KR20060019708A - 항진균 미생물과 식물추출물을 이용한 친환경적인항벼도열병 제제 - Google Patents

항진균 미생물과 식물추출물을 이용한 친환경적인항벼도열병 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼도열병 방제를 위한 친환경적인 제제를 개발하기 위하여 항진균 미생물과 식물추출물이 혼합된 제제이다. 항진균 미생물로써는 Bacillus sp. AE111을 사용하였으며, 식물추출물로는 옥수수껍질 추출물을 사용하였다. 이 두 항진균 물질을 계면활성제, 중점제, 증량제를 이용하여 분상화 하였으며, 이 제제가 벼도열병원균인 Pyricularia grisae의 생육 억제를 통해 항진균 효과를 확인하였다.
벼도열병, 친환경적인 제제, Bacillus sp., 식물추출물

Description

항진균 미생물과 식물추출물을 이용한 친환경적인 항벼도열병 제제{An agent of environmentally friendly anti-rice blast disease that use antifungal micorbe and plant extract}
도 1. 제제의 MIC 테스트
대표적인 식물 병원균 가운데 하나인 벼도열병은 진균에 의해 발생하는 식물병으로 이러한 병으로 인한 피해는 매우 큰 것으로 알려져 있다. 도열병으로 인해 약 6천만명 이상의 사람들이 먹을 수 있는 식량이 매년 손실될 정도라고 한다. 이러한 벼도열병을 방제하기 위해서 유기합성농약을 사용하고 있는 현실인데, 이것은 경제적인 부담이 크고 사람과 다른 생물체에게 해로운 화학물질을 써야만 하는 단점이 있다. 또한 유기합성농약이 식량 생산에 크게 기여해 온 것은 사실이지만 이들 화학농약의 남용에 따른 생태계 피괴등 심각한 피해가 속출되고 있는 바 세계적으로 화학농약사용에 대한 규제가 강화되고 있는 실정이다. 이러한 규제는 그린라운드 협상 체결로 세계적으로 화학농약 사용량을 2005년 까지 50%이하로 감소해야하고 이를 지키지 않을 시에는 경제개발협력기구(OECD)에서 수출에 대한 제제를 받게 된다.
식물에게 있어서 심각한 피해를 주는 진균성 병해를 방제하기 위해서 최근 분자생물학을 이용한 분자육종이 이뤄지고 있지만, 실용화되기까지는 다소 시간이 걸릴 듯하다. 현재 우리 벼농사의 현실은 쌀 재고에 의한 쌀값하락, 쌀시장 개방등 여러가지 악재속에서 벼농사를 포기하는 농업인들이 속출하고 있다. 이러한 현실속에서 쌀에 대한 고부가 가치 창조와 수입쌀에 대한 경쟁력이 요구되고 있는 실정이다.
최근 들어 친환경적인 제제에 대한 연구가 활발이 이뤄지고 있는데, 김 등은 토양 미생물 Bacillus sp. KL-3의 대사산물을 이용하여 벼도열병균 P. oryzae를 생물학적으로 방제하는 연구를 하였으며[Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol, 25(4), 396-402, 1997], 윤 등은 P. oryzae의 성장을 억제하는 물질을 생산하는 Streptomyces sp. NA-52를 분리 및 동정을 하였으며[Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 25(6), 537-545, 1997], 배 등은 P. oryzae에 대한 길항성을 갖는 세균 Paenibacillus macerans PM-1의 분리 및 항진균 효과에 대한 연구를 하였다[J. Microbiol. Biotechnol., 10(6), 811-816, 2000]. 그리고 국내 몇 바이오벤쳐에서 미생물농약으로 등록하여 현재 시판중에 있으나, 그 효과가 들쑥날쑥하여 농민들에게 큰 호응을 얻지 못하고 있는 실정이다. 이러한 원인중에 하나는 미생물만으로는 진균을 억제하기는 어렵다. 미생물은 환경적인 요인에 지배를 많이 받기 때문에 지속적인 항진균 효과를 얻기가 힘들기 때문이다. 또한 이러한 제제에 대한 제제화 연구가 제대로 이뤄지지 않은 것도 하나의 이유가 될 수 있다.
본 발명에서는 항진균 미생물의 단점을 보완하기 위해 항진균 활성이 있는 식물추출물을 혼합하고 이 항진균 물질의 효과를 극대화 시키기 위해 계면활성제, 중점제, 증량제를 사용하였다. 이러한 첨가제들은 모두 식품첨가가 가능한 원료를 사용하여 안정성을 확보하였다.
실시 예 1. 항진균 미생물의 분말화
기확보된 항진균 미생물 Bacillus sp. G100, G101, AE111, AE1322, Paenibacillus polymyxa G317을 NB 배지에서 37℃ 24시간 진탕배양하였다. 배양된 균체를 5.0×106 cfu/ml가 되도록 하고 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 동결건조하기 위해서 적정량의 배양 상청액에 20%(w/v)부형제를 첨가하여 혼합한 후 동결건조 하였다. 동결건조 부형제로는 lactose, starch, skim milk를 사용하였다. 후보 항진균 미생물의 생존수를 확인하기 위하여 평판 계수법을 사용하였다[그림 1].
그 결과는 그림 1과 같으며, 동결건조 부형제 선택시 skim milk가 항진균 후보 미생물 5종의 생존율을 더 높이는 것으로 확인되었으며, 그 중에서 AE1322와 AE111이 상대적으로 다른 미생물 보다 생존율이 높은 것으로 확인되었다.
그림 1
Figure 112004038903113-PAT00001
실시 예2. 중점제를 이용한 분말화
중점제를 이용하여 제제시 항진균 미생물의 생육저해 유무를 확인하였다. 사용된 중점제는 식품첨가물중에서 구입하기 용이한 중점제를 선택하였다. 실험에 사용된 중점제로는 Glucomannan(G.m.), Logust bean gum(LBG), Sodium alginate(SA), Gluar gum(GG), Glucosamine(G.s.), Gelatin(Gel.), Arabic gum(AG) 이상 7종을 중점제로 사용하였다. 후보 항진균 미생물을 NB배지에서 24시간 37℃로 진탕 배양한 후 배양된 균체를 5.0×106 cfu/ml가 되도록 한 후에 중점제를 첨가하여 다시 24시간동안 방치한 후 후보 미생물들의 생존수를 비교하였다. 생존수 테스트는 평판 계 수법을 이용하여 측정하였다[그림 2].
그 결과는 그림 2와 같다. 7종의 중점제중에서 sodium alginate가 다른 중점제들 보다 미생물에 대한 생존율이 대체적으로 높았으며, AE111과 AE1322가 다른 미생물 보다 생존률이 높은 것으로 확인되었다.




그림 2
Figure 112004038903113-PAT00002
실시 예 3. 항진균 식물 추출물의 선발
항진균 예상 식물를 선발한 후 용매에 따라 추출하였다. 그 추출물들의 항진균 활성은 8mm paper disc method에 통해서 측정하였고, 피검균은 P.grisae로 하였고, 추출물은 100㎕를 loading하였다. 배지는 PDA를 사용하였고, 배양 조건은 25℃ 5일간 배양하였다[표 1].
그 결과는 표 1과 같으며 항진균이 우수한 추출물로는 석류껍질(아세톤), 옥수수 껍질(아세톤), 부추씨(아세톤)이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 하지만 이 항진균 활성이 있는 추출물이라도 앞으로 사용하게 될 항진균 미생물 생육에 영향 을 끼칠 수 있기 때문에 후보 항진균 미생물의 생육 억제 유무를 확인하였다. 이 확인 또한 8mm paper disc method를 통해 확인하였다. 배지는 NA를 사용하였고, 배양조건은 37℃ 24시간 배양하였다. 그리고 추출물은 100㎕를 paper disc위에 loading 하였다[표 2].
그 결과는 표 2와 같으며, 항진균 활성 추출물 17종 중에 석류껍질, 부추씨, 부추에서 항진균 후보 미생물을 억제하는 것을 확인하였다. 이로써 식물 추출물중에서는 옥수수 껍질(아세톤) 추출물을 대표적인 항진균 식물 추출물로 선발하였다.

표 1
No. 추출물 농도 추출용매 P. grisae 저해능 비고
1 석류껍질 5g / 500㎖ 90% 에탄올 +++
2 뽕잎 50% 아세톤 ++
3 톳잎 에탄올 -
4 루이보스 물 -
5 연근 70g / 100㎖ 90% 메탄올 +
6 연근 70g / 100㎖ 50% 아세톤 +
7 연근 70g / 100㎖ 물 -
8 씀바귀 30g / 100㎖ 90% 메탄올 -
9 씀바귀 30g / 100㎖ 50% 아세톤 -
10 깻잎 20g / 100㎖ 90% 메탄올 -
11 깻잎 20g / 100㎖ 50% 아세톤 -
12 석이버섯 5g / 50㎖ 90% 메탄올 +
13 석이버섯 5g / 50㎖ 50% 아세톤 +
14 옥수수껍질 10g / 200㎖ 90% 메탄올 +
15 옥수수껍질 10g / 200㎖ 50% 아세톤 +++
16 부추씨 30g / 100㎖ 90% 메탄올 -
17 부추씨 30g / 100㎖ 50% 아세톤 +++
18 둥글레 25g / 200㎖ 50% 아세톤 -
19 둥글레 25g / 200㎖ 90% 메탄올 -
20 선인장열매 35g / 200㎖ 50% 아세톤 -
21 팽이버섯 30g / 30㎖ 물 -
No. 추출물 농도 추출용매 P. grisae 저해능 비 고
22 마 10g / 50㎖ 50% 아세톤 +
23 옥수수알 4g / 200㎖ 물 +
24 옥수수알 5g / 200㎖ 50% 아세톤 +
25 옥수수알 5g / 200㎖ 90% 메탄올 +
26 대마씨 100g / 200㎖ 50% 아세톤 -
27 대마씨 100g / 200㎖ 90% 메탄올 -
28 차가버섯 5g / 50㎖ 물 -
29 차가버섯 5g / 50㎖ D.W boiling +
30 차가버섯 10g / 100㎖ 50% 아세톤 +
31 Amphiprora 아세톤 ++
inhibition zone; - (0mm), + (8~10mm), ++ (10~12), +++ (12~ )
표 2
길항미생물 식물추출물 G100 G101 G317 AE 111 AE 1322
석류껍질(M) ++ ++ ++ +++ +++
뽕잎(A) - - - -
연근(M) - - - - -
연근(E) - - - - -
석이버섯(M) - - - - -
석이버섯(A) - - - - -
옥수수껍질(M) - - - - -
옥수수껍질(A) - - - - -
부추씨(A) + ++ + ++ ++
부추(W) - - + + +
마(A) - - - - -
옥수수알(W) - - - - -
옥수수알(A) - - - - -
옥수수알(M) - - - - -
차가버섯(B) - - - - -
차가버섯(A) - - - - -
Amphiprora(A) - - - - -
inhibition zone; - (0mm), + (8~10mm), ++ (10~12), +++ (12~ )
실시 예 4. 계면활성제 및 기타 첨가제에 의한 분말화
G100, G101, G317, AE111, AE1322을 NB 배지에 37℃ 24시간 배양하고 균체수가 5.0×106 cfu/ml가 되도록 배양액을 희석한 후 배양액을 원심분리기를 이용하여 균체를 회수하였고, 표 3에 제시한 조성으로 formulation을 하였다.
표 3
Components Composition(%)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Anti-fungal bacteria 20 20 20
Plant extract 20 20 20
Sodium algniate - - 3
Surface active agent Polyoxyethylene alkyl sulfate, Sodium aromatic sulfonate 8 7 -
Sodium dialkyl sulfosuccinate, Sodium benzonate 2 2 -
Tween-20 - - 5
Stabilizer 10 10 10
Carrier 40 41 42
실시 예 5. 발아율, 팽윤도, 흡습도에 따른 제제의 안정성 테스트
1. 발아율 테스트
앞서 분말화된 제제에 함유된 항진균 미생물의 발아율을 확인함으로써 제제의 안정성을 확인하였다. 분말화된 제제는 멸균증류수에 10-1 희석하여 NA plate에 도말하고 37℃, 24시간 배양하여 균체수를 측정하는 평판계수법을 사용하였다[그림 3]. 그 결과 3가지 형태의 제제중에서 Ⅲ type의 발아율이 높은 것으로 확인되었다.
그림 3
1)Type Ⅰ
Figure 112004038903113-PAT00003
2) Type Ⅱ
Figure 112004038903113-PAT00004
3) Type Ⅲ
Figure 112004038903113-PAT00005
2. 팽윤도 테스트
분말화도니 수화제 타입 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ를 100mesh 크기의 입자만 선변한 후 이들을 5~15% 농도로 물과 혼합하여 10분간, 30분간 방치한 후 분무기를 통과하는데 지장이 없는 지를 조사하였다[표 4]. 그 결과 각각의 수화제 타입을 30분간 물속에 방치 후 분무하였을 경우 큰 어려움 없이 분무할 수 있었다. 하지만 10분간 물속에 방치할 경우 15% 농도에서 분무시 수화제 입자가 충분히 풀어지지 않아 분무하는데 약간의 어려움을 확인하였다.
표 4
샘플 농도 (%) 10분간 물속에 방치후 분무 난이도 30분간 물속에 방치후 분무 난이도
AE111 Ⅰ 5 10 15 +++ +++ ++ +++ +++ +++
Ⅱ 5 10 15 +++ +++ ++ +++ +++ ++
Ⅲ 5 10 15 +++ +++ ++ +++ +++ +++
AE1322 Ⅰ 5 10 15 +++ ++ ++ +++ +++ +++
Ⅱ 5 10 15 +++ +++ ++ +++ +++ +++
Ⅲ 5 10 15 +++ +++ ++ +++ +++ +++
3. 흡습도 테스트
분말화된 수화제 타입 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 수분 흡수능력을 적외선 수분계를 이용하여 측정하였다. 습도 90%, 온도 30℃하에 샘플을 방치한 후 3시간, 24시간 후에 샘플의 수분함량을 측정하였다[그림 4]. 그 결과 시간이 지남에 따라 흡습하는 정도가 3시간 후에는 10%미만, 12시간 정도에는 11~12% 정도였으며, 24시간 후네는 30%이상의 흡습도를 보였다.
그림 4
1) Type Ⅰ
Figure 112004038903113-PAT00006
2) Type Ⅱ
Figure 112004038903113-PAT00007
3) Type Ⅲ
Figure 112004038903113-PAT00008
실시 예 6
지금까지 제제의 안정성 테스트 결과 Type Ⅲ가 가장 적합한 것으로 판단되어 이 type의 항진균활성을 확인하였다[도 1]. 도열병균은 P.grisae를 사용하였으며, 희석배수는 10%, 1%, 0.5%로 희석하여 paper disk method를 통해서 확인하였다. 샘플 loading volume은 100㎕를 사용하였고, disk는 지름 8mm disk를 사용하였다. 활성 조건은 25℃에서 5일 정도 활성을 측정하였다. 그 결과 항진균 미생물과 CHE(옥수수 껍질 추출물)를 혼합과 type Ⅲ와의 항진균 차이는 type Ⅲ가 더 항진균 활성이 높은 것으로 확인되었다. Type Ⅲ-1은 항진균 미생물이 AE111이고, Type Ⅲ-2는 AE1322이다.
본 발명은 항진균 미생물 단독 제제의 단점을 보완하기 위해 식물추출물을 혼합한 제제로써 항진균 효과를 극대화 시키며, 일반 유기화학합성제제에 비해 농약 잔류가 없는 친환경적인 항진균제제이다. 현재 도열병에만 접목을 했지만 이 제제의 formula를 이용해 다른 곰팡이병에 대한 제제도 가능하다.

Claims (2)

  1. Bacillus sp. AE111 또는 Bacillus sp. AE1322, 옥수수껍질 추출물, Sodium alginate, Tween-20, Sucrose를 조성으로 하는 항진균 제제.
  2. 1항의 구성으로 된 제제의 벼도열병 감소 효과
KR1020040068324A 2004-08-30 2004-08-30 항진균 미생물과 식물추출물을 이용한 친환경적인항벼도열병 제제 KR20060019708A (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107760628A (zh) * 2017-11-22 2018-03-06 宁夏农林科学院植物保护研究所（宁夏植物病虫害防治重点实验室） 一株防治稻瘟病的短小芽孢杆菌s9

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CN107760628A (zh) * 2017-11-22 2018-03-06 宁夏农林科学院植物保护研究所（宁夏植物病虫害防治重点实验室） 一株防治稻瘟病的短小芽孢杆菌s9

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