KR20070007483A - A method of detecting a presence or absence of viable cells using a magnetic nanoparticles and device for the same - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 본 발명의 장치를 이용하여 산 세포의 존재 여부 또는 간접적으로 죽은 세포의 존재 여부를 검출하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.1 is a diagram showing a process of detecting the presence of live cells or indirectly dead cells using the apparatus of the present invention.
본 발명은 자성 나노입자를 이용하여 살아 있는 세포의 존재 여부를 검출하는 방법 및 그에 사용되는 장치에 관한 것이다. The present invention relates to a method for detecting the presence of living cells using magnetic nanoparticles and a device used therein.
종래 특정한 화합물이 세포의 생물학적 기능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 여러 표지된 화합물 분자를 세포 내에 주입하고, 이들이 세포에 미치는 변화를 검출함으로써 상기 화합물이 세포 기능에 미치는 영향을 확인하는 방법이 알려져 있었다. 그러나, 종래 이러한 방법은 일반적으로 세포 내 효소나 대사물질 또는 죽어 가는 세포가 세포 밖으로 방출하는 효소나 대사 물질이 불활성 상태의 형광 리포터 분자를 활성화하여 발광하는 원리를 이용하는 간접적 광학 검출 방법으로 형광표지 가능 리포터 분자와 같이 광학적으로 검출가능한 표지로 표지된 분자를 리 포터 분자로 많이 사용하였으며, 그에 따라 광학적 검출 시스템이 주로 사용되었다 (예, 미국특허 제6,875,578호).In order to identify the effect of a specific compound on the biological function of the cell, a method of identifying the effect of the compound on the cell function by injecting various labeled compound molecules into the cell and detecting the change in the cell has been known. However, such a conventional method can be fluorescently labeled by an indirect optical detection method using the principle of activating and emitting fluorescent reporter molecules in an inactive state by enzymes or metabolites in cells or enzymes or metabolites that are released from dying cells. Many molecules labeled with an optically detectable label, such as a reporter molecule, have been used as reporter molecules, and thus an optical detection system has been mainly used (e.g., US Pat. No. 6,875,578).
또한, 종래 수퍼파라마그네틱 철 옥사이드 나노입자 (SPION; super paramagnetic iron oxide nanoparticle)가 MRI 조영제 또는 약물전달시스템에 오래전부터 사용되어 왔다. In addition, conventional super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) have been used for a long time in MRI contrast agents or drug delivery systems.
또한, Gupta AK 등의 Biomaterials, 2005, 5; 26(13): 1565-73에는 자성 나노입자의 세포독성을 낮추고 세포 흡수를 높이기 위하여 풀루란으로 SPION의 표면을 변형하는 방법이 개시되어 있다. Gupta AK 등에 의하면, SPION은 섬유아세포에 대하여 세포독성이 있으며, 흡수되는 경우 세포의 세포골격 조직을 파괴하는 반면, 풀루란으로 변형된 SPION은 세포독성이 없으며, SPION과는 다른 세포 골력 조직 변화를 유도하였다. In addition, Biomaterials such as Gupta AK, 2005, 5; 26 (13): 1565-73 discloses a method of modifying the surface of SPION with pullulan to lower the cytotoxicity of magnetic nanoparticles and increase cellular uptake. According to Gupta AK et al., SPION is cytotoxic to fibroblasts and, when absorbed, destroys cytoskeletal tissue of cells, whereas SPION modified with pullulan is not cytotoxic and changes in cellular bone tissue different from SPION. Induced.
한편, 엔도사이토시스 (endocytosis)는 세포가 거대 분자, 입자성 물질 및 특별한 경우에는 다른 세포를 내부로 받아 들이는 과정을 말한다. 포집되어질 물질은 점진적으로 세포 막의 작은 부분에 의하여 둘러 쌓여지고, 떨어져 나가 세포 내 낭 (vesicle)을 형성한다. 엔도사이토시스에는 작은 낭 (vesicle) (직경 ≤ 150 nm)을 통하여 액체 및 용질을 섭취하는 피노사이토시스 (pinocytosis)와 일반적으로 직경 ≥ 250 nm의 큰 낭인 파고좀 (phagosome)을 통하여 미생물 또는 세포 파편과 같은 고상 물질을 섭취하는 파고사이토시스 (phagocytosis)로 분류된다. 대부분의 살아 있는 진핵세포는 피노사이토시스를 통하여 연속적으로 액체 및 용질을 섭취하나, 큰 입자는 일반적으로 특화된 식세포 (phagocytic cell)에 의하여 섭취되 어진다. Endocytosis, on the other hand, refers to the process by which a cell accepts large molecules, particulate matter, and in other cases, other cells internally. The material to be collected is gradually enclosed by a small portion of the cell membrane, which falls off to form an intracellular vesicle. Endocytosis includes microbial or cellular debris through pinocytosis, which ingests liquids and solutes through small vesicles (diameter ≤ 150 nm) and pagosomes, typically large sacs ≥ 250 nm in diameter. It is classified as phagocytosis (phagocytosis) ingesting solid substances such as. Most living eukaryotic cells ingest liquids and solutes continuously through pinocytosis, but large particles are generally ingested by specialized phagocytic cells.
상기한 바와 같은 자성 나노입자들은 MRI 또는 약물전달시스템에서 특정한 세포 또는 약물의 이동 경로 또는 대사 경로를 추적하기 위한 목적으로 사용되었다. 그러나, 상기 자성 나노입자를 이용하여 살아 있는 세포와 죽은 세포 또는 활성이 없는 세포를 분별하는 방법, 살아 있는 세포를 죽은 세포로부터 분리하는 방법 또는 그를 위한 장치는 개시된 바 없다.Magnetic nanoparticles as described above have been used for the purpose of tracking the migration or metabolic pathways of specific cells or drugs in MRI or drug delivery systems. However, a method of separating live cells from dead cells or inactive cells using the magnetic nanoparticles, a method of separating living cells from dead cells, or a device therefor has not been disclosed.
이에 본 발명자들은 자성 나노입자가 살아 있는 세포에 엔도사이토시스에 의하여 흡수되나, 죽은 세포 또는 활성이 없는 세포에는 흡수되지 않는다는 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.The present inventors have found that magnetic nanoparticles are absorbed by living cells by endocytosis, but are not absorbed by dead cells or inactive cells, and have completed the present invention.
본 발명의 목적은 자성 나노입자를 이용하여 살아 있는 세포의 존재 여부 또는 간접적으로 죽은 세포의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for detecting the presence of living cells or indirectly dead cells using magnetic nanoparticles.
본 발명의 다른 목적은 자성 나노입자를 이용하여 살아 있는 세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for separating living cells using magnetic nanoparticles.
본 발명의 또 다른 목적은 자성 나노입자를 이용하여 살아 있는 세포의 존재 여부를 검출하기 위한 장치를 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a device for detecting the presence of living cells using magnetic nanoparticles.
본 발명은 세포에 시험 물질을 접촉시키고 배양하는 단계;The present invention comprises the steps of contacting and culturing the test substance to the cells;
상기 배양물에 자성 나노입자를 첨가하고 배양하여 살아 있는 세포가 상기 자성 나노입자를 흡수하도록 하는 단계; Adding magnetic nanoparticles to the culture and culturing the living cells to absorb the magnetic nanoparticles;
배양물 중의 세포에 의하여 흡수되지 않은 상기 자성 나노입자를 세척하여 제거하는 단계; 및 Washing and removing the magnetic nanoparticles not absorbed by the cells in the culture; And
상기 세포 배양물에 자기장을 인가하여 배양물 중에서 상기 자성 나노입자의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 자성 나노입자를 이용하여 살아 있는 세포의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공한다.It provides a method for detecting the presence of live cells using magnetic nanoparticles, comprising the step of detecting the presence of the magnetic nanoparticles in the culture by applying a magnetic field to the cell culture.
본 발명은 시험 물질 (test compound)을 세포에 접촉시키고 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명에 있어서, 시험 물질이란 특정한 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여 사용되는 임의의 물질이다. 이러한 물질에는 신약 후보 물질 (new drug candidate), 독성물질 및 단백질 등이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 시험 물질을 세포에 접촉시키는 온도 및 시간 등의 조건은 선택되는 세포 및 시험 물질에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 상기 세포는 시험 물질 및 실험의 목적 등에 따라 임의적으로 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 세포는 다중웰이 구비되어 있는 다중웰 플레이트에 배양되는 것이 고성능 분석 (HTS)을 위하여 바람직하다. 본 발명에 따르면, 자성 물질의 존재 여부를 검출하는 것은 나노단위의 자성 검출 프로브를 제작하는 것이 가능하기 때문에, 고성능 분석 장치를 개발하는 것이 가능하다. The present invention includes contacting and culturing a test compound with a cell. In the present invention, a test substance is any substance used to identify the effect on a specific cell. Such substances may be new drug candidates, toxic substances and proteins, but are not limited to these examples. Conditions such as temperature and time for contacting the test substance with the cells may be appropriately set depending on the cell and the test substance to be selected. The cells may be arbitrarily selected and used depending on the test substance and the purpose of the experiment. In addition, the cells are preferably cultured in multiwell plates equipped with multiwells for high performance assays (HTS). According to the present invention, since the detection of the presence or absence of the magnetic material enables the production of nano-scale magnetic detection probes, it is possible to develop a high performance analysis device.
본 발명은 또한, 상기 시험 물질과 접촉된 후 배양된 세포 배양물에 자성 나노입자를 첨가하고 배양하여 살아 있는 세포가 상기 자성 나노입자를 흡수하도록 하는 단계를 포함한다. 상기 자성 나노입자는 자성을 가지고 있으며, 세포에 독성 을 주지 않고, 엔도사이토시스 (endocytosis) 등에 의하여 세포에 의하여 용이하게 흡수될 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 자성 입자는 예를 들면, 수퍼파라마그네틱 철 옥사이드 나노입자 (superparamagnetic iron oxide nanoparticles: SPION), 마그네타이트, 마그헤마이트, 소프트페로마그네틱 비드, 코발트 및 구리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 이들 나노입자는 그 자체로 세포에 유해하지 않은 재질의 것이거나 페루카보트란 및 페룸옥사이드 등과 같은 세포에 유해하지 않은 물질로 코팅되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 자성 나노입자에는 풀루란 코팅된 자성 나노입자와 같이 특정한 물질로 코팅되거나 변형된 자성 나노입자가 포함된다. 상기 자성 나노입자의 크기는 세포에 의하여 용이하게 흡수될 수 있는 크기이면, 특별한 차원의 크기에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 나노 수준의 입자, 더욱 바람직하게는 1 내지 1000nm, 가장 바람직하게는 5 내지 500 nm의 직경을 갖는 것이다. The present invention also includes adding magnetic nanoparticles to the cultured cell culture after contact with the test substance and culturing the living cells to absorb the magnetic nanoparticles. The magnetic nanoparticles include any one as long as the magnetic nanoparticles have magnetic properties and do not give toxicity to the cells and can be easily absorbed by the cells by endocytosis. The magnetic particles may be, for example, selected from the group consisting of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION), magnetite, maghemite, soft ferromagnetic beads, cobalt and copper, but these examples It is not limited to. These nanoparticles may themselves be of a material that is not harmful to the cell or may be coated with a material that is not harmful to the cells, such as Perucarbotran and ferrum oxide. In addition, the magnetic nanoparticles include magnetic nanoparticles coated or modified with a specific material, such as pullulan-coated magnetic nanoparticles. The size of the magnetic nanoparticles is not limited to the size of a particular dimension as long as the size of the magnetic nanoparticles can be easily absorbed by the cells, preferably nano-level particles, more preferably 1 to 1000nm, most preferably 5 To 500 nm in diameter.
본 발명은 또한 배양물 중의 세포에 의하여 흡수되지 않은 상기 자성 나노입자를 세척하여 제거하는 단계를 포함한다. 이러한 세척 단계는 종래 세포를 이용한 통상의 생물학적 분석방법에 있어서의 세척과정과 동일하다. 즉, 적절한 버퍼로 세포를 세척하여 세포 표면에 존재하는 상기 자성 나노입자를 세포로부터 분리하여 제거하는 것이다. 이러한 세척 단계에 의하여 배양물 중에 존재하는 상기 자성 나노입자는 세포에 의하여 흡수된 것만 잔류하게 된다. The invention also includes washing and removing the magnetic nanoparticles that have not been taken up by the cells in the culture. This washing step is the same as the washing process in conventional biological assays using conventional cells. In other words, the magnetic nanoparticles present on the cell surface are removed from the cells by washing the cells with an appropriate buffer. By this washing step, the magnetic nanoparticles present in the culture remain only those which have been absorbed by the cells.
본 발명은 또한, 상기 세포 배양물에 자기장을 인가하여 상기 배양물 중의 세포에서 자성 나노입자의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 자기장은 종래 알려진 통상의 자기장 발생 수단에 의하여 인가될 수 있다. 자기장이 세포 배양물 중의 각 세포 부분 (part)에 인가되는 경우, 세포 내에 흡수된 자성 나노입자의 양에 따라 그로부터 측정되는 자기장 및 자기력 등의 자기적 특성에 차이가 발생하게 된다. 이러한 자기 특성의 차이로부터 자성 나노입자가 흡수되어 있는 살아 있는 세포와 그렇지 않은 죽은 세포 또는 활성이 없는 세포를 분별할 수 있다. 자기장이 세포에 인가되고 그로부터 다시 방출되는 자기적 특성은 종래 알려진 임의의 자기 특성 검출기에 의하여 측정될 수 있다. 상기 자성 나노입자의 존재 여부는 자기저항 센서 예를 들면, GMR (거대 자기저항), MFM (자력 현미경), 마그네틱 이미지 센서, 소형화 실리콘 홀 센서 또는 평면 홀 효과 센서를 사용하여 검출할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. The present invention also includes applying a magnetic field to the cell culture to detect the presence of magnetic nanoparticles in the cells in the culture. The magnetic field can be applied by conventional magnetic field generating means known in the art. When a magnetic field is applied to each cell part in the cell culture, a difference occurs in magnetic properties such as magnetic field and magnetic force measured therefrom according to the amount of magnetic nanoparticles absorbed in the cell. From such a difference in magnetic properties, it is possible to distinguish between living cells in which magnetic nanoparticles are absorbed and dead or inactive cells. The magnetic property applied to the cell and released back from the cell can be measured by any magnetic property detector known in the art. The presence of the magnetic nanoparticles can be detected using a magnetoresistive sensor, for example, GMR (giant magnetoresistance), MFM (magnetic microscope), magnetic image sensor, miniaturized silicon Hall sensor or planar Hall effect sensor, but these It is not limited to the example.
본 발명의 방법은 또한, 배양물 중의 세포에 자성 나노입자가 존재하는 것으로 판명되는 경우에는, 상기 시험 물질이 세포에 치사적이지 않은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 세포와 시험 물질을 접촉시킨 후에, 세포가 자성 나노입자를 흡수할 수 있다는 것은 세포가 여전히 살아 있거나 활성이 있는 것으로 판단할 수 있다. 역으로, 세포와 시험 물질을 접촉시킨 후에, 세포가 자성 나노입자를 흡수할 수 없다는 것은 세포가 죽은 상태이거나 활성이 없는 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 시험 물질은 각각 독성 물질 또는 비독성 물질로 분류될 수 있다. The method may further comprise determining that the test substance is not lethal to the cell when it is determined that the magnetic nanoparticles are present in the cells in the culture. After contacting the cell with the test substance, it can be determined that the cell is still alive or active that the cell can absorb the magnetic nanoparticles. Conversely, after contacting a cell with a test substance, the cell's inability to absorb magnetic nanoparticles can be determined to be dead or inactive. Thus, the test substance may be classified as a toxic substance or a nontoxic substance, respectively.
이상과 같이 본 발명의 방법은 살아 있거나 활성이 있는 세포를 자성 나노입자를 이용하여 측정하기 때문에, 높은 민감도, 높은 정확도 및 높은 반복 재현성을 가지고 있다. As described above, the method of the present invention has high sensitivity, high accuracy, and high repetitive reproducibility because the cell is measured using magnetic nanoparticles.
본 발명은 또한, 세포에 시험 물질을 접촉시키고 배양하는 단계; 상기 배양물에 자성 나노입자를 첨가하고 배양하여 살아 있는 세포가 상기 자성 나노입자를 흡수하도록 하는 단계; 및 상기 세포 배양물에 자기장을 인가하여 상기 자성 나노입자를 포함하고 있는 살아 있는 세포만을 이동시켜 죽은 세포로부터 분리하는 단계를 포함하는, 자성 나노입자를 이용하여 살아 있는 세포를 분리하는 방법을 제공한다. The invention also includes contacting and culturing a test substance to a cell; Adding magnetic nanoparticles to the culture and culturing the living cells to absorb the magnetic nanoparticles; And applying a magnetic field to the cell culture to move only living cells containing the magnetic nanoparticles to separate them from dead cells, thereby providing a method for separating living cells using magnetic nanoparticles. .
본 발명의 방법에 있어서, 상기 배양하는 단계 및 상기 나노입자를 흡수시키는 단계는 상기한 바와 같다. In the method of the present invention, the step of culturing and the step of absorbing the nanoparticles are as described above.
본 발명의 방법은 나노입자를 흡수한 세포를 포함하는 세포 배양물에 자기장을 인가하여 상기 자성 나노입자를 포함하고 있는 살아 있는 세포만을 이동시켜 죽은 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다. 상기 세포는 부유성 세포, 부착성 세포 및 이들 모두의 성질을 가진 세포 모두가 포함된다. 부유성 세포란 세포 배지 중에 부유하여 성장하는 세포를 말하는 것으로, 별도의 처리없이 배양물 자체에 자기장을 인가함으로써 세포 중에 포함되어 있는 나노입자가 자기력을 받도록 하고, 그 자기력에 의하여 상기 자성 나노입자를 포함하고 있는 세포 자체가 이동되도록 함으로써, 상기 자성 나노입자를 포함하고 있는 세포를 상기 나노입자로부터 분리할 수 있다. 부착성 세포란 세포의 성장에 있어서 고체 기판과 같은 고체 기저 물질을 필요로 하는 세포를 말한다. 세포가 자성 나노입자를 포함하고 있다 하더라고 고체 기질에 자기력에 의하여 이동되지 않을 정도로 강하게 부착되어 있는 경우에는, 자기장을 인가하기 전에 상기 세포를 고체 기판으로부터 이탈시킬 수 있다. 세포의 이탈은 트립신과 같은 효소 또는 다른 화학적 또는 물리적 방법이 사용될 수 있다. The method includes applying a magnetic field to a cell culture containing cells that have absorbed nanoparticles to move only live cells containing the magnetic nanoparticles to separate them from dead cells. Such cells include both floating cells, adherent cells, and cells having properties of both. Floating cells are cells that float and grow in a cell medium. The nanoparticles contained in the cells receive a magnetic force by applying a magnetic field to the culture itself without any treatment, and the magnetic nanoparticles are separated by the magnetic force. By allowing the containing cells themselves to migrate, the cells containing the magnetic nanoparticles can be separated from the nanoparticles. Adherent cells are cells that require a solid base material, such as a solid substrate, for cell growth. Even if a cell contains magnetic nanoparticles and is strongly attached to the solid substrate so as not to be moved by magnetic force, the cell can be detached from the solid substrate before the magnetic field is applied. Departure of the cells may be by enzymes such as trypsin or other chemical or physical methods.
따라서, 본 발명의 방법은 상기 세포가 부착성 세포인 경우, 상기 세포 분리 단계 전에 세포를 배양기 표면으로 세포를 떼어내는 단계를 더 포함할 수 있다. Thus, the method of the present invention may further comprise the step of detaching the cells to the incubator surface before the cell separation step, if the cells are adherent cells.
본 발명은 또한, 세포를 자성 나노입자와 접촉시켜 살아 있는 세포가 상기 자성 나노입자를 흡수하도록 하는 단계; 및 The invention also provides a method comprising the steps of contacting a cell with magnetic nanoparticles to allow live cells to absorb the magnetic nanoparticles; And
상기 개체에 자기장을 인가하여 개체 중에서 상기 자성 나노입자의 존재 위치를 모니터링하는 단계를 포함하는, 자성 나노입자를 이용하여 그를 포함하는 세포의 개체 내에서의 위치를 모니터링하는 방법을 제공한다. Applying a magnetic field to the subject to monitor the presence of the magnetic nanoparticles in the subject, using a magnetic nanoparticles to provide a method for monitoring the position within the subject of a cell comprising the same.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 인 비트로 또는 인 비보의 세포일 수 있다. 인 비트로 세포의 경우 예를 들면, 세포 배양물의 형태일 수 있으며, 인 비보 세포의 경우, 기관 및 조직 등의 형태일 수 있다. In the present invention, the cells may be cells in vitro or in vivo. In vitro cells may be, for example, in the form of cell cultures, and in vivo cells, in the form of organs and tissues, and the like.
또한, 상기 자성 나노입자는 마그네타이트, 마그헤마이트, 소프트페로마그네틱 비드, 코발트 및 구리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 그 크기는 5 내지 500nm의 직경을 갖는 것이 바람직하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 자성 나노입자는 그 자체로서 세포 유해하지 않은 재질로 구성되거나, 예를 들면 페루카보트란 및 페룸옥사이드와 같은 물질로 코팅되어 있는 것일 수 있다. In addition, the magnetic nanoparticles may be selected from the group consisting of magnetite, maghemite, soft ferromagnetic beads, cobalt and copper, the size is preferably having a diameter of 5 to 500nm, but is limited to these examples It is not. The magnetic nanoparticles may be composed of a material which is not cytotoxic to itself, or may be coated with a material such as, for example, perucarbotran and ferrum oxide.
본 발명에 있어서, 상기 개체는 인간을 포함한 동물 및 식물이 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다. 개체 중에서의 상기 자성 나노입자의 위치는 GMR (거대 자기저항) 또는 MFM (자력 현미경)을 사용하여 자기장과 같은 자기적 신호를 검출함으로써 달성될 수 있다. In the present invention, the subject includes, but is not limited to, animals and plants, including humans. The location of the magnetic nanoparticles in the subject can be achieved by detecting magnetic signals such as magnetic fields using GMR (giant magnetoresistance) or MFM (magnetic microscope).
본 발명에 있어서, 상기 세포와 자성 나노입자의 접촉이 인 비트로에서 이루어지는 경우에는, 상기 자성 나노입자를 포함하는 세포를 개체에 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.In the present invention, when the contact between the cell and the magnetic nanoparticles are made in vitro, it may further comprise the step of administering a cell containing the magnetic nanoparticles to the individual.
본 발명의 방법은, 세포 내에서의 자성 나노입자의 존재 위치를 검출함으로써 자성 나노입자의 흡수가 일어나는 정도를 모니터링할 수 있고, 그에 따라 세포 활성이 높은 영역과 그렇지 못한 영역을 구분할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 개체 중의 특정한 질병 예를 들면, 암 등을 검출할 수 있다. The method of the present invention can monitor the extent to which magnetic nanoparticles take up by detecting the location of magnetic nanoparticles in the cell, thereby distinguishing between regions of high cellular activity and those not. Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to detect a particular disease in an individual, for example, cancer.
본 발명은 또한, 세포 배양 용기; 상기 세포 배양 용기에 시험 물질 또는 자성 나노입자를 제공하기 위한 수단; 상기 세포 배양 용기에 자기장을 인가할 수 있도록 배치되어 있는 자기장 발생부; 및 상기 세포 배양 용기에 인가된 자기장을 검출하기 위한 검출부를 포함하는, 자성 나노입자를 이용하여 살아 있는 세포의 존재 여부를 검출하기 위한 장치를 제공한다. The invention also provides a cell culture vessel; Means for providing a test substance or magnetic nanoparticles to the cell culture vessel; A magnetic field generator arranged to apply a magnetic field to the cell culture vessel; And it provides a device for detecting the presence of live cells using magnetic nanoparticles, including a detection unit for detecting a magnetic field applied to the cell culture vessel.
상기 세포 배양 용기는 다중웰을 포함하는 다중웰 플레이트 등이 될 수 있다. 상기 세포 배양 용기에 시험 물질 또는 자성 나노입자를 제공하기 위한 수단은 상기 시험 물질 또는 자성 나노입자를 수용하는 용기 또는 상기 물질이 도입될 수 있도록 하는 유입구 등이 될 수 있다. 상기 자성 나노입자는 자성을 가지고 있으며, 세포에 독성을 주지 않고, 엔도사이토시스 (endocytosis) 등에 의하여 세포에 의하여 용이하게 흡수될 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 자성 입자는 예를 들면, 수퍼파라마그네틱 철 옥사이드 나노입자 (superparamagnetic iron oxide nanoparticles: SPION), 마그네타이트, 마그헤마이트, 소프트페로마그네틱 비드, 코발트 및 구리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 자성 나노입자는 그 자체가 세포 유해하지 않은 재질로 구성되거나, 페루카보트란 및 페룸옥사이드 등과 물질로 코팅되어 세포에 유해하지 않게 것이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 자성 나노입자에는 풀루란 코팅된 자성 나노입자와 같이 특정한 물질로 코팅되거나 변형된 자성 나노입자가 포함된다. 상기 자성 나노입자의 크기는 세포에 의하여 용이하게 흡수될 수 있는 크기이면, 특별한 차원의 크기에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 나노 수준의 입자, 더욱 바람직하게는 1 내지 1000nm, 가장 바람직하게는 5 내지 500 nm의 직경을 갖는 것이다. The cell culture vessel may be a multiwell plate or the like including a multiwell. Means for providing a test substance or magnetic nanoparticles to the cell culture vessel may be a container containing the test substance or magnetic nanoparticles or an inlet for introducing the substance. The magnetic nanoparticles include any magnet as long as the magnetic nanoparticles are magnetic and can be easily absorbed by cells by endocytosis or the like without causing toxicity to the cells. The magnetic particles may be selected from, for example, superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION), magnetite, maghemite, soft ferromagnetic beads, cobalt and copper. The magnetic nanoparticles may be composed of a material which is not cytotoxic to itself, or coated with a material such as perucarbotran and ferumoxide, and the like, so as not to be harmful to cells, but is not limited thereto. In addition, the magnetic nanoparticles include magnetic nanoparticles coated or modified with a specific material, such as pullulan-coated magnetic nanoparticles. The size of the magnetic nanoparticles is not limited to the size of a particular dimension as long as the size of the magnetic nanoparticles can be easily absorbed by the cells, preferably nano-level particles, more preferably 1 to 1000nm, most preferably 5 To 500 nm in diameter.
상기 자기장 발생부는 영구 자석 또는 전자석 등의 종래 알려진 임의의 자기장 발생 수단이 될 수 있다. 또한, 상기 자기장 검출부는 자기저항 (magneto resitance) 센서 등이 사용될 수 있다. 예를 들면, 자성 나노입자의 존재 여부는 GMR (거대 자기저항), MFM (자력 현미경), 마그네틱 이미지 센서, 소형화 실리콘 홀 센서 또는 평면 홀 효과 센서가 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.The magnetic field generating portion may be any magnetic field generating means known in the art such as a permanent magnet or an electromagnet. In addition, the magnetic field detection unit may be a magnetoresistance sensor or the like. For example, the presence or absence of magnetic nanoparticles may include, but are not limited to, GMR (giant magnetoresistance), MFM (magnetic microscope), magnetic image sensor, miniaturized silicon Hall sensor, or planar Hall effect sensor.
본 발명에 따른 장치는, 자기장을 신호로서 이용하기 때문에 형광 표지 또는 효소 반응에 의하여 발생하는 발색 물질로부터 발생하는 신호를 검출하는 것에 비하여 민감도가 높다. 따라서, 본 발명의 장치 중의 세포 배양 용기는 소형화가 용이하고 고밀도로 배치될 수 있다. 상기 세포 배양용기는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 마이크로어레이와 같이 나노미터 또는 마이크로미터 수준에서 어레이 방식으로 고밀도로 배열되어 있는 것이다. 구체적으로, 상기 세포 배양 용기는 고체 기판 상에 넓이가 0.1μm2 내지 200μm2인 세포 배양용 웰이 배열되어 있는 것일 수 있다. 이와 같이 본원의 장치 중의 배양 용기가 소형화되고 고밀도 배열될 수 있는 것은 검출 장치로서 자기적 특성을 검출하는 장치를 이용함으로써 고감도 검출이 가능하기 때문이다. Since the apparatus according to the present invention uses a magnetic field as a signal, the sensitivity is higher than that of detecting a signal generated from a fluorescent substance or a chromophore generated by an enzymatic reaction. Therefore, the cell culture vessel in the apparatus of the present invention can be easily downsized and can be arranged at high density. The cell culture vessels are densely arranged in an array manner at the nanometer or micrometer level, such as polynucleotide or protein microarrays. Specifically, the cell culture vessel may be a cell culture well having a width of 0.1μm 2 to 200μm 2 is arranged on a solid substrate. Thus, the culture vessel in the apparatus of the present application can be miniaturized and arranged in high density because high sensitivity detection is possible by using an apparatus for detecting magnetic characteristics as a detection apparatus.
도 1은 본 발명의 장치의 일 예를 이용하여 산 세포의 존재 여부를 검출하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.1 is a diagram illustrating a process of detecting the presence of acid cells using an example of the device of the present invention.
먼저, 본 발명의 장치의 일 예는 세포 배양 용기로서 다중웰을 포함하는 어레이 시스템, 시험 물질 주입 수단, 자기장 발생부 (도시되지 않음) 및 검출부로서 자기저항 센서를 포함하고 있다. 상기 자기저항 센서에는 GMR (거대 자기저항) 또는 MFM (자력 현미경)이 포함될 수 있다.First, one example of the apparatus of the present invention includes an array system including multiple wells as a cell culture vessel, a test material injection means, a magnetic field generator (not shown), and a magnetoresistive sensor as a detector. The magnetoresistive sensor may include GMR (giant magnetoresistance) or MFM (magnet microscope).
본 발명의 방법에 따른 살아 있는 세포의 존재 여부의 검출은, 먼저 세포를 마이크로어레이 시스템 상의 마이크로웰에서 배양하고, 여기에 각각의 시험 물질을 각 웰에 첨가하여 세포가 상기 시험 물질을 흡수하여 대사하도록 한다. 다음으로, 상기 배양물에 자성 나노입자를 첨가하고 배양하여 자성 나노입자가 세포의 상태에 따라 흡수 또는 흡수되지 않도록 한다. 이때 살아 있는 세포는 자성 나노입자를 흡수하고, 죽은 세포는 흡수하지 않는다. 다음으로, 세포의 표면을 세척함으로써, 흡수되지 않고 용액 중 또는 세포 표면에 존재하는 자성 나노입자를 제거한다. 다음으로, 자기장 발생부를 통하여 자기장을 상기 웰에 인가하고, 자기저항 센서를 이용하여 자기장의 정도를 측정한다. 이렇게 함으로써, 자성 나노입자가 흡수된 살아 있는 세포가 존재하는 웰로부터 특이적인 신호를 얻음으로써, 살아 있는 세포의 존재를 검출할 수 있다. Detection of the presence of viable cells according to the method of the present invention involves first culturing the cells in a microwell on a microarray system, where each test substance is added to each well so that the cells absorb the test substance and metabolize it. Do it. Next, the magnetic nanoparticles are added to the culture and cultured so that the magnetic nanoparticles are not absorbed or absorbed depending on the state of the cells. Living cells absorb magnetic nanoparticles and do not absorb dead cells. Next, the surface of the cells is washed to remove magnetic nanoparticles that are not absorbed and present in solution or on the surface of the cells. Next, a magnetic field is applied to the well through the magnetic field generating unit, and the degree of the magnetic field is measured using a magnetoresistive sensor. In this way, the presence of viable cells can be detected by obtaining a specific signal from a well in which viable cells in which magnetic nanoparticles are absorbed are present.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 시험 물질과 접촉된 후 특정한 세포가 여전히 살아 있거나 활성이 있는지 여부를 높은 민감도, 높은 정확도 및 반복적으로 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 신약 개발의 초기에서 약물 표적을 발굴하는 과정, 전임상 단계에서 약물 반응을 스크리닝하는 과정 및 임상1기에서 약물의 안정성을 효과적으로 검사하는데 유용하게 이용될 수 있다. According to the detection method of the present invention, high sensitivity, high accuracy and repeatability can be determined whether a particular cell is still alive or active after being contacted with a test substance. Therefore, the method of the present invention can be usefully used to effectively detect the drug target in the early stage of drug development, screen the drug response in the preclinical stage, and effectively test the stability of the drug in the first phase.
본 발명의 살아 있는 세포를 분리하는 방법에 의하면, 살아 있는 세포를 죽은 세포로부터 간단하고 신속하게 분리할 수 있다. 따라서, 살아 있는 세포의 검출과정 및 살아 있는 세포를 죽은 세포로부터 분리하는 단계를 동시 또는 순차적으로 진행할 수 있다. 따라서, 특정 시험 물질의 생물학적 활성을 용이하게 분석할 수 있다. According to the method for separating living cells of the present invention, the living cells can be easily and quickly separated from dead cells. Therefore, the detection process of living cells and the step of separating living cells from dead cells can be carried out simultaneously or sequentially. Thus, the biological activity of certain test substances can be easily analyzed.
본 발명의 장치에 의하면, 시험 물질과 접촉된 후 특정한 세포가 여전히 살 아 있거나 활성이 있는지 여부를 효율적으로 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 장치는 카메라 및/또는 형광 측정 장치와 같은 큰 장비를 필요로 하지 않기 때문에 고집적화 및/또는 소형화된 고성능 (HTS: High throughput screening) 장치를 제작할 수 있다. According to the device of the present invention, it is possible to efficiently measure whether a particular cell is still alive or active after being contacted with a test substance. In addition, the device of the present invention does not require large equipment such as cameras and / or fluorescence measurement devices, so that high throughput and miniaturized high throughput screening (HTS) devices can be fabricated.
본 발명의 방법에 의하면, 세포 내에서의 자성 나노입자의 존재 위치를 검출함으로써 자성 나노입자의 흡수가 일어나는 정도를 모니터링할 수 있고, 그에 따라 세포 활성이 높은 영역과 그렇지 못한 영역을 구분할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 개체 중의 특정한 질병 예를 들면, 암 등을 검출할 수 있다. According to the method of the present invention, by detecting the position of the magnetic nanoparticles in the cell, it is possible to monitor the extent of the absorption of the magnetic nanoparticles, thereby distinguishing the region with high cellular activity from the region with which it is not. Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to detect a particular disease in an individual, for example, cancer.
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