KR20060087693A - Ｌｒｒｃ3ｂ 유전자를 포함하는 항암용 조성물 및 상기유전자를 이용한 진단방법 - Google Patents
Ｌｒｒｃ3ｂ 유전자를 포함하는 항암용 조성물 및 상기유전자를 이용한 진단방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 LRRC3B(Leucine rich repeat containing 3B) 유전자를 포함하는 항암용 조성물 및 상기 유전자를 이용한 암 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 우수한 암 형성 억제활성을 나타내는 LRRC3B 유전자를 포함하는 항암용 조성물 및 상기 유전자의 비정상적인 메틸화를 측정하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 LRRC3B 유전자를 포함하는 항암용 조성물 및 진단방법은 암 발생 억제 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
메틸화, 항암용 조성물
Description
도 1a는 인간 암 세포의 게놈 DNA를 추출하여 RLGS(restriction landmark genomic scanning)를 실시한 과정을 나타낸 그림이고,
N: NotI 제한효소의 절단부위
E: EcoRV 제한효소의 절단부위
H: HinfI 제한효소의 절단부위
도 1b는 위암 세포주 12종의 게놈 DNA를 대상으로 RLGS 프로화일을 비교한 결과를 나타낸 그림이고,
화살표: 스팟 DNA(3C43)
도 1c는 3C43 스팟 DNA가 정상조직에 비해 위암 환자의 암 조직에서 농도가 현저히 감소하였음을 나타내는 그림이고,
도 2a는 정상조직의 3C43 스팟 DNA를 추출한 후 시퀀싱하여 결정한 염기서열을 나타낸 그림이고,
도 2b는 도 2a의 염기서열이 LRRC3B 유전자의 프로모터에 위치하고, CpG 섬 (island)과 중복되어 있음을 나타내는 그림이고,
도 3은 정상조직, 암 조직, 림프절, 세포주에서 게놈 DNA를 이용하여 서던 블럿 분석(Southern blot analysis)을 실시한 결과를 나타내는 그림이고,
N: 정상조직 T: 암 조직 L: 림프절 C: 세포주
도 4a는 인간 LRRC3B 유전자의 cDNA 염기서열을 나타낸 그림이고,
도 4b는 도 4a의 인간 LRRC3B 유전자의 cDNA 염기서열로부터 추정된 아미노산 서열을 나타낸 그림이고,
도 5는 인간의 정상조직에서 LRRC3B 유전자의 발현유무를 파악하기 위해 도 4a의 PCR 산물을 방사선 동위원소로 표지하고 MTN(multi-tissue nitrocellulose membrane)에 대한 노던 블럿을 실시한 결과를 나타내는 그림이고,
도 6a는 LRRC3B 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 위암 세포주 및 유방암 세포주에서 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 실시한 결과를 나타낸 그림이고,
도 6b는 LRRC3B 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 위암 및 유방암 환자의 암 조직에서 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 실시한 결과를 나타낸 그림이고,
도 7은 위암 환자로부터 적출된 암 조직과 정상조직의 전체 RNA를 대상으로 RT-PCR분석을 수행하여 정상조직에서의 LRRC3B 유전자 발현량에 대한 암 조직에서의 LRRC3B의 발현량의 비를 점으로 표시하고 조직병리학적인 분류기준에 따라 그 분포도를 나타내고,
막대: 발현량의 평균값
도 8a는 인간 LRRC3B 유전자의 엑손(exon) 1 부위를 포함한 상위영역에서의 염기서열을 나타낸 그림이고,
도 8b는 도 8a의 CpG 섬에 해당되는 염기서열이 LRRC3B 유전자에 대한 프로모터의 역할을 하는지 검증하기 위한 루시퍼레이즈 분석(Luciferase assay) 결과를 나타낸 그림이고,
도 8c는 바이설피트(bisulfate)로 변형된 위암 세포주의 게놈 DNA를 주형으로 BS 프라이머를 이용하여 증폭하여 pGemTeasy 벡터에 클로닝하고 염기서열을 결정하여 52개의 CpG 좌위에서의 메틸화 유무를 분석한 결과를 나타낸 그림이고,
메틸화된 CpG 좌위: 검은 네모
도 8d는 바이설피트로 변형된 위암 세포주의 게놈 DNA를 주형으로 MSP#1 및 MSP#2 프라이머를 이용하여 MSP를 수행한 결과를 나타낸 그림이고,
M: 메틸화 DNA를 검출하기 위한 MSP 결과
U: 비메틸화 DNA를 검출하기 위한 MSP 결과
도 9는 LRRC3B이 극히 낮게 발현되는 것으로 확인된 위암 세포주 및 유방암세포주를 대상으로 DNA 메칠전이효소 저해제 또는 히스톤 탈아세틸효소 저해제, 또는 두 가지 저해제를 동시에 처리한 후 이들 세포주로부터 분리·정제한 전체 RNA를 RT-PCR로 분석한 결과이고,
도 10은 인간 LRRC3B 유전자를 발현하는 발현벡터를 제조하고 이를 LRRC3B가 극히 낮게 발현되는 위암 세포주에 형질전환시켰을 때, 대조군에 비해 LRRC3B 유전자가 과발현된 실험군에서 세포의 성장속도가 현저하게 둔화되었음을 나타내는 그림이고,
도 11a는 LRRC3B 유전자를 안정적으로 과발현하는 두 종의 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3 그리고 LRRC3B 유전자를 낮게 발현하는 대조군인 SNU601 세포주에 대한 시험관내 세포성장률을 분석한 결과를 나타낸 그림이고,
도 11b는 LRRC3B 유전자를 안정적으로 과발현하는 두종의 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3, 그리고 LRRC3B 유전자를 낮게 발현하는 대조군인 SNU601 세포주를 각각 누드 마우스에 동량씩 피하주사한 후 57일간 암 조직의 크기 변화를 측정한 결과를 나타낸 그림이고,
도 11c는 상기 도 11b에서 암 형성능 관찰 최종일에 마우스를 희생시키고 암 조직을 적출하여 크기를 측정한 결과를 나타낸 그림이고,
도 11d는 상기 도 11c에서 암 형성능 관찰 최종일에 마우스를 희생시키고 암 조직을 적출하여 크기를 직접 비교한 결과를 나타낸 그림이고,
도 11e는 상기 도 11d에서 실험군 SNU601-LRRC3B#1과 대조군 SNU601로 부터 적출된 각각 3쌍의 암 조직에서 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 이용하여 LRRC3B 유전자의 활성을 검증한 결과를 나타낸 그림이고,
도 12a는 80명의 위암 환자의 암 조직의 게놈 DNA를 대상으로 LRRC3B 단백질을 코딩하는 염기서열에서 돌연변이 또는 단일염기다형성(SNP)이 일어났는지 조사하기 위해 각각의 LRRC3B 유전자의 염기서열을 결정하고 이로부터 발견된 SNP의 염기서열 결과를 나타내는 그림이고,
도 12b는 LRRC3B 유전자의 SNP를 PCR을 이용하여 검색하기 위해 도 4a에 표시된 프라이머를 사용하여 80명의 위암 환자 및 21명의 정상 대조군의 게놈 DNA의 PCR 산물에 대한 A/A 및 A/T, T/T 등의 유전자형을 결정한 결과를 나타낸 그림이다.
본 발명은 LRRC3B(Leucine rich repeat containing 3B) 유전자를 포함하는 항암용 조성물 및 상기 유전자를 이용한 암 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우수한 암 형성 억제활성을 나타내는 LRRC3B 유전자 및 상기 유전자의 비정상적인 메틸화를 측정하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
종양은 과잉 증식을 나타내는 세포의 집단으로서, 치료가 어려운 악성 종양과 쉽게 제거 가능한 양성 종양으로 구별되는데 예외의 경우도 많아 정확한 구별이 어렵다. 특히, 암은 발암(oncogene)이나 암 억제(tumor suppressor gene) 유전자에 변이가 일어나서 발생하는 유전적 질환이며, 분자 또는 세포 수준에서 그 원인을 찾아낼 수 있다. 암 유전자의 발현 결과 만들어진 단백질들은 세포내에서 네트워크를 이루어 세포의 분열이나 분화를 위한 신호전달을 조절하는 역할을 수행하고 있다. 이들의 조절에 이상이 생기면 세포의 분화과정이 차단되고 분열만을 계속하여 이상증식하게 되는데, 이러한 잘못된 신호 전달 경로를 정상적으로 환원시켜 줄 수 있는 항암제의 개발이 절실히 요구되고 있다(Vogelstein and Kinzler, Nat. Med. Vol.10, 789-799, 2004).
현재, 암의 3가지 주요 치료법은 외과적 치료법, 약물 요법, 방사선 요법인데, 약물요법은 치료에 동반한 고통이 적고, 외과적 치료나 방사선 치료에 비해 치료 후에도 암의 재발이 상대적으로 적으므로 이에 대해 기대가 모아지고 있다. 따라서 이에 부응할 만한 수많은 항암제가 개발되어 사용되고 있는데, 이들 대부분의 항암제는 암의 이상증식을 염두에 두고 활발하게 분열하는 세포를 선택적으로 죽게 함으로써 항암 효과를 나타내는 것이다. 이러한 항암제는 일반적으로 인체 내에서 활발하게 분열하는 세포인 면역세포, 모근세포와 같은 정상세포도 함께 죽이게 되는 심각한 부작용을 동반하므로 장기간 사용이 불가능한 문제점을 안고 있다. 그러므로 암 발병의 원인이 새롭게 밝혀지고 있는 지금, 이에 기초한 새로운 항암제의 개발이 요구되고 있다.
암 발병의 원인을 살펴보면, 암을 유발하는 발암 유전자의 비정상적인 활성화로 인해 세포가 증식하거나 반대로 세포의 비정상적인 증식을 억제하거나 세포사멸 프로그램을 작동시켜 특정 세포를 사멸시킴으로써 암세포의 생성을 차단하는 암 억제 유전자에 이상이 생겨 발생하게 된다. 일단 비정상적으로 활성화된 암 유전자를 갖는 세포라 할지라도 암 억제 유전자가 정상적인 활성을 나타내게 되면 그 세포는 암을 형성하지 못하고 사멸된다. 그러므로 암세포가 되기 위해서는 발암 유전자의 활성화 뿐 아니라 암 억제 유전자의 불활성화가 하나의 세포에서 동시에 나타나야 한다.
암 억제 유전자의 불활성화가 일어나는 기전 중 하나는 시토신과 구아닌 염기쌍이 섬(island)과 같은 모양으로 존재하는 CpG 섬에 비정상적인 DNA 메틸레이션이일어나는 것이다(Jones and Laird, Nature Genet. Vol.21,163-167,1999). CpG 섬의 메틸화는 DNA 메칠전이효소에 의하여 이루어지며 메틸화가 축적되면 MeCP2와 같은 단백질이 메틸화된 DNA에 결합하게 되고 이로 인해 히스톤 탈아세틸 효소도 결합하게 된다. 히스톤 탈아세틸 효소는 히스톤에 결합된 아세틸기를 제거하고 그 결과 그 부근의 DNA 구조가 조밀해져 전사인자의 결합이 저해되고 결국 유전자 발현이 억제되게 된다(Brown and Strathdee, Trends Mol. Med. Vol. 8, S43-48, 2002). DNA 메틸화에 의하여 유전자 발현이 억제된 경우는 DNA 메칠전이효소의 저해제 또는 히스톤 탈아세틸 효소의 저해제를 사용함으로써 발현을 복구할 수 있다. 현재까지 알려진 DNA 메틸화에 의하여 발현이 억제되는 암 억제 유전자로는 CDH1, VHL, CDKN2A, CDKL2B, MLH1, DAPK1, GST1 등이 있으나 훨씬 많은 암 억제 유전자들이 DNA 메틸화에 의해 발현에 영향을 받을 것으로 추정된다.
상기와 같이, DNA 메틸화 및 탈아세틸화가 진핵세포의 유전자 전사조절에 매우 중요한 역할을 하고 있으며, 5-아자-2-데옥시사이티딘(5-aza-2-deoxycytidine) 등의 DNA 메칠전이효소의 저해제와 트라폭신(trapoxin), 트리코스타틴 A(trichostatin A), 디퓨데신(depudecin) 등과 같은 천연의 히스톤 탈아세틸효소 억제제들은 암세포 증식에 대한 억제능이 알려져 이들을 항암제로 사용하기 위한 임상실험이 실시되고 있다(Furumai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 87- 92, 2001).
항암제를 이용한 치료도 중요하지만 이보다 더 중요한 것은 암세포의 조기 발견이다. 암에 의한 사망률이 높은 이유는 대부분 다른 장기로의 전이가 발생한 후에 암이 발견되기 때문이다. 따라서 조기에 암을 발견하면 할수록 생존률을 훨씬 높일 수 있다. 예를 들어 대장암의 경우, 조기에 발견하면 환자의 5년 생존률이 95%에 이르지만 만일 다른 장기로의 전이가 발생했을 경우에는 생존률은 7% 정도로 크게 떨어진다(Etzioni et al., Nat. Rev. Cancer Vol. 3, 243-252, 2003). 그러므로 대부분의 연구자들은 초기단계에서 암 발생을 검진하기 위한 방법 및 타겟 유전자를 개발하기 위해 노력하고 있다. 최근에 암환자의 혈장이나 혈청 등과 같은 체액에서 암세포로부터 유래된 DNA 및 RNA가 검출된다는 것이 보고되고 있어 이들 핵산을 분리하여 암의 조기진단에 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 체액으로부터 분리된 암세포 유래의 DNA는 PCR에 의해 증폭이 가능하므로 암세포에서의 DNA 메틸화 변화를 검색할 수 있어 암의 조기진단에 매우 유용한 방법을 제공할 것으로 기대하고 있다. 또한 체액을 통해 수술 후 환자의 예후를 판정하거나 암치료에 대한 반응성을 모니터링할 수 있는 중요한 도구로 활용할 수 있다.
최근 위암환자의 체액으로부터 수득한 DNA를 대상으로 실험한 결과, CDH1, CDK2A, CDK2B, DAPK1 및 GSTP1 등의 암 억제 유전자들의 메틸화 검출은 15~58% 정 도에 지나지 않는다. 따라서 정확도를 보다 증대시키기 위해서는 새로운 유전자 타겟의 발굴이 필요한 실정이다(Laird, Nat. Rev. Cancer Vol. 3, 253-66, 2003).
이에 본 발명자들은 위암 세포주 및 위암 조직 게놈 DNA의 암 특이적인 메틸화를 DNA 2 차원 전기영동법(RLGS, restriction landmark genomic scanning)으로 분석하여 신규 유전자인 LRRC3B를 발견하였고 상기 유전자 산물이 암 억제 활성을 갖고, 다양한 암 세포주에서 LRRC3B 엑손 1 부근의 DNA 메틸화로 인해 LRRC3B 유전자의 발현이 감소하는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 우수한 암 형성 억제활성을 나타내는 LRRC3B 유전자 및 상기 유전자의 비정상적인 메틸화를 측정하여 암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 LRRC3B 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LRRC3B 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LRRC3B 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LRRC3B 유전자를 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRRC3B 유전자를 포함하는 발현벡터를 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRRC3B 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포주를 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메칠화를 조절하는 물질을 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRRC3B 유전자를 이용한 암 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRRC3B 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 마이크로 칩(microchip)을 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열의 919번째 염기의 SNP을 이용하여 질병을 진단하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 2로 기재되는 LRRC3B 단백질 및 상기 LRRC3B 단백질을 코딩하는 서열번호 1로 기재되는 유전자를 제공한다.
본 발명자들은 위암 세포주의 게놈 DNA를 분리하고 RLGS 방법을 이용하여 위암 유전체에서 특이적으로 농도가 현저하게 감소 또는 소실된 3C43 DNA 스팟(spot)을 발견하였다(도 1 참조). 3C43은 RLGS 겔상의 스팟 분포를 총 30개 영역으로 나 누고 이중 3C영역에서 43번째의 DNA 스팟임을 뜻한다. 3C43 DNA 스팟의 염기서열을 분석한 결과, 상기 서열은 인간의 3번 염색체 단완에 위치하고 있는 염기서열과 100% 동일하며, 아직 기능이 밝혀지지 않은 LRRC3B(Leucine rich repeat containing 3B) 유전자의 상위(5’ upstream) 및 전사개시 영역에 걸쳐 있음을 확인하였고 또한 CpG 섬과 서열이 일치함을 확인하였다(도 2 참조). 상기 LRRC3B 유전자의 전사개시 코돈과 전사 종료 코돈 사이에 나타나는 오픈 리딩 프레임으로부터 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 259개의 폴리펩타이드, 즉 LRRC3B 단백질이 암호화된다(도 4b 참조).
또한, 본 발명은 LRRC3B 유전자를 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
LRRC3B 유전자는 조직에 따라 발현량의 차이는 있으나 전립선, 위, 심장, 방광, 소장, 대장, 자궁, 골격근 등 인체의 모든 조직에서 정상적으로 발현되는 기능성 유전자이다. 암세포의 경우 LRRC3B 유전자의 엑손 1과 상류(upstream)에 존재하는 CpG 섬(시토신과 구아닌 염기쌍이 섬과 같은 모양으로 존재하는 부위)이 존재하는데 이 영역에 고메틸화가 일어나고 이로 인해 LRRC3B 유전자가 제대로 발현되지 않아 암세포에서 LRRC3B 유전자 발현산물이 소실되게 된다. 이는 본 발명자들이 LRRC3B 유전자의 발현이 검출되지 않는 암 세포주에 메틸화를 억제하는 저해제 처리 결과 LRRC3B 유전자가 재활성화되는 결과를 관찰함으로써 확인하였다(도 9 참조). 이와 더불어 LRRC3B 유전자를 암세포에 도입하여 콜로니 형성능이나 세포 성장률을 관찰한 결과 암세포 성장 억제활성을 나타내고(도 10 및 도 11a 참조) 누 드 마우스에 피하주입하였을 때는 종양의 크기를 감소시키는 결과로부터(도 11b 내지 d 참조) LRRC3B 유전자가 항암활성을 나타냄을 확인하였다
또한, 본 발명은 LRRC3B 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 LRRC3B 유전자의 활성과 작용기작을 밝히기 위하여 LRRC3B 유전자가 저발현되는 SNU601 암세포주에 미리 제조한 LRRC3B 발현 벡터인 pDEST12.1-LRRC3B, 이와는 별도로 LRRC3B 유전자가 들어 있지 않은 벡터인 pDEST12.2를 대조군으로 각각 형질전환시키고 동량의 세포를 배양하여 콜로니 형성능(Colony forming assay)을 조사하였다.
그 결과, LRRC3B 유전자의 발현에 의해 암세포의 성장 속도가 약 33% 정도로 매우 유의하게 저하됨을 알 수 있었으며 이 결과로부터 LRRC3B가 암세포의 성장을 억제하는 기능을 보유하고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포주 및 상기 형질전환 세포주를 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 상기에서 제조된 LRRC3B 발현벡터 pDEST12.1-LRRC3B로 형질전환시킨 LRRC3B 유전자를 과발현하는 세포주 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3을 제작하였다.
상기 형질전환체의 항암효과를 분석하기 위하여 누드마우스를 이용한 암 형 성능(tumorigenecity) 분석을 수행하였다. 암 형성능 분석은 대조군인 SNU601 및 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3 등의 세 종의 세포주 각각을 누드마우스 피하로 이식한 후 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, LRRC3B 유전자의 발현이 매우 낮은 SNU601 세포주가 주사된 대조군인 경우, 시간에 따라 급속도로 암이 형성됨을 관찰하였고 본 발명의 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3 등이 주사된 마우스는 대조군에 비하여 현저히 암성장이 둔화됨을 관찰하였다(도 11a 참조).
이러한 결과로부터 본 발명자들은 LRRC3B 형질전환체 즉, LRRC3B 유전자가 우수한 암 형성 억제 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 LRRC3B 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명의 LRRC3B 유전자 즉 LRRC3B 유전자의 산물인 단백질은 우수한 항암 활성을 나타낸다. 구체적으로, LRRC3B 유전자 발현은 약 82%의 위암 세포주 및 모든 유방암 세포주에서 억제되어 있음을 확인하였다. 또한, 다양한 위암 및 유방암 세포주에서 LRRC3B 유전자의 발현억제는 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근에 존재하는 전형적인 CpG 섬에서의 비정상적인 DNA 메틸화에 기인하는 것이며, DNA 메칠전이효소 억제제 또는 히스톤 탈아세틸효소 억제제 처리에 의하여 LRRC3B 유전자의 발현이 유도될 수 있음이 확인하였다. 따라서, 본 발명의 LRRC3B 유전자 및 그의 유전자 산물은 항암제 개발 뿐 아니라 LRRC3B 유전자의 엑손 1부근의 비정상적인 DNA 메틸화를 측정하여 암을 진단하는 검사방법의 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, LRRC3B의 발현이 억제된 암의 치료목적으로 LRRC3B 유전자의 발현을 유도하는 활성물질의 개발에도 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 LRRC3B 유전자의 엑손 1부근에 CpG 섬을 포함하는 염기서열(도 8a 참조)의 메틸화를 조절하는 물질을 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피험자의 조직으로부터 게놈 DNA를 분리 정제하는 단계;
2) 단계 1의 게놈 DNA를 변형하는 단계;
3) 단계 2의 게놈 DNA 중 LRRC3B의 CpG 섬의 염기서열 일부를 MSP(methylation-sensitive PCR)에 의해 증폭하는 단계;
4) 단계 3의 산물로부터 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법을 제공한다.
본 발명자들은 단계 2)의 DNA 변형을 위하여 수산화나트륨(NaOH), 하아드로퀴논(hydroquinone) 및 소디움 바이설피트(sodium bisulfite)를 처리하였다.
단계 2)에서 MSP 방법은 DNA를 변형했을 때, 메틸화된 CpG의 C(시토신)는 변형되지 않은 상태로 존재하나 비메칠 C의 경우에는 CpG의 C가 T(티민)으로 변형되는 원리를 이용하여 C(PCR-M) 또는 T(PCR-U)로 고안된 두 종류의 프라이머를 가지고 PCR을 수행하는 것으로, 목적하는 유전자부위가 메틸화 되어있으면 PCR-M 프라이머에서 PCR 산물이 나타나며 메틸화 되어있지 않으면 PCR-U에서 PCR 산물이 나타 나지 않는 원리를 이용하는 것이다.
또한, 본 발명은
1) 피험자의 암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리 정제하는 단계;
2) 단계 1의 게놈 DNA를 DNA의 메틸화에 민감한 제한효소 및 메틸화에 민감하지 않은 제한효소로 절단하는 단계;
3) 단계 2의 DNA를 주형으로 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 일부를 프라이머(primer)로 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
4) 단계 3의 반응산물의 차이로부터 서열번호 3으로 기재되는 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법을 제공한다.
단계 2)에서 DNA 메틸화에 민감한 제한효소는 메틸화된 DNA는 절단하지 못하고 메틸화되지 않은 DNA만을 절단할 수 있다. 반면 DNA 메틸화에 민감하지 않은 효소는 메틸화된 DNA나 메틸화되지 않은 DNA 모두를 절단하므로 상기 두 제한효소로 동일한 DNA를 처리하였을 때, 절편 크기에 차이가 있는 DNA 부위가 메틸화된 부위이다.
또한, 본 발명은
1) 피험자의 조직으로부터 게놈 DNA를 분리 정제하는 단계;
2) 단계 1의 게놈 DNA를 DNA 메틸화에 민감한 제한효소로 절단하는 단계;
3) 단계 2의 게놈 DNA를 전기영동한 후 막에 이동시키는 단계;
4) 단계 3의 막을 LRRC3B 유전자의 CpG 염기서열에 방사성 동위원소를 표지한 DNA 탐침으로 혼성화 반응을 수행하는 단계;
5) 단계 4의 막을 X-선 필름에 노출시켜 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법을 제공한다.
본 발명자들은 단계 2에서 게놈 DNA를 이동시키기 위한 막으로 하이본드-N+나일론 막을 사용하였고 방사성 동위원소는 [α-32P]dCTP로 표지하여 제작하였다.
또한, 본 발명은
1) 피험자의 조직으로부터 전체 RNA를 분리 정제하는 단계;
2) 단계 1의 전체 RNA를 LRRC3B 유전자의 일부 서열로 제작된 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 발현 mRNA를 증폭하는 단계;
3) 단계 2의 증폭된 RNA로부터 LRRC3B 유전자의 발현유무를 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피험자의 조직으로부터 전체 RNA를 분리 정제하는 단계;
2) 단계 1의 전체 RNA를 전기영동 한 후 막에 이동시키는 단계;
3) 단계 2의 막을 방사성 동위원소를 표지한 LRRC3B 유전자를 RNA 탐침으로 혼성화 반응을 수행하는 단계;
4) 단계 3의 막을 X-선 필름에 노출시켜 LRRC3B 유전자의 발현량을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRRC3B 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 마이크로 칩(microchip)을 제공한다.
마이크로칩은 분자생물학적 지식과 전자공학적 기술을 접목하여 제조되는 것으로, 동시에 최소 수백 개의 이상의 유전자 또는 단백질을 빠른 시간 내에 검색할 수 있어, 새로운 유전자 탐색 및 진단을 신속하고 간편하게 할 수 있다. 그러므로 상기의 LRRC3B cDNA 염기서열의 일부 또는 이로부터 생산된 LRRC3B 단백질에 대한 항체를 이용한 마이크로칩은 위암 및 유방암을 포함하는 각종 암으로 의심되는 수많은 환자들의 진단에 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 특히 위암의 경우 조기위암(EGC, early gastric cancer)과 진행성 위암(AGC, advanced gastric cancer) 등의 두 그룹 사이에는 조기위암에서 LRRC3B 유전자의 평균 발현량이 매우 유의하게 낮게 나타났으므로(도 7 참조) 위암의 발생에서 LRRC3B 유전자의 기능소실은 암의 조기진단에 효과적으로 이용될 것으로 예측된다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열의 919번째 염기의 SNP을 이용하여 질병을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 염기서열 분석과정에서 지금까지 보고된 바 없는 새로운 단일 염기다형성(SNP)을 발견하였다(도 12a 참조). 이 새로운 SNP은 서열번호 1로 기재되는 염기서열의 919번째에 해당되는 염기로서 도 4b의 110번째 아미노산인 글라이신(gly)을 지정하는 GGA의 3번째 뉴클레오티드인 A가 T로 치환된 것으로 아미노산의 치환에는 영향을 주지 않는 염기변화이다. 염기서열결정(sequencing)이 아닌 보다 경제적이고 빠른 방법으로 상기의 SNP 검증을 위해 본 발명의 정방향 프라이머 LRRC3B-919-forward와 두 종의 역방향 프라이머 LRRC3B-919A-reverse 및 LRRC3B-919T-reverse를 사용할 수 있다(도 4a 참조).
본 발명자에서 새로이 발견된 상기의 SNP는 위암의 발병과 관련된 유의성은 없으나 인간의 전체 유전체의 SNP를 이용한 반수체지도(Haplotype Map)의 구성 및 특정 질환과의 연관성 분석에 매우 유용한 표지자로 활용될 가치가 높다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단. 하기 실시에는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> LRRC3B 유전자 발굴
본 발명자들은 위암 세포주 및 위암 조직에서 암 발생과 관련된 유전자를 발굴하기 위하여 암 세포 유전자에서 특이적으로 발견되는 비정상적 메틸화를 탐색한 결과, LRRC3B 유전자의 고메틸화된 부위인 CpG 섬을 발견하였다.
<1-1>
RLGS(restriction landmark genomic scanning) 분석
우선 본 발명자들은 11종의 위암 세포주 및 15명 환자로부터 적출된 위암조직과 정상조직으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 게놈 DNA의 정제는 Samblook and Russell (Molecular Cloning, CSHL Press, 3rd ed. 2001)의 절차에 따라 상기 조직을 액체질소에서 동결하여 분쇄한 후 10 ml의 RNase가 함유된 Proteinase 완충액에서 부유시키고 37C에서 20분간 반응시키고 이어 Proteinase K를 1mg/ml의 최종농도로 첨가하고 65C에서 1시간 반응하였다. 반응이 종료된 용액에 phenol/chloroform 및 에탄올을 처리한 후 spull-out하여 최종 고분자 DNA 만을 회수하였다. 정제된 게놈 DNA들은 전부 제한효소로 처리한 후 2차원 전기영동시켜 절편의 크기를 확인하는 제한효소 표지 게놈 스캐닝 방법(restriction landmark genomic scanning, RLGS)(도 1a)으로 세포주 대 정상조직, 정상조직 대 암조직의 스캐닝한 프로파일을 비교하였다. 게놈 DNA를 제한효소로 처리하여 전기영동한 결과 효소로 절단된 절편인 2천 여개의 스팟(spot) DNA가 젤 상에 나타났는데 이중 3C43 DNA 스팟의 경우 12종의 암세포주 중 10종의 암세포주에서 스팟이 소실된 것(83%)을 발견하였고(도 1b) 15명 환자 중 12명의 환자의 암 조직에서도 스팟 DNA 농도가 감소함을(80%) 관찰하였다(도 1c).
<1-2> 고메틸화 3C43 스팟 DNA 분리 및 클로닝
Nagai et al.의 방법에 따라 RLGS를 수행한 전기영동 겔로부터 3C43 스팟 DNA를 회수하였다(Nagai et al., BBRC, 213: 258-265, 1995). 우선 전기영동 겔로 부터 3C43의 영역을 오려내고 DNA 회수용액(66mM Tris, 6.6mM MgCl2, 10mM DTT, 150mM NaCl, 10% PEG6000)에서 용해시킨 후 원심분리에 의해 상등액을 얻고 에탄올을 처리하여 침전된 DNA를 회수하였다. 이를 다시 회수용액에 녹이고 라이게이즈(T4 ligase)로 NotI 및 HinfI 링커와 접합시킨 후, 링커 염기서열을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응조건은, DNA 중합효소(Taq polymerase, Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍과 주형을 94℃에서 2분 동안 변성시키고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분간 35회 반응시키고, 72℃에서 5분간 연장(extension)시켜 반응을 종결하였다. 이로써 3C43 스팟 DNA를 증폭하였으며 이를 pBlue-KS(+) 벡터에 클로닝하여 pBlue-KS(+)3C43로 명명하였다.
<1-3> 고메틸화 3C43 스팟 DNA 염기서열 결정 및 LRRC3B 발굴
상기에서 클로닝한 pBlue-KS(+)3C43의 염기서열을 분석하여(도 2a) 이 염기서열을 UCSC 게놈 데이터베이스에서 블랏(Blat) 프로그램을 이용하여 조사한 결과, 인간염색체 3번 단완에 위치한 LRRC3B 유전자의 엑손 1 및 상기 유전자의 상류(upstream)에 존재하는 CpG 섬과 100% 동일함을 확인하였다(도 2b).
<1-4> LRRC3B 유전자의 CpG 섬의 프로모터 활성 분석
본 발명자들은 LRRC3B 유전자의 엑손 1 및 상기 유전자의 상류(upstream)에 존재하는 CpG 섬이 여타의 프로모터가 유전자의 상류에 존재하는 것과 같이 CpG 섬 도 LRRC3B 유전자의 프로모터로 작용하는지 조사하였다.
구체적으로, 서열번호 1로 기재되는 DNA를 주형으로 하고 서열번호 4와 5로 기재되는 프라이머를 이용하여 LRRC3B의 CpG 섬에 해당되는 염기서열 696bp를 PCR 방법으로 증폭하였다(도 8a). PCR 반응조건은, DNA 중합효소(Taq polymerase, Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍과 주형을 94℃에서 2분 동안 변성시키고, 94℃에서 40초, 56℃에서 50초 및 72℃에서 1분간 35회 반응시키고, 72℃에서 5분간 연장(extension)시켜 반응을 종결하였다. 이를 pGemT easy 벡터(Promega)에 클로닝하고 이로부터 제한효소 NcoI와 SacI으로 DNA 단편을 이중절단하여 루시퍼라제 유전자를 포함하는 pGL3-Basic 벡터(Promega)에 삽입함으로써 pGL3-LRRC3BCpG를 제조하였다. 대조군인 pGL3-Basic DNA와 실험군인 pGL3-LRRC3BCpG DNA 각 1μg을 리포펙타민(Invitrogen)을 이용하여 Hela 세포주에 형질전환시키고 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
그 결과, 형질전환 48 시간 후 CpG 섬의 염기서열을 포함한 pGL3-basic-S03CpG71 루시퍼라제 활성이 대조군인 pGL3-basic에 비해 현저하게 높았으므로 pGL3-basic-S03CpG71의 프로모터 활성이 pGL3-basic에 비해 높다고 생각할 수 있고(도 8b) 이는 CpG 섬의 영역이 LRRC3B 유전자의 프로모터로 작용하는 것임을 나타낸다.
<1-5> 서던 블럿 분석
상기 실시예 <1-3>에서 확보된 DNA 염기서열이 암세포에서 소실되거나 농도 가 낮아진 것이 고메틸화에 의한 것인지 아니면 염색체 결실에 의한 것인지를 파악하기 위하여 서던 블럿 분석을 수행하였다. 림프절로 암세포가 전이된 환자의 정상조직, 암조직, 림프절 조직 및 암세포주의 게놈 DNA 10 μg을 각각 NotI과 EcoRV, NotI과 HinfI 등의 제한효소로 절단 또는 이중 절단한 후 1.2% 아가로오스 젤에 전기영동시키고 하이본드-N+ 나일론 막으로 이동시켰다. DNA 탐침은 실시예 <1-2>에서 클로닝한 pBlue-KS(+)3C43 DNA를 [α-32P]dCTP(3,000 Ci/mmol, NEN 사)로 표지하여 사용하였다. 혼성화 반응은 하이본드-N+나일론 막을 106cpm/ml의 탐침 DNA를 포함한 5×SSPE/0.1% SDS 용액으로 실온에서 15분간 2회, 0.1×SSPE/0.1% SDS 용액으로 60℃에서 15분간 2회 세척하였다. 반응결과는 상기 막을 -70℃에서 16시간 동안 Kodak XAR-5 필름에 노출시킨 후 현상하여 검출하였다(도 3).
그 결과, 메틸화-비감수성 제한효소, 즉 제한효소 인식부위에 메틸화가 일어나도 DNA를 절단하는 HinfI/HinfI 절단의 경우, 정상조직, 암조직, 림프절 조직 및 세포주 등 모든 유전체 DNA에서 뚜렷한 DNA 밴드를 관찰하였으며, 메틸화-감수성 제한효소인 NotI을 사용하였을 경우, 정상조직과 비교하여 암조직 및 림프절과 세포주의 유전체 DNA에서는 메틸화된 제한효소부위를 NotI이 절단하지 못함에 따라 DNA 절편의 크기가 변화함을 확인하였다(도 3).
따라서 위암세포주 및 위암조직에서 RLGS 분석에 의한 3C43 스팟 DNA의 소실 또는 농도의 감소는 염색체 결실 또는 이형성 소실(LOH, loss of heterozygosity)이 그 원인이 아니라, 3C43 DNA 절편의 NotI 제한효소 인식부위의 메틸화가 주 원인임을 입증하였다.
<실시예 2>
정상조직, 암세포주, 암조직에서 LRRC3B 유전자의 발현 양상 분석
본 발명자들은 <실시예 1>에서 발견한 메틸화된 3C43 DNA의 일부를 포함하는 LRRC3B 유전자의 다양한 인체조직에서의 발현양상을 조사하는 한편 암세포주 및 암조직에서의 LRRC3B 유전자의 발현 이상을 분석하였다.
<2-1> 노던 블럿 분석
본 발명자들은 각종 인체조직에서 LRRC3B 유전자가 정상적으로 발현되는지 파악하기 위하여 클론텍(Clontech)에서 제공하는 ‘Human Muscle MTN Blot'(Cat#7765-1)으로 노던 블럿 분석을 수행하였다. DNA 탐침은 각각 서열번호 6과 7로 기재되는 RT-PCR 용 프라이머인 정방향 LRRC3B 프라이머와 역방향 LRRC3B 프라이머(도 4a)를 이용하여 얻은 PCR 산물을 [α-32P]dCTP(3,000 Ci/mmol, NEN 사)로 표지하여 제작하였다. 혼성화 반응은 하이본드-N+나일론 막을 106cpm/ml의 탐침 DNA를 포함한 5×SSPE/0.1% SDS 용액으로 실온에서 15분간 2회, 0.1×SSPE/0.1% SDS 용액으로 65℃에서 15분간 2회 세척하여 수행하였다. 상기 막을 -70℃에서 16시간 동안 Kodak XAR-5 필름에 노출시킨 후 현상하여 반응결과를 검출하였다(도 5).
그 결과, 조직에 따라 발현량의 차이가 있으나 전립선, 위, 심장, 방광, 소장, 대장, 자궁, 골격근 등의 조직에서 뚜렷한 LRRC3B mRNA 밴드가 검출되었으며 특히 골격근의 경우에는 두 가지 다른 크기의 mRNA가 검출되었다. 따라서 LRRC3B 유전자는 인체의 모든 조직에서 정상적으로 발현되는 기능성 유전자임을 확인하였다.
<2-2> 위암 및 유방암 세포주에 대한 RT-PCR 분석
본 발명자들이 발견한 LRRC3B 유전자가 정상세포와 달리 암세포주에서 발현이 감소하는지 조사하기 위하여 11 종의 위암 세포주와 6 종의 유방암 세포주로부터 전체 RNA를 분리한 후 RT-PCR 방법으로 LRRC3B 유전자의 mRNA 발현 여부를 조사하였다.
위암 세포주로는 SNU1, SNU5, SNU16, SNU216, SNU484, SNU520, SNU601, SNU620, SNU638, SNU668, SNU719 등을 사용하였고, 유방암세포주로는 MCF-7, ZR-75-1, Hs578T, MDA-MB-231, SCC-1395, SK-BR-3 등을 사용하였다. 상기 세포주들은 서울대병원 한국세포주은행(KCLB: http://cellbank.snu.ac.kr/index.htm)으로부터 분양받아 사용하였다.
전체 RNA는 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 제시된 지침에 따라 각각의 암세포주로부터 분리ㆍ정제하였다. 정제된 RNA는 DNA 분해효소(DNase I, Gibco-BRL)를 처리하여 DNA를 제거하여 이를 주형으로 올리고-dT(Oligo-dT) 프라이머(Gibco-BRL), SuperScript II RNase H- kit(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 기초로 하여 각각 서열번호 6과 7로 기재되는 정방향 LRRC3B프라이머와 역방향 LRRC3B 프라이머를 이용한 RT-PCR 방법으로 LRRC3B mRNA 발현 여부를 분석하였다. 대조군 실험의 RT-PCR을 위하여 인체의 β-액틴 cDNA 염기서열을 이용하여 서열번호 8로 기재되는 H-액틴 정방향 프라이머와 서열번호 9로 기재되는 H-액틴 역방향 프라이머 쌍을 제조하였다.
RT-PCR 반응조건은 유전자 증폭장치(Perkin-Elmer Cetus, model 9600)를 이용하여, 94℃로 2분간 전처리한 후 94℃로 40초간 변성(danaturation) 단계, 60℃로 50초간 결합(annealing) 단계, 72℃로 1분간 효소반응(extension) 단계를 연속적으로 30회 반복하였다. 반응이 종결된 후 반응액 모두를 2% 아가로오스 젤 상에 전기영동한 후 에디티움 브로마이드로 염색하여 관찰하였다.
대조군 실험을 위한 β-액틴 유전자에 대한 RT-PCR 반응은 94℃로 2분간 전처리한 후 94℃로 30초간 변성(danaturation) 단계 , 68℃로 1분간 결합(annealing) 단계, 72℃로 1분간 효소반응(extension) 단계를 연속적으로 20회 반복하였다. 반응이 종결된 후 반응액의 3㎕를 2% 아가로오스 젤 상에 전기영동한 후 에디티움 브로마이드로 염색하여 관찰하였다.
그 결과, 대부분의 위암 세포주에서, 예상되는 LRRC3B 유전자의 크기인 516 bp의 RT-PCR 산물이 관찰되었으나 SNU484 및 SNU520의 경우를 제외하고는 LRRC3B 유전자의 발현이 매우 낮은 것으로 나타났다. 또한, 6종의 유방암 세포주에서도 동일한 방법으로 LRRC3B 유전자의 발현을 분석한 결과, 모든 세포주에서 LRRC3B 유전자 발현이 매우 낮음을 확인하였다(도 6a).
<2-3> 위암 및 유방암 조직에 대한 RT-PCR 분석
실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 269명의 위암 및 18명의 유방암 환자로부터 적출한 암 조직 및 정상조직에서 전체 RNA를 분리한 후 RT-PCR 방법을 이용하여 LRRC3B 유전자의 발현 여부를 조사하였다.
그 결과, 한 환자의 정상조직에서의 LRRC3B 발현량에 대한 동일 환자의 암조직에서의 LRRC3B 발현량의 비가 0.5 이하이면 유전자 발현 소실로 정의하였다. 이 때, 총 269명 위암 환자의 경우 30%의 환자에서 LRRC3B 유전자의 발현 소실이 관찰되었다(도 6b). 또한 18명 유방암 환자의 조직에서는 모든 환자의 암조직에서 유전자 발현 소실이 관찰되었다(도 6b). 따라서 상기의 결과는 위암 조직 및 유방암 조직에서 LRRC3B 유전자의 소실에 따른 LRRC3B의 기능소실이 위암 및 유방암 발생의 주요 원인임을 강력하게 시사하고 있다.
<2-4> 위암 진행단계와 LRRC3B 유전자 발현 소실의 상관관계 분석
본 발명자들은 특히 위암의 경우 조기 위암으로부터 진행성 위암 단계로의 이행과 LRRC3B 유전자 발현 소실의 연관성을 조사하기 위하여, 정상조직과 암 조직에서 LRRC3B 유전자 발현량을 비교, 분석하였다.
그 결과, 위암의 로렌스형 분류(Lauren's classification)에 의한 장형 위암(I, intestinal type)과 미만형 위암(D, diffuse type)에서 LRRC3B 유전자의 평균 발현치는 T 검정 결과 유의한 차이가 나타나지 않았다(P=0.8447). 그러나 조기 위암(EGC, early gastric cancer)과 진행성 위암(AGC, advanced gastric cancer)에서는 T 검정 결과, 조기위암의 LRRC3B 유전자의 평균 발현량이 매우 낮게 나타났으며(P,0.0001), TNM 병기에 의한 분류에서도 IA 병기가 다른 병기에 비해 LRRC3B 유전자의 평균 발현량이 매우 낮게 나타났다(P=0.0002)(도 7). 참고로 TNM 병기에서 T는 종양의 침윤정도에 따른 분류체계로서 진행정도에 따라 Tx -> T0 -> T1 -> T2 -> T3 -> T4로 나누고, N은 림프절 전이정도를 나타내는 것으로 전이된 림프절 수에 따라 Nx -> N0 -> N1 -> N2 -> N3로 나누며, M은 다른 장기로의 전이 정도를 나타내는 것으로 Mx -> M0 -> M1으로 분류한다. 상기의 세가지 파라미터(parameter)를 종합하여 암의 진행정도 또는 병기를 구분하는데 이를 TNM 병기라 하고 초기단계부터 IA -> IB -> II -> IIIA -> IIIB -> IV등으로 병기를 구분합니다. 따라서 IA는 조기 위암에 해당되는 예후가 좋은 경우이며 뒤로 갈수록 예후가 나쁜 병기가 되어 IV는 말기에 해당된다.
그러므로 상기의 결과는 위암의 발생 단계에서 비교적 초기 단계에 LRRC3B 유전자 발현 소실로 인한 LRRC3B 유전자의 기능소실이 나타나며, 특히 전암 단계(intestinal metaplasia)에서부터 LRRC3B 유전자의 기능소실이 발생할 가능성이 높을 것으로 판단되며 이러한 기능소실은 실시예 <1-1>의 결과에서 보는 것처럼 LRRC3B의 CpG 섬에서의 메틸화와 연관성이 있는 것으로 추정할 수 있다.
<실시예 3>
LRRC3B 유전자 발현과 CpG 섬 메틸화 간의 연관성 분석
이에 본 발명자들은 LRRC3B 유전자의 발현 소실이 상기 유전자에 존재하는 CpG 섬에서의 DNA 메틸화에 기인한 것인지를 밝히기 위하여 LRRC3B 유전자의 발현과 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬에서의 메틸화 양상을 비교하였다.
<3-1>
암 세포주에서 LRRC3B 유전자 발현과 CpG 섬의 메틸화 간의 연관성 분석
LRRC3B 유전자의 CpG 섬에서의 메틸화가 LRRC3B 유전자의 발현 소실의 직접적인 원인임을 조사하기 위하여 위암 세포주를 대상으로 CpG 좌위(loci)에 대한 메틸화 상태를 분석하였다.
먼저 11 종의 위암 세포주의 게놈 DNA 각각 1μg을 최종농도 0.3 M의 수산화나트륨(NaOH)으로 변성하고 하이드로퀴논(hydroquinone) 및 소디움 바이설피트(sodium bisulfite)를 처리하여 변형된 DNA를 얻었으며 이들 DNA를 주형으로 서열 10으로 기재되는 BS 정방향 프라이머 및 서열 11로 기재되는 BS 역방향 프라이머( 도 8a)를 사용하여 각각의 PCR 산물을 얻었다. 이 PCR 산물을 pGEMT easy 벡터(Promega)에 클로닝하고 각 세포주당 평균 6개 클론의 pGEMT-CpG에 대한 염기서열을 결정하여 57개의 CpG 좌위의 메틸화 유무를 분석하였다(도 8c).
그 결과, 11개의 세포주 중 SNU484를 제외한 10개의 세포주(SNU001, SNU005, SNU016, SNU216, SNU520, SNU601, SNU620, SNU638, SNU668, SNU719)에서 CpG 섬이 44~95%에 걸쳐 심하게 메틸화되어 있었다. 이중 SNU520을 제외한 나머지 9개의 세포주에서의 경우, 도 6a에서 보는 바와 같이 LRRC3B 유전자의 발현이 매우 낮음을 확인하였으며 또한 SNU484에서 LRRC3B 유전자는 정상적으로 발현되고 있었고 메틸화 정도는 2%였다. 상기 결과는 LRRC3B 유전자의 CpG 섬에서의 고메틸화가 LRRC3B의 유전자 발현 소실을 가져오는 직접적인 원인임을 확인할 수 있다.
<3-2> MSP(methylation-sensitive PCR)에 의한 LRRC3B CpG 섬 메틸화 상태 분석
본 발명자들은 시퀀싱(sequencing) 이외에, LRRC3B 유전자의 CpG 섬에서의 메틸화 상태를 간단하고 빠르게 분석할 수 있도록 MSP 방법을 도입하였다. MSP는 실시예 <3-1>에서와 같이 DNA를 소디움 바이설피트로 변형했을 때, 메틸화된 CpG의 C(시토신)는 변형되지 않은 상태로 존재하나 메칠화되지 않은 C의 경우에는 CpG의 C가 T(티민)로 변형되는 원리를 이용한 것이다. CpG 섬(시토신과 구아닌 염기쌍이 섬(island) 모양으로 산재하는 것)의 동일한 염기좌위(loci)에 대하여 C(PCR-M 프라이머) 또는 T(PCR-U 프라이머)로 고안된 두 종류의 프라이머를 가지고 PCR을 수행하였을 때, 목적하는 유전자 부위가 메틸화 되어있으면 PCR-M 프라이머에서 PCR 산물이 나타나며 메틸화 되어있지 않으면 PCR-U에서 PCR 산물이 나타나게 된다.
상기에서 소디움 바이설피트를 처리하여 변형된 DNA를 사용하여 MSP#1 및 MSP#2 등 두 세트의 프라이머를 이용하여 MSP를 수행하였다(도 8a). 그 결과 도 8d에서 보는 바와 같이 MSP#1을 사용하였을 경우, LRRC3B의 발현이 매우 낮은 9종의 세포주 중 7종의 세포주(SNU001, SNU005, SNU601, SNU620, SNU638, SNU668, SNU719)에서 PCR-M 프라이머에 의해 PCR 산물이 생성되었고 다른 세포주에 비해 상대적으로 낮은 메틸화를 나타내는 2종의 세포주(SNU016 및 SNU216)에서는 U(비메칠 DNA)에서 산물이 관찰되었다. 따라서 이 결과는 MSP#1의 프라이머의 위치가 7 종의 세포에서는 메틸화되지만 두 세포주에서는 메틸화되지 않은 영역임을 나타내고 있다.
따라서 본 연구자들은 MSP가 LRRC3B 유전자 발현과 직접적인 연관성을 보여 주는 영역을 선택하여 MSP를 실시하였다. 그 결과, MSP#2를 사용하였을 때 SNU016 및 SNU216의 두 세포주에서 모두 M과 U에서 산물이 관찰되었다. 따라서 MSP#2의 반응조건이 도 8c의 결과와 일치하고 있음을 알 수 있었으며 이러한 결과는 MSP#2의 프라이머가 LRRC3B CpG 섬에서의 메틸화 양상을 보다 정확하게 분석할 수 있어 암을 진단하는 검사방법의 개발에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
<3-4> LRRC3B 유전자의 재활성 분석
본 연구자들은 상기 실시예 <3-2>에서 관찰된 DNA 메틸화가 LRRC3B 유전자의 발현을 억제하는 직접적인 원인인지 분석하기 위하여, DNA 메칠전이효소 저해제 또는 히스톤 탈아세틸효소 저해제를 처리하였을 때 LRRC3B 유전자의 발현이 재활성화되는지 조사하였다.
구체적으로, RT-PCR 분석 방법에 의하여 LRRC3B 유전자의 발현이 검출되지 않은 세포주 중에서 두 종의 위암세포주 SNU216 및 SNU601과 두 종의 유방암세포주 Hs578T 및 SK-BR-3을 임의로 선택하여 DNA 메칠전이효소 저해제인 5-아자-2-데옥시사이티딘(5-aza-2-deoxycytidine, AZA, 300nM) 또는 히스톤 탈아세틸효소 저해제인 트리코스타틴 에이(trichostadin A, TSA, 1nM)를 단독으로 처리하거나 두 가지 저해제를 동시에 처리하였다. 1일 또는 3일간 처리 후 각각의 세포주로부터 전체 RNA를 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법에 따라 분리ㆍ정제하였으며 서열번호 6 및 7 로 기재되는 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 방법으로 LRRC3B 유전자의 발현여부를 분석하였다. 반응조건은 94℃로 2분간 전처리한 후 94℃로 40초간 변성(danaturation) 단계, 60℃로 50초간 결합(annealing) 단계, 72℃로 1분간 효소반응(extension) 단계를 연속적으로 30회 반복하였다.
그 결과, DNA 메칠전이효소 저해제 또는 히스톤 탈아세틸효소 저해제를 처리하였을 때 LRRC3B 유전자의 발현이 다시 유도됨을 확인하였다(도 9). 메틸화를 억제하는 저해제 처리 결과 LRRC3B 유전자가 재활성화되는 상기의 결과로부터 위암 및 유방암 세포주에서 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화에 의하여 LRRC3B 유전자의 발현이 억제됨이 증명되었다.
<실시예 4> SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3 세포주 제작
본 발명자들은 LRRC3B 유전자의 활성과 작용기작을 밝히기 위하여 LRRC3B 유전자를 과발현하는 세포주를 하기와 같이 제작하였다.
<4-1> LRRC3B 유전자 발현 플라스미드 벡터의 제조
구체적으로 LRRC3B 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터는 서열번호 1로 기재되는 LRRC3B 유전자를 주형으로, 정방향 프라이머 LRRC3B, 역방향 프라이머 LRRC3B를 사용하여 LRRC3B유전자의 cDNA 중 코딩 부위 전체를 포함하는 780 bp크기의 DNA 단편(도 4a)을 수득하였다. 반응조건은 94℃로 2분간 전처리한 후 94℃로 40초간 변성(danaturation) 단계, 60℃로 50초간 결합(annealing) 단계, 72℃로 1분간 효소반응(extension) 단계를 연속적으로 30회 반복하였다. 이를 pDEST12.1 벡터에 정방향으로 삽입하여 제조하고 pDEST12.1-LRRC3B라 명명하였다.
<4-2> 콜로니 형성능 분석(Colony forming assay)
본 발명자들은 암세포내에서 LRRC3B 유전자의 활성과 작용기작을 밝히기 위하여 상기에서 제조한 LRRC3B 발현 벡터인 pDEST12.1-LRRC3B와 대조군 벡터인 pDEST12.1를 LRRC3B 유전자가 저발현되는 SNU601 암세포주에 각각 형질전환시키고 형질전환된 암세포주 동량(1 x 104 cell/well)을 소프트 아가에서 배양하여 콜로니 형성능(Colony forming assay)을 조사하였다.
독립적으로 3회 반복하여 20일 동안 세포를 배양한 결과, pDEST12.1을 형질전환시킨 대조군의 경우 플레이트 당 평균 113±14개(100~129)의 콜로니가 형성된 반면, pDEST12.1-LRRC3B를 형질전환시킨 실험군의 경우 평균 37±5개(31~41)의 콜로니가 형성되었다(도 10). 따라서 LRRC3B 유전자의 발현에 의하여 암세포의 성장 속도가 약 33% 정도로 매우 유의하게 저하됨을 알 수 있었으며 이로부터 LRRC3B가 암세포의 성장을 억제하는 기능을 보유하고 있음을 확인하였다.
<4-3> 형질전환(Stable transfection)
본 발명자들은 LRRC3B 유전자를 과발현하는 세포주를 제조하기 위하여 상기 실시예 <4-1>로부터 제조된 플라스미드 벡터 pDEST12.1-LRRC3B와 네오마이신 선별 마커(neo selection marker)를 가진 pDEST12.1 플라스미드를 LRRC3B 유전자를 현하지 않는 SNU601 세포주에 리포펙타민(Lipopectamin, Gibco-BLR)을 이용하여 동시-형질전환(co-transfection)시킨 후 pDEST12.1-LRRC3B가 안정적으로 도입된 형질감염체(stable transfectant)를 G418로 선별하였다. 이와 같이 선별된 LRRC3B 유전자를 과발현하는 세포주를 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3로 각각 명명하였다.
<실시예 5> LRRC3B 유전자의 암 형성능(tumorigenicity) 억제활성 조사
본 발명자들은 상기 실시예 <4-2>의 콜로니 형성능 분석에서의 결과에서 관찰한 바와 같이, LRRC3B 유전자가 항암효과를 가질 것이라는 가설을 세우고 시험관 내에서의 세포 성장률 및 누드 마우스를 이용한 암 형성능(tumorigenicity) 분석을 수행하였다.
<5-1> 시험관내 세포 성장률 측정
우선 상기 실시예 <4-3>에서 수립된 LRRC3B 유전자의 과발현 세포주 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3에 대한 시험관내 세포 성장률을 분석하였다.
각각 “Day 0”에 5 x 104cells/well의 농도로 세포를 접종하고 24시간 경과 후 세포량을 측정하였다. 세포량 측정을 위하여 플레이트에 50% TCA(trichloroacetic acid)를 가하고 4℃에서 60분간 방치하여 세포를 고정, 세척한 후 건조시켰다. 0.4% SRB(sulforhodamine B) 용액으로 30분간 염색하고 0.1% 초산으로 세척하여 건조시킨 후 이를 10mM Tris Base(pH 10.5) 100 ㎕로 녹여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이와 동일한 방법으로 2일째, 3일째 및 4일째의 세포의 양을 측정하여 세포 성장 변화를 확인하였다.
그 결과, 대조군인 형질전환되지 않은 SNU601 세포주에 비하여 SNU601-LRRC3B#1 및 SNU601-LRRC3B#3 세포의 경우 2일째에는 각각 16.5% 및 34.4%의 감소가 있었으며, 3일째에는 각각 50.8% 및 4.4%의 세포 성장률 감소가 관찰되었다. 최종일인 4일째에는 각각 137.6%(SNU601-LRRC3B#1) 및 57.4%(SNU601-LRRC3B#3)의 세포 성장률 감소가 관찰되었다(도 11a).
<5-2> 누드 마우스 이식시험에 의한 암 형성능(tumorigenicity) 억제활성 조사
본 발명자들은 LRRC3B 유전자의 항암효과를 분석하기 위하여 누드 마우스를 이용한 암 형성능(tumorigenecity) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 대조군인 형질전환되지 않은 SNU601 및 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3의 세포주 각각을 동량씩(3 x 107 cells/ml) 누드마우스에 0.3 ml 씩 피하이식했다. 피하주사한 후 13일째부터 종양의 크기를 측정하기 시작하여 최종일인 57일째까지 총 7회 개체별로 측정했으며 이 때, 종양의 크기는 버니어 캘리퍼(vernier caliper)를 이용하여 3 방향을 측정하여 계산하고 최종일인 57일째에는 누드 마우스를 희생시켜 종양을 절제하고 무게를 측정하였다.
그 결과, 메틸화에 의해 SNU601 세포주가 주사된 대조군의 경우, 시간에 따라 급속도로 암이 형성됨을 관찰하였고 SNU601-LRRC3B#1과 SNU601-LRRC3B#3 등이 주사된 마우스는 대조군에 비하여 암 성장이 현저히 둔화됨을 관찰하였다(도 11b).
구체적으로, 최종일(day 57)에 SNU601-LRRC3B#1 및 SNU601-LRRC3B#3 등 이식군의 암 조직 크기는 각각 108.0±53.2 ㎣ 및 0.5±1.1 ㎣로서 대조군인 SNU601의 480.6±117.0 ㎣에 비해 각각 77.5% 및 99.9%의 종양 크기 감소가 관찰되었다(p<0.001, 도 11c). 동일한 날에 암 조직을 절제하여 그 무게를 측정하였는데 SNU601-LRRC3B#1 및 SNU601-LRRC3B#3 등 이식군의 경우 각각 370.3±244.4 mg 및 5.2±6.6 mg로서 대조군인 SNU601의 1114.0±342.9 mg에 비해서 종양무게가 각각 66.8% 및 99.5% 감소하는 결과를 관찰하였다(p<0.001, 도 11d).
<5-3> 누드 마우스 이식 시험에 의한 암에 대한 RT-PCR 분석
본 발명자들은 상기의 누드 마우스 이식 실험에서 관찰된 암 형성능 억제활성과 더불어 누드 마우스에서 얻은 암 조직에서 LRRC3B 유전자 활성이 유지되는지를 확인하기 위하여 SNU601 및 SNU601-LRRC3B#1가 이식된 마우스에서 적출된 3개의 암 조직을 대상으로 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 제시된 지침에 따라 각각의 전체 RNA는 분리ㆍ정제하였다. 정제된 RNA는 DNA 분해효소(DNase I, Gibco-BRL)를 처리하여 DNA를 제거하여 이를 주형으로 올리고-dT(Oligo-dT) 프라이머(Gibco-BRL), SuperScript II RNase H- kit(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 서열번호 6과 7로 기재되는 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하여 LRRC3B 유전자의 활성을 조사하였다. 반응조건은 94℃로 2분간 전처리한 후 94℃로 40초간 변성(danaturation) 단계, 60℃로 50초간 결합(annealing) 단계, 72℃로 1분간 효소반응(extension) 단계를 연속적으로 30회 반복하였다.
그 결과, SNU601 이식 마우스로부터 적출한 암 조직은 LRRC3B 유전자의 활성이 매우 낮은 상태이나 SNU601-LRRC3B#1 이식 마우스로부터 적출한 암 조직은 LRRC3B 유전자가 과발현되고 있음을 관찰하였다. 상기 결과를 토대로 본 발명자들은 LRRC3B가 암조직에서도 유전자 활성을 유지하고 있음을 관찰하고 LRRC3B 유전자가 암 형성 억제 활성을 가지고 있음을 확인하였다(도 11d).
<실시예 6> LRRC3B 유전자의 돌연변이 및 단일염기다형성(SNP) 분석
본 발명자들은 암세포에서 LRRC3B 유전자의 발현 감소 또는 소실이 CpG 섬에서의 메틸화 외에 기타의 유전적 기작이 관여해 있는지를 조사하기 위하여 LRRC3B 유전자에서의 돌연변이 또는 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 조사하였다.
<6-1> LRRC3B 유전자의 단백질 코딩 영역의 염기서열의 분석
우선 본 발명자들은 80명 환자의 암 조직을 대상으로 서열번호 1로 기재되는 LRRC3B 유전자의 cDNA 중 코딩 부위 전체를 포함하는 780 bp의 염기서열을 시퀀싱에 의해 확인하였다. 그 결과, 환자의 암 조직 내 LRRC3B의 단백질을 코딩하는 염기서열에서 어떠한 돌연변이도 관찰되지 않았으며, 이로부터 본 발명자들은 위암환자의 암 조직에서 관찰되는 LRRC3B 유전자의 발현 감소는 돌연변이로 인한 것이 아님을 확인하였다.
그러나 본 발명자들은 염기서열 분석과정에서 지금까지 보고된 바 없는 새로운 단일염기다형성(SNP)을 발견하였다(도 12a). 이 새로운 SNP는 도 4a의 919번째에 해당되는 염기로서 도 4b의 110번째 아미노산인 글라이신(gly)을 지정하는 GGA의 3번째 뉴클레오티드인 A가 T로 치환된 것으로 아미노산의 치환에는 영향을 주지 않는 염기변화이다. 본 발명자들은 80명 위암환자의 암 조직에서 A/A 동형접합체(homozygote) 및 A/T 이형접합체(heterozygote), T/T 동형접합체를 각각 53 명, 23명, 4명 등으로 관찰하였으며 이에 따라 A 및 T 대립인자(allele)의 빈도는 각각 80.6%(129/160) 및 19.4%(31/160)로 분석되었다.
<6-2> PCR을 이용한 LRRC3B 유전자내 SNP형 결정
본 발명자들은 상기의 SNP 결과를 검증하기 위하여 PCR을 수행하였다. 이를 위하여 서열번호 20으로 기재되는 정방향 프라이머 LRRC3B-919-forward와 21과 22로 기재되는 두 종의 역방향 프라이머 LRRC3B-919A-reverse 및 LRRC3B-919T-reverse를 고안하였으며(도 4a), 이를 이용하여 80명 위암환자의 정상조직 DNA 및 위암병력이 없는 정상인 21명의 혈액 DNA에 대해 PCR을 수행하였다. 반응조건은 반응조건은 94℃로 5분간 전처리한 후 94℃로 45초간 변성(danaturation) 단계, 60℃로 35초간 결합(annealing) 단계, 72℃로 2분간 효소반응(extension) 단계를 연속적으로 35회 반복하였다.
그 결과, 위암 환자의 경우에서는 염기서열 결정을 통한 결과와 동일하여 PCR를 이용하여 상기의 SNP를 정확하게 결정할 수 있음을 확인하였다. 또한 정상인의 경우, A/A 동형접합체(homozygote) 및 A/T 이형접합체(heterozygote), T/T 동형접합체가 각각 11명, 9명, 1명 등으로 관찰되어 A 및 T 대립인자(allele)의 빈도는 각각 73.8%(31/42) 및 26.2%(11/42)로 관찰되었으며 위암 환자와 정상인 사이에 특정 인자형 및 대립인자의 분포에 대한 카이-스퀘어 검정 결과 두 집단사이에 유의한 차이는 나타나지 않았다.
그러나 본 발명에 의해 새로이 발견된 상기의 SNP는 인간의 전체 유전체의 SNP를 이용한 반수체지도(Haplotype Map)의 구성 및 특정 질환과의 연관성 분석에 매우 유용한 표지자로 활용될 가치가 높다고 판단된다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들이 발견한 LRRC3B 유전자는 다양한 인체조직에서 정상적으로 발현되는 기능성 유전자로, 상기 유전자의 CpG 섬에서의 비정상적인 DNA 메틸화로 인한 기능 소실은 발암의 주요 원인 중의 하나이다. 따라서 본 발명의 LRRC3B 유전자의 비정상적인 DNA 메틸화 측정 또는 LRRC3B 유전자의 발현 정도의 측정은 암 진단에 유용하게 이용될 수 있고 LRRC3B 유전자의 비정상적인 메틸화를 조절하는 약물은 LRRC3B 유전자의 발현을 촉진시켜 항암제로 이용될 수 있으며 더 나아가 본 발명의 LRRC3B 유전자 또는 유전자 산물이 항암활성을 나타내므로 LRRC3B 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체는 항암제로 활용될 수 있다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
<120> LRRC3B
<130> 4P-12-39
<160> 22
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1718
<212> DNA
<213> human LRRC3B cDNA gene
<400> 1
gactgagccg actgcatctc tgggcaagcg gcgctttgcc tctctcctgt ctttgtctgc 60
tcttcctgca aggctacggc gcctggagca gggtctgcag cggccgccgc agcaacgcga 120
gccaagtcgt gccccgcacg gccgcccggg gccgcaccct cgctcggtgg cggcgcccga 180
agacgccagc cgcgccacgc actgcctgcg tcccgcgccc cagccgccgc gcaccaacgc 240
cgccgccttc gccgggagcc aagcccgccg ggccggcccg gtcccaggtg ggcagctcgg 300
cttgcaactg gttggaggtg gcggccgctg cagccctggc agcgggcaca cccctaagca 360
tacgcaccca acgcctcctc cctgagccac gaggatggag cagccacccc ggcccgggac 420
tggcgcaagg tgcccaagca aggaaagaaa taatgaagag acacatgtgt tagctgcagc 480
cttttgaaac acgcaagaag gaaatcaata gtgtggacag ggctggaacc tttaccacgc 540
ttgttggagt agatgaggaa tgggctcgtg attatgctga cattccagca tgaatctggt 600
agacctgtgg ttaacccgtt ccctctccat gtgtctcctc ctacaaagtt ttgttcttat 660
gatactgtgc tttcattctg ccagtatgtg tcccaagggc tgtctttgtt cttcctctgg 720
gggtttaaat gtcacctgta gcaatgcaaa tctcaaggaa atacctagag atcttcctcc 780
tgaaacagtc ttactgtatc tggactccaa tcagatcaca tctattccca atgaaatttt 840
taaggacctc catcaactga gagttctcaa cctgtccaaa aatggcattg agtttatcga 900
tgagcatgcc ttcaaaggag tagctgaaac cttgcagact ctggacttgt ccgacaatcg 960
gattcaaagt gtgcacaaaa atgccttcaa taacctgaag gccagggcca gaattgccaa 1020
caacccctgg cactgcgact gtactctaca gcaagttctg aggagcatgg cgtccaatca 1080
tgagacagcc cacaacgtga tctgtaaaac gtccgtgttg gatgaacatg ctggcagacc 1140
attcctcaat gctgccaacg acgctgacct ttgtaacctc cctaaaaaaa ctaccgatta 1200
tgccatgctg gtcaccatgt ttggctggtt cactatggtg atctcatatg tggtatatta 1260
tgtgaggcaa aatcaggagg atgcccggag acacctcgaa tacttgaaat ccctgccaag 1320
caggcagaag aaagcagatg aacctgatga tattagcact gtggtatagt gtccaaactg 1380
actgtcattg agaaagaaag aaagtagttt gcgattgcag tagaaataag tggtttactt 1440
ctcccatcca ttgtaaacat ttgaaacttt gtatttcagt ttcttttgaa ttatgccact 1500
gctgaacttt taacaaacac tacaacataa ataatttgag tttaggtgat ccacccctta 1560
attgtacccc cgatggtata tttttgagta agctactatt tgaacattag ttagatccat 1620
ctcactattt aataatgaaa tttatttttt taatttaaaa gcgaataaaa ggttaacttt 1680
gaaccatgga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1718
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> human LRRC3B protein
<400> 2
Met Asn Leu Val Asp Leu Trp Leu Thr Arg Ser Leu Ser Met Cys Leu
1 5 10 15
Leu Leu Gln Ser Phe Val Leu Met Ile Leu Cys Phe His Ser Ala Ser
20 25 30
Met Cys Pro Lys Gly Cys Leu Cys Ser Ser Ser Gly Gly Leu Asn Val
35 40 45
Thr Cys Ser Asn Ala Asn Leu Lys Glu Ile Pro Arg Asp Leu Pro Pro
50 55 60
Glu Thr Val Leu Leu Tyr Leu Asp Ser Asn Gln Ile Thr Ser Ile Pro
65 70 75 80
Asn Glu Ile Phe Lys Asp Leu His Gln Leu Arg Val Leu Asn Leu Ser
85 90 95
Lys Asn Gly Ile Glu Phe Ile Asp Glu His Ala Phe Lys Gly Val Ala
100 105 110
Glu Thr Leu Gln Thr Leu Asp Leu Ser Asp Asn Arg Ile Gln Ser Val
115 120 125
His Lys Asn Ala Phe Asn Asn Leu Lys Ala Arg Ala Arg Ile Ala Asn
130 135 140
Asn Pro Trp His Cys Asp Cys Thr Leu Gln Gln Val Leu Arg Ser Met
145 150 155 160
Ala Ser Asn His Glu Thr Ala His Asn Val Ile Cys Lys Thr Ser Val
165 170 175
Leu Asp Glu His Ala Gly Arg Pro Phe Leu Asn Ala Ala Asn Asp Ala
180 185 190
Asp Leu Cys Asn Leu Pro Lys Lys Thr Thr Asp Tyr Ala Met Leu Val
195 200 205
Thr Met Phe Gly Trp Phe Thr Met Val Ile Ser Tyr Val Val Tyr Tyr
210 215 220
Val Arg Gln Asn Gln Glu Asp Ala Arg Arg His Leu Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Ser Leu Pro Ser Arg Gln Lys Lys Ala Asp Glu Pro Asp Asp Ile Ser
245 250 255
Thr Val Val
<210> 3
<211> 807
<212> DNA
<213> CpG island in exon 1 of human LRRC3B gene
<400> 3
agagctgtgt aagggggtgc gaggaaggca ggcgagagca gcagagggag ttaatactcc 60
tacctcagct ggtctccggc agccaacgct cagcccccgc ctcctctctc cattccggac 120
cccgcaaccg cgaggcgaga gagcagcgcc ggcgaggcac tggctgggct ctgactgtca 180
cgttaattcc ctgctgcttt ttctagtccc cagccgcctc gcccctcctc cctcattccc 240
agcctgggtt tggaggcgat ttccctctat tgactgagcc gactgcatct ctgggcaagc 300
ggcgctttgc ctctctcctg tctttgtctg ctcttcctgc aaggctacgg cgcctggagc 360
agggtctgca gcggccgccg cagcaacgcg agccaagtcg tgccccgcac ggccgcccgg 420
ggccgcaccc tcgctcggtg gcggcgcccg aagacgccag ccgcgccacg cactgcctgc 480
gtcccgcgcc ccagccgccg cgcaccaacg ccgccgcctt cgccgggagc caagcccgcc 540
gggccggccc ggtcccaggt gggcagctcg gcttgcagct ggttggaggt ggcggccgct 600
gcagccctgg cagcgggcac acccctaagc atacgcaccc aacgcctcct ccctgagcca 660
cgaggatgga gcagccaccc cggcccggga ctggcgcaag gtaaggtgca gccgcctgtt 720
gcttttcgca gagcgcggga tcatccctct gcccgggtac ctaggccgtc cctccaagga 780
acaagtagag gagaactatt acaccag 807
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> forward primer for CpG 72 cloning
<400> 4
cgagagcagc agagggagt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> reverse primer for CpG 72 cloning
<400> 5
gctctgcgaa aagcaacag 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> forward primer of LRRC3B RT-PCR
<400> 6
ttccctctcc atgtgtctcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> reverse primer of LRRC3B RT-PCR
<400> 7
ccagcatgtt catccaacac 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> forward primer of beta-actin RT-PCR
<400> 8
caagagatgg ccacggctgc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> reverse primer of beta-actin RT-PCR
<400> 9
tccttctgca tcctgtcggc a 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> forward primer of CpG amplification for bisulfite sequencing
<400> 10
tatttttagt ttgggtttg 19
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> reverse primer of CpG amplification for bisulfite sequencing
<400> 11
taattctcct ctacttattc cttaa 25
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> forward primer of MSP#1-M
<400> 12
gcggtcgtcg tagtaacgc 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> reverse primer of MSP#1-M
<400> 13
ccacctccaa ccaactacaa a 21
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> forward primer of MSP#1-U
<400> 14
gtttgtagtg gttgttgtag taatgt 26
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> reverse primer of MSP#1-U
<400> 15
ccaccacctc caaccaact 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> forward primer of MSP#2-M
<400> 16
ggcgttcgaa gacgttagtc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> reverse primer of MSP#2-M
<400> 17
cgacccgacg aacttaactc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> forward primer of MSP#2-U
<400> 18
tgtttggtgg tggtgtttga 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> reverse primer of MSP#2-U
<400> 19
ccaacccaac aaacttaact cc 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> forward primer of LRRC3B-919
<400> 20
ccaagggctg tctttgttct 20
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> reverse primer of LRRC3B-919A
<400> 21
gagtctgcaa ggtttcagct act 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> reverse primer of LRRC3B-919T
<400> 22
gagtctgcaa ggtttcagct aca 23
Claims (17)
- 서열번호 2로 기재되는 LRRC3B 단백질.
- 제 1항의 LRRC3B 단백질을 코딩하는 유전자.
- 제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 기재되는 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제 2항의 LRRC3B 유전자를 포함하는 발현벡터.
- 제 4항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포주.
- 제 2항의 LRRC3B 유전자를 함유하는 항암용 조성물.
- 제 4항의 발현벡터를 함유하는 항암용 조성물.
- 제 5항의 형질전환 세포주를 함유하는 항암용 조성물.
- 서열번호 3으로 기재되는 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메칠화를 조절하는 물질을 함유하는 항암용 조성물.
- 1) 피험자의 조직으로부터 게놈 DNA를 분리 정제하는 단계;2) 단계 1의 게놈 DNA를 변형하는 단계;3) 단계 2의 게놈 DNA 중 LRRC3B의 CpG 섬의 염기서열 일부를 MSP(methylation-sensitive PCR)에 의해 증폭하는 단계;4) 단계 3의 산물로부터 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법.
- 1) 피험자의 암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리 정제하는 단계;2) 단계 1의 게놈 DNA를 DNA의 메틸화에 민감한 제한효소 및 메틸화에 민감하지 않은 제한효소로 절단하는 단계;3) 단계 2의 DNA를 주형으로 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열 일부를 프라이머(primer)로 이용하여 PCR을 수행하는 단계;4) 단계 3의 반응산물의 차이로부터 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법.
- 1) 피험자의 조직으로부터 게놈 DNA를 분리 정제하는 단계;2) 단계 1의 게놈 DNA를 DNA 메틸화에 민감한 제한효소로 절단하는 단계;3) 단계 2의 게놈 DNA를 전기영동한 후 막에 이동시키는 단계;4) 단계 3의 막을 LRRC3B 유전자의 CpG 염기서열에 방사성 동위원소를 표지한 DNA 탐침으로 혼성화 반응을 수행하는 단계;5) 단계 4의 막을 X-선 필름에 노출시켜 LRRC3B 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법.
- 1) 피험자의 조직으로부터 전체 RNA를 분리 정제하는 단계;2) 단계 1의 전체 RNA를 LRRC3B 유전자의 일부 서열로 제작된 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 발현 mRNA를 증폭하는 단계;3) 단계 2의 증폭된 RNA로부터 LRRC3B 유전자의 발현유무를 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법.
- 1) 피험자의 조직으로부터 전체 RNA를 분리 정제하는 단계;2) 단계 1의 전체 RNA를 전기영동 한 후 막에 이동시키는 단계;3) 단계 2의 막을 방사성 동위원소를 표지한 LRRC3B 유전자를 RNA 탐침으로 혼성화 반응을 수행하는 단계;4) 단계 3의 막을 X-선 필름에 노출시켜 LRRC3B 유전자의 발현량을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단방법.
- 제 10항 내지 제 14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 1)의 조직은 암 조직 또는 혈액 조직인 것을 특징으로 하는 단계.
- LRRC3B 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 마이크로 칩(microchip).
- 서열번호 1로 기재되는 염기서열의 919번째 염기의 SNP을 이용하여 질병을 진단하는 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020050008495A KR100748185B1 (ko) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | Ｌｒｒｃ3ｂ 유전자를 포함하는 항암용 조성물 및 상기유전자를 이용한 진단방법 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111793693A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-10-20 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100475649B1 (ko) * | 2001-01-29 | 2005-03-10 | 배석철 | 항암활성을 나타내는 ｒｕｎｘ３ 유전자 및 그의 용도 |
-
2005
- 2005-01-31 KR KR1020050008495A patent/KR100748185B1/ko not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111793693A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-10-20 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用 |
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|---|---|
| KR100748185B1 (ko) | 2007-08-10 |
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