KR20060033899A - Ｔ 세포 수용체 서열, 및 류마티스 관절염을 검출 및치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2에 개시되어 있는 핵산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 DNA 단편, 및 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL, 서열번호 5, 서열번호 169 및 서열번호 170으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 펩티드를 제공하며, 또한 상기 DNA 단편 및/또는 펩티드의 1개 이상으로부터 생성된 백신, 항체 및 약학적 조성물을 제공하고, 추가로 류마티스 관절염을 검출 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

Ｔ 세포 수용체 서열, 및 류마티스 관절염을 검출 및 치료하는 방법{T CELL RECEPTOR SEQUENCE AND METHOD FOR DETECTING AND TREATING RHEUMATOID ARTHRITIS}

본 발명은 통상적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 류마티스 관절염을 진단하고 치료하는 방법 및 T 세포 수용체의 특이적 서열에 관한 것이다.

성숙한 T 림프구 표면의 항원을 인식하는 수용체(T-세포 항원 수용체 또는 TCR)는 면역글로불린의 표면 항원과 유사한 구조를 갖는다. 따라서 상기는 α및 β당단백 사슬 또는 γ및 δ당단백 사슬을 포함하는 헤테로다이머형 구조를 함유한다.

T-세포 수용체의 디렉토리로 광범위하게 다양한 항원 결정 인자(antigenic determinant)를 설명할 수 있어야 한다. 상기는 T-세포 수용체의 상이한 구조 영역을 암호화하는 상이한 불연속 유전자 부위를 유전자 재조합(genetic recombination)시킴으로써 수득된다. 따라서 상기 유전자는 V 부위(가변성 부위), 선택적으로 D 부위(다양성 부위), J 부위(연결 부위) 및 C 부위(불변 부위)를 함유 한다. T-세포는 분화하기 때문에 α및 β유전자 자리에 대한 V 및 J 부위와 β및 δ유전자 자리에 대한 V, D 및 J 부위의 재조합으로 특이 유전자를 제조한다. 이러한 특이 재조합뿐만 아니라 2개의 사슬이 쌍(pairing)을 이룸으로써 결합성 다양성이 만들어진다. 상기 다양성은 2개의 보조적 기작, 즉 V-D-J 또는 V-J 부위의 불명확한 재조합, 및 N 영역에 대응하는 뉴클레오티드를 첨가함으로써 매우 다양하게 증폭된다(Davis et al., 1988). T-세포 수용체(TCR) α및 β사슬을 암호화하는 유전자는 각각 Vα, Jα및 Cα 또는 Vβ, Jβ, Dβ 및 Cβ부위를 재조합시킴으로써 제조된다.

70개 이상의 Vα및 Vβ유전자 부위는 분자적으로 특성이 밝혀져 있으며, 이들의 암호화 영역내 유사한 서열을 기준으로 각각 29 아과 및 25 아과로 분류된다. 이러한 독특한 수준의 TCR 다양성으로 MHC 분자에 연결된 짧은 펩티드의 다양성이 다양할 수 있는 다양한 T 세포 레퍼토리가 만들어 진다. V(D)J 연결에 의해 암호화된 영역-3(CDR3)-유사 루프를 결정하는 고가변성 상보성은 항원 펩티드와 직접 상호작용하는 것으로 생각된다. TCR 폴리펩티드 분석은 T 세포 반응을 정확하게 분석하는 방법이다.

류마티스 관절염(RA)은 말단 관절(peripheral joint) 활액막(synovium)의 만성적인 감염이 특징이며, T-세포가 질병 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다(Lee et al., 2001 및 Lipsky et al., 1998). 상기는 코카서스인(Caucasian) RA 질환자에서 DR4(유전자형 B1^*0404와 DRB1^*0401)와 DQ(DQB1^*0302와 DQB1^*0301)를 포함 하는 MHC 클래스 II 유전자와 밀접하게 관련되어 있는 RA의 활액막에 Th1 염증매개성 세포(pro-inflammatory cell)의 현저한 침투(infiltration)와 축적(accumulation)에 의해서도 확인된다(Kerlan-Candon et al., 2001; MacGregor et al., 1995; 및 Fries et al., 2002). 추가로 상기 이론을 지지하는 증거로는 병에 걸린 관절에 T 세포의 침투성 클론이 팽창되고 T 세포 중재 감염에 유리한 사이토카인 환경으로 스큐잉(skewing)되는 것을 포함한다(Dolhain et al., 1996; Berner et al., 2000; Davis et al., 2001; Goronzy et al., 1994; Struyk et al., 1993; Gonzalez-Quintial et al., 1996; 및 Alam et al., 1996). 그러나, 류마티스 활액막에 침투하는 T 세포에 특이적인 항원은 알려져 있지 않다. 콜라겐 타입 II, 열 충격 단백질(heat shock protein) 및 기타를 포함하는 몇가지의 자가 항원은 RA 질환자에서 이러한 항원에 T 세포 반응성을 기본으로 하는 RA와 관련이 있다(Londei et al., 1989; Pope et al., 1989; Devereux et al., 1991; 및 Res et al., 1994). 미생물 항원(microbial antigen), 예컨대 미생물 항원(mycobacterial antigen)과 스타필로코커스 초항원(superantigen)도 또한 RA에서 T 세포 활성에 기여할 수 있다(Paliard et al., 1991 및 Holoshitz et al., 1986). 그러나 상기 항원 중 어떤 것에 반응하는 T 세포가 임상적으로 RA에 관련이 있는지의 여부는 명확하지 않다.

RA와 관련된 유발 항원(들) 없이 RA 질환자의 활액막 또는 활액(synovial fluid)로부터 유도되는 침투성 T 세포의 T 세포 수용체(TCR)의 구조적 특성을 규명하려는 시도가 있었다. 류마티스 활액막과 관련된 T 세포의 특이 클로노타입(clonotype) 또는 통상적인 TCR 구조 특성(들)로 상기 침투성 T 세포가 활성화되 고, 활액막 중에 영속시키는 기작을 더 많이 이해할 수 있게 되고, 잠재적으로는 새로운 치료적인 전략을 세울 수 있을 것으로 희망했었다. 자가 또는 환경적 항원의 반응과 개개의 유전적 배경에 의해 T 세포 수용체 레파토리가 형성되기 때문에 유사한 MHC 클래스 II 분자와 관련된 항원-유도 자극으로 보통의 V-D-J 부위를 이용한 T 세포의 올리고클론성 팽창(oligoclonal expansion)이 유도된다. 한편으로 초항원 자극에 의해 유도되는 T 세포 활성은 상이한 D-J 부위를 갖는 특정 TCR BV 유전자 군의 폴리클론성 팽창이 특징이다. 따라서 류마티스 활액막에 T 세포 사이의 제3 상보적 결정 영역(CDR3)의 구조 특성과 BV 유전자 분포 패턴을 설명하는 것이 중요하다.

코카서스인 RA 질환자에 대한 다수의 연구에서는 T 세포의 TCR BV의 유용성은 활액으로부터 유도되고, 어떤 경우에는 RA 질환자의 활액막은 BV14, BV17 및 몇가지의 다른 것들을 포함하는 BV 유전자를 포함하는 것으로 다양하게 스큐잉되는 것을 보여주었다(Zagon et al., 1994; Alam et al., 1995; VanderBorght et al., 2000; Jenkins et al., 1993; 및 Williams et al., 1992). 과발현 BV 유전자의 CDR3의 분석으로 RA 질환자의 질병이 있는 관절 중에 T 세포 클로날 팽창을 알 수 있는, 류마티스 활액막에는 존재하지만 주변 T 세포에는 존재하지 않는 몇 가지의 클로노타입이 밝혀졌다(Li et al., 1994; Mima et al., 1999; 및 Davey et al., 1997). 그러나 RA 활액 또는 활액막 중의 침투성 T 세포의 TCR BV 유전자의 유용성과 클론성(clonality)은 비교적 불균일하며, 보통 또는 반-정량적인 PCR을 사용하는 BV 유전자 분석이 복잡하다. 상기는 다른 연구에서 기록된 RA 활액 T 세포의 CDR3 구조 특성과 과발현 BV 유전자의 검출에서의 현저한 다양성을 설명하는데 도움을 줄 수 있을 것이다. 또한 RA에서 보여지는 침투성 T 세포의 비교적 다양한 클론성은 보통 CDR3 구조 특성을 규명하는 어려움을 크게 증가시킨다. RA의 활액 TCR 전사에서 통상적으로 발견되는 다중 CDR3 사이징 피크는 원하는 클로노타입을 밝히기 위해서 다수의 BV 유전자와 BJ 유전자(25 BV와 13 BJ 유전자)에 의해 증가되는 경우 각 샘플을 수백 수천번 측정해야 한다(Even et al., 1995).

US 특허 제6,159,470호에서는 T 세포를 사멸시키거나 또는 T 세포의 증식을 억제시키기 위해서 Vβ17과 특이적으로 반응하는 유효량의 세포독성 또는 세포증식억제성 제제(상기 제제는 항원임)와 사람 중의 T 세포 함유 Vβ를 결합시키는 단계를 포함하는 인간의 류마티스 관절염을 치료하는 방법을 개시하고 있다.

US 특허 제5,985,552호에서는 사람에게서 류마티스 관절염에 감수성을 예견하거나 또는 진단하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은 류마티스 관절염에 감수성 또는 류마티스 관절염을 나타내는 보통 사람들의 수준을 비교하여 Vβ14-함유 또는 Vβ17-함유 T 세포 수용체의 비정상 수준의 존재하에 이들의 표면에 Vβ14-함유 또는 Vβ17-함유 T 세포 수용체를 갖는 사람의 T 세포로부터 분리된 샘플에서의 수준을 선별적으로 검출하는 단계를 포함한다.

US 특허 제6,207,645호에서는 류마티스 관절염으로 고생하는 질환자의 면역 반응을 유발하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은 단일 사슬 T 세포 수용체 다양성 베타 3, 14 또는 17 펩티드, 또는 이의 단편들을 암호화하는 핵산 서열에 연결된 작동가능한 프로모터를 포함하는 플라스미드 벡터를 질환자의 근육 조직에 직접 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 서열은 질환자 중의 암호화된 펩티드에 대항하는 면역 반응을 유발하기 위한 효과적인 수준으로 근육 조직에서 발현된다.

US 특허 제6,221,352에서는 류마티스 관절염이 있는 질환자에 Vβ17-발현 T 세포의 증식을 예방하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은 유효량의 세포독성 또는 세포증식억제성 제제를 질환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제제는 항체를 포함하고, 상기 항체는 T 세포에 의해 발현되는 Vβ14와 선별적으로 결합한다.

Mima 등은 우성 CDR3 서열, 즉 CASS-PRERATYEQ가 두명의 다른 질환자의 류마티스 관절의 V베타14⁺ T 세포에서 발견되었다는 것을 발표하였다. 류마티스 활액막과 관련된 T 세포의 특이 클로노타입 또는 보통의 TCR 구조 특성(들)으로 상기 침투성 T 세포가 활성화되고, 활액막에서 영속되는 기작을 더 잘 이해하게 될 수 있었고, 새로운 치료 전략이 잠재적으로 유도될 수 있다. 따라서 류마티스 관절염을 진단하고 치료하는 효과적인 방법과 류마티스 관절염 질환자와 관련된 T 세포의 TCR 서열 특성을 규명하는 것을 오랫동안 지속해야 한다. 본 발명은 당업에서 이러한 오랫동안의 기다림을 만족시켰다.

발명의 요약

본 발명은 류마티스 관절염(RA) 질환자의 T 세포 수용체의 각각 Vβ14 군(BV14 유전자)과 Vβ16 군(BV16 유전자) 중의 상보적 결정 영역-3(CDR3)의 일부인 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 DNA 단편에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열번호 1과 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 DNA 단편을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염으로 고생하는 질환자들의 T 세포 수용체 베타-사슬 BV14(서열번호 3과 SLS) 또는 BV16(서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5) 유전자의 CDR3로부터 유도된 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 펩티드에 대항하는 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염으로 고통받는 질환자의 BV14와 BV16으로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 유전자의 CDR3으로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 1개 이상의 펩티드를 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염으로 고통받는 질환자의 T 세포 수용체 베타-사슬 BV14 유전자의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유도된 서열번호 169로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 펩티드에 대항하는 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염으로 고통받는 질환자의 T 세포 수용체 베타-사슬 BV16 유전자의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유도된 서열번호 170으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 실질적으로 순수하고 분리된 펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 펩티드에 대항하는 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염으로 고통받는 질환자의 BV14와 BV16으로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 유전자의 CDR2로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 1개 이상의 펩티드를 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 류마티스 관절염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 각각 의심되는 사람과 정상인으로부터 채취한 조직 샘플을 수득하는 단계; 상기 조직 샘플에서 T 세포 수용체의 BV14 및/또는 BV16의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 의심되는 사람과 정상인에서의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 것이 유리하다. BV14 및/또는 BV16이 정상인에서 보다 의심되는 사람에서 실질적으로 더 높은 수준으로 발현된다면, 의심되는 사람에게는 류마티스 관절염이 있는 것을 나타낸다.

본 발명은 추가로 중국인 개개의 사람에게서 류마티스 관절염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 의심되는 사람과 정상인 각각에서 조직 샘플을 수득하는 단계; 상기 조직 샘플에서 T 세포 수용체의 BV16의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 의심되는 사람과 정상인의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 것이 유리하다. BV16이 정상인에서보다 의심되는 사람에게서 실질적으로 더 높은 수준으로 발현된다면 중국 사람 중 상기 의심되는 사람은 류마티스 관절염이 있는 것을 나타낸다.

본 발명은 추가로 류마티스 관절염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 1과 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖는 DNA 단편에 상보적 프로브를 제조시키는 단계; 의심되는 사람에서 조직 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 조직 샘플과 프로브를 혼합하는 단계를 포함하는 것이 유리하다. 상기 방법에서 양성 하이브리드화 신호(positive hybridization signal)는 의심되는 사람에게 류마티스 관절염이 검출될 가능성을 나타낸다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대항하는 항체를 제조시키는 단계; 의심되는 개인의 조직 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 조직 샘플과 항체를 혼합하는 단계를 포함하는 것이 유리한다. 상기 방법에서 양성 신호는 의심되는 사람에게서 류마티스 관절염이 검출되었다는 가능성을 나타낸다.

본 발명은 또한 면역 반응을 유발하기 위해 유효량의 면역유전성 T 세포 수용체 펩티드를 사람에게 투여함으로써 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 펩티드는 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대항하는 유효량의 항체를 사람에게 투여함으로써 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 단일 사슬 T 세포 수용체 다양성 베타 16(Vβ16) 펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 DNA 단편에 연결된 작동성 프로모터를 포함하는 DNA 발 현 벡터를 사람에게 투여하고, 이후에 사람에게서 이러한 DNA 단편을 발현시키는 단계를 포함하는 것이 유리하다. 상기 방법에서 DNA 단편은 암호화된 펩티드에 대한 면역 반응을 유발하기에 충분한 수준으로 발현되며, 이에 따라 사람의 류마티스 관절염을 치료하거나 또는 류마티스 관절염의 발병을 예방한다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 단일 사슬 T 세포 수용체 다양성 베타 14(Vβ14) 펩티드, 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 DNA 단편과 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 발현 벡터를 사람에게 투여하고, 이후에 사람에게서 이러한 DNA 단편을 발현시키는 단계를 포함하는 것이 유리하다. 상기 방법에서 핵산 서열은 서열번호 1으로 나타내는 서열을 포함한다. 사람에게 들어감에 따라 DNA 단편은 암호화된 펩티드에 대한 면역 반응을 유발하기에 충분한 수준으로 발현되며, 이에 따라 사람에게서 류마티스 관절염을 치료하거나 또는 류마티스 관절염의 발현을 예방한다.

본 발명은 또한 류마티스 관절염으로 고통받는 사람에게서 병원성 T 세포 반응을 억제시키기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 단일 사슬 T 세포 수용체 다양성 베타 14(Vβ14) 또는 16(Vβ16), 또는 이의 단편으로부터 유도된 면역학적으로 유효량인 펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것이 유리하다.

본 발명의 전술한 잇점과 또 다른 잇점은 첨부한 도면과 함께 본 발명의 바람직한 실시양태의 하기에서 설명하는 상세한 설명으로부터 당업에 통상의 지식을 가진 자들에게 명백할 것이다.

하기 도면은 본 명세서의 일부이며, 추가로 본 발명의 특정 측면을 설명하기 위해서 포함하였다. 본 발명은 여기에서 설명하는 특이 실시양태의 상세한 설명과 함께 1개 이상의 도면을 참조하면 보다 이해가 용이할 수 있다.

도 1A는 25 BV 군과 BC 유전자에 특이적인 일련의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 PCR 증폭 효율을 나타낸다. 도 1B는 4명의 건강한 사람으로부터 개별적으로 제조된 말초 혈액 단핵 세포의 실시간 PCR 분석 결과를 나타낸다[상기 세포는 독성 쇼크 증후군 독소(toxic shock syndrome toxin)이 존재하거나 존재하지 않고 배양됨].

도 2는 실시간 PCR 분석으로 조절되고 RA 질환자의 활액 및 혈액 견본의 BV 유전자 분포를 나타낸다. BV 유전자 분포는 Y 축 상에 BC 발현에 대한 각 BV 유전자 발현의 평균 %로 나타내었다. 스튜던트 t 시험(student t test)은 견본 군 사이의 BV14와 BV16 발현에서의 통계적 차이를 계산하기 위해 사용하였다. 별표는 통계적으로 현저한 차이를 나타낸다(p＜0.05).

도 3은 유세포 분류(flow cytometry)의 흐름에 의한 SF와 ST 견본의 TCR Vβ14와 Vβ16의 발현 분석을 나타낸다.

도 4는 BV14 유전자가 5‘BV14-3'BC 특이 프라이머 쌍을 BV14-BJ-3'BC 사이의 서열 영역을 분석하기 위해서 사용하는 경우에 RA 질환자로부터 유도된 활액(SF)과 ST 견본 둘 다의 이종의 CDR3 길이 프로파일을 나타낸다는 것을 보여준다.

도 5는 BV16 유전자가 5‘BV16-3'BC 특이 프라이머 쌍을 BV16-BJ-3'BC 사이의 서열 영역을 분석하기 위해서 사용하는 경우 RA 질환자로부터 유도된 SF와 ST 견본 둘 다에서의 이종유전자 CDR3 길이 프로필을 나타낸다는 것을 보여준다.

도 6은 OA 조절의 BV14와 BV16 전사의 5‘BV-3'BC 영역의 CDR3 길이 분석을 나타낸다.

도 7은 각각 13 사람의 BJ 유전자에 특이적인 일련의 프라이머, 및 BV14 또는 BV16 프라이머를 사용하는 면역기에 의해 CDR3 길이 프로파일에 대해 분석된 BV14와 BV16 전자의 결과를 나타낸다.

도 8은 유사한 CDR3 길이로 재조합된 동일한 BV와 BJ를 갖는 대표적인 클로형 패턴을 나타낸다.

본 발명의 이해를 돕기위하여, 이후에 사용되는 용어에 대해서 하기에 정의하였다.

"PCR"은 폴리머라제 연쇄 반응을 의미하며, 예를들면 통상적으로 U.S. 특허 제4,683,202호에 기술되어 있다. PCR은 선택된 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머를 중합 제제(예컨대, 폴리머라제)의 존재하에 핵산 주형에 하이브리드화시키고, 4개의 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 연장(extension) 생성물을 상기 프라이머로부터 형성시키는 증폭 기술이다. 그리고 상기 생성물을 변성시키고, 존재하는 핵산의 수와 양을 증폭시켜서 연이어 이들을 검출하는데 용이하게 하는 사이클링 반응(cycling reaction)에서 주형으로 사용한다. 다양한 PCR 기술이 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 방법으로 사용될 수 있다.

"프라이머(primer)"는 천연의 또는 합성의 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 주형 분자 상에 특이적 DNA 서열에 상보적인 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.

"초항원(superantigen)"은 T 세포 수용체(TCR)의 β 사슬 상의 특이적 부위에서 T 세포에 우선적으로 결합하여 매우 높은 빈도율(frequency rate)로 T 세포를 자극하는 항원 또는 이의 단편을 의미한다. 초항원은 특이적 Vβ에 결합함으로써 T 세포를 활성화시킨다. 다양한 TCR의 초항원 결합 부위는 TCR의 종래의 고가변성 상보적 결정 영역(hypervariable complementary determining region, CDR)과는 구별된다. 상기 CDR은 MHC와 착화되는 종래의 항원과 결합하는 것으로 사료되는 TCR 영역을 나타낸다.

"Vβ14"는 T 세포 수용체의 특이적 인간 β사슬 가변 영역을 나타낸다. Vβ14는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

"Vβ16"은 T 세포 수용체의 특이적 인간 β 사슬 가변 영역을 나타낸다. Vβ16은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

"단편(fragment)"은 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 아미노산 서열의 면역원성(immunogenically)의 유효 서브세트(subset)를 의미한다. 상기 용어는 부가의 서열 또는 성분들과 접합하거나 또는 결합하는 단편들을 포함하는 것이며, 상기 펩티드는 다른 아미노산 서열 또는 담체(carrier)에 결합된다.

"상보적 결정 영역-3(complementary determining region-3, CDR3)"은 V(D)J 영역으로 알려져 있다. 성숙(maturation)하기 이전에 V, D 및 J 영역 유전자의 재조합으로 인해서, 상기 영역을 가로지르는 아미노산 서열은 각각의 T 세포 및 이의 클론에만 실질적으로 존재한다. CDR3 또는 이의 단편은 본 발명의 백신으로서 유용하며, 이는 상기 영역에 해당하는 펩티드에 의해서 확인되는 T 세포 면역은 특정 항원에 대해서 매우 특이적일 것으로 기대된다.

"상보적 결정 영역-2(complementary determining region-2, CDR2)"는 V(D)J 영역으로 알려져 있다. 성숙하기 이전에 V, D 및 J 영역 유전자의 재조합으로 인해서, 상기 영역을 가로지르는 아미노산 서열은 각각의 T 세포 및 이의 클론에만 실질적으로 존재한다. CDR2 또는 이의 단편은 본 발명의 백신으로서 유용하며, 이는 상기 영역에 해당하는 펩티드에 의해서 확인되는 T 세포 면역은 특정 항원에 대해서 매우 특이적일 것으로 기대된다.

본 발명은 중국인 RA 질환자 그룹의 활물질(synovial material)로부터 유래된 침투성(infiltrating) T 세포의 BV 사용 패턴을 조사하였고, 중국인 RA 질환자의 인간 백혈구 항원(HLA) 배경은 코카서스인(caucasian) 질환자와는 상이하여, HLA와 BV 유전자 분포의 가능한 조합을 결정한다. 통상의 클로노타입(clonotype) 및 CDR3 구조적 특성은 상이한 RA 질환자로부터 활액(synovial) T 세포의 과발현된 BV 전사물 중에서 확인할 수 있다. 상기 분석은 질환자의 활물질 및 혈액으로부터 생체외(ex vivo)로 유래된 TCR 전사물로 실시되어진다. 시험관내(in vitro) 배양은 요구되지 않으며, 비스듬하게 도입한다. 류마티스 활막(synovium) 중에 침투성 T 세포는 RA-결합된 DR 또는 DQ 분자 중에 통상의 자기 항원 또는 미생물 항원에 의해 유도된다. 상기 T 세포는 상이한 개체들 사이에서 공통 또는 공유된 TCR 구조적 특징을 나타낸다. 주된 접근법으로는 먼저 정량적 실시간 PCR에 의해서 류마티스 활막 중의 과발현된 BV 유전자(들)를 측정하는 것이다. 상기 분석은 명확한 RA 질환자 그룹과 골관절염(OA) 질환자의 대조군 그룹의 말초 혈액(PB), 활액(SF) 및 활액 병변 조직(synovial lesion tissue, ST)에서 실시하였다. 일련의 CDR3 길이 분석은 면역기(immunoscope) 기술에 의해서 상기 영역내에서 5'BV-3'BC [클론성 분석(clonality analysis)]를 스캐닝함으로써 실시되었다. V-D-J 영역내에 다수 피크들의 개개의 CDR3 길이는 BV 및 BJ 특이적 프라이머를 사용하여 추가로 절단하여 유사한 CDR3 길이를 갖는 동일한 BV 및 BJ 유전자를 사용하는 공통의 클로노타입을 확인한다.

중국인 RA 질환자의 활액 병변 조직으로부터 유래된 침투성 T 세포는 BV14 및 BV16에 대한 BV 유전자 분포의 현저한 스큐잉(skewing)을 나타낸다. 상기 분석은 실시간 PCR을 사용하여 중국인 RA 질환자 그룹에서 정량적으로 실시되며, 이전 연구에서 사용된 정규 또는 반-정량적 PCR보다 중요한 기술적인 잇점을 갖는다. 활막에서 볼 수 있는 스큐잉된 BV14 패턴은 한쌍의 활액에서는 나타나지 않지만, BV16의 과발현은 활액 중에 남아있다. RA의 활막 구획 중에 BV14 및 BV16 T 세포의 선택적 활성화 및 축적을 나타낸다. 과발현된 BV14 유전자가 RA 활액 및 활막으로부터 유래된 T 세포 중에서 보고되었음에도 불구하고, RA의 활액 T 세포 중에 과발현된 BV16의 발견은 아직 보고되어 있지 않다는 것은 흥미롭다. 더우기, 코카서스인 RA 질환자에서 기술된 스큐잉된(skewing) BV17 유전자 및 다른 BV 유전자(Zagon et al., 1994; Alam et al., 1995; VanderBorght et al., 2000; Jenkins et al., 1993; and Williams et al., 1992)는 상기 연구에서 검출되지 않았다. BV16 유전자의 과발현, 스큐잉된 BV17 유전자의 부족 및 수개의 다른 BV 유전자들은 특징적으로 중국인 RA 질환자과 연관될 수 있으며, BV14 스큐잉(skewing)은 RA를 갖는 코카서스인 질환자와 RA를 갖는 중국인 질환자에서 공통된다. BV 유전자 스큐잉에서 상기와 같은 차이는 지리적 의미의 환경적 요인 및 유전적 배경(예컨대, HLA 유전자)에서 기인될 수 있다. 이점에 있어서, 상기 중국인 RA 질환자 그룹은 우선적으로 DRB1*0405(43% 질환자)와 결합되며, 코카서스인 RA 질환자들과 밀접하게 연관된 DR4의 다른 2개의 유전자형(DRB1*0404 및 DRB1*0401)과는 구별된다(Kerlan-Candon et al., 2001; MacGregor et al., 1995; and Fries et al., 2002). 또한 본 연구는 RA 질환자에 있어서 활액 T 세포 중에 과발현된 BV16(BV14는 아님)과 DRB1*0405 사이의 상관관계에 대한 경향을 제공한다. 그러나 상기 시료의 크기가 너무 작아서 유효 통계 분석을 실시할 수 없다. 대조적으로, 이들 RA 질환자들에 있어서 BV16 및 BV14의 발현 수준과, DR 및 DQ 유전자형에 종종 사용되는 다른 것 사이에서 상관관계는 발견되지 않았다. 이러한 발견은 개체의 HLA 유전자형 및 인종적 배경은 RA에 있어서 활액 침투성 T 세포의 BV 스큐잉에 영향을 줄 수 있다는 개념을 지지하며, 본 연구에서 기술된 바와 같은 상기 중국인 RA 인구에서 BV16의 특징적인 과발현에 대한 설명을 제공한다.

활액 T 세포의 BV14 및 BV16의 과발현은 활막(synovium)내 자기항원 자극(autoantigen stimulation)으로부터 기인하는지의 여부 또는 통상의 감염 제제(들)과 연관된 초항원(superantigen)에 의해서 유도되는지의 여부를 설명하기위해 중요하다. 스큐잉된 BV 유전자의 클론성(clonality) 분석으로 증거를 제공할 수 있다. 즉, T 세포의 항원 자극으로 올리고클론성 팽창시키고, 초항원-유도된 BV 유전자 스큐잉은 폴리클론성 팽창과 특징적으로 연관되며, V-D-J 결합 영역의 면역기 패턴에 의해서 구별될 수 있다. 상기 연구에서, 과발현된 BV14 및 BV16의 클론성은 상대적으로 이종성을 보인다. 수개의 병변 조직은 매우 제한적인 올리고클론성 패턴을 나타내며, 다른 것은 폴리클론성 프로필을 나타낸다. 이러한 발견은 몇가지 경우에 과발현된 BV는 자기항원(들)에 의해서 유도되는 시나리오(scenario)를 제공한다. 그러나, 다른 경우에, 다수의 자기항원과 초항원의 관련 사이의 구별이 어려우며, 2가지 상황은 폴리클론성 프로필에 대한 V-D-J 영역의 클론성 패턴에서 전이를 일으킨다. 상기 가능성은 질병의 이후의 클론성 단계에서, 침투성 T 세포의 클론성은 불명료하며, 이종성의 침투성 T 세포의 다양성은 류마티스 활막에서 생성된 다양한 케모카인(chemokine) 및 사이토킨(cytokine)을 포함하는 비특이적 기작을 통해서 보충된다.

BV14 또는 BV16의 과발현은 동시계류중인 출원 제60/439,096호에 개시된 실시간 PCR법에 의해서 측정될 수 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 통합된다. 실시간 PCR법은 표 1에 개시된 올리고뉴클레오티드 서열 BV1-BV25(서열번호 8-57) 및 BC(서열번호 58 및 59)의 특이적 포워드 프라이머(forward primer) 및 리버스 프라이머(reverse primer) 세트를 사용한다. 상기 프라이머 세트는 동일한 효율로 상이한 TCRBV 유전자 및 TCRBC 유전자를 증폭시키므로, 원래 시료는 PCR에 의한 증폭 이후에 정확하게 정량화될 수 있다.

본 발명은 또한 류마티스 활막 중에 과발현된 BV14 및 BV16을 나타내는 침투성 T 세포 사이의 특이적 CDR3 서열 및 공통의 CDR3 서열 모티프를 동정한다. BV14 및 BV16의 활액 T 세포는 유사한 HLA 배경의 상황에서 RA와 연관된 몇가지 공통의 자기항원(들)에 의해서 유도되며, T 세포 수용체 레퍼토리(repertoire)는 상이한 RA 질환자들 사이의 동일한 CDR3 또는 공통의 CDR3 구조적 특징의 T 세포 개체를 발현시키는 질병의 과정동안 증가될 수 있다. 과발현된 BV14 및 BV16의 V-D-J 영역 패턴은 상대적으로 다양하기 때문에, 상기 시도는 매우 어려운 작업이다. 먼저 본 연구는 과발현된 BV14 및 BV16에서 공통의 우세한 V-D-J 서열 패턴에 따라 그룹된 유사한 클로노타입을 동정한다. 이후에 상기 공통의 클로노타입을 함유하는 전사물(transcript)은 CDR3 서열에 대해서 클로닝 및 분석된다. 상기에서 기술된 발견된 사항은 상기 공통의 클로노타입은 RA를 앓고 있는 상이한 질환자들 사이에서 유도되는 활액 병변에서 동일한 V-D-J 서열을 갖는 것이 확인되었다. 2개의 동일한 CDR3 서열이 상이한 질환자들 사이의 RA 병변에서 검출될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 이러한 관찰은 CDR3 서열이 2명의 RA 질환자들의 활액 조직에서 발견되었다는 이전 보고서와 동일한다(Mima et al., 1999). 상기 결과는 수초기저단백질(myelin basic protein, MBP), 다발성경화증(multiple sclerosis, MS)의 후보 자기항원을 인식하는 T 세포들 사이의 유사한 발견을 연상시킨다. Oksenberg 및 그의 동료들은 MS 질환자의 뇌 병변의 부검 물질로부터 유도된 TCR은 상이한 MS 질환자들로부터 발생된 특징적인 MBP-특이적 T 세포 클론의 것과 동일한 V-D-J 서열을 공유하는 것을 입증하였고, MS 뇌 병변 중의 MBP-반응성인 T 세포의 존재를 확인하였다(Hong et al., 1999). 최근에 공통의 CDR3 서열이 MBP-반응성 T 세포 중에서 보고되었으며, MS 질환자들의 상당 부분이 MBP의 면역우성 (immunodominant) 펩티드를 인식한다(Moreland et al., 1998).

또한, 과발현된 BV14+ 및 BV16+의 서열 분석으로 상이한 RA 질환자들 중에 활액 T 세포 사이에서 공유되거나 또는 공통된 다수의 CDR3 서열 모티프를 나타낸다. 다시, 이러한 발견은 과발현된 BV14 및 BV16의 CDR3이 랜덤(random)하지 않으며, RA와 잠재적으로 연관된 공통되지만 아직 확인되지 않은 자기항원(들)에 대한 T 세포 반응으로부터 기인될 수 있다는 의견을 지지한다. 이는 몇개의 병변 조직은 V-D-J 영역의 면역기 분석에 의한 매우 제한된 올리고클론성 패턴을 나타내는 본 연구에서 기술된 관찰과 일치된다. 그러나 동일한 특이성 및 제한을 갖는 BV 유전자의 서열 모티프는 매우 복잡하며, 화학적으로 보존된 곁사슬을 갖는 각 위치에서 비(非)인접한 잔기 및 아미노산을 포함한다. 또한, 면역기(immunoscope)에 의한 클로노타입 분석은 스큐잉된 BV 유전자(들)의 >20%의 발현 수준의 선택된 시료에 한정되며 DNA 클로닝/시퀀싱은 대표적인 클로노타입에서 선택적으로 실시되기 때문에, 확인된 CDR3 서열에 상응하는 서열-특이성 프라이머(SSP)를 사용하는 추가의 조사로 중국인 RA 질환자들 대부분의 활액 물질에서 CDR3 구조적 특징의 실제 빈도를 평가하는데 도움을 준다.

또한, 본 발명은 류마티스 활막에서 과발현된 BV14 및 BV16 개체를 나타내는 침투성 T 세포들 사이의 특이적 CDR2 서열을 동정한다. 추가의 연구가 CDR2 구조적 특징에서 실시될 것이다.

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2에 개시된 핵산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 DNA 단편에 관한 것으로서, 상기 DNA 단편은 각각 류마티스 관절염(RA)을 앓고 있는 질환자에서 T 세포 수용체들 중의 Vβ14(BV14 유전자) 및 Vβ16(BV16 유전자)내에 상보적 결정 영역-3(CDR3)의 일부이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 DNA 단편을 포함하는 백신(vaccine)에 관한 것이다. 바람직하게, DNA 단편은 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 10㎎/㎖의 농도로 존재한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체 중에 T 세포 수용체 베타-사슬 BV 16(서열번호 3 및 SLS) 또는 BV14(서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5) 유전자의 CDR3으로부터 유래된다. 또한 상기 펩티드에 직접 대항하는 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 BV14 및 BV16으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 유전자의 CDR3으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 1개 이상 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 169에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 T 세포 수용체 베타-사슬 BV14 유전자의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유래된다. 또한, 상기 펩티드에 직접 대항하는 항체를 제공한다.

본 발명은 서열번호 170에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 T 세포 수용체 베타-사슬 BV16 유전자의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유래된다. 또한, 상기 펩티드에 직접 대항하는 항체를 제공한다.

본 발명은 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 BV14 및 BV16으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 유전자의 CDR2로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 1개 이상 포함하는 백신에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 류마티스 관절염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 유익하게 상기 방법은 의심되는 개체와 정상 개체로부터 조직 시료(tissue sample)를 각각 수득하는 단계; 상기 조직 시료내 T 세포 수용체의 BV14 및/또는 BV16의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 의심되는 개체 및 정상 개체에서 발현 수준을 비교하는 단계를 포함한다. BV14 및/또는 BV16은 정상 개체에서보다 의심되는 개체 중에서 실질적으로 더 높은 수준으로 발현된다면, 상기 개체는 류마티스 관절염을 가질 것으로 나타낸다. 바람직하게, 상기 조직 시료는 활액(synovial fluid), 활액 병변 조직(synovial lesion tissue), 또는 말초 혈액(peripheral blood)으로부터 수득될 수 있다.

또한, 본 발명은 중국인 개체에서 류마티스 관절염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 의심되는 개체와 정상 개체로부터 조직 시료(tissue sample)를 각각 수득하는 단계; 상기 조직 시료내 T 세포 수용체의 BV16의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 의심되는 개체 및 정상 개체에서 발현 수준을 비교하는 단계를 포함한다. BV16은 정상 개체에서보다 의심되는 개체 중에서 실질적으로 더 높은 수준으로 발현된다면, 상기 중국인 개체는 류마티스 관절염을 가질 것으로 나타낸다. 바람직하게 상기 조직 시료는 활액, 활액 병변 조직, 또는 말초 혈액으로부터 수득될 수 있다. 중국인 류마티스 관절염 질환자들은 우선적으로 유전자형 HLA DRB1*0405와 관련된 것이 발견되었기 때문에, 상기 방법은 HLA DRB1*0405의 개체 중에 류마티스 관절염을 검출하기위해 특히 유익하다.

또한, 본 발명은 류마티스 관절염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖는 DNA 단편에 상보적인 프로브(probe)를 생성시키는 단계; 의심되는 개체로부터 조직 시료를 수득하는 단계; 및 상기 프로브와 조직 시료를 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 양성의 하이브리드화 신호(positive hybridization signal)는 의심되는 개체에서 류마티스 관절염이 검출될 가능성이 있음을 나타낸다. 바람직하게, 상기 조직 시료는 활액, 활액 병변 조직, 또는 말초 혈액으로부터 수득될 수 있다.

또한, 본 발명은 류마티스 관절염을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 직접 대항하는 항체를 생성시키는 단계; 의심되는 개체로부터 조직 시료를 수득하는 단계; 및 상기 항체와 조직 시료를 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 양성의 신호는 의심되는 개체에서 류마티스 관절염이 검출될 가능성이 있음을 나타낸다. 바람직하게, 상기 조직 시료는 활액, 활액 병변 조직, 또는 말초 혈액으로부터 수득될 수 있다.

또한, 본 발명은 면역 반응을 확인하기위해서 유효량의 면역성 T 세포 수용체 펩티드를 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 펩티드는 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

상기 펩티드의 면역성(immunogenicity)을 향상시키기위해서, 상기 펩티드는 보조제(adjuvant)와 콘쥬게이트되거나 또는 면역성을 줄 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 직접 대항하는 항체의 유효량을 개체에 투여함으로써 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 유익하게, 상기 방법은 단일 사슬 T 세포 수용체 가변성 베타 16(Vβ16) 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 이의 단편을 포함하는 DNA 단편에 실시가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 발현 벡터를 개체에 투여하는 단계; 및 상기 개체에서 DNA 단편을 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, DNA 단편을 코딩된 펩티드에 대항하는 면역 반응을 확인하기에 충분한 수준으로 발현시킴으로써 상기 개체에서 류마티스 관절염의 개시를 방지하거나 또는 류마티스 관절염을 치료한다.

바람직하게, 핵산 서열은 Vβ16의 상보적 결정 영역-3(CDR3)을 코딩하고, 서열번호 2에 개시된 서열을 포함한다. 더 바람직하게, Vβ16의 CDR3은 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

바람직하게, 핵산 서열은 Vβ16의 상보적 결정 영역-2(CDR-2)를 코딩한다. 또한 바람직하게, Vβ16의 CDR2는 서열번호 170에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.

프로모터는 유도성(inducible) 프로모터 또는 구성적(constitutive) 프로모터인 것이 바람직하다. 대표적인 예로는 β-액틴 프로모터, SV40 전 및 후 프로모터(SV40 early and late promoter), 면역글로불린 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터 및 레트로바이러스(retroviral) LTR을 포함한다.

바람직하게, DNA 발현 벡터를 개체에 피하 투여, 피내 투여, 정맥내 투여 또는 경구 투여하며, 더 바람직하게는 개체의 근육 조직 또는 척수액(spinal fluid)에 투여한다.

또한, 본 발명은 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 유익하게 상기 방법은 단일 사슬 T 세포 수용체 가변성 베타 14(Vβ14) 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 이의 단편을 포함하는 DNA 단편에 실시가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 발현 벡터를 개체에 투여하는 단계; 및 상기 개체에서 DNA 단편을 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 핵산 서열은 서열번호 1에 개시된 서열을 포함한다. 개체에 투여된 이후에, DNA 단편은 코딩된 펩티드에 대항하는 면역 반응을 확인하기위해 충분한 수준으로 발현시킴으로써 상기 개체에서 류마티스 관절염의 개시를 방지하거나 또는 류마티스 관절염을 치료한다.

바람직하게, 핵산 서열은 Vβ14의 상보적 결정 영역-3(CDR3)을 코딩하고, 상기는 서열번호 3 및 및 SLS로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

바람직하게, 핵산 서열은 Vβ14의 상보적 결정 영역-2(CDR-2)를 코딩하며, 서열번호 169에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.

최근 클로닝 기술의 출현으로, 유전자는 선택적으로 발현되지 않을 수 있다. 류마티스 관절염(RA)을 치료하는 1가지 가능한 방법은 표적 유전자의 mRNA와 특이적으로 결합하는 안티센스(antisense) RNA 또는 DNA 분자를 형성시키고 단백질로서 유전자를 발현하는 정확한 분자 기작을 해석하는 것이다. 상기 안티센스 기술은 서열번호 1 및/또는 서열번호 2에 개시된 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 RA 질환자들을 치료하는데 사용될 수 있으며, 이는 안티센스 배향으로 숙주 세포에서 발현된다.

본 발명은 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 병원성 T 세포 반응을 억제하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 단일사슬 T 세포 수용체 가변성 베타 14(Vβ14) 또는 16(Vβ16)으로부터 유래된 펩티드 또는 이의 단편의 면역학적(immunologically) 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 바람직하게, 상기 펩티드는 Vβ14 또는 Vβ16의 상보적 결정 영역-3(CDR3)으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하며, 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 펩티드는 Vβ14 또는 Vβ16의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하며, 서열번호 169 및 서열번호 170으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 설명하기위한 목적으로 제공되며, 어떠한 형태로든 본 발명을 제한하는 것으로 이해되지 않는다.

하기의 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 설명하기 위한 목적으로 나타내었으며, 임의의 방식으로 본 발명을 제한하는 것을 의미하지는 않는다.

실시예 1

질환자 및 견본

미국 류마티즘 연합 표준에 따라 진단한 RA 중국인 질환자 37명의 군을 본 연구에 대상으로 하였다. 골관절염(OA)이 있는 7명의 질환자는 대조군으로 시험하 였다. 포함된 표준 중의 하나는 선택된 질환자들을 대상으로 하기 전에 2 달간 스테로이드나 또는 기타 면역 억제 처리를 하지 않은 질환자들을 선별하였다는 것이다. 징후가 있는 치료를 하는 질환자들은 제외하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 글래디언트 분리에 의해서 헤파린처리된 혈액 견본으로부터 준비하였다. 활액(SF) 세포는 원심분리와 이후의 세척에 의해 두 군의 질환자로부터 수집하였다. 활액 병변 조직(ST)은 본 연구와 관련되지 않은 외과적 절차 중에 RA 및 OA 조절 질환자 둘 다로부터 관절경을 통해 무릅 관절 활막 절제술에 의해 수득하였다. 상기 조직 견본을 작은 조각으로 절단하고, 바로 RAN 추출을 실행하였다. 본 연구 방법은 전문 피험자 심의 위원회에 의해 입증하였다.

실시예 2

유세포 분류(flow cytometry)에 의한 TCR Vβ 발현의 분석과 표현형 조사

활액 조직을 외과적으로 제거한 직후에 10 % 태아 소 세럼(FBS)와 1 % 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민을 함유하는 완전한 RPMI 1640 배지(Gibco RBL, Life Technologies, NY)에서 작은 조각으로 절단하였다. 작은 조각의 조직 견본은 Teflon Resin 막자가 있는 미세 조직 분쇄기를 사용하여 분쇄하였다. 단일 세포 현탁액은 400 ㎛ 나일론 망으로 여과한 후 수득하였다. PB, SF 및 ST의 TCR Vβ14 또는 Vβ16 발현의 분석은 콘쥬게이트된 마우스 항-인간 항체 쌍, CD3-PerCP-Cy5.5, CD4-FITC, CD8-FITC(BD Biosciences, San Jose, CA), 및 Vβ14-PE 또는 Vβ16-PE(Beckman Coulter Immunotech, Marseille, France)를 사용하는 이중 염색으로 실행하였다. 양성 염색의 퍼센트는 유세포 분류로 결정하였다(FACS Caliber, BD Biosciences, San Diego, CA).

실시예 3

RNA 추출 방법

총 RNA는 TRIZOL RNA 분리 키트(GIBCOBRL, Carlsbad, CA)를 사용하여 말초 혈액(PB), 활액(SF) 또는 활액 조직(ST) 실험 재료들(PB, SF 및 ST 샘플)로부터 추출하였다. ST 중 50 mg 내지 100 mg을 1 ml TRIZOL 시약 중에서 DEPC-처리 막자사발 또는 막자로 균질화시켰다. PB 및 SF로부터의 세포는 1 ml TRIZOL 시약에서 직접 용해시킨다. 클로로포름(0.2 ml)를 TRIZOL 1 ml에 첨가하여 강하게 혼합하였다. 상기 준비물을 원심분리하고, 이소프로필 알콜과 혼합하여 제조자의 방법에 따라 RNA를 침전시켰다.

실시예 4

HLA 유전자형 조사

모든 질환자에게서 수득한 PBMC 견본으로 HLA DR 및 DQ 유전자형을 분석하였다. 간단하게, 게놈 DNA를 질환자의 EDTA-처리 혈액으로부터 추출하고, HLA-DRB1과 HLA-DQB1 대립 유전자는 고 해상도 SSP UniTray(PEL-FREEZE Clinical System, Brown Deer, WI)를 사용하여 서열-특이 프라이머(28)로 PCR를 실행하여 측정하였다. 대립 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트는 WHO의 국제 명명법 위원회에 기재되어 있다(http://www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html). HLA-DRB1 대립 유전자와 HLA-DQB1 대립 유전자 패널은 제조자의 방법에 따라 분석하였다.

실시예 5

실시간 PCR 분석으로 활액과 혈액 T 세포에서 BV 유전자의 유용성 측정

25 TCRBV와 TCRBC 유전자 부위를 제조업자의 방법에 따라 TA 클로닝(상표명) 키트(Invitrogen, San Diego, CA)와 원 샷(상표명) TOP10 E.coli 컴피턴트 세포(Invitrogen, San Diego, CA)를 사용하여 클로닝하였다. BV-특이 프라이머의 올리고뉴클레오티드 서열은 표 1에 나타내었다. cDNA는 20 ㎕ 반응물에 랜덤 프라이머와 슈퍼스크립트 II(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 RNA로부터 합성하였다. TCR BV 유전자 발현은 실시간 정량 PCR로 분석하였다. BV-BC 증폭에 대한 내부 참조 대조군과 cDNA를 함유하지 않은 비-템플레이트 대조군을 각 반응에 첨가하였다. 실시간 PCR은 ABI 7000 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에서 96-웰 광 PCR 플레이트로 실행하였다. 간단하게, cDNA 샘플을 나누어(0.7 ㎕) SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, Foster City, CA)와 함께 각각 25 쌍의 BV-특이 프라이머와 1 쌍의 BC 프라이머(최종 용액 중에 0.1 mM)와 혼합하여, 최종 반응 부피가 50 ㎕가 되게 하였다. 상기 반응은 핫 스타트 활성(hot start activation)으로서 50 ℃에서 2 분 동안 실행하고, 95 ℃에서 10 분 동안 실행하고, 이 후에 95 ℃에서 15 초와 60 ℃에서 1 분 동안 반응을 40 사이클로 실행하였다. 사람의 BV 유전자의 발현은 하기의 수학식 1에 따라 PCR 반응의 신호 강도를 기준으로 계산하였다:

수학(Ct는 한계 사이클을 나타냄)

실시예 6

면역기 분석 방법

PCR 반응은 하기의 증폭 혼합물에서 ST 견본으로부터 유도된 cDNA 샘플 1 ㎕로 실행하였다: 5 ㎕ 10x PCR 버퍼(100 mM Tris-HCl, pH 8.3 및 500 mM KCl), 3 ㎕ 25 mM 염화 마그네슘, 1 ㎕ 10 mM dNTP 믹스, 0.5 ㎕ Taq 폴리머라이즈(5 U/㎕)(Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 pmol 프라이머(BV14 또는 BV16 정방향 프라이머와 BC 프라이머). PCR 증폭 프로필은 변성에 대해서는 94 ℃에서 30 초, 어닐링(annealing)에 대해서는 57 ℃에서 30 초, 및 연장(extention)에 대해서는 72 ℃에서 30 초간 총 40 사이클을 사용하였다. 면역기 분석은 변형된 방법으로 실행하였다(Even et al., 1995와 Oksenberg 1993). 2 ㎕ BV14-BC 또는 BV16-BC PCR 생성물을 템플레이트로서 사용하였고, 런오프(run-off) 반응은 6 FAM (팽창)-표지화 BC 또는 BJ 프라이머 각각에 대해서 단일 내부 형광 표지로 실행하였다(표 2 참조). 반응 프로파일은 변성 온도에 대해서 94 ℃에서 30 초 및 94 ℃에서 45 초 동안 15 사이클; 55 ℃에서 45 초 동안, 72 ℃에서 1 분 동안, 이후에 연장 단계로서 72 ℃에서 5 분 동안으로 구성된다. 수득된 PCR 생성물은 그 다음에 포름아미드로 변성시키고, GeneScan 3.7 소프트웨어(Perkin-Elmer, Boston, MA)를 사용하여 Applied Biosystems 3100 Prism상에서 분석하였다. 표지된 생성물을 하나의 컬러 전기형광그래프로 분리하여 분석하였다. CDR3 길이에 상응하는 신호의 비교 강도(RIS)는 코카서스인 분포내에서 발견되는 대조군 피크하의 영역으로 나눈 실험 피크하의 영역으로서 나타낸다. 신호 강도의 분포를 기준으로 특이 BJ 프라이머는 CDR3 서열 분석용으로 선택하였다.

실시예 7

BV14와 BV16 전사의 서열 분석 및 DNA 클로닝 방법

ST 샘플로부터의 BV14 및 BV16 정방향 프라이머 및 BC 프라이머에 의해 증폭된 PCR 생성물은 특이적으로 표지되지 않은 BJ 프라이머로 PCR을 이차로 진행시키기 위한 템플레이트로서 사용하였다(표 2 참조). 이차 진행 PCR 생성물을 TA 클로닝 벡터 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝하였다. 15개의 콜로니를 BV14 또는 BV16 정방향 프라이머와 BJ 플라이머에 상응하는 것을 사용한 콜로니 PCR에 대해 각 샘플로부터 찍었다. PCR에 의해 가시적인 증폭을 보여주는 양성 플라즈미드를 선별하였다. 플라즈미드 DNA는 QIAPrep 미니 플라즈미드 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 상기 샘플로부터 제조하였고, V-D-J 영역은 BV14 또는 BV16 정방향 플라이머로 서열을 확인하여 CDR3 또는 CDR2 영역의 서열을 결정하였다.

실시예 8

RA 질환자의 활액과 병변 조직으로부터 유도된 T 세포 중 제한된 TCR V 유전자 유용성

류마티스 관절염(RA)으로 규정된 질환자 군과 골관절염(OA) 질환자의 대조군을 실시예 1에서 기재된 것과 같이 본 연구에 사용하였다. 임상적인 특성과 HLA DR 및 DQ 유전자형은 표 3에서 설명하였다. 중국인 RA 질환자 군에서, 유전자형 DRB1^*0405는 코카서스인 RA 질환자와 통상적으로 관련된 2개의 다른 DR4 유전자형, 즉 DRB1^*0401(8%) 및 DRB1^*0404(3%)와 비교해서 가장 우성의 DR4(16/37, 43%)를 나타낸다(Kerlan-Candon et al., 2001; MacGregor et al., 1995; 및 Fries et al., 2002). 또한 DRB1^*09012(35%) 및 3개의 DQB1 유전자형(0301, 0303 및 0401)도 또한 RA 질환자 군에서 자주 발현된다(30% 내지 41%).

T 세포가 제한된 TCR BV 유전자에 나타나 있는 RA 활액 병변 및 활액으로부터 유도되는지의 유무와 제한된 BV 유전자가 HLA 유전자형과 관련이 있는지의 유무를 시험하는 것이 첫 번째 시험이다. 이것 때문에 PB와 활액(SF 및 ST) 견본을 25개의 특이 프라이머를 사용하여 실시간 정량 PCR을 사용하여 TCR BV 유전자의 유용성을 일차로 분석하였다. 본 연구에서 사용한 실시간 PCR 방법은 BV 발현 패턴을 기본으로 하는 T 세포의 선별적 팽창을 검출하기에 특이적이며 민감하다. 도 1A 및 도 1B에서는 초항원으로 자극시킨 후 말초 T 세포의 BV 유전자 분석과 실시간 PCR 분석을 위해 BV-특이 프라이머를 최적화시킨 것을 보여준다. 도 1A에서는 25개의 BV 군과 BC 유전자에 특이적인 일련의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 ABI 7000 서열 검출 시스템으로 PCR 증폭 효율성 프로파일을 시험하였다. 상기 결과는 실시예 5에서 기재된 PCR 조건하에서 TCRBV 및 TCRBC 프라이머의 유사한 증폭 효율 성을 나타내는 사이클 수의 함수로 형광 강도(Delta Rn)의 유사한 슬로프를 보여준다. 도 1B에서는 말초 혈액 단핵 세포를 4명의 건강한 사람으로부터 분리하여 준비하고, 7 일 동안 1 ug/ml의 전 처리 농도에서 독성 쇼크 증후군 독소(TSST-1)의 존재 및 부재하에 배양하였다. 세포를 모아 원심분리로 세척하고, RNA를 25개의 BV 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 실시간 PCR 분석으로 추출하였다. PCR 조건은 상기 실시예 5에서 기재하였다. 결과는 4개의 세포 준비물에서 BC 발현에 대한 BC 유전자의 발현 평균 %로 나타내었다. 도 1B에서 보여주는 것과 같이, BV2의 선별적인 팽창은 BV2⁺ T 세포를 활성화시키는 것으로 알려진 초항원, 독성 쇼크 증후군 독소으로 자극한 후에 4개의 말초 혈액 단핵 세포 준비물에서 실시간 PCR 분석에 의해서 용이하게 검출하였다.

실시예 9

실시간 PCR 분석에 의한 RA 질환자와 대조군의 활액 및 혈액 견본의 BV 유전자 분포

RNA는 20개의 PB와 쌍을 이룬 37개의 ST 견본으로부터 추출하고, 몇몇 SF와 PB 견본으로서 동일한 RA 질환자의 SF 견본은 분석용으로 사용하지 않았다. 각 전사에서 BV 유전자 발현은 25개의 BV 유전자용으로 특이적인 프라이머를 사용하여 실시간 PCR를 사용해서 정량적으로 분석하였다. OA 질환자의 7개 모두의 쌍 견본을 대조군으로서 사용하였다. BV 유전자 분포는 Y 축에서 BC 발현에 대한 각각 BV 유전자의 평균 발현 %로 나타내었다. 별표는 과 발현된 BV 유전자와 잔존하는 BV 유전자사이에 현저한 차이가 있는 것을 나타낸다. 도 2는 실시간 PCR 분석으로 RA 질환자와 대조군의 활액 및 혈액 견본의 BV 유전자 분포를 나타낸다. RNA는 20개의 PB와 쌍을 이룬 37개의 ST 견본으로부터 추출하고, 몇몇 SF와 PB 견본으로서 동일한 RA 질환자의 SF 견본은 분석용으로 사용하지 않았다. 각 전사에서 BV 유전자 발현은 25개의 BV 유전자용으로 특이적인 프라이머를 사용하여 실시간 PCR를 사용해서 정량적으로 분석하였다. OA 질환자의 7개 모두의 쌍 견본을 대조군으로서 사용하였다. 유사하게 BV16 과발현은 동일한 RA 질환자로부터 수득된 SF 견본(28%)에서 관찰된 반면에 BV14 스큐잉은 쌍 SF 견본에서는 현저하게 관찰되지 않았다. CD4+T 세포 대 CD8+T 세포의 평균 비율은 유세포 분류에 의해 PB에 있어서는 1.36 ±0.74, SF에 있어서는 1.41 ±0.87, 및 ST-유도 단일-세포 현탁액에 있어서는 1.80 ±1.10이었다. 대조적으로 BV 유전자 분포는 RA-유도 PB 견본에서뿐만 아니라 OA 질환자에게 수득한 ST 및 SF 견본에서도 이종성이 높게 나타났다(도 2 참조). BV14와 BV16은 이러한 OA-유도 활액 견본에서는 과 발현되지 않았다.

일련의 추가 실험은 랜덤하게 선택한 RA 질환자 8명의 ST로부터 제조된 비쌍 단일-세포 현탁액 및 SF 내의 Vβ14+ 및 Vβ16+ 세포의 퍼센트를 시험하기 위해서 실행하였다. 단일-세포 현탁액과 활액 세포 준비물은 랜덤하게 선별된 RA 질환자 8명의 비쌍 ST(ST-1에서 ST-4) 및 SF(SF-1에서 SF-4) 견본으로부터 유도하였다. 세포는 콘쥬게이트된 단일클로날 항체를 사용하여 유세포 분류에 의해 각각 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 서브셋에 대한 T 세포 모집단의 TCR Vβ14+ 또는 Vβ16+ 세포의 퍼센트를 분석하였다. CD8+ 서브셋의 입구의 Vβ14+ 및 Vβ16+T 세포의 평균 퍼센트는 시험한 SF 및 ST 견본에서 각각 8.5 % 내지 16.2 % 및 7.2 % 내지 9.8 %의 범위였다. Vβ14+CD8+ 및 Vβ16+CD8+ T 세포의 평균 퍼센트는 쌍 PBMC에서 각각 2.2 % 이하 및 0.8 % 이하였다. 상기 결과로 TCR Vβ14와 Vβ16의 발현이 RA 질환자의 SF 및 ST 견본 둘 다의 CD8+T 세포 모집단에서 우세하게 검출되었다는 것을 알 수 있었다(도 3 참조).

추가의 분석으로 RA 질환자 군에서 DRB1^*0405 발현과 함께 BV16이 과발현되고 BV14는 발현되지 않은 경향을 알 수 있었다. DR 및 DQ 유전자형 둘 다와 BV 유전자 유용성을 분석한 37명의 RA 질환자로부터 BV16과 BV14의 발현이 각각 DRB1^*0405가 양성인 사람(n=16)에게서는 29%와 11%이고, DRB1^*0405가 음성인 사람(n=21)에게서는 각각 21%와 20%였다. 그러나 이러한 차이는 통계적으로 현저한 차이는 아니다. 대조적으로 BV14와 BV16의 발현 수준은 DRB1^*09012와 DQB1^*0301, 0303 및 0401를 포함하는 기타 자주 검출되는 유전자형의 RA 질환자에서는 비교적 낮았다.

실시예 10

RA 병변-유도 T 세포의 과 발현 BV14 및 BV16 전사의 CDR3 길이 분석과 우선적인 BJ 유전자의 유용성

선택된 활액 물질로부터 유도된 T 세포의 과발현 BV14와 BV16의 클론성(상기 견본에서의 >20% 상대 발현 수준)은 면역기 기술을 사용하여 CDR3 길이 분석으로 시험하였다. BV14와 BV16은 OA의 ST 견본에서는 과발현되지 않기 때문에, BV14와 BV16의 발현이 비교적 높게 나타나는(6.2% - 8.8%) 4명의 OA ST 견본을 대조군으로 시험하였다. 추가의 대조군으로는 실시간 PCR에 의해 BV14(모든 PBMC 견본에 대해서 평균이 5.7%에 대하여 8.1%를 의미함) 또는 BV16(모든 PBMC 견본에 대해서 평균이 2.9%에 대하여 4.7%를 의미함)의 발현이 검출가능한 12개 쌍의 PBMC 견본을 포함한다. 도 4와 도 5에서 설명하는 것과 같이, BV14와 BV16 유전자 둘 다는 BV14/BV16-BJ-3'BC 사이의 서열 영역을 분석하기 위해 2개 쌍의 5‘BV14-3'BC 및 5’BV16-3'BC 특이 프라이머를 사용하는 경우에 RA 질환자로부터 유도된 SF 및 ST 견본 둘 다에서 이종성 CDR3 길이 프로파일을 나타낸다. 몇몇 ST 견본들은 특이 유전자형(예를 들어 BV14에 대해서는 RA2, RA17, RA28 및 RA23, 및 BV16에 대해서는 RA21 및 RA18)을 갖는 크게 제한된 클론성을 나타내는 반면에 다른 것들은 폴리클로날 패턴을 나타낸다. 대조적으로 다양성이 큰 패턴의 클론성은 비교적 높은 BV14 또는 BV16 발현을 나타내는 쌍 PBMC 견본에서 검출된다(도 4와 도 5 참조). 또한 비교적 높은 BV14 또는 BV16 발현을 나타내는 4명의 OA 질환자의 활액 조직 견본으로부터 유도된 BV14와 BV16의 전사는 5‘BV14-3'BV 및 5’BV16-3'BC에 대한 특이적인 프라이머를 사용하여 면역기에 의해 5‘BV-BD-BJ-3'BC 영역의 클론성을 분석하였다. BV14와 BV16 둘 다는 OA 유도 ST 견본에서 폴리클로날 패턴을 나타낸다(도 6 참조).

시험된 BV14와 BV16의 CDR3 길이 프로파일을 추가로 분석하여, 13개의 BJ 유전자에 대해서는 역방향 프라이머와 BV14 또는 BV16 정방향 프라이머를 사용하여 면역기에 의해서 정제하였다. 총 689개의 CDR3 길이 프로파일은 ST 견본의 과발현 BV14 및/또는 BV16 유전자로부터 유도된 선택 전사로부터 만들었다. 이러한 분석으로 몇가지 중요한 사실을 발견하였다. 첫째로 3개 내지 4개의 BJ 유전자를 과발현 BV14 및 BV16와 관련하여 우세하게 사용하였다. BJ1S4, BJ2S1 및 BJ2S7은 BV16과 우선적으로 사용한 반면에 BJ1S1, BJ2S1, BJ2S4 및 BJ2S7은 BV14와 함께 사용하였다. 대표적인 실시예는 도 7에 나타내었다.

또한 몇몇의 과발현 BV14와 BV16 전사는 상이한 RA 질환자의 다양한 ST 견본에 존재하는 유사한 CDR3 길이와 BV 및 BJ의 동일한 구조적 특성을 갖는 보통 및 우성의 유전자형을 함유한다. 15, 21 및 24 염기쌍의 CDR3 길이를 갖는 3개 이상의 동일한 유전자형은 각각 BJ2S1, BJ2S7 및 BJ1S1 재조합을 갖는 BV16 전사에서 검출되었다. 유사한 보통의 유전자형은 또한 독립적인 RA 질환자의 ST-유도 TCR 전사에 BJ2S1, BJ2S7, BJ1S4 및 BJ1S1 재조합을 갖는 BV14에서도 또한 나타난다. 대표적인 유전자형 패턴은 도 8에서 설명하고 있으며, 상기 도 8에서는 유사한 CDR3 길이(BV16 및 BV14에 대해 피크 영역이 15, 21 및 24 염기쌍)를 갖는 동일한 BV 및 BJ 재조합을 갖는 대표적인 유전자형을 나타낸다. 보통의 유전자형의 선택된 TCR 전사는 TA 클로닝 키트를 사용하여 클로닝하고, 수득된 DNA 클론은 이후에 대응하는 BV 및 BJ 프라이머를 사용하여 CDR3 서열을 분석하였다. 상기 결과로 이러한 몇몇의 보통 유전자형은 동일한 CDR3 서열 또는 보통 CDR3 서열 모티프를 가질 수 있다는 가능성을 보여주었다. 상기를 설명하기 위해서 몇몇의 우성 유전자형을 추가 분석을 위해 선별하였다.

실시예 11

보통의 유전자형을 함유하는 TCR 전자의 CDR3 서열 분석

동일한 V-D-J 구조 특성을 갖는 규명된 유전자형이 상이한 질환자 사이에 동일한 CDR3 서열 또는 보통의 CDR3 서열 모티프를 갖는지의 여부를 설명하게 위해서 독립적인 ST 견본의 TCR 전사에 존재하는 보통의 유전자형을 규명하였다.

몇몇의 우성 유전자형을 분석을 위해 선별하였다. 보통 유전자형의 선택된 TCR 전사를 TA 벡터로 클로닝하고, 수득된 DNA 클론을 이후에 대응하는 BV 및 BJ 프라이머를 사용하여 CDR3 서열을 분석하였다. BV 및 BJ 재조합의 각각의 클러스터는 서열 분석을 위해 무작위로 선택된 대략 15개의 독립적인 DNA 클론을 갖는다. 총 490개의 DNA 클론의 서열을 성공적으로 확인하였다. 상기 결과로서 대부분의 동일한 클러스터의 개인의 DNA 클론은 선택된 유전자형의 동일한 CDR3 서열을 가지며, 이것은 생체내에서 T 세포의 클로날 팽창이 유전자형을 유도한다는 것을 나타내는 것을 알 수 있었다. 유전자형의 대부분은 각 개인에게 특이적인 독립 CDR3 서열을 나타낸다. 몇몇 유사한 유전자형은 상이한 개인이 동일한 CDR3 서열을 갖는 경우에 발견되었다.

3개의 유사한 유전자형을 함유하는 과발현 BV16의 전사(BV16-2S1/2S7/1S1-CDR3 길이 24bp/21bp/15bp)는 TA 클로닝 방법으로 클로닝하였다. 각 DNA 클로닝에 있어서, 10-15개의 수득된 DNA 클론의 서열을 BV 및 BJ 특이 프라이머를 사용하여 V-D-J 서열에 대해 확인하였다.

4개의 유사한 유전자형을 함유하는 과발현 BV14의 전사는 (BV14-2S1/2S7/1S4/1S1-CDR3 길이 24bp/21bp/15bp)는 TA 클로닝 방법으로 클로닝하였다. 각 DNA 클로닝에 있어서, 10-15개의 수득된 DNA 클론의 서열을 BV 및 BJ 특이 프라이머를 사용하여 V-D-J 서열에 대해 확인하였다.

CDR3 서열(SQADGTH, 서열번호 3)은 RA12 및 RA16의 BV16-BJ2S7 전사에서 발견하였다(표 4 참조). 또 다른 CDR3 서열(SSGGSLF, 서열번호 4)는 RA22 및 RA23의 BV14-2S7 전사에서 나타났다(표 5 참조). 표 4와 표 5에서 알 수 있는 것과 같이, 상기 유사한 유전자형은 나뉜/보통의 서열 모티프로 나타난다. BV16에 대한 모티프 SQD, SLL 및 SWGG는 6/12 BV16 질환자에게서 검출되며, SLS 모티프는 5/14 BV14 질환자에게서 발견되었다. 전체적으로 SLS, SP- 및 SS-의 서열 패턴은 모든 BV14 유전자형의 86%에서 발견된 반면에 BV16 유전자형의 77%는 SQ-, SLL 및 SWGG 서열 패턴을 갖는다.

추가적으로, 2개의 서열이 각각 BV14와 BV16의 CDR2와 관련하여 규명되었다(서열번호 169 및 서열번호 170). CDR2 또는 이의 단편은 이러한 영역에 상응하는 펩티드에 의해 유발된 T 세포 면역성이 특정 항원에 대한 높은 특이성이 기대되기 때문에 백신으로서 유용하다. 대부분의 연구는 CDR2 서열, 구조 특성 및 의학적 응용에서 이루어질 것이다.

본 명세서에서 언급하는 임의의 특허 또는 출판물은 본 발명에 속하는 당업에 통상적인 지식을 가진 자들에게 알려져 있다. 본 발명이 특이적이 실시양태를 참조하여 설명되었다고 하더라도 이에 제한하지는 않으며, 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 범위내에서의 다양한 변형과 변화를 줄 수 있다.

Claims (59)

1. 서열번호 1에 개시되어 있는 핵산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 DNA 단편.
2. 제 1 항에 있어서,

   DNA 단편은 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체내 T 세포 수용체 β-사슬 BV14 유전자의 상보적 결정 영역-3(complementary determining region-3, CDR3)의 전부 또는 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수하게 분리된 DNA 단편.
3. 서열번호 2에 개시되어 있는 핵산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 DNA 단편.
4. 제 3 항에 있어서,

   DNA 단편은 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체내 T 세포 수용체 β-사슬 BV16 유전자의 상보적 결정 영역-3(CDR3)의 전부 또는 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수하게 분리된 DNA 단편.
5. 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 DNA 단편 을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신(vaccine).
6. 제 5 항에 있어서,

   상기 DNA 단편은 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 백신.
7. 서열번호 3 및 SLS로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드(peptide).
8. 제 7 항에 있어서,

   펩티드는 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체내 T 세포 수용체 β-사슬 BV14 유전자의 상보적 결정 영역-3(CDR3)으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
9. 제 8 항의 펩티드에 직접 대항하는 항체(antibody).
10. 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드.
11. 제 10 항에 있어서,

    펩티드는 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체내 T 세포 수용체 β-사슬 BV16 유전자의 상보적 결정 영역-3(CDR3)으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
12. 제 11 항의 펩티드에 직접 대항하는 항체.
13. 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체내 BV14 및 BV16으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 유전자의 상보적 결정 영역-3(CDR3)으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 1개 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
14. 제 13 항에 있어서,

    서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 1개 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
15. 서열번호 169에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드.
16. 제 15 항에 있어서,

    펩티드는 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체내 T 세포 수용체 β-사슬 BV14 유전자의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
17. 제 15 항의 펩티드에 직접 대항하는 항체.
18. 서열번호 170에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수하게 분리된 펩티드.
19. 제 18 항에 있어서,

    펩티드는 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체내 T 세포 수용체 β-사슬 BV16 유전자의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
20. 제 18 항의 펩티드에 직접 대항하는 항체.
21. 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체내 BV14 및 BV16으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 유전자의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 1개 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
22. 제 21 항에 있어서,

    서열번호 169 및 서열번호 170으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 1개 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
23. 류마티스 관절염이 의심되는 개체에서 류마티스 관절염을 검출하는 방법으로서,

    상기 방법은 하기 단계들 (a) 내지 (c)를 포함하며:

    (a) 의심되는 개체로부터 조직 시료(tissue sample)를 수득하는 단계;

    (b) 상기 조직 시료 중의 T 세포 수용체의 BV14, BV16, 또는 BV14 및 BV16의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

    (c) 정상 개체에서 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계;

    정상 개체에서의 BV14, BV16, 또는 BV14 및 BV16의 발현 수준보다 의심되는 개체에서의 BV14, BV16, 또는 BV14 및 BV16의 발현 수준이 실질적으로 높으면 의심되는 개체에서 류마티스 관절염이 검출될 가능성이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서,

    의심되는 개체와 정상 개체의 활액(synovial fluid), 활액 병변 조직(synovial lesion tissue), 또는 말초 혈액(peripheral blood)으로부터 조직 시료를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 류마티스 관절염이 의심되는 중국인 개체군에서 류마티스 관절염을 검출하는 방법으로서,

    상기 방법은 하기 단계들 (a) 내지 (c)를 포함하며:

    (a) 의심되는 개체로부터 조직 시료를 수득하는 단계;

    (b) 상기 조직 시료 중의 T 세포 수용체들의 BV16의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

    (c) 정상의 중국인 개체군에서 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계;

    정상 개체군에서의 BV16의 발현 수준보다 의심되는 개체군에서의 BV16의 발현 수준이 실질적으로 높으면 의심되는 중국인 개체군에서 류마티스 관절염이 검출될 가능성이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서,

    의심되는 중국인 개체군과 정상 개체군의 활액, 활액 병변 조직, 또는 말초 혈액으로부터 조직 시료를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 류마티스 관절염이 의심되는 개체에서 류마티스 관절염을 검출하는 방법으로서,

    상기 방법은 하기 단계들 (a) 내지 (c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    (a) 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖 는 DNA 단편에 상보적인 프로브(probe)를 생성시키는 단계;

    (b) 의심되는 개체로부터 조직 시료를 수득하는 단계; 및

    (c) 상기 단계 (a)의 프로브와 상기 단계 (b)의 조직 시료를 혼합하는 단계[양성의 하이브리드화 신호(positive hybridization signal)는 의심되는 개체에서 류마티스 관절염이 검출될 가능성이 있음을 나타냄].
28. 제 27 항에 있어서,

    의심되는 개체와 정상 개체의 활액, 활액 병변 조직, 또는 말초 혈액으로부터 조직 시료를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 류마티스 관절염이 의심되는 개체에서 류마티스 관절염을 검출하는 방법으로서,

    상기 방법은 하기 단계들 (a) 내지 (c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    (a) 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 직접 대항하는 항체를 생성시키는 단계;

    (b) 의심되는 개체로부터 조직 시료를 수득하는 단계; 및

    (c) 상기 단계 (a)의 항체와 상기 단계 (b)의 조직 시료를 혼합하는 단계(양성의 신호는 의심되는 개체에서 류마티스 관절염이 검출될 가능성이 있음을 나타 냄).
30. 제 29 항에 있어서,

    의심되는 개체와 정상 개체의 활액, 활액 병변 조직, 또는 말초 혈액으로부터 조직 시료를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 류마티스 관절염을 치료하는 방법으로서,

    면역 반응을 확인하기위해서 유효량의 면역성(immunogenic) T 세포 수용체 펩티드를 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하며,

    상기 펩티드는 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 류마티스 관절염을 치료하는 방법으로서,

    서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 직접 대항하는 항원의 유효량을 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 개체에서 류마티스 관절염을 방지 및 치료하는 방법으로서,

    상기 방법은 하기 단계 (a) 및 (b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    (a) 단일 사슬 T 세포 수용체 가변성 베타 16(Vβ16) 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 이의 단편을 포함하는 DNA 단편에 실시가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 발현 벡터를 개체에 투여하는 단계; 및

    (b) 상기 개체에서 DNA 단편을 발현시키는 단계(상기 DNA 단편을 충분한 수준으로 발현시켜서 코딩된 펩티드에 대항하는 면역 반응을 확인함으로써 상기 개체에서 류마티스 관절염의 개시를 방지하거나 또는 류마티스 관절염을 치료함).
34. 제 33 항에 있어서,

    핵산 서열은 Vβ16의 상보적 결정 영역-3(CDR3)을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 34 항에 있어서,

    핵산 서열은 서열번호 2에 개시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 34 항에 있어서,

    Vβ16의 CDR3은 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 33 항에 있어서,

    핵산 서열은 Vβ16의 상보적 결정 영역-2(CDR-2)를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 37 항에 있어서,

    Vβ16의 CDR2는 서열번호 170에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 33 항에 있어서,

    프로모터는 유도성(inducible) 프로모터 또는 구성적(constitutive) 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 39 항에 있어서,

    프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 전 및 후 프로모터(SV40 early and late promoter), 면역글로불린 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터 및 레트로바이러스(retroviral) LTR을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 33 항에 있어서,

    DNA 발현 벡터를 개체에 피하 투여, 피내 투여, 정맥내 투여 또는 경구 투여 하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 41 항에 있어서,

    상기 DNA 발현 벡터를 개체의 근육 조직에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 41 항에 있어서,

    상기 DNA 발현 벡터를 개체의 척수액(spinal fluid)에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 개체에서 류마티스 관절염을 방지 및 치료하는 방법으로서,

    상기 방법은 하기 단계 (a) 및 (b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    (a) 단일 사슬 T 세포 수용체 가변성 베타 14(Vβ14) 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 이의 단편을 포함하는 DNA 단편에 실시가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 발현 벡터를 개체에 투여하는 단계; 및

    (b) 상기 개체에서 DNA 단편을 발현시키는 단계(상기 DNA 단편을 충분한 수준으로 발현시켜서 코딩된 펩티드에 대항하는 면역 반응을 확인함으로써 상기 개체에서 류마티스 관절염의 개시를 방지하거나 또는 류마티스 관절염을 치료함).
45. 제 44 항에 있어서,

    핵산 서열은 Vβ14의 상보적 결정 영역-3(CDR3)을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 45 항에 있어서,

    핵산 서열은 서열번호 1에 개시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 45 항에 있어서,

    Vβ14의 CDR3은 서열번호 3 및 SLS로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 44 항에 있어서,

    핵산 서열은 Vβ14의 상보적 결정 영역-2(CDR-2)를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 48 항에 있어서,

    Vβ14의 CDR2는 서열번호 169에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제 44 항에 있어서,

    프로모터는 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제 50 항에 있어서,

    프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 전 및 후 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 레트로바이러스 LTR을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제 44 항에 있어서,

    DNA 발현 벡터를 개체에 피하 투여, 피내 투여, 정맥내 투여 또는 경구 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 52 항에 있어서,

    상기 DNA 발현 벡터를 개체의 근육 조직에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 52 항에 있어서,

    상기 DNA 발현 벡터를 개체의 척수액에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
55. 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에서 병원성 T 세포 반응(pathogenic T cell response)을 억제하기 위한 약학적 조성물로서,

    상기 약학적 조성물은 단일사슬 T 세포 수용체 가변성 베타 14(Vβ14) 또는 16(Vβ16)으로부터 유래된 펩티드 또는 이의 단편의 면역학적(immunologically) 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
56. 제 55 항에 있어서,

    펩티드는 Vβ14 또는 Vβ16의 상보적 결정 영역-3(CDR3)으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
57. 제 56 항에 있어서,

    펩티드는 서열번호 3, SLS, 서열번호 4, SQD, SLL 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
58. 제 55 항에 있어서,

    펩티드는 Vβ14 또는 Vβ16의 상보적 결정 영역-2(CDR2)로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
59. 제 58 항에 있어서,

    펩티드는 서열번호 169 및 서열번호 170으로 이루어진 군으로부터 선택된 아 미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

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