KR20060124654A - 방법 - Google Patents

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KR20060124654A
KR20060124654A KR1020067012067A KR20067012067A KR20060124654A KR 20060124654 A KR20060124654 A KR 20060124654A KR 1020067012067 A KR1020067012067 A KR 1020067012067A KR 20067012067 A KR20067012067 A KR 20067012067A KR 20060124654 A KR20060124654 A KR 20060124654A
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stem cells
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magnetizable
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존 도슨
알리시아 엘하요
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킬레유니버시티
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Abstract

줄기세포를 원격 방식으로 자기적으로 조작할 수 있는 줄기세포들을 선택적으로 활성화 그리고/또는 표적화하는 방법이 제공된다. 이 방법은 자화가능한 입자를 줄기세포와 결합하는 것에 의해서 생체내 또는 생체외 방식으로 줄기세포를 자기적으로 조작하는 것을 포함한다.

Description

방법{METHOD}
본 발명은 줄기세포들(stem cells)을 생체내 또는 생체외에서 자기(磁氣)로 조작하는 새로운 방법과 이와 관련된 치료 방법에 관련된 것이다.
세포 기반(cell-based) 치료법들에서 줄기세포들을 사용하는 것은 현재 질병 치료 및 회복 의약 분야에서 가장 전도유망한 분야들 중의 하나이다. 분열 증식(proliferation)과 배아 줄기세포 및 성체 줄기세포 등의 분화(differentiation)를 제어할 수 있는 방법들에 대한 기본 연구는 매우 중요하다.
미국 특허공보 제6,548,264호는 자기(磁氣) 금속 코어(core)를 포함하는 이산화규소(실리카)가 코팅된 나노입자들을 개시한다. 상기 입자들 내의 자기 코어는 상기 입자들이 자기장에 응답할 수 있게 한다. 따라서, 상기 입자들은 진단, 화상진찰, 및 기록(녹음, 녹화) 시스템에 적합하게 사용된다. 그러나 종래 기술의 나노입자들은 셀 수준(cellular level)에서의 활성화(activation) 방법을 정의하지 못하는 단점을 갖는다.
자기 구슬 뒤틀림 세포분석(MBTC:magnetic bead twisting cytometry)이 단일 세포들의 역학적(mechanical) 특성들을 정의하고, 막투과성(transmembrane) 세포 유착 분자들(cell adhesion molecules), 예를 들어 인테그린(integrins)을 통해서 외부 역학적인 힘이 세포 표면을 가로질러서 세포골격을 통과할 수 있다는 것을 입증하는 데 사용되어져 왔다. 이에 대해서는 예를 들어, Biochem. Cell Biol. 73: 327-335에 기재된 Wang, N and Ingberger, DE(1955)에 의한 '자기 뒤틀림 세포분석을 이용한 막투과성 역학적 결합 및 세포기계학(cytomechnics) 탐침'을 참조할 수 있다.
보건의료분야4-6에서, 생물친화적 자기 나노입자들 합성, 특징 묘사1-3, 그리고 새로운 자기 기술들의 응용면에서 많은 발전들이 있었다. 이러한 연구는 주로 통제되고 규제된 약의 운반을 조사하는 것을 포함한다. 이 시스템에서 치료를 위한 약 또는 유전자가 자기(磁氣) 운반체(carrier) 입자들 (일반적으로 고분자가 코팅된 자철광(마그네타이트))에 꼬리표로 부착될 수 있고(tagged), 상기 자기 운반체 입자들은 공간적으로 집중된 고경사 자기장(high gradient magnetic field)을 통해 생체내 목표 지점(target site)에 모일 수 있다. 약/운반체 복합체들이 일단 목표 지점에 축적되면, 약은 방출되고 그 지점에서의 섭취(uptake)는 증대된다. 이론적, 실험적 조사와 생체내(in vivo) 및 생체외(in vitro)4,6 모델 시스템에서 자기 마이크로 및 나노입자 운반체들의 침적을 향상시키기 위한 방법뿐만 아니라, 유전자 치료를 위한 자기 표적화(magnetic targeting)를 위한 새로운 방법들이 연구되고 있다.
토크(torque)를 사용하여 힘을 세포막에 적용하거나, RGD 또는 아교질(collagen) 분자들과 같은 막투과성 단백질들에 장력(tension)을 적용하는 단 기(short term) 실험들이 많은 연구자들7,8에 의해 보고되고 있다. 이러한 실험들에서 다양한 세포들에 단기 내부 칼슘 플럭스(flux)를 유발하는 '역학적' 자극이 사용된다. 다른 기술을 사용하는 역학적 시그널링(signalling)은 골수 기질 세포들(bone marrow stromal cells) 내에 뼈발생성 계통(osteogenic lineage)11 을 따라 분화 경로들(pathway)을 유발할 수 있다고 알려져 있다. 특히, 세포막에 대한 낮은 수준의 역학 신호는 뼈모세포성(osteoblastic) 특이 전사 인자들(transcription factors)인 cbfal 과 cfos12,13의 형질 발현(expression) 및 DNA 결합 활동을 상승-조정(up-regulation)할 수 있다.
상기 연구들에 있어서, 힘이 여러 다른 꼬리표 부착(tagged) 수용체들(receptors)에 적용될 수 있다. 어떻게 다운스트림 프로세스(downstream process)에 영향을 줄 수 있고, 아교질과 다른 기질단백질 합성15을 증대시킬 수 있는지 증명되어져 왔다. 본 발명자들은 뼈발생성(osteogenic) 및 연골발생성(chondrogenic) 계통으로의 분화가 조건지워진 중간엽 줄기세포들(mesenchymal stem cells)에서 추출된 골수를 사용하여 특이 수용체들의 자기 입자 활성화에 응답하는 다운스트림 유전자 조절을 연구하였다. 초기 데이터는 인간의 중간엽 줄기세포들 내에서 칼슘 통로들(channels)의 자기 입자 자극에 응답하여 Runx 2에서 상승-조정 및 뒤따라 발생하는 역학감각적 기질단백질인 오스테오폰틴(osteopontin)의 상승-조정을 보여주었다. 이에 더하여, 인간의 분화된 단일막(monolayer) 연골 세포(chondrocytes)의 자극 후에 SOX 9의 상승-조절을 본 발명자들은 입증하였다. 이러한 연구들은 생체외 방식의 조직 공학(tissue engineering)에서 구성체 제작을 위한 이러한 전략들의 유용성을 조사하기 위한 장기간 배양에 걸친 세포씨앗뼈대(cell-seeded scaffolds)의 3D 분석으로 확대되었다. 또한, 입자수 및 적용된 힘의 용량-반응(dose-response) 분석을 포함하는 초기 연구들은 고무적이었으며, 이 연구들에서 기질 합성과 뼈발생성 표현형(osteogenic phenotype)14의 형질발현이 증가한 것을 확인하였다.
골수는 특히, 섬유모세포성 세포(fibroblastic cell), 뼈발생성 세포(osteogenic cell), 지방 세포성 세포(adipogenic cell), 및 그물 세포(reticular cell)로 분화될 수 있는 다계열 가능성(multipotential) 기질 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포를 포함한다. 인간의 골수 기질 섬유모세포와 같은 이러한 중간엽 줄기세포들은 자발적 공여체(volunteer donors)로부터 분리될 수 있고, 그들의 다계통(지방 세포성(adipocytic), 연골발생성(chondrogenic), 뼈모세포성(osteoblastic)) 가능성(multilineage potential)을 보유할 수 있다. 상술한 세포의 사용 및 조작에서의 장점은 특히, 연골 조직 및 뼈 치료에서 이러한 세포들의 사용을 위한 가능성을 제공하는 면역기제의 결핍에 있다.
공개되지 않았으며 현재 계류중인 우리의 또 다른 국제 특허 출원(출원 번호 PCT/GB2003/002624)은 자기 나노입자 접근법을 역학감각적 이온 통로(mechanosensitive ion channels), 특히 TREK K+ 통로에 관한 지식과 결합시킨 다. TREK 통로는 뼈모세포성, 연골발생성, 및 골수 기질 세포들에 존재하는 것으로 입증되었다. 특이 수용체들의 표적화(targeting)를 더욱 면밀하게 정의하기 위해서 HIS-tag가 부착된 TREK 유전자의 클론(clones)이 사용되었다. HIS 꼬리표(태그)들은 HIS 항체 또는 NI2+ 가 결합한 자기 입자가 부착하도록 TREK 분자의 특정 영역에 삽입되었는데, 이 입자들은 자기장을 사용하는 원격 조작의 토크들이 될 수 있다. 세포막의 내부 및 외부 모두에 있는 이온 통로 단밸질이 차지하고 있는 위치들(sites)은 꼬리표가 붙여졌으며(tagged), 이러한 방법으로 다운스트림 프로세스를 스위치 하는데 필요한 신호 주파수를 정의할 뿐만 아니라, 분자의 역학감각적 영역을 식별할 수 있다. 도 2는 HIS 태그가 장착된 TREK 통로에 부착된 자기 나노입자들에 자기장을 적용한 결과로서 상승-조정된 내부 칼슘 수준을 갖는 골수 기질 세포들을 사용한 실험 결과들을 보여준다.
특히, 시험관 내 2D 단일막 배양(monolayer cultures) 및 3D 세포 씨앗 뼈대에 자기력을 적용할 수 있는 자기력 생물 반응기(bioreactor)의 발달로 생체외 결합 조직 세포들을 조절하는 것이 확인되었다.
그러나 미국 특허공보 제6,548,264호와 왕(Wang)은 임상 사용을 위한 세포 공학의 궁극적 목적을 둘러싸고 있는 다음 두 개의 기본적인 질문과 관련된 문제점들을 해결하지 못한다.
(ⅰ) 세포들을 어떻게 치료 위치로 향하게 할 수 있으며, 그 위치에서 어떻게 유지할 수 있는가?
(ⅱ) 줄기세포와 같은 세포들은 생체외 그리고/또는 생체내에서 어떻게 조절되고, 분화되는가?
놀랍게도 우리 발명자들은 자기 나노입자들 꼬리표가 붙은(tagged) 줄기세포들이 외부의 자기 조작에 의해 특정 치료 위치로 전달되거나 그 위치에서 유지될 수 있는 방법들을 알아냈다. 이에 더하여, 우리는 이 개념들을, 본질적으로 줄기세포와 같은 세포들을 소정 위치에 배치하는 것을 포함하는 특이 세포막 수용체들의 원격 활성화를 포함하는 데까지 계발시켰다. 간단하게, 이것은 위치에서, 예를 들어 치료 위치에서 줄기세포들을 침적시키고, 그 위치에서 상기 세포들을 유지하고, 환자 생체내 그 위치(in-situ)에서 세포들을 원격으로 활성화하는 것을 포함한다.
특히, 본 발명은 줄기세포에서 막투과성 이온 통로들의 원격 활성화를 위하여 세포들 상의 특이 수용체들을 표적화하는 방법들을 제공한다. 자기 나노입자 기반 기술들이 임상적으로 많은 보건 의료 분야, 예를 들의 MRI의 콘트라스트(contrast) 증가를 위해 사용되고 있다.
본 발명에서, 우리는 이러한 세포 형태들의 분화 초기 단계들을 획득할 수 있다. 이에 더하여, 획득된 분화는 인체내 원격 표적화 그리고/또는 국부적인 특정 위치에서 활성화를 가능하게 하는 결합(binding) 전략 모델로서 작용한다.
따라서, 본 발명은 K+ 통로(TREK), 칼슘 통로와 같은 역학적으로 활성화된(mecahno-activated) 이온 통로, 인테그린(integrins), 및 RGD와 같은 표면 세포막 결합 자리(binding site)와 같이 인간의 골수 줄기세포 내에 존재하는 다양한 줄기세포 수용체 유형들의 표적화를 가능하게 한다. 상기 수용체들은 원격 활성화를 위한 잠재력을 갖는다. Runx2 및 Osx(Osterix)와 같은 다운스트림 전사인자를 활성화시키고, 줄기세포 분화에 중요한 외부 성장 인자들(예컨대, TGFB와 BMP2)과 같은 다른 수용체들의 표적화도 또한 획득될 수 있다.
따라서, 본 발명은 특히, 인간의 중간엽 줄기세포들의 손상 및 치료 위치에서 줄기세포에 대한 장기(長期) 생물학적 효과들을 갖는 진정한 생착(engraftment)의 기회를 제공한다. 또한, 이러한 세포들을 선택, 확장하고 분화시키며, 자기 나노입자들을 사용하여 세포들을 표적화하는 능력이 특히 유익하다. 또한, 본 발명의 이용(utilisation)은 특히 유전자 치료 및 조직 공학에서 치료상 사후효과(implication)를 제공한다.
주로 실리카(silica), 덱스트란(dextran), 또는 PVA로 코팅된 자철광(마그네타이트:Fe3O4) 및/또는 마그헤마이트(Fe2O3) 코어를 포함하는 생물친화적 자기 나노입자들은 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 입자들은 다음과 같은 방법으로 합성될 수 있다. 그러나 다른 자기 나노입자들도 사용될 수 있다. 입자 크기는 10나노미터 ~ 수 마이크로미터(예컨대, 1~10마이크로미터) 일 수 있다. 변화하는 표면의 화학적 성질을 가지는, 상업적으로 입수가능한, 자기 마이크로 및 나노입자들이 또한 사용될 수 있다. 상기 코팅은 기능적으로 이루어질 수 있고, 상술한 것들과 같은 세포막 부착 모티브(motifs)에 교차결합될 수 있다. 자기 나노입자들은 적절히 변경될 수 있는 데, 특히 입자 내재화 주파수 및 결합 효율을 적절히 맞출 수 있도록(customise) 변경될 수 있고, 안정성은 세포 생존 능력 및 기능에 관한 결합 효과로서 검사될 것이다. 변경은 또한 외부 세포막 위치들뿐만 아니라, 내부 결합 위치(binding site)들의 맞춤 제작(customisation)을 포함할 수 있다. 다양한 코팅들이 인간의 뼈모세포14,15 에서 자기 나노입자 결합 및 로딩(loading)에 사용될 수 있고, 더 나아가 이러한 기술들이 줄기세포 결합, 전달, 및 활성화(예를 들어, 성체 일차 골수 인간 줄기세포 그리고/또는 인간 배아 줄기세포를 사용하는 것)에 대하여 최적화될 수 있다.
표적화
종래 알려진 고경사 자석(high gradient magnets), 예를 들어, 외부 희귀 토류(external rare earth)(주로 NdFeB), 고경사 자석은 생체외 테스트 시스템 내에서 그리고/또는 생체내 방식에서 특정 위치로 줄기세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일면은 줄기세포를 생체내에서 표적화하는 것이다. 상기 자석은 세포에 로딩되는 자기 입자들에 병진력(translational force)을 작용하고, 이들을 다음 식에 따라 표적 위치에서 유지할 수 있는 높은 장(field)/경사(gradient) 산물을 만든다.
수식
Fmag = (X2-X1)(V/μ0)B(▽B)
활성화
원격 역학적 활성화는 예컨대, 자기 조절(magnetic conditioning) 생물 반응기(bioreactor)를 사용하여 달성될 수 있다. 상기 생물 반응기는 다중-웰(multi-well) 2D 시스템 내에서 생체외 배양된 세포에 또는 생체내 3D 뼈대 기반 시스템(scaffold-based system)에 배양된 세포에 부착된 자기입자들에 힘이 적용될 수 있게 한다. 줄기세포, 예를 들어, 중간엽 줄기세포와 이로부터 발생된 개체군들(populations), 예를 들어, 뼈발생성, 연골발생성, 및 지방발생성 개체군들은 예를 들어, 알려진 표준 프로토콜들을 사용하여 STRO-1과 같은 단일 클론의 항체를 갖는 자기 활성화된 세포 소팅(MACS: magnetic activated cell sorting)을 사용하여 분리될 수 있다. 상기 프로토콜들은 단일막에서 BMSc 배양으로 알려지고 폴리라틱산(PLLC: poly lactic acid) 또는 아교질 젤들과 같은 생물분해성이 있는 중합체들을 포함하는 3D 뼈대를 사용하는 것들을 포함한다.
우리는 세포가 원격적 방법으로 역학적으로 조작될 수 있게 하는 줄기세포의 선택적인 활성화 그리고/또는 표적화의 방법을 알아냈다.
"원격적 방법"이라는 용어는 예를 들어 비접촉식 방법 및 생체내 방식에서는 신체 외부로부터 특이적으로 활성화/표적화가 이루어지는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따르면, 자기 입자를 줄기세포와 결합시키는 것을 포함하는 생체내 또는 생체외 줄기세포를 자기적으로 조작할 수 있는 방법을 제공한다.
상기 방법은 생체내 프로세스의 생체외 조작을 포함할 수 있다. 더 나아가서, 세포라는 언급을 할 때, 이는 다수의 세포들을 포함하는 것으로 해석되어야 하 는 것은 당업자에게 이해되는 사항이다.
더 구체적으로, 본 발명은 상술한 바와 같이 줄기세포를 갖는 자기 입자의 활성화 그리고/또는 표적화를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 자기 입자를 세포와 결합시키는 것을 포함하며 줄기세포를 자기적으로 조작할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 방법은 자기 입자를 세포와 결합시키는 것에 의해 세포 내에 이온 통로들에 대한 작용 작동(agonising) 또는 대항 작동(antagonising)을 포함한다.
본 발명에서, 상기 방법은 분화단계를 포함한다.
본 발명에서, 자기 입자는 직접 세포와 결합될 수 있다. 또는, 상기 방법은 자기 입자를 항체, 효소 등과 결합시키는 것을 포함할 수 있다.
자기 입자를 세포와 결합시키는 것은 세포속으로 상기 입자를 도입하는 것, 세포(예컨대, 세포의 내부 또는 외부)에 상기 입자를 부착하는 것, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 자기 입자들은 세포 내부 또는 외부에 결합하거나 세포 내부 및 외부 모두에 결합할 수 있다. 그러나 상기 입자들은 세포 내부에 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법이 내부 결합을 포함할 때, 상기 방법은 내부 결합 위치(binding site)와의 결합(association)을 포함한다. TREK-1을 예로 들면, 상기 입자는 이온 통로의 N 말단 영역(N-terminus region)에 결합될 수 있다. 또는, 상기 입자는 이온 통로의 COOH 말단 영역에 결합될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 다양한 이온 통로와 결합 위치(binding site)가 사용될 수 있다. 따라서, TREK- 1에 나타나는 이온 통로의 N 말단 영역 또는 COOH 말단 영역에 대응하는 내부 결합 자리뿐만 아니라 다른 결합 자리도 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 역학감각적 이온 통로를 조작하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 자기 입자를 이온 통로와 직접적으로 또는 간접적으로 결합시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 포유류 세포 또는 박테리아 세포, 식물 세포 등과 같은 다른 형태의 세포를 조작하는 것을 포함한다. 그러나 본 발명에 따른 방법은 여기서 언급되지 않은 형태의 세포를 조작하는데도 사용될 수 있다. 이에 더하여, 상기 방법은 생체외 방법(in vitro method) 또는 생체내 방법(in vivo method)일 수 있지만, 생체내 방법이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법은 줄기세포의 역학적 조작에 응답하여 줄기세포에서 유전자 형질발현을 상승-조정하는 것 또는 하강-조정(down-regulation)하는 것을 포함한다. 유전자 형질발현 패턴 또는 수준(levels) 조작을 통하여 줄기세포는 특별한 분화 경로를 따르도록 유도될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 방법은 세포를 원격 조작하는 것 그리고/또는 이온 통로들에 대한 작용 작동(agonising) 또는 대항 작동(antagonising), 예를 들어, 원격 역학적 활성화와 같은 신체외부로부터 조작하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 다양한 세포들과 관련하여 사용될 수 있다. 그러나 바람직하게, 상기 방법은 포유류 줄기세포와 관련된 사용에 적절하다.
본 발명에 따른 방법은 종래 알려진 세포 내 이온 통로들과 연계하여 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 역학감각적 이온 통로에서의 사용에 적합하다. 상기 역학감각적 이온 통로는 많은 세포 형태에 존재하는 것으로 밝혀졌고, 칼슘 또는 칼륨 이온 통로와 관련하여 주로로 기술되어 왔다. 그러나 본 발명에 따른 방법에서는 칼슘 또는 칼륨 이온 통로와 관련된 사용에 한정되지 않는다. 일례로, 신경 세포(neuronal cells)에서 분자 수준 및 작용기 수준에서 특징지어진 통로는 염색체 유전자 TREK-1이다. 이는 2P K+ 통로군(channel family)의 일 부분이다. TREK-1 통로는 뼈 세포내에 존재하는 것으로 밝혀졌고, 지방산 및 전신 마취약(general anaesthetics)과 같은 다른 외부 인자뿐만 아니라, 전단응력(shear stress), 세포 종창(cell swelling), 및 세포막 신장(membrane stretch)에 응답하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 특징적인 면은 역학감각적 이온 통로를 조작하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 역학감각적 이온 통로는 다양한 포유류(예컨대, 인간) 및 박테리아 세포에 존재하고, 본 발명은 세포가 신체내 및/또는 세포 배양내에서 선택적으로 활성화될 수 있게 한다. 예를 들어, 소카베, 엠, 에프 삭스, 에이 징(1991) 에 의한 '패치 클램프된 세포막의 정량적인 비디오 현미경사용법'(Quantitative video microscopy of patch clamped membranes): 'Stress, strain, capacitance, and stretch channel activation'. 생물리학 제이 59: 722-728; 슈튜워트, 지, 비 마티낙 및 제이 돕슨(2000)에 의한 '향자기성 박테리아(magnetotatic bacteria)에서 작은 컨덕턴스의 역학감각적 세포막 안팎의 이온 채널의 증거'. 전자-자기생물 학(Electro- and Magnetbiol) 19: 81-89를 참고할 수 있다. 이러한 통로는 정상 세포의 작용기에 도움이 되고, 뼈 및 결합 조직 형성 또는 말초 신경 시스템의 활성화 등에서 중요한 역할을 수행하기 때문에, 이들을 원격으로, 예를 들어, 신체외부로부터, 조작할 수 있는 능력은 마취, 치료, 조직 공학, 암치료와 같은 고통 완화에 적용될 수 있는 장점을 갖는다.
본 발명에서, 상기 방법은 세포 내로의 이온 통로의 핵산전달감염(transfection)에 의해, 그렇지 않으면 비반응적인(non-responsive), 종래의 비역학감각적 세포(non mechanosensitive cells) 그리고/또는 이온 통로와 함께 사용하는 데에 적합하다.
모든 이온 통로는 힘에 반응하여 개폐되는 데(예컨대, 입체 형태(conformational state)가 변한다), 이거이 이온 통로 활성화의 숨은 원리이다. 역학감각적 이온 통로의 경우, 힘은 세포막 변형을 야기하고, 통로의 개방을 유도한다. 또, 전압-작동(voltage-gated) 및 리간드-작동(ligand-gated) 이온 통로는 쿨롱힘(전압-작동 채널의 경우) 및 결합 힘(리간드-작동 채널의 경우)에 의해 발생한 역학적 스트레스에 응답한다는 점에서 역학반응적(mechanoresponsive)이다. 모든 이온 통로는 상기 방법에 의해 활성화될 수 있다. 단, 자기 입자가 통로 단백질의 역학반응적 영역에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.
따라서, 본 발명에서, 이온 통로는 전압-작동 이온 통로일 수도 있고, 리간드-작동 이온 통로일 수도 있다.
다양한 입자들이 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법에서 사 용되는 자기 입자는 원래 자성을 가진 것일 수도 있고, 이와 달리 자기장 내에서 반응하는 것일 수도 있다. 일반적으로 어떠한 자기 물질도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자기 물질은 상자성(paramanetic), 초상자성(superparamagnetic), 강자성(ferromagnetic), 그리고/또는 반강자성(antiferromagnetic) 물질일 수 있다. 상기 자기 물질은 철 원소(Fe), 철염(iron salt)(예를 들어, 자철광(Fe3O4), 삼산화철(마그헤마이트:γFe2O3), 및 사황화염(그레이가이트:greigite, Fe3S4)과 같은 철 화합물, 크롬염(chromium salt)(예를 들어, 산화크롬(CrO2))과 같은 크롬 화합물, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 자기 물질은 생물친화적 코팅을 갖는 자기 코어를 포함하는 입자, 예컨대 나노입자를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 바람직한 입자는 나노입자이고, 특히 코어와 코어를 둘러싸는 실리카 껍질을 갖는 나노입자이다. 또한, 기공 내에 다중 자기 중심(multiple magnetic centres)을 갖는 다공성 입자일 수도 있다. 상기 입자의 일례가 참고문헌으로 인용된 미국 특허공보 제6,548,264호에 기재되어 있으며, 동 특허의 내용은 본 출원의 명세서에 포함된다. 이 특허에 개시된 나노입자는 1μm(마이크로미터)이하의 평균 크기를 가질 수 있고, 상기 나노입자는 (a)자화가능 입자(magnetisable material)를 포함하는 코어와, (b)상기 코어를 둘러싸는 실리카 껍질을 포함한다. 여기서 자화가능 입자는 자기 물질(magnetic material)이다.
마이크로 및 나노 입자(세포에 부착되도록 의도된)는 통상 본질적으로 구 또는 타원형이다. 입자의 크기는 자기 물질의 특성, 적용예 등에 따라 달라질 수 있 다. 그러나, 상기 입자의 일례는 5000nm 이하, 예를 들어, 1~5000nm, 바람직하게는 1~1000nm, 더욱 바람직하게는 1~300nm 또는 2~10nm의 직경을 갖는 평균크기를 갖는 나노입자일 수 있다.
세포에 부착을 위한 입자는 코팅 또는 코팅이 안 될 수 있고, 단일 영역(domain) 또는 다중 영역일 수 있다. 적절한 입자는 (ⅰ) 스피어테크(Spheretech, Inc)로부터 구할 수 있는 코팅된 자기 마이크로구(microspheres)(d=4μm)(이 마이크로구는 중합체로 코팅되고, 자기적으로 봉쇄된 코어를 포함한다)와 (ⅱ) 조정될 수 있는 크기(d=50~300nm)와 좁은 크기 분포를 갖는 단일 영역의 페라이트가 주입된 실리카(ferrite-doped silica) 나노입자를 포함한다. 그러나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에서, 이온 통로는 세포막의 특정 영역 그리고/또는 이온 채널 자체의 특이 수용체에 위에서 언급한 자화가능 입자를 부착시킴으로써 활성화될 수 있다. 따라서, 통로를 활성화시키는데 필요한 역학적 힘이 자화가능 입자에 작용하는 자기장에 의해 원격적으로 적용될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 세포내 주요 세포 요소를 인식하는 하나 이상의 특이 항체 또는 단백질 결합 모티브(motifs)를 갖는 입자에 꼬리표를 붙임으로써 자화가능한 입자를 변경하는 것(modifying)을 포함한다. 상기 입자는 막투과성 유착(adhesion) 분자들, 예를 들어, 인테그린(integrins), 카드헤린(cadherins), 셀렉틴(selectins), 및 면역글로불린(immunoglobulins) 또는 분산된 세포막 유착 단백질, 예를 들어, RGD(arginine-glycine-aspartate)를 포함한다. 예를 들어, 제 이. 첸, 비. 파브리, 이. 엘. 쉬프린, 및 엔. 왕(2001)에 의한 '인테그린 수용체를 뒤트는 것은 엔도셀리얼 세포에서 엔도셀린(endothelin)-1 유전자 형질 발현을 증가시킨다'.(Twisting integrin receptors increases endothelin-1 gene expression in endothelial cells). Am J Physiol Cell Physiol. 280: 1475-84; 에이. 아르. 바우쉬, 유. 헬러러, 엠. 에슬러, 엠. 애프펠바허, 및 이. 사크만(2001)에 의한 '트롬빈으로 자극된 엔도셀리얼 세포에서 인테그린 수용체-액틴 결합의 급격한 응고': 자기 구슬 마이크로리알러지(microrheology) 연구 Biophys J 80: 2649-57; 카트멜, 에스에이취, 제이 돕슨, 에스 버슈어런, 에이 엘 하지(2002)에 의한 '간헐적 역학적 활성화로 뼈세포의 장기 배양을 위한 자기 입자 기술의 계발'. IEEE Transactions on NanoBioscience 1:92-97.를 참고할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 다양한 장애의 치료 방법을 제공하기 때문에 특히 유익하다. 본 발명은 하나 이상의 이온 통로가 그 기능을 수행하는 어떤 장애에도 적용될 수 있는 치료 방법을 제공한다. 이에 더하여, 본 발명은 마취 기능과 같은 고통 완화를 포함하는 이온 통로 활성화의 잠재적 제어 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명에 따르면, 우리는 이온 통로가 그 기능을 수행하는 장애로부터 고통받는 환자들의 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 상기 환자에게 자화가능한 입자를 투여하고, 자기장을 사용하여 상기 입자를 조작하는 것을 포함한다.
여기에 기술된 치료 방법은 한정적으로 해석되어서는 안되지만, 특히 조직 그리고/또는 뼈치료에 유익하다. 상기 치료 방법은 신체의 표적 영역에 국부 마취 와 같은 고통 완화 방법을 제공함으로써 치료를 용이하게 할 수 있다.
셀들의 성질은 대상이 되는 조직의 성질에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 셀들은 신생 인대들을 성장시키기 위한 인대세포들과 신생 힘줄(tendon)을 성장시키기 위한 힘줄세포들(tenocytes)일 수 있다. 또는 셀들은 연골세포들(chondrocytes) 그리고/또는 연골원종세포들(chondrocyte progenitor cells)과 같은 다른 기질세포들(stormal cells)일 수 있다.
그러므로 본 발명의 방법은 조직의 재생, 또는 피부, 연골, 인대, 힘줄, 근육, 또는 뼈와 같은 인공적인 조직의 생성을 포함할 수 있다.
또는, 본 발명의 방법은 상처 치유 그리고/또는 조직유착(tissue adhesion)을 포함할 수 있다.
본 방법의 바람직한 실시예는 뼈 재생 그리고/또는 뼈 성장을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 방법은 예를 들어, 치과용의 응용들(dental applications) 그리고/또는 수의용의 응용들(veterinary applications)을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 선택적으로 체내의 (종양세포들과 같은) 세포들을 죽이기 위한 기제(mechanism)로 사용될 수 있다. 이 경우, 자화가능 입자들(magnetisable particles)은 표적 세포막(target cell membrane) 또는 이온통로 단백질(ion channel protein)에 부착되며, 자기장은 생체내 표적 영역에 가해진다. (시간에 따라 변하는 자기장에 따른) 빠르고 주기적인 이온통로의 개폐, 그리고/또는 (정적인 자기장에 따른) 이온통로의 개방 유지는 칼슘 이온과 같은 이온들이 세포들로 대량 몰려들도록 하며, 삼투압 쇼크(osmotic shock)와 종국적인 세포 죽음을 유도한다.
그러므로 본 발명의 방법은 세포들을 파괴하거나 세포성장을 억제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 자화가능한 입자들과 세포를 결합하는 것에 의해서 세포 내에서 이온통로들(ion channels)에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 포함한다.
본 발명의 방법은 세포에 삼투압 쇼크를 유발하는 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 자화가능한 입자를 세포에 결합시켜 세포 내에서 이온통로들에 대한, 예를 들어 작용 작동 또는 대항 작동을 이용한다. 본 발명의 방법은 암세포 같은 종양세포를 치료하거나 완화시키는데 특히 유용하다.
그러므로 본 발명의 방법은 의도한 정적 자기장을 이용하여 이온통로들의 개방을 유지함으로써 세포들을 죽이는 방법을 포함할 수 있다. 이와 다르게, 본 방법은 의도한 시간에 따라 변하는 자기장을 이용하여 이온통로들을 주기적으로 개폐함으로써 세포들을 죽이는 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 자기장은, 특히 치료되는 장에의 성질에 따라, 예를 들어 0.1Hz에서 10Hz의 주파수 범위에서 변할 수 있다. 그러나 이 범위 외의 주파수도 사용될 수 있다. 자기장은 전형적으로 10밀리테슬라(mT)에서 1400mT 정도의(단, 이에 한정되지 않음) 유속밀도(flux density)를 가진다.
본 발명의 방법에서 생체내에서 이용되는 경우에는 자기장은 생체외에서 발생될 수 있으며, 영구자석 또는 전자석에 의하여 제공된다. 자기장은 일정하거나(constant) 변할 수 있다. 예를 들어, 영구자석은 세포들에 대하여 상대적인 운 동을 할 수 있다. 자석의 경우, 자기장은 적당한 크기의 전류를 전자석에 제공함으로써 발생될 수 있으며, 선택적으로 교류전류를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 방법에 따르면 세포 내에서 치료효과를 유도할 수 있으며, 이는 자화가능한 입자를 세포에 결합시켜 세포 내의 이온통로들에 대한 작용 작동또는 대한 작용과 자화가능한 입자를 자기적으로 조작하는 것을 포함한다.
게다가 본 발명은 치료를 위한 치료상 활성 물질(therapeutically active agent)의 투여(administration)를 포함하는 치료방법도 제공한다. 세포 내에서 이온통로에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 나타내도록, 치료를 위한 치료상 활성 물질은 자화가능한 입자와 동시에, 따로따로, 또는 순차적으로 함께 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 치료를 위해서 치료상 활성 물질을 사용하여 세포를 표적화 하는 방법도 제공한다. 이는 자화가능한 입자를 세포에 결합시켜 세포 내에서 이루어지는 이온통로들에 대한 작용 작동 또는 대항 작동, 자화가능한 입자를 자기적으로 조종하는 것, 그리고 동시에, 따로따로, 또는 순차적으로 치료를 위한 치료상 활성 물질을 투여를 포함한다.
본 발명의 또 다른 방법에 따르면 생체내의 세포들을 자기적으로 조정하는 방법으로 자화가능한 입자들을 이용한다.
이용하는 방법은 생체내 과정(in vivo process)의 생체외 조작(ex vivo manipulation)을 포함한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 자기(磁氣)를 사용하여 셀을 조작하기 위한 시스템의 제조에 자화가능한 입자들을 사용하는 용도를 제공한 다. 이 시스템은 세포와 자화가능한 입자들의 결합과 세포 내의 이온 통로들에 대한 효현작동 또는 대항 작동을 포함한다.
본 발명에 의하면, 자화가능한 입자는 세포와 직접 결합한다. 이와 다른 사용방법은 자화가능한 입자를 항체(antibody), 효소(enzyme) 등에 결합시키는 것을 포함한다. 그리고 항체, 효소 등에 결합된 입자는 추후에 세포와 결합된다.
본 발명을 사용하는 방법은 세포내 결합(intracellular association)을 포함한다. TREK-1을 예로 들면, 입자(들)는 이온통로의 N-말단(N-terminus) 영역에 결합된다. 이와 다르게, 입자(들)는 이온통로의 COOH 말단 영역에 결합될 수 있다.
본 발명을 사용하는 방법은 포유류 세포들(mammalian cells) 또는 박테리아 세포들(bacterial cells), 식물 세포들 등과 같은 다른 세포 유형들의 조작을 포함한다. 생체내 사용이 선호되지만, 생체내 사용 및 생체외 사용 모두 가능하다.
우선적으로, 본 발명의 사용은 세포들 그리고/또는 이온통로들에 대한 작용 작동 또는 대항 작동에 대한 원격 처리, 예를 들어 생체외로부터 조작, 즉 원격의 역학적인 활성화를 포함한다.
본 발명의 사용은 그 자체로(per se) 다양한 세포들에 대하여 사용될 수 있다. 그러나 우선적으로, 이는 포유류의 체세포들에 적합하다. 예를 들면, 뼈, 연골(cartilage), 근육(골격(skeletal)과 심장(cardiac)) 림프 세포들(lymphatic cells), 내분비 세포들(endocrine cells), 비뇨기 시스템의 세포들(urinary system cells), 재생 시스템(reproduction)과 관련된 세포들, 신경 세포들(neuronal cells)과 종양 세포들(tumour cells)이다.
본 발명의 사용은 어떤 널리 알려진 세포 내의 이온통로들과 관련하여 사용될 수 있다. 그것은 앞서 설명하였다. 이는 특히 앞서 설명한 역학감각적인(mechanosensitive) 이온통로들에 대한 사용에 적합하다.
본 발명에 의하면, 본 발명은 역학감각적인 이온통로들을 조작하기 위한 시스템의 제조에 대한 사용방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 세포들로 통로가 핵산전달감염되는 것에 의해서, 그렇지 않으면 비감각적인, 널리 알려진 역학감각적이지 않은 세포들(non mechanosensitive cells) 그리고/또는 이온통로들과 함께 사용되기에 적합하다.
본 발명에 의하면 이온통로는 전압-작동(voltage-gated) 이온통로이며, 이와 다르게는 이온통로는 리간드-작동(ligand-gated) 이온통로이다.
본 발명에서 다양하게 변형된 입자들이 사용될 수 있다. 일반적으로 임의의 자화가능한 물질이 사용된다. 예를 들어, 철(Fe), 또는 철 화합물, 예를 들어 자철광(magnetite)(Fe3O4)이나 마그헤마이트(maghemite)(γFe2O3), 그레이가이트(greigite)(Fe3S4)등의 철염(iron salt), 또는 크롬 화합물, 예를 들어 크롬산화물(CrO2)와 같은 크롬염(chrome salt), 또는 이들의 조합이 있다. 자기 물질은 생물 친화성 코팅(biocompatible coating)을 가진 자기 코어(magnetic core)를 포함하는 입자들을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 그러한 바람직한 입자들은 나노입자들이며 특히 코어와 코어를 감싸는 실리카 껍질(silica shell)을 가지는 나노입자들이다. 또, 구멍(pores) 내에 다중의 자기 중심(multiple magnetic centres)을 가 지는 다공성 입자도 사용될 수 있다. 이와 같은 입자들의 예는 US특허 6,548,264에 개시되어 있는 데, 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 이용은 세포 내의 중요 세포요소를 인식하는 하나 이상의 특이 항체 또는 단백질 결합 모티프(motifs)로 꼬리표를 붙임으로서(tagging)(태그)함으로써 자기 입자들을 변형하는 것을 포함한다. 이는 인테그린(integrins), 카드헤린(cadherins), 셀렉틴(selectins), 면역글로불린(immunoglobulins), 또는 RGD(아르기닌(arginine)-글리신(glycine)-아스파르트(aspartate))와 같은 확산된 세포막 유착 단백질 등의 막투과성 유착 분자들을 포함한다.
본 발명의 사용은 다양한 장애(disorder)를 다루기에 적합한 시스템을 제공하므로 특히 유익하다. 실제, 본 발명은 치료에 적합한 의약 제조에 사용되며, 이는 하나 이상의 이온통로들이 기능하는 장애에 대하여 적절하다. 게다가 본 발명은 마취(anaesthetic)와 같은 고통경감을 포함하는 이온통로를 활성화하는 잠재적 조절(potential control)을 위한 사용을 제공한다.
따라서, 본 발명은 이온통로가 기능을 하는 장애로 고통받는 환자의 치료에 적합한 의약 제조에 사용되는 자화가능한 입자의 사용방법을 제공한다. 이 방법은 앞서 서술한 자화가능 입자들을 환자에게 투여하고 자기장을 이용하여 입자들을 조작하는 것을 포함한다.
앞서 서술한 사용방법은 한정되는 것으로 인식되어서는 안되며, 이는 조직 그리고/또는 뼈 치유에 특히 유익하다. 사용방법은 더 나아가서 신체의 표적 영역, 예를 들어 국소적인 무감각증의 고통을 완화하는 방법에 사용될 수 있다.
세포들의 성질은 관련된 조직의 성질에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 세포들은 새로운 인대들(ligaments)을 성장하는 인대세포들(ligamentum cells)과 새로운 힘줄(tendon)을 기르는 힘줄세포들(tenocytes)일 수 있다. 이와 다르게, 세포들은 연골원종세포들 같은 연골세포들(chondrocytes)일 수 있고/있거나 다른 골수기질세포들(stormal cells)일 수 있다.
그러므로 사용방법은 조직의 재생, 또는 피부(skin), 연골(cartilage), 인대(ligament), 힘줄(tendon), 근육(muscle), 또는 뼈와 같은 인공적인 조직의 생성을 포함할 수 있다.
별도로, 사용방법은 상처 치료 그리고/또는 조직유착(tissue adhesion)을 포함할 수 있다.
사용방법의 바람직한 실시예는 뼈 재생 그리고/또는 뼈 성장을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 사용방법은 예를 들어, 치과용의 응용들(dental applications) 그리고/또는 수의용의 응용들(veterinary applications)을 포함할 수 있다.
사용방법은 앞서 서술한 바와 같이 선택적으로 생체내의 (종양세포들(tumour cells)과 같은) 세포들을 죽이기 위한 수법(mechanism)으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명 세포들을 파괴하거나 세포성장을 억제하기 위한 시스템의 제조에서 자화가능한 입자를 사용하는 방법을 제공한다. 이는 세포와 자화가능한 입자의 결합에 의한 세포내에서 이온통로들에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 포 함할 수 있다. 사용방법은 특히 암세포 같은 종양 세포의 치료 또는 경감에 유용하다.
예를 들면 세포와 자화가능한 입자의 결합에 의한 세포내에서 이온통로들에 대한 작용 작동 또는 대항 작동에 의해서 세포에 삼투압 쇼크(osmotic shock)를 유발하는 방법을 포함한다. 본 발명의 사용방법은 암세포처럼 종양세포를 치료하거나 완화시키는데 특히 유용하다.
그러므로 사용방법은 의도한(targeted) 정적 자기장을 이용하여 이온통로들의 개방을 유지함으로써 세포들을 죽이는 방법을 포함할 수 있다. 이와 다르게, 본 방법은 의도한 시변 자기장을 이용하여 이온통로들을 주기적으로 개폐함으로써 세포들을 죽이는 방법을 포함할 수 있다.
게다가 본 발명은 치료효과를 유발하기 위한 시스템의 제조에서, 세포와 자화가능한 입자의 결합에 의한 세포내에서 이온통로들에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 하고 그리고 자기적으로 자화가능한 입자를 조작하는 것을 포함하는 자화가능한 입자의 사용을 제공한다.
게다가 본 발명은 세포 내에서 작용 작동 또는 대항 작동이 이루어지는 동안 자화가능한 입자와 함께 동시에, 따로따로, 또는 순차적으로 치료상 활성 물질(therapeutically active agent)을 투여하는 것을 포함 시스템의 제조에서 자화가능한 입자를 사용하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 치료상 활성 물질을 세포에 표적화하기 위한 제조 시스템에 자화가능한 입자의 사용을 제공하는 데, 이 사용은 세포와 자화가능한 입자의 결합 에 의해서 세포내에서 이온통로에 대한 작용 작동 또는 대항 작동, 자화가능한 입자의 자기적인 조작, 그리고 동시에, 따로따로, 또는 순차적으로 상기 치료상 활성 물질을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 치료를 위한 활성 물질과 세포에 자화가능한 입자를 결합시키는 수단을 포함하는 키트를 제공한다.
임의의 널리 알려진 치료를 위한 치료상 활성 물질 또는 치료를 위한 치료상 활성 물질의 조합이 본 발명의 키트에 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.
그러므로 키트는 치료를 위한 치료상 활성 물질을 담고 있는 용기와, 자화가능한 입자들의 소스와, 동시에, 순차적인, 또는 따로따로 그것을 투여하기 위한 지침을 포함하고 있다. 본 발명의 키트는 또한 그 자체로 알려진(per se) 다른 치료상 활성 물질을 포함한다. 본 발명은 또한 의약의 제조에서 서술된 키트의 사용을 포함하고 있다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 예를 들어 설명될 것이다. 도 1a는 역학적인 조작을 위한 자기 염주(magnetic beads)의 꼬리표(tagging)를 위하여 12x 히스티딘 삽입(histidine insertion)의 세 위치를 보여주는 TREK-1의 개략적인 구조를 나타낸다. 도 1b는 카르복시기 강자성 입자(carboxyl ferromagnetic particles)(4㎛)로 코팅된 세포막 결합(membrane bound) RGD와 함께 주요 인간 성상세포(astrocyte)를 나타낸다(확대×1000). 도 2는 단백질 내에 존재하는 His. tag의 구조와 위치를 보여주는 TREK 이온을 개략적으로 나타낸다. 붉은 원들은 세 위치, 일차 루프(primary loop), COOH 말단, 그리고 NH 말단 위치에서의 His tags의 위치들을 나나탠다. 도 3은 새포내 칼슘에서 다운스트림 변화를 통해 모니터된 Trek-1의 자기 활성을 나타낸다. 도 4는 Flashpericam으로 감염된 HEK293 T 세포에에서 세포내 칼슘의 일시적인 상승(transient rise)을 유발하는 TREK-1의 자기 활성화를 나타낸다.
예1
표적화 모델 시스템
모델 시스템은 우무 겔 블럭들(agar gel blocks) 내의 채널(channel)로 제공되는 튜빙(tubing)에 연결된 연동 펌프로 이루어진다. 자석들(magnets)은 통로들에 대하여 다양한 위치에 놓일 수 있으며, 표적 자리에서 자기장과 경사(gradient)는 가우스미터(gauss meter)에 연결된 축형 홀 프로브(axial Hall probe)를 사용하여 측정되었다. 희귀 지자석들(rare earth magnets)에 의하여 발생된 자기장들은 본 프로젝트를 위하여 요구되는 레드클리프 다이어그노스틱스 매그스켄 필드 매핑 시스템(Redcliffe Diagnostics MagScan field mapping system)을 이용하여 특징지워졌다. 각 실험이 끝나면 겔 채널은 삭제되고(excised) 분석된다(assayed). 이는 염색기술을 이용하는 세포 포착(cell capture)을 위한 것이다. 자기입자포착(magnetic particle capture)은 냉각, 건조된 겔 블럭들 상에서 초전도 양자 인터페이스 장치(Superconducting Quantum Interference Device:SQUID) 자기측정(magnetmetry measurement)을 수행함으로써 정량측정된다. 모델들은 전달 및 표 적화 변수들, 즉 자기장 강도 또는 형상(geometry), 자기입자 특성, 단위세포당 입자들의 수 등을 최적화하는 데 사용될 수 있다.
예2
자기 세포분석(magnetic cytometry)를 이용한 비특이적 세포막 변형(non-specfic membrane deformation)
특히 뼈대들(scaffolds)은 골격 사이즈에 따라 106-109BMSc로 뿌려졌으며(seeded), 생물 반응기(bioreactor) 내에 놓이기 이전에 24시간동안 배양되었다. 다음으로, 구성체(construct)는 변동하는 자기장 로딩 영역(varying magnetic loading regimes), 예를 들어 입자당 1-100pN 범위의 힘으로 1Hz 주파수에서 1시간 동안 놓일 수 있다. 이러한 변수들은 조절가능하며, 여러 세포 종류나 뼈대 물질을 위하여 시스템의 최적화가 가능하다. 다음으로, 활성화 이후에 여러 지점들에서 RNA와 단백질 분석을 위해서 세포들은 제거되었다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 사용하여, FACs 분석(FACs analysis)과 양적인 PCR 기술분석(quantitative PCR techniques assays)이 오스테오폰틴(osteopontin), 콜라겐 타입 1(collagen type 1), 알카리성의 포스파타아제와 오스테오칼신(osteocalcin) 등의 기질단백질(matrix proteins)과 나란히 runx 2와 osterix 같은 골모세포 전사요소들(osteoblastic transcription factors)에 대하여 이루어졌다.
예3
자기 마이크로 나노 입자들의 응용가능성을 입증하기 위한 동물 모델에서 새로운 뼈 형성에 대한 논증
이 기술의 동물실험(animal trial)은 마우스 SCID 모델(mouse SCID model)을 이용하여 피하 확산 챔버(subcutaneous diffusion chamber) 내에서 생체내에 유지되는 세포들에 의한 뼈 분화(bone call differentiation) 및 새로운 뼈 형성을 증진시키 위하여 줄기세포를 원격으로 활성화할 수 있다는 것을 지지하였다. 이러한 방식으로, 비교 실험은 생체외실험(in vitro experiments)에서 이루어 질 수 있다. 세포 내의 특정 조직들에 대한 세포들의 표적화는 마찬가지로 바람직하다.
예4
생체내 뼈 형성에 대한 논증
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)로부터 유도된 뼈조상세포(osteoprogenitors)가 사용될 수 있다. 생체내 뼈 형성은 SCID(severely compromised immunodeficient) 마우스에서 피하 이식 모델 및 확산 챔버(diffusion chamber) 모델을 이용하여 평가된다. 이는 자기 마이크로 나노입자들의 표적화에 대한 생체내에서 효능을 확인할 수 있는 빠르고 강한 모델을 제공하며, 뼈 형성에 대한 명확한 논증을 제공한다. 확산챔버 분석(diffusion chamber assay)은, 호스트 세포들과 대조적으로, 이식된 셀들(implanted cells)에 의하여 뼈 형성에 대한 명확한 논증을 제공한다. 피하이식모델(subcutaneous implant model)은 골격조직형성 의 평가를 위한 산업 표준(industry standard)이며, 우리(RO) 발명자들 중 한 명은 골격조직 공학의 평가22를 위한 RO(30/1759)에 대한 프로젝트 라이센스 하에서 피하이식모델과 확산챔버모델 모두의 사용에 대하여 공표하였다. 간략히 말하면, 선택된 인간 뼈조상세포들(osteoprogenitors cells)은 4주동안 SCID 마이스(mice)에서 피하에(subcutaneously) 이식되며, 확산챔버 연구(diffusion chamber studies)를 위하여, 세포 및 자기입자 복합물은 각 확산챔버와 복강내(intraperitoneally) 무흉선 누드 마우스(athymic nude mice)로 주입된 챔버들에 10주간 놓인다(MFI-nu-nu; 4-6주; Harlan UK Ltd). 그 다음, 확산챔버는 제거되고, 하룻밤 동안 고정되며(95% 에탄올, 4℃), 4℃에서 폴리(hydroxymethylmethancrylate) 레진(resin) 내에 탈회되지 않은 채(undecalcified) 내장된다(embeded). 새로운 뼈 형성은 언 영역(frozen plastic region), 파라핀 영역(paraffin region), 그리고 메타크릴산 메틸(methylmethacrylate) 플라스틱 영역(plastic section)을 포함하는 조직상의 기술에 의하여 평가된다. 형성된 연골(cartilage)과 뼈에 대한 평가는 톨루이딘 블루(toludine blue) 김사(Giemsa)와 알시언 블루/시리어스 레드(alcian blue/sirius red), 그리고 사프라닌-오 스테이닝(Safranin-O staining)에 의하여 이루어진다. 모델은 현재 RO(30/1759)에 대한 프로젝트 라이센스 하에서 사우스엠프턴(Southampton) 내에서 이루어진다.
예5
생체내의 특정 위치에 대한 세포들의 표적화
이 작업은 동맥 및 정맥 주사를 통하여 특정 조직 위치에 대한 자기 입자가 로딩된 세포들의 전달에 주안점을 두고 있다. 간단히 말해, 선택되고 확장된 중간엽 줄기세포들(mesenchymal stem cells)은 자기입자들로 로딩되며, 말단 정맥(tail vein)에 의하여 마취된 MF1nu/nu mice로 주사된다. 세포들은 외부 고경사 NdFeB 자석들을 이용하여 특정 표적 위치로 국소화된다. 대조군 마이스(control mice) 또한 주입되며, 그러나, 대조군 마이스에 대하여는 어떠한 자석도 표적화에 사용되지 않는다. 표적화 효율은 자기 공명 단층 촬영 장치(MRI)와(자기 나노파티클들은 임상의 엠알 이미징(MR imaging)에서 대비 강화 물질(contrast enhancement agents)로 사용된다), 4, 7, 14일 후에 절개되고 냉동건조된 표적 조직에 대한 SQUID 자기측정 분석(magnetometry analysis)을 이용하여 검사된다.
예6
여기에서 서술된 기술을 이용한 예비적인 실험은 인간 뼈로부터 유도된 유도 중간엽 줄기세포들(Cambrex poietics-hMSC)에 행해진다. 세포들은 10%의 FCS와 1%의 항생제를 갖는 알파 MEM, 아스코르브산(ascorbic acid)(50micrograms/ml), 그리고 베타-글리세로포스페이트(beta-glycerophosphate)에서 5일동안 배양된다.
자기 마이크로입자들(d-4㎛)은 전압작동 칼슘이온 통로 수용체 항체(voltage gated calcium ion channel receptor antibody)의 비오틴화(biotinylated) α2/δ-1 서브유니트(subunit)로 코팅된다. 4일이 지나면, 입자들은 칼슘 통로 수용체를 통해 40분 동안 줄기세포들에 부착된다. 40분이 지나면, 세포들은 대략 입자당 30피코뉴턴(picoNewtons)(∼2입자/세포)의 힘을 가하는 1Hz 자기장에 노출된다. 2시간 40분이 지나면, 입자들은 세포들로부터 분리되며, 흡인(aspiration)에 의하여 제거된다. 샘플은 원래의 배양기(culture media)에서 추가로 24시간동안 더 배양된다. 5일에서 조절되고 자극된 그룹들(control and stimulated groups)로부터 알앤에이(RNA)는 수집된다. 유전자 마이크로어레이(microarray) 분석은 샘플 각각에 대하여 수행된다. 샘플당 8000 유전자들이 자기 활성화(2배 증가/감소로 취해진 상승조절 및 하향조절)에 응하여 HG-Focus 인간 게놈 칩들(human genome chips)(Affymetrix UK Ltd)을 이용하여 분석된다.
이 실험으로부터 마이크로어레이 데이터(microarray data)는 역학적인 자극이 신경 성장 인자와 섬유모세포(fibroblast) 성장 인자(표 1)와 같은 어떤 유전자의 하향조정(downregulation)을 가져온다는 것을 보여준다. 이것은 자기 입자들을 사용한 역학적 힘의 적용은 줄기세포 분화를 신경세포나 섬유모세포로 향하는 경로로부터 이탈시킨다는 것을 암시한다. 역학적 힘에 응하여 테트라넥틴(tetranectin)과 같은 유전자의 상승조절(upregulation)은 골형성의 경로(osteogenic pathway)를 향한 세포들의 분화를 암시한다. 세포골격 재조직(cytoskeletal reorganisation)과 세포유착 단백질(cell adhesion proteins)과 관련한 유전자의 상향조절(upregulation)은 힘을 가한 후 예견된 세포 프로세스(expected cell processes)와 서로 관련된다.
발현된 유전자들의 총 수 (Total no. of genes expressed) 82(42▲ 40▼)
발현된 유전자들의 선택 (Selection of genes expressed) 인슐린 같은 GF 결합 단백질1(2.1 배▲) FK506 결합 단백질(2.1 배▲) 자이신(Zyxin)(2.1 배▲) 인테그린(Integrin) α5(2 배▲) 초기 성장 응답(Early growth response)1(2 배▲) 콜라겐 타입(collagen type)Ⅳ 알파3(2.1 배▼) 신경(Nerve) GF(2 배▼) 섬유모세포(Fibroblast) GF7 & 9(2.1 & 2.5 배▼) 테트라넥틴(Tetranectin)(2.1 배▲)
표1: 자극없는 조절 배양(non-stimulated control cultures)과 비교하여 분화(differentiation)와 역학적인 자극(mechanical stimulation)과 그들의 상대적인 상향 및 하향조정(up- and downregulation)에 관한 특정 유전자의 활동을 보여주는 마이크로어레이 분석 결과(results of microarray analysis)
기호: 상승조정 그리고 ▼= 하강조정
줄기세포들(stem cells)을 생체내 또는 생체외에서 자기로 조작하는 것에 의해 다양한 장애를 치료 또는 경감하는 데 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 다양한 장애의 치료 방법을 제공하기 때문에 특히 유익하다. 본 발명은 하나 이상의 이온 통로가 그 기능을 수행하는 어떤 장애에도 적용될 수 있는 치료 방법을 제공한다. 이에 더하여, 본 발명은 마취 기능과 같은 고통 완화를 포함하는 이온 통로 활성화의 잠재적 제어 방법을 제공한다.

Claims (205)

  1. 줄기세포를 선택적으로 활성화 그리고/또는 표적화하여 원격 방식으로 역학적으로 줄기세포를 조작할 수 있는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 원격 방식은 비접촉식 방식이며 생체내에 있어서는 생체외로부터 고유하게 활성화/표적화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 자화가능한 입자와 줄기세포를 결합하는 것에 의해서 줄기세포를 생체내 또는 생체외 자기적으로 조작하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기세포를 치유 위치로 표적화 그리고/또는 상기 위치에 유지하는 것; 그리고
    생체외 그리고/또는 생체내 조절 그리고/또는 분화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 생체내 줄기세포를 표적화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 인간 줄기세포를 조작하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 외인성 자기적인 조작에 의해서 치유 위치로 전달되거나 상기 치유 위치에 고정될 수 있는 자화가능한 입자들을 사용하여 상기 줄기세포를 태깅하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 특이 줄기세포 막 수용체를 원격 활성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 위치에 줄기세포를 두고, 상기 위치에 상기 줄기세포를 유지시키고, 그리고 환자 내에서 그 위치에서 상기 줄기세포를 원격적으로 활성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포에서 막투과 이온 통로의 원격 활성화를 위해서 상기 줄기세포 상의 특이 수용체를 표적화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 초기 단계에서의 세포 유형의 분화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 인간 골수 줄기세포에 존재하는 다양한 세포 수용체 유 형들을 표적화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 줄기세포 수용체 유형들은 역학적으로 활성화된 이온 통로, 즉, 칼륨 통로(TREK), 칼슘 통로, 인테그린들 그리고 RGD 같은 표면 막 결합 위치들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, Runx2 그리고 Osterix (줄기세포 분화에 중요한 인자) 같은 하방 전사 인자를 활성화하는 것으로 알려진 외인성 성장 인자(즉, TGRB 및 BMP2)를 위한 수용체를 표적화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 손상 또는 치유 위치에서 인간 중간엽 줄기세포의 주입을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 치료학상 처치를 제공하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 선택적으로 활성화 그리고/또는 표적화하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 치료학상 처치는 유전자 요법 및 조직 공학 중에 서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 위치는 조직 치유 위치인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 기능적 수준에서 상기 줄기세포가 신경 세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포를 결합, 전달, 그리고 활성화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 1에 있어서, 성인 일차 골수 인간 줄기세포 그리고/또는 인간 배아 세포를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 1에 있어서, 생물 반응기가 다중-웰 2D 시스템 내에서의 생체외 또는 3D 뼈대-기초 시스템의 생체내에서 배양된 줄기세포에 부착된 자기 입자에게 힘이 가해질 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 뼈발생, 연골발생, 그리고 지방발생 집단들로부터 선택되는 집단들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 1에 있어서, 클론 항체를 사용하여 자기적으로 활성화된 세포 분류를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 클론 항체는 STRO-1인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 23에 있어서, 생분해성 중합체로 구성된 3D 뼈대를 사용하는, 단일층의 BMSc 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 생분해성 중합체는 폴리라틱산(PLA) 그리고 아교질 젤 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 1에 있어서, 생체내 과정을 생체외 조작하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 1에 있어서, 줄기 세포를 가지는 자화가능한 입자를 활성화 그리고/또는 표적화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 줄기세포를 자기적으로 조작하는 방법에 있어서:
    상기 방법은 자화가능한 입자와 셀을 결합하는 것을 포함하며,
    상기 방법은 자화가능한 입자를 세포와 결합하는 것에 의해서 셀 내의 이온 통로에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 분화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 자화가능한 입자는 상기 줄기세포와 직접적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 자화가능한 입자를 항원 또는 효소와 결합하는 것을 포함하며, 상기 항원 또는 효소는 상기 자화가능한 입자에 결합한 후에 상기 줄기세포에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 입자를 줄기세포에 유입시키거나 입자를 줄기세포에 부착시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 입자는 세포외 또는 세포내 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 입자는 세포내 결합하는 것을 특징으로 하는 방 법.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 세포내 결합은 내부 결합 위치와 결합하는 것을 포함하는 것을 특징으로 방법.
  39. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 줄기세포에서 역학감각적 이온 통로를 조절하는 것을 포함하며,
    자화가능한 입자를 이온 통로와 직접적으로 또는 간접적으로 결합하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 입자는 이온 통로의 N-말단 영역에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 상기 입자는 이온 통로의 COOH 말단 영역에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 청구항 39에 있어서, 줄기세포의 원격적 조작 그리고/또는 이온 채널에 대한 원격적인 작용 작동 또는 대항 작동을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 전단응력, 세포 종창, 그리고 막 신장 그리고/또는 외부 물질에 반응하는 것으로 알려진 줄기세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 외부 물질은 지방산 또는 전신성 마취제인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 자기적으로 조작하는 방법.
  45. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 고통 경감, 감각상실, 치료학, 조직 공학 그리고 치유 그리고/또는 암 치료에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 줄기세포는 결합 조직 또는 신경 조직으로 분화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 청구항 45에 있어서, 상기 줄기세포는 뼈, 신경, 심장 세포 또는 이들의 조합으로 분화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 청구항 39에 있어서, 상기 이온 통로는 기계 감각적 이온 통로인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 39에 있어서, 상기 기계 감각적 이온 통로는 세포로 전달감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 청구항 39에 있어서, 통로 또는 전압작동, 그리고 리간드작동 이온 통로의 개방을 촉발하는 막 변형을 야기하는 힘을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 이온 통로는 전압작동 이온 통로인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 청구항 50에 있어서, 상기 이온 통로는 리간드작동 이온 통로인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 청구항 39에 있어서, 상기 이온 통로는 나트륨 통로, 칼륨 통로, 칼슘 통로, 염화물 통로, 그리고 비선택적 양이온 채널 또는 이들의 조합중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 청구항 53에 있어서, 상기 이온 통로는 칼슘 통로 또는 칼륨 통로에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 청구항 53에 있어서, 상기 통로는 나트륨 통로인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 나트륨 통로는 TREK-1 통로인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 뼈 세포의 TREK-1 통로를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 청구항 1 또는 31에 있어서, 외부의 높은 경사 희귀 지자석을 사용하여 표적화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 희귀 지자석은 NdFeB 자석인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 자석은 세포를 수식 Fmag = (X2-X1)(V/μ0)B(▽B) 에 따른 표적 위치에서 유지한 채로, 상기 세포에 로딩된 자기 입자에 병진성 힘을 가하는 높은 자장/경사 산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 활성화는 자기 조절 생물 반응기를 사용하여 달성되는 원격 역학적 활성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 자화가능한 입자는 고유의 자석 또는 자기장에서 반응할 수 있는 자석인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 자화가능한 입자는 자석인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 자기 물질은 상자성 초상자성체, 강자성체 그리고/또는 반강자성체인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 청구항 62에 있어서, 상기 자화가능한 물질은 철 또는 그 화합물, 크롬 화합물, 또는 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 철 화합물은 철염인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 철염은 자철광(Fe3O4), 감마산화제이철(γFe2O3), 그리고, 황화제삼철(Fe3S4) 또는 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 청구항 65에 있어서, 상기 크롬 화합물은 크롬염인 것을 특징으로 하는 방 법.
  69. 청구항 68에 있어서, 상기 크롬염은 산화크롬(CrO2)인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 청구항 63에 있어서, 상기 자기 물질은 생체친화성 코팅을 갖는 자기코어를 포함하는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 청구항 70에 있어서, 상기 생체친화성 나노입자는 실리카, 덱스트란, 도는 PVA 코팅을 갖는 자철광 코어 그리고/또는 산화제이철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 입자는 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 나노입자는 1나노미터 내지 10마이크로미터 범위의 크기인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 청구항 73에 있어서, 상기 나노입자의 평균 크기는 5000나노미터 이하인 것 을 특징으로 하는 방법.
  75. 청구항 74에 있어서, 상기 나노입자의 평균 크기는 1나노미터 내지 5000나노미터인 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 청구항 72에 있어서, 상기 자기 나노입자는 10나노미터 이상 수 마이크로의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 코팅은 기능화되고 막 부착 모티브에 교차결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 상기 자기 나노입자는 세포 생활력 및 기능 상의 입자 내재화 주파수, 결합 효율, 안정성, 그리고 결합을 맞출 수 있도록 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 청구항 78에 있어서, 상기 변형은 막 외부 상의 위치뿐만 아니라 내부 결합 위치를 맞추는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 청구항 71에 있어서, 상기 입자는 코어 및 상기 코어를 감싸는 실리카 껍질을 구비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 청구항 80에 있어서, 상기 입자는 자화가능한 입자를 포함하는 코어 그리고 상기 코어를 감싸는 실리카 껍질을 포함하는 것들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 청구항 70에 있어서, 상기 입자는 구멍내에 다중 자기 중심을 갖는 다공성 입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 청구항 1 또는 청구항 31에 있어서, 자화가능한 입자 상에 원격 자기장을 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 청구항 34에 있어서, 상기 입자는 세포내의 중요한 세포 성분을 인식하는 하나 이상의 특이 항원 또는 단백질 결합 모티브로 태그되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 특이 항원 또는 단백질 결합 모티브는 막투과 세포외 기질분자, 유착 분자 또는 분산된 막 부착 단백질들 또는 세포외 기질단백질들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 청구항 85에 있어서, 상기 막투과 유착 분자는 인테그린, 카드헤린, 셀렉틴, 그리고 면역글로불린으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 특이 항원 또는 단백질 결합 모티브는 분산된 막 유착 단백질들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 청구항 87에 있어서, 상기 분산된 막 유착 단백질은 RGD(아르기닌-글리신-아스파라진산염)인 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 이온 통로가 기능을 하는 질환을 겪는 환자를 치료하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 자화가능한 입자를 환자에 투여하고, 신체 외부로부터의 자기장을 사용하여 줄기세포의 이온 통로 또는 상기 줄기세포를 조작하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  90. 청구항 89의 치료 방법을 사용하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  91. 청구항 90에 있어서, 상기 종양 세포는 암 세포인 것을 특징으로 하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  92. 청구항 91에 있어서, 의도한 정적 자기장을 사용하여 이온 채널을 개방 상태로 유지하는 것에 의해서 세포를 죽이는 것을 포함하는 종양 세포의 치료 또는 경 감 방법.
  93. 청구항 91에 있어서, 미리 설정된, 시간-변화 자기장을 사용하여 이온 통로를 주기적으로 개방 및 폐쇄하는 것에 의해서 세포를 죽이는 것을 포함하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  94. 청구항 91에 있어서, 질환은 이온 통로가 정상적인 세포의 항상성에 중요한 역할을 하는 신체에서 다양한 조직들에 관계하는 것을 특징으로 하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  95. 청구항 94에 있어서, 상기 세포들은 심장 근육 세포인 것을 특징으로 하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  96. 청구항 94에 있어서, 고혈압 치료를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  97. 청구항 94에 있어서, 고통 경감을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  98. 청구항 97에 있어서, 무감각증을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  99. 청구항 98에 있어서, 상기 무감각증은 국부적으로 발생한 것을 특징으로 하는 종양 세포의 치료 또는 경감 방법.
  100. 청구항 89의 방법이 조직 그리고/또는 뼈 치유를 포함하는 환자를 치료하는 방법.
  101. 청구항 100에 있어서, 상기 세포는 인대 세포, 힘줄 세포, 연골 세포, 그리고 연골원종세포 같은 다른 기질 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  102. 청구항 100에 있어서, 조직의 재생성 또는 피부, 연골, 힘줄, 근육 또는 뼈 같은 인공 조직의 생성을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  103. 청구항 100에 있어서, 이온 통로의 원격 활성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  104. 청구항 100에 있어서, 상처 치유 그리고/또는 조직 유착을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  105. 청구항 100에 있어서, 뼈의 치유 그리고/또는 뼈 성장을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  106. 청구항 89의 방법이 치아 또는 척추 적용을 포함하는 치료 방법.
  107. 청구항 98의 방법이 신체 외부로부터의 자기장에 의해서 이온 통로를 변형하여 국소 무감각증을 나타내게 하는 것을 포함하는 치료 방법.
  108. 청구항 89의 방법이 0.1 내지 10헤르쯔의 주파수에서 자기장을 사용하는 것을 포함하는 치료 방법.
  109. 청구항 89의 방법이 10밀리테슬라 내지 1400밀리테슬라 범위의 자속 밀도를 가는 자기장을 사용하는 것을 포함하는 치료 방법.
  110. 줄기세포에서 치료 효과를 유발하는 방법에서,
    상기 방법은 세포를 자화가능한 입자와 결합하는 것에 의해서 상기 세포 내의 이온 통로에 대한 작용 작동 또는 대항 작동, 상기 자화가능한 입자를 자기적으로 조작하는 것을 포함하는 치료 효과를 유발하는 방법.
  111. 줄기세포 내의 이온 통로에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 나타내면서 자화가능한 입자와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여되는 치료상 활성 물질을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  112. 치료상 활성 물질을 사용한 줄기세포 표적화 방법에 있어서:
    자화가능한 입자를 세포와 결합하는 것에 의해서 상기 세포 내의 이온 통로에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 나타내고, 상기 자화가능한 입자를 자기적으로 조작하고, 그리고, 상기 자화가능한 입자와 함께, 개별적으로, 또는 순차적으로 상기 치료상 활성 물질을 투여하는 것을 포함하는 줄기세포 표적화 방법.
  113. 자화가능한 입자를 줄기세포와 결합하는 것을 포함하는 줄기세포를 자기적으로 조작하는 방법에 사용하는 자화가능한 입자의 용도.
  114. 청구항 113에 있어서, 상기 줄기세포가 역학적으로 원격 방식으로 조작가능하도록 상기 줄기세포를 활성화 그리고/또는 표적화 하는 것을 포함하는 자화가능한 입자의 용도.
  115. 청구항 113에 있어서, 상기 원격 방식은 비접촉식 방식이고 생체내의 경우에 신체외로부터 특이적으로 활성화/표적화인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  116. 청구항 113에 있어서, 자화가능한 입자를 줄기세포와 결합하는 것에 의해서 생체내 또는 생체외 줄기세포를 자기적으로 조작하는 것을 포함하는 자화가능한 입자의 용도
  117. 청구항 113에 있어서,
    치유 위치로 줄기세포를 표적화 그리고/또는 상기 위치에 상기 줄기세포를 유지하는 것;
    생체내 그리고/또는 생체외 조절 그리고/또는 분화를 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  118. 청구항 113에 있어서, 생체내 줄기세포의 표적화를 포함하는 자화가능한 입자의 용도
  119. 청구항 113에 있어서, 인간 줄기세포의 조작을 포함하는 자화가능한 입자의 용도.
  120. 청구항 113에 있어서, 외인성 자기적 조작에 의해서 치유 위치로 전달되거나 상기 치유 위치에 고정될 수 있는 자화가능한 입자들을 사용하여 상기 줄기세포를 식별하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  121. 청구항 113에 있어서, 특이 줄기세포 막 수용체를 원격 활성화하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  122. 청구항 113에 있어서, 위치에 줄기세포를 두고, 상기 위치에 상기 줄기세포를 유지시키고, 그리고 환자 내에서 그 위치에서 상기 줄기세포를 원격적으로 활성화하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  123. 청구항 113에 있어서, 상기 줄기세포에서 막투과 이온 통로의 원격 활성화를 위해서 상기 줄기세포 상의 특이 수용체를 표적화하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  124. 청구항 113에 있어서, 초기 단계에서의 세포 유형의 분화를 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  125. 청구항 113에 있어서, 인간 골수 줄기세포에 존재하는 다양한 세포 수용체 유형들을 표적화하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  126. 청구항 125에 있어서, 상기 줄기세포 수용체 유형들은 역학적으로 활성화된 이온 통로, 즉, 칼륨 통로(TREK), 칼슘 통로, 인테그린들 그리고 RGD 같은 표면 막 결합 위치들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  127. 청구항 126에 있어서, Runx2 그리고 Osterix (줄기세포 분화에 중요한 인자) 같은 하방 전사 인자를 활성화하는 것으로 알려진 외인성 성장 인자(즉, TGRB 및 BMP2)를 위한 수용체를 표적화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  128. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  129. 청구항 128에 있어서, 손상 또는 치유 위치에서 인간 중간엽 줄기세포의 주입을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  130. 청구항 113에 있어서, 상기 방법은 치료학상 처치를 제공하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  131. 청구항 130에 있어서, 상기 치료학상 처치는 유전자 요법 및 조직 공학 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  132. 청구항 131에 있어서, 상기 위치는 조직 치유 위치인 것을 특징으로 하는 자 화가능한 입자의 용도.
  133. 청구항 113에 있어서, 기능적 수준에서 상기 줄기세포가 신경 세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  134. 청구항 113에 있어서, 상기 줄기세포를 결합, 전달, 그리고 활성화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  135. 청구항 113에 있어서, 성인 일차 골수 인간 줄기세포 그리고/또는 인간 배아 세포를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  136. 청구항 113에 있어서, 생물 반응기가 다중-웰 2D 시스템 내에서의 생체외 또는 3D 뼈대-기초 시스템의 생체내에서 배양된 줄기세포에 부착된 자기 입자에게 힘이 가할 수 있는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  137. 청구항 136에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 뼈발생, 연골발생, 그리고 지방발생 집단들로부터 선택되는 집단들을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  138. 청구항 1에 있어서, 클론 항체를 사용하여 자기적으로 활성화된 세포 분류를 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  139. 청구항 138에 있어서, 상기 클론 항체는 STRO-1인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  140. 청구항 136에 있어서, 생분해성 중합체로 구성된 3D 뼈대를 사용하는, 단일층의 BMSc 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  141. 청구항 140에 있어서, 상기 생분해성 중합체는 폴리라틱산(PLA) 그리고 아교질 젤 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  142. 청구항 113에 있어서, 생체내 과정을 생체외 조작하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  143. 청구항 113에 있어서, 줄기 세로를 가지는 자화가능한 입자를 활성화 그리고/또는 표적화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  144. 자화가능한 입자를 줄기세포와 결합하는 것에 의해서 상기 줄기세포 내에서 이온 통로에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 포함하는 요법의 제조에 사용하는 자화가능한 입자의 용도.
  145. 청구항 113 또는 144에 있어서, 분화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  146. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 자화가능한 입자는 상기 줄기세포와 직접적으로 결합하는 것을 특징으로 자화가능한 입자의 용도.
  147. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 자화가능한 입자를 항원 또는 효소와 결합하는 것을 포함하며, 상기 항원 또는 효소는 상기 자화가능한 입자에 결합한 후에 상기 줄기세포에 결합하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  148. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 입자를 줄기세포에 유입시키거나 입자를 줄기세포에 부착시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  149. 청구항 148에 있어서, 상기 입자는 세포외 또는 세포내 결합하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  150. 청구항 149에 있어서, 상기 입자는 세포내 결합하는 것을 특징으로 하는 자 화가능한 입자의 용도.
  151. 청구항 150에 있어서, 상기 세포내 결합은 내부 결합 위치와 결합하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  152. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 줄기세포에서 역학감각적 이온 통로를 조절하는 것을 포함하며,
    자화가능한 입자를 이온 통로와 직접적으로 또는 간접적으로 결합하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  153. 청구항 152에 있어서, 상기 입자는 이온 통로의 N-말단 영역에 결합하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  154. 청구항 152에 있어서, 상기 입자는 이온 통로의 COOH 말단 영역에 결합하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  155. 청구항 152에 있어서, 줄기세포의 원격 조작 그리고/또는 이온 채널에 대한 원격적인 작용 작동 또는 대항 작동을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  156. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 전단응력, 세포 종창, 그리고 막 신장 그리고/또는 외부 물질에 반응하는 것으로 알려진 줄기세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  157. 청구항 156에 있어서, 상기 외부 물질은 지방산 또는 전신성 마취제인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  158. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 고통 경감, 감각상실, 치료학, 조직 공학 그리고 치유 그리고/또는 암 치료에 적용되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  159. 청구항 158에 있어서, 상기 줄기세포는 결합 조직 또는 신경 조직으로 분화하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  160. 청구항 158에 있어서, 상기 줄기세포는 뼈, 신경, 심장 세포 또는 이들의 조합으로 분화하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  161. 청구항 152에 있어서, 상기 이온 통로는 기계 감각적 이온 통로인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  162. 청구항 152에 있어서, 상기 기계 감각적 이온 통로는 세포로 전달감염된 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  163. 청구항 152에 있어서, 통로 또는 전압작동, 그리고 리간드작동 이온 통로의 개방을 촉발하는 막 변형을 야기하는 힘을 사용하는 것을 특징으로 하 자화가능한 입자의 용도.
  164. 청구항 163에 있어서, 상기 이온 통로는 전압작동 이온 통로인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  165. 청구항 163에 있어서, 상기 이온 통로는 리간드작동 이온 통로인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  166. 청구항 152에 있어서, 상기 이온 통로는 나트륨 통로, 칼륨 통로, 칼슘 통로, 염화물 통로, 그리고 비선택적 양이온 채널 또는 이들의 조합중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  167. 청구항 166에 있어서, 상기 이온 통로는 칼슘 통로 또는 칼륨 통로에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  168. 청구항 167에 있어서, 상기 통로는 나트륨 통로인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  169. 청구항 168에 있어서, 상기 나트륨 통로는 TREK-1 통로인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  170. 청구항 169에 있어서, 뼈 세포의 TREK-1 통로를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  171. 청구항 113 또는 144에 있어서, 외부의 높은 경사 희귀 지자석을 사용하여 표적화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  172. 청구항 171에 있어서, 상기 희귀 지자석은 NdFeB 자석인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  173. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 자석은 세포를 수식 Fmag = (X2-X1)(V/μ0)B(▽B) 에 따른 표적 위치에서 유지한 채로, 상기 세포에 로딩된 자기 입자에 병진성 힘을 가하는 높은 자장/경사 산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  174. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 활성화는 자기 조절 생물 반응기를 사용하여 달성되는 원격 역학적 활성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  175. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 자화가능한 입자는 고유의 자석 또는 자기장에서 반응할 수 있는 자석인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  176. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 자화가능한 입자는 자석인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  177. 청구항 176에 있어서, 상기 자기 물질은 상자성 초상자성체, 강자성체 그리고/또는 반강자성체인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  178. 청구항 175에 있어서, 상기 자화가능한 물질은 철 또는 그 화합물, 크롬 화합물, 또는 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  179. 청구항 178에 있어서, 상기 철 화합물은 철염인 것을 특징으로 하는 자화가 능한 입자의 용도.
  180. 청구항 179에 있어서, 상기 철염은 자철광(Fe3O4), 감마산화제이철(γFe2O3), 그리고, 황화제삼철(Fe3S4) 또는 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  181. 청구항 178에 있어서, 상기 크롬 화합물은 크롬염인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  182. 청구항 181에 있어서, 상기 크롬염은 산화크롬(CrO2)인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  183. 청구항 176에 있어서, 상기 자기 물질은 생체친화성 코팅을 갖는 자기코어를 포함하는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  184. 청구항 183에 있어서, 상기 생체친화성 나노입자는 실리카, 덱스트란, 도는 PVA 코팅을 갖는 자철광 코어 그리고/또는 산화제이철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  185. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 입자는 나노입자인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  186. 청구항 185에 있어서, 상기 나노입자는 1나노미터 내지 10마이크로미터 범위의 크기인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  187. 청구항 187에 있어서, 상기 나노입자의 평균 크기는 5000나노미터 이하인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 자기적으로 조작하는 방법.
  188. 청구항 187에 있어서, 상기 나노입자의 평균 크기는 1나노미터 내지 5000나노미터인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  189. 청구항 185에 있어서, 상기 자기 나노입자는 10나노미터 이상 수 마이크로의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  190. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 코팅은 기능화되고 막 부착 모티브에 교차결합하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  191. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 상기 자기 나노입자는 세포 생활력 및 기능 상의 입자 내재화 주파수, 결합 효율, 안정성, 그리고 결합을 맞출 수 있 도록 변형되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  192. 청구항 191에 있어서, 상기 변형은 막 외부 상의 위치뿐만 아니라 내부 결합 위치를 맞추는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  193. 청구항 184에 있어서, 상기 입자는 코어 및 상기 코어를 감싸는 실리카 껍질을 구비하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  194. 청구항 193에 있어서, 상기 입자는 자화가능한 입자를 포함하는 코어 그리고 상기 코어를 감싸는 실리카 껍질을 포함하는 것들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  195. 청구항 183에 있어서, 상기 입자는 구멍내에 다중 자기 중심을 갖는 다공성 입자인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  196. 청구항 113 또는 청구항 144에 있어서, 자화가능한 입자 상에 원격 자기장을 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  197. 청구항 147에 있어서, 상기 입자는 세포내의 중요한 세포 성분을 인식하는 하나 이상의 특이 항원 또는 단백질 결합 모티브로 식별되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  198. 청구항 197에 있어서, 상기 특이 항원 또는 단백질 결합 모티브는 막투과 세포외 기질분자, 유착 분자 또는 분산된 막 부착 단백질들 또는 세포외 기질단백질들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  199. 청구항 198에 있어서, 상기 막투과 유착 분자는 인테그린, 카드헤린, 셀렉틴, 그리고 면역글로불린으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  200. 청구항 199에 있어서, 상기 특이 항원 또는 단백질 결합 모티브는 분산된 막 유착 단백질들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  201. 청구항 200에 있어서, 상기 분산된 막 유착 단백질은 RGD(아르기닌-글리신-아스파라진산염)인 것을 특징으로 하는 자화가능한 입자의 용도.
  202. 자화가능한 입자를 환자에 투여하고, 신체 외부로부터의 자기장을 사용하여 줄기세포의 이온 통로 또는 상기 줄기세포를 조작하는 것을 포함하는 이온 통로가 기능을 하는 질환을 겪는 환자를 치료하기 위한 요법 제조에서 줄기세포와 결합되는 자화가능한 입자의 용도.
  203. 자화가능한 입자를 세포와 결합하는 것에 의해서 상기 세포 내의 이온 통로에 대한 작용 작동 또는 대항 작동을 나타내고, 상기 자화가능한 입자를 자기적으로 조작하고, 그리고, 상기 자화가능한 입자와 함께, 개별적으로, 또는 순차적으로 상기 치료상 활성 물질을 투여하는 것을 포함하는 치료학적으로 활성 물질을 사용한 세포 표적화를 위한 시스템을 제조하는 방법에 사용하는 자화가능한 입자의 사용.
  204. 치료상 활성 물질; 그리고 자화가능한 입자를 세포와 결합하는 수단을 포함하는 키트.
  205. 첨부된 도면을 참조하여 기술한 방법 또는 사용.
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