KR20060105877A - 신규한 프로스타글란딘 수용체 단백질을 암호화하는 핵산및 이의 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에서는 프로스타노이드 수용체 계열의 새로운 일원, 기니 피그 프로스타글란딘 D2 수용체를 기술한다. 또한, 상기 수용체, 이를 암호화하는 핵산, 및 이의 다양한 용도를 기술한다.
프로스타글란딘 수용체, 프로스타노이드 수용체, 기니 피그 프로스타글란딘 D2 수용체

Description

신규한 프로스타글란딘 수용체 단백질을 암호화하는 핵산 및 이의 이용 방법 {Nucleic acid encoding a novel prostaglandin receptor protein and methods of use thereof}
총괄적으로, 본 발명은 프로스타노이드 (prostanoid) 수용체 계열의 지금까지 알려지지 않은 일원을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.
프로스타글란딘 (PG), 프로스타사이클린, 트롬복산 (TX)을 비롯한 프로스타노이드는 중추와 말초 생리 효과에 있어서 중요한 매개인자이다. 프로스타글란딘 D2 (PGD2)는 뇌, 비장, 폐, 골수, 위, 피부, 비만 세포(mast cell)를 비롯한 다양한 조직에서 생성된다 (Lewis 등, 1982). PGD2는 중추신경계와 말초신경계 모두에서 많은 생리 효과에 관여한다. 중추신경계에서, PGD2는 수면 유도, 체온, 후각 기능, 호르몬 방출, 통증에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 말초에서, PGD2는 면역학적 시험접종(challenge) 이후 비만 세포로부터 생산된 아라키돈산의 주요 사이클로옥시게나제 생성물이다. 알레르기 비염, 기관지 천식, 알레르기 결막염, 아토피성 피부염 환자에서 국소 알레르기원 시험접종(challenge)은 비강과 기관지 누출액 (lavage fluid), 눈물, 피부 챔버액 (chamber fluid)에서 PGD2 수준의 급격한 증가를 유발하는 것으로 밝혀졌다. PGD2의 주요 출처인 활성화된 비만 세포는 천식, 알레르기 비염, 알레르기 결막염, 알레르기 피부염 및 기타 질병과 같은 질환에서 알레르기 반응을 유도하는 핵심 인자중의 하나이다 (Brightling 등, 2003). 유사하게, PGD2는 결막과 피부에서 혈관 투과성의 증가, 비강 기도 내성의 증가, 기도 축소, 결막과 기관으로의 호산구 침윤과 같은 여러 염증 작용을 유발한다. 이런 이유로, PGD2는 염증 반응을 유도하는 핵심 인자중의 하나로서 간주된다.
초기 노력은 5가지 자연 발생 생물활성 프로스타노이드, PGD2, PGE2, PGF2 α, PGI2, TXA2에 대한 개별 수용체를 확인하는데 집중되었고, 그 결과로써 5가지 기본 유형의 프로스타노이드 수용체가 분류되었다: 각각 DP, EP, FP, 프로스타사이클린 (IP), 트롬복산 (TP) 수용체 (Coleman 등, 1994). 프로스타글란딘 D2의 작용 중에서 대부분은 D-형 프로스타글란딘 수용체 (DP), G 단백질-결합된 수용체에 대한 작용을 통하여 매개된다. 초기에는 각 프로스타노이드가 개별 수용체에 우선적으로 작용하는 것으로 생각되었지만, 프로스타노이드 생물학을 연구하는 연구자들은 상이한 수용체 계열의 일원과 상호작용하는 이들 리간드의 무차별성 (promiscuity)을 인식하게 되었다. 따라서, 프로스타노이드 신호전달을 이해하기 위하여, 프로스타노이드 수용체 활성화의 생물학적 결과를 명료하게 밝혀야 한다는 점이 더욱 분명해지고 있다.
DP 수용체가 특히 주목을 받고 있는데, 그 이유는 중추 세포와 말초 세포에 서 다양한 생물학적 경로의 매개에서 DP수용체의 관련 및 이로 인한 여러 질병 상태에서 DP수용체의 잠재적인 치료 중요성이 제안되기 때문이다. DP 수용체는 뇌에서 확인되었고, PGD2는 수면 유도, 체온, 후각 기능, 호르몬 방출에 영향을 준다 (Negishi, 등, 1993; Wright 등, 1999 및 이의 참고문헌). DP 수용체는 척수의 별개의 상이한 세포 개체군으로 국소화되었다. 이런 관찰 결과는 PGD2에 의해 유도되는 통각 과민 (hyperalgesia)과 이질통 (allodynia) (정상적으로 무해한 촉각 자극으로부터 불쾌감)의 부조화 효과를 설명할 수 있다. DP 수용체는 위장관에도 존재하고 GI 관의 수축 반응에 관여한다 (Wright 등, 1999; Ito 등, 1989). 또한, DP 수용체 리간드는 장 세포의 점액 분비와 세포 증식을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 간에서 글리코겐합성 (glycogenesis) 역시 DP 수용체에 의해 조절될 수 있다 (Ito 등, 1989). DP 수용체는 눈에서 발견되고, 효능제는 안압을 감소시키는데, 이는 녹내장에서 일정한 역할을 한다는 것을 암시한다. 혈소판은 DP 수용체를 보유하고, PGD2는 혈소판 응집을 저해하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 혈전증과 같은 혈액 질환의 조절에서 DP 수용체의 역할을 암시한다 (Armstrong, 1996). 따라서, 서로 다른 기관과 조직에서 DP 수용체의 발현의 변화는 DP 수용체가 상이한 치료 분야에서 매력적인 표적이 될 수 있음을 암시한다.
특히 흥미롭게도, DP 수용체는 천식, 알레르기 비염, 기도 과민증, 알레르기 피부염, 알레르기 결막염, 만성 폐쇄성 폐 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 염증 질환에 관여한다. 이는 PGD가 면역시험접종된(immunochallenged) 비만 세포에 의해 방출된 주요 프로스타노이드라는 관찰 결과에 의해 뒷받침된다 (Roberts, 등, 1980). 천식에서, 호흡 상피 (respiratory epithelium)는 질병의 진행을 유도하는 염증성 사이토킨과 케모킨의 핵심 출처로서 인식되고 있다 (Holgate 등, 2000). 천식의 실험적 쥐의 모델에서, DP 수용체는 항원 시험접종시에 기도 상피에서 상당히 상향조절된다 (Matsuoka 등, 2000). 반대로, DP 수용체가 결핍된 녹아웃 (knockout) 마우스에서는 인간에서 천식의 2가지 주요한 특징인 기도 과민성과 만성 염증이 현저하게 감소한다 (Matsuoka 등, 2000). 유사하게, DP 수용체 길항제는 기니 피그 실험적 천식 모델에서 기도 염증을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Arimura 등, 2001). DP 수용체는 재채기, 가려움, 비루, 코막힘 증상으로 특성화되는 상습적인 알레르기 질환인 인간에서 알레르기 비염에도 관여하는 것으로 생각된다. PGD2를 코에 국소 투여하면, 코막힘에서 약량-의존성 증가를 유발한다 (Doyle 등 1990). DP 길항제는 복수 종에서 알레르기 비염 증상을 완화시키는데 유효한 것으로 밝혀졌고, 더욱 구체적으로 알레르기 비염의 가장 명백한 증상인 항원-유도된 코막힘을 저해하는 것으로 밝혀졌다. DP 길항제는 알레르기 결막염과 알레르기 피부염의 실험 모델에도 유효하다 (Arimura 등, 2001). 따라서, DP 길항제는 기관지 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 알레르기 비염, 알레르기 피부염, 알레르기 결막염, 전신 비만세포증, 허혈성 재관류 손상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 PGD2-매개된 질환의 치료에 사용될 수 있다.
현재까지, 인간 (Boie 등, 1995), 래트 (Wright 등, 1999), 마우스 (Hirata 등, 1994)로부터 DP수용체가 클로닝되었다. 이들 DP 수용체는 인간, 마우스, 래트 사이에 아미노산 수준에서 73-90% 상동성을 공유하고, 각 경우에 재조합 수용체의 활성화는 세포내 cAMP의 축적을 유발한다. 일반적으로, G 단백질 결합된 수용체 사이에서, 화합물은 한 상동분자종 (orthologue) 수용체 내지 다른 상동분자종 수용체에서 가변적인 효능을 보이는 것으로 관찰된다.
기니 피그 기원의 DP 수용체는 본 명세서에서 최초로 개시되었다. 본 발명은 현재 당분야에 공지된 것보다 많은 여러 이점을 제공한다. 마우스, 래트, 인간, 기니 피그 사이의 종간 차이는 더욱 완전하게 확인하고 특성화될 수 있다. 고유 조직에서 DP 수용체는 발현 수준이 낮기 때문에, 상기 수용체의 조절물질, 효과인자(effctor), 효능제(agonist) 또는 길항제(antagonist)로서 화합물의 활성을 평가하기 어렵다. 본 발명은 분리 정제된 조건에서 수용체를 검사할 수 있는 기회를 제공하고, 화합물을 검사하고 시험관내 연구 결과를 생체내에서 동일 종에 연계시키는 능력을 제공한다. 기니 피그는 상대적으로 큰 크기로 인하여, 예로써 피부병과 위장 연구의 측면에서 더욱 많은 표면적을 제공하기 때문에 상대적으로 작은 설치류에 비하여 선호되는 동물 모델이다. 더욱 중요하게는, 기니 피그는 일부 알레르기 모델, 예를 들면, 코막힘에 가장 유용한 소형 동물 모델이고, 기도 과민증 조작에 더욱 민감하다. 기니 피그가 상기와 같이, 복수 질병 모델에서 DP 수용체 조절물질의 평가를 위한 이상적인 전임상 모델이긴 하지만, 기니 피그 DP 수용체의 클로닝은 이전에 보고된 바가 없었고, 따라서 이와 같은 상동분자종에 대한 화합물의 친화성을 예측하기 어렵다.
도 1에서는 본 발명의 수용체의 핵산 서열 (서열번호 1)을 도시한다.
도 2에서는 본 발명의 수용체의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 도시한다.
도 3에서는 복수 종 사이에 DP 수용체의 암호화 서열의 정렬을 도시한다. 음영된 잔기는 기니 피그 잔기에 정확하게 일치한다. Hs = 인간; Rn = 래트; Mm = 마우스; Cp = 기니 피그.
도 4에서는 복수 종 사이에 DP 수용체의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 음영된 잔기는 기니 피그 잔기에 정확하게 일치한다. Hs = 인간; Rn = 래트; Mm = 마우스; Cp = 기니 피그.
도 5에서는 기니 피그 (Cavia porcellus) DP 수용체의 게놈 DNA 단편의 노던 블랏 분석을 도시한다. 레인 1: Invitrogen 0.24-9.5 Kb RNA 라더 (ladder); 레인 2: 시험접종되지 않은 기니 피그 (Cavia porcellus)로부터 전체 폐상피 RNA; 레인 3: 시험접종된 기니 피그 (Cavia porcellus) 난알부민으로부터 전체 폐상피 RNA.
도 6에서는 마우스 DP 수용체로 산출된 동등 세포주 및 모 세포주에 비하여, 안정적으로 형질감염된 HEK-293-Gα16 세포에서 발현된 재조합 기니 피그 DP 수용체의 PGD2-유도된 칼슘 동원의 실례를 도시한다.
도 7에서는 SPA cAMP 분석을 이용하여 안정적으로 형질감염된 HEK-293-Ga16 세포에서 발현된 재조합 기니 피그 DP 수용체의 PGD2-용량 반응 곡선의 실례를 도시한다. 마우스 DP 수용체로 산출된 동등 세포주 및 모 세포주에 대한 비교가 포함 된다.
본 발명은 프로스타노이드 (prostanoid) 수용체 계열을 포함하지만 이에 국한되지 않는 분리된 핵산과 단백질 형태에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산과 단백질은 기니 피그 (guinea pig) DP 수용체를 나타낸다. 본 발명의 다양한 측면은 아래의 단락에서 더욱 상세하게 기술한다.
정의
본 명세서에서, "핵산 분자"는 리보뉴클레오시드 (아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘: "RNA") 또는 데옥시리보뉴클레오시드 (데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 데옥시시티딘: "DNA")의 포스페이트 에스테르 중합체형, 또는 포스포로티오에이트 및 티오에스테르와 같은 임의의 포스포에스테르 유사체로 된 단일 가닥 또는 이중 가닥 나선형을 의미한다. 핵산 분자에는 암호화 또는 비-암호화 단일-가닥이나 이중-가닥 합성 DNA인 데옥시리보핵산 분자 (DNA), 예를 들면, 게놈 DNA와 상보성 DNA (cDNA); 단일-가닥이나 이중-가닥 리보핵산 (RNA) 분자; DNA 유사체와 뉴클레오티드 유사체를 이용하여 산출된 RNA가 포함된다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA 나선형도 가능하다.
본 명세서에서, "분리된" 또는 "정제된" 핵산 분자는 핵산의 자연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 적절하게는, "분리된" 핵산 (특히, 단백질 암호화 서열)은 핵산이 유래된 생물체의 게놈 DNA에서 핵산에 천연적으로 인접하는 서열 (가령, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없다. 다양한 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 본 발명의 뉴클레오티드 분자에 인접한 뉴클레오티드 서열을 대략 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb 미만으로 보유할 수 있다. 가령, 이들 인접 뉴클레오티드 서열은 핵산이 분리된 세포의 게놈 DNA에서 뉴클레오티드 분자에 천연적으로 인접하는 서열일 수 있다. 핵산은 내인성 환경으로부터 실질적으로 이전되어 당업자에 의한 조작, 예를 들면, 뉴클레오티드 서열 염기 분석, 제한 절단, 특정 부위 돌연변이유발, 발현 벡터로의 서브클로닝 (subcloning)될 수 있는 경우에 분리된 것으로 간주된다. 핵산은 완전 세포 또는 세포 용해물에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있다. 세포로부터 정제된 핵산 분자는 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않는다. 화학적으로 합성된 핵산은 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 존재하지 않는 경우에 정제된 것으로 간주된다.
폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드, 즉, 분리되거나 또는 정제되거나 (상기 정의한 바와 같음), 또는 그렇지 않으면 그의 천연 상태로 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드의 해독 유도된 폴리펩티드를 의미한다. 이 용어는 가령 클로닝 벡터나 발현 벡터 뿐만 아니라, 합성 폴리펩티드를 포함하는 세포들 내에 포함되거나 또는 그에 의해 발현된 폴리펩티드들을 포함한다.
본 명세서에서, "조절물질 (modulator)"은 본 발명의 수용체 단백질의 활성을 조절하는 부분 (가령, 리간드와 후보 화합물을 포함하나 이에 국한되지 않음)을 의미한다. 본 발명의 조절물질은 효능제, 부분 효능제, 길항제, 또는 역효능제 (inverse agonist)가 될 수 있다.
본 명세서에서, "효능제"는 수용체에 결합되는 경우에, 세포내 반응을 활성화시키거나 또는 막에 대한 GTP 결합을 강화시키는 부분 (가령, 리간드와 후보 화합물을 포함하나 이에 국한되지 않음)을 의미한다.
본 명세서에서, "부분 효능제"는 수용체에 결합되는 경우에, 효능제에 의해 유도되는 것보다 다소 낮은 정도로 세포 반응을 활성화시키거나 또는 효능제에 의해 유도되는 것보다 다소 낮은 정도로 막에 대한 GTP 결합을 강화시키는 부분 (가령, 리간드와 후보 화합물을 포함하나 이에 국한되지 않음)을 의미한다.
본 명세서에서, "길항제"는 효능제가 결합하는 동일한 부위에서 수용체와 경쟁적으로 결합하는 부분 (가령, 리간드와 후보 화합물을 포함하나 이에 국한되지 않음)을 의미한다. 하지만, 길항제는 수용체의 활성화 형태에 의해 개시되는 세포내 반응을 활성화시키지 않으며, 효능제 또는 부분 효능제에 의한 세포내 반응을 저해할 수 있다. 관련 측면에서, 길항제는 효능제 또는 부분 효능제가 없어도 기저 세포내 반응을 감소시키지 않는다.
본 명세서에서, "역효능제"는 구성적(constitutive) 활성 수용체에 결합하여 기저 세포내 반응을 저해하는 부분 (가령, 리간드와 후보 화합물을 포함하나 이에 국한되지 않음)을 의미한다. 기저 반응은 효능제 또는 부분 효능제 없이 관찰되는 정상적인 기저 활성 수준 이하에서 수용체의 활성 형태, 또는 막에 대한 GTP 결합의 감소에 의해 개시된다.
본 명세서에서, "후보 화합물"은 스크리닝 기술에 사용될 수 있는 부분 (가령, 화학적 화합물을 포함하나 이에 국한되지 않음)을 의미한다. 한 구체예에서, 여기에는 효능제, 부분 효능제, 역효능제 및 길항제로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있는 공지된 화합물이 포함되지 않는다. 이들 화합물은 수용체에 특이적인 내인성 리간드를 확인하거나 수용체에 대항하는 후보 화합물을 스크리닝하는 과정 (이때, 스크리닝은 효능을 평가하기 위한 경쟁 분석을 요한다)을 수반하는 전통적인 약물 발견 공정으로 확인할 수 있다.
본 명세서에서, "구성적 활성 수용체" 또는 "자가 활성화 수용체"는 리간드 없이 활성화될 수 있는 수용체를 의미하며, 이들 두 가지 용어는 상호 호환적으로 이용된다. 이와 같은 구성적 활성 수용체는 내인성 또는 비-내인성이다 (즉, 재조합 수단을 이용하여 GPCR를 변형시켜 야생형 GPCR의 돌연변이 구성적 형태를 만들 수 있다; 참조: EP 1071701; WO 00/22129; WO 00/22131; U.S. Patent No. 6,150,393호; U.S. Patent No. 6,140,509; 이들 문헌을 참고 문헌으로서 본원에 인용한다.).
본 명세서에서, "구성적 수용체 활성화"는 수용체와 내인성 리간드 또는 이의 화학적 등가체의 결합 이외의 수단에 의해 활성 상태에서 수용체의 안정화를 의미한다.
본 명세서에서, "리간드"는 다른 분자에 결합하는 부분을 말하는데, 이러한 부분에는 호르몬 또는 신경 전달 물질 등이 포함될 수 있으나 이에 국한되지 않고, 또한 상기 부분은 입체 선택적으로 수용체에 결합된다.
본 명세서에서, 본 발명의 핵산 분자 또는 단백질을 언급할 때 이용되는 "계열(family)"은 외양적으로 공통의 구조적 도메인을 보유하고, 본 명세서에 정의된 바와 같이 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 충분한 상동성을 보유하는 2개 이상의 단백질 또는 핵산 분자를 의미한다. 이와 같은 계열의 일원은 자연 발생할 수 있고 동일하거나 또는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 가령, 여기에는 인간에서 기원된 제 1 단백질과 쥐에서 기원된 상기 단백질의 동족체 (homologue) 및 인간에서 기원된 별개의 제 2 단백질과 쥐의에서 기인된 상기 2 단백질의 동족체가 포함될 수 있다. 일 계열의 일원들은 공통의 기능적 특징을 보유할 수도 있다.
본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되는, "활성", "생물학적 활성" 또는 "기능적 활성"은 표준 기술에 따라, 생체내 (in vivo) 또는 시험관내 (in vitro) 측정에서 반응성 세포상에 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 의해 발휘되는 활성을 의미한다. 활성은 제 2 단백질과의 결합 또는 제 2 단백질에 대한 효소 활성과 같은 직접적인 활성, 또는 본 발명의 단백질과 제 2 단백질의 상호작용에 의해 매개되는 세포 신호 전달 활성과 같은 간접적인 활성일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 활성은 i) 신호 전달 경로에서 단백질과 상호작용할 수 있는 능력; ii) 리간드와 상호작용할 수 있는 능력; iii) 세포내 표적 단백질과 상호작용할 수 있는 능력 중에서 적어도 한 가지 이상의 활성을 포함하지만, 이들에 국한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따라, 당분야내에 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있는데, 이와 같은 기술들은 다음의 문헌에서 상세하게 기재되어 있다. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (이하 "Sambrook 등, 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volume I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel 등 (eds.), Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, Inc. (1994).
"벡터"는 다른 DNA 단편을 부착시켜, 부착된 단편을 복제할 수 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 레플리콘 (replicon) 등을 의미한다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA 복제를 자체적으로 할 수 있는, 다시 말하면, 자체적 단위로 조절하면서 복제할 수 있는 임의의 유전 물질 (가령, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다. 벡터의 특정 예는 하기에서 기술한다.
"카세트 (cassette)"는 벡터내에서 특정 제한 부위로 삽입될 수 있는 DNA 단편을 의미한다. DNA 단편은 목적하는 폴리펩티드를 암호화하고, 카세트 및 제한 부위는 전사와 해독을 위한 적절한 해독틀(reading frame)에서 카세트의 삽입을 보장할 수 있도록 설계된다.
이와 같은 DNA가 세포내로 도입될 때, 세포는 외인성 또는 이종성 DNA에 의해 "형질감염"된다. 형질감염된 DNA가 표현형 변화를 유도하는 경우에 외인성 또는 이종성 DNA에 의해 세포는 "형질전환"된다. 적절하게는, 형질전환 DNA는 염색체 DNA에 결합 (공유 연결)되어, 세포의 게놈을 구성한다.
"이종성" DNA는 세포내에 또는 세포의 염색체 부위에 천연적으로 존재하지 않는 DNA를 의미한다. 적절하게는, 이종성 DNA에는 세포에 대한 외부 유전자가 포함된다.
"상동성 재조합"은 염색체내에서 벡터의 외부 DNA 서열을 삽입하는 것을 의미한다. 특히, 벡터는 상동성 재조합을 위한 특정 염색체 부위를 표적으로 한다. 특이적인 상동성 재조합의 경우에, 벡터는 염색체내로 벡터의 상보적인 결합과 혼입이 허용될 수 있을 만큼 염색체 서열에 상동성인 충분히 긴 영역을 보유한다. 더욱 긴 상동성 영역과 더욱 높은 서열 유사성은 상동성 재조합 효능을 증대할 수 있다.
분리된 핵산 분자
본 발명의 한 측면은 본 발명의 수용체 단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 분리되거나 정제된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보체는 표준 분자 생물학 기술 및 본 발명에서 제공하는 서열 정보를 이용하여 분리할 수 있다. 하이브리드화 반응의 프로브로서 서열번호 1의 핵산 서열의 일부 또는 전부를 이용하여, 본 발명의 핵산 분자는 표준 하이브리드화 반응 및 클로닝 기술로 분리할 수 있다 (Sambrook 등, 1989). 서열번호 1에 상응하는 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 일부분은 예로써 자동화 DNA 합성장치를 이용한 표준 합성 기술로 제조할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자, 또는 이의 일부분은 표준 PCR 증폭 기술에 따라, 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA 및 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 서열번호 1의 일부를 포함할 수 있다. 핵산 단편은 리간드 결합 도메인과 같은 수용체의 생물학적 활성 부분이거나 또는 그렇지 않은 단백질 단편을 암호화할 수 있는 프로브 또는 프라이머 또는 단편으로 사용될 수 있다. 가령, 제7의 막관통(transmembrane) 도메인에서 아르기닌은 프로스타노이드 분자의 카르복실기에 대한 결합 부위로 제안되었고 (Narumiya 등, 1993), 마우스에서 제2의 막관통 도메인의 Lys-75와 Leu-83은 리간드 결합 특이성을 공여한다 (Kobayashi 등, 2000). 이들 두 서열 가닥은 프로스타노이드 계열의 GPCR에서 특징적으로 보존되는 것으로 앞서 보고되었고 (Hirata 등, 1994), 기니 피그 DP 단백질에도 존재한다: 제2의 세포외 루프에서 QYCPGTWCR 및 제7의 막관통 도메인에서 RFLSVISIVDPWIFI는 모든 DP 상동분자종 (orthologue)에서 동일하였다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열은 세포, 조직, 기관에서 본 발명의 수용체 또는 동족체를 확인하거나 클로닝하기 위한 목적으로 프로브와 프라이머의 산출을 가능하게 한다. 전형적으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 엄격한 조건하에 서열번호 1의 센스 또는 안티센스 서열, 또는 서열번호 1의 자연 발생이나 인위적 돌연변이의 적어도 10개, 바람직하게는 대략 12개, 더욱 바람직하게는 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 연속 뉴클레오티드에 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다. 프로브는 여기에 부착되는 표지 그룹, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 포함할 수 있다. 프로브는 핵산을 암호화하는 세포 또는 조직을 확인하거나, mRNA 수준을 검출하거나, 또는 게놈 유전자가 돌연변이 또는 결실되었는지를 결정하는 키트의 일부일 수 있다.
또한, 본 발명에는 서열번호 1에 90% 동일한 분리된 핵산 분자가 포함된다. 실질적으로 상동한 서열은 디폴트 매개 변수를 이용하여 서열 데이터 뱅크에서 입수가능 표준 소프트웨어로 서열을 비교하거나, 또는 예로써 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은 엄격한 조건하에 서던 (Southern) 하이브리드화 반응 실험에서 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 적절한 하이브리드화 반응 조건은 당업자의 능력 범위에서 한정될 수 있다 (Maniatis 등, supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra)
자연 대립형질 변이로 인하여 개체군내에서 DNA 서열 다형성이 존재할 수 있다. 대립형질은 일정한 유전자 좌위에서 대안으로 발생되는 일군의 유전자이다. 본 명세서에서, "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명의 수용체 단백질, 바람직하게는 기니 피그 수용체 단백질을 암호화하는 개방 해독틀을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서, "대립형질 변이체"는 상기 유전자 좌위에서 발생하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드를 의미한다. 여러 다른 개체에서 목적 유전자를 서열분석함으로써, 대안 대립형질을 확인할 수 있다. 본 발명의 수용체의 기능적인 활성에 변화를 주지 않으면서 자연적인 대립 형질 변이체 결과로 인한 이와 같은 임의의 또는 모든 뉴클레오티드 변이 및 이로 인한 아미노산 다형성 또는 변이는 본 발명의 범위에 속한다.
"생물학적 활성" 또는 "생물학적으로 유관한" 일부분을 암호화하는 핵산 단편은 본 발명의 수용체의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1의 일부분을 분리하고, 리간드-결합 도메인 또는 신호-전달 도메인의 수용체 단백질의 암호화된 일부분을 발현하고 (가령, 시험관내에서 재조합 발현으로), 이후 수용체의 암호화된 일부분의 활성을 평가함으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과는 상이하지만, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질과 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 포함된다. 가령, 본 발명자들은 2가지 잠재적 N-글리코실화 부위: 아미노 말단에서 Asn-7 및 제1의 세포외 루프에서 Asn-86을 확인하였다. 이에 더하여, 2가지 잠재적 단백질 키나아제 C 인산화 부위: 각각 제1의 세포질 루프와 제3의 세포질 루프에 위치한 Ser-46과 Thr-140 역시 존재한다.
자연 발생 대립형질 변이체 이외에, 특정 아미노산을 암호화하는 다양한 코돈에서 상당한 양의 중복 (redundancy)이 존재하는 것으로 당업자들에게 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 2 또는 이의 일부분의 궁극적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 대안 코돈을 포함하는 RNA 또는 대안 코돈을 암호화하는 RNA 서열을 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 아래의 코돈이 각각의 특이적인 아미노산을 암호화하는데 상호 교환적으로 이용될 수 있는 것으로 당업계에 공지되어 있다:
페닐알라닌 (Phe 또는 F) UUU 또는 UUC
루이신 (Leu 또는 L) UUA 또는 UUG 또는 CUU 또는 CUC 또는 CUA 또는 CUG
이소루이신 (Ile 또는 I) AUU 또는 AUC 또는 AUA
메티오닌 (Met 또는 M) AUG
발린 (Val 또는 V) GUU 또는 GUC 또는 GUA 또는 GUG
세린 (Ser 또는 S) UCU 또는 UCC 또는 UCA 또는 UCG 또는 AGU 또는 AGC
프롤린 (Pro 또는 P) CCU 또는 CCC 또는 CCA 또는 CCG
트레오닌 (Thr 또는 T) ACU 또는 ACC 또는 ACA 또는 ACG
알라닌 (Ala 또는 A) GCU 또는 GCG 또는 GCA 또는 GCG
티로신 (Tyr 또는 Y) UAU 또는 UAC
히스티딘 (His 또는 H) CAU 또는 CAC
글루타민 (Gln 또는 Q) CAA 또는 CAG
아스파라진 (Asn 또는 N) AAU 또는 AAC
리신 (Lys 또는 K) AAA 또는 AAG
아스파르트산 (Asp 또는 D) GAU 또는 GAC
글루탐산 (Glu 또는 E) GAA 또는 GAG
시스테인 (Cys 또는 C) UGU 또는 UGC
아르기닌 (Arg 또는 R) CGU 또는 CGC 또는 CGA 또는 CGG 또는 AGA 또는 AGG
글리신 (Gly 또는 G) GGU 또는 GGC 또는 GGA 또는 GGG
트립토판 (Trp 또는 W) UGG
종료 코돈 UAA 또는 UAG 또는 UGA
상기 명기된 코돈은 RNA 서열용 코돈이다. DNA에 상응하는 코돈은 U 대신에 T가 된다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 암호화된 단백질의 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 돌연변이로 서열번호 1에 변화를 도입할 수 있다. "비-필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 야생형 서열, 예를 들면, 서열번호 2로부터 변형될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 필요하다. 따라서, 여러 종에서 보존되지 않거나 반-보존되는 아미노산 잔기는 비-필수이고, 변형을 위한 가능 표적이 된다. 본 발명의 다른 측면은 활성에 비-필수적인 아미노산 잔기에서 변화를 보유하는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이들 단백질은 아미노산 서열에서 서열번호 1과 상이하지만 생물학적 활성을 보유한다. 서열번호 2와 상이한 서열을 보유하는 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 만들 수 있다.
돌연변이는 특정 부위 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술을 이용하여 도입할 수 있다. 적절하게는, 하나 이상의 예측된 비-필수 아미노산 잔기에 보존형 아미노산 치환이 수행된다. "보존형 아미노산 치환"은 특정 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당분야에 정의되어 있다. 가령, 이들 계열에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지형 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 트레오닌, 발린, 이소루이신), 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 기니 피그의 서열을 인간, 래트, 마우스의 서열과 비교하는 하기 "실시예 3"에 제공된 기니 피그 수용체의 서열 분석 결과는 비-필수 아미노산의 선별에 있어서 지침을 제공한다. 따라서, 예측된 비-필수 아미노산 잔기는 가급적, 동일한 측쇄 계열로부터 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 대안으로, 예로서 포화 돌연변이 (saturation mutagenesis)로 암호화 영역 또는 이의 일부분에 돌연변이를 무작위로 도입하고, 생성된 돌연변이에서 생물학적 활성을 스크리닝하여 활성을 유지하는 돌연변이체를 확인할 수 있다. 돌연변이유발 이후, 암호화된 단백질은 재조합 방식으로 발현하고, 단백질의 활성을 측정할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 변이 단백질은 예로써 프로스타노이드 신호 전달 경로의 단백질과 단백질:단백질 상호작용을 형성하는 능력; 프로스타노이드 수용체에 결합하는 리간드와 같은 리간드에 결합하는 능력; 또는 세포내 표적 단백질에 결합하는 능력으로 평가될 수 있다. 또한, 본 발명은 진단, 치료, 예방 목적의 고유 또는 변이 단백질이나 단백질 단편에 관계하며, 수용체 기능의 효능제, 길항제 또는 조절제를 스크리닝하는데 이용된다.
펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 예로써, 리간드 결합 도메인의 친화성을 변화시키거나 신호 전달 경로를 조절함으로써, 자연 발생 펩티드에서와 상이한 특성을 보유하는 단백질을 암호화하도록 변형될 수 있다. 또한, 본 발명은 단백질의 생물학적 활성을 변화시키는 서열번호 1 또는 이의 일부분의 핵산 서열의 변형에 관한 것이다.
분리된 핵산 분자의 하이브리드화
온도와 용액 이온 강도의 적절한 조건하에서 단일 가닥 형태의 핵산 분자가 다른 핵산 분자, 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA에 어닐링될 수 있는 경우에, 핵산 분자는 "하이브리드화될 수 있다" (Sambrook 등, supra). 온도와 이온 강도의 조건은 하이브리드화 반응의 "엄격성" (stringency)을 결정한다. 낮은 엄격성 하이브리드화 조건은 55 ℃의 Tm에 상응한다 (가령, 5x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC), 0.1% SDS, 0.25% 우유, 포름아미드 없음; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS). 중간 정도의 엄격성 하이브리드화 조건은 더욱 높은 Tm에 상응한다 (가령, 40% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC). 높은 엄격성 하이브리드화 조건은 최대 Tm에 상응한다 (가령, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC). 하이브리드화 반응은 하이브리드화 반응의 엄격성 조건에 따라 염기 간에 미스매치 (mismatches)도 가능하지만, 두 핵산이 상보적인 서열을 보유할 것으로 요구한다. 핵산의 하이브리드화를 위한 적절한 엄격성 정도는 당분야에 공지된 변수인 핵산 길이와 상보성 정도에 좌우된다. 두 뉴클레오티드 서열 간에 유사성 또는 상동성 정도가 클수록, 이들 서열을 보유하는 핵산의 하이브리드에 대한 Tm 값이 커진다. 핵산 하이브리드화의 상대적 안정성 (더욱 높은 Tm에 상응하는)은 RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA 순으로 감소된다. 뉴클레오티드 길이가 100개 이상인 하이브리드의 경우에, Tm을 계산하는 방정식이 유도되었다 (Sambrook 등, supra, 9.50-9.51). 더욱 짧은 핵산, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화의 경우에, 미스매치 위치가 더욱 중요하고, 올리고뉴클레오티드 길이가 이의 특이성을 결정한다 (Sambrook 등, supra, 11.7-11.8). 하이브리드화가능 핵산 분자의 길이는 최소 길이가 적어도 20개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 30개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 40개 뉴클레오티드, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 60개 뉴클레오티드이다.
특정 구체예에서, "표준 하이브리드화 조건"은 55 ℃의 Tm을 의미하고, 상기한 조건을 이용한다. 바람직한 구체예에서, Tm은 60 ℃이고; 더욱 바람직한 구체예에서, Tm은 65 ℃이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 하이브리드화가능 핵산 분자는 적어도 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900 또는 1000개의 뉴클레오티드를 보유하고, 엄격한 조건하에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열번호 1의 암호화 서열 또는 이의 상보체 또는 단편을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화된다. 본 명세서에서, "엄격한 조건하에서 하이브리드화"는 서로에 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 바람직하게는 75% 또는 그 이상 상보적인 뉴클레오티드 서열이 전형적으로 하이브리드화 상태로 유지되는 하이브리드화 반응과 세척의 조건을 의미한다. 이와 같은 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있다 (참조: "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.). 엄격한 하이브리드화 조건의 적절한 무제한적 예는 6X SSC에서 대략 45 ℃에서 하이브리드화, 이후 50 내지 65 ℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척이다. 적절하게는, 엄격한 조건하에서 서열번호 1의 서열 또는 이의 상보체에 하이브리드화되는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 자연 발생적인 핵산 분자에 상응한다. 본 명세서에서, "자연 발생적인" 핵산 분자는 자연에서 생성되는 뉴클레오티드 서열 (가령, 천연 단백질을 암호화하는)을 보유하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 당업자는 서열특이적 변수 (가령, 길이, G-C 함량 등)를 고려하여, 조건을 수정할 수도 있다. 다른 구체예에서, 엄격한 조건하에 서열번호 1 서열의 일부분에 하이브리드화되는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 프로브 또는 프라이머로 이용될 수 있다. 전형적으로, 프로브/프라이머는 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 서열번호 1 또는 서열번호 1의 자연 발생적 돌연변이의 센스 또는 안티센스 서열의 적어도 12개, 바람직하게는 대략 25개, 더욱 바람직하게는 대략 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개 또는 400개의 구성적 뉴클레오티드에 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열 영역으로 구성된다.
안티센스 핵산 분자
본 발명에는 안티센스 (antisense) 핵산 분자, 다시 말하면, 단백질을 암호화하는 센스 핵산에 상보적인 (가령, 이중 가닥 cDNA 분자의 암호화 가닥에 상보적인 또는 mRNA 서열에 상보적인) 분자가 포함된다. 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소결합할 수 있다. 안티센스 핵산은 서열번호 1의 전체 핵산 서열 또는 이의 일부분에 상보적일 수 있다. 본 명세서에 기술된 암호화 가닥 서열 (가령, 서열번호 1)에 기초하여, 본 발명의 안티센스 핵산은 Watson & Crick 염기쌍 형성 규칙에 따라 설계될 수 있다. 안티센스 (antisense) 올리고뉴클레오티드는 예로써 대략 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 뉴클레오티드 길이를 보유한다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당분야에 공지된 절차를 이용하여 화학적 합성 반응 및 효소 연결 반응을 통하여 작제할 수 있다. 가령, 안티센스 핵산 (가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나, 또는 안티센스와 센스 핵산 간에 형성된 이중 가닥의 물리적인 안정성을 증가시키도록 설계된 자연 발생 뉴클레오티드 또는 다양한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (가령, 포스포로티오에이트 유도체, 포스포네이트 유도체, 아크리딘-치환된 뉴클레오티드)를 이용하여, 화학적으로 합성될 수 있다.
안티센스 핵산을 만드는데 이용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드에는 5-플로오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, β-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, β-D-만노실큐에오신, 5-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세트산, 위부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, 2,6-디아미노퓨린 등이 포함된다. 대안으로, 안티센스 핵산은 안티센스 방향으로 핵산이 서브클로닝된 발현 벡터를 이용하여 생물학적으로 생산될 수 있다 (가령, 삽입된 핵산에서 전사된 RNA는 목적 표적 핵산에 안티센스 방향이 된다).
전형적으로, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 개체에 투여하거나 자체에서 생성되도록 하여, 본 발명의 단백질을 암호화하는 세포 mRNA 및/또는 게놈 DNA에 하이브리드화되거나 결합함으로써 전사 및/또는 해독을 저해하고 단백질 발현을 저해한다. 하이브리드화 반응은 안정적인 이중 나선을 형성하기 위한 통상적인 뉴클레오티드 상보성에 의해, 또는 예로써 DNA 이중나선 또는 조절 영역에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에, 이중나선의 주요 홈 (groove)에서 특이적인 상호작용을 통하여 달성될 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자 투여 경로에는 조직 부위에 직접 주사가 포함된다. 대안으로, 안티센스 핵산 분자는 선택된 세포를 표적하도록 변형되고, 이후 전신 투여될 수 있다. 가령, 전신 투여 경우에, 안티센스 분자는 예로써 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 안티센스 핵산 분자를 연결함으로써, 이들 분자가 선택된 세포 표면상에서 발현되는 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형된다. 안티센스 핵산 분자는 또한, 본 명세서에 기술된 벡터를 이용하여 세포로 운반될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 확보하기 위하여, 안티센스 핵산 분자가 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터의 제어하에 위치하는 벡터 구조체가 선호된다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산 분자는 상보적인 RNA와 특정한 이중 가닥 하이브리드를 형성하는데, 그 이유는 이들 가닥이 서로 평행하기 때문이다 (Gaultier 등, Nucleic Acids Res (1987)15:6625-6641). 안티센스 핵산 분자는 또한, 메틸리보뉴클레오티드 (Inoue 등, Nucleic Acids Res (1987) 15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체 (Inoue 등, FEBS Lett (1987) 215:327-330)로 구성될 수 있다.
리보자임
본 발명에는 리보자임 역시 포함된다. 리보자임은 리보자임에 하이브리드화되는 단일 가닥 핵산, 예를 들면, mRNA를 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매성 RNA 분자다. 따라서, 리보자임 (가령, 헤머헤드 리보자임) (Haselhoff 등, Nature (1988) 334:585-591)은 핵산 전사체를 촉매적으로 절단하여 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 해독을 저해하는데 이용될 수 있다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 서열번호 1의 핵산에 특이성을 갖는 리보자임을 설계할 수 있다. 가령, Tetrahymena L-19 IVS RNA 유도체를 작제할 수 있는데, 이때 활성 부위의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 보고된 핵산 서열에 기초하여 절단되는 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이다 (참조: U.S. Patent No. 4,987,071; U.S. Patent No. 5,116,742; 이를 참고 문헌으로 본원에 인용한다). 대안으로, 서열번호 1의 핵산 서열을 이용하여 RNA 분자 푸울 (pool)으로부터 특이적인 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매성 RNA을 선별할 수 있다 (Bartel 등, Science (1993) 261:1411-1418).
삼중나선 핵산 분자 및 펩티드 핵산
본 발명에는 삼중나선 구조물을 형성하는 핵산 분자 역시 포함된다. 가령, 서열번호 1의 조절 영역 (가령, 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 핵산 서열을 표적하여 3중 나선 구조를 형성하고 이는 표적 세포에서 유전자의 전사를 방해함으로써 유전자 발현을 저해할 수 있다 (Helene, Anticancer Drug Des (1991) 6 (6):569 Helene Ann NY Acad Sci (1992) 660:27; Maher, Bioassays (1992) 14 (12):807).
특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 염기 부분, 당 부분 또는 인산염 기본 구조에서 변형시켜, 분자의 안정성, 하이브리드화 반응 또는 용해도를 개선할 수 있다. 가령, 핵산의 데옥시리보스 포스페이트 기본 구조를 변형시켜 펩티드 핵산을 만들 수 있다 (참조: Hyrup 등, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4:5). 본 명세서에서, "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 데옥시리보스 인산염 기본 구조가 슈도펩티드 (pseudopeptide) 기본 구조로 대체되고, 4가지 자연 뉴클레오염기 (nucleobase)만 유지되는 핵산 모방물질, 예를 들면, DNA 모방물질을 의미한다. PNA의 중성 기본구조는 낮은 이온 강도 조건하에서도 DNA와 RNA에 대한 특이적인 하이브리드화 반응이 가능한 것으로 밝혀졌다. PNA 올리고머의 합성은 Hyrup 등, (1996) supra; Perry-O’Keefe 등, Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:14670에서 기술된 바와 같이 표준 고형상 펩티드 합성 과정에 따라 수행될 수 있다.
PNA는 치료요법적 분야 및 진단 분야에 이용될 수 있다. 가령, PNA는 예로써 전사 또는 해독 중지를 유도하거나 복제를 저해함으로서 유전자 발현의 서열-특이적 조절을 위한 안티센스 또는 항원 물질로서 이용될 수 있다. 본 발명의 PNA 역시 이용될 수 있다. 가령, PNA는 예로써 PNA-유도된 PCR 클램핑 (clamping)에 의한 유전자에서 단일 염기 쌍 돌연변이 분석에서; 다른 효소, 예를 들면, S1 뉴클레아제와 공동으로 이용되는 경우에 인공 제한 효소로서 (Hyrup 등 (1996) supra); 또는 DNA 서열 및 하이브리드화 반응을 위한 프로브 또는 프라이머로서 (Hyrup 등 (1996) supra; Perry-O’Keefe 등 (1996) supra) 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 PNA는 예로써 PNA에 친지성 그룹 또는 다른 도우미 그룹을 부착하거나, PNA-DNA 키메라를 형성하거나, 또는 리포좀 또는 당분야에 공지된 약물 운반 기술을 이용하여 변형함으로써 안정성, 특이성 또는 세포의 흡입 (uptake) 등을 강화시킬 수 있다. PNA-DNA 키메라 합성은 문헌[참조: Hyrup 등 (1996) supra, Finn 등, Nucleic Acids Res (1996) 24 (17):3357-63, Mag 등, Nucleic Acids Res (1989) 17:5973; Peterser 등, Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5:1119]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
RNA/핵산 간섭
RNA 간섭 (RNAi) 또는 핵산 간섭 (NAi)은 짧은 간섭 RNA (siRNA) 또는 짧은 간섭 핵산 (siNA)에 의해 매개되는 서열-특이적 전사후 유전자 침묵 과정이다. 상기 과정은 예로써 바이러스 감염의 결과로써 이중-가닥 RNA (dsRNA) 또는 이중-가닥 핵산 (dsNA)이 다이서 (dicer)라고 하는 리보뉴클레아제 III 효소의 활성을 촉진하는 진화적으로 보존된 방어 기전으로 생각된다 (Berstein 등, 2001, Nature 409:363). 가령, 다이서는 dsRNA를 siRNA로 가공한다. 다이서는 해독 조절에 관여하는 21개와 22개 뉴클레오티드 소형 임시적 RNA (stRNA)를 제거하는데 수반된다. 이런 RNAi 반응은 siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 보유하는 표적 단일-가닥 RNA를 절단하는 엔도뉴클레아제 복합체, RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 역시 수반한다 (Elbashir 등, 2001, Genes Dev., 15:188). 효율적인 RNAi 또는 NAi를 위한 길이, 구조, 화학적 조성, 서열에 기초한 siRNA, dsRNA, siNA 또는 dsNA의 최적 설계는 당업자에게 공지되어 있다 (참조: Chiu and Rana 등, 2003, RNA 9:1034-48; Elbashir 등, 2001; Parish 등, 2000; PCT 공개 공보번호., WO 03/070744, WO 01/75164, WO 01/68836, WO 01/49844, WO 01/36646, WO 01/29058, WO 00/44914 WO 00/01846, WO 99/32619,WO 99/07409 WO 99/53050; 캐나다 특허 출원번호. 2,359,180; 상기 문헌들은 참조로 인용된다). 활성을 개선하기 위한 siNA 또는 dsNA로의 일부 가능한 변형에는 3'-말단 디뉴클레오티드 돌출부 (overhangs); 하나의 또는 둘 모두의 siNA 가닥의 2'-데옥시뉴클레오티드 (2'-H)로 치환; siNA 이중 나선의 3'-말단 뉴클레오티드 돌출 분절의 데옥시리보뉴클레오티드로 치환; dsRNA 구조체에서 질소 또는 황 헤테로원자, 2'-아미노 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-O 또는 4'-C 메틸렌 가교를 보유하는 뉴클레오티드 중에서 적어도 하나를 보유하도록 인산염-당 골격 또는 뉴클레오시드의 변형; 센스와 안티센스 가닥에서 4-티오우라실, 5-브로모우라실, 5-요오드우라실, 3- (아미노알릴)우라실 치환이 포함된다. PCT 공개 공보 WO 01/68836에서는 내인성으로 유래된 dsRNA를 이용하여 유전자 발현을 약화시키는 방법을 기술한다. 또한, RNAi에 대하여 표적된 mRNA는 한 세포형에서 유전자에 표적된 새로운 dsRNA의 5'에서 3' 합성을 위한 주형으로서 기능하는 것으로 제안되었고, 별개의 세포형에서 발현된 제 2 유전자의 RNAi-매개된 침묵을 유도할 수 있는데, 이런 형상은 과도적 (transitive) RNAi라고 한다 (Alder 등, 2003 rna 9:25).
단백질
본 발명에는 서열번호 2의 아미노산 서열, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 분리된 폴리펩티드가 포함된다.
서열번호 2와 상이한 서열을 갖는 본 발명의 단백질 (가령, 변이체)을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열내로 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써, 암호화된 단백질에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 도입하여 만들 수 있다. 가령, 제1 및 제3의 세포내 루프는 각각 기니 피그 DP 단백질에서 3개와 5개 아미노산이 짧은 반면, 마우스, 인간, 래트 DP 단백질에서 이들 세포내 루프는 모두 동일한 크기를 갖는다. 서열번호 2의 변이체는 임의의 다른 상동분자종에서 발견되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 삽입함으로써 만들 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 돌연변이 단백질은 (1) 신호 전달 경로에서 단백질과 단백질:단백질 상호작용을 형성하는 능력; (2) 리간드에 결합하는 능력; (3) 세포내 표적 단백질에 결합하는 능력; 또는 (4) 세포 증식, 세포 분화 또는 세포 반응을 조절하는 능력에 대해 분석하였다.
본 발명의 고유 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 적절한 정제 계획에 따라 세포 또는 조직 공급원으로부터 분리할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 단백질은 재조합 DNA 기술을 이용하여 용이하게 생산할 수 있다. 또 다른 대안적 구체예는 표준 펩티드 합성 기술을 이용한 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 화학적 합성이다.
본 발명의 단백질의 생물학적 활성 부분 또는 단편에는 서열번호 2의 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 상기 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된 펩티드가 포함되는데, 이들 펩티드는 본 발명의 전장 단백질보다는 적은 수의 아미노산을 보유하고, 본 발명의 단백질의 적어도 한 가지 활성을 나타낸다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 본 발명의 단백질의 적어도 한 가지 활성을 갖는 도메인 또는 모티프로 구성된다. 가령, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 단편은 프로스타노이드 계열의 GPCR에서 특징적으로 보존되는 것으로 이미 보고되었고 (Hirata 등, 1994), 기니 피그 DP 단백질: 제2의 세포외 루프에서 QYCPGTWCR 및 제7의 막관통 도메인에서 RFLSVISIVDPWIFI에도 존재하는 2개의 서열 스트레치들을 포함한다. 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 부분은 예로써 10, 25, 50, 100개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 생물학적 활성을 갖는 적절한 폴리펩티드는 본 발명의 단백질의 하나 이상의 확인된 구조 도메인을 보유한다. 또한, 재조합 기술을 이용하여 단백질의 다른 영역이 결실된 다른 생물학적 활성 부분을 만들고, 본 발명의 단백질의 한 가지 이상의 기능적 활성을 평가하였다. 본 발명의 생물학적으로 유관한 부분과 관련된 추가의 지침은 하기 "실시예 3"에서 제공한다.
서열번호 2와 실제로 동일하고 서열번호 2의 단백질의 기능적 활성을 보유하지만 천연 대립형질 변이 또는 돌연변이로 인하여 아미노산 서열에서 차별되는 다른 유용한 단백질이 존재한다. 가령, 이와 같은 단백질과 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 적어도 한 가지 생물학적 활성을 보유한다. 따라서, 본 발명의 유용한 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에 적어도 약 65%, 75%, 85%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가지고, 서열번호 2의 단백질의 기능적 활성을 보유하는 단백질이다.
두 아미노산 서열 또는 두 핵산의 동일성 비율을 결정하기 위하여, 최적 비교 목적으로 서열을 정렬한다 (가령, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위하여, 제1 아미노산 또는 핵산 서열에 갭 (gap)을 도입할 수 있다). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기를 비교한다. 제1 서열의 특정 위치에서 제2 서열의 상응하는 위치에서와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기가 존재한다면, 이들 분자는 상기 위치에서 동일한 것으로 간주된다. 두 서열간에 동일성 비율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수에 대한 함수로 표시된다 (동일성 비율 = 동일한 위치 수/총 위치 수 (가령, 중복 위치)X100). 한 구체예에서, 이들 두 서열은 동일한 길이를 가진다.
두 서열간에 동일성 비율의 결정은 수학 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다. 두 서열을 비교하는데 이용하는데 이용되는 수학 알고리즘의 적절한 무-제한적 예는 Karlin 등, Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:5873-5877에 기재된 바와 같이 변형된 Karlin 등, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:2264의 알고리즘이다. 이와 같은 알고리즘은 Altschul 등, J Mol Bio (1990) 215:403의 NBLAST와 XBLAST 프로그램에 통합된다. 비교 목적의 갭 정렬 (gapped alignment)을 달성하기 위하여, Altschul 등, Nucleic Acids Res (1997) 25:3389에 기술된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. 대안으로, 분자간 거리 관계를 확인하기 위한 반복 서치를 실행하는데 PSI-Blast를 이용할 수도 있다 (Altschul 등 (1997) supra). BLAST, Gapped BLAST 및 PSIBlast 프로그램을 이용하는 경우에, 개별 프로그램의 디폴트 변수 (가령, XBLAST 및 NBLAST)를 이용할 수 있다 (참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). 서열을 비교하는데 이용되는 수학 알고리즘의 다른 적절한 무-제한적 예는 Myers 등, CABIOS (1988) 4:11-17의 알고리즘이다. 이런 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (version 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열 비교를 위한 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우에, PAM120 중량 잔기 테이블, 갭 길이 페널티 12, 갭 페널티 4가 이용될 수 있다.
2개의 서열 간에 동일성 비율은 상기에서 기술된 것과 유사한 기술을 이용하여 갭을 허용하거나 또는 허용하지 않으면서 결정할 수 있다. 동일성 비율을 계산할 때, 정확한 정합만 계산한다.
또한, 본 발명에는 본 발명의 키메라 또는 융합 단백질이 포함된다. 본 명세서에서, 본 발명의 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 "본 발명의 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드"에 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 폴리펩티드로 구성된다. "본 발명의 폴리펩티드"는 서열번호 2에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. "본 발명의 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드"는 서열번호 2와 실제로 동일하지 않은 단백질, 예를 들면, 본 발명의 단백질과 상이하고 동일하거나 상이한 생물체에서 유도된 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 융합 단백질내에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 2의 전부 또는 일부분, 바람직하게는 서열번호 2의 적어도 한가지 생물학적 활성 부분에 상응한다. 융합 단백질내에서, "작동가능하게 연결된"은 본 발명의 폴리펩티드와 본 발명의 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드가 서로 인-프레임 (in-frame)으로 융합된다는 것을 나타낸다. 본 발명의 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 한 가지 유용한 융합 단백질은 글루타티온-S-전이효소 (GST)를 이용하는데, 여기서 본 발명의 폴리펩티드는 GST의 C-말단에 융합된다. 이와 같은 융합 단백질은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제를 용이하게 할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질에는 서열번호 2의 전부 또는 일부가 면역글로불린 단백질 계열 (family)의 일원으로부터 유래된 서열에 융합된 면역글로불린 융합 단백질이 포함된다. 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은, 약제학적 조성물에 도입하고 개체에 투여하여, 세포 표면상에서 리간드와 본 발명의 수용체 단백질간의 상호작용을 방해함으로써 생체내에서 수용체-매개된 신호 전달을 억제할 수 있다. 본 발명의 면역글로불린-융합 단백질을 이용하여 본 발명의 수용체의 동족 리간드의 생체이용성에 영향을 줄 수 있다. 리간드-수용체 상호작용의 저해는 치료 목적, 예를 들면, 수면 유도, 체온, 후각 기능, 호르몬 방출, 통증, 위장관 질환, 간 질환, 눈 질환 (가령, 녹내장), 혈액 질환 (가령, 혈전증), 염증 질환 (가령, 천식, 알레르기 비염, 기도 과민증, 알레르기 피부염, 알레르기 결막염, 만성 폐쇄성 폐 질환)을 치료하거나 조절하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 면역글로불린-폴리펩티드 융합 단백질은 개체에서 항체를 생산하고, 리간드를 정제하고, 스크리닝 검사에서 본 발명의 수용체와 리간드의 상호작용을 저해하는 분자를 확인하는 면역원으로 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술로 생산된다. 가령, 상이한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 단편은 통상의 기술에 따라, 예를 들면, 결찰(ligation)을 위한 평활 말단 또는 점착성 말단, 적절한 말단을 제공하는 제한효소 분해, 점착성 말단의 적절한 충전 (filling-in), 불필요한 결합과 효소 결찰을 차단하는 알칼리 포스포타제 처리를 이용하여 함께 인-프레임으로 결찰한다. 다른 구체예에서, 자동화 DNA 합성기를 수반하는 통상의 기술을 이용하여 융합 유전자를 합성할 수 있다. 대안으로, 후속으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 산출할 수 있는 2개의 연속 유전자 단편 사이의 상보적 돌출부를 만드는 앵커 (anchor) 프라이머를 이용하여 유전자 단편의 PCR 증폭을 수행할 수 있다 (Ausubel 등, supra). 또한, 융합 부분 (가령, GST 폴리펩티드)을 이미 암호화하는 많은 발현 벡터를 상업적으로 구입할 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 이의 일부분을 발현 벡터내로 클로닝하여, 융합 부분을 본 발명의 단백질에 인-프레임으로 연결할 수 있다.
핵산과 단백질 변이체
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명에는 서열번호 1과 서열번호 2의 변이체가 포함된다. 가령, 특정 부위 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술을 이용하여 서열번호 1의 아미노산 서열에 돌연변이를 도입할 수 있다. 또한, 하나 이상의 예측된 비-필수 아미노산 잔기에서 보존형 아미노산 치환을 수행할 수 있다. "보존형 아미노산 치환"은 특정 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 가령, 하나 이상의 아미노산을 기능적 등가체로 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산으로 치환하여 침묵 (silent) 변화를 유도할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열내에서 아미노산 치환체는 아미노산이 속하는 부류의 다른 일원의 아미노산에서 선택될 수 있다. 가령, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌이 포함된다. 방향족 환 구조를 갖는 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판, 티로신이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민이 포함된다. 양전하 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신, 히스티딘이 포함된다. 음전하 (산성) 아미노산에는 아스파르트산, 글루탐산이 포함된다. 이와 같은 변형은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점에 의한 측정에서, 겉보기 분자량 (apparent molecular weight)에 영향을 주지 않을 것으로 예상된다.
특히 적절한 치환은 다음과 같다;
- 양전하를 유지할 수 있는 Arg의 Lys로 치환 (그 역도 성립)
- 음전하를 유지할 수 있는 Asp의 Glu로 치환 (그 역도 성립)
- 유리-OH기를 유지할 수 있는 Thr의 Ser로 치환
- 유리 NH2를 유지할 수 있는 Asn의 Gln로 치환
합성 (즉, 천연 발생되지 않은) 아미노산에 의한 추가의 치환이 이루어질 수 있다.
또한, 특히 선호되는 성질을 갖는 아미노산으로 대체하기 위하여 아미노산 치환을 도입할 수도 있다. 가령, 다른 Cys와 이황화 결합 목적의 가능 부위를 위하여 Cys를 도입할 수 있다. 특정 "촉매" 부위로서 His를 도입할 수도 있다 (His는 산성 또는 염기성으로 작용할 수 있기 때문에, 생화학 촉매에서 가장 흔히 사용되는 아미노산이다). Pro는 단백질 구조에 β-턴 (turn)을 유도하는 특수한 평면 구조 때문에 도입될 수 있다.
포화 돌연변이유발 (saturation mutagenesis)과 같은 방법으로 서열번호 1의 암호화 서열의 전부 또는 일부분에 돌연변이를 도입하고, 생성된 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 확인하는 생물학적 활성을 스크리닝할 수 있다. 돌연변이유발이후, 암호화된 단백질은 재조합적으로 발현시키고 단백질의 활성을 측정할 수 있다.
본 발명의 변이체는 효능제 (모방체) 또는 길항제로서 기능할 수 있다. 돌연변이유발, 예를 들면, 본 발명의 단백질의 별개의 점 돌연변이 또는 절단을 통하여, 본 발명의 단백질 변이체를 만들 수 있다. 본 발명의 단백질 효능제는 본 발명의 자연 발생 단백질의 생물학적 활성과 실제로 동일한 활성 또는 부분 활성을 보유할 수 있다. 길항제는 본 발명의 단백질을 포함하는 세포 신호 전달 연속 반응의 하류 또는 상류 일원에 경쟁적으로 결합하여, 본 발명의 단백질의 자연 발생 형태의 한 가지 이상의 활성을 저해할 수 있다. 따라서, 제한된 기능의 변이체로 처리하여 특정 생물학적 효과를 유도할 수 있다. 본 발명의 단백질의 자연 발생 형태의 생물학적 활성 중에서 부분 활성을 갖는 변이체로 개체를 치료하면, 상기 단백질의 자연 발생 형태로 치료된 개체에서보다 부작용을 줄일 수 있다.
효능제 (모방체) 또는 길항제로서 기능하는 본 발명의 단백질 변이체는 본 발명의 단백질 변이체, 예를 들면, 절단 변이체의 복합 라이브러리 (combinatorial library)에서 효능제 또는 길항제 활성을 스크리닝하여 확인할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 단백질 변이체의 다변화된 라이브러리는 핵산 수준에서 복합 돌연변이유발로 산출되고, 다변화된 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 변이체의 다변화된 라이브러리는 예로써 합성 올리고뉴클레오티드 혼합물을 유전자 서열에 효소로 결찰시켜 만들 수 있는데, 본 발명의 잠재적인 핵산 서열의 축퇴성 세트는 개별 폴리펩티드로서, 또는 내부에 본 발명의 서열 세트를 포함하는 더 큰 융합 단백질 (가령, 파지 디스플레이용) 세트로서 발현된다. 다양한 방법을 이용하여 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 본 발명의 잠재적인 변이체 라이브러리를 만들 수 있다. 자동화 DNA 합성기에서 축퇴성 유전자 서열을 화학적으로 합성할 수 있고, 이후 합성된 유전자를 적절한 발현 벡터에 결찰시킨다. 유전자의 축퇴성 세트를 이용하면 한 혼합물에서 본 발명의 잠재적인 핵산 서열 세트를 암호화하는 모든 서열을 제공할 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당분야에 공지되어 있다 (Narang, Tetrahedron (1983) 39:3; Itakura 등, Ann Rev Biochem (1984) 53:323; Itakura 등, Science (1984) 198:1056; Ike 등, Nucleic Acid Res (1983) 11:477).
또한, 단백질 암호화 서열의 단편 라이브러리를 이용하여 본 발명의 단백질 변이체의 스크리닝 및 후속 선별을 위한 단편의 다변화된 개체군을 만들 수 있다. 한 구체예에서, 암호화 서열 단편 라이브러리는 분자 하나당 니킹 (nicking)이 한 번만 일어나는 조건하에 본 발명의 암호화 서열의 이중-가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키고, DNA를 복원하여 상이한 니킹 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함하는 이중-가닥 DNA를 형성하고, 재형성된 이중 가닥으로부터 단일 가닥 부분을 제거하기 위해 S1 뉴클레아제로 처리하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 결찰시켜 만들 수 있다. 이와 같은 방법으로, 본 발명의 단백질의 다양한 크기의 내부 단편과 N-말단을 암호화하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다.
점 돌연변이 또는 절단에 의해 만들어지는 복합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고 선별된 성질을 갖는 유전자 생성물의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러 기술이 당분야에 공지되어 있다. 이와 같은 기술은 본 발명의 단백질의 복합 돌연변이유발에 의해 만들어지는 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에도 적용될 수 있다. 대형 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 고처리량 분석에 가장 널리 이용되는 기술은 전형적으로, 복제가능 발현 벡터내로 유전자 라이브러리를 클로닝하고, 생성된 라이브러리 벡터로 적절한 세포를 형질전환시키고, 원하는 활성의 검출이 생성물이 검출되는 유전자를 암호화하고 벡터의 분리를 용이하게 하는 조건하에 복합 유전자를 발현시키는 단계를 수반한다. 순환 전체 돌연변이유발 (Recursive ensemble mutagenesis (REM))은 라이브러리내에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 증가시키는 기술이며, 본 발명의 변이체 단백질을 확인하는 스크리닝 검사와 공동으로 이용될 수 있다 (Arkin 등, Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:7811-7815; Delgrave 등, Protein Engineering (1993) 6 (3):327-331).
본 발명의 단백질의 유사체와 유도체
또한, 본 발명에는 화학적 변형으로 생산된 본 발명의 단백질의 유도체와 유사체가 포함된다. 본 발명의 단백질은 단백질 부분에 하나 이상의 화학기를 부착시켜 유도할 수 있다.
유도체화 반응에 적합한 화학기는 상기 유사체 또는 유도체가 생리학적 환경과 같은 수용성 환경에서 침전되지 않도록 수용성 중합체 중에서 선택될 수 있다. 선택적으로, 중합체는 약제학적으로 허용가능해야 한다. 당업자는 중합체/성분 접합체가 치료요법적으로 사용할 수 있는지, 그리고 치료요법적으로 적합하다면, 바람직한 용량, 순환시간, 단백질 분해에 대한 내성 및 다른 고려사항에 근거하여 바람직한 중합체를 선택할 수 있다. 본 발명의 단백질의 경우에, 본 명세서에 제공된 검사법을 이용하여 확인할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 적절한 수용성 중합체의 무제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오즈, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 덱스트란, 폴리 (n-비닐피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 또는 폴리비닐 알코올 등이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에 안정하기 때문에 제조시에 유리하다.
중합체는 임의 분자량을 가진 분지쇄 또는 직쇄일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우에, 적절한 분자량은 취급 및 제조의 용이성을 위해 대략 2 kDa 내지 대략 100kDa ("대략"은 폴리에틸렌 글리콜의 제조에서, 일부 분자가 언급된 분자량에서 다소 증감한다는 것을 의미한다)이다. 원하는 치료 프로필 (가령, 지속 방출 기간, 생물학적 활성에 대한 영향, 취급 용이성, 항원성 정도와 항원성 부재, 치료 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 공지 효과 등)에 따라 다양한 크기를 이용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 이렇게 부착된 중합체 분자의 수는 매우 다양하며, 당업자는 기능에 미치는 효과를 확인할 수 있다. 동일하거나 또는 상이한 화학기 (가령, 상이한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체)를 이용하여, 모노, 디-, 트리-, 테트라-유도체화 또는 다른 유도체화 조합을 달성할 수 있다. 본 발명의 단백질 분자에 대한 중합체 분자의 비율은 다양하게 변할 수 있고, 반응 혼합물에서 이들의 농도 역시 다양하게 변할 수 있다. 일반적으로, 최적 비율 (반응하지 않은 성분과 중합체가 과도하지 않도록 반응 효능 측면에서)은 원하는 유도체화 정도 (가령, 모노-, 디-, 트리- 등), 선택된 중합체의 분자량, 중합체가 직쇄인지 또는 분지쇄인지의 여부, 반응 조건 등과 같은 인자에 의해 결정된다.
본 발명의 단백질에 폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 다른 화학기)를 부착할 경우에, 기능성 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려해야 한다. 당업자가 이용할 수 있는 여러 부착 방법, 예를 들면, G-CSF에 PEG 커플링 (EP 0 401 384), 염화트레실을 이용한 GM-CSF 페길화 (peglyation) (Malik 등, 1992, Exp. Hematol. 20:1028-1035) 등이 존재한다. 가령, 폴리에틸렌 글리콜은 유리 아미노기 또는 카르복시기와 같은 반응기를 통하여 아미노산 잔기에 공유 결합될 수 있다. 반응기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합할 수 있는 기를 의미한다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기에는 리신 잔기와 N-말단 아미노산 잔기가 포함된다; 유리 카르복시기를 갖는 아미노산 잔기에는 아스파르트산, 글루탐산, C-말단 아미노산 잔기가 포함된다. 설피드릴 (SH)기 역시 폴리에틸렌 글리콜 분자 (들)을 부착시키기 위한 반응기로서 이용될 수 있다. 치료 목적으로는 N-말단 또는 리신기에서 부착과 같은 아미노기에 부착이 선호된다.
특히, N-말단이 화학적으로 변형된 본 발명의 단백질을 원할 수도 있다. 본 발명의 조성물로의 실례로서 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여, 당업자는 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자 (분자량, 분지쇄 등으로), 반응 혼합물에서 본 발명의 단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 비율, 실행되는 페길화 반응의 유형, 선별된 N-말단 페길화된 단백질 분자를 획득하는 방법에서 선택할 수 있다. N-말단 페길화된 제조물을 획득하는 (즉, 필요에 따라 다른 모노페길화된 부분으로부터 상기 부분을 분리하는) 방법은 페길화된 단백질 분자 계열로부터 N-말단 페길화된 물질을 정제하는 것이다. 선택적-N-말단 화학적 변형은 유도체화 반응에 이용할 수 있는 다른 유형의 1차 아미노기 (리신 대 N-말단)의 차등적인 반응성을 이용하는 환원성 알킬화반응으로 달성될 수 있다. 적절한 반응 조건하에, 카르보닐기 보유 중합체로 N-말단에서 실질적으로 선택적인 유도체화 반응을 실시할 수 있다. 가령, 리신 잔기의 ε-아미노기와 N-말단 잔기의 α-아미노기의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH에서 반응을 수행함으로써, 본 발명의 단백질을 선택적으로 N-말단 페길화시킬 수 있다. 이와 같은 선택적 유도체화 반응에 의해, 본 발명의 단백질에 수용성 중합체가 부착되는 것을 조절할 수 있다. 중합체와의 접합은 N-말단에서 주로 일어나고, 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응기는 크게 변형되지 않는다. 환원성 알킬화반응을 이용하여, 수용성 중합체는 전술한 유형일 수 있고, 본 발명의 단백질에 결합하기 위한 단일 반응성 알데히드기를 보유해야 한다. 단일 반응성 알데히드를 보유하는 폴리에틸렌 글리콜 프로프리온알데히드가 이용될 수도 있다.
항체
폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조를 위한 표준 기술에 따라 본 발명의 분리된 단백질 또는 이의 일부 또는 단편은 본 발명의 단백질에 결합하는 항체를 만들기 위한 면역원으로 이용할 수 있다. 본 명세서에서, "항체"는 면역글로불린 분자 및 이의 면역학적 활성 부분, 다시 말하면, 본 발명의 단백질과 같은 항원에 특이적인 - 결합하는 - 항원-결합 부위를 보유하는 분자 또는 이의 단편을 의미한다. 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 분자는 본 발명의 단백질에 결합하지만 시료, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 자연적으로 포함하는 생물학적 시료에서 다른 분자에는 실질적으로 결합하지 않는 분자이다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예는 F(ab)와 F(ab')2 단편인데, 이들은 펩신과 같은 효소로 항체를 처리하여 생성될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 단백질, 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체를 면역원으로 보유하는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체를 제시한다. 인간 질병이나 질환의 치료에 키메라 항체가 선호되는데, 그 이유는 인간 또는 인간화 항체가 이종 항체보다 면역 반응, 특히 알레르기 반응을 유도할 가능성이 훨씬 낮기 때문이다.
본 발명의 전장 단백질을 면역원으로 이용하거나, 대안으로 본 발명의 항원성 펩티드 단편을 면역원으로 제공할 수 있다. 본 발명의 항원성 펩티드는 서열번호 2에 도시된 아미노산 서열의 적어도 8개 (바람직하게는 10개, 15개, 20개, 30개 또는 그 이상) 아미노산 잔기를 포함하고 에피토프를 포함하여, 상기 펩티드에 대하여 생성된 항체가 본 발명의 단백질과 특이적인 면역 복합체를 형성한다.
전형적으로, 면역원은 적합한 개체 (가령, 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유동물)를 면역원으로 면역화시킴으로써 항체를 만드는데 이용된다. 가령, 적절한 면역원성 제제는 재조합에 의해 발현되는 본 발명의 단백질 또는 화학적으로 합성되는 본 발명의 폴리펩티드를 함유한다. 상기 제제는 Freund 완전 또는 불완전한 어쥬번트 또는 유사한 면역자극제를 추가로 함유할 수 있다. 적합한 개체를 면역원성 제제로 면역화시켜 본 발명의 단백질에 대한 폴리클로날 항체 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 본 명세서에서, "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체조성물"은 본 발명의 단백질의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 한 종류의 항원-결합 부위만을 보유하는 항체 분자 계열을 의미한다. 따라서, 모노클로날 항체 조성물은 일반적으로, 본 발명의 단백질의 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 친화성을 나타낸다.
본 발명의 면역원으로 적합한 개체를 면역화시킴으로써 상기한 바와 같이 폴리클로날 항체를 만들 수 있다. 면역화된 개체에서 항체 역가는 고정된 본 발명의 단백질을 이용한 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)과 같은 표준 방법으로 시간 경과에 따라 모니터할 수 있다. 원하는 경우에, 본 발명의 단백질에 대한 항체 분자는 포유동물로부터 (가령, 혈액으로부터) 분리하고, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술로 추가 정제하여 IgG 분획물을 수득할 수 있다. 면역화 후 적절한 시점에, 가령, 항체 역가가 최고일 때, 항체-생성 세포를 개체로부터 수득하고, Kohler 등, Nature (1975) 256:495497에 처음 기술된 하이브리도마 기술; 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (Kohler 등, Immunol Today (1983) 4:72); EBV 하이브리도마 기술 (Cole등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, (1985), Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96); 또는 트리오마 기술과 같은 표준 기술로 모노클로날 항체를 준비하는데 이용할 수 있다. 하이브리도마를 만드는 기술은 널리 공지되어 있다 (Current Protocols in Immunology (1994) Coligan 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). 간략하게 설명하면, 전술한 바와 같이, 불멸 세포주 (전형적으로, 골수종)를 본 발명의 면역원으로 면역화된 포유동물로부터 유래된 림프구 (주로, 비장세포)에 융합하고, 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상층액을 스크리닝하여, 본 발명의 단백질에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인한다.
림프구와 불멸 세포주를 융합시키는데 이용되는 많은 공지의 프로토콜이 모노클로날 항체를 생산하는데 이용될 수 있다 (Current Protocols in Immunology, supra; Galfre 등, Nature (1977) 266:550-552; Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); Lerner, Yale J Biol Med (1981) 54:387-402). 또한, 당업자는 이와 같은 방법의 다양한 변형 역시 유용하게 이용할 수 있다. 일반적으로, 불멸 세포주 (가령, 골수종 세포주)는 림프구와 동일한 포유동물 종으로부터 유래된다. 가령, 불멸화된 마우스 세포주, 예를 들면, 하이포산틴, 아미노프테린, 티미딘을 함유하는 배양 배지 ("HAT 배지")에 민감한 골수종 세포주와 본 발명의 면역학적 제제로 면역화된 마우스의 림프구를 융합시켜, 쥐의 하이브리도마를 만들 수 있다. 표준 기술에 따라 다수의 골수종 세포주, 예를 들면, P3-NS1/l-Ag4-1, P3x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Agl4 골수종 세포가 융합 짝으로서 이용될 수 있다. 골수종 세포주는 ATCC에서 입수가능하다. 일반적으로, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG")을 이용하여 HAT-민감성 마우스 골수종 세포를 마우스 비장세포에 융합시킨다. 융합으로 생성된 하이브리도마 세포는 융합되지 않거나 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 죽이는 HAT 배지를 이용하여 선별한다 (융합되지 않은 비장세포는 형질전환되지 않기 때문에 수일후에 죽는다). 예로써 표준 ELISA 분석 방법을 이용하여, 하이브리도마 배양 상층액에서 본 발명의 단백질에 결합하는 항체를 스크리닝함으로써 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 검출한다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하는 대안으로, 본 발명의 단백질로 재조합 복합 면역글로불린 라이브러리 (가령, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함으로써 모노클로날 항체를 확인 및 분리하여, 본 발명의 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 산출하고 스크리닝하는 키트는 상업적으로 구입가능하다 (참조: Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 2794-00-01; Stratagene "SurfZAP" Phage Display Kit, Catalog No. 240612).
또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 산출하고 스크리닝하는데 이용할 수 있는 방법 및 시약은 당업자에게 공지되어 있다 (Fuchs 등, Bio/Technology (1991) 9:1370-1372; Hay 등, Hum Antibody Hybridomas (1992) 3:81-85; Huse 등, Science (1989) 246:1275-1281; Griffiths 등, EMBO J (1993) 25 (12):725-734; U.S. Patent No. 5,223,409; PCT Publication No. WO 92/18619; PCT Publication No. WO 91/17271; PCT Publication No. WO 92/20791; PCT Publication No. WO 92/15679; PCT Publication No. WO 93/01288; PCT Publication No. WO 92/01047; PCT Publication No. WO 92/09690; PCT Publication No. WO 90/02809; 이를 참고 문헌으로 본원에 인용한다).
또한, 인간과 비-인간 부분을 포함하는 키메라와 사람화된 모노클로날 항체와 같은 재조합 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있다. 이들 키메라와 사람화된 모노클로날 항체는 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있다 (참조: PCT 공개공보 WO 87/02671; 유럽 특허출원 184,187; 유럽특허출원 171,496; 유럽특허출원 173,494; PCT 공개공보 WO 86/01533; 미국특허 4,816,567; 유럽특허출원 125,023; Better 등, Science (1988) 240:1041-1043; Liu 등, Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3439-3443; Lin 등, J Immunol (1987) 139:3521-3526; Sun 등, Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:214-218; Nishimura 등, Canc Res (1987) 47:999-1005; Wood 등, Nature (1985) 314:446-449; Shaw 등, J Natl Cancer Inst (1988) 80:1553-1559; Morrison, Science (1985) 229:1202-1207; Oi 등, Bio/Techniques (1986) 4:214; U.S. Patent No. 5,225,539; Jones 등, Nature (1986) 321:552-525; Verhoeyan 등, Science (1988) 239:1534; Beidler 등, J Immunol (1988) 141:4053-4060; 이를 참고 문헌으로 본원에 인용한다).
완전 인간 항체가 인간 환자의 치료에 특히 적합하다. 이들 항체는 내인성 면역글로불린 중쇄와 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만 인간 중쇄와 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 유전자전이된 (transgenic) 마우스를 이용하여 생산할 수 있다. 유전자전이된 마우스는 선택된 항원, 예를 들면, 본 발명의 단백질의 전체 또는 일부를 사용하여 정상적인 방식으로 면역화시킨다. 통상적인 하이브리도마 기술을 이용하여 상기 항원에 대한 모노클로날 항체를 획득할 수 있다. 유전자전이된 마우스가 보유하는 인간 면역글로불린 전이유전자 (transgene)는 B 세포 분화동안 재배열되고, 이후 종 전환 (class switching)과 체세포 돌연변이를 겪게 된다. 따라서, 이와 같은 에피토프를 이용하여, 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 항체를 확인한다. 비-인간 항체의 중쇄와 경쇄를 클로닝하고 이용하여 파지 디스플레이 Fab 단편을 만든다. 가령, 중쇄 유전자를 플라스미드 벡터에 클로닝하여 박테리아로부터 중쇄가 분비되도록 할 수 있다. 경쇄 유전자를 파지 외피 단백질 유전자에 클로닝하여 파지의 표면에서 경쇄가 발현되도록 할 수 있다. 파지에 융합된 인간 경쇄의 레퍼토리 (무작위 수집)를 이용하여 비-인간 중쇄를 발현하는 박테리아를 감염시킨다. 생성된 후손 파지는 하이브리드 항체 (인간 경쇄/비-인간 중쇄)를 디스플레이한다. 선택된 항원은 선택된 항원에 결합하는 파지를 선별하는 패닝 스크린 (panning screen)에 이용된다. 이런 파지를 확인하는데 수회의 선별이 필요할 수 있다.
인간 경쇄 유전자는 선택된 항원에 결합하는 선택된 파지로부터 분리한다. 이후, 선택된 인간 경쇄 유전자는 아래와 같이 인간 중쇄 유전자의 선별을 유도하는데 이용된다. 선택된 인간 경쇄 유전자는 박테리아에 의한 발현을 위하여 벡터에 삽입한다. 선택된 인간 경쇄를 발현하는 박테리아는 파지에 융합된 인간 중쇄의 레퍼토리로 감염시킨다. 생성된 후손 파지는 인간 항체 (인간 경쇄/인간 중쇄)를 디스플레이한다.
이후, 선택된 항원은 선택된 항원에 결합하는 파지를 선별하는 패닝 스크린에 이용된다. 선택된 파지는 최초 선택된 비-인간 모노클로날 항체에 의해 인식되는 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체를 디스플레이한다. 중쇄와 경쇄 모두를 암호화하는 유전자는 분리하고, 인간 항체의 생산을 위하여 더욱 조작할 수 있다. 이러한 기술은 Jespers 등, Bio/Technology (1994) 12:899-903에서 기술한다.
항체 (가령, 모노클로날 항체)는 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술로 본 발명의 단백질을 분리하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 항체는 세포로부터 천연 단백질 및 숙주 세포에서 발현된 재조합에 의해 생산된 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있다. 또한, 항체는 상기 단백질의 발현량 및 발현 패턴을 평가하기 위하여 본 발명의 단백질 (가령, 세포 용해물질 또는 세포 상청액에서)을 검출하는데 이용될 수 있다. 항체는 예로써 일정한 치료 방법의 효능을 결정하는 임상 검사 절차의 일부로서 조직 내 단백질 수준을 모니터하는 진단학적으로 이용될 수 있다. 항체에 검출가능 물질 (하기에 기술됨)을 결합시킴으로써 검출을 용이하게 할 수 있다.
검출가능 표지
선택적으로, 본 발명의 분리된 핵산 분자, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 항체 및 이들 부분의 단편은 검출가능하게 표지될 수도 있다. 적절한 표지에는 효소, 형광단 (가령, 형광 이소티오시아네이트 (FITC), 피코에리트린 (PE), 텍사스 레드 (TR), 로다민, 유리 또는 킬레이트화된 란타니드 시리즈 염, 특히, Eu3 + 등), 발색단, 방사성동위원소, 킬레이트화제, 염료, 콜로이드성 금, 라텍스 입자, 리간드 (가령, 바이오틴), 생물발광 물질, 화학발광물질 등이 포함된다. 대조 마커가 이용되는 경우에, 수용체 및 대조 마커에 동일하거나 상이한 표지를 이용할 수 있다.
방사성 표지, 예를 들면, 동위원소, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re가 사용되는 경우, 현재 공지된 카운팅 절차를 이용할 수 있다. 효소가 표지로 사용되는 경우, 현재 당분야에 공지된 발색, 분광광도, 형광광도, 전류검출, 가스검출 기술을 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 검출가능 표지의 한 가지 실례는 직접 표지 (direct label)이다. 직접 표지는 자연 상태에서 육안으로 또는 광학 필터 및/또는 자극, 예를 들면, 형광을 촉진하는 UV 광을 통하여 쉽게 가시화되는 실체로서 정의된다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 착색 표지에는 금속성 졸 입자, 가령 금 졸 입자 (Leuvering, 미국특허 4,313,734); 염료 졸 입자 (Gribnau 등, 미국특허 4,373,932; May 등, WO 88/08534); 염색된 라텍스 (May, supra, Snyder, EP-A 0 280 559; 0 281 327); 리포좀에 포집된 염료 (Campbell 등, 미국특허 4,703,017) 등이 포함될 수 있다. 다른 직접 표지에는 방사성 뉴클레오티드, 형광 기 또는 발광 기 등이 포함된다. 이와 같은 직접 표지화 장치에 추가하여, 효소를 포함하는 간접 표지를 본 발명에 이용할 수도 있다. 당분야에는 다양한 유형의 효소 연결된 면역검사물질이 공지되어 있는데, 예를 들면, 알칼리 포스포타제와 양고추냉이 과산화효소, 라이소자임, 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 락테이트 디하이드로게나제, 우레아제 등이다 (Eva Engvall in Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymology, 70. 419-439, 1980; U.S. Patent No. 4,857,453).
본 발명에 이용될 수 있는 다른 검출가능 표지에는 자성 비드 또는 자성 공명 영상 표지가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리펩티드, 본 발명의 항체, 이의 단편에 32P 표지화 (labelling)를 위한 인산화 반응 부위를 만들 수 있다 (참조: 유럽특허 0372707).
본 명세서에 예시된 바와 같이, 항체를 비롯한 단백질은 대사적 표지화를 이용하여 검출가능하게 표지할 수 있다. 대사적 표지화는 [35S]-메티오닌 또는 [32P]-오르토포스페이트와 같은 대사적 표지로 보충된 배양 배지의 존재에서 단백질을 발현하는 세포의 시험관내 배양동안 진행된다. [35S] 메티오닌을 이용한 대사적 (또는 생합성) 표지화에 추가하여, 본 발명에서는 [14C]-아미노산 및 [3H]-아미노산 (안정적 위치에서 3중수소로 치환됨)으로 표지화를 고려한다.
항체들은 상기 인용된 표지 외에 항체들에 의해 인식될 수 있는 항원성 펩티드 태그들을 사용하여 추가로 검출될 수 있다. 그 예는 HA 태그 및 FLAGR 태그를 포함한다.
재조합 발현벡터 및 숙주 세포
본 발명의 다른 측면은 벡터, 바람직하게는 서열번호 1 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 벡터의 한 가지 유형은 "플라스미드"인데, 이는 추가의 DNA 단편이 결찰될 수 있는 환형 이중-가닥 DNA 루프를 의미한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터인데, 여기서 추가의 DNA 단편이 바이러스성 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다 (가령, 세균 복제 기점을 보유하는 벡터 및 에피좀성 포유동물 벡터). 다른 벡터 (가령, 비-에피좀성 포유동물 벡터)는 숙주 세포내로 도입직후에 숙주 세포의 게놈에 통합되고 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 발현 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 플라스미드 (벡터) 형태를 취한다. 하지만, 본 발명에는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 등가의 기능을 할 수 있는 바이러스 벡터 (가령, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스) 등이 포함된다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현의 적합한 형태로 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 이는 본 발명의 재조합 발현 벡터가 발현에 이용되는 숙주 세포에 기초하여 선택되고 발현되는 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 보유한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터내에서, "작동가능하게 연결된"은 뉴클레오티드 서열의 발현이 가능한 방식으로 목적 뉴클레오티드 서열이 조절 서열에 연결된다는 것을 의미한다 (가령, 시험관내 전사/해독 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포내로 도입되는 경우에 숙주 세포에서). "조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 다른 발현 조절 요소 (가령, 폴리아데닐화 신호 등)를 의미한다. 이와 같은 조절 서열은 예로써 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 기술한다. 조절 서열에는 다양한 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 서열 (가령, 조직-특이적 조절 서열)이 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 소요 단백질의 발현 수준 등과 같은 선택 인자에 좌우될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포내로 도입되어 본 명세서에 기술된 핵산에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 진핵이나 원핵 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli)과 같은 세균 세포, 곤충 세포 (바쿨로바이러스 발현 벡터 이용), 효모 세포, 포유동물 세포에서 서열번호 1 또는 이의 일부분의 발현을 위하여 설계될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 문헌[Goeddel, supra]에서 더욱 상술한다. 대안으로, 재조합 발현 벡터는 예로써 T7 프로모터 및/또는 T7 폴리메라제와 같은 파지 조절 요소와 단백질을 이용하여 시험관내에서 전사 및 해독할 수 있다.
원핵 세포에서 단백질 발현은 대부분의 경우에 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 유도하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 보유하는 벡터에 의해 대장균 (E. coli)에서 수행된다. 융합 벡터는 벡터내에 암호화되는 단백질에, 일반적으로 재조합 단백질의 아미노산 말단에 다수의 아미노산을 추가한다. 이와 같은 융합 벡터는 전형적으로, 3가지 목적을 수행한다: 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고; 3) 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 돕는다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 원핵 절단 부위를 융합 부분과 재조합 부분의 접점에 도입하여, 융합 단백질의 정제이후 융합 부분으로부터 재조합 단백질이 분리되도록 한다. 이와 같은 효소와 동족 인식 서열에는 인자 Xa, 트롬빈, 엔테로키나아제가 포함된다. 전형적인 융합 발현 벡터에는 표적 재조합 단백질에 글루타티온-5-트란스퍼라제 (GST)를 융합시키는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith 등, Gene (1988) 67:31-40), 표적 재조합 단백질에 말토오스 E 결합 단백질을 융합시키는 pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), 표적 재조합 단백질에 단백질 A를 융합시키는 pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ) 등이 포함된다.
적절한 유도성 비-융합 대장균 (E. coli) 발현 벡터에는 pTrc (Amann 등, Gene (1988) 69:301-315); pET 11d (Studier 등, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:60-89)등이 포함된다. pTrc 벡터로부터 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터 숙주 RNA 폴리메라제 전사에 좌우된다.
대장균 (E. coli)에서 재조합 단백질 발현을 최대화시키는 한 가지 방법은 재조합 단백질을 단백분해 절단하는 능력이 손상된 숙주 세포에서 상기 단백질을 발현시키는 것이다 (Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:119-128). 다른 방법은 각 아미노산의 개별 코돈이 대장균 (E. coli)에서 선호적으로 이용되는 개별 코돈이 되도록 발현 벡터내로 삽입되는 핵산 분자의 핵산 서열을 변형시키는 것이다 (Wada 등, Nucleic Acids Res (1992) 20:2111-2118). 본 발명의 핵산 서열의 이런 변형은 표준 DNA 합성 기술로 수행할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae)와 같은 효모에서 발현 벡터에는 pYepSecl (Baldari 등, EMBO J (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan 등, Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz 등, Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA) 등이 포함된다.
대안으로, 서열번호 1 또는 이의 일부분은 바쿨로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충 세포 (가령, Sf 9 세포)에서 단백질 발현에 이용될 수 있는 바쿨로바이러스 벡터에는 pAc 시리즈 (Smith 등, Mol Cell Biol (1983) 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow 등, Virology (1989) 170:31-39)가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 포유동물 발현 벡터를 이용하여 포유동물 세포에서 발현시킨다. 포유동물 발현 벡터에는 pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman 등, EMBO J (1987) 6:187-195)이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다. 포유동물 세포에 이용되는 발현 벡터의 조절 기능은 바이러스 조절 요소에 의해 빈번하게 제공된다. 가령, 통상적으로 이용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 원숭이 바이러스 40으로부터 유래된다. 진핵과 원핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템은 문헌[Sambrook 등, supra의 16장과 17장]을 참조한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포형에서 핵산의 발현을 선호적으로 유도할 수 있다 (가령, 핵산을 발현하는데 조직-특이적 조절 요소가 이용된다). 조직-특이적 조절 요소들은 당분야에 공지되어 있다. 적절한 조직-특이적 프로모터의 무-제한적 예에는 알부민 프로모터 (간 특이적 프로모터; Pinkert 등, Genes Dev (1987) 1:268-277); 림프구-특이적 프로모터 (Calame 등, Adv Immunol (1988) 43:235-275), 특히, T 세포 수용체 (Winoto 등, EMBO J (1989) 8:729-733)와 면역글로불린 (Banerji 등, Cell (1983) 33:729-740; Queen 등, Cell (1983) 33:741-748)의 프로모터; 신경-특이적 프로모터 (가령, 신경미세섬유 프로모터; Byrne 등, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:5473-5477); 췌장-특이적 프로모터 (Edlund 등, Science (1985) 230:912-916); 유선-특이적 프로모터 (가령, 우유 유장 프로모터; U.S. Patent No. 4,873,316; 유럽특허 264,166) 등이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 발생학적으로 조절된 프로모터, 예를 들면, 쥐의 hox 프로모터 (Kessel 등, Science (1990) 249:374-379) 및 α-태아단백질 프로모터 (Campes 등, Genes Dev (1989) 3:537-546) 역시 포함된다 이를 참고 문헌으로 본원에 인용한다.
또한, 본 발명은 안티센스 방향으로 발현 벡터에 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제시한다. 다시 말하면, DNA 분자는 본 발명의 mRNA에 안티센스인 RNA 분자가 발현 (가령, DNA 분자의 전사에 의해)되도록 하는 방식으로 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 안티센스 방향으로 클로닝된 핵산에 작동하게 연결된 조절 서열은 다양한 세포형에서 안티센스 RNA 분자가 지속적으로 발현될 수 있도록 선택된다. 가령, 안티센스 RNA의 구성적, 조직-특이적 또는 세포형-특이적 발현을 유도하는 바이러스성 프로모터 및/또는 인핸서 또는 조절 서열을 선택할 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 고효율 조절 영역의 제어하에 안티센스 핵산이 생산되는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화된 바이러스 형태일 수 있고, 이들의 활성은 벡터가 도입되는 세포의 유형에 의해 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 이용한 유전자 발현 조절은 문헌[Weintraub 등, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1)1986]을 참고한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포에 관한 것이다. "숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 상호 호환적으로 이용된다. 이들 용어는 특정 개체 세포뿐만 아니라, 이와 같은 세포의 후손 또는 잠재적인 후손을 포괄한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인하여 특정한 변형이 후대에 발생할 수 있기 때문에, 후손은 모 세포와 실제로 동일하지 않지만 여전히 상기 용어의 범위에 포함된다.
숙주 세포는 진핵이나 원핵 세포일 수 있다. 가령, 본 발명의 단백질은 대장균 (E. coli)과 같은 세균 세포, 곤충세포, 효모 또는 포유동물 세포 (Chinese hamster ovary cells (CHO), 293 세포 또는 COS 세포)에서 발현될 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포는 당분야에 공지되어 있다. 벡터 DNA는 통상의 형질도입 또는 형질감염 기술을 이용하여 진핵이나 원핵 세포내로 도입될 수 있다. 본 명세서에서, "형질전환" 및 "형질감염"은 외부 핵산 (가령, DNA)을 숙주 세포로 도입하기 위한 당분야에 인정되는 다양한 기술, 예를 들면, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동-침전, 형질도입, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공 등을 의미한다.
포유동물 세포의 안정적인 형질감염을 위해서, 발현 벡터 및 이용된 형질감염 기술에 따라, 일부의 세포 분획만 외부 DNA를 게놈에 통합한다. 통합체를 확인하고 선별하기 위하여, 선별가능 마커 (가령, 항생제 내성)를 암호화하는 유전자가 목적 유전자와 함께 숙주 세포로 도입된다. 적절한 선별가능 마커는 약물, 예를 들면, G418, 하이그로마이신 (hygromycin), 메토트렉세이트 (methotrexate)에 내성을 제공한다. 선별가능 마커를 암호화하는 핵산은 서열번호 1 또는 이의 일부분을 암호화하는 벡터와 동일한 벡터로 숙주 세포로 도입되거나, 또는 별도의 벡터로 도입될 수 있다. 가령, 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선택성을 이용하여 확인할 수 있다 (가령, 선별가능 마커 유전자를 포함하는 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 사멸한다).
배양물에서 진핵이나 원핵 숙주 세포와 같은 본 발명의 숙주 세포를 이용하여, 본 발명의 단백질을 생산 (발현)할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 이용하여 서열번호 2 또는 이의 일부분을 생산하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포 (서열번호 1을 암호화하는 재조합 발현 벡터가 도입됨)를 적절한 배지에서 생장시켜, 본 발명의 단백질을 생산하는 과정을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 방법에는 배지 또는 숙주 세포로부터 본 발명의 단백질을 분리하는 단계가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에는 변형된 발현 벡터에 서브클로닝된 다른 단백질의 재조합적 발현을 위한 유도성 발현 시스템이 포함된다. 가령, 돌연변이된 G 단백질을 포함하는 숙주 세포 (가령, 효모 세포, Y2 부신피질 세포 및 cyc S49, 미국특허 6,168,927 B1, 미국특허 5,739,029, 미국특허 5,482,835; Mitchell 등, Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89 (19):8933-37; Katada 등, J Biol Chem (1984) 259 (6):3586-95)는 서열번호 1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 1 발현 벡터를 형질도입하는데, 여기서, 서열번호 2가 이들 숙주 세포에서 기능적으로 발현된다. 비록, 본 발명의 발현된 단백질이 구성적인 활성을 나타내긴 하지만, 이런 돌연변이는 신호 전달을 허용하지 않는다. 다시 말하면, G-단백질 유도된 하류 연속 반응의 활성화가 진행되지 않는다 (가령, 아데닐릴 사이클라아제 활성화 없음). 이후, 제 2 발현 벡터를 이용하여, 서열번호 1을 포함하는 숙주 세포를 형질도입한다. 제 2 벡터는 유도성 시스템에 의해 발현되는 목적 유전자에 추가하여, 숙주 세포의 G 단백질 돌연변이를 보충하는 구조 유전자 (즉, 기능성 포유동물 또는 효모 Gs, Gi, Go 또는 Gq)를 포함한다 (참조: PCT 공개공보 WO 97/48820; 미국특허 6,168,927 B1, 미국특허 5,739,029; 미국특허 5,482,835; 이를 참고 문헌으로 본원에 인용한다). 제 2 벡터의 보충적 구조 유전자는 보충적 구조 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 활성화시키는 외부에서 추가된 성분 (가령, 테트라사이클린, IPTG, 소분자 등, Sambrook et a., supra)의 제어하에 유도된다. 유도인자에 추가하여, 보충적 구조 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 기능적으로 발현되어, 본 발명의 구성적 활성 단백질은 적절한 하류 경로 활성화를 유도하는 복합체 (가령, 제 2 메신저 형성)를 형성한다. 제 2 벡터를 포함하는 목적 유전자는 적절한 제 2 메신저 (가령, CREB, AP1 요소)에 의해 활성화되는 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유한다. 따라서, 제 2 메신저가 축적되면, 목적 유전자로부터 상류에 위치한 프로모터가 활성화되어 상기 유전자의 생성물을 발현한다. 유도인자가 부재하는 경우에, 목적 유전자의 발현이 중단된다.
특정 구체예에서, 유도성 발현 시스템용 숙주 세포에는 S49 (cyc-) 세포가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. G-단백질 돌연변이를 보유하는 세포주를 고려하는 경우에, 적절한 돌연변이가 인공적으로 생산되거나 작제될 수 있다 (효모 세포의 경우, U.S. Patent No. 6,168,927 B1; U.S. Patent No. 5,739,029; U.S. Patent No. 5,482,835).
관련 측면에서, 세포는 서열번호 2에 열거된 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 cDNA에 작동가능하게 연결된 벡터로 형질감염시킨다. 이와 같은 시스템을 포함하는 제1과 제2 벡터에는 pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840); pMT2PC (Kaufman 등, EMBO J (1987) 6:187-195); pYepSecl (Baldari 등, EMBO J (1987) 6:229-234); pMFa (Kurjan 등, Cell (1982) 30:933-943); pJRY88 (Schultz 등, Gene (1987) 54:113-123); pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA) 등이 고려되지만, 이들에 국한되지 않는다.
관련 측면에서, 숙주 세포는 적절한 수단을 이용하여 형질감염시킬 수 있는데, 여기서, 형질감염은 기능성 단백질의 발현을 유도한다 (참조: Sambrook 등, supra; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, 1990). 이와 같은 "기능성 단백질"에는 일단 발현되면, G-단백질과 복합체를 형성하는 단백질이 포함되지만 이에 국한되지 않는데, 여기서 G-단백질은 제 2 메신저 형성을 조절한다. 본 발명에 이용되는 숙주 세포를 형질감염시키는 다른 방법에는 형질감염 (transfection), 전기천공 (electroporation), 마이크로인젝션 (microinjection), 형질도입 (transduction), 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션 (라이소자임 융합), 유전자 총 (gene gun) 이용, 또는 DNA 벡터 운반자 (Wu 등, 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut 등, 캐나다 특허 출원 2,012,311, 1990년 3월 15일에 출원) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명은 매우 다양한 프로모터를 이용한다. 실제로, 본 발명의 폴리펩티드의 발현은 당분야에 공지된 임의의 프로모터/인핸서 요소에 의해 조절될 수 있긴 하지만, 이와 같은 조절 요소들은 발현을 위하여 선택된 숙주에서 기능할 수 있어야 한다. 발현 조절에 이용될 수 있는 프로모터에는 SV40 조기 프로모터 영역 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 라우스 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus)의 3’긴 말단 반복체에 포함된 프로모터 (Yamamoto, 등, 1980, Cell 22:787-797), 허피스 (herpes) 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열 (Brinster 등, 1982, Nature 296:39-42); β-락타메이즈 프로모터 (VillaKamaroff, 등, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) 또는 tac 프로모터 (DeBoer, 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)와 같은 원핵 발현 벡터 (참조: "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94); Gal 4 프로모터, ADC (알코올 디하이드로게나제) 프로모터, PGK (포스포글리세롤 키나아제) 프로모터, 알칼리 포스포타제 프로모터와 같은 효모 또는 다른 곰팡이로부터 프로모터 요소; 조직 특이성을 나타내고 유전자전이된 동물에서 이용될 수 있는 동물 전사 조절 영역: 췌장 포상 세포에서 활성을 갖는 엘라스타제 I 유전자 조절 영역 (Swift 등, 1984, Cell 38:639-646; Ornitz 등, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성을 갖는 인슐린 조절 영역 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프구 세포에서 활성을 갖는 면역글로불린 유전자 조절 영역 (Grosschedl 등,1984, Cell 38:647-658; Adames 등, 1985, Nature 318:533-538; Alexander 등, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 림프구 및 비만 세포에서 활성을 갖는 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역 (Leder 등, 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성을 갖는 알부민 유전자 조절 영역 (Pinkert 등, 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성을 갖는 알파-페토단백질 유전자 조절 영역 (Krumlauf 등, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer 등, 1987, Science 235:53-58), 간에서 활성을 갖는 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역 (Kelsey 등, 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 골수 세포에서 활성을 갖는 베타-글로빈 유전자 조절 영역 (Mogram 등, 1985, Nature 315:338-340; Kollias 등, 1986, Cell 46:89-94), 뇌의 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte)에서 활성을 갖는 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (Readhead 등, 1987, Cell 48:703-712), 골근육에서 활성을 갖는 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 (Sani, 1985, Nature 314:283-286), 시상하부에서 활성을 갖는 고나도트로핀 방출호르몬 유전자 조절 영역 (Mason 등, 1986, Science 234:1372-1378) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 아래의 4가지 일반적인 방법으로 확인가능하다: (a) 원하는 플라스미드 DNA 또는 특정 mRNA의 PCR 증폭, (b) 핵산 하이브리드화 반응, (c) 선별가능 마커 유전자 기능의 존부, (d) 삽입된 서열의 발현. 첫 번째 방법으로, 핵산은 PCR로 증폭하고 증폭된 생성물을 검출할 수 있다. 두 번째 방법으로, 삽입된 마커 유전자에 상동성 서열을 포함하는 프로브를 이용한 핵산 하이브리드화 방법으로, 발현 벡터내에 삽입된 외부 유전자의 존재를 검출할 수 있다. 세 번째 방법으로, 벡터에 외부 유전자의 삽입으로 유도된 특정"선별가능 마커"유전자 기능 (가령, β-갈락토시다아제 활성, 티미딘 키나아제 활성, 항생제 내성, 형질전환 표현형, 바쿨로바이러스에서 폐색 체 형성 등)의 존부에 기초하여 재조합 벡터/숙주 시스템을 확인하고 선별할 수 있다. 다른 예를 들면, 본 발명의 단백질, 이의 변이체, 이의 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산이 벡터의 "선별가능 마커 유전자"내에 삽입되는 경우에, 삽입체를 포함하는 재조합체는 유전자 기능의 부재로 확인할 수 있다. 네 번째 방법으로, 발현된 단백질이 기능적 활성 형태인 경우에, 재조합 벡터에 의해 발현되는 유전자 생성물의 활성, 생화학적 특성, 면역학적 특징을 분석함으로써 재조합 발현 벡터를 확인할 수 있다.
본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 다양한 숙주/발현 벡터 조합이 이용될 수 있다. 가령, 유용한 발현 벡터는 염색체, 비염색체, 합성 DNA 서열의 부분 단편으로 구성된다. 적절한 벡터에는 SV40 유도체 및 공지된 세균 플라스미드, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 플라스미드 col El, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith 등, 1988, Gene 67:31-40), pMB9와 이의 유도체, RP4와 같은 플라스미드; 파지 DNA, 예를 들면, 파지 λ의 많은 유도체 (가령, NM989) 및 다른 파지 DNA, 예를 들면, M13, 섬유성 단일 가닥 파지 DNA; 2μ 플라스미드 또는 이의 유도체와 같은 효모 플라스미드; 곤충 또는 포유동물 세포에 유용한 벡터와 같은 진핵 세포에 유용한 벡터; 플라스미드와 파지 DNA의 복합체로부터 유도된 벡터, 예를 들면, 파지 DNA 또는 다른 발현 조절 서열 등을 이용하도록 변형된 플라스미드 등이 포함된다.
가령, 바쿨로바이러스 발현 시스템에서, 비-융합 전달 벡터 및 융합 전달 벡터를 모두 이용될 수 있는데, 이때 비-융합 전달 벡터에는 pVL941 (BamHI 클로닝 부위; Summers), pVL1393 (BamHI, SmaI, XbaI, EcoRI, NotI, XmaIII, BglII, PstI 클로닝 부위; Invitrogen), pVL1392 (BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI, BamHI 클로닝 부위; Summers and Invitrogen), pBlueBacIII (BamHI, BglII, PstI, NcoI, HindIII 클로닝 부위와 blue/white 재조합 스크리닝 가능; Invitrogen)이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 융합 전달 벡터에는 pAc700 (BamHI과 KpnI 클로닝 부위, 이때 BamHI 인식 부위는 개시 코돈에서 시작된다; Summers), pAc701, pAc702 (pAc700과 동일하지만 상이한 해독틀을 보유), pAc360 (BamHI 클로닝 부위는 폴리헤드린 개시 코돈의 하류 36개 염기쌍; Invitrogen (195)), pBlueBacHisA, B, C (3가지 상이한 해독틀, BamHI, BglII, PstI, NcoI, HindIII 클로닝 부위, ProBond 정제를 위한 N-말단 펩티드, 플라크의 blue/white 재조합 스크리닝; Invitrogen (220))가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명에 이용될 수 있는 포유동물 발현 벡터에는 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 보유하는 벡터, 예를 들면, DHFR 발현 벡터를 보유하는 임의의 발현 벡터, 또는 클로닝된 유전자와 DHFR을 모두 발현시키는 벡터와 pED (PstI, SalI, SbaI, SmaI, EcoRI 클로닝 부위)의 DHFR/메토트렉세이트 동시-증폭 벡터가 포함된다 (Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology , 16.12 (1991). 대안으로, pEE14 (HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI, BclI 클로닝 부위는, 이때 벡터는 글루타민 합성효소와 클로닝된 유전자를 발현한다; Celltech)와 같은 글루타민 합성효소/메티오닌 설폭시시민 동시-증폭 벡터를 이용할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus, EBV)의 제어하에 에피좀 발현을 유도하는 벡터, 예를 들면, pREP4 (BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, KpnI 클로닝 부위, 구성적 RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선별가능 마커; Invitrogen), pCEP4 (BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, KpnI 클로닝 부위, 구성적 hCMV 즉각 조기 유전자, 하이그로마이신 선별가능 마커; Invitrogen), pMEP4 (KpnI, Pvu I, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI 클로닝 부위, 유도성 메탈로티오닌 Iia 유전자 프로모터, 하이그로마이신 선별가능 마커: Invitrogen), pREP8 (BamHI, XhoI, NotI, HindIII, NheI, KpnI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, 히스티디놀 선별가능 마커; Invitrogen), pREP9 (KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, G418 선별가능 마커; Invitrogen), pEBVHis (RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선별가능 마커, ProBond 수지를 통하여 정제가능하고 엔테로키나아제에 의해 절단되는 N-말단 펩티드; Invitrogen) 등이 이용될 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 선별가능 포유동물 발현 벡터에는 pRc/CMV (HindIII, BstXI, NotI, SbaI, ApaI 클로닝 부위, G418 선별성: Invitrogen), pRc/RSV (HindIII, Spe I, BstXI, NotI, XbaI 클로닝 부위, G418 선별성; Invitrogen) 등이 포함된다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 백시니아 바이러스 포유동물 발현 벡터 (Kaufman, 1991, supra)에는 pSC11 (SmaI 클로닝 부위, TK-와 β-gal 선별성), pMJ601 (SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI, HindIII 클로닝 부위; TK-와 β-gal 선별성), pTKgptF1S (EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI, Hpa 클로닝 부위, TK- 또는 XPRT 선별성) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
효모 발현 시스템 역시 본 발명에 따른 단백질, 이의 변이체, 또는 이의 유도체 또는 유사체를 발현시키는데 이용될 수 있다. 가령, 비-융합 pYES2 벡터 (XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, KpnI, HindIII 클로닝 부위; Invitrogen) 또는 융합 pYESHisA, B, C (XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI, HindIII 클로닝 부위, ProBond 수지로 정제되고 엔테로키나아제로 절단되는 N-말단 펩티드; Invitrogen) 등이 본 발명에 이용될 수 있다.
특정 재조합 DNA 분자가 확인되고 분리되면, 당분야에 공지된 여러 방법으로 이를 증폭시킬 수 있다. 적절한 숙주 시스템 및 생장 조건이 확립되면, 재조합 발현 벡터를 증폭하고 대량으로 제조할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이용될 수 있는 발현 벡터에는 아래의 벡터 또는 이들의 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 인간이나 동물 바이러스; 바쿨로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지 벡터 (가령, 람다); 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
이에 더하여, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 또는 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 가공하는 숙주 세포주를 선택할 수 있다. 서로 다른 숙주 세포는 단백질의 전사와 전사후 가공 및 변형 (가령, 글리코실화반응, 신호 서열의 절단 등)을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 보유한다. 발현된 외부 단백질을 원하는 방식으로 변형하고 가공하기 위하여 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 가령, 세균 시스템에서 발현을 이용하여 글리코실화되지 않은 코어 단백질 생성물을 만들 수 있다.
유전자전이된 동물
또한, 본 발명의 숙주 세포를 이용하여 비-인간 유전자전이된 동물을 만들 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 서열번호 1에 상응하는 서열이 도입된 수정된 난모세포 또는 배아 줄기 세포이다. 이와 같은 숙주 세포를 이용하여, 외인성 서열이 게놈에 도입된 비-인간 유전자전이된 동물, 또는 내인성 서열이 변형된 상동성 재조합 동물을 만들 수 있다. 이들 동물은 본 발명의 단백질의 기능 및/또는 활성을 연구하고 본 발명의 단백질의 활성 조절 물질을 확인하거나 평가하는데 이용된다. 본 명세서에서, "유전자전이된 동물"은 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 래트 또는 마우스와 같은 설치류인데, 여기서 상기 동물의 하나 이상의 세포가 전이유전자를 포함한다. 유전자전이된 동물의 다른 예에는 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등이 포함된다. 본 발명의 특정 구체예는 본 발명의 수용체를 과다발현하고 알레르기 비염, 기관지 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환의 동물 모델로서 유용한 기니 피그이다.
본 명세서에서, "전이유전자"는 유전자전이된 동물이 발생하는 세포의 게놈에 통합되고 성숙한 동물의 게놈에 유지되는 외부 DNA를 의미한다. 전이유전자는 유전자전이된 동물의 한 가지 이상의 세포형 또는 조직에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 유도한다. 본 명세서에서, "상동성 재조합 동물"은 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 마우스인데, 여기서 서열번호 1에 상응하는 내인성 유전자는 상동성 재조합에 의해 변형된다. 이는 동물의 발달에 앞서, 동물의 세포, 예를 들면, 동물의 배아 세포에 도입되는 내인성 유전자와 외인성 DNA 분자 사이에 달성된다.
본 발명의 유전자전이된 동물은 상기한 형질감염 방법 중에서 한 가지를 이용하여, 서열번호 1 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산 분자를 수정된 난모세포의 수컷 전핵으로 도입함으로써 만들 수 있다. 이후, 난모세포는 가상임신 (pseudopregnant) 암컷 부양 동물에서 발달시킨다. 가령, 서열번호 1의 cDNA 서열을 전이유전자로서 비-인간 동물의 게놈으로 도입할 수 있다. 대안으로, 마우스 유전자와 같은 인간의 유전자의 비-인간 상동성 유전자를 서열번호 1에 상응하는 cDNA에 대한 하이브리드화 반응에 기초하여 분리하고, 전이유전자로서 이용할 수 있다. 전이유전자의 발현 효율을 증가시키기 위하여 인트론 서열 및 폴리아데닐화 신호가 전이유전자에 포함될 수도 있다. 조직-특이적 조절 서열을 본 발명의 전이유전자에 작동가능하게 연결하여, 특정 세포에서 본 발명의 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배아 조작 및 마이크로인젝션을 통하여 유전자전이된 동물, 특히, 마우스와 같은 동물을 산출하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며 이를 참고 문헌으로 본원에 인용한다 (참조: U.S. Patent No. 4,736,866; U.S. Patent No. 4,870,009; U.S. Patent No. 4,873,191; Hogan, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)). 게놈에서 전이유전자 및/또는 동물의 조직이나 세포에서 본 발명의 mRNA의 발현으로 다른 유전자전이된 동물을 산출하는데 유사한 방법을 이용할 수 있다. 이후, 유전자전이된 최초 동물을 이용하여 전이유전자를 갖는 추가 동물을 번식시킬 수 있다. 또한, 서열번호 1을 암호화하는 전이유전자를 갖는 유전자전이된 동물은 다른 전이유전자를 갖는 다른 유전자전이된 동물로 더욱 번식시킬 수 있다
상동성 재조합 동물을 산출하기 위하여, 본 발명의 유전자를 변형, 예를 들면, 기능적으로 교란시키기 위하여 결실, 부가 또는 치환이 도입된 본 발명의 유전자의 적어도 일부분 (가령, 본 발명의 유전자의 인간이나 비-인간 상동체, 예를 들면, 쥐의 유전자)을 보유하는 벡터를 제조한다. 바람직한 구체예에서, 벡터는 상동성 재조합 시에 내인성 유전자가 기능적으로 교란되도록 설계된다 (다시 말하면, 기능성 단백질을 더 이상 암호화하지 않는다; "녹아웃 ("knock out") 벡터).
대안으로, 벡터는 상동성 재조합시에 내인성 유전자가 돌연변이되거나 변형되지만 기능성 단백질을 여전히 암호화하도록 설계된다 (다시 말하면, 상류 조절 영역을 변형시켜 내인성 단백질의 발현을 변형시킬 수 있다).
상동성 재조합 벡터에서, 유전자의 변형된 부분은 유전자의 추가 핵산 서열을 5'와 3' 말단에서 인접시켜, 벡터에 의해 운반되는 외인성 유전자와 배아 줄기 세포에서 내인성 유전자 사이에 상동성 재조합이 발생되도록 한다. 추가 인접 핵산 서열은 내인성 유전자와의 성공적인 상동성 재조합을 위하여 충분한 길이를 갖는다. 일반적으로, 수 kb (킬로베이스)의 인접한 DNA (5'와 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 (상동성 재조합 벡터에 관하여 Thomas 등, Cell (1987) 51:503을 참조한다).
벡터를 배아 줄기 세포 (가령, 전기천공으로)에 도입하고, 본 발명의 도입된 유전자가 내인성 유전자와 상동성 재조합된 세포를 선별한다 (Li 등, Cell (1992) 69:915). 이후, 선별된 세포를 동물 (가령, 마우스)의 낭포에 주입하여 응집 키메라를 형성한다 (참조: Bradley in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL, Oxford, (1987) pp. 113-l52). 그 다음, 키메라 배아를 적절한 가상임신 암컷 부양 동물에 착상시키고, 임신시킨다. 생식 세포에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 후손을 이용하여 동물을 번식시키는데, 이때 동물의 모든 세포는 전이유전자의 생식세포주 전달에 의해 상동성 재조합된 DNA를 보유한다.
상동성 재조합 벡터 및 상동성 재조합 동물을 작제하는 방법은 문헌[Bradley, Current Opinion in Bio/Technology (1991) 2:823-829; PCT Publication No. WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968; WO 93/04169]에서 더욱 상세하게 기술한다.
다른 구체예에서, 전이유전자의 발현을 조절할 수 있는 선택된 시스템을 보유하는 유전자전이된 비-인간 동물을 만들 수 있다. 이와 같은 시스템의 한 가지 예는 박테리오파지 P1의 cre/loxP 리콤비나아제(recombinase) 시스템이다. cre/loxP 리콤비나아제 시스템에 관하여 Lakso 등, Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:6232-6236을 참조한다. 리콤비나아제 시스템의 다른 예는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae)의 FLP 리콤비나아제 시스템이다 (O'Gorrnan 등, Science (1991) 251:1351-1355). cre/loxP 리콤비나아제 시스템을 이용하여 전이유전자의 발현을 조절하는 경우에, cre 리콤비나아제 및 선택된 단백질 모두를 암호화하는 전이유전자를 보유하는 동물이 필요하다. 이들 동물은 예로써 2가지 유전자전이된 동물: 선택된 단백질을 암호화하는 전이유전자를 보유하는 유전자전이된 동물 및 리콤비나아제를 암호화하는 전이유전자를 보유하는 다른 유전자전이된 동물을 교배함으로써 "이중" 유전자전이된 동물의 작제를 통하여 만들 수 있다.
본 명세서에 기술된 비-인간 유전자전이된 동물의 클론 역시 문헌[Wilmut 등, Nature (1997) 385:810-813; PCT Publication No. WO 97/07668; WO 97/07669]에 기술된 방법에 따라 만들 수 있다. 간략하게 설명하면, 유전자전이된 동물의 세포, 예를 들면, 체세포를 분리하고, 성장주기를 중단시키고 G0 단계로 유도한다. 이후, 전기 자극을 통하여, 정지 세포 (quiescent cell)가 분리된 동종의 동물로부터 유래된 핵이 제거된 난모세포에 정지 세포를 융합시킬 수 있다. 그 다음, 재구성된 난모세포를 배양하여 상실배 또는 배반세포로 발달시키고, 이후 가상임신 암컷 부양 동물에 이전한다. 암컷 부양 동물로부터 태어난 후손은 세포, 예를 들면, 체세포가 분리된 동물의 클론이 된다.
본 발명의 추가적인 용도 및 방법
본 발명의 핵산 분자, 단백질, 단백질 상동체, 항체 및 이들의 단편은 아래의 한 가지 이상의 방법에 이용될 수 있다: a) 스크리닝 검사; b) 검출 검사 (가령, 염색체 맵핑, 조직 유형결정, 법의생물학); c) 예측 약물 (가령, 진단 검사, 예후 검사, 임상 시험 모니터, 약리유전체학 (pharmacogenomics)); d) 치료 방법 (가령, 치료 및 예방). 본 발명의 단백질은 다른 세포 단백질과 상호작용하기 때문에, (i) 세포 증식 조절; (ii) 세포 분화 조절; (iii) 세포 생존 조절; (iv) 세포 기능 조절에 이용될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산 분자를 이용하여 본 발명의 단백질을 발현하거나 (가령, 유전자 치료에서 숙주 세포내에 재조합 발현 벡터를 통하여), 본 발명의 mRNA를 검출하거나 (가령, 생물학적 시료에서), 또는 본 발명의 유전자에서 유전적 병소를 검출하고 내인성 mRNA, DNA 또는 단백질의 활성을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 이용하여 단백질 활성 또는 발현을 조절하고, 내인성 단백질의 과소생산 또는 과다생산으로 특성화되는 질환을 치료하는 약물 또는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 야생형 단백질에 비하여 감소되거나 비정상적인 활성을 갖는 단백질 형태의 생산에 대한 스크리닝 역시 본 발명에서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 이용하여 단백질을 검출 및 분리하고, 활성을 조절할 수 있다. 본 발명은 또한, 상기한 스크리닝 검사에 의해 확인된 신규한 물질 및 본 명세서에서 기술된 바와 같은 이들의 치료 용도에 관한 것이다.
1. 검출 및 스크리닝 분석
내인성 리간드의 존재하에 G 단백질의 수용체가 활성화되면 G 단백질 수용체 복합체가 형성되고, 결과로써 GTP가 G 단백질에 결합하게 된다. G 단백질의 GTPase 도메인은 GTP를 GDP로 서서히 가수분해시켜, 정상적인 조건하에 수용체 탈활성화 (deactivation)를 유도한다. 하지만, 구성적 활성화 수용체는 GDP를 GTP로 계속 가수분해한다.
G 단백질의 가수분해되지 않은 기질인 [35S]GTPγS를 이용하여 구성적 활성화 수용체를 발현하는 막에 대한 강화된 결합을 모니터할 수 있다. Traynor와 Nahorski는 [35S]GTPγS 를 이용하여 리간드의 존부하에, 막에 대한 G 단백질 결합을 모니터할 수 있다고 보고하였다 (Traynor 등, Mol Pharmacol (1995) 47 (4):848-54). 이와 같은 검사 시스템은 가급적, 후보 화합물의 초기 스크리닝에 이용되는데, 그 이유는 상기 시스템이 수용체에 결합하는 특정 G 단백질에 상관없이 모든 G 단백질-결합된 수용체에 포괄적으로 적용될 수 있기 때문이다.
Gs는 효소 아데닐릴 시클라아제를 자극하는 반면, Gi과 Go는 상기 효소를 저해한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 아데닐릴 시클라아제는 ATP의 cAMP로의 전환을 촉매한다; 따라서, Gs 단백질에 결합하는 구성적 활성화 GPCR은 cAMP의 증가된 세포 수준과 연관한다. 대안으로, Gi (또는 Go) 단백질에 결합할 수 있는 구성적 활성화 GCPR은 cAMP의 감소된 세포 수준과 연관한다 (참조: "Indirect Mechanism of Synaptic Transmission," Chpt. 8, from Neuron to Brain (3rd Ed.), Nichols 등 eds., Sinauer Associates, Inc., 1992). 따라서, cAMP를 검출하는 검사를 이용하여 후보 화합물이 수용체에 역효능제인지를 결정할 수 있다. cAMP를 측정하는 당분야에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 항-cAMP 항체가 ELISA-기초된 포맷에 이용된다. 한 구체예에서, 전체 세포 제 2 메신저 리포터 시스템 검사가 고려된다 (PCT Publication No. WO 00/22131; 이를 참고 문헌으로 본원에 인용한다). 특정 구체예는 하기 "실시예 5"에 기술된 SPA 검사이다.
관련 측면에서, 환형 AMP는 cAMP-반응성 DNA 결합 단백질 또는 전사 인자 (CREB)의 결합을 촉진하고, 이후 상기 인자가 cAMP 반응성 요소라고 하는 특정 위치에서 프로모터에 결합하고 유전자의 발현을 유도하게 된다. 따라서, β-갈락토시다아제 또는 루시페라제와 같은 리포터 유전자에 앞서 복수 cAMP 반응 요소를 보유하는 프로모터를 포함하는 리포터 시스템을 작제할 수 있다. 또한, 구성적으로 활성화된 Gs-연결된 수용체는 cAMP의 축적을 유도하고, 이후 유전자를 활성화시키고 리포터 단백질을 발현시킨다. β-갈락토시다아제 또는 루시페라제와 같은 리포터 단백질은 표준 생화학적 검사를 이용하여 검출할 수 있다 (참고 문헌으로 인용된 PCT 공개공보 WO 00/22131).
Go 및 Gq와 같은 다른 G 단백질은 포스포리파제 C 효소의 활성화에 연관하는데, 상기 효소는 인지질 PIP2를 가수분해하여 2가지 세포내 메신저: 디아실글리세롤 (DAG)과 이노시톨 1,4,5-삼인산염 (IP3)을 방출한다. IP3의 증가된 축적은 Gq-연합된 수용체 및 Go-연합된 수용체의 활성화와 연관한다 (PCT 공개공보 WO 00/22131). IP3 축적을 검출하는 분석을 이용하여 후보 화합물이 Gq-연합된 수용체 또는 Go-연합된 수용체에 대하여 역효능제인지를 결정할 수 있다. Gq-연합된 수용체 역시 Gq-의존성 포스포리파제 C가 AP1 요소를 포함하는 유전자를 활성화시키는 지를 측정하는 AP1 리포터 검사를 이용하여 분석할 수 있다. 따라서, 활성화된 Gq-연합된 수용체는 이와 같은 유전자의 발현 증가를 입증하는 반면, 역효능제는 이와 같은 발현에서 감소를 입증한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단백질에 결합하거나, 또는 예로써 상기 단백질의 발현 또는 활성에 촉진 또는 저해 효과를 갖는 조절물질, 다시 말하면, 후보 물질 또는 검사 화합물 (가령, 펩티드, 펩티드모방체, 소형 분자 또는 다른 약물)을 확인하는 방법 (이하 "스크리닝 방법")을 제공한다. 가령, 본 명세서에 기술된 스크리닝 검사를 이용하여 수용체에서 길항제로서 작용하고 기관지 천식을 치료하는데 유효한 화합물을 확인할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 부분의 막-결합된 형태에 결합하거나, 또는 이의 활성을 조절할 수 있는 후보 물질 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 당분야에 공지된 복합 라이브러리 방법에서 다양한 접근 방식으로 수득할 수 있는데, 여기에는 생물학적 라이브러리; 공간적으로 접근가능한 평행 고형상 또는 액상 라이브러리; 탈합성 (deconvolution)을 요하는 합성 라이브러리 방법; "1개 비드-1개 화합물" 라이브러리 방법; 친화력 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리 방법 등이 포함된다. 생물학적 라이브러리 접근 방식은 펩티드 라이브러리에 한정되는 반면, 다른 4가지 접근 방식은 화합물의 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 소형 분자 라이브러리에 적용될 수 있다 (Lam, Anticancer Drug Des (1997) 12:145).
분자 라이브러리 합성 방법은 당분야에 공지되어 있다 (DeWitt 등, Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:6909; Erb 등, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:11422; Zuckermann 등, J Med Chem (1994) 37:2678; Cho 등, Science (1993) 261:1303; Carrell 등, Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2059; Carell 등, Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2061; Gallop 등, J Med Chem (1994) 37:1233).
화합물 라이브러리는 용액 (가령, Houghten Bio/Techniques (1992) 13:412-421) 또는 비드 (Lam, Nature (1991) 354:82-84); 칩 (Fodor, Nature (1993) 364:555-556); 세균 (미국특허 5,223,409); 포자 (미국특허 5,571,698; 미국특허 5,403,484; 미국특허 5,223,409); 플라스미드 (Cull 등, Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:1865-1869); 또는 파지 (Scott 등, Science (1990) 249:386-390; Devlin, Science (1990) 249:404-406; Cwirla 등, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:6378-6382; Felici, J Mol Biol (1991) 222:301-310)에 제공될 수 있으며, 이를 참고 문헌으로 본원에 인용한다 .
본 발명의 특정 구체예에서, 검사법은 세포-기초된 검사인데, 세포 표면에서 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 막-결합된 형태를 발현하는 세포는 시험 화합물과 접촉시키고, 상기 단백질에 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정한다. 가령, 세포는 효모균 세포 또는 포유동물 기원의 세포일 수 있다. 본 발명의 단백질에 결합하는 검사 화합물의 능력은 예로써 방사성동위원소 또는 효소 표지를 보유하는 검사 화합물을 결합시킴으로써 결정할 수 있는데, 복합체내에서 표지된 화합물을 검출함으로써 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에 대한 검사 화합물의 결합을 결정할 수 있다. 가령, 검사 화합물은 125I, 35S, 14C, 3H를 직간접적으로 표지하고, 방사능 방출량의 직접 산정 또는 신틸레이션 산정으로 방사성동위원소를 검출할 수 있다. 대안으로, 검사 화합물을 예로써 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제 또는 루시페라제로 효소적으로 표지하고, 효소 표지를 적절한 기질의 생성물로의 전환을 결정함으로써 검출할 수 있다. 특정 구체예에서, 검사법은 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 막-결합된 형태를 발현하는 세포를 세포 표면에서, 상기 단백질과 결합하여 검사 혼합물을 형성하는 공지의 화합물과 접촉시키고, 이후 검사 혼합물을 검사 화합물과 접촉시키고 상기 단백질과 상호작용하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 과정을 포함하는데, 여기서 상기 단백질과 상호작용하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 과정은 공지의 화합물에 비하여 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에 선호적으로 결합하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 검사법은 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 막-결합된 형태를 발현하는 세포를 세포 표면에서 검사 화합물과 접촉시키고, 상기 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절 (가령, 촉진 또는 저해)하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는 세포-기초된 검사이다. 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절하는 검사 화합물의 능력은 예로써 상기 단백질이 표적 분자에 결합하거나 표적 분자와 상호작용하는 능력을 결정함으로써 달성될 수 있다. 본 명세서에서, "표적 분자"는 본 발명의 단백질이 천연적으로 결합하거나 상호작용하는 분자, 예를 들면 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 표면에 위치한 분자, 제 2 세포의 표면에 위치한 분자, 세포외 환경에 위치한 분자, 세포 막 또는 세포질 분자의 내부 표면과 연합하는 분자를 의미한다. 표적 분자는 본 발명의 다른 분자 또는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 한 구체예에서, 표적 분자는 세포외 신호 (가령, 본 발명의 막-결합된 단백질에 화합물의 결합으로 산출된 신호)의 세포막을 통한 세포로의 도입을 용이하게 하는 신호 전달 경로의 한 성분이다. 가령, 표적은 촉매 활성을 갖는 제2 세포 단백질 또는 하류 신호전달 분자와의 연합을 용이하게 하는 단백질일 수 있다.
표적 분자와 상호작용하는 본 발명의 단백질의 능력은 직접적인 결합을 결정하기 위한 상기한 방법 중에서 한 가지 방법으로 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 분자에 결합하거나 표적 분자와 상호작용하는 본 발명의 단백질의 능력은 표적 분자의 활성을 결정함으로써 결정할 수 있다. 가령, 표적 분자의 활성은 표적의 세포 제2 메신저 (가령, 세포내 Ca2 + , 디아실글리세롤, IP3 등)의 유도를 검출하거나, 적절한 기질에서 표적의 촉매/효소 활성을 검출하거나, 리포터 유전자 (가령, 루시페라제와 같은 검출가능 마커를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 반응성 조절 요소)의 유도를 검출하거나, 또는 세포 분화, 증식 또는 기능과 같은 세포 반응을 검출함으로써 결정될 수 있다. 특정 구체예는 하기 "실시예 4"에서 기술하는데, 여기서 본 발명의 수용체는 Gα16에 결합되어 칼슘 반응을 유도한다.
본 발명에는 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 검사 화합물과 접촉시키고, 상기 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분과 결합하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는 무-세포 검사법이 포함된다. 상기 단백질에 대한 검사 화합물의 결합은 상기한 바와 같이 직간접적으로 결정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 검사법은 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 상기 단백질에 결합하여 검사 혼합물을 형성하는 공지된 화합물과 접촉시키고, 상기 단백질과 상호작용하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, 본 발명의 단백질과 상호작용하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 과정은 공지 화합물에 비하여 상기 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에 우선적으로 결합하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 무-세포 검사법은 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 검사 화합물과 접촉시키고, 상기 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절 (가령, 촉진 또는 저해)하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 단백질의 활성을 조절하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 과정은 직접 결합을 결정하기 위한 상기한 방법 중에서 한 가지 방법으로 표적 분자에 결합하는 상기 단백질의 능력을 결정함으로써 달성될 수 있다. 대안적 구체예에서, 상기 단백질의 활성을 조절하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 과정은 표적 분자를 더욱 조절하는 상기 단백질의 능력을 결정함으로써 달성될 수 있다. 가령, 적절한 기질에서 표적 분자의 촉매/효소 활성은 전술한 바와 같이 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 무-세포 검사법은 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 상기 단백질과 결합하여 검사 혼합물을 형성하는 공지된 화합물과 접촉시키고, 검사 혼합물과 검사 혼합물을 접촉시키고, 상기 단백질과 상호작용하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 단백질과 상호작용하는 검사 화합물의 능력을 결정하는 과정은 표적 분자에 우선적으로 결합하거나 표적 분자의 활성을 조절하는 상기 단백질의 능력을 결정하는 단계를 포함한다.
수용체는 리간드 결합을 반드시 저해하지는 않지만 수용체내에 구조적 변화를 유도하여 G 단백질 결합, 또는 활성화를 유도할 수 있는 수용체 응집, 이량체화 또는 군집화를 가능하게 하는 비-리간드 분자에 의해 활성화될 수 있다. 가령, 세포 표면에서 노출된 본 발명의 수용체의 다양한 부분에 대한 항체가 생성될 수 있다. 이들 항체는 표준 검사, 예를 들면, cAMP 수준 또는 세포내 Ca+2 수준의 모니터에 의한 결정에서, G 단백질 연속 반응을 통하여 세포를 활성화시킨다. 분자 맵핑 (mapping), 특히, 에피토프 맵핑이 수반되기 때문에, 모노클로날 항체가 선호된다. 모노클로날 항체는 세포 표면에서 발현된 고유 수용체 및 세포 표면에서 형성되는 것으로 공지된 펩티드 모두에 대하여 만들 수 있다. 문헌[Geysen 등, U.S. Patent No. 5,998,577[의 방법을 실시하여 다수의 관련 펩티드를 수득할 수 있다.
본 발명의 수용체를 활성화시키는 것으로 밝혀진 항체를 변형시켜, 상보적 고정 (complement fixatioin)과 같은 수용체 활성화에 이질적인 활성을 최소화시킬 수 있다. 따라서, 항체 분자는 수용체 활성화이외의 활성을 최소화하거나 제거하기 위하여 절단되거나 돌연변이될 수 있다. 가령, 특정 항체 경우에, 항원-결합 부분만 필요하다. 따라서, 항체의 Fc 부분을 제거할 수 있다.
본 발명의 수용체를 발현하는 세포를 항체에 노출시켜 상기 수용체를 활성화시킬 수 있다. 이후, 활성화된 세포를 다양한 분자에 노출시켜, 어떤 분자가 수용체 활성을 조절하는지를 확인하고 더욱 높거나 더욱 낮은 활성화 수준을 유도할 수 있다. 그 다음, 이들 목적을 달성하는 분자는 비-활성화된 세포에 대한 효과를 관찰하기 위하여, 항체없이 본 발명의 수용체를 발현하는 세포에서 검사할 수 있다. 이후, 표적 분자는 공지된 기술을 이용하여 변화된 대사와 연관된 질환의 치료를 위한 후보 물질로서 검사하고 변형할 수 있다.
본 발명의 무-세포 검사법은 본 발명의 단백질의 가용성 형태 및 막-결합된 형태에 모두 이용할 수 있다. 막-결합된 형태를 포함하는 무-세포 검사물의 경우에, 막-결합된 형태가 용액에서 유지되도록 용해제 (solubilizing agent)를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 용해제의 예에는 n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥탄오일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, THESIT, 이소트리데실폴리 (에틸렌 글리콜 에테르)n, 3-[(3-클로아미도프로필)디메틸아미노]-1-프로판 설포네이트 (CHAPS), 3-[ (3-클로아미도프로필)디메틸아미노]-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트 (CHAPSO) 또는 N-도데실-N,N-디메틸-3-아미노-1-프로판 설포네이트와 같은 비-이온성 계면활성제가 포함된다.
본 발명의 상기 검사법의 한 가지 이상의 구체예에서, 본 발명의 단백질 또는 이의 표적 분자를 고정시켜, 하나의 단백질 또는 둘 모두의 단백질의 복합된 형태를 복합되지 않은 형태로부터 분리하고 자동화된 검사를 수행할 수 있다. 후보 검사 화합물 존부하에 본 발명의 단백질에 검사 화합물의 결합 또는 상기 단백질과 표적 분자의 상호작용은 반응물을 수용하기에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이들 용기의 예에는 미량역가(microtitre) 평판, 시험관, 마이크로 원심분리 튜브 등이 포함된다. 한 구체예에서, 하나의 단백질 또는 둘 모두의 단백질이 매트릭스에 결합하도록 허용하는 도메인이 추가된 융합 단백질을 제공할 수 있다. 가령, 글루타티온-S-트란스퍼라제/본 발명의 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트란스퍼라제/표적 융합 단백질을 글루타티온 세파로스 비드 (Sigma Chemical, St. Louis, MO)상에 흡착시킬 수 있다. 대안으로, 글루타티온-유도된 미량역가 평판을 검사 화합물과 결합시킨다. 이후, 비-흡착된 표적 단백질 또는 본 발명의 단백질 및 상기 혼합물은 복합체 형성을 유도하는 조건 (가령, 염과 pH에 대하여 생리학적 조건에서)에서 배양한다. 배양이후, 비드 또는 미량역가 평판 웰을 세척하여 결합되지 않은 임의의 성분을 제거하고, 직간접적으로 복합체 형성의 존재를 측정한다. 대안으로, 복합체를 매트릭스로부터 분리하고, 표준 기술을 이용하여 결합 또는 활성 수준을 결정할 수 있다.
단백질을 매트릭스에 고정시키는 다른 기술 역시 본 발명의 스크리닝 검사에 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 단백질 또는 이의 표적 분자는 바이오틴과 스트렙타비딘의 접합을 이용하여 고정시킬 수 있다. 본 발명의 바이오티닐화된 단백질 또는 표적 분자는 당분야에 공지된 기술 (가령, 바이오티닐화 키드, Pierce Chemicals, Rockford, IL)을 이용하여 바이오틴-NHS (N-하이드록시-숙시니미드)로부터 준비하고, 스트렙타아비딘-피복된 96-웰 평판 (Pierce Chemicals)에 고정시킬 수 있다. 대안으로, 본 발명의 단백질 또는 표적 분자와 반응하지만 본 발명의 단백질과 표적 분자의 결합을 간섭하지 않는 항체를 평판의 웰에 유도할 수 있다. 배양이후, 결합되지 않은 표적 또는 본 발명의 단백질은 항체 접합에 의해 웰에 포획될 수 있다. GST-고정된 복합체에 대한 상기한 것들에 추가하여, 이와 같은 복합체를 검출하는 방법에는 본 발명의 단백질 또는 표적 분자와 반응하는 항체를 이용한 복합체의 면역검출, 본 발명의 단백질 또는 표적 분자와 연관된 효소 활성을 검출하는 효소-연결된 검사법 등이 포함된다.
다른 구체예에서, 단백질 발현의 조절물질은 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, 세포에서 본 발명의 mRNA 또는 단백질이 발현되는지를 결정하는 방법으로 확인할 수 있다. 후보 화합물의 존재하에 mRNA 또는 단백질의 발현 수준은 후보 화합물이 없는 상태에서 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교한다. 이후, 상기 비교에 기초하여, 후보 화합물은 발현 조절물질로서 확인될 수 있다. 가령, 후보 화합물이 없을 때보다 후보 화합물이 존재할 때, mRNA 또는 단백질의 발현이 큰 (통계학적으로 더욱 유의한) 경우, 후보 화합물은 mRNA 또는 단백질 발현의 촉진물질 또는 효능제로서 확인된다. 대안으로, 후보 화합물이 없을 때보다 후보 화합물이 존재할 때, mRNA 또는 단백질의 발현이 작은 (통계상으로 덜 유의한) 경우, 후보 화합물은 mRNA 또는 단백질 발현의 저해물질 또는 길항제로서 확인된다. 활성이 리간드 또는 효능제의 존재하에 감소하거나, 또는 구성적 발현 세포에서 기저 수준 이하인 경우에, 후보 화합물은 역효능제로서 확인된다. 세포에서 mRNA 또는 단백질 발현의 수준은 mRNA 또는 단백질을 검출하기 위한 상기한 방법으로 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질에 결합하거나 상기 단백질과 상호작용하고 본 발명의 단백질의 활성을 조절하는 다른 단백질을 확인하기 위한 이중-하이브리드 검사 또는 삼중-하이브리드 검사에서, "미끼(biat) 단백질"로서 이용될 수 있다 (미국특허 5,283,317; Zervos 등, Cell (1993) 72:223-232; Madura 등, J Biol Chem (1993) 268:12046-12054; Bartel 등, Bio/Techniques (1993) 14:920-924; Iwabuchi 등, Oncogene (1993) 8:1693-1696; PCT 공개공보 WO 94/10300). 이와 같은 결합 단백질은 신호전달 경로의 상류 또는 하류 요소 등의 본 발명의 단백질에 의한 신호 전달에도 관여하는 것으로 생각된다.
본 발명은 본 발명의 순수한 단백질의 대량 생산이 가능하기 때문에, 가능 기능 부위의 형태에 대한 물리적인 특성화로 이상적인 약물 설계를 확인할 수 있다. 가령, 세포내와 세포외 도메인이 특히 주목되는 영역이다. 영역의 모양 및 이온 배열이 확인되면, 이들 영역과 상호작용하는 후보 약물을 형성하고, 고유 세포, 동물, 환자에서 검사할 수 있다. 이와 같은 3-D 구조 정보를 이끌어낼 수 있는 방법은 X-선 결정법, NMR 분광법, 분자 모델링 등이다. 이런 3-D 구조로 상기 부위에서 상호작용하는 공지된 약물이 존재하는 다른 공지된 단백질에서 유사한 형태 부위를 확인할 수 있다. 이들 약물 또는 이들의 유도체는 본 발명의 단백질 함께 이용될 수 있다.
상기 스크리닝 검사는 기관지 천식, COPD, 알레르기 비염, 알레르기 피부염, 알레르기 결막염, 전신 비만세포증, 허혈성 재관류 손상을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 질병의 치료를 위한 화합물들을 확인하는 수단을 제공하는 본 발명의 수용체의 효능제, 부분 효능제, 길항제, 역효능제 또는 조절 물질로서 작용하는 화합물들을 확인하는데 특별히 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기한 스크리닝 검사에 의해 확인된 신규 물질 및 본 명세서에 기술된 질환에서 이들의 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명의 DNA 서열의 일부 또는 단편은 폴리뉴클레오티드 시약으로서 다양한 방식으로 이용할 수 있다. 가령, 상기 서열은 (i) 염색체상에 각 유전자를 맵핑하고, 따라서 유전자 질환과 연관된 유전자 영역을 찾고; (ii) 미소한 생물학적 시료 (조직 유형결정)로부터 개별 샘플을 확인하고; (iii) 생물학적 시료의 법의학적 확인을 보조하는데 이용될 수 있다. 적용 부분은 하기에서 기술한다.
2. 염색체 맵핑
일단 유전자 서열 (또는 서열의 일부)이 분리되면, 상기 서열을 이용하여 염색체에서 본 발명의 유전자 위치를 맵핑할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 핵산 분자 또는 이의 단편을 이용하여 게놈에서 상기 위치를 맵핑할 수 있다. 게놈, 특히, 인간 게놈에서 상기 서열의 위치 맵핑은 질병과 연관된 유전자와 상기 서열을 상관시키는데 중요한 첫 번째 단계이다.
간략하게 설명하면, 유전자는 서열번호 1에 열거된 서열로부터 PCR 프라이머 (바람직하게는 15-25bp 길이)를 준비함으로써 게놈에서 맵핑될 수 있다. 프라이머는 개별 인간 염색체를 포함하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 이용된다. 본 발명의 서열에 상응하는 인간 유전자를 포함하는 하이브리드만 증폭된 단편을 산출한다.
체세포 하이브리드는 상이한 포유동물 (가령, 인간 세포와 마우스 세포)로부터 유래된 체세포를 융합함으로써 준비한다. 인간 세포와 마우스 세포의 하이브리드가 성장하고 분화됨에 따라, 인간 염색체는 무작위 순서로 손실되지만 마우스 염색체는 유지된다. 마우스 세포는 성장할 수 없지만 (특정 효소의 부재로 인하여) 인간 세포는 성장할 수 있는 배지를 이용함으로써, 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 인간 염색체는 유지되게 된다. 다양한 배지를 이용함으로써, 하이브리드 세포주 패널을 확립한다. 패널에서 각 세포주는 단일 인간 염색체 또는 소수의 인간 염색체 및 완전한 일단의 마우스 염색체를 보유하기 때문에, 특정 인간 염색체에서 개별 유전자의 용이한 맵핑이 가능하다 (D'Eustachio 등, Science (1983) 220:919-924). 전좌 (translocation)와 결실을 보유하는 인간 염색체를 이용함으로써 인간 염색체의 단편만을 포함하는 체세포 하이브리드를 만들 수도 있다.
체세포 하이브리드의 PCR 맵핑은 특정 서열을 특정 염색체에 지정하는 신속한 절차이다. 단일 열 순환기 (thermocycler)를 이용하여 일일 3개 이상의 서열이 지정될 수 있다.
게놈에서 특정 염색체에 서열을 맵핑하는데 유사하게 이용될 수 있는 다른 맵핑 전략에는 원위치(in situ) 하이브리드화 (Fan 등, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:6223-27), 표지된 유동-선별된 염색체를 이용한 사전-스크리닝 (pre-screening), 염색체 특이적 cDNA 라이브러리에 하이브리드화 반응에 의한 사전-선별 등이 포함된다.
또한, 유사분열중기 염색체 스프레드에 DNA 서열의 형광 원위치 하이브리드화 반응 (FISH)을 이용하여 단일 단계에서 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 유사분열 방추사를 파괴하는 화학물질, 예를 들면, 콜세미드 (colcemid)에 의해 분열이 중기에서 차단된 세포를 이용하여, 염색체 스프레드를 만들 수 있다. 염색체는 트립신으로 짧게 처리한 후에 Giemsa로 염색한다. 각 염색체에서 명암 띠 패턴이 나타나기 때문에, 염색체를 개별적으로 확인할 수 있다. FISH 기술은 길이가 500 또는 600bp로 짧은 DNA 서열에 이용할 수 있다. 하지만, 1,000bp 이상의 클론은 간단한 검출을 위한 충분한 신호 강도로 독특한 염색체 위치에 결합할 가능성이 더욱 높다. 적절하게는, 1,000개 염기, 더욱 바람직하게는 2,000개 염기 정도면 합리적인 시간 내에 좋은 결과를 얻을 수 있다. 이와 같은 기술에 관하여 Verma 등, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988을 참조한다. 염색체 맵핑은 in silico에서, 로드 스코어 (lod score) 또는 단순 근접성 (mere proximity)과 같은 통계학적 변수를 이용하여 추론할 수 있다.
염색체 맵핑을 위한 시약은 염색체에서 단일 부위를 찾기 위하여 개별적으로 이용될 수 있다. 또한, 시약 패널은 복수 부위 및/또는 복수 염색체를 표시하는데 이용될 수 있다. 유전자의 인접 영역에 상응하는 시약이 실제로 맵핑에 선호된다. 암호화 서열은 유전자 군내에서 보존될 가능성이 더욱 높고, 따라서 염색체 맵핑 동안 교차 하이브리드화 반응의 기회가 증가한다.
일단 서열이 정확한 염색체 위치에 맵핑되면, 염색체에서 서열의 물리적인 위치는 유전자 지도 데이터와 상관시킬 수 있다 (이들 데이터는 예로써 McKusick, Mendelian Inheritance in Man, Johns Hopkins University, Welc Medical Library를 참조한다). 이후, 동일한 염색체 영역에 맵핑된 유전자와 질병의 상관관계는 Egeland 등, Nature (1987) 325:783-787에 기술된 연관 분석 (linkage analysis)을 통하여 확인할 수 있다 (물리적으로 인접한 유전자의 공통-유전).
또한, 본 발명의 단백질과 연관된 질병을 앓는 개체와 질병이 없는 개체 간에 DNA 서열의 차이를 결정할 수 있다. 돌연변이가 질병을 앓는 개체의 일부 또는 전체에서 관찰되지만 질병이 없는 개체에서는 관찰되지 않는다면, 상기 돌연변이는 특정 질환의 원인 인자일 가능성이 높다. 질병을 앓는 개체와 질병이 없는 개체의 비교는 일반적으로, 염색체 스프레드에서 명백하거나 DNA 서열에 기초한 PCR을 이용 하여 검출될 수 있는 결실 또는 전좌와 같은 염색체상의 구조적 변화를 먼저 확인하는 단계를 수반한다. 궁극적으로, 여러 개체로부터 얻은 유전자의 완전한 서열분석을 수행하여 돌연변이의 존재를 확증하고, 돌연변이와 다형성을 구별할 수 있다.
3. 진단학적 분석
생물학적 시료내에 본 발명의 핵산 또는 단백질의 유무를 검출하는 전형적인 방법은 검사 개체로부터 생물학적 시료를 얻고, 상기 단백질 또는 핵산 (가령, mRNA 또는 게놈 DNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 물질과 생물학적 시료를 접촉시켜 생물학적 시료내에 이런 존재를 검출하는 단계를 수반한다. mRNA 또는 게놈 DNA 검출하기 위한 적절한 물질은 본 발명의 mRNA 또는 게놈 DNA에 하이브리드화될 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 핵산 프로브는 예로써 전장 핵산, 예를 들면, 서열번호 1의 핵산, 또는 이의 일부분, 예를 들면, 엄격한 조건하에서 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성될 만큼 충분한 적어도 15, 30, 50, 100, 250, 500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 진단 검사에 이용될 수 있는 다른 적절한 프로브는 본 명세서에서 기술한다.
본 발명의 단백질을 검출하기 위한 특정 시약은 단백질에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는, 검출가능 표지를 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 또는 더욱 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 고유 항체 또는 이의 단편 (가령, Fab 또는 F(ab')2)을 이용할 수 있다. "생물학적 시료"는 개체로부터 분리될 수 있는 조직, 세포, 생물학적 유체 및 개체내에서 조직, 세포, 유체를 포괄한다. 다시 말하면, 본 발명의 검출 방법을 이용하여, 시험관내 및 생체내에서 생물학적 시료내에 mRNA, 단백질, 게놈 DNA를 검출할 수 있다. 가령, mRNA 검출을 위한 시험관내 기술에는 노던 (Northern) 하이브리드화 반응 및 원위치 하이브리드화 반응이 포함된다. 단백질 검출을 위한 시험관내 기술에는 ELISA, 웨스턴 블랏, 면역 침전, 면역형광법 등이 포함된다. 게놈 DNA 검출을 위한 시험관내 기술에는 서던 (southern) 하이브리드화 반응이 포함된다. 또한, 단백질 검출을 위한 생체내 기술은 본 발명의 단백질에 대한 표지된 항체를 개체에 도입하는 단계를 포함한다. 가령, 항체는 개체에서 존재와 위치가 표준 영상 기술로 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
한 구체예에서, 생물학적 시료는 검사 개체로부터 얻은 단백질 분자를 포함한다. 대안으로, 생물학적 시료는 검사 개체에서 얻은 mRNA 분자 또는 검사 개체로부터 얻은 게놈 DNA 분자가 포함할 수 있다. 통상의 방법으로 개체로부터 분리된 호중구 백혈구 세포가 본 발명에 이용하기 적합한 시료이다.
이런 이유로, 질병과의 연관 및 보균자 또는 병든 환자에 특징적인 핵산 또는 단백질 다형성의 확인은 예방 또는 진단 검사법을 개발하는데 유익할 수 있다. 가령, 류머티스 관절염, 천식, 크론병 등에 대한 예방 또는 진단 검사법을 개발하는 것에 유익하다. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 발현은 활성화된 상태 또는 염증 상태와 연관된 세포에서 상승한다. 염증과 연관된 질병에는 아나필락시스 상태, 결장염, 크론병, 부종 상태, 접촉 과민증, 알레르기, 다른 형태의 관절염, 수막염 및 종기 등을 유발하는 임의의 부위에서 혈관 투석, 열, 세포 수집, 유체에 의한 손상에 면역계가 반응하는 다른 질환이 포함된다. 따라서, 대사 장애는 류머티스 관절염에 특징적일 수 있다. 또한, 류머티스 관절염의 분자 기전이 검출될 수 있는데, 예로써 혈액 시료와 같은 조직 시료에서 검출될 수 있는 진단 SNP, RFLP, 발현 수준의 변이성, 기능의 변이성 등이 존재한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한, 대조 개체에서 생물학적 시료를 얻고, 본 발명의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있는 화합물 또는 시약과 대조 시료를 접촉시켜 생물학적 시료에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재와 양을 검출하고, 대조 시료에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재와 양 및 검사 시료에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재와 양을 비교하는 단계를 수반한다.
4. 화학적 라이브러리의 고처리량 분석
본 발명의 핵산 또는 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물에 대한 임의의 겁사법을 고처리량 스크리닝에 이용될 수 있다. 고처리량 스크리닝 시스템은 시판되는 것을 구입 할 수 있다 (참조: Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, etc.). 이들 시스템은 전형적으로, 모든 샘플과 시약 피펫팅, 액체 분배, 일정 시간 배양, 분석에 적합한 검출기 (들)에서 마이크로평판의 최종 판독 등을 포함하는 전체 공정을 자동화한다. 이와 같은 구성 시스템은 고처리량, 신속한 개시, 고도의 유연성과 맞춤화를 제공한다. 이와 같은 시스템의 제조업자는 다양한 고처리량 프로토콜의 상세한 프로토콜을 제공한다. 따라서, 예로써 Zymark Corp에서는 유전자 전사, 리간드 결합 등의 조절을 검출하는 스크리닝 시스템을 설명하는 기술 보고서를 제공한다.
5. 키트
본 발명에는 또한, 생물학적 시료 (검사 시료)에서 본 발명의 핵산 또는 단백질의 존재를 검출하는 키트가 포함된다. 이와 같은 키트를 이용하여 개체가 비정상적 발현과 연관된 질환 (가령, 면역 질환)을 앓고 있거나, 또는 상기 질환이 발병할 위험이 높은 지를 결정할 수 있다. 가령, 키트는 생물학적 시료에서 본 발명의 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 물질 및 시료에서 핵산 또는 단백질의 양을 결정하는 수단 (가령, 항체 또는 올리고뉴클레오티드 프로브)을 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 단백질 또는 mRNA의 양이 정상 수준보다 높거나 낮은 경우에, 검사된 개체가 상기 핵산 또는 단백질의 비정상적인 발현과 연관된 질환을 앓고 있거나, 또는 상기 질환이 발병할 위험이 높은 지를 지시하는 결과를 산출하는 데에도 이용될 수 있다.
항체-기초한 키트에서, 키트는 (1) 본 발명의 단백질에 결합하는 제 1 항체 (가령, 고형상에 부착된); 선택적으로 (2) 본 발명의 단백질 또는 제 1 항체에 결합하고 검출가능 물질에 접합된 상이한 제 2 항체를 포함할 수 있다. 제 2 항체가 존재하지 않는 경우에, 제 1 항체가 검출가능하게 표지되거나, 또는 대안으로 제 1 항체에 결합하는 다른 분자가 검출가능하게 표지될 수 있다. 어떤 경우든, 표지된 결합 부분은 당분야에 공지된 바와 같이, 검출가능 리포터 분자로서 포함된다.
올리고뉴클레오티드-기초한 키트에서, 본 발명의 키트는 예로써 (1) 본 발명의 핵산 서열에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 검출가능-표지된 올리고뉴클레오티드 또는 (2) 본 발명의 핵산 분자를 증폭하는데 유용한 한 쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.
키트는 또한, 완충제, 보존제 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 검출가능 물질 (가령, 효소 또는 기질)을 검출하는데 필요한 성분을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 분석되고 검사 시료와 비교되는 대조 시료 또는 일련의 대조 시료를 포함할 수도 있다. 키트의 각 성분은 통상적으로, 개별 용기에 넣어지고, 모든 다양한 용기들은 단일 포장된다. 사용설명서 및 배경 정보 역시 동봉될 수 있다.
6. 임상 시험중 효과의 모니터
본 발명의 핵산 또는 단백질의 발현 또는 활성 (가령, 비정상적인 세포 증식, 분화 및/또는 기능을 조절하는 능력)에 대한 약물 (가령, 약물 또는 화합물)의 영향을 모니터하는 과정은 기본적인 약물 스크리닝뿐만 아니라 임상 시험에도 적용될 수 있다. 가령, 본 명세서에 기술된 바와 같은 스크리닝 검사에 의한 측정에서, 유전자 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 증가시키는 약물의 효능은 감소된 유전자 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 보이는 개체의 임상 시험동안 모니터될 수 있다. 대안으로, 스크리닝 검사에 의한 측정에서, 유전자 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 감소시키는 약물의 효능은 증가된 유전자 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 보이는 개체의 임상 시험동안 모니터될 수 있다. 이와 같은 임상 시험에서, 발현 또는 활성, 바람직하게는 예로써 세포 증식 질환에 관련된 다른 유전자의 발현 또는 활성은 특정 세포의 면역 반응성의 마커로서 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 핵산 또는 단백질 (가령, 본 명세서에 기술된 스크리닝 검사에 의해 확인된)의 활성을 조절하는 약물 (가령, 화합물, 약물 또는 소형 분자)로 처리에 의해 세포에서 조절되는 본 발명의 유전자를 비롯한 유전자가 확인될 수 있다. 따라서, 예로써 임상 시험동안 세포 증식 질환에 대한 약물의 효과를 조사하기 위하여, 세포를 분리하고 RNA를 준비하고 본 발명의 핵산 및 상기 질환에 관여하는 다른 유전자의 발현 수준을 분석할 수 있다. 유전자 발현의 수준 (즉, 유전자 발현 패턴)은 본 명세서에 기술된 바와 같이 노던 블랏 분석 또는 RT-PCR에 의해, 또는 대안으로 본 명세서에 기술된 방법중 한 가지 방법으로 생산된 단백질의 양을 측정하거나 본 발명의 유전자 또는 다른 유전자의 활성 수준을 측정함으로써 정량할 수 있다. 이런 방식으로, 유전자 발현 패턴은 약물에 대한 세포의 생리 반응을 지시하는 마커로서 기능할 수 있다. 따라서, 반응 상태는 상기 약물로 개체의 치료이전 및 치료동안 다양한 시점에서 결정될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 약물 (가령, 효능제, 길항제, 펩티드모방체, 단백질, 펩티드, 핵산, 소형 분자 또는 본 명세서에 기술된 스크리닝 검사에 의해 확인된 다른 약물 후보)을 이용한 개체 치료의 효능을 모니터하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 (i) 약물의 투여에 앞서 개체로부터 투여전 시료를 획득하고; (ii) 투여전 시료에서 본 발명의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 수준을 검출하고; (iii) 개체로부터 하나 이상의 투여후 시료를 획득하고; (iv) 투여후 시료에서 본 발명의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 검출하고; (v) 투여전 시료에서 본 발명의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준 및 투여후 시료에서 본 발명의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 비교하고; (vi) 이에 따라서, 개체에 대한 약물 투여를 변화시키는 단계를 포함한다. 가령, 본 발명의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 검출된 수준보다 높은 수준으로 증가시키기 위하여, 다시 말하면, 약물의 효능을 증가시키기 위하여, 약물의 증가된 투여가 바람직하다. 대안으로, 본 발명의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 검출된 수준보다 낮은 수준으로 감소시키기 위하여, 다시 말하면, 약물의 효능을 감소시키기 위하여, 약물의 감소된 투여가 바람직하다.
본 발명을 아래의 실시예에서 더욱 상세하게 기술한다.
실시예 1
기니 피그 DP 수용체의 최초 엑손 DNA 단편의 클로닝
기니 피그 (Cavia porcellus) DP 수용체 cDNA의 클로닝은 PCR을 이용하여 게놈 DNA로부터 DP 수용체의 엑손 단편을 클로닝함으로써 시작하였다. 프로그램 Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor MI)를 이용하여 정렬된 인간 (U31332), 마우스 (NM_008962), 래트 (NM_022241) DP 수용체 서열의 보존된 영역을 이용하여 한 무리의 PCR프라이머를 설계하였다. 기니 피그 (Cavia porcellus) 게놈 DNA는 CeMines (Evergreen, Co.)로부터 구입하였다. 기니 피그 (Cavia porcellus) 게놈 DNA의 420 bp 단편을 증폭하는데 이용된 프라이머는 프라이머 675_Topo_F3 (서열번호 3: GGGACACCCTTTCTTCTACAA)과 675_Topo_R2 (서열번호 4: GAACACATGGTGAAGAGCACTG)로 수행하였다. PCR 생성물은 TOPO-TA 클로닝 (Invitrogen, Carlsbad CA)을 이용하여 클로닝하고, 삽입체는 제조업자의 지시에 따라 ABI 3100 DNA 서열분석기에서 염기서열 분석하였다.
3'와 5' RACE- PCR 클로닝
생성된 DNA 서열은 인간, 마우스, 래트 DP 서열에 정렬하였다. 이와 같은 정렬에서, PCR 생성물 서열은 검사된 종으로부터 얻은 DP 수용체 컨센스와 상동하긴 하지만 동일하지는 않는 것으로 밝혀졌다 (도 3). 기니 피그 (Cavia porcellus) DP 수용체 컨센스는 DNA 말단의 신속 증폭 (RACE) 방법을 이용하여 클로닝된 서열을 신장하기 위한 추가의 프라이머를 설계하는데 이용되었다. DP 수용체 전사체의 3' 말단을 획득하기 위하여, Clontech (BD Biosciences의 자회사, Palo Alto CA)로부 터 구입한 SMART RACE 시스템을 이용하였다. 프라이머 675_GP_3'RACE_F (서열번호 5: GTGCTCGTGGCGCCGGTGTG)는 Cavia DP 수용체 mRNA 서열을 신장하기 위한 cDNA 주형으로 전환된 Cavia 폐 mRNA와 함께 이용하였다. RACE 생성물은 PCR4-Topo (Invitrogen, Carlsbad CA)에 클로닝하고, 염기서열 분석하고, 상기한 바와 같이 정렬하여 DP 수용체의 암호화 서열의 완전 3' 신장을 노출시켰다. Cavia DP 수용체 cDNA의 5' 말단을 분리하기 위하여, 프라이머 675_Rev_P2 (서열번호 6: CACATGGTGAAGAGCACGGTCATGA)로 SMART RACE를 수행하고 1 kb PCR 생성물을 산출하였다. 정제된 PCR 생성물은 프라이머 675_RACE_R9 (서열번호 7: TCACCAGGCACTTGCCTAGCAGGTCTGT)를 이용한 5' Nested RACE를 위한 주형으로 이용하였다. RACE 생성물은 PCR4-Topo (Invitrogen)에 클로닝하고, 염기서열 분석하고 상기한 바와 같이 정렬하여 DP 수용체의 암호화 서열의 완전 5' 신장부를 노출시켰다.
기니 피그 DR 수용체를 암호화하는 cDNA의 작제
DP 수용체의 암호화 서열은 프로그램 Gene Construction Kit (Textco , Keene NH)를 이용하여 확인하였다. 암호화 서열에 인접하도록 Gateway 클로닝 적합성 프라이머를 설계하고 (GW675, 정방향 프라이머 서열번호 8: AAAAGCAGGCTTAGGAATGTCCTTCTATCCCTGCAACAC; GW675, 역방향 프라이머 서열번호 9 AAGAAAGCTGGGTCTCACAGACTGGATTCCACGTTAG), 기니 피그 (Cavia porcellus) 난알부민-자극된 폐상피 세포 (lungepithelial cell)로부터 산출된 cDNA로 PCR 반응에 이용 하였다. PCR은 10 단위의 PFU Turbo (Stratagene, La Jolla CA) 열안정성 중합효소 및 100 ng의 주형 cDNA를 이용하여 수행하였다. 1.1 kb DNA 단편을 산출하고 QiaQuick 프로토콜 (Qiagen)에 의한 겔 전기영동 크로마토그래피로 정제하고, Gateway BP 리콤비나아제 클로닝 방법 (Invitrogen)을 이용하여 pDONR201 벡터에 클로닝하였다. 클로닝 반응물은 대장균 (E. coli) DH5-알파에 형질전환시키고, 생성된 콜로니로부터 mini-prep DNA는 DNA 염기서열 분석하여 완전 DP 수용체 암호화 서열의 클로닝을 확인하였다.
실시예 2
노던 블랏 분석 (Northern Blot Analysis)
노던 블랏 분석은 Cavia DP 수용체의 최초 게놈 DNA 단편으로 수행하였다 (도 5). 폐는 난알부민으로 공격되거나, 또는 난알부민 처리를 받지 않은 수컷 Hartley 기니 피그로부터 분리하였다. 공격받지 않은 기니 피그 (Cavia porcellus) (레인 2)로부터 전체 폐상피 RNA 발현은 난알부민 공격된 기니 피그 (Cavia porcellus) (레인 3)로부터 전체 폐상피 RNA 발현과 비교하였다. 적하된 RNA는 18S RNA 띠의 분광법과 강도에 의한 측정에서, 동등하였다. DP 수용체에 대한 노던 블랏팅에서, 마우스와 인간 DP에서 보고된 전사체에서와 일치하는 크기인 3-4 kb mRNA가 기니 피그 폐에서 확인되었다 (Hirata 등, 1994; Boie 등, 1995). 상기 mRNA는 감작되고 난알부민으로 공격된 기니 피그의 폐에서 현저하게 상향조절되었는데, 이런 결과는 항원 공격시에 마우스 폐에서 상향조절되는 DP 수용체에 대하여 기존에 보고된 결과와 일치한다 (Matsuoka 등, 2000). 이들 데이터는 기니 피그 폐에서 천식 반응에서 DP의 중요성을 뒷받침한다.
실시예 3
상동분자종 ( orthologue ) DP 수용체에 대한 기니 피그의 서열 분석
기니 피그 DP 수용체에 대한 뉴클레오티드 서열 (도 1)과 추정된 아미노산 서열 (도 2)를 도시한다. 기니 피그 DP cDNA는 345개의 아미노산 단백질을 암호화하고 38,250의 계산된 분자량을 보유하는 1,032 bp 개방 해독틀을 포함한다.
기니 피그 DP 단백질은 2개의 잠재적 N-글리코실화 부위, 아미노 말단에서 Asn-7 및 제1의 세포외 루프에서 Asn-86을 보유한다. 2개의 잠재적 단백질 키나아제 C 인산화 부위, 각각 제1의 세포질 루프와 제3의 세포질 루프에 위치한 Ser-46과 Thr-140 역시 존재한다.
인간, 래트, 마우스 DP의 상응하는 서열과 비교되는 기니 피그 DP 수용체의 뉴클레오티드 서열은 도 1에 도시한다. 단백질 수준에서 유사하게, 기니 피그 DP 수용체에 대한 서열 동일성은 인간 DP에 대하여 66%, 마우스 DP에 대하여 63%, 래트 DP에 대하여 65%이었다 (도 2).
친수도 분석 (hydropathy analysis)으로, 마우스, 래트, 인간 DP의 서열에서 기존에 정의된 보존된 부분에 동일하게 맵핑된 7개의 추정 막관통 도메인의 존재를 확증하였다. 서열 보존은 DP 상동분자종 사이의 막관통 도메인에서 최대이었다. 프로스타노이드 계열의 GPCR 사이에 특징적으로 보존된 것으로 기존에 보고되었던 2 개의 서열 스트레치 (Hirata 등, 1994) 역시 기니 피그 DP 단백질에 존재하였다: 제 2 세포외 루프에서 QYCPGTWCR 및 제 7 막관통 도메인에서 RFLSVISIVDPWIFI는 모든 DP 상동분자종 사이에서 동일하였다.
TMD VI와 VII 사이의 세포외 루프 역시 종간 차이를 보였다. 상기 루프는 상동분자종 사이에 상이하였고 인간, 래트, 마우스, 기니 피그 DP에서 각각 24, 21, 21, 18개의 아미노산 길이를 보유하였다. 특히, 인간 DP 수용체와 비교하여 기니 피그 DP에서 TMD VI와 VII 사이에 6개 아미노산이 손실된다. 게다가, 마우스와 래트 DP 수용체 모두에서 상기 영역에 3개의 아미노산이 또한 제거된다. Kobayashi 등 (2000)은 DP의 리간드 결합 특이성을 제공하는 영역을 정의하는 일련의 키메라 IP-DP 수용체를 산출하였다. 흥미롭게도, PGD2의 선택적이고 강력한 결합에서 중요한 것으로 결론된 영역 중에서 한 영역은 막관통 VI-VII 영역인데, 상기 영역은 새로 클로닝된 기니 피그 DP 수용체에서 6개 아미노산이 짧아진 것으로 밝혀진 영역과 정확하게 일치한다. 리간드 친화성 또는 화합물 효능에서 상동분자종 차이는 TMD VI-VII 루프내에서 상호작용 및 기니 피그 수용체상의 상기 루프에서 변형에 기인하는 것으로 생각된다.
제1 및 제3의 세포내 루프는 기니 피그 DP 단백질에서 3 내지 5개 아미노산이 짧아지는 반면, 마우스, 인간, 래트 DP 단백질에서 이들 세포내 루프는 모두 동일한 크기를 갖는다. Kobayashi 등은 또한, PGD2 결합을 위한 제 1 세포외 루프 영역에 막관통 도메인 1의 중요성을 강조하였다. 제1의 세포내 루프가 인간, 마우스 또는 래트 DP와 비교하여 기니 피그 DP에서 3개 아미노산이 짧기 때문에, 상기 영 역은 수용체 결합 친화성에 기여하는 추가의 영역일 수 있다. 부가적으로, 상기 수용체 영역은 인간과 기니 피그 DP에 대한 화합물의 친화성 사이에 관찰되는 차이에 기인할 수 있다. 제3의 세포내 루프 (TMD V와 VI 사이)는 기니 피그 DP에서 5개 아미노산이 짧아지고, PGD2의 기능적 관련성 (functional relevance)에 기여하는 수용체상의 다른 영역을 제공한다.
실시예 4
pEAK10 - gpDP 와 pEAK10 - mDP 포유동물 발현 벡터의 작제
마우스 DP 수용체에 대한 전장 cDNA는 PCR로 획득하고 Gateway BP 리콤비나아제 클로닝 방법을 이용하여 pDONR201 벡터에 클로닝하였다. 이로부터 상기한 기니 피그 DP 벡터에 유사한 마우스 DP 벡터가 산출되었다. DNA 염기서열분석에서, 상기 마우스 DP cDNA는 GenBank 수탁 번호 NM_008962로 정의된 기존에 보고된 마우스 DP 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다. 발현 연구를 위하여, 마우스와 기니 피그 DP 수용체는 LR 반응으로, 이미 게이트웨이 적합된 pEAK10 발현 벡터 (Edge Biosystems)에 서브클로닝하였다. pEAK10 벡터의 게이트웨이 적합화는 EcoRI로 분해 및 후속으로, Gateway 카세트의 벡터로의 클로닝을 위한 클레노우 충전 (klenow filling)으로 수행하였다. 생성된 벡터 pEAK10-gpDP와 pEAK10-mDP는 후술한 바와 같이 안정적인 세포주의 생산에 이용하였다.
HEK293 -Gα16 세포주의 생산
인간 Gα16을 암호화하는 cDNA는 기존 문헌에 기술된 바와 같이 클로닝하였다 (Amatruda 등, 1991). 간략하게 설명하면, HL-60 인간 전골수구성 백혈병 세포로부터 전체 RNA를 분리하고, Gα16을 암호화하는 cDNA의 PCR-매개된 합성을 위한 주형으로 이용하였다. 생성된 PCR 산물은 발현 벡터 pHook-3 (Invitrogen)에 클로닝하는데, 상기 발현 벡터는 단일-사슬 항체 (sFv)를 동시-발현함으로써 합텐-코팅된 자성비드로 패닝 프로토콜 (panning protocol)을 이용한 형질감염된 세포의 간편한 농축이 가능하다 (Chesnut 등, 1996). HEK293 세포는 작제된 플라스미드 (pGα16)로 형질감염시키고, 제오신 (zeocin)으로 선별하며, 양성 클론은 공급업체에 의해 제공된 프로토콜에 따라 자성비드를 이용하여 농축하였다. 최종 정제와 선별을 위하여, 단일 클론은 개별적으로 성장시키고, Gαs (GIP 수용체)에 천연적으로 결합하는 무작위 선택된 GPCR에 대한 발현 벡터를 이용한 분량의 추가적인 형질감염으로 Gα16의 기능적 발현을 분석하며, 이후 형질감염된 세포에서 Molecular Devices Corp.로부터 구입한 FLIPR 장치를 이용하여 칼슘 신호전달을 검사하였다.
HEK293 -Gα16 세포에서 pEAK10 - gpDP 와 pEAK10 - mDP 의 발현
pEAK10-gpDP와 pEAK10-mDP 벡터는 제조업자에 의해 지시된 바와 같이, Lipofectamine 2000 (Gibco)을 이용하여 HEK293-Gα16 세포주에 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 1 ㎍/㎖ 푸로마이신 (puromycin)과 250 ㎍/㎖ 제오신으로 선별하에 5주간 배양하였다. DP 수용체의 발현은 형질감염된 세포 개체군에서, PGD2 자극에 반응하는 세포내 칼슘의 방출을 측정함으로써 모니터하였다.
세포내 칼슘 검사
기능적 특성화를 위하여 새로 클로닝된 기니 피그 DP 수용체를 HEK293-Gα16 세포에 안정적으로 형질감염시키고, 비교를 위하여 마우스 DP 수용체로 동등한 세포주를 생산하였다. 양 DP 수용체-발현 세포주 및 임의의 형질감염된 DP 수용체를 발현하지 않는 모 세포주는 칼슘 반응을 유도하는 수용체의 Gα16으로의 강제 결합 (force coupling)을 이용한 2차 메신저 검사에서 평가하였다. 세포내 칼슘 측정은 형질감염되지 않은 HEK293-Gα16 세포, 또는 pEAK10-gpDP 또는 pEAK10-mDP 발현 벡터로 형질감염된 세포를 이용하여 수행하였다. 형질감염되거나 형질감염되지 않은 세포는 384 웰 평판에서 웰당 10,000개의 세포로 도말하였다. 세포는 칼슘 검사 완충액으로 3회 세척하였다. 이후, 세포는 칼슘 적하 염료 Fura-4/AM (Molecular Probes)와 함께 37 ℃ 에서 x분동안 배양하였다. 통합되지 않은 fura-4/AM은 칼슘 검사 완충액으로 3회 추가 세척하여 제거하였다. 세포내 칼슘은 Fura-4/AM 적하된 세포의 PGD2 또는 완충액 자극이후, FLIPR 장치 (Molecular Devices Corp.)를 이용하여 측정하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, PGD2 자극은 기니 피그와 마우스 DP-발현 세포주 모두에서 세포내 칼슘 동원의 강한 증가를 유도하였고, 이들 세포주에서 EC50 수치는 각각 1.4 nM와 18 nM이었다. 둘 모두의 세포주에서 최대 칼슘 방출은 동등하였다. 대조적으로, 부모 HEK293-Gα16 세포주는 매우 높은 PGD2 농도 (즉, 10 μM 이상의 PGD2)에서만 칼슘 반응을 보였다.
실시예 5
SPA cAMP 검사
새로 클로닝된 기니 피그 DP 수용체의 추가의 기능적 특성화는 DP에 대한 자연적인 신호전달 경로, 아데닐산 시클라아제에 의한 cAMP 생산의 자극을 이용하였다. 형질감염되거나 형질감염되지 않은 세포는 96 웰 평판에서 웰당 40,000개의 세포로 도말하였다. 37 ℃에서 하룻밤동안 배양한 이후, 배지를 교체하고 세포를 정의된 농도의 PGD2로 15분간 자극하였다. 제조업자에 의해 명시된 절차에 따라 cAMP SPA 직접 스크리닝 검사 시스템 (Amersham)을 이용하여, 자극된 세포에서 cAMP의 축적을 측정하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 기니 피그 DP 세포주는 PGD2 자극에 우수한 cAMP 반응을 보였는데, 상기 반응은 마우스 DP 수용체 반응에 동등하였다. 기니 피그와 마우스 DP 세포주에 대한 EC50 수치는 각각 0.8 nM과 0.5 nM이었고, 최대 반응은 양 수용체에서 동등하였다. 대조적으로, 부모 HEK293-Gα16 세포주는 PGD2 자극에 대응하는 세포내 cAMP의 증가를 보이지 않았다.
참고 문헌
Figure 112006047321434-PCT00001
Figure 112006047321434-PCT00002
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Claims (46)

  1. 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 핵산은 서열번호 2의 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 검출가능 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  4. 제3항에 있어서, 검출가능 표지가 효소, 방사성 동위원소, 또는 형광성 화학물질을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 핵산 서열은 RNA, 합성 RNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 및 cDNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  6. 서열번호 1의 핵산 서열에 하이브리드화되는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 핵산 서열은 엄격한 조건하에 하이브리드화되는 것을 특징 으로 하는 분리된 핵산 분자.
  8. 제7항에 있어서, 하이브리드화는 약 45 ℃, 6X SSC에서 발생하고, 이후 약 50 내지 65 ℃, 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 적어도 1회 세척되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  9. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  10. 제9항에 있어서, 유전자 코드의 축퇴성 (degeneracy)의 결과로써, 핵산이 서열번호 1의 핵산과 상이한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  11. 서열번호 1의 핵산과 65% 이상 동일한 핵산을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  12. 제12항에 있어서, 핵산은 서열번호 1의 핵산과 75% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 핵산은 서열번호 1의 핵산과 85% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  14. 제12항에 있어서, 핵산은 서열번호 1의 핵산과 95% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  15. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 검출가능 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 검출가능 표지가 효소, 방사성 동위원소, 또는 형광성 화학물질을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  18. 서열번호 2의 아미노산 서열과 65% 이상 동일하고 서열번호 2의 폴리펩티드의 기능을 유지하는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열과 75% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
  20. 제18항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
  21. 제18항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 재조합 폴리펩티드.
  22. 제18항의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  23. 제19항의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  24. 제20항의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  25. 제21항의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  26. 제15항의 재조합 폴리펩티드에 특이적인 항체.
  27. 제26항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 키메라 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
  28. 제26항에 있어서, 검출가능 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  29. 제28항에 있어서, 검출가능 표지가 효소, 방사성 동위원소, 형광성 화학물질, 또는 항체에 의해 인식되는 항원성 펩티드 태그를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  30. 발현 제어 요소와 작동가능하게 연결된 제1항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 발현 제어 요소는 구성적 조절 서열, 세포-특이적 조절 서열 및 유도성 조절 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  32. 제30항에 있어서, 발현 제어 요소가 hCMV의 즉각 조기(immediate early) 프로모터, SV40의 조기 프로모터, 아데노바이러스의 조기 프로모터, 백시니아의 조기 프로모터, 폴리오마의 조기 프로모터, SV40의 후기 프로모터, 아데노바이러스의 후기 프로모터, 백시니아의 후기 프로모터, 폴리오마의 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, 파지 람다의 주요 오퍼레이터와 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세리트 키나아제 프로모터, 산 포스 파타아제 프로모터, 또는 효모 α 교배 인자 (mating factor)의 프로모터를 포함하는 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  33. 제30항의 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  34. 제33항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  35. 제34항에 있어서, 숙주 세포가 대장균 (E. coli), 슈도모나스 (Pseudonomas), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 효모 (yeast), CHO, R1.1, B-W, L-M, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 또는 Sf9 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  36. 발현 제어 요소와 작동가능하게 연결된 제6항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  37. 제36항의 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  38. 발현 제어 요소와 작동가능하게 연결된 제11항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  39. 제38항의 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  40. a) 서열번호 1의 핵산; 및
    b) 서열번호 2의 아미노산을 암호화하는 핵산
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산에 상보적인 안티센스 RNA를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  41. 서열번호 1의 분리된 핵산을 포함하는 전이유전자(transgene)를 포함하는 게놈을 갖는 유전자전이된(transgenic) 비-인간 동물.
  42. a) 제15항의 재조합 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건하에 제19항의 숙주 세포를 배양하고;
    b) 상기 재조합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여, 제15항의 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  43. a) 단백질을 제26항에 따른 항체와 접촉시키고;
    b) 상기 항체와 상기 단백질 사이의 상호작용을 평가하는 단계를 포함하여, 단백질을 검출하는 방법.
  44. a) 잠재적 효능제를 서열번호 2를 발현하는 세포와 접촉시키고;
    b) 잠재적 효능제의 존재하에서의 서열번호 2의 신호전달 활성이 잠재적 효능제의 부재하에서의 서열번호 2의 신호전달 활성에 비하여 증가하는 지를 결정하는 단계를 포함하여, 서열번호 2의 효능제를 확인하는 방법.
  45. a) 잠재적 역효능제를 서열번호 2를 발현하는 세포와 접촉시키고;
    b) 잠재적 역효능제의 존재하에서의 서열번호 2의 신호전달 활성이 잠재적 역효능제의 부재하에서의 서열번호 2의 신호전달 활성에 비하여 감소하고, 내인성 리간드 또는 효능제의 존재하에서 감소하는 지를 결정하는 단계를 포함하여, 서열번호 2의 역효능제를 확인하는 방법.
  46. a) 잠재적 길항제를 서열번호 2를 발현하는 세포와 접촉시키고;
    b) 잠재적 길항제의 존재하에서의 서열번호 2의 신호전달 활성이 내인성 리간드 또는 효능제의 존재하에서의 서열번호 2의 신호전달 활성에 비하여 감소하는 지를 결정하는 단계를 포함하여, 서열번호 2의 길항제를 확인하는 방법.
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