KR20060114090A - An antifungal composition comprising resveratrol having antifungal activity - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 아플라톡신의 대표적 생산 균주인 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)에 대해 Agar hole assay를 실시하여 레스베라트롤의 항진균 활성을 나타낸 사진이며,1 is a photograph showing the antifungal activity of resveratrol by performing an Agar hole assay on Aspergillus flavus , a representative strain of aflatoxin,
도 2는 레스베라트롤의 시간에 따른 캔디다 알비칸스 (Candida albicans)에 대한 항진균 활성의 작용 형태를 나타낸 그래프이며,2 is a graph showing the mode of action of antifungal activity against Candida albicans over time of resveratrol,
도 3은 레스베라트롤의 캔디다 알비칸스의 세포의 형태에 미치는 영향을 나타낸 도이며,3 is a diagram showing the effect on the morphology of the cells of the Candida albicans of resveratrol,
도 4는 레스베라트롤의 병원성 진균인 캔디다 알비칸스가 생체 내의 감염 시 병원성을 유발시키는데 필수적인 역할을 하는 동종 이형(Dimorphic transition) 에 대한 영향을 나타낸 도이며,4 is a diagram showing the effect on the dimorphic transition that plays an essential role in inducing pathogenicity during infection in vivo, Candida albicans is a pathogenic fungus of resveratrol,
도 5는 레스베라트롤에 의한 캔디다 알비칸스의 세포 주기의 변화를 나타낸 그래프이다.5 is a graph showing the change in the cell cycle of Candida albicans by resveratrol.
본 발명은 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 레스베라트롤(trans-3,4',5-trihydroxystilbene)을 유효성분으로 함유하는 항진균용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an antifungal composition containing resveratrol (trans-3,4 ', 5-trihydroxystilbene) having antifungal activity against pathogenic fungi as an active ingredient.
지금까지 항생 활성을 가진 수많은 생물체 유래 항생제가 개발되면서 병원성 미생물, 특히 병원성 진균에 의한 질병 치료에 사용되어 왔지만 항생제의 오남용으로 인해 각종 항생제에 대해 내성을 지닌 내성 균주가 출현하게 되었다. 이로 인해 지금까지 사용된 수많은 항생제의 사용에 많은 제약이 따르고 있다. 이러한 시점에서 항생제 내성 균주에 대한 새로운 항생제의 개발이 절실하게 요구되고 있다. 또한 강력한 항진균 효과를 나타내며 각종 식품의 보존제 및 농약으로 사용되어지고 있는 화합물 등은 인체에 대하여 매우 유독한 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 화합물성 항진균제를 대체할 수 있는 인체에 무해하면서도 강력한 항진균 효과를 나타낼 수 있는 새로운 항진균 물질의 개발의 필요성이 제기되어지고 있다. Until now, a number of organism-derived antibiotics with antibiotic activity have been used to treat diseases caused by pathogenic microorganisms, especially pathogenic fungi, but the misuse of antibiotics has led to the emergence of resistant strains resistant to various antibiotics. This places a lot of restrictions on the use of many antibiotics used to date. At this point, the development of new antibiotics against antibiotic resistant strains is urgently needed. In addition, compounds that have a strong antifungal effect and are used as preservatives and pesticides of various foods are known to be very toxic to the human body. Therefore, there is a need for the development of a new antifungal substance that can replace the compound antifungal agent is harmless to the human body but can exhibit a strong antifungal effect.
레스베라트롤은 다양한 환경적 스트레스에 대한 식물체의 반응 과정에서 생성되는 식물 면역물질의 일종으로서, 포도, 땅콩, 오디 등의 식용 작물 등에서 분리 되어지는 것으로 알려져 있고(Jang, M., et al. Science. 275, p218, 1997), 특히 포도주에 고농도로 존재하는 것으로 알려져 있다(Soleas, G. J., et al. J. clin. Lab. Anal. 11, p287, 1997). 레스베라트롤에 대한 선행 연구로는 동물 모델에서의 항산화 작용(Lucia, A., et al. J. Biol. Chem. 276, p22586, 2001), 항염 작용 (Bertelli, A. A., et al. Int. J. Tissue React. 21, p93, 1999), 혈소판 응고 방지(Pace-Asciak, C. R., et al. Clin. Chim. Acta., 246, p163, 1996) 등의 생리 작용이 보고 되어 왔고, 특히 인간의 암세포를 대상으로 항암 작용(Scarlatti, F., et al. FASEB J., 17, p2339, 2003) 및 종양 형성 억제 작용(Jang, M., et al. Science., 275, p218, 1997) 등의 연구 결과들이 보고 되어 왔다. Resveratrol is a type of plant immune substance produced by the plant's response to various environmental stresses and is known to be separated from edible crops such as grapes, peanuts and audi (Jang, M., et al. Science. 275) . , p218, 1997), particularly in high concentrations in wine (Soleas, GJ, et al. J. clin. Lab. Anal. 11 , p287, 1997). Previous studies on resveratrol include antioxidant activity in animal models (Lucia, A., et al. J. Biol. Chem. 276 , p22586, 2001), anti-inflammatory action (Bertelli, AA, et al. Int. J. Tissue React. 21 , p93, 1999), and platelet coagulation prevention (Pace-Asciak, CR, et al. Clin. Chim. Acta., 246 , p163, 1996) have been reported, particularly in human cancer cells. Anticancer activity (Scarlatti, F., et al. FASEB J., 17 , p2339, 2003) and tumor suppression activity (Jang, M., et al. Science., 275 , p218, 1997). Has been reported.
그러나 상기 문헌 어디에도 레스베라트롤의 항진균 활성에 대한 어떠한 교시나 개시가 없는 바, 이에 본 발명자들은 레스베라트롤의 인체에 감염되는 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.However, there is no teaching or disclosure about the antifungal activity of resveratrol anywhere in the literature, and thus the present inventors have completed the present invention by confirming the antifungal activity against the pathogenic fungi infected with the human body of resveratrol.
본 발명의 목적은 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 항진균용 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 상기 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 식품 보존용 첨가제 또는 화장품 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide an antifungal composition containing resveratrol having an antifungal activity against pathogenic fungi as an active ingredient. In another aspect, the present invention provides a food preservative additive or cosmetic additive composition containing the resveratrol as an active ingredient.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 항진균용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an antifungal composition containing resveratrol having an antifungal activity against pathogenic fungi as an active ingredient.
상기 병원성 진균은 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Sacchromyces cerevisiae) 또는 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)을 포함한다.Such pathogenic fungi include Candida albicans , Trichosporon beigelii , Sacchromyces cerevisiae or Aspergillus flavus .
또한 본 발명은 상기 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 식품 보존용 첨가제 조성물 또는 화장품 첨가제 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a food preservative additive composition or cosmetic additive composition containing the resveratrol as an active ingredient.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 항진균용 조성물을 제공한다.The present invention provides an antifungal composition containing resveratrol having an antifungal activity against pathogenic fungi as an active ingredient.
본 발명의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 레스베라트롤은 포도, 땅콩, 오디 등의 식용 작물에서 분리되거나 당업계의 통상적인 방법에 의하여 합성하거나 일반 시중에서 구입하여 사용할 수 있다.Resveratrol having the structure of Formula 1 of the present invention can be isolated from edible crops such as grapes, peanuts, audi, synthesized by conventional methods in the art, or can be purchased commercially.
상기 화학식 1의 레스베라트롤은 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Sacchromyces cerevisiae) 또는 아스퍼질러스 플라버스 등의 병원성 진균에 대하여 항진균 활성을 나타내는 바, 상기 병원성 진균의 생육을 저지하고, 진균 세포를 파괴하며, 세포주기를 S기에서 정지시키며 캔디다 알비칸스(Candida albicans)의 병원성 인자를 유발하는데 필수적인 동종 이형(Dimorphic transition)에 대해 균사 체 형성을 저해하며 또한, 인간 적혈구 세포에 대하여 본 발명의 레스베라트롤은 세포독성을 전혀 나타내지 않았다. 또한 본 발명의 레스베라트롤은 상기 병원성 진균에 대해 정균작용이 아니라 살균작용을 하는 것이다.Resveratrol of Formula 1 has antifungal activity against pathogenic fungi such as Candida albicans , Trichosporon beigelii , Sacchromyces cerevisiae or Aspergillus flavers . Mycelia for dimorphic transition, which are essential for inhibiting the growth of the pathogenic fungi, destroying fungal cells, stopping the cell cycle at S phase and inducing pathogenic factors of Candida albicans . Inhibition of formation and also the resveratrol of the present invention showed no cytotoxicity to human red blood cells. In addition, the resveratrol of the present invention is a bactericidal action, not bacteriostatic action against the pathogenic fungi.
또한 본 발명은 상기 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 식품 보존용 첨가제 또는 화장품 첨가제 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a food preservative additive or cosmetic additive composition containing the resveratrol as an active ingredient.
본 발명은 상기 항진균 활성을 갖는 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하여 식품 보존용 첨가제로 이용하여 식품을 장기간 보존할 수 있으며, 또한 상기 항진균 활성을 갖는 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하여 화장품 첨가제로 이용하여 손 또는 발의 청결유지를 위한 화장료 조성물 제조할 수 있다.The present invention can contain the resveratrol having the antifungal activity as an active ingredient to preserve food for a long time using as an additive for food preservation, and also containing the resveratrol having the antifungal activity as an active ingredient as a cosmetic additive Cosmetic compositions for keeping feet clean can be prepared.
이하 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 권리범위를 한정하지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following Examples and Experimental Examples. However, the following Examples and Experimental Examples illustrate the present invention and do not limit the scope of the present invention.
실시예 1. 레스베라트롤 및 실험 균주의 준비Example 1 Preparation of Resveratrol and Experimental Strains
레스베라트롤(trans-3,4',5-trihydroxystilbene)의 항진균 활성을 입증하기 위하여 시그마 알드리치 코리아사로부터 구입하여 하기 실험에 이용하기 까지 4 ℃에서 보관하고, 멸균된 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해하여 하기의 실험에 이용하였다. 병원성 균주인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)는 일본 오사카의 아카데믹 서사이어티즈(Academic Societies)로부터, 트리코스포론 베이겔리 (Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)는 한국생명공학연구원의 한국유전자원은행(KCTC)으로부터 분양받아 실험에 이용하였다.To demonstrate the antifungal activity of resveratrol (trans-3,4 ', 5-trihydroxystilbene), purchased from Sigma Aldrich Korea, stored at 4 ° C until used in the following experiment, dissolved in sterile DMSO (dimethyl sulfoxide) It was used for the experiment. Candida albicans , a pathogenic strain, is derived from Academic Societies in Osaka, Japan, Trichosporon beigelii , Saccharomyces cerevisiae , and Aspergillus flavisia . Aspergillus flavus was distributed from Korea Genetic Resources Bank (KCTC) of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.
실험예 1. 병원성 진균에 대한 생육저지실험Experimental Example 1. Growth inhibition test for pathogenic fungi
병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 YPD 완전 배지(포도당 2 %, 펩톤 1 %, 효모 추출액 0.5 %, pH 5,5)에 배양하여, YPD 액체 배지로 2×103 세포/ 1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 상기 실시예 1에서 준비한 레스베라트롤을 멸균된 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 80, 40, 20, 10, 5, 2.5 ㎍의 양으로 처리하였다. 플레이트를 28 ℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl- 2H-tetra- zolium bromide] 용액 [5 mg of MTT/mL of PBS (pH 7.4)]을 각각의 웰에 넣고, 37 ℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. MTT에 의하여 생성된 포르마잔(Formazan)들을 용해하기 위해 0.02 N HCl이 포함된 20 % SDS를 20 ㎕를 넣은 후, 37 ℃에서 16시간 반응시켰다. ELISA 판독기(reader)로 570 nm의 파장 하에서의 각 웰의 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도(MIC)를 측정하였다.Pathogenic fungi Candida albicans , Trichosporon beigelii , Saccharomyces cerevisiae were added to YPD complete medium (2% glucose, 1% peptone, 0.5% yeast extract, incubated at pH 5,5), diluted with YPD liquid medium to 2 × 10 3 cells / 1 mL of bacterial count, dispensed 100 μl into a 96-well plate, and then sterilized the resveratrol prepared in Example 1 above. Dimethyl sulfoxide (DMSO) was treated in an amount of 80, 40, 20, 10, 5, 2.5 μg. After incubating the plate for 24 hours in a 28 ° C. incubator, MTT [3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetra-zolium bromide] solution [5 mg of MTT / mL of PBS (pH 7.4)] into each well and incubated for 4 hours in a 37 ℃ incubator. To dissolve Formazan produced by MTT, 20 μl of 20% SDS containing 0.02 N HCl was added and reacted at 37 ° C. for 16 hours. The minimum growth inhibition concentration (MIC) was determined by measuring the absorbance of each well under a wavelength of 570 nm with an ELISA reader.
상기 실험 수행의 결과, 하기 표 1에서 보는 바와 같이, 레스베라트롤의 최 소 생육 저지 농도(MIC)가 대조군인 현재 임상적으로 사용되고 있는 항진균제인 암포테리신 B와 큰 차이가 없는 10 - 20 ㎍에서 형성되는 것으로 보아 매우 강력한 항진균 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 하기 표 1에서의 a는 병원성 진균에 대해 생육이 전혀 안되는 레스베라트롤의 농도를 의미한다.As a result of the experiment, as shown in Table 1 below, the minimum growth inhibition concentration (MIC) of resveratrol was formed at 10-20 ㎍ without significant difference from the currently clinically used antifungal agent amphotericin B. It can be seen that it shows a very strong antifungal activity. In Table 1, a means the concentration of resveratrol that is not grown at all against pathogenic fungi.
실험예 2. 레스베라트롤의 항진균 활성의 가시적 관찰Experimental Example 2 Visual Observation of Antifungal Activity of Resveratrol
레스베라트롤의 항진균 활성을 가시화하기 위해 아스퍼질러스 플라버스의 포자를 채취하여 YPD 액체 배지에 섞은 후, YPD 고체 배지 페트리 접시에 도말하고 배지 가운데에 작은 구멍을 만들었다. 만들어진 구멍에 500㎍의 레스베라트롤 용액을 첨가한 후, 28 ℃ 배양기에서 4일간 배양하여 페트리 접시 사진을 찍었다.In order to visualize the antifungal activity of resveratrol, spores of Aspergillus plabus were harvested and mixed in YPD liquid medium, plated in a YPD solid medium Petri dish and made a small hole in the middle of the medium. 500 μg of resveratrol solution was added to the prepared holes, and then cultured in a 28 ° C. incubator for 4 days to take a Petri dish.
상기 실험 수행의 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 레스베라트롤을 처리한 페트리 접시의 가운데 부분에는 아스퍼질러스의 균사체가 자라지 않는 것을 확인할 수 있었고, 이로써 레스베라트롤의 항진균 활성을 분명하게 확인할 수 있었다.As a result of the experiment, it was confirmed that the mycelia of Aspergillus did not grow in the middle part of the Petri dish treated with resveratrol as shown in FIG. 1, thereby clearly confirming the antifungal activity of resveratrol.
실험예 3. 시간별 레스베라트롤의 항진균 활성Experimental Example 3. Antifungal activity of resveratrol over time
캔디다 알비칸스를 YPD 배지에서 배양한 후, 세포수를 2×103 세포/1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 분주하였다. 그런 후, 레스베라트롤 용액 20㎍을 처리하고 28℃에서 배양하면서 2, 4, 8, 12, 24 시간 별로 YPD 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 28 ℃ 배양기에서 도말한 페트리 접시를 배양하여 형성된 집락의 수를 확인하였다. 대조군으로 암포테리신 B 5㎍을 처리하여 실험하였다.After Candida albicans was incubated in YPD medium, the dilution was dispensed into 96-well plates by diluting the cells with YPD medium to 2 × 10 3 cells / 1 mL. Then, the number of colonies formed by treating 20 μg of resveratrol solution and incubating at 28 ° C. for 2, 4, 8, 12 and 24 hours in a YPD solid medium petri dish and incubating the petri dish plated in a 28 ° C. incubator. Confirmed. Experiments were performed by treating 5 μg of amphotericin B as a control.
상기 실험 수행의 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 레스베라트롤을 처리하고 시간이 흐르면서 캔디다 알비칸스의 집락형성수가 현저히 감소하기 시작하면서 레스베라트롤 처리 8시간 후에는 집락형성을 전혀 볼 수 없는 바, 이는 본 발명의 레스베라트롤의 항진균 활성은 병원성 진균에 대해서 정균 작용이 아니라, 살균 작용을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 2에 있어서 ▼는 어떠한 물질도 처리하지 않은 음성 대조구, ●는 5㎍ 암포테리신 B를 처리구, 그리고 ○는 20㎍ 레스베라트롤 처리구를 나타낸다).As a result of the experiment, as shown in FIG. 2, the colony formation of Candida albicans started to decrease significantly over time after treatment with resveratrol, and no colony formation was observed after 8 hours of resveratrol treatment. It was confirmed that the antifungal activity of resveratrol was not bacteriostatic but pathogenic to the pathogenic fungi (in FIG. 2, negative control without any substance was treated with 5 μg amphotericin B, and ○ indicates a 20 μg resveratrol treatment).
실험예 4. 레스베라트롤에 의한 진균세포의 형태 변화 관찰Experimental Example 4 Observation of Morphological Changes of Fungal Cells by Resveratrol
YPD 배지에서 배양된 캔디다 알비칸스에 레스베라트롤 20 ㎍을 처리하여 28 ℃에서 2시간 동안 배양한 후, 4 % 글루탈알데히드와 1 % 파라포름알데히드가 포함된 0.05 M Cacodylate buffer(pH 7.2)로 4 ℃에서 3시간동안 고정시킨다. 0.05 M Cacodylate buffer로 세 차례 세척한 후, 에탄올과 건조기를 이용하여 탈수 및 건조시키고 도금하여 전자 현미경으로 관찰하였다.Candida albicans cultured in YPD medium was treated with 20 ㎍ of resveratrol and incubated for 2 hours at 28 ℃, followed by 4 ℃ with 0.05 M Cacodylate buffer (pH 7.2) containing 4% glutaraldehyde and 1% paraformaldehyde. Fix for 3 hours at. After washing three times with 0.05 M Cacodylate buffer, dehydration, drying and plating using ethanol and dryer were observed by electron microscope.
상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 어떠한 물질도 처리하지 않은 (가)에 비하여 본 발명의 레스베라트롤 20㎍을 처리한 (나)에서의 캔디다 알비칸스의 세포가 파괴되어 형태가 변하는 것을 확인할 수 있었다.As a result of performing the experiment, it was confirmed that the cells of Candida albicans in the (b) treated with 20 μg of the resveratrol of the present invention were changed in form compared to (A) which did not process any substance as shown in FIG. 3. Could.
실험예 5. 동종이형에 대한 레스베라트롤의 영향Experimental Example 5. Effect of resveratrol on allogeneic
캔디다 알비칸스가 병원성 인자를 유발하는데 필수적인 동종 이형(Dimorphic transition)에 대한 레스베라트롤의 영향을 조사하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 캔디다 알비칸스을 YPD 배지에서 배양한 후, 세포수가 2×105 세포/1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 분주하였다. 20 % 송아지 혈청액(Fetal bovine serum)을 넣어 생체 내와 유사한 환경을 갖추고 레스베라트롤을 20㎍을 처리한 구와 레스베라트롤 40㎍만을 처리한 구에서 체온과 동일한 온도인 37 ℃ 배양기에서 배양하면서 균의 형태 변화를 관찰하였다.The following experiments were conducted to investigate the effect of resveratrol on the dimorphic transition essential for Candida albicans to induce pathogenic factors. Candida albicans was incubated in YPD medium, then diluted with YPD medium so that the cell number was 2 × 10 5 cells / 1 mL and the dilutions were dispensed into 96-well plates. Changes in the morphology of microorganisms were cultured in a 37 ° C. incubator at 20 ° C incubated with 20% fetal bovine serum and treated with 20 µg of resveratrol and 40 µg of resveratrol. Was observed.
상기 실험 수행의 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 대조구인 송아지의 혈청액만을 넣은 경우에는 균사체를 형성하는데 비하여, 레스베라트롤의 처리구에서는 균사체 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 레스베라트롤이 생체 내에서 캔디다 알비칸스에 의한 발병을 막을 수 있음을 확인할 수 있었다(도 4의 (가)는 어떤 물질도 처리하지 않은 음성 대조구, (나)는 송아지 혈청액만을 처리한 구, (다)는 송아지 혈청액과 레스베라트롤 20㎍을 처리한 구, (라)는 레스베라트롤 40㎍만을 처리한 구이다).As a result of performing the experiment, as shown in FIG. 4, only the serum solution of the calf as a control was added to the mycelium, whereas it was confirmed that the mycelium formation was inhibited in the treatment group of resveratrol. As a result, it was confirmed that resveratrol can prevent the incidence caused by Candida albicans in vivo ((A) of FIG. 4 is a negative control not treated with any substance, and (B) is treated with calf serum only, ( C) treated with calf serum and 20 μg of resveratrol, and (d) treated with only 40 μg of resveratrol).
실험예 6. 진균세포주기에 대해 레스베라트롤이 미치는 영향Experimental Example 6. Effect of resveratrol on fungal cell cycle
캔디다 알비칸스 세포수가 1×109 세포/1 mL가 되도록 YPD배지에서 배양한 후, 100㎍ 레스베라트롤을 처리하여 28℃ 배양기에서 6시간 배양한 후, DNA 염색 시약인 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)를 사용하여 DNA를 염색한 후, flow cytometry를 이용하여 형광의 강도를 측정하였다.After incubating in YPD medium so that the number of Candida albicans cells becomes 1 × 10 9 cells / 1 mL, the cells were treated with 100 ㎍ resveratrol and incubated for 6 hours in a 28 ° C incubator, followed by propidium iodide, a DNA staining reagent. After DNA staining using the flow cytometry was measured the intensity of fluorescence.
상기 실험 수행의 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 아무 물질도 처리하지 않은 대조구의 세포 주기 그래프(가)와 달리 레스베라트롤 처리구(나)에서의 캔디다 알비칸스의 세포 주기가 S기에서 멈추는 것을 확인할 수 있었는 바, 본 발명의 레스베라트롤은 진균세포의 분열을 억제함을 확인할 수 있었다.As a result of the experiment, it was confirmed that the cell cycle of Candida albicans in the resveratrol treatment (I) stopped at S phase, unlike the cell cycle graph (A) of the control which was not treated with any substance as shown in FIG. 5. The resveratrol of the present invention was confirmed to inhibit the division of fungal cells.
실험예 7. 세포 독성 실험Experimental Example 7. Cytotoxicity Test
본 발명의 레스베라트롤 화합물이 세포에 대한 독성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여 하기의 실험방법을 수행하여 인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성을 측정하였다. 적혈구 세포(Human red blood cell)를 pH 7.4의 인산-염화나트륨 완충액(PBS)으로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액으로 희석하여, 8.0 %의 적혈구 세포 용액을 만들었다. 그 후 8.0 % 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100㎕씩 분주한 후에 레스베라트롤을 단계적으로 희석한 용액을 섞어주었다. 각각의 웰에 총액의 양이 200 ㎕가 되도록 생리 식염수(Saline, 0.85 % NaCl)을 넣어주고, 37 ℃ 배양기에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1500 rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 각각의 상등액을 새로운 웰로 옮겼다. 적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기(reader)로 414 nm의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 0.1 % 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다. 레스베라트롤의 파괴능은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였다.In order to determine whether the resveratrol compound of the present invention is toxic to cells, cytotoxicity to human erythrocytes was measured by performing the following experimental method. Human red blood cells were washed three times with pH 7.4 phosphate-sodium chloride buffer (PBS) and then diluted with phosphate-sodium chloride buffer to make 8.0% red blood cell solutions. Thereafter, 100 μl of the 8.0% red blood cell solution was dispensed into a 96-well plate, followed by mixing the resveratrol diluted solution. Each well was added with physiological saline (Saline, 0.85% NaCl) so that the total amount of 200 μl, and incubated for 1 hour 30 minutes in a 37 ℃ incubator. After incubation, each supernatant was transferred to a new well by centrifugation for 10 minutes at a rotational speed of 1500 rpm in a centrifuge. Destructive capacity for erythrocytes was analyzed by measuring the absorbance under a wavelength of 414 nm with an ELISA reader. And when treated with 0.1% Triton X-100 as a control, the value was calculated as 100% destructive capacity, and only the red blood cells were counted as 0% destructive capacity. The breaking capacity of resveratrol was calculated by the following equation.
상기 실험 수행의 결과,하기 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 레스베라트롤은 전혀 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 그에 비해 임상에서 항진균제로 사용되어지는 암포테리신 B은 강력한 세포 독성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 레스베라트롤은 세포독성을 전혀 나타내지 아니하므로 신체에 대한 피해 없이 안전하게 사용할 수 있다.As a result of the experiment, it was confirmed that the resveratrol of the present invention shows no cytotoxicity as shown in Table 2 below. In contrast, amphotericin B, which is used as an antifungal agent in the clinic, showed strong cytotoxicity. Therefore, the resveratrol of the present invention does not exhibit any cytotoxicity, and thus can be used safely without damaging the body.
본 발명은 항진균 활성을 갖는 레스베라트롤(trans-3,4',5-trihydroxystilbene)을 유효성분으로 함유하는 항진균용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 레스베라트롤은 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Sacchromyces cerevisiae) 또는 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus) 등의 병원성 진균의 생육을 저지시키고, 상기의 진균 세포를 파괴하며 균사체 형성을 저해하며 또한 세포의 주기가 S기에서 정지시킴으로서 탁월한 항진균 활성을 가지고 있으며, 세포독성이 없어 인체에 안전하기에 본 발명의 항진균 활성을 갖는 레스베라트롤은 항진균제, 식품보존용 첨가제 또는 화장품 첨가제로서의 이용이 가능하다.The present invention relates to an antifungal composition containing resveratrol (trans-3,4 ', 5-trihydroxystilbene) having antifungal activity as an active ingredient, wherein the resveratrol of the present invention is Candida albicans , Tricosporon Bay. It inhibits the growth of pathogenic fungi, such as Jelly ( Trichosporon beigelii ), Sacchromyces cerevisiae or Aspergillus flavus , destroys the fungal cells and inhibits mycelial formation. Resveratrol having antifungal activity of the present invention can be used as an antifungal agent, a food preservative additive or a cosmetic additive because the cell cycle has excellent antifungal activity by stopping at S phase, and has no cytotoxicity and is safe for human body.
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