키는 방법(즉, 생리학적으로 분해가능한 물질과 함께), 및 흡수성 물질내로 수성 또는 유성의 용액 또는 현탁액을 흡수시키고, 그 후 건조과정을 거치거나 거치지 않는 방법을 포함한다.

세정제(douche preparation) 또는 질내 관주를 위한 용액은 유효성분을 약학적으로 허용되는 액상 담체와 결합하여 만들 수 있다. 공지 기술로 잘 알려진 바와 같이, 세정제는 개체의 질 조직에 적합한 전달 장치를 통하여 투여되거나, 이러한 형태로 포장될 수 있다. 세정제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 산화방지제, 항생제, 항균제 및 방부제를 포함하는 다양한 보조성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 약학적 조성물의 “비경구 투여(parental preparation)”는 개체 조직의 물리적 개구(physical breaching)를 특징으로 하는 투여경로 및 조직의 개구를 통한 약학적 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 비경구 투여는, 이에 제한되는 것은 아니나, 조성물의 주사, 외과 절개를 통한 조성물의 투여, 조직을 관통하는 비-외과적 상처를 통한 조성물의 투입 등을 포함한다. 특히, 예상되는 비경구 투여는, 이에 제한되는 것은 아니나, 피하, 복막, 근육, 흉골 주사 및 신장 투석 주입 기술을 포함한다.

비경구 투여를 위한 약학적 조성물의 제제는 멸균수나 멸균 등장성 염수 등의 약학적으로 허용된 담체와 조합된 유효성분을 포함한다. 이러한 제제는 일시투여(bolus administration)나 연속투여(continuous administration)에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사가능한 제제는 앰플(ampule) 또는 방부제를 함유하는 다회-복용 용기(multi-dose container)와 같은 단위 복용량 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 운반체내의 에멀션, 연고(paste) 및 주입가능한(implantable) 서방형 또는 생분해성 제제를 포함한다. 이러한 제제는 현탁제, 안정제, 또는 분산제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 비경구 투여를 위한 제제의 한 실시예에 따르면, 유효성분은 액화된(reconstituted) 조성물의 비경구 투여 전에 적절한 운반체(예를 들어, 무균성 무발열원(pyrogen-free) 물)와 함께 액화될 수 있는 건조형태(즉, 분말 또는 과립)로 제공될 수 있다.

약학적 조성물은 수성 또는 유성의 무균성 주사가능한 현탁액이나 용액의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액이나 용액은 공지 기술에 의하여 제조될 수 있고, 유효성분에 더하여, 본 명세서에서 설명한 바와 같이 분산제, 습윤제 또는 현탁제 등의 보조성분을 포함할 수 있다. 이러한 무균성 주사가능한 제제는 예를 들어, 물 또는 1,3-부탄디올 등의 무독성 비경구 투여가능한 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용가능한 희석제와 용매는, 이에 제한되는 것은 아니나, 링거액, 등장성 소듐 클로라이드 용액, 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드 등의 비휘발성유를 포함한다. 다른 유용한 비경구 투여가능한 제제는, 유효성분을 미결정질 형태 내부, 리포좀제 내부 또는 생분해성 고분자 시스템의 한 성분으로서 포함하는 형태로 될 수 있다. 서방형 방출 또는 접종(implantation)을 위한 조성물은 에멀션, 이온교환 수지, 낮은 용해도의 고분자, 또는 낮은 용해도의 염을 포함할 수 있다.

국부 투여를 위한 제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 바르는 약(liniment), 로션 및 크림이나 도포제 또는 연고 등의 물-내-기름(oil-in-water) 또는 기름-내-물(water-in-oil) 에멀션과, 용액 또는 에멀션 등의 액상 또는 반액상 제제를 포함한다. 국부 투여가능한 제제는, 예를 들어, 약 1% 내지 10%(w/w) 의 유효성분을 포함할 수 있으나, 유효성분의 농도는 용매내에서 유효성분의 용해도의 최대치에 이를 수도 있다. 국부 투여를 위한 제제는 하나 또는 그 이상의 본 명세서에서 설명한 보조성분을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는 유효성분을 포함하며 약 0.5 내지 약 7 나노미터의 지름을 갖고, 바람직하게는 약 1 내지 약 6 나노미터의 지름을 갖는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 통상적으로 추진제(propellant)의 흐름이 분말을 분산시키는 방향으로 향하는 건조 분말 용기를 포함하는 장치를 사용하는 투여를 위한 건조 분말이거나, 밀봉된 용기내에서 끓는점이 낮은 추진제내에 용해되거나 현탁된 유효성분을 포함하는 장치와 같이 자가-추진 용매/분말-분배 용기를 사용하는 투여를 위한 건조 분말의 형태이다. 바람직하게는, 이러한 분말은 최소한 입자 무게의 98%에 해당하는 입자들이 0.5 나노미터 이상의 지름을 갖고, 최소한 입자 개수의 95%에 해당하는 입자들이 7 나노미터 이하의 지름을 갖는 입자들을 포함한다. 보다 바람직하게는, 이러한 분말은 최소한 입자 무게의 95%에 해당하는 입자들이 1 나노미터 이상의 지름을 갖고, 최소한 입자 개수의 95%에 해당하는 입자들이 6 나노미터 이하의 지름을 갖는 입자들을 포함한다. 건조 분말 조성물은 바람직하게 설탕 등의 고형 미세 분말 희석제를 포함하며 단위 복용량 형태로 제공된다.

끓는 점이 낮은 추진제는 일반적으로 대기압 하에서 65⁰F 이하의 끓는 점을 갖는 액상 추진제를 포함한다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50 내지 99.9%(w/w)를 차지하며, 유효성분은 조성물의 0.1 내지 20%(w/w)를 차지한다. 추진제는 액상 비이온성 계면활성제, 고형 음이온성 계면활성제 또는 고형 희석제 등의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다(바람직하게는, 유효성분을 포함하는 입자와 같은 정도의 입자 크기를 갖는다).

본 발명의 폐 전달을 위하여 제제화된 약학적 조성물은 용액이나 현탁액의 점적(droplet)의 형태로 유효성분을 제공할 수 있다. 이러한 제제는 유효성분을 포함하는 수용액 또는 희석된 알콜성 용액 또는 현탁액 상태로, 선택적으로는 무균성으로, 제조, 포장 또는 판매될 수 있고, 통상적으로 흡입기나 분무기 등을 이용하여 투여된다. 이러한 제제는 사카린 소듐, 휘발성유, 완충제, 계면활성제, 또는 메틸히드록시벤조에이트 등의 방부제등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 투여 경로를 통해 제공되는 방울은 바람직하게, 약 0.1 내지 약 200 나노미터의 평균 지름을 갖는다.

본 명세서에서 설명한 폐 전달에 유용한 제제는 본 발명의 약학적 조성물의 비강내(intranasal) 전달에도 사용될 수 있다.

비강내 투여에 적합한 또 다른 제제로는 유효성분을 포함하는 거친 분말이 있으며, 이는 약 0.2 내지 500 마이크로미터의 평균 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제는 코로 흡입하는 방법으로, 다시 말해서, 비강을 통하여 콧구멍 근처에 위치한 분말 용기로부터 빠르게 흡입을 하는 방법으로 투여될 수 있다.

비강내 투여에 적합한 제제는, 예를 들어, 적게는 0.1%(w/w)에서 많게는 100%(w/w)의 유효성분을 포함할 수 있고, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 구강 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어, 통상적인 방법을 사용하여 정제 또는 구중정(lozenge)의 형태일 수 있고, 예를 들어, 0.1 내지 20%의 유효성분과 기타 경구내에서 용해 또는 분해되는 조성물 및 선택적으로 하나 또는 그 이상의 본 명세서에서 설명된 보조성분을 포함할 수 있다. 구강 투여에 적합한 또 다른 제제는 유효성분을 포함하는 분말 또는 에어로졸화되거나 가루화(atomized)된 용액이나 현탁액을 포함할 수 있다. 이러한 분말화, 에어로졸화, 또는 가루화된 제제는, 바람직하게는 분산되는 때에 약 0.1 내지 200 나노미터의 평균 입자 또는 방울 크기를 가지며, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 눈을 통한(ophthalmic) 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어, 수성 또는 유성의 액상 담체 내에 유효성분이 0.1-1.0%(w/w)인 용액 또는 현탁액을 포함하는 안약의 형태일 수 있다. 이러한 안약은 완충제, 염 또는 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다. 다른 유용한 눈을 통한 투여가능한 제제는 미결정질 내 또는 리포좀 조제 내에 존재하는 유효성분을 포함하는 제제를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 “보조성분(additional ingredient)”은, 이에 제한되는 것은 아니나, 하나 또는 그 이상의 다음 성분을 포함한다: 부형제; 계면 활성제; 분산제; 비활성 희석제; 과립 및 분해제; 결합제; 윤활제; 감미료; 향료; 착색제; 방부제; 젤라틴 등의 생리적 분해가능한 조성물; 수성 운반체 및 용매; 유성 운반체 및 용매; 현탁제; 분산 및 습윤제; 유화제; 완화제(demulcent), 완충제; 염; 농화제(thickening agent); 충전제(filler); 유화제; 산화방지제; 항생제; 항균제; 안정제; 및 약학적으로 허용되는 고분자성 또는 소수성 물질. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 “보조성분”은 공지 기술로 알려져 있으며, 본 명세서에 인용문헌으로 삽입된 Genaro, ed(참조: 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA) 등의 문헌에 기재되어 있다.

통상적으로, 동물, 바람직하게는 사람에 투여될 수 있는 본 발명의 조성물의 투여량은, 동물의 종류, 치료되는 질병 상태의 종류, 동물의 나이, 및 투여 경로 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 여러 가지 요인들에 의하여 가변적일 수 있다.

본 발명의 화합물은 하루에 수회, 또는 그 보다 더 적은 회수인 하루에 1회, 1주일에 1회, 2주에 1회, 1달에 1회 또는 몇 달에 1회 또는 1년에 1회 또는 그 이하와 같이 이보다 더 적은 회수로 동물에 투여될 수 있다. 투여 회수는 당업자에게 자명할 것이며, 치료되는 질병의 종류나 정도, 동물의 종류나 나이 등의 다양한 요인들에 의하여 결정된다.

VIII . 방법

A. 레날라제 발현에 관련되고 매개되는 병, 질환 또는 상태를 치료하거나 경감시키는 방법

본 발명의 한가지 측면에 따르면, 포유동물 레날라제에 연관되거나 매개되는 질병, 장애 및 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 질병, 장애 및 상태는, 이에 제한되는 것은 아니나, ESRD, 만성 고혈압, 심장수축 고혈압, 고립형(isolated) 심장수축 고혈압, 당뇨성 고혈압, 폐의 고혈압, 급성의 심각한 고혈압, 병의 징후가 보이지 않는 좌심실 기능장애, 만성 출혈성 심장질환(CHF), 심근경색(MI), 심장 리듬 장애, 발작, 동맥경화증, 우울증, 불안, 조병 및 정신분열증 등을 포함한다.

본 명세서에 개시한 데이타는 레날라제의 양을 감소 또는 증가시키거나, 레날라제의 활성을 감소 및 레날라제의 활성을 증가시키는 방법이 잠재적으로 유익한 것처럼, 레날라제의 과발현, 레날라제의 저발현, 과활성의 레날라제 및 불활성 레날라제가 다양한 질병, 질환 및/또는 상태에 연관되어 있다는 것을 암시하는데, 상술한 방법은 본 발명에서 고려되는 특별한 장애, 상태 및/또는 질병에 의존적이다. 따라서, 다양한 질병, 장애 또는 상태를 치료/경감시키기 위하여 레날라제의 양에 영향을 주는 방법이 본 명세서에 개시되어 있는데, 레날라제의 양은 치료에 앞서 세포 내에서 레날라제의 양과 비교하거나 변화된 레날라제 양과 관련되거나 매개되는 질병, 장애 또는 상태에 의해 고통받지 않는 것으로 알려진 포유동물에서 수득한 다른 동일한 세포에서의 레날라제의 양과 비교하였을 때, 감소하거나 증가하였다.

당업계의 숙련된 자라면 레날라제의 발현, 폴리펩티드의 양 또는 그 활성이 증가 또는 감소에 관계없이, 본 명세서의 개시에 근거하여 레날라제를 감소 또는 증가시키는 방법이, 자연발생적이거나 비자연발생적인 레날라제, 레날라제 저해제, 또는 레날라제를 발현시키거나 발현시키지 않는 재조합 세포의 투여를 포함한다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 당업계의 숙련된 자는, 본 명세서의 개시에 근거하여, 본 발명이 포유동물에서 레날라제의 발현 또는 활성 수준에서 감지할 만한 증가 또는 감소에 영향을 주는 당업계에 알려진 치료방법을 포함한다는 것을 인지할 것이다.

본 발명의 조성물은 레날라제를 세포, 조직 또는 동물로의 투여 및 세포, 조직 또는 동물에서 레날라제의 발현을 촉진하는데 이용할 수 있다. 조성물은 레날라제의 발현 또는 세포, 조직 및 동물내에서 단백질의 양을 증가 또는 감소시키는 것이 동물에 이로운 정도로 레날라제의 변형된 발현에 의해 매개되는 질병, 장애 또는 상태를 치료하는데 유용하다. 동물 내에서 질병, 질환 또는 상태가 바뀐 레날라제의 발현 또는 단백질 양에 의해 매개되거나 관련될 때, 조성물은 이러한 레날라제의 발현 또는 단백질 양을 조절하는데 이용할 수 있다. 당업계의 숙련된 자는, 본 명세서의 개시에 근거하여, 세포내에서 레날라제의 양 또는 활성을 증가시키는 것이 유용하다는 것을 이해할 것이다. 이는 레날라제 발현과 고혈압 사이의 관계를 묘사하는 본 명세서에 개시한 데이타가 레날라제 활성의 과발현 또는 증가는 혈압을 낮출 수 있음을 암시한다. 이는 자연발생적이거나 비자연발생적인 레날라제의 투여에 의해 질병, 질환 또는 상태로부터 고통받지 않는 다른 동일한 세포, 조직, 동물에서 레날라제의 발현, 양, 활성과 비교했을 때, 레날라제의 감소한 발현, 양, 활성에 관련되거나 매개되는 상태의 질병, 질환을 치료하거나 경감시키는데 이용할 수 있다. 이러한 질병, 질환 또는 상태는, 이에 제한되는 것은 아니나, ESRD, 고혈압, 심혈관장애 또는 정신적 장애를 포함한다.

본 명세서에 개시한 데이타는 레날라제가 전반적인 혈압을 조절할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 당업계의 숙련된 자라면, 본 명세서의 개시에 근거하여, 카테콜아민을 대사시킴으로써, 레날라제는 심혈관 질환을 치료하는데 이용할 수 있다는 점을 인식할 것이다. 그러므로, 본 발명은 순환계에서의 레날라제 활성 또는 세포에서의 레날라제 발현을 증가시키는 것을 포함하는 카테콜아민 대사작용을 증가시키는 방법을 포함한다. 예를 들어, ESRD는 효과적인 양의 레날라제를 포유동물에 투여함으로써 치료할 수 있다. 이것은 본 명세서에 개시한 데이타가 레날라제는 말기신장병과 관련됨을 입증하였기 때문이다. 또한, 본 명세서에 개시한 데이타는 재조합 레날라제를 쥐에 주입하는 것이 쥐의 혈압을 감소시키는 결과를 보였고, 이는 레날라제가 ESRD가 유발하는 고혈압 및 다른 심혈관 질환을 치료하는데 이용할 수 있음을 제안하였다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 레날라제의 발현 또는 활성을 저해하는 저해제를 포유동물에 투여함으로써 레날라제의 변형된 발현 또는 활성에 의해 매개되는 질병, 장애, 상태를 완화화는 방법을 포함한다. MAO 저해제처럼, 레날라제 저해제는 감정 장애 같은 CNS 질환의 치료에 유용함을 증명할 것이다. 따라서, 레날라제를 저해하는 화합물, 펩티드-유사물질(peptidomimetic), 작은 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, 항체 및 세포내 항체(intrabody)로 레날라제의 발현을 감소시키거나 레날라제의 활성을 감소시키는 것이, 이러한 질환의 증상을 완화시키는 뇌의 모노아민 함량을 증가시킬 것이다. 따라서, 당업계의 일반적 방법 중 하나는 본 명세서에 기술한 것처럼 다양한 방법에 의해 성취할 수 있는 레날라제 저해가 특별한 감정 질환에서의, CNS 질환에 대한 유용한 치료법이라는 점을 이해할 것이다.

CNS 질환은, 이에 제한되는 것은 아니나, 치매, 알츠하이머 병, 정신분열증, 정신병, 우울증, 두통 및 편두통을 포함한다. 본 명세서에 사용한 것처럼, "우울증(depression)"이란 용어는, 예를 들어, 일회성 또는 재발성의 주된 우울성 질환, 흉선장애 질환, 우울성 신경증, 신경성 우울증; 식욕감퇴, 체중감소, 불면증 및 이른 아침 깨는 현상, 정신운동 지체를 포함하는 우울증: 식욕증가, 수면과잉(hypersomina), 정신운동의 동요 또는 성급한, 불안 및 공포증을 포함하는 불규칙적인 우울증 (또는 반발적 우울증); 계절에 영향을 받는 질환; 또는 양극성 질환 또는 조병의 우울증, 예를 들어, 양극성 I 질환, 양극성 II 질환 및 순환성 흉선 질환; 등의 우울성 질환을 포함한다. "우울증(depression)"이란 용어 내에 포함된 다른 감정 질환은 이르거나 늦은 징후 및 비전형적 특징; 알츠하이머 형태의 치매, 이르거나 늦은 징후, 우울한 감정; 우울한 감정의 도관성 치매(vascular dementia); 알콜, 암페타민, 코카인, 환각제, 흡입제, 마취제, 펜시클리딘, 진정제, 최면제, 불안완화제 및 다른 물질에 의해 유발되는 감정 질환; 정신분열증이 영향을 주는 우울증 형태의 질환; 우울한 감정을 지닌 적응 장애; 을 지니거나 또는 그런 특징이 없는 흉선 장애성 질환을 포함한다.

본 발명의 조성물은 불안증 치료에 효과적이다. 본 명세서에 사용한 것처럼, “불안(anxiety)”이란 용어는 광장 공포증을 지니거나 지니지 않는, 일련의 공포 질환이 없는 광장공포증, 특별한 공포증, 예를 들어, 특별한 동물 공포증, 사회적 공포증, 강박관념의 강제적 질환, 외상 후의 스트레스 질환 및 급성 스트레스 질환 및 일반화된 불안성 질환을 포함하는 스트레스성 질환 등의 공포성 질환 같은 불안 질환을 포함한다.

“일반화된 불안(generalized anxiety)”은 확장된 기간의 매일의 증상을 지난 일반적으로 과도한 불안 또는 걱정의 확장된 기간(예를 들어, 최소 6개월)으로 정의하였다. 불안과 걱정은 조절하기 어렵고 들뜨는 것, 쉽게 피로해짐, 집중하기 어려움, 성급함, 근육 긴장 및 비 숙면 등을 동반하였다.

“공포 질환(panic disorder)”은 다른 공포의 습격에 대한 최소 한 달 이상의 지속적 관심후에 나타나는 재발성 공포의 습격의 존재로 정의하였다. “공포의 습격(panic attack)”이란 고도의 걱정, 두려움 또는 공포의 갑작스런 징후가 있는 불연속적인 기간을 의미한다. 공포의 습격 동안, 각 개체은 심계항진, 발한, 떨림, 짧아진 호흡, 가슴 고통, 메스꺼움 및 현기증을 포함하는 다양한 증상을 경험할 수 있다. 공포 질환은 광장공포증과 같이 또는 없이 나타날 수 있다.

“공포증(phobia)”은 광장 공포증(agoraphobia), 특정 공포증(specific phobia) 및 사회적 공포증(social phobia)을 포함한다. “광장 공포증(agoraphobia)”은 탈출이 힘들거나 난처한 또는 도움이 공포의 습격시 이용할 수 없는 장소나 상황에 대한 불안으로 특징지워진다. 광장 공포증은 공포의 습격에 대한 병력없이 나타날 수 있다. “특정 공포증(specific phobia)”은 특별히 두려운 대상 또는 상황에 대한 노출에 의해 야기되는 임상적으로 주요한 불안으로 특징지워 진다. 특정 공포증은 다음과 같은 아류형(subtype)을 포함한다: 동물 및 곤충에 의해 야기되는 동물형(animal type); 자연환경에서의 대상들에 의해 야기되는 자연환경형(natural environment type), 예를 들어, 폭풍, 고도 또는 물; 혈액이나 상해를 보거나, 주입 또는 다른 침입성 의료행위를 보거나 수용하여 야기되는 혈액-주입-상해형(blood-injection-injury type); 대중 교통, 터널, 다리, 엘리베이터, 비행, 운전 또는 폐쇄된 공간 같은 특별한 상황에 의해 야기되는 상황형(situation type); 두려움이 다른 자극에 의해 야기되는 다른 형. 특정 공포증은 또한 단순한 공포증이라고도 한다. “사회적 공포증(social phobia)”은 특정 형태의 사회적 또는 행동 상황에 대한 노출에 의해 야기되는 임상적으로 중요한 불안으로 특징지워 진다. 사회적 공포증은 또한 사회적 불안 질환이라고도 한다.

“불안(anxiety)”이란 용어 내에 포함되는 다른 불안 질환은 알콜, 암페타민(amphetamine), 카페인, 대마초, 코카인, 환각제, 흡입제, 펜시클리딘(phencyclidine), 진정제, 최면제, 불안완화제 및 다른 물질, 불안 또는 불안과 우울이 혼합된 적응 질환에 의해 유발되는 불안 질환을 포함한다.

불안은 혼합된 불안 또는 우울성 질환 같은 다른 질환과 같이 또는 그런 질환없이 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 우울증을 동반하거나 동반하지 않는 불안의 치료에 유용하다.

또한, 본 발명은 다른 동일하지만 일반 조직, 예를 들어 치료하거나 완화되는 질병, 장애 또는 상태와 연관되는 어떠한 탐지가능한 임상적 요인을 보여주지 않는 조직에서의 레날라제 발현양과 비교했을 때 증가한 레날라제 발현에 의해 매개하는 질병, 장애, 상태로 고통받는 환자에 대한 레날라제를 암호화하는 핵산에 상보적인 안티센스 핵산을 투여함으로써 레날라제의 바뀐 발현에 의해 매개하는 질병, 장애, 상태를 완화시키는 방법을 제공하였다. 이는 차례로, 레날라제 발현의 감소를 매개함으로써 비정상적인 레날라제 발현에 의해 매개되는 질병, 장애 또는 상태를 완화시켰다.

레날라제의 저해가 세포에 안티센스를 투여함으로써 세포내에서의 레날라제 발현을 저해함을 예시하였다 할지라도, 당업계의 숙련된 자는 세포 내에서 단백질 발현 및/또는 활성을 저해시키는 다양한 방법이 있음을 고려할 것이다. 이러한 방법은 리보자임을 이용한 레날라제 발현의 저해 및 세포내에서 단백질 활성의 저해, 예를 들어 세포에 항체를 투여하는 것, 세포에 항테를 암호화하는 핵산을 투여함으로써 항체가 세포내에서 발현되어 항체를 세포의 세포질로 운반시키는 방법을 포함하였고 이에 제한되지는 않는다. 이러한 단백질의 세포내 활성을 억제하는 “세포내 항체(intrabody)"의 이용은 당업계에 잘 알려졌다(참조: Verma et al., 1997, Nature, 389:239-242; Benhar & Pastan, 1995, J. Biol. Chem., 270:23373-23380; Willuda et al., 1999, Cancer Res., 59:5758-5767; and, Worn et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:2795-2803). 따라서, 본 발명은 당업계에서 알려진 방법 또는 미래에 개발될 방법을 이용한 세포내에서 목적하는 단백질 활성을 저해하는 방법을 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 레날라제 발현과 관련된, 그 발현에 의해 매개되는 질병, 장애 또는 상태로부터 고통받는 개체은 손상된 세포를 보충, 증가, 또는 레날라제 발현이 결핍된 세포로 치환시킴으로써 치료할 수 있다. 세포는 정상적인 동계의 일치하는 공여자 또는 치료받는 개체로부터 수득한 세포로부터 유래할 수 있다. 세포는 유전적으로 변형시켜서 레날라제 발현을 저해하였다. 다시 말해서, 세포는 당업계에서 잘 알려진 재조합 방법을 이용하여 레날라제 발현을 증가시키도록 변형할 수 있다. 또한, 본 발명은 레날라제의 변경된 발현과 관련된 질병 또는 장애로 고통받지 않는 다른 동일한 공여자에서 수득한 정상 세포를 이용함을 포함하였고, 세포는 그것으로부터 필요한 포유동물로 투여할 수 있다. 부가적으로, 본 발명은 세포를 레날라제의 증가된 또는 감소한 양을 발현하도록 변형시킨 포유동물 및 재도입시킨 포유동물로부터 수득하는 생체외 기술을 포함한다. 게다가, 레날라제의 변경된 발현과 관련된 상태로부터 고통받지 않는 같은 포유동물로부터 수득한 다른 동일 세포내에서 발현시킨 레날라제 양과 비교했을 때, 레날라제의 정상적인 양을 발현하는 포유동물로부터의 세포는 성장 및 확장시킬 수 있고, 효율적인 수의 세포는 포유동물로 재도입시킬 수 있다. 이러한 방법은 당업계에서 잘 알려진 방법이 골수 간질 세포의 이용에 관련한 세포 및 유전자 치료 기술을 포함한다. 따라서, 당업계에서 숙련된 자는 세포가 생체 내 투여되어 탐지할 수 있는 레날라제 발현을 지니거나 또는 결핍된 세포에 관련된 세포 치료 및 유전자 치료가 본 발명에 포함되어 있음을 고려할 것이다.

손상된 세포를 회복한 세포 또는 동계의 면역적으로 일치하는 공여자로부터의 정상 세포로 교환하는 것 뿐만 아니라, 본 발명의 방법은 동물 내에서 분비될 때, 유용한 효과를 가져오는 목적하는 단백질의 발현을 촉진하는데 이용할 수도 있다. 즉, 세포는 분리될 수 있고, 레날라제를 암호화하는 유전자를 공급받고, 공여자 또는 세포외 레날라제의 발현이 치료 효과를 보이는 동계의 일치한 수용자에 도입될 수 있다

당업계의 숙련된 자는 본 명세서의 개시에 근거하여, 세포로부터 레날라제의 분비가 본 발명에 고려되었음을 이해할 것이다. 이는, 숙련자라면 본 명세서의 개시에 근거하여, 세포로부터 레날라제의 분비가 유용한 치료 방법이 될 수 있고, 본 발명이 세포로부터 레날라제의 분비를 포함함을 고려할 것이다. 세포로부터 레날라제의 분비는 당업계에서 잘 알려진 표준 방법 및 미래에 개발될 방법에 따라 영향받을 수 있다. 이러한 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 분비된 분자의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산의 5’ 말단에 공유결합시키는 것을 포함한다. 세포로부터 단백질의 분비를 매개하는데 이용할 수 있는 다양한 신호 서열은 당업계에서 입수가능하고 당업계에 널리 알려져 있으며, 본 발명은 이 뿌만 아니라 세포로부터 단백질의 분비를 유도하는 미래에 개발될 서열 들도 포함한다.

본 발명의 이러한 측면은 레날라제의 치료 적정량을 개체에게 투여하는 유전자 치료법에 관련되어 있다. 본 발명의 일부 측면에 따라, 레날라제, 안티센스 핵산, 또는 본 발명의 유전자 제거용 벡터로 형질전환한 재조합 세포는 레날라제 발현의 결핍을 포함하는, 레날라제의 변경된 발현에 의해 특성화되는 질병, 장애 및 상태를 치료하는 세포 치료제로서 이용할 수 있다.

특히, 레날라제를 암호화하는 이종의 유전자를 포함하는 유전자 구축물이 세포 내로 도입되었다. 이러한 재조합 세포는 분리한 레날라제를 정제하는데 이용하고, 이는 동물에 투여하였다. 당업계에서 숙련된 자는 본 명세서의 개시에 근거하여, 분리한 레날라제 폴리펩티드를 투여하는 대신, 재조합 세포 자체를 포유동물에 투여함으로써, 레날라제를 필요로 하는 포유동물에 레날라제를 투여할 수 있음을 이해할 것이다. 이는 수용자의 체내로 재조합 세포에 의해 단백질이 발현되고 분비되는 것이 필요한 수용자 개체에게 이익이 될 것이다.

본 발명에 따라, 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 구성하는 유전자 구축물을 세포로 도입하였다. 즉, 본 명세서에서 “재조합 세포(recombinant cell)”로 불리우는 세포는 레날라제를 암호화하는 핵산 또는 재조합 세포에 의해 레날라제 발현 및/또는 분비를 저해하는 핵산을 도입하도록 유전적으로 변형되어(예를 들어, 안티센스 레날라제 핵산, 레날라제 항체를 암호화하는 핵산 및 그 유사체들), 이 재조합 세포를 투여받은 수용자에게 유용한 효과를 야기시켰다. 본 발명의 일부 측면에 따라, 치료받은 같은 개체로부터 수득한 세포 또는 다른 개체로부터의 새포 또는 인간이 아닌 동물로부터의 세포는 손상된 레날라제 유전자를 교환하거나 레날라제 유전자 발현이 개체에 대하여 유용한 효과를 보이는 레나라제 유전자의 도입 또는 개체에게 유용한 효과를 보이는 레날라제 발현의 저해를 위해 유전적으로 변형시킬 수 있다.

본 발명의 일부 측면에 의하면, 질병, 장애, 상태로부터 고통받는 개체는 레날라제를 암호화하는 핵산의 정상적이고 기능적인 복사본을 포함하는 유전자 구축물을 포함하는 분리한 재조합 세포를 제공하여, 손상되거나 결핍된 레날라제를 암호화하는 핵산을 보충, 증대 및/또는 교환함으로써 치료할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면은 레날라제가 존재하지 않고/존재하지 않거나, 기능이 결핍된 개체가 레날라제를 암호화하는 핵산을 제공받는 유전자 치료법에 관계되어 있다. 핵산이 개체에서 발현될 때, 단백질이 생산되어 개체의 질병, 장애 또는 상태를 완화하거나 치료하는 역할을 하기 때문에, 세포에 의해 제공하는 레날라제를 암호화하는 분리한 핵산은 개체의 손상된 레날라제 발현을 보완하였다. 이러한 핵산은 바람직하게는 재조합 세포로부터 분비되는 레날라제 폴리펩티드를 암호화하였다.

레날라제를 암호화하는 유전자 구축물을 세포로 형질전환시키는 모든 경우에, 핵산은 재조합 세포에서 핵산의 발현을 얻는데 필요한, 적절한 프로모터/조절서열에 작동가능하도록 결합시켰다. 이러한 프로모터/조절서열은, 이에 제한되는 것은 아니나, 지속적이며 유도적이고 조직 특이적인 분화 특이적 프로모터를 포함하며, 이러한 프로모터/조절서열은 본 명세서의 다른 부분에도 기술되어 있다. 지속성 프로모터(constitutive promoter)는, 이에 제한되는 것은 아니나, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 즉시초기 프로모터 및 라우스 육종바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터를 포함한다. 그외에도, 하우스키핑 유전자의 발현을 조절하는 것과 같은 하우스키핑 프로모터(housekeeping promoter)를 이용될 수 있다. 다른 프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 신경교섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein)을 암호화하는 유전자에 대한 프로모터와 같은, 중추 신경계의 세포에서 우선적으로 발현되는 것을 포함한다. 예를 들어, 테트라싸이클린 유도 프로모터를 이용할 수 있다(참조: Freundlich et al., 1997, Meth. Enzymol., 283:159-173).

바람직하게는, 유전자 구축물은 본 발명의 포유동물 레날라제의 암호화 서열 필수적인 프로모터/조절서열에 작동가능하도록 결합시켜서 벡터를 세포에 형질전환시켰을때, 암호화서열이 세포에 의해 발현되도록 하는 발현벡터로 제공하였다. 암호화 서열은 세포 내에서 서열의 발현에 필요한 프로모터/조절 구축물에 작동가능하도록 연결시켰다. 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 cDNA, 지놈 DNA, 합성한 DNA, 또는 이들의 혼성물 도는 mRNA 같은 RNA 분자일 수 있다. 프로모터/조절 구축물에 작동가능하도록연결시킨 레날라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구축물은 세포 내에서 기능적인 에피솜 분자로써 존재할 수 있거나 세포의 크로모좀 DNA에 병합할 수도 있다. 유전 물질은 플라스미드 형태로 분리된 유전자 물질로써 남아 있는 세포로 도입할 수 있다. 다시 말해서, 숙주 세포 크로모좀에 병합할 수 있는 선형 DNA는 세포 내로 도입시킬 수 있다. 세포로 DNA를 도입시킬 때, DNA의 크로모좀으로의 병합을 촉진시키는 인자를 첨가할 수 있다. 병합을 촉진시킬 때 유용한 DNA 서열은 DNA분자로 포함시킬 수도 있다. 다시 말해서, RNA를 세포로 도입시킬 수도 있다.

발현 벡터 내의 유전 물질을 발현시키기 위해서, 프로모터/조절 조성물은 작동가능하도록 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 결합시켜야만 한다. 단배질 생산을 극대화시키기 위해서, 프로모터/조절서열은 목적하는 세포에서 유전자 발현에 아주 적합하도록 선택할 수 있다. 게다가, 코돈은 세포내에서 가장 효율적으로 전사되도록 선택할 수 있다. 당업계에서 일반적인 기술을 지닌 이는 목적하는 세포에서 기능할 수 있는 발현 벡터로써 재조합 유전 물질을 생산할 수 있다.

또한 프로모터/조절서열 조성물은 단백질의 조직 특이적 발현을 촉진시키도록 선택할 수 있음을 고려해야 한다. 따라서, 예를 들어, 특이적인 프로모터/조절서열을 제공하여 이종의 유전자가 오직 재조합 세포를 이식한 조직에서만 발현될 것이다. 추가적으로, 숙련된 이는 본 명세서의 개시에 근거하여, , 레날라제 프로모터는 목적하는 핵산에 작동가능하도록연결시키서 조직 또는 기관의 특정 위치에서 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 마찬가지로, 레날라제 프로모터는 높은 카테콜아민 순환이 문제가 되는 핵산의 발현이 유용한 목적하는 핵산의 발현을 유발시킬 수 있다.

당업계에서 숙련된 자는 본 명세서의 개시에 근거하여, 레날라제의 발현 또는 발현의 결핍을 목적으로 하는 바람직한 조직은 피부의 궤양화, 뼈의 골절 및 유사현상을 포함한다는 것을 고려하며, 이에 제한되지는 않는다. 부가적으로, 프로모터/조절서열 조성물을 선택하여 유전자 발현을 유도할 수 있다. 예를 들어, 테트라사이클린 유도 프로모터를 이용할 수 있다(참조: Freundlich et al., 1997, Meth. Enzymol., 283:159-173).

어느 특정한 이론에 부합됨이 없이, 레날라제를 암호화하는 핵산은 바람직하게는 본문의 다른 곳에 발표한 추정되는 신호 서열을 포함하였고(예를 들어, 사람의 레날라제 N 말단의 아미노산), 이는 재조합 세포에서 분리한 핵산에 의해 암호화하는 레날라제의 운반 및 분비를 유도할 수 있다. 신호 서열은 세포로부터 성숙한 레날라제 단백질의 분비시 조작되어 제거될 것이다. 다시 말해서, 특정 이론에 부합됨이 없이, 추정되는 신호 서열은 절단되지 않을 것이다. 그러나, 대신 막통과 도메인이 될 수 있다.

세포내 유전적 결합을 교정하는, 유전 물질이 개체의 유전적 결합을 교정하기 위해 다른 곳에서 충분한 양 및 기능적 조건이 없는 단백질을 암호화하는, 이와 관련된 특정한 병, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 유용한, 세포에서 레날라제의 발현을 저해하는(예를 들어, 유전자 제거 목표의 벡터, 안티센스 핵산 및 그 유사체) 재조합 유전 물질을 세포에 제공하는 것 외에 부가적으로, 유전 물질은 또한 이러한 제거가 바람직한, 선택적으로 그런 세포를 제거하는 방법을 제공하기 위해 본 발명에 이용하는 재조합 세포로 도입시킬 수 있다. 재조합 세포를 파괴시키는 이런 방법은 재조합 세포로 도입시킬 수 있다.

본 발명에 따라, 재조합 세포는 그들이 특이적으로 파괴되기 쉽도록 하는 유전물질을 공급받을 수 있다. 예를 들어, 재조합 세포는 세포 독성 인자를 특이적으로 목표로 하는 수용체를 암호화하는 유전자를 제공받을 수 있다. 선택적인 세포 죽음을 유발시키는데 이용할 수 있는 유전자의 발현 형태는 재조합 세포로 도입시킬 수 있다. 이러한 시스템에서, 허피스 바이러스 티미딘 키나제(herpes virus thymidine kinase, herpes tk) 유전자의 발현 형태를 재조합 세포에 도입시킬 수 있고 선택적인 세포 죽음을 유발시키는데 이용할 수 있다. herpes tk 유전자를 포함하는 도입한 유전 물질을 각 개체에게 도입하였을 때, herpes tk가 생산될 것이다. 이식한 제조합 세포를 죽이는 것이 바람직하거나 필요할 때, 약제 갱사이클로버(gangcyclovir)를 herpes tk의 선택적 죽음을 유도하는 각 개체에게 투여할 수 있다. 따라서, 이 시스템은 이식한 재조합 세포의 선택적 파괴를 허용하도록 제공할 수 있다.

당업계에서 숙련된 자는 본 명세서의 개시에 근거하여, 본 발명이 레날라제를 제공하거나 포유동물에서 레날라제 발현을 저해하는 재조합 세포의 생산을 포함하는 것을 고려할 수 있다. 세포는 동물에 대해 레날라제를 투여하거나 분자를 운반하는데 이용할 수 있다(예를 들어, 유전자 제거 목표의 벡터, 안티센스 핵산, 리보자임, 레날라제에 특이적으로 결합하는 항체 등등).

동물에 대한 레날라제의 투여는 레날라제의 활동 기작을 연구하기 위해 또는 레날라제 발현에 관련된 병, 장애 또는 상태에 대한 진단약 및 치료제의 개발에 유용한 모델 시스템의 개발을 위한 모델 시스템으로써 이용할 수 있다.

또한, 레날라제를 발현 및 분비하는 재조합 세포의 투여에 의해 매개하는 동물로의 레날라제 운반은 레날라제의 양 증가가 치료 효과를 매개하는 병, 장애 또는 상태를 치료하거나 경감시키는데 이용할 수 있다. 좀 더 특이적으로, 레날라제를 암호화하는 핵산을 발현하는 재조합 세포를 투여함으로써 동물에 대해 레날라제를 투여하는 것은 ESRD, 고혈압, 심근 질환, 다른 병들 사이에서 유용할 수 있다.

다시 말해서, 세포로부터 레날라제의 발현, 활성 및 분비를 저해 또는 감소시키는 핵산을 포함하는 재조합 세포의 투여는 레날라제 발현, 활성 및 분비에 관련되거나 매개되는 병, 장애 및 상태에 유용한 진단제 및 치료제의 개발에 대한 모델로써 이용할 수 있다. 본 발명은 재조합 세포가 레날라제를 발현하여 이러한 분자를 동물에 제공하는 것을 저해하는 분자를 생산할 수 있다는 것을 포함한다. 다시 말해서, 특별 이론에 부합됨이 없이, 재조합 세포 자체는 기능적 세포이며, 레날라제를 발현시킬 무능력을 제외하고, 레날라제 신호 전달 경로에 대한 관련성 없이, 비 재조합 세포와 동일한 기능을 수행할 수 있다.

동물 또는 상용화되거나 개발된 세포 주로부터 수득한 세포들, 실험적 조건에서 배양한 1차 세포들은 당업계에서 평범한 기술을 지닌 이들에게 쉽게 이용할 수 있는 잘 알려진 기술을 이용하여 형질전환시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 공여 동물 또는 환자 동물 자체로부터의 수득한 세포에 제한되지는 않는다. 더욱이, 본 발명은 재조합 세포가 레잘라제를 발현하거나(조작에 앞서 레날라제를 발현하지 않는 곳, 또는 핵산을 세포로 도입하기에 앞서 세포가 다른 양의 레날라제를 발현하는 장소에서), 또는 재조합 세포가 레날라제를 발현하지 않거나 적은 양을 발현하는(이전에 레날라제를 발현시켰거나 또는 핵산을 세포로 도입시키기 전에 다른 양의 레날라제를 발현시키는) 본 발명의 핵산을 이용하여 조작할 수 있는 모든 세포를 이용하는 것을 포함하고 있다.

핵산은 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 발현하거나 레날라제 발현을 저해하는 분자를 발현시키는 세포로 유전자 구축물을 도입하기 위해 이용하는 표준 방법을 이용하여 세포로 도입시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 세포는 인산화 칼슘 침전 형질전환법, DEAE 덱스트란(dextran) 형질전환법, 전기천공법, 미세주입법, 리포좀 매개법, 화합물 매개법, 리간드 매개법 또는 재조합 바이러스 벡터 운반체에 의해 형질전환시킬 수 있다.

일부 실시예에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 목적하는 서열을 지닌 DNA를 세포로 도입시키는데 이용하였다. 일부 실시예에서, 재조합 레트로바이러스 벡터는 목적하는 서열을 지닌 DNA를 세포로 도입시키는데 이용하였다. 일부 실시예에서, 표준 인산화 칼슘, DEAE 덱스트란 또는 지방 운반체가 매개하는 형질전환 기술을 목적하는 DNA를 분열하는 세포에 결합시키는데 이용하였다. 표준 항생제 저항성 선택 기술은 형질전환된 세포를 확인하고 선택하는데 이용할 수 있다. 일부 실시예에서, DNA는 미세주입법에 의해 세포로 직접 도입하였다. 마찬가지로, 잘 알려진 전기천공 또는 입자 폭격(bambardment) 기술은 외부 DNA를 세포로 도입시키는데 이용할 수 있다. 2차 유전자는 일반적으로 레날라제를 암호화하는 핵산과 같이 또는 그 핵산에 공유 결합시켜서, 또는 유전자 제거 목표 벡터 또는 거기에 안티센스 분자와 같이 형질전환시켰다. 2차 유전자는 주로 선택적 항생제 저항성 유전자였다. 형질전환된 재조합 세포는 선택적 유전자를 받아들이지 않으면 세포를 죽이는 항생제 속에서 세포를 배양함으로써 선택할 수 있다. 두 유전자가 결합되지 않고 동시에 형질전환시켰던 대부분의 경우에서, 항생제 처리시에 살아 있는 세포는 두 가지 유전자를 모두 지녔고 발현시켰다.

레날라제의 양을 측정하는 방법들(예를 들어, 웨스턴 블랏에서 항-레날라제 항체를 이용하거나 ELISA같은 면역에 기초한 다른 분석) 및 세포나 조직에서 레날라제 발현량을 측정하는 방법들(노던 블랏 분석, RT-PCR 분석, 제자리 혼성화 등을 이용하는) 은 여기에 언급하였고 당업계의 숙련된 자들에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법들은 레날라제의 양을 목적하는 수준으로 감소시키거나 증가시키기 위해 동물에 투여할 레날라제의 "효율적 양"( 분리한 핵산, 항체, 안티센스 핵산, 리보자임, 재조합 세포 등등을 이용)을 결정하는데 이용할 수 있다.

B. 유용한 화합물을 확인하는 방법

본 발명은 또한 세포 내에서 레날라제의 발현 또는 활성에 영향을 주는 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 이 방법은 세포를 시료 화합물에 접촉시켜서 접촉한 세포와 화합물에 접촉하지 않은 다른 동일한 세포에서의 레날라제 발현양 및 활성을 비교하는 단계를 포함한다. 만약, 레날라제의 발현양 및 활성이 시료 화합물과 접촉하지 않은 다른 동일한 세포에서의 레날라제 발현양 및 활성과 비교했을 때 시료 화합물에 접촉시킨 세포에서 높거나 낮으면, 이는 시료 화합물이 세포 내에서 레날라제 발현 및/또는 활성에 영향을 준다는 것으로 확인한다.

마찬가지로, 본 발명은 세포 내에서 레날라제 발현 또는 활성을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 이 방법은 시료 화합물과 세포를 접촉시켜서 화합물과 접촉한 세포와 화합물에 접촉시키지 않은 다른 동일한 세포에서의 레날라제 발현양 및 활성과 비교하는 단계를 포함한다. 만약, 세포 내에서 레날라제의 발현양 및 활성이 화합물과 접촉하지 않은 세포에서의 양과 비교했을 때 화합물과 접촉한 세포 내에서 낮다면, 이는 시료 화합물이 세포 내에서 레날라제 발현 및/또는 활성을 감소시키는데 영향을 준다는 것으로 확인한다.

당업계의 숙련된 자는, 본 명세서의 개시에 근거하여, 세포 내에서 레날라제의 발현양 및 활성은 레날라제를 암호화하는 mRNA의 발현양 및/또는 활성을 결정함으로써 측정할 수 있다. 선택적으로, 레날라제를 암호화하는 mRNA의 발현양 및/또는 활성은 본 발명의 항-레날라제 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 통해 본 명세서에서 예증한 대로 이러한 mRNA로부터 레날라제 생산을 측정하는 면역학적인 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 노던 블랏 및 PCR 분석 등의 핵산에 기초한 검출방법 또한 이용할 수 있다. 부가적으로, 세포 내에서 레날라제 활성의 수준은 또한 예를 들어, 신장, 심장, 골격근 및 소장 등에서의 레날라제 발현양과 같이 레날라제의 활성에 의해 영향을 받을 수 있는 다양한 변수의 양을 결정함으로써 측정할 수 있다. 선택적으로, 레날라제 활성의 수준은 아민 산화효소 실험에서 측정할 수 있다. 따라서, 당업계에서 숙련된 자는 본 명세서에서 제공한 광범위한 개시 및 실시예에 근거하여, 본 명세서에 개시한 방법, 당업계에 잘 알려진 방법들 및 미래에 개발될 다른 방법들을 포함하는 세포 내에서 레날라제의 발현양 및/또는 활성을 측정하는데 이용할 수 있는 다양한 방법이 있음을 인식할 수 있을 것이다.

또한, 당업계의 숙련된 자는, 본 명세서의 개시에 근거하여, 아래의 실시예에서 언급한 바와 같이, 내생적인(endogenous) 레날라제의 발현 및/또는 활성이 결핍된 세포를 세포 내에서 레날라제의 발현 및/또는 활성이 영향을 받는 레날라제를 암호화하는 분리한 핵산을 포함하는 벡터와 같이 형질 전환시킬 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 형질전환된 세포는 이후 시료 화합물과 접촉시켜서 화합물이 레날라제 발현 및/또는 활성에 영향을 주는지를 결정한다. 그 결과, 본 발명을 지득한 당업계의 숙련된 자라면, 레날라제 발현벡터를 이용하여 레날라제의 감지할 수준의 양이 결핍된 세포를 선택적으로 형질전환시킴으로써, 선택적으로 레날라제 발현 및/또는 활성에 영향을 주는 화합물을 동정할 수 있을 것이다.

또한, 숙련된 자는, 본 명세서의 개시에 근거하여, 세포에서 검출가능한 레날라제가 생산되도록, 레날라제 발현 및/또는 활성을 내생적으로 검출할 정도의 양이 부족한 세포에 레날라제를 암호화하는 분리된 핵산을 투여할 때, 분리된 핵산은, 예를 들어 태그 폴리펩티드에 공유결합한 추가적인 핵산을 포함할 수 있다. 이는 태그 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 감지함으로써 레날라제의 발현 및/또는 활성을 감지할 수 있게 해 주었다. 따라서,본 발명은 레날라제와 같이 발현되는 다른 분자의 발현 및/또는 활성을 감지함으로써, 레날라제의 발현 및/또는 활성을 감지하는 방법을 포함한다.

본 발명은 레날라제에 특이적으로 결합하는 단백질을 동정하는 방법을 포함한다. 레날라제는 최소한 하나의 다른 단백질과 결합함으로써, 레날라제의 생물학적 기능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 본 발명은 레날라제에 특이적으로 결합하고/결합하거나, 연관되는 단백질을 동정하기 위한 당업계에 잘 알려져 있고 또 개발될 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 목적 단백질, 예를 들어 레날라제를 적절한 지지대에 고정시키고, 레날라제가 레날라제-연관된 단백질과 결합하도록 하는 조건하에서 반응시키는 단백질 결합 측정방법을 포함한다. 레날라제는, 이에 제한되는 것은 아니나, GST(glutathione-S-transferase) 태그, MBP(maltose binding protein) 태그 또는 His₆-태그와의 융합단백질을 생산하고, 각각을 글루타치온-세파로스 비드(glutathione-Sepharose bead), 말토스(maltose) 컬럼 또는 니켈 킬레이트 수지(nickel chelation resin, 예를 들어, His-Bind resin, Novagen, Madison, WI)와 같은 지지체에 결합시키는 표준방법을 이용하여 지지체에 고정될 수 있다. 고상 지지체를 세척하여 거기에 비특이적으로 결합하는 단백질을 제거한 다음, 모든 레날라제-연관된 단백질을 주형으로부터 분리하여 레날라제-연관된 단백질을 동정한다.

부가적으로, 레날라제에 특이적으로 결합하는 단백질, 예를 들어 수용체, 리간드 및/또는 다른 레날라제-연관된 단백질은 예를 들어 이스트 투 하이브리드(yeast two hybrid) 측정법을 이용하여 동정할 수 있다. 이스트 투 하이브리드 측정법은 당업계에 잘 알려져 있고, 상업적으로 입수가능한 키트(예를 들어, MATCHMAKER^TM Systems, Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA 및 다른 키트)를 이용해 실행할 수 있다. 그리하여, 일단 본 명세서에서 제공되는 교시, 예를 들어 “미끼(bait)” 단백질인 레날라제의 전장 아미노산 및 핵산서열을 이용하면, 이에 제한되는 것은 아니나, 레날라제 수용체 단백질, 레날라제 리간드 등과 같은 레날라제에 특이적으로 결합하는 단백질을 용이하게 동정할 수 있다.

당업계의 숙련된 자라면, 본 명세서의 개시에 근거하여, 본 발명이 본 명세의 다른 부분에서 기술한 방법을 이용하여 동정한 다른 분자를 포함한다는 사실을 이해할 수 있을 것이다. 즉, 레날라제에 결합하는 분자, 예를 들어 레날라제 수용체 단백질, 레날라제 리간드 단백질, 또는 그 둘다는 ESRD, 고혈압, 심근질환 등과 같은 레날라제-연관된 단백질과의 레날라제 상호작용에 의해 매개되는 질병, 장애 또는 상태의 치료제 및 진단제를 개발하는데 이용할 수 있다. 당업계에서 숙련된 자는 레날라제에 특이적으로 결합하는 항체를 고려할 때, 본 명세서의 다른 부분에서 충분히 설명하였듯이, 레날라제-연관된 단백질은 레날라제 활성에 필요한 레날라제 수용체/리간드의 상호작용 및 다른 레날라제 결합반응을 저해하는 치료제를 개발하는데 이용할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다.

상술한 방법에 의해 동정된 레날라제-연관된 단백질은, 세포를 레날라제-연관된 단백질 또는 그것의 일부에 세포를 접촉시켜서 직접적으로 레날라제 상호작용을 억제할 수 있거나, 레날라제와 레날라제-연관된 단백질의 상호작용을 저해하여 레날라제의 기능 및 활성을 저해하는 항체 및 펩티드-유사물질(peptidomimetic) 개발에 이용할 수 있다. 따라서, 레날라제 수용체-리간드 단백질을 포함하여 레날라제-연관된 단백질은 유용하며, 본 발명은 이를 포함한다.

C. 진단 및 치료 평가방법

본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니나, ESRD, 만성 신장질환, 고혈압, 무증상 좌심실 기능이상, 만성 심장질환 및 죽상동맥경화와 같은 심근질환 등의 질병, 장애 또는 상태의 진단방법을 포함한다. 또한, 레날라제는 급성 신장질환 등(예를 들어, ATN, acute tubular necrosis)의 진단 마커로서 이용할 수 있다.

본 발명의 방법은 포유동물로부터의 생물학적 시료를 수득하는 단계 및 시료의 레날라제의 수준(발현, 양, 활성)과 신장질환으로 고통받지 않은 사람에게서 얻은 시료의 레날라제 양을 비교하는 단계를 포함한다. ESRD, ANT 또는 고혈압으로 고통받지 않은 사람에게서 수득한 시료에서의 레날라제 양과 비교한 환자로부터 시료에 있어서 레날라제의 낮은 양은 환자가 ESRD, ANT, 또는 고혈압으로 고통받고 있다는 징후이다.

본 발명은 포유동물에서 ESRD의 치료 효율성을 평가하는 방법을 포함한다. 이 방법은 ESRD가 감소한 레날라제 발현과 연관되어 있기 때문에, ESRD에 대한 특별한 치료기간 전, 중, 후에 레날라제 발현, 양 및/또는 활성의 수준을 평가하는 단계를 포함한다. 이는 본 명세서의 다른 부분에서 이미 언급하였고, 본 명세서에 개시한 데이타에 의해 입증하였듯이, 레날라제 발현, 양 및/또는 활성은 특정 질병의 상태(예를 들어, ESRD, 고혈압)의 특징이 되는 증가한 카테콜아민 순환에 연관되어 있기 때문이다. 따라서, 레날라제 발현/양/활성에 대한 치료경과의 효과를 측정하는 것은, 레날라제 발현, 양 또는 활성의 증가된 수준이 곧 그 치료방법이 성공적이라는 것을 암시하는 정도로, 치료의 효율성을 나타낸다.

추가적 설명없이도, 당업계의 숙련된 자라면 상술한 내용 및 후술하는 실시예를 참조하여, 본 발명의 화합물을 제조하고 이용하며 특허청구범위에 기술한 방법을 실시할 수 있을 것이다. 따라서, 이하의 실시예는 특히 본 발명의 바람직한 실시예를 적시한 것이고, 달리 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다.

실시예

개요

본 실시예에 나타난 실험은 아래와 같이 요약할 수 있다. 우선, 레날라제를 확인하였다. 이러한 신규한 신장-분비성 단백질을 분리하기 위하여, 현존하는 공용 데이터베이스, 특히 포유동물 유전자은행(Mammalian Gene Collection, MGC) 프로젝트를 이용하였다. 신규한 분비성 단백질을 암호화하는 114개의 후보 유전자 전부를 아래의 기준에 근거하여 확인하였다: (i) 후보 유전자는 데이터 베이스에 존재하는 단백질에 대하여 20% 미만의 유사성/동일성을 지닌 신규한 단백질을 암호화한다; (ii) 추정 단백질이 신호 펩타이드 서열을 지닌다고 예상된다(신호 펩타이드 서열을 예상하는 2 가지 다른 방법을 이용함); (iii) 추정 단백질이 막통과 도메인을 지니지 않는다(type I 막 단백질 등 일부 막 단백질이 또한 신호 펩타이드 서열을 지니기 때문이다).

이러한 전략은 여러 가지 뚜렷한 이익을 제공하였다: 분석은 신규한 유전자에만 제한하였다; 이는 성가신 클로닝 과정의 생략, 목적하는 유전자를 찾기 위한 수개월 또는 수년 시간의 절약을 가져왔다; 이는 조직에서의 유전자 발현 및 생화학적 및 기능적 연구를 즉각적으로 검증할 수 있게 하였다. 실제로, 이러한 알고리즘을 이용하여 하나의 클론(MGC12474)은 신장에서 다량 발현됨을 발현하였다(아래 참조). 따라서, 이 클론을 이하의 연구를 위해 선택하였다.

MGC12474는 모노아민 산화효소(MAO) 활성을 지닌 단백질을 암호화함을 발견하였다. MAO는 FAD(flavin-adenosine-dinucleotide)-보유 효소이며, 이는 생리적 모노아민을 그의 대응하는 알데히드로 변환시켰다. 이 효소반응(Massey et al., 2000)은 기질의 α-CH 결합을 산화적으로 절단시켜서 모노아민의 산화를 촉매시켜서 플라빈(flavin) 조효소의 환원상태인 이민(imine) 산물을 형성하게 하였다. 이 이민 산물은 이후 가수분해되어 상응하는 알데히드 및 암모니아가 되었다. 환원된 플라빈 코엔자임은 산소와 반응하여 과산화수소를 형성하여, 플라빈의 산화 형태는 촉매 순환을 완성시켰다. 토끼의 항-레날라제 다클론성 항체는 또한 인간과 마우스 간에 동일한 아미노산 226-238로부터 유래한 합성 펩타이드를 이용하여 만들었다. 웨스턴 블랏 연구는 이러한 항체가 항-HA 항체처럼 동일한 37Kd 레날라제-HA 융합 단백질을 인식함을 보여 주었다.

또한, 레날라제는 사람에게서 혈액으로 분비됨(아래를 상세히 참조할 것)과 레날라제의 본질이 분비성 단백질임을 입증하였다.

단백질 산물의 감지를 촉진시키기 위해, 레날라제의 C-말단에 HA 표지자를 연결시켰다. 항-HA 및 항-레날라제 항체를 이용한 웨스턴 블랏은 신장-유래한 HEK 293 세포의 배양 배지에 37kD 단백질을 확인하였고, 이는 레날라제가 기능성의 N-말단 신호 서열을 지니고 있으며 이러한 연구를 이용한 세포 배양 모델에서 분비됨을 암시하였다.

아울러, 사람의 혈액은 레날라제 특이적인 다클론성 항체를 이용한 웨스턴 블랏에 의해 측정하였다. 도 3b는 레날라제는 혈액에서 쉽게 감지할 수 있음을 보여 주었다. 신장이 순환하는 레날라제의 주요 원인인지를 확인하기 위해, 우리는 혈액량이 심각한 신장질환을 지닌 환자에서 감소하는 것과 신장의 기능이 감소하는지를 시험하였다. 도 3b에서 볼 수 있듯이, 레날라제는 실제로 혈액투석을 실시한 ESRD환자의 혈액에서 찾을 수 없었다.

실험은 아래에 좀 더 자세히 설명하였다.

실시예 1: 레날라제 암호화 유전자의 식별과 분석

재료 및 방법

MGC 데이터베이스에 관한 생명정보학적 분석

본 실험일을 기준으로 포유동물 유전자은행(MGC) 프로젝트를 통해 확보된 총 12,563종의 인간 전장(ORF) cDNA가 3회에 걸친 서열 탐색에 도입되었다. MGC에 대한 최초의 분석은 2001년 12월 24일 시행하였다. 첫째, GenBank에 등록정보가 없는 유전자를 정밀 분석 대상으로 선정되었다. 둘째, 1회차에서 선별된 유전자에 의해 암호화되는 예상 아미노산 서열을 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 분석한 다음, 그 중에서 공지의 단백질들과 20% 미만의 동일성을 갖는 단백질들을 선별하였다. 셋째, SignalP V2.0(www.cbs.dtu.dk/services.SignalP-2.0)과 SOSUI signal Beta_Version(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp)을 사용하여 추정 신호서열(putative signal sequence)이 존재하는지 평가하였다. 그리하여, 상기 두 방법에 의해 예상된 신호 펩티드 서열을 갖는 신규 단백질에 대하여 Pfam을 통한 도메인 탐색을 실시하였다. 목적하는 클론이 암호화된 cDNA 클론은 ATCC로부터 입수하여, 양사슬의 서열을 결정한 후(예일대학 케크재단 생명공학자원연구소), BLAST로 분석하였다.

MGC

MGC 프로젝트는 인간 유전자에 대한 기능적인 연구를 촉진시키기 위해 전장 cDNA 자원을 형성하고자 하는 NIH의 새로운 노력이다. 이 프로젝트를 통하여 전 세계 연구자들은 공공이용이 가능한 자원을 공적으로 제공받게 된 것이다. MGC 프로젝트는 인간 및 기타 포유류의 전장(ORF; 개방해독틀) 서열 풀세트와 발현 유전자 클론의 획득을 목적으로 하여, 라이브러리의 구축, 서열결정 및 분석기술에 대한 지원뿐만 아니라, 라이브러리, 서열결정, 및 데이터베이스의 구축 및 개발을 수반한다(참조: Rozanski 등, 1999; Tendera 등, 2001). 가장 주목할 점은 MGC를 계기로 하여, 선별된 클론이 잠재적으로 완전한 서열을 암호화하고 있음을 보증하는 견고한 정보적 수단이 마련되었다는 사실이다. MGC는 본 실험일 기준으로 12,563종의 인간 전장 cDNA를 밝혀냈으며, 그 중 약 20%는 신규 유전자에 해당한다(신규 유전자는 주지 단백질과의 유사성/동일성이 20% 미만인 것을 의미함).

DNA 서열

레날라제를 암호화하는 MGC12474 cDNA 클론을 ATCC로부터 입수하여, 양사슬의 서열을 결정한 후(예일대학 케크재단 생명공학자원실험실), 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 웹사이트(www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)의 BLAST를 사용하여 공지의 서열과의 DNA 서열 동일성/유사성에 대해 분석하였다.

노던 블랏 분석

인간 복합조직(multiple tissue) 노던블랏을 CLONTECH사로 부터 입수하여, [α-³²P] dCTP로 표지된 레날라제 cDNA와 혼성화하였다. 혼성화는 1-2시간 또는 하룻밤 동안 62-68℃의 조건하에, 표지된 탐침을 포함하는 Rapid-hyb 완충용액(Amersham Pharmacia Biotech사 제품)을 사용하여 실시하였다. 블랏은 엄격한 조건에 따라 세척한 후, Kodak XAR 필름에 노출시켰다. 상응하는 RNA 로딩용 내부조절 탐침으로는, 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소의 cDNA를 사용하였다.

통계 분석

두 실험군 간의 비교에는 표준 쌍체(standard paired) Student's t-test를, 동등 기간에 대한 군간 비교에는 표준 비쌍체(standard unpaired) Student's t-test를 사용하였다. 전체 데이터 범위는 평균±SE(표준오차)이며 통계학적 유의차로서 P<0.05를 적용하였다.

결과

중요한 생물학적 기능을 갖는 신규 단백질을 분리하기 위하여, 신장에서 분비되는 것으로 보이는 신규 단백질을 추출하도록 설계된 알고리즘을 사용하여, 기존의 공용 데이터베이스, 특히 포유류 유전자 수집 프로젝트(MGC)를 탐색하였다(Strausberg, 등, 1999). MGC 프로젝트는 유전자 생성물에 대한 기능적인 연구를 촉진시키기 위해 인간과 마우스의 전장 cDNA 자원을 형성하고자 하는 NIH의 새로운 노력이다(참조: Strausberg 등, 1999; http://mgc,nci,nih,gov). 분비 단백질을 암호화하는 후보 유전자를 선별하기 위해, MGC에서 발표한 모든 클론들을 대상으로 하였다. MGC는 본 실험일 기준으로 12,563종의 인간 전장 cDNA를 밝혀냈고, 그 중 20% 정도는 신규 유전자에 해당한다(신규 유전자는 주지 단백질과의 유사성/동일성이 20% 미만인 것을 의미함). 2003년 8월 1일에 MGC 데이터 분석을 완료할 때까지 신규 분비 단백질을 암호화하는 총 114종의 후보 유전자를 식별함에 있어서는, (i) 후보 유전자가 데이터베이스 상의 기존 단백질과 20% 미만의 유사성/동일성을 갖는 신규 단백질을 암호화하는지, (ii) (2가지 방법을 사용하여 신호 펩티드 서열을 예상한 결과) 추정 단백질이 신호 펩티드 서열을 내포하는 것으로 보이는지, (iii) 추정 단백질이 막 통과 도메인(transmembrane domain)을 포함하지는 않는지(이는 type I 막 단백질 등의 일부 막 단백질들 역시 신호 펩티드 서열을 포함하기 때문에 고려대상으로 함)를 기준으로 하였다. 각 후보 유전자의 조직발현 상태를 노던블랏 분석으로 평가한 결과, 인간 신장의 클론들(MGC12474, GenBank 등록번호 BC005364) 중 하나에 관한 확실하고 우위적인 발현인 것으로 밝혀졌다(참조: 도 1a). MGC12474는 1,474개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 그 중에서 가장 긴 개방해독틀(뉴클레오티드 22-1047)은 측정 분자량 37.8kDa로서 342개 아미노산으로 이루어진 신규 단백질을 암호화한다(참조: 도 2a). 레날라제의 인간 유전자는 10번 염색체 q23.33에 위치하며 311,000개 정도의 염기쌍과 잔기로 이루어진 7개의 엑손을 포함한다(참조: 도 2b). MotifScan을 이용한 분석은 N 말단의 신호 펩티드, FAD 결합 부위(아미노산 4 내지 35번), 및 아미노산 11 내지 339번 위치의 아미노 산화효소 도메인을 나타내었다(참조: 도 1b). 레날라제는 모노아민 산화효소(MAO-A)(참조: 도 1c)와 13.2%의 아미노산 동일성을, MAO-B(참조: 도 2c)와 약간의 유사성을 나타낸다.

실시예 2: 신장에 의한 레날라제 분비

유전자 발현 카세트의 제조( TAP 단편)

2회의 서열결정 RCR 반응을 실시한 후, 5‘-CMV 프로모터와 3'-SV40pA를 각각 후보 클론의 5' 및 3’ 말단에 결합시키는 PCR에 기초하한 방법으로 접근하였다. 구체적인 방법론은 Liang 등의 저서에 설명되어 있다. 간단히 설명하면, 이 방법은 2개의 서열결정 PCR 단계를 포함한다. 제 1단계는 일반적인 TAP 말단과 목표 유전자에 특이적인 서열로 이루어진 프라이머(각 0.4 μg)들을 사용하여 진행된다. 5' 유니버설 말단서열은 CMV 즉시초기 유전자 프로모터를 포함하는 DNA 단편에 상보적이며, 제 2단계에서 CMV 프로모터를 증식된 유전자에 결합시키는데 사용된다. 3‘ 유니버설 말단은 SV40 조기 유전자의 전사종결 부위를 포함하는 DNA 단편과 일부 일치하는 부분이 있으며, 또한 2단계에서 전사종결 부위 서열을 증폭된 유전자에 결합시키는 데 사용된다. 레날라제를 포함하는 TAP 단편을 생성하기 위하여, 제 1단계 PCR에 사용된 5' 및 3’ 프라이머는 5‘-(oligo)TGCAGGCACCGTCGTCGACTTA

ACAatgcgaccccagggccccgccg(서열번호 6, 대문자 부분은 2단계 PCR에서 앵커로 사용되는 5‘-TAP 유니버설 서열이고, 소문자 부분은 ATG 개시 부위부터 클론 #2에 특이적인 서열임)과 3’-(oligo)CATCAATGTATCTTATCATG

TCTGATCAACCAGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTttttggtagttcttcaataag(SEQ ID 7번, 앞부분의 염기 25개는 2단계 PCR에서 앵커로 사용되는 3’-TAP 유니버설 서열이고, 밑줄 친 서열은 정지 코돈 TGA를 뒤따르게 하는 HA를 암호화하며, 그 뒤의 서열은 3‘-말단에서 정지 코돈을 뺀 위치부터 클론 레날라제에 특이적인 서열임)이다. 2단계 PCR에 사용되는 5’ 및 3‘-프라이머는 제조업체(Gene Therapy Systems사, 캘리포니아 샌디에고)로부터 제공받은 것이다.

유전자 전달 및 발현

생체 외(In vitro) 형질도입(transfection)은 GenePORTER(Gene Therapy Systems사, 캘리포니아 산디에고)를 사용하여 제조사가 권고하는 절차에 따라 수행하였다. 대조군으로 녹색형광단백질(green fluorescence protein) TAP 단편을 사용하여 평가함으로써, 40~60%의 일관된 형질도입 효율을 얻을 수 있었다.

생체 외( In vitro ) 번역

레날라제 cDNA는 삽입물의 5'-말단 앞에 T7을 포함하는 pDNR-LIB에 클로닝되었다. 레날라제 mRNA는 전사된 다음, single tube protein^? system 3(Novagen사, 캘리포니아)을 사용하여 번역되었다. 양성 대조군으로는 루시페라아제 T7 cDNA를 사용하였다. 생체 외(In vitro) 전사-번역은 [³⁵S]메티오닌 50 μCi(Amersham Pharmacia Biotech사, 뉴저지)를 추가한 반응 혼합물 50 μl 내에서 플라스미드 DNA 1 μg를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 10 μl의 생성물은 10%-SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 분리한 후, 방사능사진촬영과 웨스턴 블랏을 실시하였다.

유전자 전달 및 발현

생체 외(In vitro) 형질도입은 GenePORTER(Gene Therapy Systems사)를 사용하여 제조사에서 권고하는 절차에 따라 수행하였다. 대조군으로서 녹색형광단백질 TAP 단편을 사용하여 40~60%의 일관된 형질도입 효율을 얻었다. 레날라제가 분비 단백질인지 여부를 확인함에 있어서는, 생체 내(in vivo) 발현 실험에 직접적으로 사용되었던 활성화 PCR (TAP) 단편을 전사를 통해 생성하는 PCR에 기초하여 접근하였다(참조: Liang 등, 2002).

레날라제 항체 형성

토끼 항레날레제 다클론성 항체는 Proteintech Group사(시카고)가 재조합 GST-레날라제 융합 단백질을 항원으로 사용하여 생성하였다. 10주 후, 토끼에게 GST-레날라제 융합 단백질을 주입하였다. 항원 2차 주입 이후 6~8주 정도가 지나자, 토끼는 출혈 증상을 보였고 친화성을 이용하여 혈액 내의 항레날라제 항체를 정제하였다.

웨스턴 블랏 분석

HEK 239 세포는 10% 우태혈청(fetal bovine serum), L-글루타민 2 mM 및 항생물질을 추가한 둘베코 변형배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 성장시켰다. 세포들을 배양밀도 60~80%로 6-웰 플레이트에서 키운 후, Geneporter를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 레날라제-HA 융합 단백질을 포함하는 TAP 단편에 감염시켰다. 이와 같은 형질도입 후 48~72시간 이내에, 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 세포 용해물 내의 단백질을 분리하여 니트로셀룰로오스 막으로 전이시킨 후. 항HA 단일 클론 항체(Roche Chemical사)를 이용하여 면역블랏을 실시하였다.

면역복합체는 호스라디쉬 페록시다아제(Pierce사)와 결합한 2차 항체를 이용하여 검출하고, SuperSignal West Pico 루미놀(Luminol)/인핸서 용액(Pierce사)으로 가시화하였다. 후보 유전자에 의해 암호화된 단백질의 분비를 확인하기 위해서는, 세포 용해물과 더불어 배지의 웨스턴 블랏 분석이 필요하였다. 인간 혈장 레날라제를 분석하기 위하여는, 레날라제에 특이적인 항체를 사용하여 10 μl의 혈장을 웨스턴 블랏방법으로 분석하였다.

제자리 혼성화 분석( In situ Hybridization )

상기한 바와 같이 제자리 혼성화 분석을 수행하였다. 간단히 설명하면, MGC 클론 #12474의 426개 염기쌍으로 이루어진 DNA 단편을 제한효소 HindIII와 PstI로 분해시켜 분리하였다. 이어서, pBluescript^? II KS(+) 벡터로 서브클로닝한 후, DIG-표지 킷(Roche Biochemicals사)을 이용하여 DIG-표지 RNA 탐침으로 생체 외(In vitro) 전사시켰다. 레날라제의 검출에는 안티센스 가닥을, 대조군으로는 센스 가닥을 사용하였다. 이러한 탐침들은 파라핀으로 처리한 심장 및 신장 조직으로부터 떼어낸 조각과 혼성하는 데 사용하였다. 성인의 심장/신장 조직은 가족의 동의 및 대학병원 연구윤리위원회의 승인하에 부검물로부터 수득하였다. 조직은 4% 파라포름알데히드 인산염 완충용액을 사용하여 하룻밤 동안 고정시켰다. 사후(postmortem)의 경과시간은 7시간 이내였다. 이어서, 조직을 에탄올로 탈수시키고 크실렌으로 세척하여 파라필름에 넣은 후, 5 μm 두께의 절편으로 절단하였다.

이러한 절편은 탈랍(dewaxing) 및 수화(hydration)를 거쳐 10분 동안 37℃에서 단백질 가수분해효소 K(20 μg/ml)로 분해시켰다. 그런 다음, 10분 동안 4% 파라포름알데히드 PBS 용액으로 최종 고정시켰다. 혼성화는 4× SSC, 10% 텍스트란 설페이트, 1× Denhardt 용액, 5 mM EDTA, 01% CHAPS, 50% 탈이온 포름아미드, 200 μg/ml 연어 정액 DNA 및 200 ng/ml DIG-표지 탐침을 포함하는 혼성화 완충용액을 이용하여 50℃에서 수행하였다. 슬라이드는 각각 2× SSC에서 15분간 4회 세척한 후, 역시 각각 50℃의 0.2X SSC/0.1% SDS에서 15분간 2회 세척하였다. 이어서, 알칼리 인산가수분해효소에 접합시킨 항DIG 항체를 이용하여 색상을 검출한 후, 디곡시게닌(digoxigenin)-핵산 검출 킷(Roche사, 독일)을 이용하여 NBT/BCIP 착색 기질과 함께 반응시켰다. 인간 레날라제의 경우, NBT/BCIP 착색 기질 용액에서 색이 나타나는 데에는 5분 이내의 시간이 소요되었다.

결과

레날라제 mRNA의 조직별 분포를 판단하기 위해 인간 조직판(panel 0f human tissue)에 대하여 노던 블랏을 실시하였다. 도 1a의 결과에서 보듯이, 레날라제 mRNA는 신장에서는 고도로 발현되는 반면, 기타 여러 조직에서는 낮은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다. 다양한 인간 조직 내의 레날라제 mRNA의 공간 분포를 판단함에 있어서는, 제자리 혼성화 분석을 수행하였다(참조: 도 3). 특이적인 신호는 신장 사구체, 근위 세관(참조: 도 3a, 좌측패널) 및 심근세포(참조: 도 3a, 좌측패널)에서 검출되었다. 이와 같은 분포는 면역세포화학 실험에서 신장 사구체, 근위 세관(참조: 도 3c, 좌측패널) 및 심근세포(참조: 도 3d, 좌측패널)의 레날레제 단백질 검출을 통해 증명됨에 따라 확인되었다. 상기 결과는 레날레제 mRNA가 신장, 골격근, 심장 및 간에서 발견되는 세포에 특이적인 기능을 가진다는 사실을 의미함으로써, 고도한 레날라제 mRNA 발현 수준이 조직 특이적임을 나타내는 것이다.

후보 유전자가 분비 단백질을 암호화는지 여부를 시험함에 있어서는, 생체 내(in vivo) 발현실험(6)에서 직접적으로 사용된 활성 PCR(TAP) 단편을 전사를 통해 형성하는 PCR에 기초하여 접근하였다. 또한, 단백질 생성물 검출을 촉진하기 위하여, 레날라제의 C-말단을 HA 표지로 처리하기도 하였다(신호 펩티드를 보전하기 위해 N-말단은 처리하지 않음). ,Fig 4a에서 보듯이, 레날라제-HA에 5'-CVM 프로모터와 3'-SV40pA를 융합시킨 후 TAP 단편을 HEK293 세포로 감염시켰다. 항HA 항체를 이용한 웨스턴 블랏에서는 예상량이었던 37 Kd의 단백질 생성물이 배지에 발현된 것으로 밝혀졌으며, 이는 N-말단에 신호 서열이 존재할 것이라는 추정과도 일관되는 결과였다.

막에 결합되어 있거나 세포내 구획에 한정되어 있는 MAO-A, MAO-B 및 PAO와는 달리, 레날라제는 혈액으로 분비되며 이는 웨스턴 블랏에 의해 검출이 가능하다. 인간 혈장 내에서 측정한 아민 산화효소의 활성은 혈관부착단백질 1(VAP-1), 평활근에 의해 분비되는 구리를 함유하는 세미카비자이드(semicarbizide) 민감성 아민 산화효소, 지방세포 및 내피세포에 의해 조절되는 것으로 보인다. VAP-1의 기질 특이성과 저해제는 레날라제의 그것과 매우 다르다. VAP-1은 벤질아민과 메틸아민을 대사시키고, 세미카비자이드와 히드록실아민에 의해 저해된다. 따라서, 레날라제는 현재 순환계로 분비되어 순환물질인 카테콜아민을 대사시키는 것으로 알려진 유일한 아민 산화효소라 할 수 있다.

레날라제는 신장, 심장, 골격근 및 소장에 제한하여 발현하는 것으로 보인다. 그 중에서도 가장 높은 발현 수준을 보이는 신장은 레날라제의 대량 순환을 담당하는 것으로 여겨지고 있다. 실제로, 투석을 받고 있는 말기신장병(ESRD) 환자의 경우에는 레날라제 농도가 급격하게 감소한다. 이러한 사실을 배경으로, 심한 신장 기능부전과 관련된 대사 이상에 의하여 심장 및 골격근의 레날라제 분비량이 감소할 가능성은 배제될 수 없는 것이다. 그럼에도 불구하고 신장은 레날라제 풀의 순환에 있어 중요한 기여요인이라 할 수 있다.

흥미로운 점은, 최근 여러 연구에서 ESRD 환자의 혈장 도파민 및 노르에피네프린 농도와 교감신경 긴장성이 꾸준히 증가한 것으로 나타났다는 사실이다(참조: Joles 등, 2004; Zoccali 등, 2002; Hausberg 등, 2002). 또한, 최근 한 연구에 따르면, 갑작스러운 정신적 스트레스는 심근 경직의 원인이 되는 교감신경 자극을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(참조: Wittstein 등, ‘갑작스러운 정신적 스트레스로 인한 심근 경직의 신경액성적 특성’, New England Journal of Medicine, 2005, p.352, 539~548). ,교감신경 긴장성의 증가는 고혈압, 좌심실 비대 및 기능장애 등 심장 혈관 합병증의 발병에 기여할 수 있다. 이러한 문제들은 ESRD 환자들의 높은 사망률에 기여 요인이 되는 것으로 보인다. 그러므로, 혈액 내 레날라제의 낮은 농도는 ESRD 환자의 경우와 같이 교감신경 긴장성 증가로 이어지며, 레날라제를 투여함으로써 시장 혈관 합병증의 발병률이 감소하고, 생존율이 개선될 가능성이 높다 할 수 있다.

실시예 3: 레날라제는 생체 외에서 카테콜아민을 분해하여 생체 내에서 강심제 기능 및 전반적인 혈압을 조절한다

생체 외 전사 / 번역

MGC12474 클론은 삽입체 끝의 앞에 T7을 가지는 pDNR-LIB에 연결하였다. 레날라제 mRNA를 전사시킨 후, single tube protein? system 3(Novagen, Cat# 70192)를 이용하여 번역하였다. 루시퍼라제 T7 cDNA를 양성 대조군으로 이용하였다. 생체 외 전사-번역은 50uCi [³⁵S]methionine(Amersham Pharmacia Biotech)을 보충한 반응 혼합물 50㎕속에서 1㎍의 플라스미드 DNA를 이용하여 실시하였다. 10㎕ 산물을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동에 의해 분리하고, 방사성 사진 촬영 및 웨스턴 블랏을 실시하였다.

GST - 레날라제 재조합 단백질의 생산

레날라제 암호화 영역(nt 24-1052)를 센스 프라이머 5'-TTTT GGA TCC ATG GCG CAG GTG CTG ATC GTG(서열번호 8) 및 안티센스: 3'-TTTT GAA TTC CTA AAT ATA ATT CTT TAA AGC(서열번호 9)를 이용하여 증폭하였다. PCR 단편은 BamHI 및 EcoRI으로 절단한 후, N-말단에 GST-표지(26kDa)를 틀에 맞추어서 pGEX-4T(Promega)에 연결시켰다. DNA 서열분석에 의해 제대로 클로닝되었는지 확인한 후, 재조합 GST-레날라제 플라스미드를 재조합 융합 생산을 위해 E.coli BL21로 형질전환시켰다. 그런 다음, 6 리터 대장균 배양을 배양의 마지막 3.5 시간에 IPTG(0.5mM)을 첨가하여 16시간 동안 220rpm, 37℃에서 실시하였다. 또한, 10uM FAD를 IPTG 유발시점에 첨가하였다. 레날라제의 존재는 전체 대장균 용해물 40㎍ 단백질을 이용한 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

레날라제 단백질은 GSTrap 컬럼을 이용한 1단계 방법으로 대장균 용혈물로부터 직접 정제할 수 있다. 결합 완충액은 PBS pH 7.0, 140 mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄ 및 1.8mM KH₂PO₄, pH 7.0을 포함하고, 용리 완충액(elution buffer)는 50mM Tris^TM-HCl 및 10mM 환원된 글루타치온, pH 8.0을 포함한다. 시료의 제조를 위해, 10g 대장균 시료를 원심분리하여 얼음 속의 결합 완충액에서 부유시켰다. 시료는 초음파 분해하여 GST-레날라제 융합 단백질을 추출하였다. 컬럼 정제의 순서는 아래와 같다.

1) 컬럼을 5배의 컬럼 부피의 결합 완충액으로 평형화시킨다.

2) 시료를 0.2㎖/min 의 유속으로 넣어 준다

3) 컬럼 부피 5-10 배의 결합 완충액으로 세척해서 흘러나온 것에 아무 것도 없을 때까지 세척한다

4) 컬럼 부피 5-10 배의 용출 완충액으로 용리시킨다.

GSTrap로의 GST 융합 단백질 또는 다른 글루타치온 결합 단백질의 결합에 영향을 주는 가장 중요한 요인 중 하나는 유속이다. 상대적으로 느린 GST와 글루타치온 사이의 결합 동력학 때문에, 최대한의 결합능력에 대하여 시료 주입하는 동안 유속을 낮게 유지하는 것이 중요하다. 용출에 이용하는 부피와 시간은 다른 일련 묶음의 단백질 사이에서 다양할 수 있다. 보다 고농도의 글루타치온을 이용한 추가적인 용출이 필요할 수 있다. 컬럼으로부터 투과액(flow-through), 세척 및 용출 물질은, 필요하다면 웨스턴 블랏과 조합한 SDS-PAGE를 이용하여 GST-융합 단백질에 대하여 모니터링해야 한다.

GST - 레날라제 변성

요소에 의한 GST-레날라제 변성은 연구와 논쟁의 대상이었다. 레날라제 변성의 연구는 아래와 같이 실시하였다.

1. 최종 단백질 농도 약 1㎎/㎖에서 50mM Tris-HCl(pH 8)을 지닌 시료 완충액 50㎕에서 비교하기 위해 두 가지 단백질 시료 각각을 준비하였다.

2. 최종 요소 농도가 6M이 되도록 시료(1단계로부터의) 50㎕를 18㎎ 고체 요소에 첨가하여 단백질을 변성시켰다.

3. 새로 만든 100 mM DTT(시약등급의 H₂O로 준비) 5㎕를 첨가시켜서 단백질을 환원시키고 교반하여 혼합하였다.

4. 상온에서 1시간 동안 용액을 배양하였다.

GST - 레날라제 재접힘( refolding )

변성된 레날라제의 효율적인 재접힘은, 레날라제를 중성 pH에서 8 M 요소로 변성시키고, 재빨리 다양한 완충액을 이용하여 희석시켜 수행하였다. 중성 pH 완충액을 이용한 빠른 용출은 단백질 회수율이 낮았다. 알카라인 완충액을 이용한 빠른 용출 역시 단백질 회수율이 낮은 결과를 낳았다. 그러나, 약산성 완충액을 이용한 희석은 부분적인 효소 활성을 지닌 정량적인 단백질 회수율을 나타내는데, 이는 회수한 단백질이 아직 부분적으로 재접힙 상태에 있음을 암시하였다. 따라서, 저온(4℃)에서 산성 완충액 속의 부분적으로 재접힘된 레날라제의 효율적인 재접힘 과정을 연구하였다. 레날라제의 효소적 활성은 pH 4에서 일정하였다. 12시간 미만 방치할 때 동일한 pH 적정은 효소 활성을 낮게 만들었다. 상온에서의 재접힘 시도는 4℃에서의 활성대비 절반 정도의 활성을 지닌 상태로 응집(aggregation)되었다. 저온의 산성 pH조건하에서 요소에 의해 변성된 레날라제의 빠른 희석은 생리학적 pH에의 적정에 의해 본래의 상태로 전환될 수 있는 특정한 구조를 만든다는 결론을 내리게 되었다. 이 과정은 아래와 같이 실시하였다.

1. 레날라제 단백질을 봉입체 형태로 정제하여 중성으로 완충시킨 8M 요소로 용해시켰다. 단백질에 요구되는 DTT를 완충액에 보충하였다.

2. 단백질 농도를 0.1㎎/㎖로 맞추었다.

3. 순서대로 투석 완충액에 대하여 각 단백질 1000㎕를 투석하였다.

4. 용액을 서서히 혼합하는 동안 각 투석 튜브에 단백질 용액 1000㎕를 천천히 가하였다.

5. 완충액 순서에 따라 12시간 동안 4℃에서 투석하였다.

6. 5분간 마이크로휴즈(microfuge)로 레날라제를 모았다.

7. 신중하게 액체를 피펫을 이용하여 깨끗한 튜브로 옮겼다. 이는 재접힘된, 용해성 단백질을 포함한다.

8. 성공적인 재접힘은 아래와 같이 측정하였다:

어떠한 활성 단백질이 존재하는지를 결정하기 위해 기능을 측정하는 것이 가장 좋다. 잘못 접힌(misfolded) 또는 응집된(aggregated) 단백질은 올바르게 접힌 단백질과 다른 활성을 지닐 것이다. 애초의 단백질 또는 활성의 30% 이상이 용액으로 부터 회수될 때 성공적인 재접힘이 이루어졌다고 볼 수 있다. 실험에 이용한 완충액은 아래와 같다:

Buffer 1: 50mM MES pH 5.5, 10mM NaCl, 0.4mM KCl, 2mM MgCl₂, 2mM CaCl₂, 0.75M 구아니딘 HCl, 0.5% Triton X-100, 1mM DTT, O.1mM FAD

Buffer 2: 50mM MES pH 5.5, 10mM NaCl, 0.4mM KCl, 2mM MgCl₂, 2mM CaCl₂, 0.5M 아르기닌, 0.05% 폴리에틸렌글리콜 3,550, 1mM GSH, 0.1mM GSSH

Buffer 3: 50mM MES pH 5.5, 10mM NaCl, 0.4mM KCl, 1mM EDTA, 0.4M 수크로스, 0.75M 구아니딘 HCl, 0.5% Triton X-100, 0.05% 폴리에틸렌글리콜 3,550, 1mM DTT

Buffer 4: 50mM MES pH 5.5, 200mM NaCl, 10mM KCl, 2mM MgCl₂, 2mM CaCl₂, 0.5M 아르기닌, 0.5% Triton X-100, 1mM GSH, 0.1mM GSSH

Buffer 5: 50mM MES pH 5.5, 200mM NaCl, 10mM KCl, 1mM EDTA, 0.4M 수크로스, 0.75M 구아니딘 HCl, 1mM DTT

Buffer 6: 50mM MES pH 5.5, 200mM NaCl, 10mM KCl, 1mM EDTA, 0.5M 아르기닌, 0.4M 수크로스, 0.5% Triton X-100, 0.05% 폴리에틸렌글리콜 3,550, 1mM GSH, 0.1mM GSSH

아민 산화효소의 활성측정

레나라제의 효소활성의 측정은 형광판 해독기를 이용하여 아민 산화효소 활성을 지속적으로 측정하는 단일 단계의 형광법을 제공하는 Amplex Red Monoamine Oxidase Assay Kit(Molecular Probes, Cat#A-12214)를 이용하여 실시하였다. 이 측정은 대단히 민감하고 과산화수소에 대한 안정된 탐침인 10-아세틸-3,7-디히드록시-페녹사진(10-acetyl-3,7-dihydroxy-phenoxazine, Amplex Red reagent)를 이용한 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)-결합반응에서 과산화수소를 탐지하는 원리를 이용한다. 실험은 제조자의 지시에 따라 최종 기질농도 2mM에서 실시하였다.

결과

구조 분석은 레날라제가 아미노 산화효소 도메인을 지님을 밝혀내고, 이는 아민 산화에서 주된 역할을 함을 암시하였다. 따라서, 레날라제가 일련의 아민을 기질로 사용하여 산화효소 활성을 지니는지를 시험하였다. 대장균 내의 레날라제 융합 단백질은 레날라제 cDNA를 GST 유전자 융합 시스템을 이용하여 GST를 포함하는 pGEX 발현벡터에 연결시켜서 만들었다. 도 4a에서 보듯이, 레날라제는 특이적으로 아래의 순서(도파민>에피네피린>노르에피네피린)과 같이 카테콜아민을 대사작용시켰다. 이러한 효소적 활성은 FAD를 포함하는 아민 산화효소, MAO-A 및 MAO-B의 저해제에 의해 영향을 받지 않았다(참조: 도 4b).

GST-레날라제 융합 단백질은 글루타치온 세파로스(Glutathione Sepharose) 컬럼을 이용하여 균질성을 갖도록 정제하였다(참조: 도 5a). 정제된 융합 단백질은 약 64kDa의 분자량을 지니고, 이는 GST 표지(26kD)에 예상되는 레날라제의 분자량(37.8kD)를 더한 값과 일치하였다. 레날라제는 신장에서 다량 발현되고 분비성 단백질이기 때문에, 레날라제가 순환계에 존재하고 ESRD를 지닌 개체이 매우 적은 양의 레날라제를 지님은 당연한 것이다. 혈장 시료를 웨스턴 블랏에 의해 레날라제-특이적인 항체로 분석하였을 때(참조: 도 5b), 혈액 투석시ESRD 지닌 환자에서 레날라제의 양이 매우 적었고, 정상인 개체는 순환시의 레날라제 농도가 약 7㎎/㎖라는 것을 확인하였다.

이후에 일련의 아민을 기질로 이용하여 레날라제가 산화효소 활성을 지니고 있는지 시험하였다. 도 6에서 보듯이, 도파민, 노르에피네피린 및 에피네피린(2mM)을 기질로 사용했을 때, GST-레날라제 융합 단백질은 매우 높은 산화효소 활성을 지니고 있다. 따라서, 레날라제는 도파민, 노르에피네피린 및 에피네피린을 대사시키는 신규한 단백질이라고 결론지을 수 있다.

실시예 4: 레날라제는 전반적인 혈압을 조절하였다.

혈액 동력학 측정

Sprague Dawley 랫트(150-250ngs)는 인액틴(inactin)(100㎎/㎏)으로 마취시켰다. 카테터(catheter, PE-240))를, 공기의 흐름을 보호하기 위하여 호흡관에, 6.25% 소 알부민을 함유하는 정상 식염수를 포함하는 유지용액(maintenance fluid solution)을 시간당 100g 체중에 1.5㎖ 속도로 정맥 주입하기 위해 좌측 경정맥(PE-50)에 각각 시술하였다. 중심 온도를 직장 체온계를 통해 검사하고, 체온은 열판을 이용해 37℃로 유지시켰다. 동맥압 및 심장속도는 좌경동맥에 삽입하여 압력전환기(AD Instruments, CO, USA)에 연결시킨 PE-50 카테터를 이용하여 계속해서 측정하였다. 혈액동력 기록은 PowerLab/8SP 데이타 인식 시스템(AD Instruments)를 이용하여 디지털화시켜서, 저장 및 분석하였다. 랫트는 외과수술후에 1시간 정도 회복시키고, 이후의 30분은 대조군 기간으로 이용하였다. 실험군은 이후 0.5㎖ PBS 속의 재조합 레날라제 0.5㎎을 일시에 정맥 내에 주입하였다. 대조군은 0.5㎖ PBS 속의 0.5㎎ BSA 또는 0.5㎎ 재조합 글루타치온 전이효소(glutathione transferase)를 주입하였다. 혈압 및 심장 속도는 지속적으로 측정하여 기록하였다.

혈압은 심장 출력 및 말초적인 혈관 저항성의 함수이며, 교감신경계에 의해 조절된다. 순환하는 카테콜아민은 심장 속도, 심근 수축 및 저항성 혈관의 톤(tone)을 조절하였다. 레날라제는 혈액에서 순환하고 카테콜아민을 분해시키기 때문에, 레날라제의 혈액 동력학 기준에 대한 생체 내 효과를 측정하였다. 재조합 레날라제를 한 번 정맥 주입한지 30초 이내에, 수축, 이완 및 평균 동맥압이 각각 23.5±1.3, 32.6±2.9,28.9±2.7%(n=4, p<0.001)정도로 감소하였다. 도 7a(상위패널)에 나타났듯이, 혈압은 2분 이내에 회복되었고, 그후 지속적으로 감소하여 기본치(n=4,p<0.01)보다 16.5±1.5, 14.3±1.2, 14.8±1.1% 낮은 수축, 이완 및 평균 동맥압으로 최저점(60분과 90분 사이)에 도달하였다(참조: 도 7a, 하위패널). 심장 속도는 초반에 변하지 않다가, 60분경에 약간(6.4%) 감소하였다(참조: 도 7a, 하위패널). 대조군 연구에서, 혈압 및 심장 속도는 알부민 또는 GST 주입에 영향을 받지 않았다(참조: 도 7b). 이러한 데이타는 레날라제의 저혈압 작용이 아마도 촉진된 카테콜아민 분해의 결과이며, 이는 동계 속도(저혈압에 반응하는)의 예상되는 증가폭을 막고, 심장근 수축을 감소시키며, 혈관 저항성을 감소시킴을 암시하였다. 선택적으로, 레날라제는 동계의 수용체(cognate receptor)에 결합하며, 심근 수축 및 혈관 저항성을 직접적으로 조절할 수 있다.

	대조군l	레날라제	n	p
평균 동맥압 (mm Hg)	106.4±4.7	65.3±3.5	8	<0.0001
최종 수축압 (mm Hg)	127.7±8.1	92.7±2.7	5	<0.004
최종 이완압 (mm Hg)	11.3±1.8	9.3±1.5	5	NS
심장 속도 (beats / min )	342±6	304±9	5	<0.004
심장 출력 (㎖/min)	45.8±2.8	33.2±1.5	3	<0.03
dP/dt (mm Hg/sec)	8604±728	5235±442	5	<0.001
동맥 탄성 (mm Hg/㎕)	0.94±0.9	0.8±0.04	3	NS
전반적인 혈관 저항성 (mm Hg/L/min)	2323±196	1966±183	3	NS

실시예 5: 동물 모델

랫트 잔여 신장 모델( RRKM )

랫트의 부분적인(5/6) 신장절제 또는 랫트 잔여 신장 모델(rat remnant kidney model)은 다음 논문에 언급한 대로 이용할 수 있다(참조: Wada, M et al; J. Clin, Invest., 1997, Dec. 15;100(12):2977-83). 암컷 랫트(2-3개월된, 무게는 150-200g)은 우선 한쪽편만 신장절제시켰다(좌측 신장 또는 우측 신장). 2.0 ㎝ 피부를 복부의 정중선(ventral midline)에서 검상돌기(xyphoid)에 대해 꼬리가 두개골 끝 1.0 cm이 되도록 절개하였다. 2.0 cm 근육은 정중선을 따라 절개하였다. 우측 신장을 분리하여 주위의 지방 및 연결 조직을 제거하여 신장의 문(hilus)으로 들어가는 신장 동맥 및 정맥이 명확히 보이도록 하였다. 부신 선(adrenal gland)에 대한 손상을 최소화하도록 주의하였다. 봉합사(3/0 silk)는 신장 동맥, 정맥 및 수뇨관(ureter) 주변에 설치하였다. 이러한 혈관은 신장에 가깝게 절단하여 신장을 제거하고, 부신 선이 손상받지 않도록 주의를 기울였다. 외과 수술 순서의 2단계는 1단계가 끝난 후 7-10일이 지나서 남아 있는 신장의 2/3를 제거하는 것을 포함한다. 혈장 크레아틴(Cr) 및 BUN 양은 신장 부피 및 기능 손실로 인해 급격히 증가하였다. 다음 몇 주 동안, 살아 있는 동물의 혈장 Cr 및 BUN 양은 정상 값에 대하여 다소 감소하였지만, 높은 수준을 유지하였다. 이후 신장 기능은 다양한 기간 동안 상대적으로 일정하거나 안정적이었다. 이 시점이 지난 후, 동물은 죽을 때까지 신장 기능이 감소하는 만성적 신장질환의 시기에 진입하였다.

외과 수술 대조군, 연령, 무게-일치하는 랫트에 대하여, 신장은 피막을 제거(decapsulation)하지만 신장 조직은 제거하지 않는 "샴(sham)" 시술을 실시하였다.

만성 신장질환에 대한 중재 모델

이 모델에서, 신장 절제한 랫트와 샴(sham)-시술한 랫트는 수술 후 대략 5-6개월 동안 키웠다. 이 시점에, 살아 있는 신장 절제한 동물은 만성 신장질환 시기에 진입하였다.

랫트는 각 그룹이 15 랫트로 구성된 8 그룹으로 나누었다. 신장 절제한 랫트의 2 그룹은 대조군(Nx 대조군)으로 이용하고, 그 그룹의 한 그룹은 아무런 처리를 하지 않고, 다른 그룹은 운반체 완충액만을 주입하였다. 부가적으로, 샴-시술한 랫트의 2 그룹은 대조군으로 이용하였는데(샴 대조군), 하나의 그룹에는 운반체 완충용액만을 주입하고, 다른 그룹에는 100 ㎍/㎏ 체중 비율로 수용성 레날라제를 주입하였다. 신장 절제한 랫트의 네 가지 실험군을 모두 이용하고, SQ 주입에 의해 10, 100, 500 ㎍/㎏ 체중 비율도 레날라제를 주입하였다. 레날라제 처리한, 및 운반체만 처리한 랫트는 4-8 주 동안 매일 두 번씩 주입하였다.

혈장 BUN, Cr은 모든 그룹에서 레날라제 처리하는 기간 전 및 기간 중에 측정하였다. 레날라제가 Nx 랫트에 대하여 치료의 잇점을 제공할 거으로 기대하였다(만성적인 신장질환 진행을 감소시킬 것이다). 또한, 조직학적 연구가 레날라제 처리의 마지막 시기에 신사구 경화증, 세뇨관 파괴, 세포간 경화증 및 미세동맥류(microaneurysm)의 발병을 측정하기 위해 행해질 것이다.

만성 신장질환에 대한 예방 모델

만성 신장질환의 시작을 막거나, 저해하거나 늦추는 레날라제의 능력(신장 치료제)을 시험하기 위해, 랫트를 상기 언급한 대로 부분 신장절제하거나 샴(sham)-시술을 시켰다. 랫트는 레날라제 치료 시작하기 전 수술의 2차 단계를 시작한 후 약 2주간 회복시켰다. 이 시점에 살아 있는 동물은 급성 신장질환 시기를 경과하고, 아직 만성 신장질환에 진입하지 않았다. 랫트를 12랫트로 구성된 2 그룹으로 나누었다. 한 그룹은 운반체 완충액(Nx 대조군)만을 주입하고, 다른 그룹은 매일 두 번씩 주어진 SQ에 따라 100㎍/㎏체중으로 레날라제를 처리하였다. 레날라제 투여 또는 운반체 투여를 대략 8-9 주간 지속적으로 실시하였다.

혈장 BUN, Cr은 모든 그룹에서 레날라제 주입하기 전 및 주입하는 중에 측정할 것이다. 레날라제가 만성적 신장질환의 시작을 막거나 저해 또는 늦출 것으로 예상되었다. 또한, 조직학적 연구가 레날라제 처리의 마지막 시기에 신사구 경화증, 세뇨관 파괴, 세포간 경화증 및 미세동맥류(microaneurysms)의 발병을 측정하기 위해 행해질 것이다.

고혈압 모델

자발적인 고혈압 교잡(outbred) 랫트(SHR)는 흔히 필수적으로 고혈압 및 심장혈관 연구에 이용된다. 2주령 또는 그 이상의 암컷은 평균 200 mmHg보다 큰 수축 혈압을 나타낸다. 레날라제의 항-고혈압 효과는 SHR에서 측정하였다.

SHR 랫트는 12랫트로 구성한 2 그룹으로 나누었다. 한 그룹은 오직 운반체 완충액만을 주입하고, 다른 그룹은 매일 SQ에 따라 100㎍/㎏ 체중 비율로 레날라제를 처리하였다. 레날라제 또는 운반체의 투여는 대략 2-6주간 지속하였다. 랫트 혈압은 매일 이식한 원격측정 기구에 의해 측정할 것이다.

울혈성 심장질환 모델

울혈성 심장질환(congestive heart failure, CHF) 모델은 크고 작은 동물을 망라하여 문헌에 장 기술되어 있으며, 이 모델을 이용하여 레날라제의 예방 및 치료 효과를 측정할 수 있다. 예를 들어, 델레한티 등의 문헌(Delehanty et al ) (Delehanty JM et al., Am J Physiol., 1994 Mar; 266 (3Pt 2): H930-5)에 의하면, 개과동물에서(예를 들어, 개) CHF를 유발시키는 빠른 심실 보측(ventricular pacing) 모델을 이용할 수 있다. 8주간 225 beats/min으로 보측시킨 개는 증가된 좌심방 압력에 의하여 심장질환이 발생하였고, 시간의 경과에 따라 좌심실 압의 초기값이 감소하였으며, 8주간 100beats/min으로 보측시킨 개에 비하여 심장박출량(cardiac output)이 감소하였다. 빠르게 보측시킨 개는 또한 증가한 혈장 NE 및 감소한 심근 NE 함량을 나타내었다.

다른 CHF 동물 모델을 또한 이용할 수 있다. 예를 들어, 암컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트는 이미 언급한 대로 심근경색을 유발하기 위해 좌측 관상동맥을 결합시켰다(참조: Greenen, D. L. et al., J. Appl. Physiol., 63:92-96(1987); Buttick, P. et al., Am. J. Physiol., 260:11473-11479(1991)). 랫트는 펜토바비탈 나트륨(60mg/kg, ip)로 마취시키고, 기관절개를 통해 관을 삽입하여 호흡기를 이용해 환기시켰다. 좌측 개흉술 이후에 좌측 관상 동맥을 7.0 실크 봉합사를 이용해 원래 시작부분으로부터 약 2mm 정도 접합시켰다. 샴(sham) 동물에 대하여 봉합사를 관상동맥 아래로 통과시켜서 제거시키는 것을 제외한 같은 과정을 실시하였다. 접합 4-6주가 지나서, 랫트에서 심근경색이 심장질환으로 발달하였다. 임상 환자에서는, 심근경색 또는 관상 동맥 질환이 심장질환의 대부분의 일반적인 원인이었다. 이 모델에서의 울혈성 심장질환은 대부분 사람 환자에서의 울혈성 심장질환을 많이 닮았다.

발작(대뇌혈관 사고) 모델

"발작(stroke)"이란 뇌로의 혈액 공급의 비정상에 의해 일어나는 기능의 갑작스런 손실이다. 발작은 "일과성 뇌허혈 발작(transient ischemic attack)" 또는 "TIA"(영원한 불능이 아닌)부터 "부분적인 비진행성 발작(partial nonprogressing stroke)", 완전한 발작(complete stroke)"(영원하고, 비참한 신경계 결손)까지 다른 수준의 심각성을 보여 주었다.

발작하기 쉬운 자발적 고혈압(SHR-SP) 랫트는 일상적으로 발작 모델에 이용하였다. 이 실험은 발작 예방/치료시에 레날라제의 가능한 유용한 효과를 시험하기 위해 이용하였다. 암컷 8주령의 SHR-SP 랫트는 무작위 순서에 의해 2 그룹으로 나누었다. 대조군 랫트는 평범한 음식과 음료로써 1% NaCl을 지닌 물을 공급하였고, 대조군 그룹은 운반에 주입을 실시하였다. 치료 그룹은 4-8주간 레날라제 SQ를 주입하였다(100㎍/㎏, 매일 2회). 수축 혈압은 의식이 있는 동물에서 꼬리-접단 방법에 의해 측정하였고, 발작 비율은 자기공명영상화(MRI), 조직병리학 및 이 두 그룹에서 신경활동 시험을 이용하여 측정할 것이다.

동맥 경화증 모델

카테콜아민은 혈관 손상을 일으키고 과지혈증(hyperlipidaemia)이 있을 때, 동맥 경화증을 촉진시키고 악화시킨다고 알려져 있다(참조: Kukreja RS et al, Atherosclerosis, (1981) 40(3-4):291-8.). 그러므로, 레날라제는 동맥 경화를 예방/치료할 수 있을 것이다. 쿠쿠레자 등의 문헌(Kukreja et al)(참조: Kukreja RS et al, Atherosclerosis, (1981) 40(3-4):291-8)에 기술되어 있듯이, 진행형(advanced) 대동맥 및 관상동맥 경화증은 리서스(rhesus) 원숭이에서 두 가지 과정을 통해 나타날 수 있다: (a) 7개월간 고지방 및 고 콜레스테롤 주입, (b) 이 식이요법을 매일 아드레날린(50 ㎍/㎏ 체중)의 정맥 주입과 병행. (b)과정을 거친 원숭이는 대동맥과 관상동맥에 섬유모양의 반점 형태로 동맥 경화증이 급속도로 발달할 것이고, 반면 이러한 상처는 다른 그룹에서는 아주 적은 빈도가 예상된다. 자유 혈청 콜레스테롤에 대한 전체의 비율은 상당히 증가할 것이고 대동맥 콜레스테롤 함량은 죽종형성성(atherogenic) 식이요법 및 아드레날린 주입한 두 종류의 원숭이 모두에서 매우 높을 것이다. 이러한 모델은 동맥 경화증 예방 및 치료에 대한 레날라제의 효과를 측정하는데 이용할 수 있다.

레날라제를 시험하는 두 번째 모델은 apo E 녹-아웃 마우스(knockout mouse)(참조: Zhang SH, Reddick RL, Piedrahita JA, Maeda N., (1992) 아포리포단백질(apolipoprotein) E가 결핍된 마우스에서 자발적인 동맥 경화증 및 동맥 손상, Science, 258, 468-471)을 포함한다. 이러한 apo E 녹-아웃 마우스는 apoE 유전자를 제거하기 위해 배아 줄기 세포에 유전자 제거를 실시하여 만들어 내었다. apoE, 당단백질은 간과 장에서 합성되는 카일로마이크론(chylomicron)에 의해 합성되는 매우 낮은 밀도의 지방 단백질(VLDL)의 구조적 조성물이다. 또한, 세포들 사이에서 콜레스테롤 운반 능력에 관련된 고밀도 지방 단백질(HDLs)의 하위분류의 구성요소이기도 하다. apoE의 가장 중요한 역할 중 하나는 apoE를 지니는 VLDL 입자 및 카일로마이크론의 낮은 밀도 지방 단백질(LDL) 수용체에 대한 고밀착 결합을 매개하는 것이다. 이는 콜레스테롤이 풍부한 잔여부분의 혈장에 축적을 방지하는 운반에 필요한 간에 의한 이러한 입자의 특이적 수용을 허용하는 것이다. apoE 유전자의 동질의 비활성화는 그들의 혈청에서 apoE가 없는 동물을 만든다. 마우스는 정상적으로 발달하지만 정상 혈청 혈장 콜레스테롤에 비해 5배 높고 자발적인 동맥 경화 상처가 생기게 된다. 이는 LDL 수용체에 대한 결합이 부족한 다양한 형태의 apoE 유전자를 지녀서 조기에 동맥 경화가 발생할 위험이 있고 혈장의 트리글리세리드(triglyceride) 및 콜레스테롤 양이 높은 사람들의 질병과 유사하다. apoE 제거한 마우스는 동맥 경화 과정을 변형시켜 중재 치료법을 개발하는 동맥 경화증 모델로서 널리 이용할 수 있으며 여기서는 레날라제를 이용한 이러한 치료법의 효과를 측정하는데 이용할 수 있다.

실시예 6: 이후의 연구

전술한 실시예에 더하여, 본 발명자들에 의해 연구가 계획되거나 수행되어 왔다. 하나의 연구는 약 300 개체에서 레날라제 양과 신장 기능의 관계에 대한 임상적 시도를 포함한다. 70명의 사람이 지금까지 병적에 기록되었다. 기존의 결과는 6-7주 정도 이용가능할 것이다. 다른 연구에서는, 고안자들이 만성적인 신장질환의 진행 및 만성 신장질환의 랫트 모델에서 심혈관 문제의 발달에 대한 피하 주입에 의한 만성적인 레날라제 투여의 효과를 측정할 것이다. 이제까지의 다른 연구에서, 고안자는 랫트 모델에서 CMV-레날라제 벡터의 근육내 주사의 효능을 평가할 것이다.

토의

본 발명에서 확인한 레날라제는 기능적인 지놈 데이터베이스를 이용했을 때 사람의 세 번째 모노아민 산화효소이다. MAO-A 및 MAO-B와 유사하게, 레날라제는 도파민(DA), 노르에피네피린(NA) 및 에피네피린(EP)같은 카테콜아민을 대사분해시킨다. 레날라제는 MAO-A, MAO-B와 구분되는 여러 가지 중요하며, 독특한 특징을 지니고 있다. 첫째, MAO-A 및 MAO-B와 비교했을 때, 레날라제는 신장에서 우선적으로 발현되었는데, 이는 레날라제가 주위에 카테콜아민 대사작용에서 독특한 역할을 한다는 것을 의미하였다. 순환성 모노아민의 대사작용은 MAO-A, MAO-B, 카테콜-O-메틸-트랜스퍼라제(catechol-O-methyl-transferase, COMT) 및 설포트랜스퍼라제(sulfotransferase)를 포함하여, 세포간 효소의 숙주에 의해 실행한다고 생각되었다. 이러한 효소는 세포 사이에 위치하기 때문에, 순환성 카테콜아민의 수명을 제한하는 1차 기작은 효소에 의한 대사작용이 아니라 세포로의 능동 수송에 의한 흡수이다. 이는 MAO-A과 MAO-B의 우선적 역할이 아민의 대사작용 및 신경전달물질의 양과 세포간 아민 저장을 조절하는데 있다는 견해에 부합하였다. 둘째로, 미토콘드리아의 외막에 위치한 MAO-A 및 MAO-B와 달리, 레날라제는 분비성 단백질인데, 이는 카테콜아민 제거가 세포외 공간에서 일어날 수 있다는 것을 암시하며, 카테콜아민이 이화작용되기 위해서 세포에 의해 흡수되어야만 한다는 기존의 통상적인 사고에 도전하는 것이다. 레날라제는 레날라제가 혈장의 카테콜아민을 이화시키는 혈액에서 순환하고 있다. 레날라제가 시간에 따라 혈장 카테콜아민의 양을 잘 조정하고 있다는 가능성이 있다. 셋째로, 레날라제는 신장에서 다량 발현되는데, 이는 신장이 레날라제 촉매 경로를 통한 카테콜아민 분해에 관여함을 제시하였다. 본 명세서에 제공한 데이타는 레날라제가 부분적인 신장 수준 뿐만 아니라 전반적으로 카테콜아민을 조절한다는 이론에 부합하였다. 세포간 아민을 이화시키는 MAO-A 및 MAO-B와 접합하는 레날라제는 세포외 카테콜아민을 산화시키는 중요한 효소이며 전반적인 교감의 조절에 기여한다는 것은 납득할 만하다.

레날라제는 가까운 세관에 가장 풍부하며 각 개체의 순환기에 존재하는데, 이는 가까운 세관의 레날라제 단백질이 basolateral 막을 통해 레날라제가 그 기질을 이화시켜서 전반적인 수준에서의 카테콜아민 항상성을 조절하는 순환게로 분비시킬 수 있다는 점을 암시하고 있다.

레날라제는 또한 신장 세관의 내강(lumen)에서 레날라제의 생물학적 기능을 발휘할 가능성이 있는데 이는 레날라제가 네프론의 내강으로 쉽게 여과되는 작은 단백질이기 때문이다. 부가적으로, 가까운 세관에 의해 정점의 막을 통해 직접적으로 분비될 수 있고, 가까운 세관에서 사구체를 통해 여과되고 도파민등의 신장 세관 세포에 의해 처음부터(de novo) 생산되는 레날라제의 기질을 대사분해시킨다(참조: Wang et al., 2001). 관강내(intra-lumen)에서 카테콜아민 대사작용에서 레날라제의 중요성은 관강내에서의 카테콜아민 양을 조절하여 염과 물의 재흡수를 조절하는 것이다.

최근의 연구는 혈장 도파민(참조: Cuche et al., 1986; Prinseau et al., 1986) 및 노르에피네피린(참조: Zoccalie et al., 2002)는 ESRD 환자에서 지속적으로 증가하였음을 보여 주었다. 카테콜아민 양의 이러한 변화는 증상이 없는 좌심실 기능 손실(참조: Rouleau et al., 1994), 만성 울혈성 심장질환(참조: Rouleau et al., 1994) 및 아테롬성 동맥 경화증(참조: Rozanski et al., 1999) 등의 심혈관질환의 발병에 대한 중요한 요인이다. 심혈관 합병증에서 높은 교감 상태의 중요성은 또한 중재 연구에 의해 입증되었다(참조: Tendera et al., 2001). ESRD 환자에서, 순환하는 카테콜아민의 증가는 좌심실 비대증부터 부정맥까지 일련의 심혈관 합병증에 대해 요독증 환자를 민감하게 만들 수 있다(참조: Zoccali et al., 2002). ESRD 환자에서 카테콜아민이 증가하는 기작은 거의 이해되지 않은 채로 남아 있다. 레날라제에 대한 우리의 발견(카테콜아민을 이화시키고 신장에서 다량 발현되는)은 신장의 질량을 손실했을 때, 이러한 환자에서 카테콜아민 교란의 발병을 설명할 수 있다(ESRD 환자에서 적혈구 분비의 감소와 유사한).

레날라제는 대부분 신장, ESRD 환자가 기능을 잃은 기관에서 대부분 발현되기 때문에 ESRD 환자에서 레날라제의 양이 급격히 감소하는 것은 놀랄 일이 아니다. 레날라제가 카테콜아민을 이화시키고, ESRD 환자에서 카테콜아민의 양이 증가와 연관되었다는 사실은 레날라제가 마테콜아민 항상성 유지에 있어서 중요한 단백질이라는 점을 제시하였고, MAO-C는 고혈압, 징후없는 좌심실 기능장애, 만선 울혈성 심장질환 및 아테롬성 동맥 경화증 같은 심혈관 질환을 일으키는 카테콜아민 교란에 기여하는 잃어버린 요소이다.

전술한 상세한 설명은 단지 본 발명의 명확한 이해를 위함이며, 당업자에게 변형은 자명한 바, 그로부터 불필요한 제한이 가해지지 않은 것으로 이해되어야 한다.

본 발명이 그의 구체적 실시예와 관련지어 기술되었으나, 본 발명은 더 변형될 수 있고, 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 어떠한 변형, 이용 또는 개조도 포함하는 것으로 의도되며, 본 개시로부터 시작되어 본 발명이 속하는 당업계에 알려지거나 관행이며, 앞서 기술한 필수적 특징에 적용될 수 있으며, 첨부하는 청구항의 범위 내의 것을 포함한다.

참고문헌

본 명세서에서 인용된 각각 및 전부의 특허, 특허출원 및 간행물의 개시는, 아래 참고문헌 목록에 제한되어, 전체로서 본 명세서에 구체적으로 나타낸다.

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tgccggtggg aatgtaaaat gatgtagcta ctatggaaaa 1200 tgatacggca atttctttag aaatgaaata tagaattgcc gtatgatctg cagttccaca 1260 tctggatatc tatccaaaag aagtgaaagt agggacttga acgaacattt gtacaccaat 1320 gttcacagcg gctttattca caacagccaa aaggtggaag caacccagtg tccatggata 1380 gatgaataga taaataaaat gtggtataaa catacaatgg gctattgttt agccttaaaa 1440 gggaaggaaa ttctgacatg ctgcaatatg gatgaagctt aaagtcatta tgcaaagtgg 1500 aataagccta tcacaaaaaa taatattaca taattctact tatatgagga atctagagca 1560 gtcagtttca cagagacaga aaatagaatg gtggttgcca agggctggga gaagagggca 1620 atggagagtg agtgtttagt gggtcagagt tttagtttgg gaaggtaaaa agttctggag 1680 atggatgatg gttatgggtg ctcaacagtg tgaatgtact taatgccaca gaactgcaca 1740 tttaaatgtg gttaaaatca tcacttttat gttatgtata tttaccacaa taaataaaga 1800 agttgatatt tcttatactt acaaagagga gaagggcatt tgcaaatcaa caagaagtgt 1860 gaggcccctc tctctagcag aaaaatagac taaatctatt tctttatctt ttaacatcct 1920 gtttaaggga aatgccaaaa caaatgggaa aaaatacaca cacacaaata tatatgaaca 1980 tgttttgcct catgagtaat caaaatgtgt acatatgtat gtttatgtat gtgtgtttat 2040 atttaaaatc gtgttctgcc ttatgagtaa acaaaaagta tacaaattaa aaactataat 2100 gaaacgt 2107 <210> 4 <211> 2107 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aaaagcccgg gccgaacggc cccgccgcag agactcagcg cggatcgctg ctccctctcg 60 ccatggcgca ggtgctgatc gtgggcgccg ggatgacagg aagcttgtgc gctgcgctgc 120 tgaggaggca gacgtccggt cccttgtacc ttgctgtgtg ggacaaggct gaggactcag 180 ggggaagaat gactacagcc tgcagtcctc ataatcctca gtgcacagct gacttgggtg 240 ctcagtacat cacctgcact cctcattatg ccaaaaaaca ccaacgtttt tatgatgaac 300 tgttagccta tggcgttttg aggcctctaa gctcgcctat tgaaggaatg gtgatgaaag 360 aaggagactg taactttgtg gcacctcaag gaatttcttc aattattaag cattacttga 420 aagaatcagg tgcagaagtc tacttcagac atcgtgtgac acagatcaac ctaagagatg 480 acaaatggga agtatccaaa caaacaggct cccctgagca gtttgatctt attgttctca 540 caatgccagt tcctgagatt ctgcagcttc aaggtgacat caccacctta attagtgaat 600 gccaaaggca gcaactggag gctgtgagct actcctctcg atatgctctg ggcctctttt 660 atgaagctgg tacgaagatt gatgtccctt gggctgggca gtacatcacc agtaatccct 720 gcatacgctt cgtctccatt gataataaga agcgcaatat agagtcatca gaaattgggc 780 cttccctcgt gattcacacc actgtcccat ttggagttac atacttggaa cacagcattg 840 aggatgtgca agagttagtc ttccagcagc tggaaaacat tttgccgggt ttgcctcagc 900 caattgctac caaatgccaa aaatggagac attcacaggt accaagtgct ggtgtgattc 960 taggatgtgc gaagagcccc tggatgatgg cgattggatt tcccatctga cttcctggaa 1020 attggagcac acagtcaggt tttatttgat tttttttttt aaggatacca cttcacagcc 1080 tttaggatag ctattattta gaagcaaaac agaagataaa tgttggcaag gatgtggaga 1140 tattggattc ccttgtgcag tgccggtggg aatgtaaaat gatgtagcta ctatggaaaa 1200 tgatacggca atttctttag aaatgaaata tagaattgcc gtatgatctg cagttccaca 1260 tctggatatc tatccaaaag aagtgaaagt agggacttga acgaacattt gtacaccaat 1320 gttcacagcg gctttattca caacagccaa aaggtggaag caacccagtg tccatggata 1380 gatgaataga taaataaaat gtggtataaa catacaatgg gctattgttt agccttaaaa 1440 gggaaggaaa ttctgacatg ctgcaatatg gatgaagctt aaagtcatta tgcaaagtgg 1500 aataagccta tcacaaaaaa taatattaca taattctact tatatgagga atctagagca 1560 gtcagtttca cagagacaga aaatagaatg gtggttgcca agggctggga gaagagggca 1620 atggagagtg agtgtttagt gggtcagagt tttagtttgg gaaggtaaaa agttctggag 1680 atggatgatg gttatgggtg ctcaacagtg tgaatgtact taatgccaca gaactgcaca 1740 tttaaatgtg gttaaaatca tcacttttat gttatgtata tttaccacaa taaataaaga 1800 agttgatatt tcttatactt acaaagagga gaagggcatt tgcaaatcaa caagaagtgt 1860 gaggcccctc tctctagcag aaaaatagac taaatctatt tctttatctt ttaacatcct 1920 gtttaaggga aatgccaaaa caaatgggaa aaaatacaca cacacaaata tatatgaaca 1980 tgttttgcct catgagtaat caaaatgtgt acatatgtat gtttatgtat gtgtgtttat 2040 atttaaaatc gtgttctgcc ttatgagtaa acaaaaagta tacaaattaa aaactataat 2100 gaaacgt 2107 <210> 5 <211> 1924 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggggaagtct tgtgagatct gatggttttg taaagggcag ttgtacatat gctatcttgc 60 ctgccaccac taattagtga atgccaaagg cagcaactgg aggccgtgag ctactcctct 120 cgatatgctc tgggcctctt ttatgaagct ggtacgaaga ttgatgtccc ttgggctggg 180 cagtacatca ccagtaatcc ctgcatacgc ttcgtctcca ttgataataa 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gga ggt ggc att tca gga cta tct gct gcc aaa 271 Asp Val Val Val Ile Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Ser Ala Ala Lys 15 20 25 30 ctc ttg act gaa tat ggc gtt agt gtt ttg gtt tta gaa gct cgg gac 319 Leu Leu Thr Glu Tyr Gly Val Ser Val Leu Val Leu Glu Ala Arg Asp 35 40 45 agg gtt gga gga aga aca tat act ata agg aat gag cat gtt gat tac 367 Arg Val Gly Gly Arg Thr Tyr Thr Ile Arg Asn Glu His Val Asp Tyr 50 55 60 gta gat gtt ggt gga gct tat gtg gga cca acc caa aac aga atc tta 415 Val Asp Val Gly Gly Ala Tyr Val Gly Pro Thr Gln Asn Arg Ile Leu 65 70 75 cgc ttg tct aag gag ctg ggc ata gag act tac aaa gtg aat gtc agt 463 Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Ile Glu Thr Tyr Lys Val Asn Val Ser 80 85 90 gag cgt ctc gtt caa tat gtc aag ggg aaa aca tat cca ttt cgg ggc 511 Glu Arg Leu Val Gln Tyr Val Lys Gly Lys Thr Tyr Pro Phe Arg Gly 95 100 105 110 gcc ttt cca cca gta tgg aat ccc att gca tat ttg gat tac aat aat 559 Ala Phe Pro Pro Val Trp Asn Pro Ile Ala Tyr Leu Asp Tyr Asn Asn 115 120 125 ctg tgg agg aca ata gat aac atg ggg aag gag att cca act gat gca 607 Leu Trp Arg Thr Ile Asp Asn Met Gly Lys Glu Ile Pro Thr Asp Ala 130 135 140 ccc tgg gag gct caa cat gct gac aaa tgg gac aaa atg acc atg aaa 655 Pro Trp Glu Ala Gln His Ala Asp Lys Trp Asp Lys Met Thr Met Lys 145 150 155 gag ctc att gac aaa atc tgc tgg aca aag act gct agg cgg ttt gct 703 Glu Leu Ile Asp Lys Ile Cys Trp Thr Lys Thr Ala Arg Arg Phe Ala 160 165 170 tat ctt ttt gtg aat atc aat gtg acc tct gag cct cac gaa gtg tct 751 Tyr Leu Phe Val Asn Ile Asn Val Thr Ser Glu Pro His Glu Val Ser 175 180 185 190 gcc ctg tgg ttc ttg tgg tat gtg aag cag tgc ggg ggc acc act cgg 799 Ala Leu Trp Phe Leu Trp Tyr Val Lys Gln Cys Gly Gly Thr Thr Arg 195 200 205 ata ttc tct gtc acc aat ggt ggc cag gaa cgg aag ttt gta ggt gga 847 Ile Phe Ser Val Thr Asn Gly Gly Gln Glu Arg Lys Phe Val Gly Gly 210 215 220 tct ggt caa gtg agc gaa cgg ata atg gac ctc ctc gga gac caa gtg 895 Ser Gly Gln Val Ser Glu Arg Ile Met Asp Leu Leu Gly Asp Gln Val 225 230 235 aag ctg aac cat cct gtc act cac gtt gac cag tca agt gac aac atc 943 Lys Leu Asn His Pro Val Thr His Val Asp Gln Ser Ser Asp Asn Ile 240 245 250 atc ata gag acg ctg aac cat gaa cat tat gag tgc aaa tac gta att 991 Ile Ile Glu Thr Leu Asn His Glu His Tyr Glu Cys Lys Tyr Val Ile 255 260 265 270 aat gcg atc cct ccg acc ttg act gcc aag att cac ttc aga cca gag 1039 Asn Ala Ile Pro Pro Thr Leu Thr Ala Lys Ile His Phe Arg Pro Glu 275 280 285 ctt cca gca gag aga aac cag tta att cag cgg ctt cca atg gga gct 1087 Leu Pro Ala Glu Arg Asn Gln Leu Ile Gln Arg Leu Pro Met Gly Ala 290 295 300 gtc att aag tgc atg atg tat tac aag gag gcc ttc tgg aag aag aag 1135 Val Ile Lys Cys Met Met Tyr Tyr Lys Glu Ala Phe Trp Lys Lys Lys 305 310 315 gat tac tgt ggc tgc atg atc att gaa gat gaa gat gct cca att tca 1183 Asp Tyr Cys Gly Cys Met Ile Ile Glu Asp Glu Asp Ala Pro Ile Ser 320 325 330 ata acc ttg gat gac acc aag cca gat ggg tca ctg cct gcc atc atg 1231 Ile Thr Leu Asp Asp Thr Lys Pro Asp Gly Ser Leu Pro Ala Ile Met 335 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Glu Val Leu Asn Gly 450 455 460 ctc ggg aag gtg acc gag aaa gat atc tgg gta caa gaa cct gaa tca 1615 Leu Gly Lys Val Thr Glu Lys Asp Ile Trp Val Gln Glu Pro Glu Ser 465 470 475 aag gac gtt cca gcg gta gaa atc acc cac acc ttc tgg gaa agg aac 1663 Lys Asp Val Pro Ala Val Glu Ile Thr His Thr Phe Trp Glu Arg Asn 480 485 490 ctg ccc tct gtt tct ggc ctg ctg aag atc att gga ttt tcc aca tca 1711 Leu Pro Ser Val Ser Gly Leu Leu Lys Ile Ile Gly Phe Ser Thr Ser 495 500 505 510 gta act gcc ctg ggg ttt gtg ctg tac aaa tac aag ctc ctg cca cgg 1759 Val Thr Ala Leu Gly Phe Val Leu Tyr Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Arg 515 520 525 tct tgaagttc tgttcttatg ctctctgctc actggttttc aataccacca 1810 Ser agaggaaaat attgacaagt ttaaaggctg tgtcattggg ccatgtttaa gtgtactgga 1870 tttaactacc tttggcttaa ttccaatcat tgttaaagta aaaacaattc aaagaatcac 1930 ctaattaatt tcagtaagat caagctccat cttatttgtc agtgtagatc aactcatgtt 1990 aattgataga ataaagcctt gtgatcactt tctgaaattc acaaagttaa acgtgatgtg 2050 ctcatcagaa acaatttctg tgtcctgttt ttattccctt caatgcaaaa tacatgatga 2110 tttcagaaac aaagcatttg actttctgtc tgtggaggtg gagtaggtga aggcccagcc 2170 tgtaactgtc ctttttcttc ccttaggcaa tggtgaactg tcattacaga gcctagaggc 2230 tcacagcctc ctggaggaag cagcctccac tttggatcag gaaatagtaa aggaaagcag 2290 tgttgggggt agcggcatgc agaccctcag accagaatgg ggacatcttg tggtctgctg 2350 cctcaggaat ctcctgacca cttgtagtcc ctccgacttc tctagacatc tagtctcagt 2410 gctagcttat ttgtattttt cctctttcac ttcttatgga ggagagtgtt taactgagtt 2470 agaatgttga aactgacttg ctgtgactta tgtgcagctt tccagttgag cagaggaaaa 2530 tagtggcagg actgtccccc aggaggactc cctgcttagc tctgtgggag accaactacg 2590 actggcatct tctcttcccc ctggaaggca gctagacacc aatggatcct tgtcagttgt 2650 aacattctat ttcaacttca ggaaagcagc agttttcttt taatttttcc tatgaccata 2710 aaattagaca tacctctcaa cttacatatg tcttcaacat ggttacctct gcataaatat 2770 tagcaaagca tgccaatttc tcttaagtac tgaaatacat atgataaatt tgactgttat 2830 ttgttgagac tatcaaacag aaaagaaatt agggctctaa tttccttaaa gcaagctcac 2890 ttgctttagt tgttaagttt tataaaagac atgaaattga gtcattttat atatgaaaac 2950 taagttctct atcttaggag taatgtcggc ccacaagggt gcccacctct tgttttcccc 3010 ttttaaaaac tcagattttt aaaagccctt tccaaaggtt tcaactgtaa aatacttctt 3070 tttacaatgt atcaacatat ttttatttaa ggggaattaa caattgccag ggaaaccagc 3130 caacccaagt ttattatatc attaacctta tcataaattc aaacctaagt tgctggaccc 3190 tggtgtgagg acataaatct tccaaagttt tgcctatcct aagagctgca tttttctact 3250 gctctttacc ttgcatttta gctaatttag gagttttgag aatgtattgg atacgctcca 3310 gtacataagg agttgccgca tattatatca gactgctttg agaaatctca tccctagtct 3370 attgcagttg tttctattag cttactgatt aactcagtcc tgacacacct tttgggaaat 3430 gctgatttaa acttcttaac tggcaacagt tggaacagta atcagtttgc taacatattt 3490 aaagtcttga atgttgaaga actcatgtga tttacccttt tcaacttttt ggaaaacgat 3550 ttaatttatt ctaattagat taaccctatt aatctatgga ttgggtatca aaatgaatgc 3610 cagtccagat gtgcctagac acgaaattgg agctgaggac tctcacgata tgcaagttca 3670 tccaacgtga agataccata agctttttct ctgaaccaga gaaatgaaag tcagtttaag 3730 aggctgatag atcttggccc tgttaaggca tccacttcac agttctgaag gctgagtcag 3790 ccccactcca cagttaggcc aagaattaga ttttaaaact tcatctgtct gtcccagtta 3850 actgttaaat aaggcctcat cctccactga agagtatgga ttgaaggatt gtgaactatg 3910 tttagtgtga ttgtgaactt ggtgcctaat gttccatgtc tgaagtttgc cccagtgcta 3970 cacgttggag tatacctatg tgtgtgcttt gccactgaag taagattttg cctgtatggt 4030 actgttttgt ttgttaataa agtgcactgc cacccccaat gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4090 4090 <210> 11 <211> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Glu Asn Gln Glu Lys Ala Ser Ile Ala Gly His Met Phe Asp Val 1 5 10 15 Val Val Ile Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Ser Ala Ala Lys Leu Leu 20 25 30 Thr Glu Tyr Gly Val Ser Val Leu Val Leu Glu Ala Arg Asp Arg Val 35 40 45 Gly Gly Arg Thr Tyr Thr Ile Arg Asn Glu His Val Asp Tyr Val Asp 50 55 60 Val Gly Gly Ala Tyr Val Gly Pro Thr Gln Asn Arg Ile Leu Arg Leu 65 70 75 80 Ser Lys Glu Leu Gly Ile Glu Thr Tyr Lys Val Asn Val Ser Glu Arg 85 90 95 Leu Val Gln Tyr Val Lys Gly Lys Thr Tyr Pro Phe Arg Gly Ala Phe 100 105 110 Pro Pro Val Trp Asn Pro Ile Ala Tyr Leu Asp Tyr Asn Asn Leu Trp 115 120 125 Arg Thr Ile Asp Asn Met Gly Lys Glu Ile Pro Thr Asp Ala Pro Trp 130 135 140 Glu Ala Gln His Ala Asp Lys Trp Asp Lys Met Thr Met Lys Glu Leu 145 150 155 160 Ile Asp Lys Ile Cys Trp Thr Lys Thr Ala Arg Arg Phe Ala Tyr Leu 165 170 175 Phe Val Asn Ile Asn Val Thr Ser Glu Pro His Glu Val Ser Ala Leu 180 185 190 Trp Phe Leu Trp Tyr Val Lys Gln Cys Gly Gly Thr Thr Arg Ile Phe 195 200 205 Ser Val Thr Asn Gly Gly Gln Glu Arg Lys Phe Val Gly Gly Ser Gly 210 215 220 Gln Val Ser Glu Arg Ile Met Asp Leu Leu Gly Asp Gln Val Lys Leu 225 230 235 240 Asn His Pro Val Thr His Val Asp Gln Ser Ser Asp Asn Ile Ile Ile 245 250 255 Glu Thr Leu Asn His Glu His Tyr Glu Cys Lys Tyr Val Ile Asn Ala 260 265 270 Ile Pro Pro Thr Leu Thr Ala Lys Ile His Phe Arg Pro Glu Leu Pro 275 280 285 Ala Glu Arg Asn Gln Leu Ile Gln Arg Leu Pro Met Gly Ala Val Ile 290 295 300 Lys Cys Met Met Tyr Tyr Lys Glu Ala Phe Trp Lys Lys Lys Asp Tyr 305 310 315 320 Cys Gly Cys Met Ile Ile Glu Asp Glu Asp Ala Pro Ile Ser Ile Thr 325 330 335 Leu Asp Asp Thr Lys Pro Asp Gly Ser Leu Pro Ala Ile Met Gly Phe 340 345 350 Ile Leu Ala Arg Lys Ala Asp Arg Leu Ala Lys Leu His Lys Glu Ile 355 360 365 Arg Lys Lys Lys Ile Cys Glu Leu Tyr Ala Lys Val Leu Gly Ser Gln 370 375 380 Glu Ala Leu His Pro Val His Tyr Glu Glu Lys Asn Trp Cys Glu Glu 385 390 395 400 Gln Tyr Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Ala Tyr Phe Pro Pro Gly Ile Met 405 410 415 Thr Gln Tyr Gly Arg Val Ile Arg Gln Pro Val Gly Arg Ile Phe Phe 420 425 430 Ala Gly Thr Glu Thr Ala Thr Lys Trp Ser Gly Tyr Met Glu Gly Ala 435 440 445 Val Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Arg Glu Val Leu Asn Gly Leu Gly 450 455 460 Lys Val Thr Glu Lys Asp Ile Trp Val Gln Glu Pro Glu Ser Lys Asp 465 470 475 480 Val Pro Ala Val Glu Ile Thr His Thr Phe Trp Glu Arg Asn Leu Pro 485 490 495 Ser Val Ser Gly Leu Leu Lys Ile Ile Gly Phe Ser Thr Ser Val Thr 500 505 510 Ala Leu Gly Phe Val Leu Tyr Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Arg Ser 515 520 525 <210> 12 <211> 2566 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (137)..(1696) <400> 12 cgaggcgctg gtgcacgggg gcagcgcgca gcaggccggc gggcaggcgg gcgggctggc 60 tggcaggcag gactgggatc gaggcccaga aaacggagca gcgggcacca gggaggcctg 120 gaacggggcg agcgcc atg agc aac aaa tgc gac gtg gtc gtg gtg ggg 169 Met Ser Asn Lys Cys Asp Val Val Val Val Gly 1 5 10 ggc ggc atc tca ggt atg gca gca gcc aaa ctt ctg cat gac tct gga 217 Gly Gly Ile Ser Gly Met Ala Ala Ala Lys Leu Leu His Asp Ser Gly 15 20 25 ctg aat gtg gtt gtt ctg gaa gcc cgg gac cgt gtg gga ggc agg act 265 Leu Asn Val Val Val Leu Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg Thr 30 35 40 tac act ctt agg aac caa aag gtt aaa tat gtg gac ctt gga gga tcc 313 Tyr Thr Leu Arg Asn Gln Lys Val Lys Tyr Val Asp Leu Gly Gly Ser 45 50 55 tat gtt gga cca acc cag aat cgt atc ttg aga tta gcc aag gag cta 361 Tyr Val Gly Pro Thr Gln Asn Arg Ile Leu Arg Leu Ala Lys Glu Leu 60 65 70 75 gga ttg gag acc tac aaa gtg aat gag gtt gag cgt ctg atc cac cat 409 Gly Leu Glu Thr Tyr Lys Val Asn Glu Val Glu Arg Leu Ile His His 80 85 90 gta aag ggc aaa tca tac ccc ttc agg ggg cca ttc cca cct gta tgg 457 Val Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Arg Gly Pro Phe Pro Pro Val Trp 95 100 105 aat cca att acc tac tta gat cat aac aac ttt tgg agg aca atg gat 505 Asn Pro Ile Thr Tyr Leu Asp His Asn Asn Phe Trp Arg Thr Met Asp 110 115 120 gac atg ggg cga gag att ccg agt gat gcc cca tgg aag gct ccc ctt 553 Asp Met Gly Arg Glu Ile Pro Ser Asp Ala Pro Trp Lys Ala Pro Leu 125 130 135 gca gaa gag tgg gac aac atg aca atg aag gag cta ctg gac aag ctc 601 Ala Glu Glu Trp Asp Asn Met Thr Met Lys Glu Leu Leu Asp Lys Leu 140 145 150 155 tgc tgg act gaa tct gca aag cag ctt gcc act ctc ttt gtg aac ctg 649 Cys Trp Thr Glu Ser Ala Lys Gln Leu Ala Thr Leu Phe Val Asn Leu 160 165 170 tgt gtc act gca gag acc cat gag gtc tct gct ctc tgg ttc ctg tgg 697 Cys Val Thr Ala Glu Thr His Glu Val Ser Ala Leu Trp Phe Leu Trp 175 180 185 tat gtg aag cag tgt gga ggc aca aca aga atc atc tcg aca aca aat 745 Tyr Val Lys Gln Cys Gly Gly Thr Thr Arg Ile Ile Ser Thr Thr Asn 190 195 200 gga gga cag gag agg aaa ttt gtg ggc gga tct ggt caa gtg agt gag 793 Gly Gly Gln Glu Arg Lys Phe Val Gly Gly Ser Gly Gln Val Ser Glu 205 210 215 cgg ata atg gac ctc ctt gga gac cga gtg aag ctg gag agg cct gtg 841 Arg Ile Met Asp Leu Leu Gly Asp Arg Val Lys Leu Glu Arg Pro Val 220 225 230 235 atc tac att gac cag aca aga gaa aat gtc ctt gtg gag acc cta aac 889 Ile Tyr Ile Asp Gln Thr Arg Glu Asn Val Leu Val Glu Thr Leu Asn 240 245 250 cat gag atg tat gag gct aaa tat gtg att agt gct att cct cct act 937 His Glu Met Tyr Glu Ala Lys Tyr Val Ile Ser Ala Ile Pro Pro Thr 255 260 265 ctg ggc atg aag att cac ttc aat ccc cct ctg cca atg atg aga aac 985 Leu Gly Met Lys Ile His Phe Asn Pro Pro Leu Pro Met Met Arg Asn 270 275 280 cag atg atc act cgt gtg cct ttg ggt tca gtc atc aag tgt ata gtt 1033 Gln Met Ile Thr Arg Val Pro Leu Gly Ser Val Ile Lys Cys Ile Val 285 290 295 tat tat aaa gag cct ttc tgg agg aaa aag gat tac tgt gga acc atg 1081 Tyr Tyr Lys Glu Pro Phe Trp Arg Lys Lys Asp Tyr Cys Gly Thr Met 300 305 310 315 att att gat gga gaa gaa gct cca gtt gcc tac acg ttg gat gat acc 1129 Ile Ile Asp Gly Glu Glu Ala Pro Val Ala Tyr Thr Leu Asp Asp Thr 320 325 330 aaa cct gaa ggc aac tat gct gcc ata atg gga ttt atc ctg gcc cac 1177 Lys Pro Glu Gly Asn Tyr Ala Ala Ile Met Gly Phe Ile Leu Ala His 335 340 345 aaa gcc aga aaa ctg gca cgt ctt acc aaa gag gaa agg ttg aag aaa 1225 Lys Ala Arg Lys Leu Ala Arg Leu Thr Lys Glu Glu Arg Leu Lys Lys 350 355 360 ctt tgt gaa ctc tat gcc aag gtt ctg ggt tcc cta gaa gct ctg gag 1273 Leu Cys Glu Leu Tyr Ala Lys Val Leu Gly Ser Leu Glu Ala Leu Glu 365 370 375 cca gtg cat tat gaa gaa aag aac tgg tgt gag gag cag tac tct ggg 1321 Pro Val His Tyr Glu Glu Lys Asn Trp Cys Glu Glu Gln Tyr Ser Gly 380 385 390 395 ggc tgc tac aca act tat ttc ccc cct ggg atc ctg act caa tat gga 1369 Gly Cys Tyr Thr Thr Tyr Phe Pro Pro Gly Ile Leu Thr Gln Tyr Gly 400 405 410 agg gtt cta cgc cag cca gtg gac agg att tac ttt gca ggc acc gag 1417 Arg Val Leu Arg Gln Pro Val Asp Arg Ile Tyr Phe Ala Gly Thr Glu 415 420 425 act gcc aca cac tgg agc ggc tac atg gag ggg gct gta gag gcc ggg 1465 Thr Ala Thr His Trp Ser Gly Tyr Met Glu Gly Ala Val Glu Ala Gly 430 435 440 gag aga gca gcc cga gag atc ctg cat gcc atg ggg aag att cca gag 1513 Glu Arg Ala Ala Arg Glu Ile Leu His Ala Met Gly Lys Ile Pro Glu 445 450 455 gat gaa atc tgg cag tca gaa cca gag tct gtg gat gtc cct gca cag 1561 Asp Glu Ile Trp Gln Ser Glu Pro Glu Ser Val Asp Val Pro Ala Gln 460 465 470 475 ccc atc acc acc acc ttt ttg gag aga cat ttg ccc tcc gtg cca ggc 1609 Pro Ile Thr Thr Thr Phe Leu Glu Arg His Leu Pro Ser Val Pro Gly 480 485 490 ctg ctc agg ctg att gga ttg acc acc atc ttt tca gca acg gct ctt 1657 Leu Leu Arg Leu Ile Gly Leu Thr Thr Ile Phe Ser Ala Thr Ala Leu 495 500 505 ggc ttc ctg gcc cac aaa agg ggg cta ctt gtg aga gtc taaa 1700 Gly Phe Leu Ala His Lys Arg Gly Leu Leu Val Arg Val 510 515 520 gagagagggt gtctgtaatc acactctctt cttactgtat ttgggatatg agtttgggga 1760 aagagttgca gtaaagttcc atgaagacaa atagtgtgga gtgaggcggg gagcatgaag 1820 ataaatccaa ctctgactgt aaaatacatg gtatctcttt ctccgttgtg gcccctgctt 1880 agtgtccctt acctggctta gcgttctgtt tcaccagttt ccaagtttat tgccctcaaa 1940 atctttagaa tagttaaatt ggcttgttta aggttcttgc tgccccacaa cacaccttgc 2000 ccatgcacaa ggaatgaatt ttttcctacc attatggctt tgtgcttgtt cttcctctta 2060 cctgtaatag cctcaccttc cctagttctt tgcattcgtc cttagaatac tgtattgtta 2120 cagctgaaag acagtaaaga ccatttagtc ctcaccttct gttttagagt tgagcaaact 2180 gaagcccaca gaggtggaac ttaattacct aagagccaca ataagccact ggtatctggg 2240 ggactagaac acaaatccaa cgcttttccc acctctttgg atgttttccc caattatcct 2300 ccttcactcc ctgtcatagt taccgatggt gtcccgttgt gtgggtttac tctgtgctaa 2360 gttgtcttac acttctcaaa tgctactcag tatatagcct taagtcttac tgttttgtgc 2420 ggtgtgtctc cagctgattt taactttttt gatggtagaa attttatctc ttcttccttt 2480 tgtatcctcc attgtatctt catacaaagg acagtacaca cttgggtaat taaaaataaa 2540 agttgattga ccataaaaaa aaaaaa 2566 <210> 13 <211> 520 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ser Asn Lys Cys Asp Val Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly 1 5 10 15 Met Ala Ala Ala Lys Leu Leu His Asp Ser Gly Leu Asn Val Val Val 20 25 30 Leu Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg Thr Tyr Thr Leu Arg Asn 35 40 45 Gln Lys Val Lys Tyr Val Asp Leu Gly Gly Ser Tyr Val Gly Pro Thr 50 55 60 Gln Asn Arg Ile Leu Arg Leu Ala Lys Glu Leu Gly Leu Glu Thr Tyr 65 70 75 80 Lys Val Asn Glu Val Glu Arg Leu Ile His His Val Lys Gly Lys Ser 85 90 95 Tyr Pro Phe Arg Gly Pro Phe Pro Pro Val Trp Asn Pro Ile Thr Tyr 100 105 110 Leu Asp His Asn Asn Phe Trp Arg Thr Met Asp Asp Met Gly Arg Glu 115 120 125 Ile Pro Ser Asp Ala Pro Trp Lys Ala Pro Leu Ala Glu Glu Trp Asp 130 135 140 Asn Met Thr Met Lys Glu Leu Leu Asp Lys Leu Cys Trp Thr Glu Ser 145 150 155 160 Ala Lys Gln Leu Ala Thr Leu Phe Val Asn Leu Cys Val Thr Ala Glu 165 170 175 Thr His Glu Val Ser Ala Leu Trp Phe Leu Trp Tyr Val Lys Gln Cys 180 185 190 Gly Gly Thr Thr Arg Ile Ile Ser Thr Thr Asn Gly Gly Gln Glu Arg 195 200 205 Lys Phe Val Gly Gly Ser Gly Gln Val Ser Glu Arg Ile Met Asp Leu 210 215 220 Leu Gly Asp Arg Val Lys Leu Glu Arg Pro Val Ile Tyr Ile Asp Gln 225 230 235 240 Thr Arg Glu Asn Val Leu Val Glu Thr Leu Asn His Glu Met Tyr Glu 245 250 255 Ala Lys Tyr Val Ile Ser Ala Ile Pro Pro Thr Leu Gly Met Lys Ile 260 265 270 His Phe Asn Pro Pro Leu Pro Met Met Arg Asn Gln Met Ile Thr Arg 275 280 285 Val Pro Leu Gly Ser Val Ile Lys Cys Ile Val Tyr Tyr Lys Glu Pro 290 295 300 Phe Trp Arg Lys Lys Asp Tyr Cys Gly Thr Met Ile Ile Asp Gly Glu 305 310 315 320 Glu Ala Pro Val Ala Tyr Thr Leu Asp Asp Thr Lys Pro Glu Gly Asn 325 330 335 Tyr Ala Ala Ile Met Gly Phe Ile Leu Ala His Lys Ala Arg Lys Leu 340 345 350 Ala Arg Leu Thr Lys Glu Glu Arg Leu Lys Lys Leu Cys Glu Leu Tyr 355 360 365 Ala Lys Val Leu Gly Ser Leu Glu Ala Leu Glu Pro Val His Tyr Glu 370 375 380 Glu Lys Asn Trp Cys Glu Glu Gln Tyr Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Thr 385 390 395 400 Tyr Phe Pro Pro Gly Ile Leu Thr Gln Tyr Gly Arg Val Leu Arg Gln 405 410 415 Pro Val Asp Arg Ile Tyr Phe Ala Gly Thr Glu Thr Ala Thr His Trp 420 425 430 Ser Gly Tyr Met Glu Gly Ala Val Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Arg 435 440 445 Glu Ile Leu His Ala Met Gly Lys Ile Pro Glu Asp Glu Ile Trp Gln 450 455 460 Ser Glu Pro Glu Ser Val Asp Val Pro Ala Gln Pro Ile Thr Thr Thr 465 470 475 480 Phe Leu Glu Arg His Leu Pro Ser Val Pro Gly Leu Leu Arg Leu Ile 485 490 495 Gly Leu Thr Thr Ile Phe Ser Ala Thr Ala Leu Gly Phe Leu Ala His 500 505 510 Lys Arg Gly Leu Leu Val Arg Val 515 520

Claims (69)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 약 15%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
2. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
3. 서열번호 2의 아미노산 잔기 17 내지 342의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
4. 제 1항에 있어서,

   전기 폴리펩티드는 N-말단에 신호펩티드(signal peptide)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는

   분리된 폴리펩티드.
5. 제 1항에 있어서,

   전기 폴리펩티드는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD) 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는

   분리된 폴리펩티드.
6. 제 1항에 있어서,

   전기 폴리펩티드는 활성화된 레날라제(renalase) 단백질인 것을 특징으로 하는

   분리된 폴리펩티드.
7. 제 1항에 있어서,

   전기 폴리펩티드는 포유동물의 레날라제 단백질인 것을 특징으로 하는

   분리된 폴리펩티드.
8. 제 1항에 있어서,

   전기 폴리펩티드는 사람의 레날라제 단백질인 것을 특징으로 하는

   분리된 폴리펩티드.
9. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,

   폴리펩티드는 보조인자(cofactor)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

   분리된 폴리펩티드.
10. 제 9항에 있어서,

    보조인자는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD) 또는 그의 유사체(analog)인 것을 특징으로 하는

    분리된 폴리펩티드.
11. 제 9항에 있어서,

    보조인자는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)인 것을 특징으로 하는

    분리된 폴리펩티드.
12. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 운반체를 필수적 구성요소로 하거나 이들을 포함하는 조성 물.
13. 제 12항에 있어서,

    전기 조성물은 경구 또는 주사용으로 제형화된 것을 특징으로 하는

    조성물.
14. 제 12항에 있어서,

    전기 조성물은 즉시방출(immediate release) 또는 제어방출(controlled release) 투여형태인 것을 특징으로 하는

    조성물.
15. 제 12항에 있어서,

    폴리펩티드는 미세결정(microcrystalline) 형태인 것을 특징으로 하는

    조성물.
16. 제 12항에 있어서,

    폴리펩티드는 나노입자로 캡슐화된 것을 특징으로 하는

    조성물.
17. 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 17 내지 342의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 운반체를 필수적 구성요소로 하거나 이들을 포함하는 조성물.
18. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드와 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)를 결합시키는 공정을 포함하는 활성화 레날라제 폴리펩티드의 제조방법.
19. 제 18항에 있어서,

    보조인자는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD) 또는 그의 유사체(analog)인 것을 특징으로 하는

    방법.
20. 제 19항에 있어서,

    효소 보조인자는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)인 것을 특징으로 하는

    방법.
21. 적어도 하나의 체액(bodily fluid)으로부터 단백질을 분리하는 공정 및 그로부터 레날라제 단백질을 수득하는 공정을 포함하는, 레날라제 단백질을 수득하는 방법.
22. 제 21항에 있어서,

    전기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 타액(saliva), 소변, 림프액(lymph fluid), 전혈(whole blood), 척수액조직 배양배지(spinal fluid tissue culture medium) 및 세포추출액(cellular extract)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
23. 제 21항에 있어서,

    이온교환크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 리간드결합 친화성크로마토그래피, 겔투과크로마토그래피 또는 이들의 조합을 이용하여 전기 수득한 레날라제 단백질을 추가로 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
24. 레날라제 단백질을 생산하는 세포, 세포배양물, 조직, 조직배양물, 장기 또는 장기배양물로부터 상기 단백질을 분리하는 공정 및 그로부터 레날라제 단백질을 수득하는 공정을 포함하는, 레날라제 단백질을 수득하는 방법.
25. 배양배지에서 세포를 배양하여 레날라제 단백질을 생산하는 공정; 상기 세포 및/또는 배양배지에서 상기 단백질을 분리하는 공정; 및, 그로부터 레날라제 단백질을 수득하는 공정을 포함하는, 레날라제 단백질을 수득하는 방법.
26. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체.
27. 포유동물의 레날라제 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체.
28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,

    전기 항체는 다클론 항체(polyclonal antibody), 단클론항체(monoclonal antibody) 및 합성항체(synthetic antibody)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    항체.
29. 제 1항 내지 8항의 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드의 치료적으로 유효한 양을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 레날라제-매개 상태(condition), 장애(disorder) 또는 질병(disease)을 예방, 치료 또는 개선하는 방법.
30. 제 29항에 있어서,

    상태, 장애 또는 질병은 신장의 상태, 장애 또는 질병; 심장혈관의 상태, 장애 또는 질병; 심장의 상태, 장애 또는 질병; 중추신경계(CNS)의 상태, 장애 또는 질병; 및, 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
31. 제 30항에 있어서,

    심장혈관의 상태, 장애 또는 질병은 고혈압, 무증상 좌심실기능장애(asymptomatic left ventricular dysfunction), 만성울혈성 심장기능상실(chronic congestive heart failure(CHF)), 심근경색증(myocardial infarction(MI)), 심박장애(cardiac rhythm disturbance), 뇌졸중(stroke), 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
32. 제 31항에 있어서,

    전기 고혈압은 만성 고혈압(chronic hypertension), 수축성 고혈압(systolic hypertension), 고립형 수축성 고혈압(isolated systolic hypertension), 당뇨성 고혈압(diabetic hypertension), 폐 고혈압(pulmonary hypertension), 급성의 심각한 고혈압(acute severe hypertension) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
33. 제 30항에 있어서,

    신장의 상태, 장애 또는 질병은 말기신장병(ESRD), 만성 신부전증(chronic renal failure) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
34. 치료적으로 유효한 양의 제 1항 내지 8항의 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 레날라제 치료를 필요로 하는 포유동물을 치료하는 방법.
35. 치료적으로 유효한 양의 제 1항 내지 8항의 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 포유동물의 말기신장병(ESRD)을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
36. 치료적으로 유효한 양의 레날라제 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 그것 을 필요로 하는 포유동물의 중추신경계(CNS)의 상태, 장애 또는 질병을 예방, 치료, 개선시키는 방법.
37. 제 36항에 있어서,

    중추신경계(CNS)의 상태, 장애 또는 질병은 우울증(depression), 불안증(anxiety), 조증(mania), 정신분열증(schizophrenia) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는

    방법.
38. 제 36항에 있어서,

    전기 레날라제 저해제는 작은 분자 저해제, 항체, 리보자임, 간섭 RNA(interfering ribonucleic acid), 안티센스 핵산 분자 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는

    방법.
39. 제 36 내지 38항의 어느 한 항에 있어서,

    포유동물은 사람인 것을 특징으로 하는

    방법.
40. 포유동물에 서열번호 1의 핵산서열을 포함하거나 서열번호 1의 잔기 24부터 1049의 핵산서열을 포함하는 분리된 핵산분자를 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 포유동물에 대해 레날라제-매개 상태, 장애 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키기 위한 유전자치료 방법.
41. 제 40항에 있어서,

    분리된 핵산은 서열번호 1의 핵산서열 또는 서열번호 1의 잔기 24부터 1049까지의 핵산서열에 작동가능하도록 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
42. 제 40항에 있어서,

    분리된 핵산이 바이러스 벡터를 이용하여 투여되는 것을 특징으로 하는

    방법.
43. (a) 서열번호 1의 핵산서열 또는 서열번호 1의 잔기 24부터 1049의 핵산서열을 갖는 포유동물 세포를 생체 외에서(ex vivo) 조작하는 단계; 및,

    (b) 조작된 세포를 포유동물에 되돌려주는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 포유동물에 대해 레날라제-매개 상태, 장애 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키기 위한 유전자치료 방법.
44. 치료적으로 유효한 양의 레날라제 작용제(agonist)를 포유동물에 투여함으로써, 그로부터 레날라제의 발현을 증가시키며, 포유동물의 고혈압을 예방, 치료 또는 개선시키는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 포유동물의 고혈압을 예방, 치료 또는 개선시키기 위한 방법.
45. 치료적으로 유효한 양의 레날라제 작용제(agonist)를 포유동물에 투여함으로써, 그로부터 레날라제의 발현을 증가시키며, 포유동물의 ESRD를 예방, 치료 또는 개선시키는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 포유동물의 ESRD를 예방, 치료 또는 개선시키기 위한 방법.
46. 포유동물의 레날라제 발현수준을 탐지하는 단계; 및, 전기 포유동물의 전기 레날라제 발현수준을 상태, 장애 또는 질병으로 고통받지 않는 포유동물의 레날라제 발현수준과 비교함으로써, 그것에 의해 상태, 장애 또는 질병으로 고통받거나 감수성인 포유동물을 진단하거나 진단을 보조하는 단계를 포함하는, 포유동물 레날라제의 변경된 발현과 관련된 포유동물의 상태, 장애 또는 질병의 진단 또는 진단보조 방법, 또는 포유동물 레날라제의 변경된 발현과 관련된 포유동물의 상태, 장애 또는 질병에 대한 감수성을 진단 또는 진단 보조하는 방법.
47. 제 46항에 있어서,

    전기 상태, 장애 또는 질병은 말기신장병(end-stage renal disease, ESRD), 고혈압, 급성 신장질환(acute tubular necrosis, ANT), 심장혈관병 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
48. 제 46항에 있어서,

    전기 상태, 장애 또는 질병은 CNS의 상태, 장애 또는 질병인 것을 특징으로 하는

    방법.
49. 레날라제가 발현되는 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 화합물과 접촉한 세포에서의 레날라제 발현수준을 화합물과 접촉하는 것이외에는 화합물과 접촉하지 않은 세포와 동일한 세포의 발현수준과 비교하고,

    전기 화합물과 접촉하지 않은 세포와, 전기 화합물과 접촉하는 것이외에는 동일한 세포의 레날라제 발현수준과 비교하여 전기 화합물과 접촉한 세포에서 더 높은 수준의 레날라제를 발현하는 것을 가지고, 전기 세포에서 레날라제의 발현을 증가시키는 화합물로 확인하는 단계를 포함하는, 세포에서의 레날라제 발현을 증가시키는 화합물을 동정하는 방법.
50. 레날라제가 발현되는 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 화합물과 접촉한 전기 세포에서의 레날라제 발현수준을 화합물과 접촉하는 것이외에는 화합물과 접촉하지 않은 세포와 동일한 세포의 발현수준과 비교하고, 전기 화합물과 접촉하지 않은 세포와, 전기 화합물과 접촉하는 것이외에는 동일한 세포의 레날라제 발현수준과 비교하여 전기 화합물과 접촉한 세포에서의 더 낮은 수준의 레날라제 발현하는 것을 가지고, 전기 세포에서레날라제의 발현을 감소시키는 화합물로 확인하는 단계를 포함하는, 세포에서의 레날라제 발현을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법.
51. 제 49항 또는 50항의 방법에 의해 동정된 화합물.
52. (a) 분리된 폴리펩티드를 잠재적인(potential) 결합파트너와 접촉하는 단계; 및,

    (b) 잠재적인 결합파트너가 폴리펩티드의 활성에 영향을 주는지를 결정함으로써, 결합파트너를 동정하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 8항의 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드의 결합파트너를 동정하는 방법.
53. 프로모터/조절서열을 포함하는 핵산에 작동가능하도록 연결된 서열번호 1의 핵산서열을 포함하는 분리된 핵산분자.
54. 프로모터/조절서열을 포함하는 핵산에 작동가능하도록 연결된 서열번호 1의 핵산서열의 잔기 24부터 1049까지를 포함하는 분리된 핵산분자.
55. 프로모터/조절서열을 암호화하는 핵산에 작동가능하도록 연결된 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 약 40%의 서열동일성을 갖는 핵산서열을 포함하는 분리된 핵산분자.
56. 제 55항에 있어서,

    전기 핵산분자는 그것에 공유결합하는 태그(tag) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

    분리된 핵산분자.
57. 제 55항 또는 56항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
58. 제 55항의 핵산분자, 제 56항의 핵산분자 또는 제 57항의 벡터를 포함하는 재조합 세포.
59. 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 약 40%의 서열동일성을 갖는 핵산서열을 갖는 핵산분자에 의해 암호화된 레날라제 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 세포 를 배양하는 공정을 포함하는, 레날라제 폴리펩티드를 생산하는 방법.
60. 제 59항의 방법으로 생산된, 분리된 레날라제 폴리펩티드.
61. 제 59항에 있어서,

    전기 핵산분자는 아미노산 서열에 있어서 서열번호 2의 핵산서열과 적어도 약 95%의 동일성을 갖는 레날라제 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는

    방법.
62. 제 61항의 방법으로 생산된 분리된 레날라제 단백질.
63. (a) 핵산분자의 발현을 허용하는 조건하에서 제 53항의 분리된 핵산분자를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 공정; 및,

    (b) 그 세포에 의해 생산된 전기 레날라제 단백질을 수득하는 공정을 포함하는, 레날라제 폴리펩티드를 생산하는 방법.
64. 제 63항의 방법으로 생산된 분리된 레날라제 폴리펩티드.
65. 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 약 40%의 서열동일성을 갖는 핵산서열에 상보적인, 안티센스 방향의 분리된 핵산분자.
66. 제 65항에 있어서,

    작동가능하도록 연결될 수 있는 프로모터/조절 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

    분리된 핵산분자.
67. 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 약 40%의 서열동일성을 갖는 핵산서열을 갖는 핵산분자에 의해 암호화된 레날라제 폴리펩티드를 암호화하는 안티센스 방향의 핵산을 발현할 수 있는 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 레날라제 폴리펩티드를 생산하는 방법.
68. 제 67항에 있어서,

    핵산서열은 그것에 작동가능하도록 연결될 수 있는 프로모터/조절 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
69. 제 67항 또는 68항의 방법에 의해 생산된, 분리된 레날라제 폴리펩티드.

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