KR20050058530A

KR20050058530A - 5' 에이엠피-활성화 단백질 인산화 효소 활성 증진 물질의스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20050058530A
Application number: KR1020030090440A
Authority: KR
Inventors: 하주헌; 김은주; 박명규
Original assignee: 주식회사 엠디바이오알파
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2005-06-17

Abstract

본 발명은 다양한 세포나 조직에서 5' AMP-활성화 단백질 인산화 효소 (5' AMP-activated protein kinase, AMPK)의 활성을 증가시키는 물질을 탐색하기 위한 효율적인 스크리닝 시스템을 제공한다. 기존의 스크리닝 또는 분석방법은 활성화된 AMPK를 찾아내기 위하여 많은 농도의 AMPK를 필요로 하고, 복잡한 단계를 채용해야 할 뿐만 아니라, 많은 샘플을 동일한 조건에서 처리하여 스크리닝하는 과정에서 동위원소를 사용함으로써 측정의 시간적 제약과 함께 위험성을 배가 시키는 단점을 안고 있다. 는데이에 비하여, 본원 발명의 면역분석에 기초한 ELISA 방식의 스크리닝 모델은 한번에 많은 종류의 샘플에 대한 분석이 가능함은 물론, 적은 양의 샘플농도에서도 효과적으로 측정이 가능한 분석법을 제공한다. 본원 발명의 분석법을 통하여 화합물 라이브러리는 물론, 자생식물, 한약재 등의 천연물 라이브러리로부터 효과적으로 AMPK 효소 활성 증진 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라, 스크리닝된 물질을 유효성분으로 함유하는 비만 예방과 치료, 당뇨병 예방과 치료, 허혈성 질환의 예방과 치료, 암 예방과 치료, 그리고 혈당 강하용 제제 또는 생약제는 물론, 근력강화, 피로회복 등에 효과가 있는 식음료 소재 등의 개발에 활용할 수 있다.

Description

5' 에이엠피-활성화 단백질 인산화 효소 활성 증진 물질의 스크리닝 방법 {Screening Method for screening Active compounds or Natural extracts having activatory effects on 5' AMP-activated protein kinase}

본 발명은 5' AMP-활성화 단백질 인산화 효소 (5' AMP-activated protein kinase, AMPK)의 활성을 증가시키는 물질의 효율적인 탐색을 위한 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 AMPK 효소의 활성을 당뇨병의 주요 증상인 혈당강하 효과를 갖는 화합물, 한약재 및/또는 자생식물의 활성 추출물의 탐색과 이를 유효성분으로 함유하는 비만 예방과 치료, 당뇨병 예방과 치료, 그리고 혈당 강하용 생약제 및 근력강화, 피로회복, 심근경색, 중풍, 그리고 저산소증 유래 질환 등에 효과가 있는 식,음료 소재물질 등의 탐색 방법에 관한 것이다.

최근, 경제 발전에 따른 생활 수준의 향상으로 인하여 생활 여건이 향상되면서 운동 부족 현상이 초래되고 또한 전반적인 식생활의 향상으로 섭취 열량이 크게 증가하여 심각한 비만이 발생하며 이에 따라 야기 되는 제 2형 당뇨병이 증가하고 있다. 당뇨병이 오래 지속되면 혈당의 증가 이외에도 혈중 지질 농도가 증가하여 동맥 경화, 관상 심장 질환 등의 심혈관 질환, 당뇨병성 신장 및 망막 질환 등의 합병증을 유발하므로 이의 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

현재, 인슐린 저항성(insulin resistance)이 제 2형 당뇨병의 가장 중요한 병리 기전으로 인식되고 있으며 이는 체내 인슐린이 충분하다 해도 당을 제대로 활용하지 못하는 현상을 의미하고 있으며 이를 치료하기 위해 다양한 혈당 강하제가 사용되고 있다. 혈당 강하제는 치료기전 및 작용 약물의 작용점에 따라 다음의 경우로 분류된다.

1) 설포닐우레아 계통은 주로 췌장의 베타 세포 안에 있는 인슐린을 함유한 과립포의 이동을 촉진하여 간접적으로 인슐린을 분비 시키는 약물이며 저혈당 유발 등의 심각한 부작용이 보고 되고 있으나 최근에는 부작용을 최소화한 약물이 개발되어지고 있다.

2) 비구아나이드 계통 약물은 근육세포로 당을 이동시키고 간에서 당의 합성(gluconeogenesis)을 억제하는 약물로 저 혈당을 일으키지 않는 장점을 갖고 있으나 고령자와 심 혈관 질환 환자에게는 사용시는 주의가 요구되고 있다.

3) 알파-글루코시다아제 저해제는 소장에서 포도당을 만드는 효소 활동을 억제 시켜 식후에 일시적으로 혈당이 급상승하는 것을 막아주고, 부작용이 심하지 않은 편이어서 경증 당뇨병 치료에 이용된다.

4) 최근에는, 지방세포의 분화에 관계되는 피피에알 감마를 활성화하는 피페리디온계 약물도 개발되고 있다.

이러한 경구용 혈당 강하제 만으로는 혈당이 효과적으로 떨어지지 않고 이미 알려진 대부분의 약물에서 부작용이 나타나므로 보다 안전한 당뇨병 치료제 개발이 시급한 실정이다. 또한 제 2형 당뇨병은 인슐린 신호 전달 체계 및 탄수화물과 지질대사 과정에서의 다양한 문제점으로 인해 발생하기 때문에 새로운 치료제 개발을 위해서는 이러한 신호 전달 및 대사 과정을 전반적으로 조절하는 새로운 목표 단백질의 발굴이 절실한 실정이다.

최근 5'AMP 활성화 단백질 인산화 효소 (5' AMP-activated protein kinase ; AMPK)가 탄수화물 및 지질대사 그리고 포도당 흡수를 조절하는 역할이 밝혀지면서 이의 활성물질이 제 2형 당뇨병 치료제로서의 개발 가능성이 제시되고 있으며 이러한 근거는 다음과 같다.

1) 운동을 시킨 쥐의 근육세포에서 ATP 소모의 결과로 AMP의 양이 증가하고 이로 인해 AMPK 의 활성도가 증가하고 그 결과 포도당 흡수가 증가하는 사실이 관찰되었다.

2) AMPK에 의해 포도당 흡수가 증가되는 기전은 인슐린 신호 전달 체계와 독립적이며 이 사실은 인슐린 신호 전달 체계에 이상이 발견되는 대부분의 제 2형 당뇨병 환자에서 새로운 치료 목표 물질이 될 수 있다는 사실을 의미한다.

3) 실제로 제2형 당뇨 환자들의 대부분이 운동을 함으로써 혈당량을 감소할 수 있으며 당뇨 모델 동물에서 운동에 의해 AMPK가 활성화되며 동시에 혈당량이 감소되는 사실도 보고되고 있다.

4) 이 뿐 아니라 AMPK는 생체 내에서 다양할 역할을 수행하는데 췌장세포에서 인슐린의 분비를 조절할 뿐만 아니라 지방세포에서 acetyl-CoA carboxylase (ACC)와 HMG-CoA reductase의 활성을 저해하여 리포제네시스 (lipogenesis) 및 콜레스테롤 합성을 억제하여 비만의 조절에도 중요한 역할을 한다.

그러나 AMPK의 활성제로서 제 2형 당뇨병과 비만증에 선택적으로 효과가 있으며 또한 당뇨병 실험동물에 대하여 현저히 혈당을 감소시키는 저해물질에 대한 보고는 미비하다. 상기 기술된 바는 AMPK 의 활성증강 물질이 당뇨병 예방 및 치료목적 이외에 근력강화, 피로회복 등의 적응증을 갖는 약제 혹은 식,음료소재로서의 개발가능성을 보여주는 것이라 하겠다.

일반적으로, 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법론 중에서도, 효율적인 물질의 탐색방법이 매우 중요하다. AMP-activated protein kinase (AMPK)는 탄수화물 및 지질대사 그리고 포도당 흡수를 조절하는 역할을 하며 이 효소의 활성이 제 2형 당뇨병 치료에서의 개발 가능성도 제시되고 있다. 또한, AMPK는 췌장세포에서의 인슐린의 분비를 능력을 조절하고 지방세포분화 및 콜레스테롤 합성을 억제하여 비만의 조절에도 중요한 역할을 한다.

보다 구체적으로 설명하면, AMPK (Hardie, 1992)는 에너지 고갈을 유도하는 다양한 대사성 스트레스 및 운동에 의해 활성화되어 세포내에서 에너지를 소모하는 대사 경로를 억제하고 반면 에너지를 생성하는 대사 경로를 활성화시켜 에너지 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다고 보고되어 있다. AMPK에 의해 그 활성이 억제되는 효소는 지방산과 콜레스테롤의 생합성에 관계한 효소인 acetyl-CoA carboxylase (ACC)와 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase)등이 있으며 글리코겐 분해과정 및 글루코네요제네시스 과정도 AMPK에 의해 억제되고 있다. 반면 활성화된 AMPK는 근육세포에서 혈당 조절의 중요한 역할을 하는 Glut4 glucose transporter의 활성도와 양을 증가시킨다. 또한 AMPK는 지방산 산화 과정 및 해당 경로를 활성화시킨다. 이 이외에 AMPK는 간지방산의 산화, 췌장 베타세포에서 인슐린 분비의 조절, 지방 세포 분해 등에 관여하고 있으며 인슐린 민감성도 높이고 있다는 보고가 있어 AMPK는 에너지 센서의 역할을 하고 있으며 비만, 지방암, 제 2형 당뇨 및 인슐린 내성 원인 규명에 있어서 매우 새롭고 중요한 목표 물질이 됨을 시사한다.

AMPK는 한 개의 반응 부분 (α catalytic subunit)과 두 개의 조절 부위 (β & γ regulatory subunit)로 이루어진 헤테로트라이메릭 (heterotrimeric) 한 구조를 가지고 있다. 반응 부분의 경우 2개 (α1, α2)의 이성질체가 존재하고 있으며 조절 부위 또한 두개 이상의 이성질체 (β1, β2, and γ1, γ2, and γ3)가 발견되었다. AMPK는 운동 혹은 근육 수축 혹은 대사성 스트레스 조건에서 ATP가 고갈되어 그 결과로 AMP가 축적되면 활성화 되어지는데 AMP는 AMPK와 결합하여 활성화시키며 ATP는 그 반대의 역할을 한다. 따라서 AMPK는 세포내의 AMP/ATP 비율에 의해 매우 민감하게 조절되고 있으며 또한 크레아틴/포스포크레아틴 (creatine/phosphocreatine) 비율에 의해서도 조절되고 있다. 이 과정에서 아직 잘 알려지지 않은 단백질 키나제 (AMPK kinase)에 의해 α subunit의 Thr-172이 인산화 되며 이 과정이 또한 AMPK의 활성도를 증가시키는 중요한 기전으로 알려져 있다.

세포 내에서 acetyl CoA는 섭취한 음식물을 에너지 형태로 전환시키는 대사에 있어 중요한 매개체이다. acetyl CoA의 작용은 세포 내에 존재하는 receptor kinase 중의 하나인 AMP-activated protein kinase (AMPK, Hardie, 1992)를 통해 조절되는데, 에너지 대사에 있어 즉각적으로 이용할 수 있는 ATP를 생성시키거나 에너지 저장에 관련된 지방산과 콜레스테롤 합성을 조절한다. AMPK는 중심에 한 개의 반응부분과(catalytic subunit, α1, α2) 두개의 조절부분(regulatory subunit, β1, β2, and γ1, γ2, and γ3)의 heterotrimeric 구조를 이루고있다.(Hardie, D. G. 1998) 이러한 AMPK는 운동 후와 같은 에너지 부족시 글루코스 전달을 촉진하고 (Hayadhi, T. 2000), 지방산 산화를 촉진시켜 필요한 에너지를 공급하는 에너지 센서로서 작용하며 2형 당뇨병에 있어 인슐린 민감성을 증가시킨다고 알려져 있다.(Winder, W. W. 1999) AMPK의 활성은 세포 내 ATP/AMP 농도 비율에 자극되어 α-subunit(Thr172)에 존재하는 threonine기의 upstream kinases (AMPKKs)에 의한 인산화를 통해 일어난다. 또한, 근육세포 내에서 5-amino-4-imidaxolecarboxamide riboside(AICAR)는 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide(ZMP)의 인산화를 통해 AMP와 같이 AMPK를 활성화시켜 근육 세포 내로의 당 흡수를 촉진하고 GLUT4 glucose transporter 단백질 농도를 증가시킨다.

생체 내에서 AMPK의 역할은 운동 중 골격근의 수축에 필요한 에너지 대사에서 가장 잘 연구되고 있다.(Winder, W. W. 1999, Ruderman, N. B., 1999)

근육 내에서 이러한 효소는 에너지 필요에 따라 GLUT4 glucose transporter를 증가시키고 (Ihemann, J., 1999, Hayadhi, T. 2000, Bergeron, R. 2001) acetyl CoA carboxylase를 억제시켜(Kudo, N.1995, Dagher, Z. 2001, Atkinson, L. L. 2002) 글루코스의 전달과 지방산의 산화를 통한 에너지 저장을 억제하고 ATP를 생성시킨다고 알려져 있다.

그 외 활성화된 AMPK 작용은 간지방산의 산화, 췌장 베타세포에서 분비되는 인슐린 분비의 조절, 지방세포 분해 등에 알려져 있다. 따라서 AMPK 신호전달의 문제는 비만과 지방암과 같은 지방에 관련된 질병, 2형 당뇨병에 관련된 대사, 인슐린 내성 등에 원인이 된다.

(AMPK의 활성 및 작용)

AMPK는 ligand 5’-AMP의 결합으로 활성화되고 Thr-172에서 인산화되어 지방산과 콜레스테롤의 생합성에 관계한 효소인 acetyl-coA carboxylase(ACC, Ser-79)와 HMG-coA reductase (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymen A reductase)의 활성을 감소시킨다. 운동을 하는 동안 증가되는 에너지 요구는 ATP 농도를(ATP/AMP) 감소시키고 증가한 AMP의 농도는 AMPK는 활성을 자극하여 에너지 저장에 관계된 합성작용을 차단하여 사용 가능한 ATP가 생성 될 수 있게 하는 acetyl CoA의 작용을 증가시킨다.(Hardie, D. G. 1997, 1998, Kemp, B. E. 1999). 이때 AMP가 activating ligand로서 이용되는 이유는 ADP 농도는 세포 내에서 완충적으로 조절되어 일정한 상태를 유지하지만 AMP농도는 외부 반응에 따라 가변적이기 때문이며 따라서 우리 몸의 에너지 센서로서 작용한다.

그러나, 현재 널리 쓰이고 있는 AMPK 분석 방법은 많은 양의 단백질을 필요로 한다. 실험에 필요한 충분한 양의 단백질을 얻기 위해서는 많은 양의 세포를 배양해야 하며 여러 가지 복잡한 단계를 거쳐야 한다. AMPK의 활성을 증가시키는 여러 가지 물질을 탐색하고 발굴해 내는 작업을 보다 빨리 수행 하기 위해서는 기존의 복잡한 단계들을 좀 더 쉽고 빠르게 진행 시킬 수 있는 방법이 요구되는 실정이다.

AMPK는 운동, 근육 수축, 혹은 에너지를 고갈시키는 다양한 대성성 스트레스에 의해 활성화되며 비만, 당뇨, 인슐린 내성, 허혈성 질환 등 다양한 질환에서 예방 및 치료를 위한 새로운 목표물질로 인식되고 있다.

AMPK는 세포 내의 ATP/AMP와 creatine/phosphocreatine의 농도차에 의해 활성화되는데 이는 에너지 감소에 대한 세포 보호의 조절 신호이다. 근육 세포 내에서의 이러한 AMPK의 활성은 근육 내로 글루코스의 전달을 증가시키고 지방산의 산화를 촉진하여 ATP를 생성시킨다. 또, 5-amino 4-imidaxolecarboxamide riboside (AICAR)에 의한 AMPK 활성은 체내 및 체외에서 인슐린 작용에 독립적으로 작용하여 근육 내 당의 흡수를 증가시키고(Hayashi, T. 1998, Bergeron, R. 1999) 글리코겐의 합성을 감소시킨다고 알려져 있다(Wojtaszewski, J. F. 2002).

이러한 세포 내에서 작용하는 AMPK 활성을 측정하기 위한 방법들이 연구되어지고 있다. 대부분의 기존 연구방법은 방사성 동위원소를 이용하여 AMPK 활성 농도를 측정하고자 하였는데(Davies, S. P. 1989, Kim. J. M. 2001)) 대략적인 연구방법은 다음과 같다.

골격근세포에 35% 암모니움 설페이트 (ammonium sulfate)를 15분간 반응시켜 단백질을 얻어내고 AMPK의 활성은 kinase assay buffer (62.5 mM sodium pyrophosphate, 1.25 mM EDTA, 1.25 mM EGTA, and 1 mM dithiothreitol with 200 uM AMP, ATP mixture 200 μM ATP and 1.5 μCi of [γ-³²P]ATP), with or without 250 μM SAMP peptide (HMRSAMGLHLVKRR)을 30^oC에서 10분간 반응시킨 후 phosphocellulose paper (P81)에 반응용액을 스폿팅 (spotting) 한다. p81 paper를 150 mM phosphoric acid로 washing 후 신틸레이션 카운터 (scintillation counter)를 이용하여 방사활성 (radioactivity)을 측정한다.

하지만 이러한 방법은 활성화된 AMPK를 찾아내기 위해 많은 농도의 AMPK를 필요로 하고 몇 가지 복잡한 단계를 실행 해야 한다. 더욱이 많은 샘플을 동일한 조건에서 처리하여 스크리닝하는 과정에서는 동위원소 사용에 대한 위험성과 측정의 시간적인 제약이 따른다.

본 연구는 이러한 문제점을 보안하기 위하여 기존의 ELISA 방식을 모델로 한 새로운 AMPK 면역분석 시스템 (AMPK ImmunoAssay System)을 개발하고자 하였다. 새로운 면역분석 방법은 한번에 많은 종류의 샘플 측정이 가능하고 적은 양의 샘플 농도에서도 측정 가능하도록 96-well plate를 이용하였고 전체적으로 단백질들의 샌드위치 구조를 보여준다.

상기와 같은 기존 스크리닝 방법의 단점 및 문제점을 개선시키고자 ELISA 방식을 모델로 한 새로운 AMPK 면역분석 시스템 (AMPK ImmunoAssay System)에 관한 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 많은 양의 물질에서 AMPK의 활성을 보다 손쉽고 빠르며 정확하게 탐색하기 위한 신규한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 다른 한편으로 AMPK 효소의 활성증가, 비만 및 당뇨 예방 및 치료 등에 뚜렷한 효과가 있는 약물인 상기 한약재 및/또는 자생식물의 추출물을 유효성분으로 함유한 생약제를 제공하는데 그 목적이 있다.

이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 5' AMP-활성화 단백질 인산화 효소(AMPK)의 활성 증진 물질의 스크리닝 방법은 다음과 같다.

활성화된 AMPK에 의해 활성화인산화되는 기질 효소 또는 그것의 공인자(cofactor)에 특이적으로 결합하는 당단백질을 수용체 물질로서 장치에 고정시키고, 후보 물질에 의해 처리된 근육 분화세포 혹은 조직으로부터 얻어진 단백질 추출물 (extract)를을 상기 효소 등과 반응시켜, 상기 수용체 물질과 반응시켜 AMPK의 기질 효소를 분리한다. 다음 과정으로 분리된 AMPK의 기질 효소에서 AMPK에 의해 인산화된 정도를 측정함으로써 에 결합되는 활성화된 효소 또는 그것의 공인자의 량을 측정함으로써, 상기 후보 물질이 AMPK의 활성을 증가시키는 물질인지를 확인하는 과정을 포함하는 것으로 구성되어 있다.

AMPK는 운동, 대사성 스트레스 (ischemia, oxidative stress, hypoxia, heat shock, osmotic shock 등) 에 의해 활성화되고 5-amino-4-imidaxolecarboxamide riboside(AICAR)에 의해 인위적으로 활성화되기도 한다. 활성화된 AMPK는 다양한 기질 세포를 인산화하여 여러가지 대사 경로를 조절하고 있으며 가장 잘 아려진 기질 효소는 ACC 이다. ACC는 acetyl-CoA를 malonyl-CoA로 변형시켜주는 효소이며 지방산 합성의 비율을 조절하는 효소이다. 근육 세포에서는 ACC에 의해 형성된 malonyl-CoA는 지방산이 미토콘드리아로 이동하는 경로를 방하하여 지방산 산화를 억제하는 역할을 하고 있다. ACC의 Ser-79는 특이하게 AMPK에 의해 인산화되기 때문에 본 발명의 방법에 있어서 AMPK에 의해 조절되는 기질 효소의 바람직한 예로는 ACC를 들 수 있다.

AMPK의 활성도가 인체 내에서 증가하는 경우로는, 예를 들어, 운동시 근육세포에서 ATP 소모의 결과로 증가된 AMP에 의해 AMPK가 활성화되는 경우; 저 산소증이 발생했을 때 심근의 AMPK가 활성화되는 경우; 근육 세포 내에서 5-amino-4-imidaxolecarboxamide riboside(AICAR)가 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (ZMP)의 인산화를 통해 AMPK를 활성화시키는 경우 등이 알려져 있다.

이와 같이 활성화된 AMPK는 일부 효소들을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 활성화된 AMPK는 ACC를 포스포리레이션(phosphorylation)시켜 활성화된 p-ACC를 만든다. 세포내에서 활성화된 AMPK를 통한 acetyl CoA의 ACC 활성 억제는 ACC의 반응 생성물인 malonyl-CoA 농도를 감소시키면서 나타난다. malonyl-CoA는 지방산 합성의 매개물이며 지방산이 미토콘드리아로 운반되는 것을 방해하여 지방산의 산화를 막는다고 알려져 있다. 즉, AMPK의 α2 isoform에 통한 ACC의 인산화는 ACC가 malonyl-CoA decarboxylase(MCD)을 방출하여 malonyl-CoA 농도를 감소시켜 지방산의 합성을 차단시키고 지방산의 산화를 촉진시켜 ATP을 생성하게 한다. 따라서, 본 발명의 방법에 있어서, AMPK의 활성화에 의해 활성화되는 상기 효소의 바람직한 예로는 ACC를 들 수 있다.

세포 내에 존재하는 모든 카르복실라아제 (carboxyalse)는 바이오틴 (biotin)과 공유결합을 하고 있으며 바이오틴은 공인자(cofactor)로서 카르복실라아제 (carboxyalse) 반응에 중요한 역할을 하고 있다. 한편, 바이오틴(biotin)은 모든 기관에 존재하며 바이오틴-의존성 카르복실라아제 (biotin-dependent carboxylases)의 공인자(cofactor)로 작용하는 수용성 비타민이다(Wood, H. G. 1997). 바이오틴은 매우 작은 농도로 인체 내에 존재하며, 대사의 항상성을 유지하는데 필수적인 물질이다. 사람에게 있어서, 바이오틴-의존성 효소들은 미토콘드리아와 세포질에 존재하며(Lynen F. 1979), 이러한 효소들은 카르복실화 공여체와 수용체 분자들 사이에 카르복실기를 전달하기 위하여 바이오틴을 이용한다. 세포 내에서 지방산 합성, gluconeogenesis,(Wolf B. 2001)에 관련된 5 가지의 바이오틴-의존성 카르복실라아제들이 알려져 있으며, propionly-CoA carboxylase (PCC), pyruvate carboxylase (PC), methylcrotonyl-CoA (MCC), acetyl-CoA carboxylase 1 (ACC-1), and acetyl-CoA carboxylase 2 (ACC-2) (Bartlett, K. 1985, Sherwood, W. G.1982, Sweetman, L. 1982) 등이 있다(Wolf B. 2001). 이 중, ACC-1과 ACC-2는 근육 내 지방산의 합성과 산화 과정에 관계하고(Abu-Elheiga, L. 1997,2000) ACC는 세포질에 존재하는 유일한 바이오틴-의존성 카르복실라아제로서 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 효소의 공인자의 바람직한 예로는 바이오틴을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 수용체 물질로서 바이오틴과 특이적으로 결합하는 당단백질의 바람직한 예로는 아비딘(avidin)을 들 수 있다.

본 발명의 방법에서 상기 후보 물질은 화합물 라이브러리, 자생식물, 한약재 등의 천연물 라이브러리 등의 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있다.

본 발명의 방법의 특징중의 하나는 여러 후보 물질들을 한번에 스크리닝할 수 있다는 점이다. 따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 상기 장치로는 96-웰 플레이트 (96-well plate)와 같이 멀티-웰 플레이트일 수 있다.

본 발명에 따른 구체적인 예를 설명하면 다음과 같다.

AMPK및 ACC를 포함한 세포질 단백질은 분화된 근육세포를 starvation 처리 후 약물을 처리하고 세포를 digitonin 용액에 용해시켜 얻어질 수 있다. 세포질 단백질 중 AMPK에 의해 활성화된 acetyl-CoA carboxylase (ACC)만이 avidin이 코팅된 96-plate에서 아비딘 (avidin)과 결합하고 나머지 단백질들은 washing과정에서 제거된다. 이후 AMPK에 의해 인산화된 ACC Ser-79와 특이적으로 결합하는 항체 (anibody)와 반응시키고 그 반응정도를 Avidin과 결합된 ACC양은 HRP-linked secondary antibody와 3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidine(TMB) solution을 사용하여 발색된 정도를 통해 확인된다. 세포로부터 얻어진 단백질은 96well plate에서 AMPK assay가 실시되며 활성화된 AMPK 량은정도는 동일한 plate에서 발색되므로, 많은 종류의 샘플을 한번에 같은 조건에서 처리 할 수 있다 (도 1, 2).

본 발명은 이러한 스크리닝에 의해 AMPK 활성 증진 효과를 발휘하는 것으로 확인된 후보 물질로부터 추출된 활성성분에 관한 것이다.

또한 이러한 활성성분을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료제에 관한 것이다.

더 나아가 본 발명은 또한 이러한 활성성분을 유효성분으로 포함하는 당뇨 예방 또는 치료제에 관한 것이며, 또한 이러한 활성성분을 유효성분으로 포함하는, 혈당강하, 근력강화 및/또는 피로회복용 식음료에 관한 것이다.

활성화된 AMPK가 혈당강하, 근력강화 등의 효과를 발휘한다는 사실이 이미 공지되어 있고, AMPK 활성화를 증진시키는 후보 물질의 스크리닝 방법이 본 발명에 의해 제공되는 이상, 이러한 후보 물질에서 활성성분을 추출하는 방법, 이들 활성성분을 사용하여 예방제, 치료제, 식음료 등을 제조하는 방법은, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 실현될 수 있으므로, 이에 대한 자세한 설명은 생략한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

웨스턴 블롯 (Western Blot) 을 이용하여 AMPK 활성화를 증가시키는 1mM AICAR와 H₂O₂를 처리한 대조군에서 p-ACC의 발현이AMPK의 기질 효소인 ACC의 Ser79의 인산화 정도 (p-ACC)를 측정하였다 (도 3). 증가하였는지를 확인하였다. 아무것도 처리하지 않은 None의 control 에 비해 1mM AICR와 1mM H₂O₂를 처리한 대조군l실험군에서 p-ACC의 발현양이 증가함을 볼 수 있다. 또한 이렇게 과발현된증가된 p-ACC가 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate) 에 특이적으로 결합하였는지를 확인하기위해여 아무것도 처리하지 않은 None과 1mM AICAR와 1mM H₂O₂를 처리한 대조군 각각에서 얻은 동량의 단백질을 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate)에 실온에서 2시간 배양시킨 후 sup상층액을 웨스턴 블롯 (Western Blot) 하였다. 이때, 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate)에 넣어준 None과 1mM AICAR와 1mM H₂O₂ 단백질과 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate)에 넣지 않은 동량의 단백질을 같이 웨스턴 블롯 (Western Blot) 하여 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate) 에 p-ACC의 결합 유무를 관찰하였다. 실험 결과 아비딘(avidin) 과 비 특이적으로 결합하는 ERK의 경우 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate) 결합 전과 후의 양이 같게 나타나지만 아비딘 (avidin)과 특이적으로 결합하는 p-ACC는 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate) 결합 후 그 양이 줄어 들었음을 관찰할 수 있다. 그러나 단백질의 양이 많을 경우 아비딘 (avidin)과 결합하지 않은 p-ACC가 상층부에 존재하게 되므로 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate) 에 넣어주는 단백질의 양 조절이 필요한 것을 알았다. 따라서 본 실험에서는 여기서 사용한 단백질의 양, 20ug 보다 적은 10ug이하로 실시하였다.

[실시예 2]

p-ACC가 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate) 에 특이적으로 결합하는 지를 확인하였다 (도 4).

p-ACC와 특이적으로 결합하는 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate) 와 비 특이적으로 결합 하는 BSA 코팅 플레이트 (BSA coating plate)에 각각 1ug, 3ug, 5ug, 7ug, 10ug의 단백질을 첨가하여 AMPK 활성 OD^450nm 을 측정하였다. 아비딘 코팅 플레이트 (avidin coating plate)에서는 control에 비해 1mM AICAR를 처리한 군에서 AMPK 활성 OD^450nm 값이 높게 났다. 또한 단백질의 양에 비례하여 AMPK의 활성 OD^450nm 정도가 증가 하였으며 단백질 양 7ug과 10ug에서는 비슷한 AMPK 활성 OD^450nm을 확인할 수 있었다. (도 4A).

반면, p-ACC와 비 특이적으로 결합하는 BSA 코팅 플레이트 (BSA coating plate)에서는 AMPK 활성 OD^450nm이 control과 1mM AICAR를 처리한 대조군에서 비슷하게 나타났다. 또한, 단백질의 양이 많아 질수록 OD^450nm 값이 증가하는 양상을 보였다. (도. 4B).

도 4의 A와 B에서는 1mM AICAR를 처리한 대조군에서 AMPK 활성 OD^450nm이 증가함을 보여 주였고 그 활성 OD^450nm정도는 단백질양이 증가할수록 높아졌다. 그러나 대조군에서도 단백질 양이 증가함에 따라 활성 OD^450nm 값도 증가 하였기에 1ug, 3ug, 5ug, 7ug, 10ug로 처리한 단백질 양 각각의 AMPK 활성을 Fold induction으로 나타내어 그 값을 비교하여 보았다(도 5). Protein의 농도가 높을수록 AMPK 활성 OD^450nm값은 높게 나타나지만, AMPK 활성 Fold induction은 단백질 양 1ug, 3ug, 5ug, 7ug, 10ug에서 2~3배 정도로 비슷한 값을 보였다.

[실시예 3]

새로운 AMPK 면역분석 시스템 (AMPK ImmunoAssay System)을 이용하여 AMPK의 활성을 측정하기 위하여 AMPK의 활성을 증가시킨다고 알려진 AICAR와 산화 스트레스를 유도하는 H₂O₂를 근육세포에 처리한 결과를 보여주고 있다 (도 6). AMPK 활성도는 1mM AICAR를 처리하였을 경우 약 3.2배 정도, 1mM H₂O₂를 처리하였을 경우 약 3배 정도가 control에 비해 증가하였음을 보여준다.

[실시예 4]

본 실험에 사용한 새로운 면역분석 시스템과 기존의 동위원소를 사용한 결과를 Fold induction 값으로 나타내어 비교해 보았다 (도 7). 두 방법 모두 1mM AICAR를 처리한 경우 control에 비해 AMPK 활성도가 약 2.5배 정도 증가함을 보여주었고 몇 가지 샘플 처리 후 AMPK fold induction 값도 서로 유사함을 보여준다.

[실시예 5] : AMPK 면역분석 ( AMPK ImmunoAssay)의 단계

1) 세포배양 (Cell culture)

근육 분화세포로 알려진 C2C12 cell line는 12well plate에서 10% bovine calf serum이 포함된 DMEM(Life Technologies) 배지에서 배양된다. 세포밀도가 85~90% 가량 되면 1% bovine calf serum이 포함된 DMEM 배지로 교체하여 6일간 근육세포로 분화시킨다.

2) 단백질 준비 (protein lysis)

배지를 제거 후 분화된 세포는 최소한의 글루코즈를 포함하는 Krebs-Ringer Buffer(25 mM HEPES, pH 7.4, 118 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.3 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.3 mM MgSO₄, 5 mM NaHCO₃, 0.07% bovine serum albumin, and 5 mM glucose)에서 2시간 더 배양한다. 이후, Positive control (1 mM AICAR) 및 약물을 30분간 처리한다. PBS로 한번 washing 후 digitonin buffer(50 mM Tris-HCl, pH 7.3, 50 mM NaF, 30 mM glycerol phosphate, 250 mM sucrose, 1 mM sodium metavanadate, and 0.4 mg/ml)를 첨가하여 세포막을 용해시켜 세포질 단백질을 얻어내고 초원심분리(14,000rpm, 10min, 4^oC)를 통해 상층액을 얻은 후 bradford protein assay (Bio-Rad)를 이용하여 단백질농도를 하였다.

3) 면역분석을 통한 활성화된 AMPK의 확인

활성화된 AMPK는 ACC를 인산화시켜 ACC의 활성을 억제한다(Yamauchi T. 2002). 이러한 인산화를 통한 ACC활성의 조절은 여러 연구에서 정리되어있는데(Hardie, D. G. 1989, Kim. K. Q. 1989, Wakil. S. J. 1983, Thampy, K. G. 1989) 최근연구에서는 ACC가 AMPK에 의해 Ser-79에서 인산화 된다고 확신하고 있다.(Ha, J., Daniel, S. 1994) 또한, p-ACC는 세포 내에서 바이오틴(biotin)과 결합되어져 있고 아비딘 (Avidin)은 이러한 바이오틴 (biotin)에 강하게 결합하는 당단백질로서 알려져 있다. 따라서, 본 실험은 Biotin-Avidin system을 이용하여 아비딘에 결합된 p-ACC를 확인하고자 하였다. 96 well plates에 아비딘(0.2ug)을 4^oC에서 12시간 코팅한 후 blocking buffer(1% BSA/ TBST)를 처리한다. 세포에서 얻어진 단백질을 아비딘 코팅 플레이트 (Avidin coating plate) 에 2시간 반응 시킨 후, 아비딘 (avidin)과 결합한 단백질을 제외한 모든 단백질은 세척 (washing) 과정에서 제거한다. 아비딘 (Avidin) 과 결합한 ACC의 인산화된 Ser-79과 특이적으로 결합하는 p-ACC(Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase)는 p-ACC (Ser79) antibody (cell Signaling Technology)를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 washing buffer로 2회 washing 한다. 이후 HRP-linked secondary Antibody(Anti-rabbit IgG)와 반응 후 10분 동안 TMB Solution(oxidation-reduction reaction)에서 발색 되어 발색을 정지 시키는 solution(1N HCl)을 첨가 한 후 450 nm에서 측정되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 5' AMP-활성화 단백질 인산화 효소 (5' AMP-activated protein kinase, AMPK)의 활성을 증가시키는 물질을 탐색하기 위한 효율적인 스크리닝 시스템을 제공한다. 기존의 스크리닝 또는 분석방법은 활성화된 AMPK를 찾아내기 위하여 많은 농도의 AMPK를 필요로 하고, 복잡한 단계를 채용해야 할 뿐만 아니라, 많은 샘플을 동일한 조건에서 처리하여 스크리닝하는 과정에서 동위원소를 사용함으로써 측정의 시간적 제약과 함께 위험성을 배가시키는 단점을 안고 있는데 비하여 본원발명의 면역분석에 기초한 ELISA 방식의 스크리닝 모델은 한번에 많은 종류의 샘플에 대한 분석이 가능하고 적은 양의 샘플농도에서도 효과적으로 측정이 가능한 분석법을 제공한다. 본원 발명의 분석법을 통하여 화합물 라이브러리는 물론, 자생식물, 한약재 등의 천연물 라이브러리로부터 효과적으로 AMPK 효소 활성 증진 물질을 스크리닝할 수 있을 뿐 아니라, 스크리닝된 물질을 유효성분으로 함유하는 비만 예방과 치료, 당뇨병 예방과 치료, 그리고 혈당강하용 제제 또는 생약제는 물론, 근력강화, 피로회복 등에 효과가 있는 식음료 소재 등의 개발에 활용할 수 있다

도 1은 AMPK의 면역분석 시스템 (AMPK ImmunoAssay System) 을 도식화하여 나타낸 것이다.

도 2는 AMPK 효소의 활성화 과정 및 AMPK 효소의 활성화를 유도하는 데에 관여하는 요소들을 도식화 한 것이다.

도 3은 활성화 인자 처리 후의 웨스턴 블롯팅 (Western Blot) 실험 결과를 나타낸 것이다. 대조

도 4는 아비딘 코팅 플레이트 p-(avidin coating plate) 와 BSA 코팅 플레이트 p- (BSA coating plate ) 의 민감도를 비교하여 나타낸 것이다.

도 5는 단백질의 농도에 따른 AMPK Activity Fold induction (값)을 나타낸 것이다.

도 6은 AMPK 면역분석시스템 (ImmunoAssay System) 을 이용하여 AMPK 활성도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 AMPK 면역분석시스템 (ImmunoAssay System) 과 기존의 동위원소를 이용한 결과를 비교하여 나타낸 것이다.

Claims

AMPK(5' AMP-activated protein kinase)에 의해 활성화인산화되는 효소 또는 그 것의 공인자(cofactor)에 특이적으로 결합하는 수용체 물질과, 미지의 시료 물질에 의해 처리된 (근육) 분화세포 혹은 동물의 조직에서 를 용해시켜 얻은 (세포질) 단백질을 반응시키는 단계 및 상기 수용체 물질에 결합되는 활성화된AMPK 기질 효소 또는 공인자의 양을 측정하는 단계를 포함하는 AMPK의 활성 측정방법
AMPK에 의해 활성화인산화되는 효소 또는 그 것의 공인자(cofactor)에 특이적으로 결합하는 수용체 물질과 미지의 시료 물질에 의해 처리된 (근육) 분화세포를 용해시켜 얻은 (세포질) 단백질을 반응시키는 단계 및 상기 수용체 물질에 결합되는 활성화인산화된 효소 또는 공인자의 양을 측정하는 단계를 포함하는 AMPK 활성화 물질 또는 활성화 억제물질의 탐색방법
제 2 항에 있어서, 1) (근육) 분화세포를 starvation 시킨 후 미지의 시료 물질을 처리하는 반응 시키는 단계, 2) 상기 시료 물질이 처리된 세포를 적절한 조건에서 배양한 후 용해하여 (세포질) 단백질을 포함하는 용해된 세포를 얻는 단계, 3) 상기 용해된 세포와 AMPK에 의해 활성화인산화되는 효소 또는 공인자(cofactor)에 특이적으로 결합하는 수용체 물질과 반응하도록 하여 결합시키는 단계, 4) 결합되지 않은 단백질을 세척하는 단계, 5) AMPK에 의해 활성화되는 효소 또는 공인자(cofactor) 에 특이적인 1차 항원을 결합시키고, 다시 HRP로 표지된 2차 항원과 추가로 결합시키는 단계 및 6) HRP로 표지된 2차 항원 (HRP-linked Ab)의 발색반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함하는 AMPK활성화 인자를 탐색하는 면역분석 방법
제 3 항에 있어서, 상기 방법은 digitonin solution 을 이용하여 세포를 용해시키고, 5,5’-tetramethyl-benzidine(TMB) solution을 사용하여 발색반응 시키는 것임을 특징으로 하는 방법
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 반응은 96-웰 플레이트(96-well plate)또는 멀티-웰 플레이트 (multi-well plate) 에서 이루어지는 것임을 특징으로 하는 방법
제 1 항 내지 제 5 항에 있어서, 상기 수용체 물질은 당 단백질인 것임을 특징으로 하는 방법
제 6 항에 있어서, 상기 당 단백질은 아비딘(avidin) 인 것임을 특징으로 하는 방법
제 1 항 내지 제 5 항에 있어서, 상기 AMPK(5' AMP-activated protein kinase)에 의해 활성화인산화되는 효소 또는 그것의 공인자(cofactor)는 ACC1 (acetyl-CoA carboxylase 1), ACC2 (acetyl-CoA carboxylase 2), PCC (propionly-CoA carboxylase), PC (pyruvate carboxylase), MCC (methylcrotonyl-CoA), AICAR (5-amino-4-imidaxolecarboxamide riboside), ZMP (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide), AMP(Adenosine monophosphate), 바이오틴 (biotin), 또는 그것들의 활성화된 형태(예 : pACC) 중에서 선택된 어느 하나인 것임을 특징으로 하는 방법
제 8 항에 있어서, 상기 AMPK(5' AMP-activated protein kinase)에 의해 활성화되는 효소는 ACC1 (acetyl-CoA carboxylase 1), ACC2 (acetyl-CoA carboxylase 2), AICAR (5-amino-4-imidaxolecarboxamide riboside) 중에서 선택된 하나이고, 상기 공인자(cofactor)는 바이오틴 (biotin)이며, 수용체 물질은 아비딘(avidin)인 것임을 특징으로 하는 방법
제 1 항 내지 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 지방산 합성 저해, 지방산 분해 촉진, 근력 강화, 지구력 강화, 피로회복 촉진, 혈당 강하, 콜레스테롤 합성 저해 활성물질의 탐색임을 특징으로 하는 방법
제 1 항 내지 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 비만 예방 및 치료, 당뇨 예방 및 치료, 근력 및 지구력 강화, 피로회복, 동맥경화, 고 지혈증 치료 물질 중 선택된 하나 이상의 탐색임을 특징으로 하는 방법
1) AMPK(5' AMP-activated protein kinase)에 의해 활성화인산화되는 효소 또는 그것의 공인자(cofactor)에 특이적으로 결합하는 수용체 물질과 2) AMPK(5' AMP-activated protein kinase)에 의해 활성화되는 효소 또는 그것의 공인자(cofactor)에 특이적인 1차 항체, 3) 1차 항체에 대한 HRP로 표지된 2차 항체 및 4) HRP에 대한 발색반응 물질과 필요에 따라 발색 측정장치를 포함하여 구성되는 AMPK (5' AMP-activated protein kinase) 활성화 물질의 탐색 키트
제 1 2 항에 있어서, AMPK(5' AMP-activated protein kinase)에 의해 활성화되는 효소 또는 그것의 공인자(cofactor)는 ACC1 (acetyl-CoA carboxylase 1), ACC2 (acetyl-CoA carboxylase 2), PCC (propionly-CoA carboxylase), PC (pyruvate carboxylase), MCC (methylcrotonyl-CoA), AICAR (5-amino-4-imidaxolecarboxamide riboside), ZMP (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide), AMP(Adenosine monophosphate), biotin, 또는 그것들의 활성화된 형태 (예 : pACC) 중에서 선택된 어느 하나인 것임을 특징으로 하는 키트
제 1 2 항에 있어서, 상기 장치는 96-웰 플레이트(96-well plate) 또는 멀티-웰 플레이트 (multi-well plate) 인 것임을 특징으로 하는 키트