KR20050020956A - 폴리펩타이드 및 생합성 경로 - Google Patents

폴리펩타이드 및 생합성 경로 Download PDF

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KR20050020956A KR10-2004-7017096A KR20047017096A KR20050020956A KR 20050020956 A KR20050020956 A KR 20050020956A KR 20047017096 A KR20047017096 A KR 20047017096A KR 20050020956 A KR20050020956 A KR 20050020956A
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Abstract

본 발명은 글루코스, 트립토판, 인돌-3-젖산, 인돌-3-피루브산염 및 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산으로부터 모나틴을 제조하는데 사용할 수 있는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인돌-3-피루브산염과 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산 중간체를 제조하는 방법도 제공한다. 본 발명에 제공된 조성물은 핵산 분자, 폴리펩타이드, 화학적 구조물 및 세포를 포함한다. 본 발명의 방법은 시험관내 방법 및 생체내 방법을 모두 포함하며 시험관내 방법은 화학 반응을 포함한다.

Description

폴리펩타이드 및 생합성 경로{POLYPEPTIDES AND BIOSYNTHETIC PATHWAYS}
관련 출원 정보
본 출원은 2002년 4월 23일에 출원된 미국 특허 출원 60/374,831호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 인돌-3-피루브산염, 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산(MP) 및/또는 모나틴 제조에 유용한 폴리펩타이드 및 생합성 경로에 관한 것이다.
인돌 피루브산염
인돌-3-피루브산염은 산소가 고농도인 조직에서 산화성 스트레스에 대응 작용하는 것으로 사료되는 강력한 항산화제이다(Politi et al. "Recent advances in Tryptophan Research", edited by G.A.Filippini et al., Plenum Press, New York, 1996, pp 291-8). 또한, 인돌 피루브산염은 주요 식물 성장 호르몬 옥신(확산성 성장 촉진 인자)인 인돌-아세트산(IAA)을 생성하는 경로의 중간체이다. IAA는 일정 범위의 생리학적 공정, 예컨대 정아 우세성, 굴성, 지맥 신장성, 형성층 세포 분열 유도 및 발근 개시등에서 마이크로그람 이하의 양으로 활성을 나타낸다. 합성 옥신은 원예학에서 발근 유도와 과일 결실 및 성장의 촉진에 사용되는 것이다. 고농도의 합성 옥신은 활엽식물에 대한 제초제로서 효과적이다. 발효 생산되는 천연 옥신은 합성 제초제에 비해 환경 친화성인 것으로 볼 수 있다. 성장 조절제는 1999년 4억 파운드(14억 U.S.달러) 어치가 전세계적으로 판매되었다.
인돌 아세트산과 이의 유도체에 대한 몇가지 특허에는 미국 특허 제5,843,782호(Micropropagation of rose plants, auxin used in culture medium) 및 미국 특허 제5,952,231호(Micropropagation of rose plants)가 있다.
식물에 관련된 유용성 외에도 인돌 아세트산은 약학적 용도에도 유용하다. 미국 특허 제5,173,497호("Method of preparing alpha-oxopyrrolo[2,3-B]indole acetic acids and derivatives")는 알쯔하이머병 및 노인성 치매에 관련된 것과 같은 기억 손상을 치료하는데 유용한 이 화합물의 용도를 제안하고 있다. 미국 특허 제5,173,497호에 제안된 기작은 이 화합물이 폴리펩타이드 아세틸콜린스테라제를 억제하고 뇌에 아세틸콜린의 농도를 증가시킨다는 것이다.
인돌-3-카르비놀은 인돌-3-아세트산으로부터 퍼옥사다제 촉매 산화를 통해 생산되고 디인돌릴메탄으로 용이하게 전환될 수 있다. 이 두 화합물은 독소를 제거하고 여성의 건강에 유리한 호르몬 생산을 촉진하는 것으로 보고되고 있다.
트립토판 유도체
염소화된 D-트립토판은 무영양성 감미제로 동정되었고, 후속되는 다른 유도체에도 관심이 증가되고 있다. 모나틴은 아미노산 트립토판과 조성이 유사한 천연 감미제이다. 모나틴은 남아프리카 관목인 스클레로키톤 일리시폴리우스(Sclerochiton ilicofolius)의 뿌리 껍질에서 추출될 수 있고 고강도 감미제로서 식품과 음료 산업에서 촉망받고 있다. 모나틴에 대한 몇가지 특허로는 미국 특허 5994559(Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetner), 미국 특허 4975298(3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds), 미국 특허 5128164(Composition for human consumption containing 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds; 및 미국 특허 5128482(Process for the production of 3-1(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)indole)이 있다.
여기에 기술된 모나틴 전구체 일부도 합성 감미제로서 또는 모나틴 유도체 합성의 중간체로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 모나틴 및/또는 인돌-3-피루브산염을 제조하는데 사용된 생합성 경로를 도시한 것이다. 한 경로는 인돌-3-피루브산염을 트립토판을 통해 생성하고 다른 경로는 3-젖산을 통해 생성하고 있다. 이어서 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산(MP) 중간체를 통해 모나틴이 생성된다.
박스 안에 제시된 화합물은 기질과 생합성 경로에서 생성된 산물이다.
화살표 옆에 제시된 조성물은 보조인자이거나 기질이 산물로 전환되는 동안에 사용될 수 있는 반응물이다. 사용된 보조인자 또는 반응물은 생합성 경로의 구체적 단계에 사용된 폴리펩타이드 마다 달라진다. 보조인자 PLP(피리독살 5'-인산염)는 폴리펩타이드와 무관하게 반응을 촉매할 수 있어서, 단순히 PLP를 제공하면 기질이 산물로 진행될 수 있다.
도 2는 MP 중간체를 이용하는 생합성 경로의 보다 상세한 도식이다. 이 경로의 각 단계에 사용된 기질은 박스로 표시하였다. 각 기질을 전환시키는 폴리펩타이드는 각 기질 사이에 위치한 화살표 옆에 기재하였다. 각 폴리펩타이드는 일반명과 효소 분류(EC) 번호로 기재하였다.
도 3은 인돌-3-젖산을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 생합성 경로의 보다 상세한 도식이다. 기질은 박스로 표시하였고, 각 기질을 전환시키는 폴리펩타이드는 각 기질 사이에 위치한 화살표 옆에 기재하였다. 각 폴리펩타이드는 일반명과 효소 분류(EC) 번호로 기재하였다.
도 4는 화학적 수단을 통해 MP를 제조할 수 있는 가능한 1가지 반응을 도시한 것이다.
도 5A 및 도 5B는 효소적으로 생성된 모나틴을 LC/MS로 확인한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 6은 효소적으로 합성된 모나틴의 전기분사 질량 스펙트럼이다.
도 7A 및 도 7B는 효소적 혼합물에서 생성된 모나틴의 LC/MS/MS 딸 이온 분석 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 8은 효소적으로 생성된 모나틴의 고해상도 질량 분석 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 9A 내지 도 9C는 (A) R-트립토판, (B) S-트립토판 및 (C) 효소적으로 생성된 모나틴의 키랄 분리를 나타낸 크로마토그램이다.
도 10은 IPTG 유도 후 박테리아 세포에서 생성된 모나틴의 상대적 양을 나타낸 막대 그래프이다. (-)는 기질 무첨가(트립토판 또는 피루브산염 무첨가)를 나타낸다.
도 11 및 도 12는 트립토판 또는 인돌-3-피루브산염으로부터 생성되는 모나틴의 수율을 증가시키기 위해 사용된 경로를 도시한 모식도이다.
도 13은 트립토판 또는 인돌-3-피루브산염으로부터 생성되는 모나틴의 수율을 증가시키기 위해 사용할 수 있는 경로를 도시한 모식도이다.
서열 목록
첨부한 서열 목록에 열거된 핵산 서열과 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기의 표준 문자 약어와 아미노산의 3문자 코드를 사용하여 제시하였다. 각 핵산 서열은 1가닥만을 제시하였으나, 이와 같이 제시된 가닥을 참조로 하여 알 수 있는 상보적 가닥도 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
서열 번호 1 및 2는 시노라이조븀 멜리로티(Sinorhizobium meliloti)에서 유래하는 아미노전이효소의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다(tatA 유전자, 문헌에서는 타이로신 또는 방향족 아미노전이효소라고 부름).
서열 번호 3 및 4는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)(2.4.1)에서 유래하는 타이로신 아미노전이효소의 핵산 서열과 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다(tatA(서열번호 1 및 2)와의 상동성으로 인해 게노믹스 소프트웨어에서는 "아스파르트산염 아미노전이효소"인 것으로 추정하고 있음).
서열번호 5 및 6은 로도박터 스페로이드(35053)에서 유래하는 아미노전이효소의 핵산 서열과 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다(2.4.1 서열, 서열번호 3과 4에 근거하여 클로닝한 신규물).
서열번호 7 및 8은 레이쉬마니아 메이저(Leishmania major)에서 유래하는 광범위 기질 아미노전이효소(bsat)의 핵산 서열과 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열번호 9 및 10은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 유래하는 방향족 아미노전이효소(ara T)의 핵산 서열과 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열번호 11 및 12는 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus)에서 유래하는 방향족 아미노전이효소의 핵산 서열과 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다(상동성에 의해 방향족 아미노전이효소로 확인됨).
서열번호 13 및 14는 R.스페로이드(35053)에서 유래하는 다중 기질 아미노전이효소(msa)의 핵산 서열과 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다(수탁번호 AAAE01000093.1(bp 14743-16155) 및 수탁번호 ZP00005082.1과의 상동성에 의해 다중 기질 아미노전이효소로 확인됨).
서열번호 15 및 16은 B.서브틸리스 D-알라닌 아미노전이효소(dat) 서열을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 17 및 18은 S.멜리로티 tatA 서열을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 19 및 20은 B.서브틸리스 araT 아미노전이효소 서열을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 21 및 22는 로도박터 스페로이드(2.4.1 및 35053)의 다중 기질 아미노전이효소 서열을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 23 및 24는 레이쉬마니아 메이저의 bsat 서열을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 25 및 26은 락토바실러스 아밀로보러스의 araT 서열을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 27 및 28은 R.스페로이드 tatA 서열(2.4.1 및 35053)을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 29 및 30은 대장균 aspC 서열(유전자 서열 진뱅크 수탁번호 AE000195.1, 단백질 서열 진뱅크 수탁번호 AAC74014.1)을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 31 및 32는 대장균에서 유래하는 방향족 아미노전이효소(tyrB)의 핵산 서열과 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열번호 33 및 34는 대장균 tyrB 서열을 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 35 내지 40은 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 알돌라제(KHG)(EC 4.1.3.16) 활성이 있는 폴리펩타이드를 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 41 및 42는 단백질 P00913(GI:401195) 및 P31013(GI:401201)을 각각 암호화하는 대장균에서 유래하는 트립토파네이즈(tna) 및 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii)에서 유래하는 타이로신 페놀-분해효소(tpl)의 핵산 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열번호 43 내지 46은 트립토파네이즈 폴리펩타이드 및 β-타이로시나제(타이로신 페놀-분해효소) 폴리펩타이드를 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 47 내지 54는 트립토파네이즈 폴리펩타이드 및 β-타이로시나제 폴리펩타이드를 돌연변이시키는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 55 내지 64는 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.17) 활성이 있는 폴리펩타이드를 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 65 및 66은 C.테스토스테로니(C.testosteroni)에서 유래하는 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(proA)의 핵산 서열과 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열번호 67 및 68은 pET30 Xa/LIC 중에 대장균 aspC를 보유한 오페론에서 C.테스토스테로니 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(proA)를 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 69 내지 72는 pESC-his에서 대장균 aspC와 C.테스토스테로니 proA를 클로닝하는데 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.
서열번호 73 및 74는 본 발명에 개시된 유전자의 클로닝에 사용된 프라이머의 5' 말단에 첨가되는 서열을 나타낸 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
약어 및 용어
다음에 제시되는 용어와 방법의 설명은 본 발명을 보다 상세히 기술하고 당업자가 본 발명을 실시할 때 지표가 될 수 있게 하기 위한 것이다. 본 명세서에 사용된 "함유하는"이란 용어는 "포함하는"을 의미하는 것이고 단수적 표현은 다른 분명한 표시가 없는 한 복수적 의미도 포함하는 것이다. 예를 들어, "단백질을 함유하는"이란 표현은 그러한 하나의 단백질 또는 복수의 단백질을 포함하는 것이고, "세포를 함유하는"이란 표현도 당업자에게 공지된 세포 및 이의 등가물을 1종 이상 포함하는 것 등을 의미한다.
다른 표시가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 용어와 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 같은 의미를 나타내는 것이다. 본 명세서에 개시된 것과 유사하거나 동일한 방법과 재료는 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만 적당한 방법과 재료는 하기에 제시하는 바와 같다. 제시된 재료, 방법 및 실시예는 예시적인 것으로서, 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다. 다음과 같은 상세한 설명과 청구의 범위를 살펴보면 본 발명의 다른 특징과 장점도 드러나게 될 것이다.
cDNA (상보성 DNA ): 전사를 결정하고, 내부, 비암호 분절(인트론) 및 조절 서열이 없는 DNA 단편. cDNA는 세포에서 추출한 메신저 RNA로부터 역전사에 의해 실험실에서 합성할 수 있다.
보존적 치환: 유사한 생화학적 성질을 가진 아미노산 잔기로의 1개 이상의 아미노산의 치환(예컨대, 2개, 5개 또는 10개 잔기). 일반적으로, 보존적 치환은 생성되는 폴리펩타이드의 활성에 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않는다. 예를 들어, 이상적으로는 1개 이상의 보존적 치환을 포함하는 트립토판 아미노전이효소 폴리펩타이드가 트립토판 아미노전이효소 활성을 보유하는 것이다. 예를 들어, 부위 지시성 돌연변이유발 또는 PCR과 같은 표준 절차를 사용하면 그 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 조작을 통해 1개 이상의 보존적 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
치환성 변형체는 아미노산 서열 중의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 위치에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 단백질에 존재하는 원 아미노산 대신에 치환되어도 좋고 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 예로는 다음과 같은 것이 있다: ala - ser 또는 thr로 치환; arg - gln, his 또는 lys으로 치환; asn - glu, gln, lys, his, asp로 치환; asp - asn, glu 또는 gln으로 치환; cys = ser 또는 ala으로 치환; gln - asn, glu, lys, his, asp 또는 arg으로 치환; glu - asn, gln, lys 또는 asp로 치환; gly - pro로 치환; his - asn, lys, gln, arg, tyr으로 치환; ile - leu, met, val, phe으로 치환; leu - ile, met, val, phe으로 치환; lys - asn, glu, gln, his, arg 으로 치환; met - ile, leu, val, phe으로 치환; phe - trp, tyr, met, ile, 또는 leu 으로 치환; ser - thr, ala으로 치환; thr - ser 또는 ala으로 치환; trp - phe, tyr로 치환; tyr - his, phe 또는 trp로 치환; 및 val - met, ile, leu으로 치환.
보존적 치환에 대한 또 다른 정보는 다른 문헌들 중에서 특히 Ben-Bassat et al.(J.Bacteril. 169:751-7, 1987), O'Regan et al.,(Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al.,(Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli et al.,(Bio/Technology 6:1321-5, 1988), WO 00/67796(Curd et al.) 및 유전학 및 분자생물학의 표준 서적에서 찾아볼 수 있다.
외인성 : 핵산 및 특정 세포와 관련하여 본 명세서에 사용된 "외인성"이란 용어는 자연에서 발견되는 특정 세포가 기원이 아닌 모든 핵산을 의미한다. 따라서, 비자연발생성 핵산은 세포에 도입되면 세포에 외인성인 것으로 간주한다. 자연발생의 핵산도 역시 특정 세포에 대해서는 외인성일 수 있다. 예를 들어, 사람 X의 세포에서 분리된 완전 염색체는 이 염색체를 Y 세포에 도입하는 경우에 사람 Y의 세포에 대해 외인성인 핵산이다.
기능적 등가: 동등한 기능을 보유하는 것. 효소인 경우에, 기능적 등가인 분자에는 그 효소의 기능을 보유하는 다른 분자가 포함된다. 예를 들어, 기능적 등가물은 효소 서열의 서열 변화에 의해 제공될 수 있는데, 여기서 1 이상의 서열 변화가 있는 펩타이드는 그 효소 활성을 나타낼 정도로 미변형 펩타이드의 기능을 보유하는 것이다. 특정 구체예로서, 트립토판 아미노전이효소의 기능적 등가물은 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 성질을 보유한다.
서열 변형의 예로는 보존적 치환, 결실, 돌연변이, 구조이동 및 삽입이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 일 예로서, 소정의 폴리펩타이드가 항체에 결합하는 경우, 그 기능적 등가물은 동일한 항체에 결합하는 폴리펩타이드이다. 즉, 기능적 등가물은 폴리펩타이드와 동일한 결합 특이성을 갖고 그 폴리펩타이드 대신에 시약으로 사용될 수 있는 펩타이드를 포함한다. 일 예로서, 기능적 등가물에는 결합 서열이 불연속성이고 항체가 선형 에피토프에 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다. 즉, 펩타이드 서열이 MPELANDLGL(서열번호 12의 아미노산 1 내지 10)인 경우, 기능적 등가물에는 다음과 같이 나타낼 수 있는 불연속성 에피토프를 포함한다: NH2-**-M**P**E**L**A**B**D**L**G**L-COOH. 이 예에서, 이 폴리펩타이드의 입체 구조가 서열번호 12의 아미노산 1 내지 10에 결합하는 모노클론 항체에 결합할 수 있다면, 이 폴리펩타이드는 서열번호 12의 아미노산 1 내지 10에 기능적 등가물인 것이다.
하이브리드화: 본 명세서에 사용된 "하이브리드화"라는 용어는 상보성인 일본쇄 DNA 및/또는 RNA가 이본쇄 분자를 형성하는 성질에 근거하여 시험하는, 두 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열의 상보성 검사방법을 의미한다. 핵산 하이브리드화 기술은 분 발명의 범위에 속하는 분리된 핵산을 수득하는데 사용할 수 있다. 간략히 설명하면, 서열번호 11에 기재한 서열과 약간의 상동성을 보유한 모든 핵산은 중간 내지 높은 엄중도 조건하에서의 하이브리드화를 통해 유사한 핵산을 확인할 수 있는 프로브(probe)로서 사용할 수 있다. 확인되면, 핵산은 그 다음 정제하고, 서열분석한 뒤 본 발명의 범위에 속하는지의 여부를 결정하는 분석을 실시할 수 있다.
하이브리드화는 서던 분석이나 노던 분석을 통해 행하여 프로브에 하이브리드하는 DNA 서열 또는 RNA 서열을 각각 확인할 수 있다. 이 프로브는 비오틴, 디곡시게닌, 폴리펩타이드 또는 32P와 같은 방사능동위원소로 표지할 수 있다. 피분석물인 DNA 또는 RNA는 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동적으로 분리한 뒤, 니트로셀룰로스, 나일론 또는 다른 적합한 막으로 전이시킨 다음, 당해 기술분야에 공지된 표준 기법(예컨대 Sambrook et al.,(1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY의 섹션 7.39-7.52에 기술된 방법)을 사용하여 프로브와 하이브리드시켰다. 일반적으로, 프로브는 길이가 적어도 약 20개인 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 서열번호 11에 기술한 연속된 20개 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 프로브는 동일하거나 유사한 핵산을 동정하는데 사용할 수 있다. 또한, 20개 보다 길거나 짧은 뉴클레오타이드의 프로브도 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 길이가 적어도 약 12개 염기(예컨대, 적어도 약 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 100개, 250개, 500개, 750개, 1000개, 1500개, 2000개, 3000개, 4000개 또는 5000개 염기)이고, 하이브리드화 조건에서 서열번호 11에 기재된 서열을 가진 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥에 하이브리드하는 분리된 핵산 서열을 제공한다. 여기서, 하이브리드 조건은 중간 또는 높은 엄중도의 하이브리드 조건일 수 있다.
본 발명을 개시하는데 있어서, 중간 엄중도의 하이브리드 조건은 25mM KPO4(pH 7.4), 5X SSC, 5X 덴하르트 용액, 50㎍/ml 변성되고 초음파처리된 연어 정자 DNA, 50% 포름아마이드, 10% 덱스트란 설페이트 및 1 내지 15ng/ml의 프로브(약 5x107 cpm/㎍)를 함유하는 하이브리드 용액 중에서 약 42℃하에 하이브리드화를 실시하고, 2X SSC와 0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 함유하는 세척 용액을 사용하여 약 50℃에서 세척을 수행하는 것을 의미한다.
높은 엄중도의 하이브리드 조건은 25mM KPO4(pH 7.4), 5X SSC, 5X 덴하르트 용액, 50㎍/ml 변성되고 초음파처리된 연어 정자 DNA, 50% 포름아마이드, 10% 덱스트란 설페이트 및 1 내지 15ng/ml의 프로브(약 5x107 cpm/㎍)를 함유하는 하이브리드 용액 중에서 약 42℃하에 하이브리드화를 실시하고, 0.2X SSC와 0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 함유하는 세척 용액을 사용하여 약 65℃에서 세척을 수행하는 것을 의미한다.
분리된: 핵산과 관련하여 본 명세서에 사용된 "분리된"이란 용어는 이 핵산이 유래된 유기체의 자연 발생의 게놈에서 직접 인접해 있는(한쪽은 5'말단에, 다른 쪽은 3' 말단에) 두 서열에 직접 접하지 않는 자연발생의 핵산을 의미한다. 예를 들어, 분리된 핵산은 임의 길이의 재조합 DNA 분자로서, 단 자연 발생의 게놈에서 상기 재조합 DNA 분자에 일반적으로 직접 접해 있는 것으로 관찰되는 핵산 서열 중 하나가 제거되거나 존재하지 않는 것이어야 하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉, 분리된 핵산에는 다른 서열에 무관하게 별도의 분자로서 존재하는 재조합 DNA(예컨대, PCR이나 제한효소 처리에 의해 생성되는 cDNA 또는 게놈 DNA 단편) 뿐만 아니라 벡터, 자율 복제성 플라스미드, 바이러스(예, 레트로바이러스 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스), 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA에 통합되어 있는 재조합 DNA가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 분리된 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산 서열의 일부인 재조합 DNA 분자를 포함할 수도 있다.
핵산과 관련하여 본 명세서에 사용된 "분리된"이란 용어는 또한 자연 발생의 게놈에서 직접 접해있는 서열이 없고 비자연발생의 핵산 서열이 자연에서는 관찰되지 않기 때문에 임의의 비자연발생의 핵산을 포함하기도 한다. 예를 들어, 유전자조작된 핵산과 같은 비자연발생의 핵산은 분리된 핵산으로 간주한다. 유전자조작된 핵산은 일반 분자 클로닝 또는 화학적 핵산 합성 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 분리된 비자연발생의 핵산은 다른 서열과 무관하게 존재하거나, 또는 벡터, 자율 복제성 플라스미드, 바이러스(예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스), 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA에 통합되어 존재할 수 있다. 또한, 비자연발생의 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산 서열의 일부인 핵산 분자를 포함할 수 있다.
cDNA 또는 게놈 라이브러리 등에서 수백 내지 수백만개의 다른 핵산 분자 가운데 존재하는 핵산 또는 게놈 DNA 제한 분해물을 함유하는 겔 조각은 분리된 핵산으로 간주되지 않는다는 것을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.
핵산: 본 명세서에 사용된 "핵산"이란 용어는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성(예, 화학적 합성) DNA(이에 제한되지 않음) 등을 비롯하여 RNA 및 DNA 모두를 포함하는 것이다. 핵산은 이본쇄이거나 일본쇄일 수 있다. 일본쇄인 경우 핵산은 센스 가닥이거나 안티센스 가닥일 수 있다. 또한, 핵산은 환상이거나 선형일 수 있다.
작동적으로 결합된: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계 하에 배치된다면 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 "작동적으로 결합된" 것이다. 예를 들어, 프로모터가 암호 서열의 전사에 영향을 미친다면 그 프로모터는 암호 서열과 작동적으로 결합된 것이다. 일반적으로, 작동적으로 결합된 DNA 서열은 인접해 있고, 두 폴리펩타이드 암호 영역의 결합에 필요하다면 동일한 리딩 프레임에 위치한다.
펩타이드 변형: 본 발명은 효소 및 이의 합성물도 포함한다. 또한, 목적한 효소 활성이 있다면 유사체(비펩타이드 유기 분자), 유도체(개시된 펩타이드 서열을 출발물로 하여 수득한 화학적 작용기를 가진 펩타이드 분자) 및 변형체(동족체)도 본 명세서에 기술된 방법에 이용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 펩타이드는 자연발생 및 비자연발생의 L-아미노산 및/또는 D-아미노산일 수 있는 아미노산의 서열을 포함한다.
펩타이드는 미변형 펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖고, 경우에 따라 다른 바람직한 성질도 갖는 유도체를 생성하기 위하여 각종 화학적 기법으로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질의 카르복실산 기는 카르복시 말단 또는 측쇄 여부에 관계없이 약학적 허용성 양이온의 염 형태로 제공되거나 또는 에스테르화되어 C1 내지 C16 에스테르를 형성하거나 또는 화학식 NR1R2(여기서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 C1 내지 C16 알킬임)으로 표시되는 아미드로 전환되거나 또는 결합되어 헤테로시클릭 고리, 예컨대 5원 또는 6원 고리를 형성할 수 있다. 펩타이드의 아미노 기는 아미노 말단 또는 측쇄 여부에 관계없이 약학적 허용성 산 부가 염 형태, 예컨대 HCl염, HBr염, 아세트산염, 벤조산염, 톨루엔 설폰산염, 말레산염, 타르타르산염 및 기타 다른 유기산염이거나 또는 C1 내지 C16 알킬 또는 디알킬 아미노로 변형되거나 또는 아미드로 추가 전환될 수 있다.
펩타이드 측쇄의 하이드록실 기는 공지된 기법을 사용하여 C1 내지 C16 알콕시 또는 C1 내지 C16 에스테르로 전환될 수 있다. 펩타이드 측쇄의 페닐 및 페놀 고리는 1 이상의 할로겐 원자, 예컨대 F, Cl, Br 또는 I로 치환되거나 또는 C1 내지 C16 알킬, C1 내지 C16 알콕시, 카르복실산 및 이의 에스테르 또는 이 카르복실산의 아미드로 치환될 수 있다. 펩타이드 측쇄의 메틸렌 기는 동종의 C2 내지 C4 알킬렌으로 연장될 수 있다. 티올은 아세트아미드 기와 같은 다수의 공지된 보호기 중 어느 하나로 보호될 수 있다. 또한, 당업자라면 안정성을 향상시키는 구조를 선택하여 형태적 제한을 두기 위해 본 발명의 펩타이드에 고리 구조를 도입시키는 방법을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 펩타이드에 C 말단이나 N 말단 시스테인을 첨가하면 이 펩타이드의 산화 시 이황화 결합이 형성되어 고리형 펩타이드가 생성되게 된다. 다른 펩타이드 고리화 방법으로는 티오에테르 및 카르복시 말단과 아미노 말단의 아미드 및 에스테르의 형성이 있다.
또한, 펩타이드모방체 및 유기모방체도 본 발명의 범위에 속하는데, 이러한 펩타이드모방체 및 유기모방체의 화학적 구성성분들의 3차원적 배열은 펩타이드 주쇄 및 구성된 아미노산 측쇄의 3차원적 배열을 모방하고 있어서 이러한 본 발명에 개시된 단백질의 펩타이드모방체 및 유기모방체는 검출가능한 효소 활성을 갖게 된다. 컴퓨터 모델링을 통해 활용 시, 약물작용발생단은 생물학적 활성에 필요한 구조적 조건을 갖춘 이상적인 3차원 정의이다. 펩타이드모방체 및 유기모방체는 현재 통용되는 컴퓨터 모델링 소프트웨어(컴퓨터 이용 약물 디자인 또는 CADD)를 사용하여 각 약물작용발생단에 맞게 디자인할 수 있다. CADD에 사용된 기술은 문헌[Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", in Klegerman & Groves(eds.), Pharmaceutical Biotechnology, 1993, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165-74 및 Ch. 102 in Munsosn(ed.). Principles of Pharmacology, 1995, Chapman & Hall]에 설명되어 있다. 또한, 본 발명의 범위에는 이러한 기술을 사용하여 제조한 모방체도 포함된다. 일 예로서, 모방체는 효소, 이의 변형체, 단편 또는 융합체가 나타내는 효소 활성을 모방하는 것이다.
프로브 및 프라이머 : 핵산 프로브와 프라이머는 본 명세서에 개시된 아미노산 서열과 핵산 서열을 기본으로 하여 용이하게 제조할 수 있다. "프로브"는 검출가능한 표지(label) 또는 리포터 분자를 함유하는 분리된 핵산을 포함한다. 표지의 예로는 방사능활성 동위원소, 리간드, 화학발광성 제제 및 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 표지화 방법 및 각종 목적에 적당한 표지 선택의 안내는 예컨대 문헌[Sambrook et al.(ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, and Ausubel et al.(ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(with periodic updates), 1987]에 논의되어 있다.
"프라이머"는 일반적으로 뉴클레오타이드가 10개 이상인 핵산 분자(예컨대, 뉴클레오타이드가 약 10개 내지 약 100개인 핵산 분자)이다. 프라이머는 핵산 하이브리드화를 통해 상보적인 표적 핵산 가닥에 어닐링하여 프라이머와 표적 핵산 가닥 사이에 하이브리드를 형성한 다음, 예컨대 DNA 폴리머라제 폴리펩타이드를 이용하여 표적 핵산 가닥을 따라 연장될 수 있다. 프라이머 쌍은 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 당해 기술분야에 공지된 다른 핵산 증폭 방법을 통해 핵산 서열의 증폭에 사용될 수 있다.
프로브와 프라이머를 제조하고 사용하는 방법은 예컨대 문헌[]에 기술되어 있다. PCR 프라이머 쌍은 공지의 서열로부터, 예컨대 Primer(Version 0.5, ⓒ1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.)와 같은 그런 목적용의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 제조할 수 있다. 당업자라면 특정 프로브 또는 프라이머의 특이성이 길이에 따라 증가하지만, 프로브 또는 프라이머는 전장의 서열에서부터 5개 정도의 짧은 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 서열에 이르기까지 다양한 크기일 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 예를 들어 15개 뉴클레오타이드로만 이루어진 프라이머 보다 더 높은 특이성을 가진 프라이머로 표적화하고자 하는 경우에는 20개의 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머를 어닐링할 수 있다. 즉, 보다 높은 특이성을 수득하기 위해서는 예컨대, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 5000, 5050, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300, 5350, 5400, 5450 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 것 중에서 선택할 수 있다.
프로모터: 핵산의 전사를 유도하는 핵산 조절 서열의 배열. 프로모터는 전사 개시 부위 부근에 존재하는 필수 핵산 서열, 예컨대 폴리머라제 II형 프로모터인 경우에는 TATA 인자를 포함한다. 프로모터는 전사 개시 부위로부터 수천개의 염기쌍 정도가 떨어진 위치에 존재할 수 있는 원거리 증강인자(인헨서) 또는 억제인자(리프레서)를 포함할 수 있다.
정제된: 본 명세서에 사용된 "정제된"이란 용어는 절대적 순도를 필요로 하는 것이 아니며, 다소 상대적 용어로 이해되어야 한다. 예컨대, 정제된 폴리펩타이드 또는 핵산 제제는 유기체 내의 자연 환경에서 존재할 수 있는 폴리펩타이드 또는 핵산의 농도 보다 높은 농도인 것일 수 있다. 예를 들어, 제조물 중의 폴리펩타이드 함량이 제조물의 총 단백질 함량의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99%이면 정제된 것으로 간주할 수 있다.
재조합체 : "재조합체" 핵산은 (1) 발현되는 유기체 내에는 본래 존재하지 않는 서열 또는 (2) 2가지 다른 별개의 짧은 서열을 인위적으로 조합하여 만든 서열이다. 이러한 인위적 조합은 흔히 화학적 합성이나 또는 보다 일반적으로는 분리된 핵산의 분절을 인위적으로 조작하여, 예컨대 유전자조작법을 이용하여 행해지는 것이다. 또한, "재조합체"는 인위적으로 조작되었지만 핵산이 분리된 유기체에서 발견되는 것과 같은 조절 서열과 암호 영역을 함유하는 핵산 분자를 나타내기도 한다.
서열 동일성: 아미노산 서열 사이의 유사성은 서열 사이의 유사성으로 나타내며, 서열 동일성이라 부르기도 한다. 서열 동일성은 종종 동일성(또는 유사성 또는 상동성) 비율을 통해 측정하는데, 이 비율이 높으면 두 서열이 보다 유사한 것이다. 서열번호 12와 같은 펩타이드 동족체 또는 변형체는 표준 방법으로 정렬 시 비교적 높은 서열 동일성을 나타내는 것이다.
비교 목적으로 서열을 정렬하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 각종 프로그램과 정렬 알고리듬이 다수의 문헌에 기술되어 있다[Smith and Waterman, Adv.Appl.Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol. 48:443-53, 1970: Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:2444-8, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90, 1988; 및 Altschul et al., Nature Genet. 6:119-29, 1994].
서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련하여 사용되는 NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST™)(Altschul et al., J.Mol.Biol.215:403-10, 1990)은 여러 소스로부터 입수용이하다(예컨대, the National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD) 및 인터넷).
펩타이드 변형체는 일반적으로 NCBI Blast 2.0을 사용하고 디폴드 변수에 대해 설정한 blasp로 갭을 형성시키고 아미노산 서열과 전장 정렬 시 계수되는 서열 동일성이 적어도 50% 이상인 것을 특징으로 한다. 약 30개 보다 많은 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 비교하는 경우에는, 디폴트 변수에 대해 설정한 디폴트 BLOSUM62 매트릭스를 이용하는(갭 실체 코스트 11, 각 잔기 당 갭 코스트 1) Blast 2 서열 함수를 사용한다. 짧은 펩타이드(약 30개 아미노산 보다 적은 펩타이드)을 정렬시키는 경우에는 디폴트 변수(오픈 갭 9, 연장 갭 1 패널티)에 대해 설정한 PAM30 매트릭스를 이용하여 Blast 2 서열 함수를 통해 정렬을 행한다. 대조 서열과 유사성이 월등히 큰 단백질은 이 방법으로 평가했을 때 증가된 동일성 비, 예컨대 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 심지어 99% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 전체 서열 보다 적은 서열이 서열 동일성에 대해 비교되는 경우에, 동족체와 변형체는 일반적으로 10개 내지 20개 아미노산의 짧은 창에서 적어도 80% 이상의 서열 동일성을 나타내고, 대조 서열과의 유사성에 따라 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 98%의 서열 동일성을 나타낼 것이다. 이와 같은 짧은 창에서 서열 동일성을 측정하는 방법은 NCBI(매릴랜드 베데스다 소재)에서 관리하는 웹사이트에 기술되어 있다. 당업자라면 이러한 서열 동일성 범위가 단지 안내 역할 만을 하는 것으로서, 제시된 범위 외에서 강력한 유의성이 있는 동족체가 수득될 가능성이 절대적으로 존재함을 잘 알고 있을 것이다.
이와 유사한 방법을 사용하여 핵산 서열의 서열 동일성 비를 측정할 수도 있다. 구체적 예로서, 상동성 서열을 천연 서열과 정렬하고, 두 서열에 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치 수를 계수하여 정합(match) 수를측정한다. 서열 동일성 비는 정합 수를 확인된 서열(예컨대 서열번호 11)에 기재된 서열의 길이 또는 분절된 길이(예컨대, 확인된 서열에 기재된 서열 유래의 100개의 연속 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기)로 나눈 다음, 그 결과값에 100을 곱하여 측정한다. 예를 들어, 서열번호 11에 기재한 서열과 정렬했을 때 1166개 정합이 있는 핵산 서열은 서열번호 11에 기재한 서열과 75.0% 동일한 것이다(즉, 1166÷1554 *100 = 75.0). 서열 동일성 비는 가장 가까운 1/10단위로 사사오입한다. 예를 들어, 75.11, 75.12, 75.13 및 75.14는 75.1로 75.15, 75.16, 75.17, 75.18 및 75.19는 75.2로 사사오입한다. 또한, 특히 길이는 항상 정수인 것을 유념하면, 다른 예로서, 다음과 같이 확인된 서열 유래의 20개 연속된 뉴클레오타이드와 정렬시킨 20개 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 표적 서열은 상기 확인된 서열과 75% 서열 동일성을 공유하는 영역을 함유한다(즉, 15÷20*100=75).
특정 결합제 : 본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 제제. 그 예로는 폴리클론 항체, 모노클론 항체(인체화된 모노클론 항체 포함) 및 모노클론 항체의 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv 단편 및 이러한 폴리펩타이드의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 기타 다른 제제를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 제공된 폴리펩타이드(또는 이의 단편, 변형체 또는 융합체)에 대한 항체는 이 폴리펩타이드를 정제하거나 확인하는데 사용할 수 있다. 본 명세서에 제공된 아미노산 서열 및 핵산 서열을 이용하면 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드를 인식하는 특정 항체계 결합제를 제조할 수 있다.
모노클론 항체 또는 폴리클론 항체는 본 발명의 폴리펩타이드, 이의 일부 또는 이의 변형체에 대하여 생성할 수 있다. 가장 바람직하게는 폴리펩타이드 항원 상에 존재하는 1 이상의 에피토프에 대하여 유발된 항체를 이용하여 그 폴리펩타이드를 특이적으로 검출하는 것이다. 즉, 1 이상의 특정 폴리펩타이드에 대하여 유발된 항체는 그 특정 폴리펩타이드를 인식하여 결합하고, 다른 폴리펩타이드는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않을 것이다. 항체가 특정 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 지의 여부는 다수의 표준 면역분석법 중 하나, 예컨대 웨스턴 블롯팅(예, Sambrook et al.(ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)을 이용하여 측정할 수 있다.
웨스턴 블롯팅을 통해 소정의 항체 제조물(예컨대, 서열번호 12에 기재한 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드에 대하여 마우스에서 생성된 제조물)이 적당한 폴리펩타이드(예, 서열번호 12에 기재한 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드)를 특이적으로 검출하는 지를 측정하기 위하여, 먼저 세포로부터 총 세포 단백질을 추출한 다음 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 분리할 수 있다.
분리한 총 세포 단백질은 그 다음 막(예, 니트로셀룰로스)으로 전이시키고, 이 막을 항체 제조물과 항온처리한다. 비특이적으로 결합된 항체를 제거하기 위하여 막을 세척한 후, 특이적으로 결합된 항체의 존재를 알칼리성 포스파타제와 같은 폴리펩타이드(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염/니트로 블루 테트라졸륨의 첨가시 면역국재화된 알칼리성 포스파타제에 의해 암청색 화합물이 생성됨)에 결합시킨 적당한 제2 항체(예, 항마우스 항체)를 사용하여 측정할 수 있다.
면역원으로 사용하기에 적당한 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 형질감염된 세포, 형질전환된 세포 또는 야생형 세포로부터 수득할 수 있다. 최종 제조물 중의 폴리펩타이드 농도는 예컨대 아미콘(Amicon) 필터기를 이용한 농축 등을 통해 수 ㎍/ml의 농도로 조정할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드의 크기는 전장의 폴리펩타이드에서부터 아미노산 9개 잔기 정도를 갖는 폴리펩타이드에 이르기까지 다양한 크기를 면역원으로 사용할 수 있다. 이와 같은 폴리펩타이드는 세포 배양물에서 수득하거나 표준 방법으로 화학적 합성하거나 또는 보다 큰 폴리펩타이드를 정제할 수 있는 보다 작은 폴리펩타이드로 절단하여 수득할 수 있다. 9개 정도의 적은 아미노산 잔기 길이를 가진 폴리펩타이드는 주조직적합성 복합체(MHC) 분자, 예컨대 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자와 관련된 면역계에 제공하는 경우에 면역원성일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 모든 아미노산 서열의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350개 또는 그 이상의 연속된 아미노산 잔기는 항체를 생산하는 면역원으로 사용할 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩타이드에 대한 모노클론 항체는 쾰러와 밀스타인(Nature 256:495-7, 1975)의 고전적 방법 또는 이로부터 유도된 방법에 따라 뮤린 하이브리도마로부터 제조할 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩타이드의 이종의 에피토프들에 대한 항체를 함유하는 폴리클론 항혈청은 그 폴리펩타이드(또는 이의 단편)을 이용하여 적당한 동물을 면역화하여 제조할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 면역성 향상을 위해 변형하거나 변형하지 않은 것일 수 있다. 래빗에 효과적인 면역 프로토콜은 문헌(Vaitukaitis et al. J.Clin.Endocrinol.Metab. 33:988-91, 1971)에서 찾아볼 수 있다.
전 항체 대신에, 원핵세포 숙주에서 용이하게 발현될 수 있는 항체 단편을 사용할 수도 있다. "항체 단편"이라고도 부르는 모노클론 항체의 면역학적 유효 부분을 제조하고 사용하는 방법은 공지되어 있고, 다음과 같은 문헌에 공지된 것을 포함한다: Better & Horowitz(Methods Enzymol. 178:476-96, 1989), Glockshuber et al.(Biochemistry 29:1362-7, 1990), 미국 특허 제5,648,237호("Expression of Functional Antibody Fragments"), 미국 특허 제4,946,778호("Single Polypeptide Chain Binding Molecules"), 미국 특허 제5,455,030호("Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules") 및 여기에 인용된 문헌.
형질전환된 : "형질전환된" 세포는 핵산 분자가 분자생물학 기술 등으로 도입된 세포이다. 형질전환은 핵산 분자를 상기한 세포에 도입시킬 수 있는 모든 기술을 포함하는데, 그 예로는 바이러스 벡터를 이용한 형질감염, 접합, 플라스미드 벡터를 이용한 형질전환 및 일렉트로포레이션, 리포펙션, 입자 총 가속법에 의한 나출형 DNA의 도입 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
변형체, 단편 또는 융합 단백질: 본 발명에 개시된 단백질에는 이의 변형체, 단편 및 융합체도 포함된다. 단백질(예컨대, 서열번호 12), 융합 단백질, 또는 단백질의 단편이나 변형체를 암호화하는 DNA 서열(예, 서열번호 11)은 이 단백질이 진핵세포, 박테리아, 곤충 및/또는 식물에서 발현될 수 있도록 유전자조작될 수 있다. 발현이 이루어지도록 DNA 서열은 변형되고 다른 조절 서열에 작동적으로 결합될 수 있다. 조절 서열과 단백질을 함유하는 최종 산물은 벡터라고 불린다. 이 벡터는 진핵세포, 박테리아, 곤충 및/또는 식물 세포에 도입할 수 있다. 세포에 도입되면 벡터는 단백질 생성을 도모한다.
융합 단백질은 서열번호 12와 같은 트립토판 아미노전이효소(또는 이의 변형체, 다형태, 돌연변이체 또는 단편) 등의 단백질을, 이 단백질의 목적 활성, 예컨대 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 성질 등을 억제하지 않는 다른 아미노산 서열에 결합된 상태로 포함하는 것이다. 일 예로서, 다른 아미노산 서열은 길이가 아미노산 약 10개 이하, 12개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하 또는 50개 이하인 것이다.
DNA 서열의 변형은 암호화된 단백질의 생물학적 할성에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 방식으로 행할 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 예를 들면, 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 변형을 만들기 위하여 PCR을 사용할 수 있다. 이와 같은 변형체는 단백질을 발현하는데 사용된 코돈이 숙주 세포에서 선호하는 것으로 최적화된 변형체이거나 또는 발현을 촉진하는 다른 서열 변화로 최적화된 변형체일 수 있다.
벡터: 세포에 도입되어 형질전환된 세포를 생성하는 핵산 분자. 벡터는 세포 내에서 복제가 이루어지도록 하는 핵산 서열, 예컨대 복제 오리진(origin)을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 당해 기술분야에 공지된 1 이상의 선택성 마커 유전자와 다른 유전자 성분을 포함할 수도 있다.
생합성 경로의 개요
도 1 내지 3과 도 11 내지 13에 도시한 바와 같이, 모나틴이나 이의 중간체, 예컨대 인돌-3-피루브산염 또는 MP를 제조하기 위한 목적에는 다수의 생합성 경로를 이용할 수 있다. 각 기질(글루코스, 트립토판, 인돌-3-젖산, 인돌-3-피루브산염 및 MP)을 각 산물(트립토판, 인돌-3-피루브산염, MP 및 모나틴)로 전환시키기 위한 목적에는 몇가지 다른 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 더욱이, 이러한 반응은 생체내 또는 시험관내에서 수행하거나 또는 생체내 반응과 시험관내 반응의 조합을 통해 수행할 수 있으며, 여기서 시험관내 반응으로는 예컨대 비효소적 화학 반응 등이 있다. 따라서, 도 1 내지 3과 도 11 내지 13은 예시적인 것으로, 목적 산물을 얻기 위해 사용할 수 있는 다수의 상이한 경로를 도시한 것이다.
글루코스에서 트립토판으로의 전환
많은 유기체는 글루코스로부터 트립토판을 합성할 수 있다. 따라서, 이러한 유기체에 글루코스 및/또는 트립토판으로부터 모나틴, MP 및/또는 인돌-3-피루브산염을 생산하는데 필요한 유전자를 함유하는 작제물을 클로닝할 수 있다. 본 명세서에는 트립토판이 모나틴으로 전환될 수 있음을 도시하였다.
다른 예에서는 트립토판을 생산하거나 또는 트립토판을 과잉생산하는 공지의 폴리펩타이드를 사용하여 유기체를 유전자조작하기도 한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,371,614호(본원에 참고인용됨)는 야생형 트립토판 오페론을 함유하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주를 기술하고 있다.
미국 특허 제4,371,614호에 개시된 트립토판의 최대 역가는 약 230ppm이다. 이와 유사한 것으로, WO8701130(본원에 참고인용됨)은 트립토판을 생산하도록 유전자 조작된 대장균 균주를 기술하며 L-트립토판의 증가된 발효 생산에 대하여 논의하고 있다. 당업자라면 글루코스로부터 트립토판을 생산할 수 있는 유기체가 글루코스 또는 프럭토스-6-인산염으로 전환될 수 있는 다른 탄소 및 에너지원을 이용하여 유사한 결과를 산출할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 탄소 및 에너지원의 예로는 슈크로스, 프럭토스, 전분, 셀룰로스 또는 글리세롤 등이 있으며 이에 국한되는 것은 아니다.
트립토판에서 인돌-3- 피루브산염으로의 전환
트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환하는 데에는 몇가지 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 예로는 효소 부류(EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1 및 2.6.1.21의 성분을 포함한다. 이러한 부류에는 L-트립토판과 2-옥소글루타르산염을 인돌-3-피루브산염과 L-글루탐산염으로 전환시키는 트립토판 아미노전이효소(달리, L-페닐알라닌-2-옥소글루타르산염 아미노전이효소, 트립토판 아미노전이효소, 5-하이드록시트립토판-케토글루타르산 아미노전이효소, 하이드록시트립토판 아미노전이효소, L-트립토판 아미노전이효소, L-트립토판 트란스아미나제(L-트립토판 아미노전이효소로 통칭하였음) 및 L-트립토판:2-옥소글루타르산염 아미노전이효소라고도 불림); D-트립토판과 2-옥소산을 인돌-3-피루브산염과 아미노산으로 전환시키는 D-트립토판 아미노전이효소(달리, NAD(P)-L-트립토판 탈수소효소, L-트립토판 탈수소효소, L-Trp-탈수소효소, TDH 및 L-트립토판:NAD(P) 산화환원효소(탈아미노화)라고도 불림); D-아미노산과 FAD를 인돌-3-피루브산염과 NH3 및 FADH2로 전환시키는 D-아미노산 탈수소효소; L-트립토판과 페닐피루브산염을 인돌-3-피루브산염과 L-페닐알라닌으로 전환시키는 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(달리, L-트립토판-α-케토이소카프로산염 아미노전이효소 및 L-트립토판:페닐피루브산염 아미노전이효소라고도 불림); L-아미노산과 H2O 및 O2를 2-옥소산과 NH3 및 H2 O2로 전환시키는 L-아미노산 산화효소(달리 오피오-아미노산 산화효소 및 L-아미노산:산소 산화환원효소(탈아미노화)라고도 불림); D-아미노산 산화효소(달리 오피오-아미노산 산화효소 및 D-아미노산:산소 산화환원효소(탈아미노화)라고도 불림); 및 L-트립토판과 H2O 및 O2를 인돌-3-피루브산염과 NH3 및 H2O2로 전환시키는 트립토판 산화효소가 있다. 이러한 부류에는 또한 타이로신(방향족) 아미노전이효소, 아스파르트산염 아미노전이효소, D-아미노산(또는 D-알라닌) 아미노전이효소 및 복수의 아미노전이효소 활성을 나타내고 이 중 일부는 트립토판과 2-옥소산을 인돌-3-피루브산염과 아미노산으로 전환시킬 수 있는 광범위(다중 기질) 아미노전이효소도 포함된다.
이러한 활성을 나타내는 아미노전이효소 부류의 11가지 성분을 하기 실시예 1에 기술하였는데, 그 중에는 서열번호 11과 12에 제시한 신규 아미노전이효소도 포함된다. 따라서, 본 발명은 서열번호 11 및 12에 제시한 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 서열 동일성이 있는 분리된 핵산 및 단백질 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 아미노전이효소 활성을 보유하거나 아미노전이효소 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 서열번호 11 및 12의 단편과 융합체도 제공한다. 단편의 예로는 서열번호 11의 서열 중 적어도 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 또는 1000개의 인접 뉴클레오타이드로 이루어진 단편이나 또는 서열번호 12의 서열 중 적어도 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 또는 350개의 인접 아미노산으로 이루어진 단편이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 개시된 서열( 및 이의 변형체, 단편 및 융합체)은 벡터의 일부분일 수 있다. 이러한 벡터는 숙주 세포의 형질전환에 사용되어 트립토판으로부터 인돌-3-피루브산염을 생산하고 일부 경우에는 추가로 MP 및/또는 모나틴도 생산할 수 있는 재조합 세포를 만들 수 있다.
L-아미노산 산화효소(1.4.3.2)는 공지물로서, 그 서열은 여러 다른 소스, 예컨대 비페라 레베틴(Vipera lebetine sp P81375), 오피오파구스 한나(Ophiophagus hannah sp P81383), 아그키스트로돈 로도스토마(Agkistrodon rhojdostoma spP81382), 크로탈루스 아트록스(Crotalus atrox sp P56742), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter cresentus), 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii), 머스 머스큘러스(Mus musculus), 슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringae) 및 로도코커스(Rhodococcus) 균주가 있다. 또한, 트립토판 산화효소는 문헌에 기술된 바 있는 것으로서, 예컨대 코프리누스(Coprinus) 종 SF-1, 곤봉체 뿌리 병에 걸린 중국 양배추, 아라비돕시스 탈리아나 및 포유동물 간에서 분리할 수 있다. 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시킬 수 있는 L-아미노산 산화효소의 한 성분은 분자 클로닝용의 다른 소스와 함께 하기 실시예 3에서 검토하였다. 다수의 D-아미노산 산화효소 유전자는 분자클로닝용 데이터베이스에서 용이하게 입수할 수 있다.
트립토판 탈수소효소는 공지물로서, 예를 들어 시금치, 피섬 사티범(Pisum sativum), 프로소피스 줄리플로라, 배, 메즈퀴트(콩과식물의 일종), 밀, 옥수수, 토마토, 담배, 크로모박테리움 비올라슘(Chromobacterium violaceum) 및 락토바실리(Lactobacilli) 등에서 분리할 수 있다. 다수의 D-아미노산 탈수소효소 유전자 서열은 공지되어 있다.
도 11 내지 13에 도시한 바와 같이, 트립토판 산화효소와 같은 아미노산 산화효소가 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는데 사용된다면 과산화수소의 존재를 감소 또는 심지어 제거하기 위하여 카탈라제를 첨가할 수 있다.
인돌-3- 젖산염에서 인돌-3- 피루브산염으로의 전환
인돌-3-젖산염을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 반응은 각종 폴리펩타이드에 의해 촉매될 수 있는데, 그 예로는 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.- 또는 1.1.1.111 폴리펩타이드 부류의 성분이 있다. 1.1.1.110 폴리펩타이드 부류는 인돌젖산염 탈수소효소(인돌젖산:NAD+ 산화환원효소 라고도 불림)를 포함한다. 1.1.1.27, 1.1.1.28 및 1.1.2.3 부류는 젖산염 탈수소효소(젖산 탈수소효소, 젖산염:NAD+ 산화환원효소 라고도 불림)를 포함한다. 1.1.1.222 부류는 (R)-4-하이드록시페닐젖산염 탈수소효소(D-방향족 젖산염 탈수소효소, R-방향족 젖산염 탈수소효소 및 R-3-(4-하이드록시페닐)젖산염:NAD(P)+ 2-산화환원효소 라고도 불림)를 포함하고, 1.1.1.237 부류는 3-(4-하이드록시페닐피루브산염)환원효소(하이드록시페닐피루브산염 환원효소 및 4-하이드록시페닐젖산염:NAD+ 산화환원효소 라고도 불림)를 포함한다. 1.1.3.- 부류는 젖산염 산화효소를 포함하고, 1.1.1.111 부류는 (3-이미다졸-5-일)젖산염 탈수소효소( (S)-3-(이미다졸-5-일)젖산염:NAD(P)+ 산화환원효소 라고도 불림)를 포함한다. 이러한 부류에 속하는 여러 폴리펩타이드는 인돌-3-젖산으로부터 인돌-3-피루브산염을 생성할 수 있을 것이다. 이러한전환의 예에 대해서는 실시예 2에서 검토하였다.
또한, 화학적 반응을 사용하여 인돌-3-젖산을 인돌-3-피루브산염으로 전환시킬 수도 있다. 이러한 화학적 반응에는 B2 촉매(China Chemical Reporter, v 13, n 28, p 18(1), 2002), 희석한 과망간산염과 과염소산염을 이용한 대기중 산화, 또는 금속 촉매의 존재하에 과산화수소를 이용한 산화 등을 비롯한 여러 가지 방법을 잉용하여 달성할 수 있는 산화 단계를 포함한다.
인돌-3-피루브산염에서 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산 (MP)으로의 전환
인돌-3-피루브산염의 MP로의 전환에는 여러 가지 공지의 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 이러한 폴리펩타이드 부류의 예로는 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 및 4.1.2-가 있다. 이러한 부류에는 탄소-탄소 합성효소/분해효소, 예컨대 두 카르복실산 기질의 축합을 촉매하는 알돌라제 등이 있다. 펩타이드 부류 EC 4.1.3.-은 옥소산 기질(예, 인돌-3-피루브산염)을 친전자체로서 이용하여 탄소-탄소 결합을 형성하는 합성효소/분해효소인 반면, EC 4.1.2.-는 알데하이드 기질(예, 벤즈알데하이드)을 친전자체로서 이용하여 탄소-탄소 결합을 형성하는 합성효소/분해효소이다.
예컨대, EP 1045-029에 기술된 폴리펩타이드(EC 4.1.3.16, 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 알돌라제, 2-옥소-4-하이드록시글루타르산염 알돌라제 또는 KHG 알돌라제 라고도 불리는 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 글리옥실산염 분해효소)는 글리옥실산과 피루브산염을 4-하이드록시-2-케토글루타르산으로 전환시키고, 폴리펩타이드 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.17, 달리 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 피루브산염 분해효소 또는 ProA 알돌라제 라고도 불림)는 2개의 피루브산염과 같은 2개의 케토산을 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염으로 축합시킨다. 이러한 분해효소를 이용한 반응은 본 명세서에 기술하였다.
도 1과 2 및 도 11 내지 13은 3-탄소(C3) 분자가 인돌-3-피루브산염과 결합하는 반응의 모식도이다. EC 4.1.2.- 및 4.1.3.-의 다수의 성분들, 특히 PLP를 이용하는 폴리펩타이드는 세린, 시스테인 및 알라닌 등의 아미노산 또는 이의 유도체인 C3 분자를 이용할 수 있다. EC 4.1.2.- 및 4.1.3.-의 대표 성분들에 의해 촉매되는 알돌 축합은 이 경로의 C3 분자가 피루브산염이나 이의 유도체일 것을 요구한다. 하지만, 다른 화합물도 C3 탄소원으로 작용할 수 있고 피루브산염으로 전환될 수 있다. 피루브산염과 암모니아는 L-세린, L-시스테인 및 이탈이 충분한 기를 보유한 세린과 시스테인의 유도체, 예컨대 O-메틸-L-세린, O-벤질-L-세린, S-메틸시스테인, S-벤질시스테인, S-알킬-L-시스테인, O-아실-L-세린 및 3-클로로-L-알라닌의 베타 제거 반응(예컨대, 트립토파네이즈 또는 β-타이로시나제에 의해 촉매되는 반응)에 의해 수득될 수 있다. 아스파르트산염은 PLP 매개의 베타-분해효소 반응, 예컨대 트립토파네이즈(EC 4.1.99.1) 및/또는 β-타이로시나제(EC 4.1.99.2, 타이로신-페놀 분해효소라고도 불림)에 의해 촉매되는 반응에서 피루브산염의 소스로서 작용할 수 있다.베타-분해효소 반응의 속도는 무라투 등(Mouratou et al., J.Biol.Chem 274:1320-5, 1999)이 기술하고 실시예 8에 제시한 바와 같이 폴리펩타이드(4.1.99.1-2)에 부위 지시성 돌연변이유발을 수행함으로써 증가시킬 수 있다. 이러한 변형은 그 폴리펩타이드가 이카르복실산 아미노산 기질을 수용할 수 있도록 한다. 젖산염 또한 피루브산염의 소스로서 작용할 수 있어서, 젖산염 탈수소효소와 산화된 보조인자 또는 젖산염 산화효소와 산소를 첨가하면 피루브산염으로 산화된다. 이러한 반응의 예는 하기에 설명하였다. 예를 들어, 도 2와 도 11 내지 13에 도시한 바와 같이 피루브산염이 C3 분자로서 사용되는 경우에 ProA 알돌라제는 인돌-3-피루브산염과 접촉시킬 수 있다.
MP는 또한 화학적 반응을 이용하여 제조할 수 있는데, 그 예로는 실시예 5에 제시된 알돌 축합이 있다.
MP 에서 모나틴으로의 전환
MP에서 모나틴으로의 전환에는 다음과 같은 폴리펩타이드 중 1 이상에 의해 촉매될 수 있다: 트립토판 아미노전이효소(2.6.1.27), 트립토판 탈수소효소(1.4.1.19), D-아미노산 탈수소효소(1.4.99.1), 글루탐산염 탈수소효소(1.4.1.2-4), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(2.6.1.28) 또는 보다 일반적으로 아미노전이효소 과(2.6.1.-)의 성분들, 예컨대 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), 타이로신(방향족) 아미노전이효소(2.6.1.5), D-트립토판 아미노전이효소 또는 D-알라닌(2.6.1.21) 아미노전이효소(도 2). 이러한 아미노전이효소의 11가지 성분은 서열번호 11과 12에 예시한 이 부류의 신규 성분과 함께 하기 실시예 1에 기술하며, 이 아미노전이효소와 탈수소효소의 활성을 입증하는 반응은 실시예 7에 제시하였다.
이 반응 역시 화학적 반응을 통해 수행될 수도 있다. 케토산(MP)의 아민화는 암모니아와 나트륨 시아노보로하이드라이드를 이용하여 환원성 아민화를 통해 수행할 수 있다.
도 11 내지 13에는 MP를 모나틴으로 전환시키는데 사용할 수 있고 인돌-3-피루브산염 또는 트립토판으로부터 모나틴의 수율을 증가시키는데 사용할 수 있는 또 다른 폴리펩타이드를 제시하였다. 예를 들어, 아스파르트산염이 아미노 공급체인 경우에, 아스파르트산염 아미노전이효소는 아스파르트산염을 옥살로아세트산염으로 전환시키는데 사용할 수 있다(도 11). 이 옥살로아세트산염은 옥살로아세트산염 탈수소효소 등의 탈수소효소에 의해 피루브산염과 이산화탄소로 전환된다(도 11). 또한, 아미노 공여체로서 리신이 사용되는 경우에는 리신 ε-아미노전이효소를 사용하여 리신을 알리신으로 전환시킬 수 있다(도 12). 알리신은 자발적으로 1-피페리딘-6-카르복실산염으로 전환된다(도 12). MP를 모나틴으로 전환시키기 위해 환원성 아민화 반응을 촉매할 수 있는 폴리펩타이드(예, 글루탐산염 탈수소효소)가 사용된다면 NAD(P)H를 재순환시키고(또는) 휘발성 산물을 생성할 수 있는 폴리펩타이드(도 13)가 사용될 수 있으며, 그 예로는 포름산염 탈수소효소가 있다.
생합성 경로 디자인 시 고려할 추가 사항
인돌-3-피루브산염, MP 및/또는 모나틴을 생성하는데 사용된 폴리펩타이드에 따라서, 산물 형성을 향상시키기 위한 목적으로 보조인자, 기질 및/또는 추가 폴리펩타이드를 생산 세포에 제공할 수 있다.
과산화수소의 제거
과산화수소(HO)는 생성된다면 생산 세포에 유독하고 생성된 폴리펩타이드 또는 중간체에 유해할 수 있는 산물이다. 전술한 L-아미노산 산화효소는 산물로서 H2O2를 생산한다. 따라서, L-아미노산 산화효소가 사용되는 경우에는 생성되는 H2 O2를 제거하거나 또는 그 농도를 감소시켜 세포 또는 산물에 대한 잠재적 손상을 줄여야 한다.
카탈라제는 세포 내에서 H2O2의 농도를 감소시키는 사용할 수 있다(도 11 내지 13). 생산 세포는 과산화수소의 물과 산소 가스로의 분해를 촉매하는 카탈라제(EC 1.11.1.6)를 암호화하는 유전자 또는 cDNA 서열을 발현할 수 있다. 예를 들어, 카탈라제는 생산 세포에 형질감염된 벡터로부터 발현될 수 있다. 사용할 수 있는 카탈라제의 예로는 (스타필로코커스 크실로서스), (바실러스 할로듀란스), (칸디다 알비칸스), (스트렙토마이세스 코엘리컬러), (크산토모나스 캄페스트리스)(SwissProt 수탁번호)가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. L-아미노산 산화효소, D-아미노산 산화효소 또는 트립토판 산화효소를 이용하는 생물촉매 반응기에도 역시 카탈라제 폴리펩타이드를 첨가할 수 있다.
PLP (피리독살-5'- 인산염 ) 유용성의 조절
도 1에 도시한 바와 같이, PLP는 본 명세서에 기술된 1 이상의 생합성 단계들에서 이용될 수 있다. PLP는 반응의 총 효율을 제한하지 않을 정도의 PLP 농도로 보충될 수 있다.
비타민 B6(PLP 전구체)의 생합성 경로는 대장균에서 철저하게 연구된 바 있으며, 일부 단백질은 결정화되어 있다(Laber et al., FEBS Letters, 449:45-8, 1999). 피리독살 인산염 생합성에는 고유한 3가지 유전자(pdxA, pdxB 및 pdxJ)가 필요한데 반해, 다른 대사 경로에는 2가지 유전자(epd 또는 gapB 및 serC)가 필요로 된다. 대장균 경로에서 관찰되는 출발물의 하나는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-인산염(DXP)이다. 일반적인 C2 및 C3 탄소 중심 대사물로부터 이 전구체가 합성되는 단계는 폴리펩타이드 1-데옥시-D-자일룰로스-5-인산염 합성효소(DSX)에 의해 촉매된다. 다른 전구체로서, C4 당, D-에리트로스 4-인산염으로부터 형성된 트레오닌 유도체가 있다. 포스포-4-하이드록실-L 트레오닌(HTP)으로 전환되는데 필요한 유전자는 epd, pdxB 및 secC이다. PLP 형성의 마지막 반응은 pdxA와 pdxJ의 유전자 산물에 의해 촉매되는, DXP와 HTP 사이의 복잡한 분자내 축합 및 고리 닫힘 반응이다.
PLP가 모나틴 생성용 발효 동안의 제한 영양소가 된다면 생산 숙주 세포에서 이 경로의 유전자 중 1 이상의 유전자의 발현을 증가시키면 모나틴의 수율도 증가시킬 수 있을 것이다. 숙주 유기체는 그 자연 경로의 유전자들을 복수의 카피로 포함할 수 있고, 또는 그 유기체 게놈에 비자연 경로의 유전자들의 카피를 병입시킬 수도 있다. 또한, 회수 경로의 유전자 복수 카피를 숙주 유기체에 클로닝할 수도 있다.
모든 유기체에서 보존되는 1가지 회수 경로는 비타민 B6의 각종 유도체를 활성 PLP 형태로 재순환시킨다. 이 경로에 포함된 폴리펩타이드에는 pdxK 키나제, pdxH 산화효소 및 pdxY 키나제가 있다. 이러한 1 이상의 유전자의 과잉발현은 PLP이용율을 증가시킬 수 있다.
비타민 B6의 농도는 숙주 유기체에 존재하는 자연적 생합성 경로 유전자의 대사 조절의 제거 또는 억제를 통해 상승시킬 수 있다. PLP는 박테리아 플라보박테리움 종의 균주 238-7에서 전구체 트레오닌 유도체의 생합성에 관여하는 폴리펩타이드를 억제한다. 대사 조절이 제거된 이 박테리아 균주는 피리독살 유도체를 과잉생산하여 PLP를 최고 20mg/L까지 분비할 수 있다. 이와 유사한 방식에 의한 모나틴 생성 숙주 유기체의 유전자 조작은 생합성 경로 유전자의 과잉발현 없이도 PLP 생산을 증가시킬 수 있을 것이다.
암모늄 이용성
트립토파네이즈 반응은 암모니아를 보다 이용가능하거나 물을 제거함으로써 합성 방향(인돌로부터 트립토판의 생성)으로 유도할 수 있다. 환원성 아민화 반응, 예컨대 글루탐산염 탈수소효소에 의해 촉매된 반응도 과량의 암모늄에 의해 순방향으로 유도될 수 있다.
암모니아는 탄산염 또는 인산염 완충계에서 탄산암모늄이나 인산암모늄 염으로서 이용할 수 있게 할 수 있다. 암모니아는 또한 피루브산 암모늄이나 포름산 암모늄으로서 제공될 수도 있다. 또는, 반응이 암모니아를 생성하는 반응, 예컨대 글루탐산염 탈수소효소 또는 트립토판 탈수소효소 반응 등과 연결된 경우에는 암모니아가 공급될 수도 있다. 암모니아는 페놀 또는 인돌, 피루브산염 및 NH3로 가수분해되는, EC 4.1.99.-(타이로신 또는 트립토판)의 천연 기질을 첨가하여 생성시킬 수도 있다. 이것은 효소가 이의 바람직한 기질을 가수분해하도록 하여 정상적인 평형 상태의 양 보다 증가된 수율의 합성 산물이 생성되도록 한다.
산물 및 부산물의 제거
트립토판 아미노전이효소를 통한 트립토판의 인돌-3-피루브산염으로의 전환은 이 반응을 통해 글루탐산염이 생성되고 보조기질로서 2-옥소글루타르산염(α-케토글루타르산염)을 필요로 하기 때문에 인돌-3-피루브산염의 생성율에 악영향을 미칠 수 있다. 글루탐산염은 상기 아미노전이효소를 억제할 수 있어서 상기 반응에 다량의 보조기질이 소비될 수 있기 때문이다. 더욱이, 고농도의 글루탐산염은 하류 분리 과정에 나쁜 영향을 미친다.
폴리펩타이드 글루탐산염 탈수소효소(GLDH)는 글루탐산염을 2-옥소글루타르산염으로 전환하여, 트립토판 아미노전이효소에 의해 촉매되는 반응에서 보조기질을 재순환시킨다. GLDH는 또한 호기 조건하에 세포의 에너지(ATP) 생산에 사용될 수 있는 환원성 등가물(NADH 또는 NADPH)을 생산한다. 또한, 글루탐산염의 GLDH에 의한 이용성은 부산물의 형성을 감소시키기도 한다. 또한, 이 반응은 세포의 질소원으로서 작용하거나 도 1에 제시한 경로의 최종 단계에서 환원성 아민화에 기질로서 사용될 수 있는 암모니아를 생성한다. 따라서, GLDH 폴리펩타이드를 과잉발현하는 생산세포는 수율을 증가시키고 배지 및/또는 분리 공정의 비용을 감소시키는데 사용할 수 있다.
트립토판에서 모나틴으로의 경로에서, 적당한 효소 부류의 아미노전이효소가 사용된다면 단계 3의 아미노 공급체(예, 글루탐산염 또는 아스파르트산염)는 단계 1에 필요한 아미노 수용체(예, 2-옥소-글루타르산염 또는 옥살로아세트산염)로 재전환될 수 있다. 이 경로에 2가지 별도의 아미노전이효소를 사용하되, 한 아미노전이효소의 기질이 다른 아미노전이효소의 활성에 경쟁적 억제작용을 하지 않는다면 이 경로의 효율이 증가될 수 있다.
본 명세서에 기술된 경로 중의 다수의 반응들은 가역성이며, 이에 따라 기질과 산물 사이에 평형이 형성될 것이다. 따라서, 폴리펩타이드로부터 산물을 연속 제거하면 이 경로의 수율을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 퍼미에이즈 또는 다른 수송 단백질을 이용하여 모나틴을 발효액으로 분비시키거나 생물촉매 반응기로부터 모나틴을 선택적 결정화하고 이와 동시에 기질을 재순환시키면 반응 수율이 증가될 것이다.
추가 효소 반응이나 아미노 공급체 기의 치환에 의한 부산물의 제거도 반응 수율을 증가시킬 수 있는 또 다른 방법이다. 이하 실시예 13에는 여러 가지 예를 검토하고 도 11 내지 13에 예시하였다. 이상적인 것은, 상 변화(증발) 또는 미반응성 최종산물, 예컨대 이산화탄소 등으로의 자발적 전환을 통해 역방향 반응시 이용할 수 없는 부산물이 생성되는 것이다.
기질 푸울의 조절
인돌 푸울은 트립토판 전구체의 생산을 증가시키고(또는) 인돌-3-피루브산염 및/또는 트립토판을 포함하는 이화 경로의 변형을 통해 조절할 수 있다. 예컨대, 숙주 세포에서 EC 4.1.1.74를 암호화하는 유전자를 기능적으로 결실시키면 인돌-3-피루브산염으로부터 인돌-3-아세트산의 생산이 감소 또는 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 EC 4.1.99.1을 암호화하는 유전자를 기능적으로 결실시키면 트립토판으로부터 인돌의 생산이 감소 또는 제거될 수 있다. 또는, EC 4.1.99.1을 암호화하는 유전자의 양을 증가시킨 시험관내 또는 생체내 과정에서 과량의 인돌은 기질로서 이용될 수 있다(Kawasaki et al., J.Ferm.and Bioeng., 82:604-6, 1996). 또한, D-에리트로스-4-인산염 및 코리스메이트와 같은 중간체의 농도를 증가시키기 위하여 유전자 변형을 일으킬 수 있다.
트립토판의 생산은 대부분의 유기체에서 조절되어진다. 그 조절 기작 중 하나는 이 경로 내 특정 효소의 피드백 억제 작용을 통한 것으로서, 트립토판 농도가 증가하면 트립토판의 생산 속도가 감소한다. 즉, 트립토판 중간체를 통해 모나틴을 생산하기 위해 유전자조작된 숙주 세포가 사용되는 경우에는 트립토판 농도에 민감하지 않은 유기체를 사용할 수 있다. 그 예로, 고농도의 5-메틸트립토판에 반복 노출시켜 각종 트립토판 유사체에 의한 성장 억제에 내성인 카타란투스 로제우스(Catharanthus roseus) 균주가 선발된 바 있다(Schallenberg and Berlin, Z Naturforsch 34:541-5, 1979). 결과적으로 얻어진 균주의 트립토판 합성효소 활성은 산물 억제 반응에 의한 영향을 덜 받았고, 이는 유전자 내 돌연변이 때문인 것으로 추정된다. 이와 유사한 방식을 통해, 모나틴 생산에 사용된 숙주 세포도 최적화될 수 있다.
트립토판 생산은 산물 억제에 덜 민감한 폴리펩타이드를 생산하는 유도 발생의 사용을 통해 최적화될 수 있다. 예컨대, 배지에 트립토판은 함유하지 않고 비대사성 트립토판 유사체를 다량으로 함유하는 평판에서 선발을 실시할 수 있다. 미국 특허 제5,756,345호; 제4,742,007호; 제4,371,614호는 발효 유기체의 트립토판 생산율을 증가시키는데 사용한 방법을 기술하고 있다. 트립토판 생합성의 마지막 단계는 인돌에 세린의 첨가반응이다. 따라서, 세린의 유용성을 증가시키면 트립토판 생산 수율을 증가시킬 수 있다.
발효 유기체에 의해 생산되는 모나틴의 양은 숙주 유기체에 의해 생산되는 피루브산염의 양을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 효모, 예컨대 트리코스포론 큐타늄(Trichosporum cutaneum, Wang et al., Lett.Appl.Microbiol. 35:338-42, 2002) 및 토룰롭시스 글라브라타(Torulopsis glabrata, Li et al., Appl Microbiol.Biotechnol. 57:451-91, 2001)는 피루브산염을 과잉생산하는 바, 본 명세서에 개시된 방법에 사용할 수 있다. 또한, 유전자 변형을 유기체에 실시하여 피루브산 생산을 촉진할 수도 있는데, 그 예로는 대장균 균주 W1485lip2에서의 유전자 변형이 있다(Kawasaki et al., J.Ferm. and Bioeng. 82:604-6, 1996).
키랄성 조절
모나틴의 맛 프로필은 분자의 입체화학(키랄성)을 조절함으로써 변화시킬 수 있다. 따라서, 여러 음식물 시스템에는 여러 모나틴 이성체가 여러 농도의 배합으로 제공되는 것이 바람직할 수 있다. 키랄성은 pH와 폴리펩타이드의 조합을 통해 조절할 수 있다.
모나틴 C4 위치에서의 라세미화(상기 번호 표시된 분자 참조)는 알파 탄소의 탈양성자화 및 재양성자화를 통해 일어날 수 있으며, 이것은 pH 이동이나 보조인자 PLP와의 반응을 통해 수행될 수 있다. 미생물에서는 라세미화를 일으키기에 충분할 정도의 pH 이동이 일어날 가능성이 적지만 PLP는 풍부하다. 폴리펩타이드를 이용한 키랄성의 조절 방법은 모나틴 생산에 이용된 생합성 경로에 따라 달라진다.
모나틴이 도 2에 제시된 경로를 이용하여 형성되는 경우에는, 다음과 같은 점을 유념해야 한다. 생물촉매 반응에서, C2의 키랄성은 인돌-3-피루브산염을 MP로 전환시키는 효소에 의해 결정된다. 인돌-3-피루브산염을 MP로 전환시키는 효소에는 복수의 효소(예, EC 4.1.2.-, 4.1.3.-)가 있기 때문에 필요한 이성체를 형성하는 효소를 선택할 수 있다. 또는, 인돌-3-피루브산염을 MP로 전환시키는 효소의 거울상특이성을 유도 발생을 통해 변화시키거나 또는 촉매성 항체를 필요한 반응을 촉매하도록 유전자조작할 수도 있다. MP가 일단 생성되면(효소적이나 화학적 축합을 통해), 아미노 기는 본 명세서에 기술된 바와 같은 아미노전이효소를 통해 입체특이적으로 첨가할 수 있다. D형 또는 L형 방향족 산 아미노전이효소의 사용 여부에 따라 R형 또는 S형의 C4가 생성될 수 있다. 대부분의 아미노전이효소는 L-이성체에 특이적이지만, 일부 식물에는 D-트립토판 아미노전이효소가 존재하기도 한다(Kohiba and Mito, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japan 1990). 더욱이, D-알라닌 아미노전이효소(2.6.1.21), D-메티오닌-피루브산염 아미노전이효소(2.6.1.41) 및 (R)-3-아미노-2-메틸프로판산염 아미노전이효소(2.6.1.61) 및 (S)-3-아미노-2-메틸프로판산염 아미노전이효소(2.6.1.22)가 모두 동정되었다. 일부 아미노전이효소는 이 반응에 C2 탄소에 특정 배향을 가진 기질만을 허용하기도 한다. 따라서, MP로의 전환이 입체특이성이 아닐지라도 최종 산물의 입체화학은 아미노전이효소의 적당한 선택을 통해 조절될 수 있다. 이 반응이 가역성이기 때문에 미반응 MP(불필요한 이성체)는 그 구성 성분으로 재순환되어 MP의 라세미 혼합물이 개질될 수 있다.
기질의 활성화
포스포에놀피루브산염(PEP) 등과 같은 인산화된 기질은 본 명세서에 개시된 반응에 사용될 수 있다. 인산화된 기질은 에너지면에서 더욱 유리하여 반응 속도 및/또는 수율을 증가시키는데 사용할 수 있다. 알돌 축합 시, 인산기의 첨가는 친핵성 기질의 에놀 호변이성체를 안정화시켜 반응성을 더욱 높인다. 다른 반응으로서, 인산화된 기질은 종종 더 나은 이탈기를 제공하기도 한다. 이와 유사하게 CoA 유도체 또는 파이로인산염 유도체로의 전환을 통해 기질이 활성화될 수도 있다.
본 발명은 글루코스, 트립토판, 인돌-3-젖산으로부터 및/또는 인돌-3-피루브산염 및 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산과 같은 모나틴 전구체를 통해 모나틴을 제조하는 몇 가지 생합성 경로를 제공한다. 또한 본 발명은 모나틴, 인돌-3-피루브산염 및 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산 제조에 사용할 수 있는 폴리펩타이드 및 핵산 서열도 개시한다.
모나틴은 인돌-3-피루브산염, 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산(모나틴 전구체, MP, 모나틴의 알파-케토 형태), 인돌-3-젖산, 트립토판 및/또는 글루코스를 통해 생성될 수 있다(도 1). 모나틴 또는 이의 중간체를 생성 또는 제조하는 방법은 도 1 내지 3 및 도 11 내지 13에 예시하였는데, 이 방법들은 기질을 제1 산물로 전환시키고, 그 다음 이 제1 산물을 제2 산물로 전환시키는 등의 반응을 목적한 최종 산물이 생성될 때까지 지속하는 반응을 포함한다.
도 1 내지 3 및 도 11 내지 13은 잠재적 중간 산물과 최종 산물을 박스 안에 표시하고 있다. 예를 들어, 한 산물에서 다른 산물로의 전환, 예컨대 글루코스에서 트립토판, 트립토판에서 인돌-3-피루브산염, 인돌-3-피루브산염에서 MP, MP에서 모나틴, 또는 인돌-3-젖산(인돌-젖산염)에서 인돌-3-피루브산염으로의 전환은 이 방식으로 표시할 수 있다. 이러한 전환은 화학적 또는 생물학적으로 촉진될 수 있다. "전환한다"라는 용어는 제1 중간체에서 제2 중간체로 변화하는 반응에서 화학적 수단이나 폴리펩타이드가 이용되는 것을 의미한다. "화학적 전환"이란 용어는 폴리펩타이드에 의해 활성적으로 촉진되지 않는 반응을 의미한다. "생물학적 전환"이란 용어는 폴리펩타이드에 의해 활성적으로 촉진되는 반응을 의미한다. 전환은 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 생물학적 전환이 사용되는 경우에는, 폴리펩타이드 및/또는 세포를 고분자 지지체 상에 화학적으로 부착시키는 등의 방법으로 지지체 상에 고정시킬 수 있다. 이러한 전환은 당업자에게 공지된 모든 반응기, 예컨대 회분식 반응식 또는 연속 반응기를 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 제1 폴리펩타이드와 기질을 접촉시켜 제1 산물을 제조하는 단계, 형성된 제1 산물을 제2 폴리펩타이드와 접촉시켜 제2 산물을 제조하는 단계, 그 다음 형성된 제2 산물을 제3 폴리펩타이드와 접촉시켜 제3 산물, 예컨대 모나틴을 제조하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다. 사용된 폴리펩타이드와 생성된 산물은 도 1 내지 3과 도 11 내지 13에 제시되어 있다.
본 발명은 또한 도 1 내지 3과 도 11 내지 13에 제시된 전환반응에 사용될 수 있는 폴리펩타이드 및 이의 암호 서열도 개시한다. 일부 예에서는, 상기 폴리펩타이드의 기질 특이성 및/또는 활성을 변형시키는 점 돌연변이를 1개 이상 보유하는 폴리펩타이드도 모나틴 제조에 사용된다.
본 발명은 모나틴을 생성하는 분리된 재조합 세포도 개시한다. 이 세포는 식물, 동물, 박테리아, 효모, 조류, 시생대 또는 진균 세포 등의 임의의 세포일 수 있다.
특정 구체예에서, 개시된 세포는 다음과 같은 활성을 1가지 이상 보유하는 세포, 예컨대, 트립토판 아미노전이효소(EC 2.6.1.27), 타이로신(방향족) 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), L-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.2), 트립토판 산화효소(EC 번호 없음, Hadar et al., J.Bacterial 125:1096-1104, 1976 및 Furuya et al., Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93, 2000), D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1), D-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21), 합성효소/분해효소(EC 4.1.3.-), 예컨대 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.17) 또는 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.16), 합성효소/분해효소(4.1.2.-), D-트립토판 아미노전이효소(Kohiba and Mito, Proceedings of the 8th international Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japan 1990), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20) 및/또는 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4)와 같은 활성을 2가지 이상 또는 3가지 이상 보유하는 세포를 포함한다.
다른 구체예에서, 세포는 다음과 같은 활성을 1가지 이상 보유하는 세포, 예컨대 인돌젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.110), R-4-하이드록시페닐젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.222), 3-(4)-하이드록시페닐피루브산염 환원효소(EC 1.1.1.237), 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일)젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.111), 젖산염 산화효소(EC 1.1.3.-), 합성효소/분해효소(4.1.3.-), 예컨대 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.17) 또는 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.16), 합성효소/분해효소(4.1.2.-), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), 트립토판 아미노전이효소(EC 2.6.1.27), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20), 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1), D-트립토판 아미노전이효소 및/또는 D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21) 등의 활성 중에서 2가지 이상 또는 3가지 이상을 보유하는 세포를 포함한다.
또한, 개시된 세포는 다음과 같은 활성을 1가지 이상 보유하는 세포, 예컨대 트립토판 아미노전이효소(EC 2.6.1.27), 타이로신(방향족) 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), L-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.2), 트립토판 산화효소(EC 번호 없음), D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1), D-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21), 인돌젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.110), R-4-하이드록시페닐젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.222), 3-(4)-하이드록시페닐피루브산염 환원효소(EC 1.1.1.237), 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일)젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.111), 젖산염 산화효소(EC 1.1.3.-), 합성효소/분해효소(4.1.3.-), 예컨대 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.17) 또는 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.16), 합성효소/분해효소(4.1.2.-), 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20) 및/또는 D-트립토판 아미노전이효소와 같은 활성을 2가지 이상 또는 3가지 이상 보유하는 세포를 포함한다.
모나틴은 트립토판 및/또는 인돌-3-젖산을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 제1 폴리펩타이드와 트립토판 또는 인돌-3-젖산(트립토판 또는 인돌-3-젖산의 D형 또는 L형 모두 인돌-3-피루브산염으로 전환되는 기질로서 사용할 수 있음; 당업자라면 이 단계에서 선택된 폴리펩타이드가 이상적으로 적당한 특이성을 나타낸다는 것을 이해할 수 있을 것이다)을 접촉시키는 단계; 생성된 인돌-3-피루브산염을 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산(MP)으로 전환시키는 제2 폴리펩타이드와 상기 인돌-3-피루브산염을 접촉시키는 단계; 및 상기 MP를 모나틴으로 전환시키는 제3 폴리펩타이드와 상기 MP를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 전환에 사용할 수 있는 폴리펩타이드의 예를 도 2와 도 3에 예시하였다.
본 발명은 다른 관점으로서 MP와 같은 조성물, 적어도 하나의 외인성 핵산 서열에서 암호화되는 폴리펩타이드 2종 이상, 또는 때로는 3종 이상 또는 4종 이상을 함유하는 세포도 제공한다.
이러한 관점 및 기타 다른 관점의 본 발명은 다음 제시되는 상세한 설명과 예시적 실시예를 통해 명백하게 이해할 수 있을 것이다.
실시예 1
트립토판 아미노전이효소의 클로닝 및 발현
본 실시예는 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는데 사용할 수 있는 트립토판 아미노전이효소의 클로닝에 사용한 방법에 관한 것이다.
실험 개요
아미노전이효소를 암호화하는 11가지 유전자를 대장균에 클로닝하였다. 이 유전자는 바실러스 서브틸리스 D-알라닌 아미노전이효소(dat, 진뱅크 수탁번호 Y14082.1 bp 28622-29470 및 진뱅크 수탁번호 NP_388848.1, 각각 핵산 서열과 아미노산 서열), 시노라이조븀 멜리로티(라이조븀 멜리로티라고도 불림) 타이로신 아미노전이효소(tatA, 서열번호 1 및 2, 각각 핵산 서열과 아미노산 서열), 로도박터 스페로이즈 균주 2.4.1 타이로신 아미노전이효소(상동성을 통해 지지된 tatA, 서열번호 3과 4, 각각 핵산 서열과 아미노산 서열), 레이쉬마니아 메이저 광범위 기질 아미노전이효소(bsat, L.멕시카나의 펩타이드 단편과의 상동성을 통해 지지된 bsat, 서열번호 7 및 8, 각각 핵산 서열과 아미노산 서열), 바실러스 서브틸리스 방향족 아미노전이효소(araT, 상동성을 통해 지지됨, 서열번호 9 및 10, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 락토바실러스 아밀로보러스 방향족 아미노전이효소(상동성을 통해 지지된 araT, 서열번호 11 및 12, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), R.스페로이즈 35053 다중 기질 아미노전이효소(상동성을 통해 지지됨, 서열번호 13 및 14, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 로도박터 스페로이즈 균주 2.4.1 다중 기질 아미노전이효소(상동성을 통해 지지된 msa, 진뱅크 수탁번호 AAAE01000093.1, bp 14743-16155 및 진뱅크 수탁번호 ZP00005082.1, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 에세리히아 콜리 아스파르트산염 아미노전이효소(aspC, 진뱅크 수탁번호 AE000195.1 bp 2755-1565 및 진뱅크 수탁번호 AAC74014.1, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 및 대장균 타이로신 아미노전이효소(tyrB, 서열번호 31 및 32, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열)이다.
이 유전자들을 클로닝하고, 발현시켜 트립토판에서 인돌-3-피루브산염으로의 전환 시의 활성에 대하여 상용 효소와 함께 시험하였다. 11가지 클론 모두 활성을 나타내었다.
목적 활성을 가진 폴리펩타이드를 함유할 수 있는 박테리아 균주의 동정
NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에는 트립토판 아미노전이효소로 지정된 유전자가 없지만, 이 효소 활성을 나타내는 유기체는 동정되어 있다. L-트립토판 아미노전이효소(TAT) 활성은 다음과 같은 소스의 세포 추출물이나 정제 단백질로부터 측정하였다: 페스투카 옥토플로라(Festuca octoflora) 유래의 라이조박테리아 분리물, 완두콩의 미토콘드리아 및 시토졸, 해바라기 크라운 혹 세포, 라이조븀 레구미노사럼 (Rhizobium leguminosarum) biovar 트리폴리(trifoli), 에르위니아 허비콜라 pv 집소필레, 슈도모나스 시린지 pv. 사바스타노이, 아그로박테리움 튜머페이션스, 아조스피릴룸 립페럼 및 브라실렌스, 엔테로박터 클로아세, 엔테로박터 아글로머란스, 브라디라이조븀 엘칸니, 칸디다 말토사, 아조토박터 비네란디, 래트 뇌, 래트 간, 시노라이조븀 멜리로티, 슈도모나스 플루오레슨스 CHA0, 락토코커스 락티스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 헬베티쿠스, 밀 종자, 보리, 페이세올러스 아우레우스(녹두), 사카로마이세스 우바럼(칼스베르겐시스), 레이쉬마니아 종, 옥수수, 토마토 지맥, 완두콩 식물, 담배, 돼지, 클로스트리디움 스포로제네스 및 스트렙토마이세스 그리세우스.
클로닝용 게놈 DNA 의 분리
S.멜리로티(ATCC 기탁번호 9930)는 25℃하에 TY 배지(pH 7.2)에서 증식시켰다. 세포는 600nm에서의 광학밀도(OD600)가 1.85가 될 때까지 증식시키고, 게놈 DNA 제조를 위해 2% 접종물을 사용하였다. 게놈 DNA 분리를 위해 퀴아겐 게놈 팁 20/G 키트(Valencia, CA)를 사용하였다.
바실러스 서브틸리스 6051(ATCC)은 베레토 영양 배지(Bereto Nutrient Broth, Difco; Detroit, MI)에서 30℃하에 증식시켰다. 프로테이나제 K 및 리소자임의 농도를 2배로 하고 접종 시간을 2 내지 3배로 증가시킨 점을 제외하고는 퀴아겐 게놈 팁 20/G 프로토콜에 따라서 게놈 DNA를 분리하였다.
레이쉬마니아 메이저 ATCC 50122 게놈 DNA는 IDI, 인크(캐나다 퀘벡)에서 TE 완충액(pH 8.0)에 17ng/㎕의 농도로 공급받았다.
로도박터 스페로이즈 2.4.1(휴스턴에 있는 텍사스 유니버시티의 샘 카플란 교수로부터 공급받음), R.스페로이즈 35053(ATCC 번호) 및 L.아밀로보러스 게놈 DNA는 표준 페놀 추출법으로 제조하였다. 대수기 후기의 세포를 수거하고 TEN 완충액(10mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM EDTA, 100mM NaCl)에 재현탁한 뒤, 세포 현탁액 1ml 당 0.024ml의 나트륨 라우릴 사르코신을 첨가하여 용균시켰다. TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)을 포화시킨 페놀 동량으로 3회 이상 추출한 후, 9:1 클로로포름:옥탄올로 1회, 클로로포름으로 3회 추출하여 DNA 용액을 제조하였다. DNA는 3M 아세트산나트륨(pH 6.8) 0.1 부피와 에탄올 2 부피를 첨가하여 침전시켰다. 침전물은 원심분리로 수거하고 70% 에탄올로 1회 세척하였다. 마지막으로, DNA를 0.10ml 증류수에 용해하였다.
대장균 게놈 DNA는 균주 DH10B(Invitrogen)로부터 분리하여 퀴아겐 게놈-팁™(500/G) 키트를 사용하여 제조하였다. 상기 균주를 LB에서 OD650 1.87까지 증식시킨 배양액 30ml로부터 정제 DNA 0.3mg을 수득하였다. 정제한 DNA는 퀴아겐 용출 완충액(EB)에 0.37㎍/㎕의 농도로 용해시켰다.
폴리머라제 연쇄 반응 프로토콜
pET 30 Xa/LIC 벡터(Novagen, Madison, WI)의 상용성 오버행(overhang)을 이용하여 프라이머를 제조하였다. pET 벡터는 Xa/LIC 부위의 5'측에 12개 염기의 일본쇄 오버행을 갖고 있고, Xa/LIC 부위의 3' 측에 15개 염기의 일본쇄 오버행을 갖고 있다. 이 플라스미드는 결찰 독립성 클로닝(Ligation Independent Cloning)을 위해 디자인한 것으로서, N-말단에는 His-태그 및 S-태그를 붙이고 C 말단에는 선택적으로 His-태그를 부착하였다. 융합 단백질로부터 태그가 제거될 수 있도록 당해 유전자의 개시 코돈 바로 앞에는 Xa 프로테아제 인식 부위(IEGR)를 도입시켰다.
프라이머 디자인 시 유기체 특이적 서열의 5' 말단에 다음과 같은 서열을 첨가하였다: 순방향 프라이머: (서열번호 73); 역방향 프라이머: (서열번호 74).
바실러스 서브틸리스 dat 프라이머:
N 말단: (서열번호 15)
C 말단: (서열번호 16).
시노라이조븀 멜리로티 tatA 프라이머:
N 말단: (서열번호 17)
C 말단: (서열번호 18).
바실러스 서브틸리스 araT 프라이머:
N 말단: (서열번호 19)
C 말단: (서열번호 20).
로도박터 스페로이즈 msa(2.4.1 및 35053 모두):
N 말단: (서열번호 21)
C 말단: (서열번호 22).
레이쉬마니아 메이저 bast:
N 말단: (서열번호 23)
C 말단: (서열번호 24).
락토바실러스 아밀로보러스 araT:
N 말단: (서열번호 25)
C 말단: (서열번호 26).
로도박터 스페로이즈 tatA(2.4.1 및 35053 균주 모두):
N 말단: (서열번호 27)
C 말단: (서열번호 28).
에세리히아 콜리 aspC:
N 말단: (서열번호 29)
C 말단: (서열번호 30).
에세리히아 콜리 tyrB:
N 말단: (서열번호 33)
C 말단: (서열번호 34).
S.멜리로티(tatA) 유래의 유전자는 다음과 같은 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭시켰다. 50㎕ 반응물에 0.1 내지 0.5㎍ 주형, 1.5μM의 각 프라이머, 각 dNTP 0.4mM, 3.5U의 Expand High Fidelity Polymerase(Roche, 인디아나주 인디아나폴리스), 및 1X Expand™ 완충액(Mg 첨가)을 사용하였다. 사용된 열순환기 프로그램은 다음과 같이 구성하였다: 고온 개시 96℃, 5분, 그 다음 94℃ 30초, 55℃ 2분, 72℃ 2.5분으로 이루어진 사이클 29회 반복. 29회 반복 후에는 시료를 72℃에서 10분 동안 유지한 다음 4℃에 보관하였다. 이 PCR 프로토콜에 따라 1199bp의 산물이 생성되었다.
R.스페로이즈(msa 및 tatA), L.아밀로보러스 araT 및 바실러스 araT 유래의 유전자 서열은 다음과 같은 PCR 프로토콜로 증폭시켰다. 50㎕ 반응물에 0.1 내지 0.5㎍ 주형, 1.5μM의 각 프라이머, 각 dNTP 0.4mM, 3.5U의 Expand High Fidelity™ Polymerase(Roche, 인디아나주 인디아나폴리스), 및 1X Expand™ 완충액(Mg 첨가)을 사용하였다. 사용된 열순환기 프로그램은 다음과 같이 구성하였다: 고온 개시 96℃, 5분, 그 다음 94℃ 30초, 40 내지 60℃ 1분, 45초(구배 열순환기), 72℃ 2분, 15초로 이루어진 사이클 29회 반복. 29회 반복 후에는 시료를 72℃에서 10분 동안 유지한 다음 4℃에 보관하였다.
각 R.스페로이즈 msa 유전자에서, 42℃와 48℃의 어닐링 온도는 여러 산물을 생산했고, 특징적 밴드는 약 1464bp에서 나타났다. L.아밀로보러스 araT의 경우에, 42℃, 48℃ 및 56℃ 어닐링 온도는 1173bp에서 강한 밴드를 나타내는 단일 산물을 산출하였다. B.서브틸리스 araT의 경우에는, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃ 어닐링 온도는 게놈 DNA와 콜로니 모두에서 하나의 주산물(1173bp)을 산출하였다. L.메이저 bsat의 경우에는, 55℃ 어닐링 온도에서 가장 순수한 산물(1239bp)이 산출되었다. 로도박터 tatA 유전자에서는 50 내지 55℃ 어닐링 온도가 정확한 크기(1260bp)의 순수한 산물을 제공했다. 두 대장균 유전자와 B.서브틸리스 dat 유전자에서는 55 내지 60℃의 어닐링 온도를 사용하였고, 어닐링 시간은 45초로 단축하였다. 그 결과, 정확한 크기의 순수한 산물이 수득되었다(대장균 유전자의 경우에는 약 1.3kb, dat 유전자의 경우에는 850bp).
클로닝
PCR 산물은 퀴아겐 겔 추출 키트(Valencia, CA)를 사용하여 0.8% 또는 1% TAE-아가로스 겔로부터 겔 정제하였다. 이 PCR 산물을 아가로스 겔에서 표준물과 비교하여 정량한 다음, 결찰 독립성 클로닝(Novagen, Madison, WI)용의 제조자 권장 방법에 따라 T4 DNA 폴리머라제로 처리하였다.
간략히 설명하면, 정제한 PCR 산물 약 0.2pmol을 dGTP의 존재하에 1U T4 DNA 폴리머라제로 22℃에서 30분 동안 처리하였다. 이 폴리머라제는 PCR 산물의 3' 말단으로부터 염기를 연속적으로 제거한다. 이 폴리머라제는 구아닌 잔기를 만나면 이 효소의 5'에서 3' 방향으로의 폴리머라제 활성이 엑소뉴클레아제 활성을 억제하여 추가 절제를 효과적으로 차단한다. 그 결과, pET Xa/LIC 벡터에 상용성인 일본쇄 오버행이 만들어진다. 폴리머라제는 75℃에서 20분간 항온처리하여 불활성화시킨다.
벡터와 처리된 삽입물을 노바겐의 권유법에 따라 어닐링하였다. 약 0.02pmol의 처리된 삽입물과 0.01pmol의 벡터를 22℃에서 5분간 항온처리하고, 6.25mM의 EDTA(최종 농도)를 첨가한 뒤, 22℃에서 다시 항온처리하였다. NovaBlue™ 컴피턴트 단세포(Novagen, Madison, WI)에 어닐링 반응물(1㎕)을 첨가하고, 얼음상에서 5분 동안 항온처리하였다. 혼합 후, 세포를 42℃에서 30초간 열충격으로 형질전환시켰다. 2분간 얼음 상에 세포를 방치하고 실온의 SOC 250㎕에서 225rpm의 진탕하에 37℃에서 30분 동안 회복시켰다. 세포를 가나마이신(25 내지 50㎍/㎖)을 함유하는 LB 평판에 평판배양하였다.
퀴아겐 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제하고 XhoI와 XbaI를 사용하여 제한 분해하여 정확한 삽입체를 선별하였다. 디데옥시 사슬 종결 DNA 서열분석을 통해 정확한 삽입체를 보유하는 것으로 관찰되는 플라스미드 서열을 확인하였다.
서열번호 1 내지 14 및 31과 32는 재조합체 아미노전이효소의 뉴클레오타이드 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열로서, 진뱅크 서열과의 임의의 변화는 단백질 서열내 침묵 변이이거나 보존적 치환을 초래하였다. 서열번호 11과 12는 신규 서열이다.
유전자 발현 및 분석
서열분석으로 확인한 플라스미드 DNA는 대장균 발현 숙주 BLR(DE3) 또는 BL21(DE3)(Novagen, Madison, WI)에 서브클로닝했다. 배양물을 증식시킨 뒤, 퀴아겐 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드를 분리한 뒤 동일성 확인을 위해 제한효소 분해로 분석하였다.
먼저, BLR(DE3) 및 BL21(DE3) 세포에서 L.아밀로보러스 araT, B.서브틸리스 araT 및 S.멜리로티 tatA를 이용하여 발현 유도하였다. 가나마이신(30mg/L)을 함유하는 LB에서 OD600 0.5 내지 0.8까지 증식시킨 뒤 1mM IPTG(이소프로필 티오갈락토사이드)로 유도한 배양물을 이용하여 경시적 연구를 수행하였고, 유도 후 0시간, 1시간, 2시간 및 4시간째 시료를 채취하였다. 10% 나트륨 도데실 설페이트, 10% 2-머캅토에탄올 및 20% 글리세롤을 함유하는 120mM Tris-HCl(pH 6.8) 0.10ml에 시료 2.0ml의 세포를 재현탁시키고, 95℃에서 10분간 가열한 다음, 냉각하고 0.10ml H2O로 희석하였다. 이 총 세포 단백질 시료의 일정량을 4 내지 15% 구배 겔을 이용하는 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질 발현 양은 2시간 유도와 4시간 유도 사이에, 또는 BLR(DE3) 세포와 BL21(DE3) 세포 사이에 큰 차이가 없었다.
세포 추출물은 4시간 시료를 가지고 배양물 2ml로부터의 세포 펠릿을 0.25㎕ 벤조나제 뉴클레아제를 함유하는 노바겐 BugBuster™ 시약 0.25ml에 현탁시킨 뒤, 부드러운 진탕하에 20분 동안 실온에서 항온배양한 다음, 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 16,000xg에서 원심분리하여 제조하였다. 세포의 가용성 단백질의 분석을 위해 상청액(세포 추출물)을 4 내지 15% 구배 겔 위에 로딩하였다.
3가지 클론, L.아밀로보러스 araT(서열번호 11 및 12), B.서브틸리스 araT(서열번호 9 및 10) 및 S.멜리오티 tatA(서열번호 1 및 2)는 정확한 크기(약 45kDa)에 상응하는 가용성 단백질을 나타내었다. B.서브틸리스 araT 유전자 산물이 가장 다량으로 과잉발현되었고(또는) 다른 두 유전자 산물 보다 더 많이 용해되어 있었다.
후속 발현법에서는, 양성 클론 유래의 플라스미드 DNA를 BL21(DE3)에 서브클로닝하였는데, 그 이유는 이 숙주가 보다 양호한 증식성을 보였기 때문이다. 가나마이신 50mg/L를 함유하는 LB에서 증식시킨 배양물을 가지고 1mM IPTG를 이용하여 재유도하였으며, OD600이 약 0.8에 이를 때까지 유도하였다. 37℃에서 4시간 동안 증식시킨 후, 3000rpm으로 10분(4℃)간 원심분리하고 TEGGP 완충액(50mM Tris-HCl(pH 7.0), 0.5mM EDTA, 100mg/L 글루타치온, 5% 글리세롤 및 로쉐 완전 프로테아제 억제제 혼합물)으로 세척한 다음, -80℃ 에탄올에서 급속 동결시켰다.
시료를 5㎕/㎖ 프로테아제 억제제 혼합물 세트 #3(Calbiochem-Novabiochem Corp., 캘리포니아 산디에고 소재)과 벤조나제 뉴클레아제 1㎕/ml를 함유하는 BugBuster™(Novagen) 시약 5ml 당 습윤 세포 중량 1g의 비율로 세포를 재현탁했다. 시료를 오비탈 진탕기에서 실온하에 20분 동안 항온배양하였다. 불용성 세포 찌꺼기는 16,000g에서 20분 동안 4℃하에 원심분리하여 제거하였다.
세포 추출물은 SDS-PAGE로 분석하고, 다음과 같은 방법에 따라 인돌-피루브산의 후속 생산을 통해 트립토판 아미노전이효소의 활성을 분석하였다. 1ml 반응물을 50mM 사붕소화나트륨(pH 8.5), 0.5mM EDTA, 0.5mM 비산나트륨, 50μM 피리독살 인산염, 5mM α-케토글루타르산염 및 5mM L-트립토판에 첨가하였다. 무세포 추출물이나 정제 효소를 첨가하여 반응을 개시시키고 30℃에서 30분간 항온처리하였다. 반응 정지를 위해 20% TCA(200㎕)를 첨가하고 침전된 단백질을 원심분리로 제거하였다. 327nm에서 흡광도를 측정하여 분석 완충액에 갓 제조한 인돌-3-피루브산염으로 작도한 표준 곡선과 비교했다. 기질 트립토판을 첨가하지 않은 대조용 반응이나 pET30a만으로 형질전환시킨 클론 유래의 무세포 추출물을 이용한 대조용 반응을 수행하였다.
세포 추출물에 존재하는 본래의 대장균 아미노전이효소에 의한 배경값이 존재하기 때문에, 재조합 단백질은 제조자의 프로토콜(Novagen, 위스콘신 매디슨 소재)에 따라 His-Bind 카트리지를 사용하여 정제하였다. 용출 분획은 PD-10(Amersham Biosciences, 뉴저지 피츠카타웨이 소재)에서 탈염시키고, 50mM Tris, pH 7.0으로 용출시켰다. 정제 단백질은 SDS-PAGE로 분석하고 아미노전이효소 활성에 대해 분석했다.
1mM IPTG를 이용하여 37℃에서 유도(4시간)한 후 얻어지는 결과는 L.메이저 bsat, S.멜리로티 tatA, 대장균 aspC 및 두 R.스페로이즈 tatA 클론이 유의적 수준의 트립토판 아미노전이효소 활성을 나타낸다는 것을 입증하였다. B.서브틸리스로부터 araT 단백질은 과잉발현되고 가용성이었으나, 효소 활성은 거의 나타내지 않았다. L.아밀로보러스 araT 유전자 산물은 세포 추출물에서 가용성으로 나타났으나, His-Bind 카트리지를 이용한 정제 후 정확한 분자량을 갖는 단백질은 소량만이 확인되었다. msa 유전자 산물은 불용성이었고 추가 발현 실험은 봉입체 형성을 최소화하기 위해 24℃에서 수행했다. 10μM 내지 1mM 사이의 다양한 농도의 IPTG를 이용하여 가용성 단백질의 양을 최대화하였다.
하기 표 1은 1분 당 단백질 1mg 당 형성된 인돌-3-피루브산염(I3P)의 비활성(㎍)을 열거한 것이다. 몇몇 경우에는, 극소량의 재조합 단백질이 분석의 유효 직선 범위 이상의 높은 활성을 나타내었다. 이러한 경우에는 비활성 수치 앞에 '>'를 표시하였다.
표 1
세포 추출물(CE) 및 정제물(P) 형태의 클론과 상용화된 효소의 비활성
효소 비활성(I3P㎍/단백질㎎/min) 주해
L.메이저 bsat CE >49.3
L.메이저 bsat P >4280
S.멜리로티 tatA CE >28.6
S.멜리로티 tatA P >931
2.4.1 tatA CE >41.2
2.4.1 tatA P 1086
35053 tatA CE >62.3
35053 tatA P >486
L.아밀로보러스 araT CE 1.26
L.아밀로보러스 araT P 0 His-Bind 카트리지 이후 소량의 단백질
B.서브틸리스 araT CE 0 검출불가능
B.서브틸리스 araT P 1.5-4.5
2.4.1 msa P 2.05 극히 적은 가용성 단백질
2.4.1 msa P 0 His-Band 카트리지 이후 단백질 미검출
35053 msa CE 3.97 극히 적은 가용성 단백질
35053 msa P 0 His-Band 카트리지 이후 단백질 미검출
대장균 aspC(P) 800
대장균 tyrB(P) 1 난용성
B.서브틸리스 D-아미노전이효소(P) 2.7 기질로서 D-트립토판 사용
광범위 아미노전이효소 22 시그마 cat# T7684
돼지 II-A형 1.5 시그마 G7005
돼지 I형 1 시그마 G2751
클로닝한 재조합 단백질 모두를 비교하기 위해 정렬한 결과 araT, tatA, bsat 및 msa 서열 사이에는 고도 보존성 영역이 많지 않음을 알 수 있었다. 최고의 활성을 나타내는 재조합 단백질, 로도박터 tatA 유전자 산물 동족체, L.메이저 광범위 기질 아미노전이효소 및 시노라이조븀 멜리로티 타이로신 아미노전이효소의 정렬 시에는 여러 보존적 영역을 나타내었으나, 이들은 단백질 수준에서 단지 약 30 내지 43%의 동일성이 있었다. 광범위 D-특이성(D-알라닌) 아미노전이효소의 유용성은 모나틴의 다른 입체이성체 생산에 이용할 수 있다.
실시예 2
인돌-3- 젖산염에서 인돌-3- 피루브산염으로의 전환
도 1과 3에 도시한 바와 같이, 인돌-3-젖산은 인돌-3-피루브산염의 생산에 사용할 수 있다. 젖산과 피루브산염 사이의 전환은 인돌-3-피루브산염과 인돌-3-젖산염 간의 전환과 마찬가지로 가역적 반응이다. 그 다음, 인돌-3-피루브산염에 의한 340nm에서의 높은 배경값의 존재로 인하여 인돌-젖산염의 산화를 수행하였다.
표준 분석 혼합물은 100mM 인산칼륨(pH 8.0), 0.3mM NAD+, 젖산염 탈수소효소(LDH)(시그마-L2395, 미주리주 세인트루이스 소재) 7 유닛, 기질 2mM을 0.1ml로 구성하였다. 분석은 UV 투과성 미량역가 평판에서 분광분석기(Molecular Devices SpectraMax Plus platereader)를 이용하여 2반복으로 실시하였다. 폴리펩타이드와 완충액을 혼합하고, 인돌-3-젖산과 NAD+를 함유하는 웰에 주입한 뒤 순간 혼합 후 9초 간격으로 각 웰의 340nm 흡광도를 판독하였다. 반응은 25℃에서 5분간 유지시켰다. NAD+로부터 NADH의 생산으로 인해 340nm에서의 흡광도가 증가하였다. 별도로 NAD+ 및 기질을 첨가하지 않은 음성 대조군도 분석하였다. 류코노스톡 메센테로이즈 유래의 D-LDH(시그마 카달로그 번호 L2395)는 바실러스 스테아로터모필러스 유래의 L-LDH(시그마 카달로그 번호 L5275) 보다 인돌 유도체 기질 시 보다 나은 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다.
D-LDH 폴리펩타이드의 천연 기질인 D-젖산 및 NAD+ 또는 NADH 및 피루브산염에도 유사한 방법을 이용하였다. 피루브산염 환원반응의 Vmax는 젖산염 산화반응의 Vmax 보다 100 내지 1000배 높았다. D-LDH에 의한 인돌-3-젖산 산화반응의 Vmax 는 젖산 Vmax 의 약 1/5이었다. 또한, 0.5mM EDT와 0.5mM 비산나트륨을 함유하는 50mM 붕산나트륨 완충액을 이용하고 327nm(에놀-붕산염 유도체) 흡광도를 변화시켜 인돌-3-피루브산염의 존재를 측정하였다. L-LDH 및 D-LDH 폴리펩타이드 모두에 대한 음성 대조군과 비교했을 때 작은 흡광도 변화가 반복적으로 관찰되었다.
또한, 광범위 특이성의 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 및/또는 EC 1.1.2.3과 관련된 활성을 가진 효소)를 클로닝할 수 있고, 이를 이용하여 인돌-3-젖산으로부터 인돌-3-피루브산염을 제조할 수 있다. 광범위 특이성을 가진 탈수소효소의 소스로는 대장균, 네이제리아 고노로에(Neisseria gonorrhoeae) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)이 있다.
또는, 인돌젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.110)를 함유하는 클로스트리듐 스포로제네스의 세포 추출물; 인돌-3-피루브산염에 대해 활성이 있는 것으로 공지된 p-하이드록시페닐젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.222)를 함유하는 트립파노소마 크루지 에피마스티고테스(Trypanosoma cruzi epimastigotes) 세포 추출물; 이미다졸-5-일 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.111)를 함유하는 슈도모나스 아시도보란스(Pseudomonas acidovorans) 또는 대장균 세포 추출물; 하이드록시페닐피루브산염 환원효소(EC 1.1.1.237)를 함유하는 콜레우스 블루메이(Coleus blumei); 또는 D-방향족 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.222)를 함유하는 칸디다 말토사(Candida maltosa) 세포 추출물과 인돌-3-젖산염을 접촉시켜 인돌-3-피루브산염을 제조할 수도 있다. 이러한 활성에 대해 설명하고 있는 참고문헌으로는 다음과 같은 것이 있다: Nowicki et al.(FEMS Microbiol Lett 71:119-24, 1992), Jean and DeMoss(Canadian J. Microbiol. 14 1968, Coote and Hassall(Biochem.J.111:237-9, 1969), Cortese et al.(C.R.Seances Soc.Biol.Fil. 162 390-5, 1968), Petersen and Alfermann(Z.Naturforsch.C: Biosci. 43 501-4, 1988), 및 Bhatnagar et al.(J.Gen Microbiol 135:353-60, 1989). 또한, 슈도모나스 종 유래의 것(Gu et al., J.Mol.Catalysis B: Enzymatic: 18:299-305, 2002)과 같은 젖산염 산화효소는 인돌-3-젖산을 인돌-3-피루브산염으로 산화시키는데 이용할 수 있다.
실시예 3
L-아미노산 산화효소를 이용한 L- 트립토판의 인돌-3- 피루브산염으로의 전환
본 실시예는 실시예 1에 기술한 트립토판 아미노전이효소 이용법의 대안으로서 산화효소(EC 1.4.3.2)를 통해 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 사용되는 방법을 설명한 것이다. L-아미노산 산화효소는 크로탈루스 듀리서스(Crotalus durisus)(시그마, 카달로그 번호 A-2805, 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 정제하였다. 분자클로닝을 위한 L-아미노산 산화효소는 다음과 같은 수탁번호의 폴리펩타이드를 포함한다: CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, O93364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 및 Z48565.
미량원심분리관에서 총부피를 1ml로 하여 반응물을 제조하고 37℃하에 진탕하면서 10분 동안 항온배양하였다. 반응 혼합물에는 5mM L-트립토판, 100mM 인산나트륨 완충액 pH 6.6, 0.5mM 비산나트륨, 0.5mM EDTA, 25mM 사붕산나트륨, 0.016mg 카탈라제(83U, 시그마 C-3515), 0.008mg FAD(시그마) 및 0.005 내지 0.125 유닛의 L-아미노산 산화효소를 첨가하였다. 음성 대조군에는 트립토판을 제외한 모든 성분을 첨가하였고, 대조군에는 산화효소를 제외한 모든 성분을 첨가하였다. 카탈라제는 산화 탈아민화 동안 형성되는 과산화수소를 제거하기 위해 사용하였다. 사붕산나트륨과 비산나트륨은 327nm에서 최대 흡광도를 나타내는 인돌-3-피루브산염의 에놀-붕산염 형태를 안정화시키기 위해 사용하였다. 인돌-3-피루브산염 표준물은 반응 혼합물에 0.1 내지 1mM의 농도로 제조하였다.
구입한 L-아미노산 산화효소는 단백질 1mg 당 1분 당 형성된 인돌-3-피루브산염 540㎍의 비활성을 나타내었다. 이것은 트립토판 아미노전이효소의 비활성과 동일한 수준이었다.
실시예 4
알돌라제를 이용한 인돌-3- 피루브산염의 2- 하이드록시 2-(인돌-3- 일메틸 )-4-케토 글루타르산으로의 전환
본 실시예는 알돌라제(분해효소)를 이용하여 인돌-3-피루브산염을 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산 모나틴 전구체(MP)로 전환시키는데 사용할 수 있는 방법을 설명한 것이다(도 2). 알돌 축합은 한 알데하이드 또는 케톤의 β-탄소와 다른 알데하이드 또는 케톤의 카르보닐 탄소 사이에 탄소-탄소 결합을 형성하는 반응이다. 한 기질의 카르보닐 기 인접 탄소에는 카르보음이온이 형성되고, 이것은 제2 기질의 카르보닐 탄소(친핵성 탄소)를 공격하는 친핵체로서 작용한다. 가장 일반적으로는, 친핵성 기질은 알데하이드로서, 대부분의 알돌라제는 EC 4.1.2.- 부류에 속한다. 흔히 친핵성 기질은 피루브산염일 때도 있다. 알돌라제가 두 케토산이나 두 알데하이드 사이의 축합반응을 촉매하는 것이 흔한 일은 아니다.
하지만, 두 카르복실산의 축합을 촉매하는 알돌라제가 동정된 바 있다. 예컨대, EP 1045-029호는 슈도모나스 배양물(EC 4.1.3.16)을 사용하여 글리옥실산과 피루브산염으로부터 L-4-하이드록시-2-케토글루타르산을 생산하는 예를 설명하고 있다. 또한, 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 피루브산염 분해효소, EC 4.1.3.17)는 두 케토산의 축합반응을 촉매할 수 있다. 따라서, 인돌-3-피루브산염과 피루브산염의 축합을 촉매하기 위하여 유사한 알돌라제 폴리펩타이드를 사용하였다.
클로닝
4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 피루브산염 분해효소(ProA 알돌라제, EC 4.1.3.17) 및 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 글리옥실산염 분해효소(KHG 알돌라제, EC 4.1.3.16)는 도 2의 알돌라제 반응과 매우 유사한 반응을 촉매한다. 따라서, pET30 Xa/LIC 벡터(Novagen, 위스콘신주 매드슨 소재)에 상용성인 오버행을 가지고 프라이머를 디자인하였다. 이러한 프라이머의 디자인에 대해서는 실시예 1에 전술한 바와 같다.
pET30 Xa/LIC 클로닝을 위하여 다음과 같은 프라이머를 디자인하였다:
1. 슈도모나스 스트라미네아 proA 유전자(진뱅크 수탁번호 12964663 Version: 12964663) 및 코마모나스 테스토스테로니 proA 유전자(서열번호 65 및 66, 각각 핵산 서열과 아미노산 서열):
순방향 (서열번호 55)
역방향 (서열번호 56).
2. 시노라이조븀 멜리로티 1021 SMc00502 유전자(proA와 상동성, 진뱅크 수탁번호: 15074579 및 CAC46344, 각각 핵산 서열과 아미노산 서열):
순방향 (서열번호 61)
역방향 (서열번호 62) .
3. 스핑고모노나스 종 LB126 fldZ 유전자(진뱅크 수탁번호 7573247 Version: 7573247, 추정상의 아실 전이효소 암호화):
순방향 (서열번호 57)
역방향 (서열번호 58).
4. 아트로박터 키세리 pcmE 유전자(진뱅크 수탁번호 AF331043 Version: AF331043.1, 옥살로시트라말산염 알돌라제 암호화):
순방향 (서열번호 59)
역방향 (서열번호 60).
5. 예르시니아 페스티스 균주 CO92 YPO0082 유전자(진뱅크 수탁번호: 15978115 Version: 15978115, 가능한 전이효소 암호화):
순방향 (서열번호 63)
역방향 (서열번호 64).
6. 바실러스 서브틸리스 khg 유전자(진뱅크 수탁번호 Z99115.1, GI:2634478, 126711-127301 및 CAB14127.1, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열):
순방향 (서열번호 35)
역방향 (서열번호 36).
7. 대장균 khg 유전자(진뱅크 수탁번호 AE000279.1 1331-1972 및 AAC74920.1, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열):
순방향 (서열번호 37)
역방향 (서열번호 38).
8. S.멜리로티 khg 유전자(진뱅크 수탁번호 AL591792.1, GI:15075850, 65353-64673 및 CAC47463.1, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열):
순방향 (서열번호 39)
역방향 (서열번호 40).
상기 1과 2, 6 내지 8에 기술한 유기체의 게놈 DNA를 퀴아겐 게놈-팁 프로토콜에 따라 정제하였다. 이와 유사한 기술로 3 내지 5에 기술한 유기체의 게놈 DNA도 정제할 수 있다.
슈도모나스 스트라미네아(ATCC 33636)는 영양액체배지와 하이드록시벤조산염을 함유하는 배지에서 30℃하에 증식시켰다. 코마모나스 테스토스테로니(ATCC 49249)는 영양액체배지와 하이드록시벤조산염을 함유하는 배지에서 26℃하에 증식시켰다. 스핑고모나스 종 LB126(Flemish Institute for Technological Research, VITO, B-2400 Mol, Belgium)은 문헌[Wattiau et al. Research in Microbiol. 152:861-72, 2001]에 기술된 방법에 따라 증식시켰다. 아트로박터 키세리(Gulf Ecology Division, National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S.Environmental Protectin Agency, Gulf Breeze, FL32561, USA)는 이튼(Eaton, J.Bacteriol. 183:3689-3703, 2001)이 기술한 프로토콜에 따라 증식시켰다. 시노라이조븀 멜리로티 1021(ATCC 51124)는 ATCC TY 배지 및 하이드록시벤조산염 배지에서 26℃ 하에 증식시켰다. 에르시니아 페스티스 균주 CO92(ATCC)는 ATCC 배지 739 말 혈액 아가에서 26℃ 하에 증식시켰다. 바실러스 서브틸리스 6051(ATCC)은 베레토 영양 액체배지(Difco; 미시간주 디트로이트 소재)에서 30℃하에 증식시켰다. 대장균 게놈 DNA는 실시예 1에 기술된 바와 같이 균주 DH10B(Invitrogen)로부터 분리하였다.
실시예 1에 기술된 PCR, 클로닝 및 선별 프로토콜을 사용하여 C.테스토스테로니 및 S.멜리로티 proA 서열과 대장균, B.서브틸리스 및 S.멜리로티 khg 서열을 클로닝하였다. 전술한 다른 서열의 클로닝에도 이와 동일한 방법을 사용할 수 있다.
양성 클론의 서열분석에는 S-태그와 T7 종결인자 프라이머(Novagen) 및 내부 프라이머(Integrated DNA Technologies, Inc.(Coralville, IA) 제품)를 이용한 디데옥시 사슬 종결 서열분석법을 사용하였다.
발현 및 활성 분석
플라스미드 DNA(서열분석으로 확인함)는 발현 숙주 BL21(DE3)(Novagen)에 서브클로닝하였다. 배양물은 50mg/L 가나마이신을 함유하는 LB 배지에서 증식시키고, 플라스미드는 퀴아겐 스핀 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 분리하였으며, 이어서 제한효소 분해로 동일성을 확인하였다. 50mg/L 가나마이신을 함유하는 LB 배지에서 37℃하에 증식시킨 BL21(DE3) 작제물을 이용하여 유도 실험하였다. OD600이 약 0.6에 도달한 후 0.1mM IPTG를 이용하여 단백질 발현을 유도하였다. 세포는 30℃에서 4시간 동안 증식시킨 후 원심분리로 수거하였다. 세포를 그 다음 Bugbuster™시약 (Novagen)을 사용하여 용균하고 전술한 His-Bind 카트리지(실시예 1)를 사용하여 His-태그 재조합체 단백질을 정제하였다. 정제한 단백질은 PD-10 일회용 컬럼을 이용하여 탈염시키고 2mM MgCl2를 첨가한 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.3)으로 용출시켰다.
재조합체 융합 단백질의 추정 분자량에서 가용성 단백질의 농도를 검출하기 위하여 4 내지 15% 구배 겔의 SDS-PAGE를 통해 단백질을 분석하였다.
단백질의 활성은 기질로서 인돌-3-피루브산염과 피루브산나트륨을 이용하여 분석하였다. 분석 혼합물은 100mM Tris-HCl(pH 7 내지 pH 8.9), 0 내지 8mM MgCl2, 3mM 인산칼륨(pH 8) 및 각 기질 6mM을 1ml에 함유한 것이다. 이 반응물에 다양한 양의 폴리펩타이드(예컨대, 10 내지 100㎍)를 첨가하여 반응을 개시시키고 25℃ 내지 37℃에서 30분 동안 항온배양한 뒤, 여과한 다음 -80℃에서 동결시켰다.
proA 유전자 산물에 의한 활성 결과
C.테스토스테로니 proA 및 S.멜리로티 SMc00502 유전자 작제물은 IPTG 유도시 다량의 발현율을 나타내었다. 재조합체 단백질은 총 단백질 및 세포 추출물 시료의 SDS-PAGE 분석 결과 고도로 가용성이었다. C.테스토스테로니 유전자 산물은 >95% 순도로 정제되었다. His-Bind 카트리지를 이용한 친화성 정제 이후 S.멜리로티 유전자 산물의 수율은 극히 낮아지기 때문에 효소 분석에는 세포 추출물을 이용하였다.
두 재조합체 알돌라제는 모두 인돌-3-피루브산염과 피루브산염으로부터 MP의 형성을 촉매했다. 효소 활성에는 2가 인산마그네슘 및 인산칼륨의 존재가 요구되었다. 인돌-3-피루브산염, 피루브산염 또는 인산칼륨이 없는 경우에는 산물이 뚜렷하게 관찰되지 않았다. 효소 부재시에도 소량의 산물이 형성되었다(일반적으로 효소 존재 시보다 1차수 낮은 농도).
산물의 피크는 역상 C18 컬럼으로부터 인돌-3-피루브산염 보다 약간 늦게 용출되었고, 이 피크의 질량 스펙트럼은 산물 MP에 대해 예상된 모이온인 292.1의 충돌 유도성 모이온([M+H]+)을 나타냈다. 질량 스펙트럼에 존재하는 주요 딸단편으로는 m/z=158(1H-인돌-3-카르브알데하이드 카르보늄 이온), 168(3-부타-1,3-디에닐-1H-인돌 카르보늄 이온), 274(292-H2O), 256(292-2H2O), 238(292-3H2O), 228(292-CH4O3) 및 204(피루브산염 상실)인 것을 포함했다. 산물은 또한 트립토판과 같은 다른 인돌 함유 화합물에서 특징으로 나타나는 UV 스펙트럼을 나타내었는데, 279 내지 280에서 λmax와 약 290nm에서 작은 쇼울더를 나타내었다.
C.테스토스테로니 알돌라제에 의해 생산되는 MP의 양은 반응 온도를 실온에서 37℃로 증가시키고, 기질 양 및 마그네슘 양을 증가시킨 결과 증가하였다. 효소의 합성 활성은 pH 증가에 따라서는 감소하였는데, 최대 산물에 바람직한 pH는 7로 관찰되었다. 트립토판 표준물을 기초로 할 때, 정제된 단백질 20㎍을 이용하여 표준 분석에 의해 생산된 MP의 양은 1ml 반응물 당 약 10 내지 40㎍이었다.
S.멜리로티 및 C.테스토스테로니 ProA 알돌라제 암호 서열은 전술한 다른 유전자와 고도의 상동성을 나타내기 때문에 재조합체 유전자 산물 모두가 이 반응을 촉매할 수 있을 것으로 예상했다. 더욱이, 위치 59와 87에 트레오닌(T)을 보유하는 알돌라제, 위치 119에 아르기닌(R)을 보유하는 알돌라제, 위치 120에 아스파르트산염(D)을 보유하는 알돌라제 및 위치 31과 71에 히스티딘(H)을 보유하는 알돌라제(C.테스토스테로니의 번호 시스템을 기초로 한다)는 유사한 활성을 가질 것으로 예상된다.
khg 유전자 산물에 의한 활성 결과
B.서브틸리스 및 대장균 khg 유전자 작제물은 IPTG로 유도했을 때 단백질을 다량으로 발현하는 반면 S.멜리오티 khg는 발현율이 보다 낮다. 재조합체 단백질은 총 단백질 및 세포 추출물의 SDS-PAGE 분석으로 판단해보면 용해성이 큰 단백질이다. B.서브틸리스 및 대장균 khg 유전자 산물은 >95% 순도로 정제되었지만, S.멜리로티 유전자 산물의 수율은 His-Bind 카트리지를 이용한 친화성 정제 후 그 만큼 높아지지 않았다.
이 효소의 활성에 마그네슘 및 인산염이 필요하다는 증거는 없었다. 하지만, 문헌에서는 이 분석을 인산나트륨 완충액 중에서 수행한다고 보고하고 있고, 보고에 따르면 이 효소는 이작용성으로서 인산화된 기질, 예컨대 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루콘산염(KDPG)에 활성을 나타내고 있다. 효소 분석은 전술한 바와 같이 수행하였고, 몇몇 경우에는 인산염을 제외시켰다. 그 결과, 재조합체 KHG 알돌라제는 MP를 생산하였지만 ProA 알돌라제만큼 활성적이지는 않았다. 몇몇 경우에는 KHG에 의해 생산된 MP의 농도가 마그네슘 및 인산염만에 의해 생산된 양과 거의 동일하였다. 즉, 인산염은 KHG 활성을 증가시키는 것으로 보이지 않았다. 바실러스 효소는 최고 활성을 보였고, SRM(실시예 10 참조)으로 측정 시 마그네슘 및 인산염 만에 의한 활성 보다 약 20 내지 25% 더 높았다. 시노라이조븀 효소는 가장 낮은 활성을 보였으며, 이것은 발현 시 관찰되는 폴딩(folding)과 용해성 문제과 관련이 있을 가능성이 있다. 3가지 효소 모두 활성 부위 글루탐산염(B.서브틸리스 번호매김 시스템에서 위치 43)과 피루브산염과의 쉬프 염기 형성에 필요한 리신(위치 130)을 보유하였지만, B.서브틸리tm 효소는 활성 부위 잔기인 위치 47에 아르기닌이 아닌 트레오닌을 함유하고 있었다. B.서브틸리스 KHG는 보다 작았고, S.멜리로티 및 대장균 효소와 활성 부위 트레오닌을 가진 다른 효소와 달리 클러스터로 존재하는 것으로 보인다. 즉, 활성 부위의 차이가 B.서브틸리스 효소의 증가된 활성을 나타내는 원인일 가능성이 있다.
알돌라제 활성의 향상
촉매 항체는 천연 알돌라제 만큼 효율성이고, 광범위한 기질을 허용하며 도 2에 도시한 반응을 촉매하는데 사용될 수 있다.
알돌라제는 또한 유도 진화(directed evolution)를 통해 향상시킬 수 있는데, 예를 들면 인산염의 필요성을 없애고 거울상선택성을 전도시키기 위한 DNA 셔플링(shuffling)과 에러 프론(error-prone) PCR을 통해 진화시킨 KDPG 알돌라제(전술한 KHG와 고도 상동성임)에 대해 종래 기술된 바와 같이 향상시킬 수 있다. KDPG 알돌라제 폴리펩타이드는 공급체 기질에 대한 특이성은 높지만 수용체 기질(즉, 인돌-3-피루브산염)에 대해서는 비교적 유동적이기 때문에 생화학적 반응에 유용하다(Koeller & Wong, Nature 409:232-9, 2001). KHG 알돌라제는 다수의 카르복실산과 피루브산염의 축합에 활성을 나타낸다. KHG 알돌라제의 포유동물 형태는 박테리아 형태 보다 특이성이 더 광범위한 것으로 사료되며, 예컨대 4-하이드록시 4-메틸 2-옥소글루타르산염에 대한 활성이 보다 높고 4-하이드록시-2-케토글루타르산염의 입체이성체 모두를 허용한다. 박테리아 소스는 R 이상체에 대해 10배의 선호도를 나타내는 것으로 보인다. 게놈 데이터베이스에서 이용가능한 KHG 상동체는 거의 100개에 달하고, 활성도 슈도모나스, 파라코커스, 프로비덴시아, 시노라이조븀, 모르가넬라, 대장균 및 포유동물 조직에서 입증된 바 있다. 이 효소는 모나틴 생산에 바람직한 거울상선택성을 맞추기 위한 출발점으로 사용될 수 있다.
피루브산염과 케토산 및/또는 인돌 같은 벌키한 소수성 기를 보유한 다른 기질을 이용하는 알돌라제는 이 폴리펩타이드의 특이성, 속도 및 선택성을 맞추기 위하여 "진화"시킬 수 있다. 본 명세서에 입증된 KHG 및 ProA 알돌라제 외에도, 이러한 효소의 예로는 다음과 같은 것이 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다: KDPG 알돌라제 및 관련 폴리펩타이드(KDPH); 노카르디오이즈 균주 유래의 트란스카르복시벤잘피루브산염 하이드라타제-알돌라제; 피루브산염과 2-카르복시벤즈알데하이드(방향족 고리 함유 기질)를 축합시키는 4-(2-카르복시페닐)-2-옥소부트-3-에노에이트 알돌라제(2'-카르복시벤잘피루브산염 알돌라제); 또한 피루브산염과 방향족 함유 알데하이드를 기질로서 이용하는 슈도모나스 푸티다 및 스핑고모나스 알로마티시보란스 유래의 트란스-O-하이드록시벤질리덴피루브산염 하이드라타제-알도라제; 2-옥소산을 기질로서 이용하고 유기체 마이크로코커스 데니트리피칸스에 존재하는 것으로 사료되는 3-하이드록시아스파르트산염 알돌라제(에리트로-3-하이드록시-L-아스파르트산염 글리옥실산염 분해효소); 벤질 기를 함유하는 기질을 이용하는 벤조인 알돌라제(벤즈알데하이드 분해효소); 디하이드로네오프테린 알돌라제; 벤즈알데하이드와 글리신을 축합시키는 L-트레오-3-페닐세린 벤즈알데하이드-분해효소(페닐세린 알돌라제); 4-하이드록시-2-옥소발레르산염 알돌라제; 1,2-디하이드록시벤질피루브산염 알돌라제; 및 2-하이드록시벤잘피루브산염 알돌라제.
필요한 활성을 가진 폴리펩타이드는 다음과 같은 방법을 사용하여 당해 클론을 선별함으로써 선발할 수 있다. 발현 카세트에 당해 클론을 운반하는 벡터를 이용하여 트립토판 영양요구변이주를 형질전환시키고, 소량의 모나틴 또는 MP를 함유하는 배지에서 증식시킨다. 아미노전이효소 및 알돌라제 반응은 가역성이므로, 세포는 모나틴의 라세미 혼합물로부터 트립토판을 생산할 수 있다. l와 유사한 방식으로, 탄소 및 에너지 원으로서 MP 또는 모나틴을 이용하는 성질을 통해 유기체(재조합체 및 야생형 모두)를 선별할 수 있다. 목표 알돌라제의 한 소스는 각종 슈도모나스 및 라이조박테리아 균주의 발현 라이브러리이다. 슈도모나드는 방향족 분자를 분해하는 다수의 독특한 이화 경로를 보유하며, 또한 다수의 알돌라제를 함유하는 반면, 라이조박테리아는 알돌라제는 함유하고 식물 근권에서 증식하는 것으로 알려져 있고 모나틴의 생합성 경로를 작도할 때 기술한 다수의 유전자를 보유하고 있다.
실시예 5
모니탄 전구체의 화학적 합성
실시예 4에는 인돌-3-피루브산염을 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산 모나틴 전구체(MP)를 전환시키기 위해 알돌라제를 이용하는 방법을 설명하였다. 본 실시예에는 MP를 화학적으로 합성하는 대안적 방법을 설명한다.
MP는 일반적으로 알돌형 축합을 통해 제조한다(도 4). 간략히 설명하면, 전형적인 알돌형 반응은 강염기, 예컨대 LDA(리튬 디이소프로필아미드), 리튬 헥사메틸디실라잔 또는 부틸 리튬을 이용하여 피루브산염 에스테르의 카르보음이온을 생성시키는 것을 포함한다. 생성된 카르보음이온은 인돌-피루브산염과 반응하여 결합 산물을 형성한다.
인돌 질소를 보호하기 위해 사용할 수 있는 보호기로는 t-부틸옥시카르보닐(Boc) 및 벤질옥시카르보닐(Cbz)이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 카르복실산의 차단기로는 알킬 에스테르(예, 메틸, 에틸, 벤질 에스테르)가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 보호기가 사용되는 경우에는 형성되는 산물의 입체화학을 조절하는 것이 불가능하다. 하지만, R2 및/또는 R3이 (S)-2-부탄올, 멘톨 또는 키랄 아민과 같은 키랄 보호기(도 4)이면 한 MP 거울상이성체의 형성이 유리할 수 있다.
실시예 6
트립토판 또는 인돌-3- 피루브산염에서 모나틴으로의 전환
2가지 효소, 아미노전이효소와 알돌라제를 이용하는 시험관내 방법은 트립토판과 피루브산염으로부터 모나틴을 생성했다. 제1 단계에서 알파-케토글루타르산염은 트란스아민화 반응에서 트립토판 유래의 아미노기를 수용하는 수용체로서 인돌-3-피루브산염과 글루탐산염을 생성한다. 알돌라제는 제2 반응을 촉매하여 Mg2+와 인산염의 존재하에 피루브산염을 인돌-3-피루브산염과 반응시켜 모나틴의 알파-케토 유도체(MP), 즉 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산을 생성한다. 제1 반응에서 형성된 글루탐산염으로부터 아미노 기의 전이는 목적 산물인 모나틴을 생산했다. 산물을 정제하고 특성 분석한 결과 형성된 이성체는 S,S-모나틴인 것으로 확인되었다. 이하에 대안적 기질, 효소 및 조건과 함께 이 공정에 수행된 개선안을 기술하였다.
효소
코마모나스 테스토스테로니 유래의 알돌라제인 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 피루브산염 분해효소(ProA 알돌라제, proA 유전자)(EC4.1.3.17)를 실시예 4에 기술한 바와 같이 클로닝하고, 발현시켜 정제하였다. B.서브틸리스, 대장균 및 S.멜리로티 유래의 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 글리옥실산염 분해효소(KHG 알돌라제)(EC 4.1.3.16)도 실시예 4에 기술된 바와 같이 클로닝, 발현, 정제하였다.
모나틴 생산을 위해 알돌라제와 함께 사용된 아미노전이효소로는 대장균 aspC 유전자에 의해 암호화된 L-아스파르트산염 아미노전이효소, 대장균 tyrB 유전자에 의해 암호화된 타이로신 아미노전이효소, S.멜리로티 TatA 효소, L.메이저 bsat 유전자에 의해 암호화된 광범위 기질 아미노전이효소, 돼지 심장 유래의 또는 글루탐산-옥살로아세트산 아미노전이효소(IIa형)가 있다. 비포유동물 단백질의 클로닝, 발현 및 정제는 실시예 1에 기술하였다. 돼지 심장 유래의 글루탐산-옥살로아세트산 아미노전이효소(IIa형)는 시그마(#G7005)에서 입수하였다.
ProA 알돌라제 및 L- 아스파르트산염 아미노전이효소를 이용한 방법
50mM 아세트산암모늄, pH8.0, 4mM MgCl2, 3mM 인산칼륨, 0.05mM 피리독살 인산염, 100mM 피루브산암모늄, 50mM 트립토판, 10mM 알파-케토글루타르산염, 160mg의 재조합체 C.테스토스테로니 ProA 알돌라제(미정제 세포 추출물, 약 30% 알돌라제), 233mg의 재조합체 대장균 L-아스파르트산염 아미노전이효소(미정제 세포 추출물, 약 40% 아미노전이효소)를 1 리터에 함유한 반응 혼합물을 이용하였다. 효소를 제외한 모든 성분은 함께 혼합하고 트립토판이 용해될 때까지 30℃에서 항온처리하였다. 그 다음, 효소를 첨가하고 반응 용액을 부드러운 진탕(100rpm)하에 3.5시간 동안 항온처리하였다. 효소 첨가 후 0.5시간 및 1시간이 경과했을 때 반응물에 일정량의 고체 트립토판(각각 50mmol)을 첨가하였다. 첨가한 트립토판은 모두 용해되지 않았지만 농도는 50mM 또는 그 이상으로 유지되었다. 3.5시간 후 고체 트립토판을 여과제거하였다. 이 반응 혼합물을 표준물인 일정량의 트립토판과 함께 LC/MS로 분석한 결과 용액 내 트립토판의 농도는 60.5mM이고 모나틴의 농도는 5.81mM(1.05g)임을 관찰하였다.
최종 산물은 다음과 같은 방법으로 정제하였다. 90%의 투명 용액을 바이오래드 AG50W-X8 수지 컬럼(225ml; 결합 용량 1.7meq/ml)에 적용하였다. 이 컬럼은 280nm에서의 흡광도가 분획을 통해 1차류의 <5%이 될 때까지 300ml 분획을 수집하면서 물로 세척하였다. 그 다음, 1M 아세트산암모늄 pH 8.4를 컬럼을 통해 용출시켜 300ml 분획 4개를 수집하였다. 모나틴을 함유한 분획은 총 4개였고, 미온의 수조가 구비된 회전증발기를 이용하여 105ml로 증발시켰다. 부피 감소시 침전물이 형성되었고, 이것을 증발 과정 동안 여과분리하였다.
LC/MS에 의한 컬럼 분획의 분석 결과, 트립토판과 모나틴의 99%가 컬럼에 결합되었음을 확인하였다. 증발 과정 동안 형성된 침전물은 >97% 트립토판과 <2% 모나틴을 함유하고 있었다. 상청액 중의 트립토판:산물의 비는 약 2:1 이었다.
상청액(7ml)은 미리 0.5L 1M NaOH, 0.2L 물, 1.0L의 1.0M 아세트산 암모늄 pH 8.4 및 0.5L 물로 세척하여 아세트산염 형태로 전환시켜둔 100ml Fast Flow DEAE 세파로스(Amersham Biosciences) 컬럼에 적용하였다. 상청액은 <2ml/min의 양으로 로딩하고, 280nm에서의 흡광도가 약 0이 될 때까지 3 내지 4ml/min의 물로 세척하였다. 모나틴은 100mM 아세트산암모늄 pH 8.4로 용출시켰고, 100ml 분획 4개를 수집하였다.
분획의 분석 결과, 유동 분획내 트립토판:모나틴의 비는 85:15였고, 용출물 분획내 비는 7:93이었다. 모나틴의 280nm에서의 흡광계수가 트립토판과 동일한 것으로 가정하면, 용출물 분획내 산물의 양은 0.146mmol 이었다. 총 1L 반응물로 환산하면 모나틴 약 2.4mmol(약 710mg)이 생성되는 것으로서, 68%의 회수율을 나타내었다.
DEAE 세파로스 컬럼으로부터 용출물 분획은 <20ml로 증발시켰다. 분석 규모의 모나틴 특성규명을 위하여 실시예 10에 기술한 바와 같은 크로마토그래피 조건을 사용하는 C8 정제용 역상 컬럼에 산물의 일정량을 적용하여 추가 정제하였다. m/z=293 이온의 검출에 기초하여 모나틴을 자동 분획 수집하기 위하여 워터스 Fractionlynx™ 소프트웨어를 사용하였다. 모나틴의 해당 양성자화된 분자 이온을 보유한 C8 컬럼 유래의 분획을 수집하고, 무수 증발시킨 뒤, 소량의 물에 용해시켰다. 이 분획을 산물의 특성 규명에 사용하였다.
그 결과 얻어지는 산물은 다음과 같은 방법으로 특성규명하였다.
UV /가시광선 분광학. 효소적으로 생성된 모나틴의 UV/가시광선 분광 측정은 Cary 100 Bio UV/가시광선 분광광도계를 사용하여 수행하였다. 물에 용해한 정제 산물은 280nm에서 최대 흡광도를 나타내고, 인돌 함유 화합물의 전형적인 특징인 288nm에서 쇼울더를 보였다.
LC /MS 분석. 시험관내 생화학적 반응에 의해 유도된 모나틴을 검출하기 위한 혼합물의 분석은 실시예 10에 기술한 바와 같이 수행하였다. 시험관내 효소적 합성 혼합물에 존재하는 모나틴의 전형적인 LC/MS 분석은 도 5에 예시하였다. 도 5의 하단 패널은 m/z=293에서 모나틴의 양성자화된 분자 이온에 대한 선택성 이온 크로마토그램을 도시한 것이다. 이와 같은 혼합물에서의 모나틴의 확인은 도 6에 도시한 질량 스펙트럼을 통해 확인하였다. LC/MS에 의한 정제 산물의 분석은 280nm에서의 흡광도와 293의 분자 이온을 가진 단일 피크를 나타냈다. 질량 스펙트럼은 도 6에 도시한 것과 동일하였다.
MS/MS 분석. 실시예 10에 기술한 바와 같은 LC/MS/MS 딸이온 실험 역시 모나틴에 대해서도 실시하였다. 모나틴의 딸이온 질량 스펙트럼은 도 7에 도시하였다. 표지된 모든 단편 이온들에 대해 도 7에 가상적으로 구조 지정하였다. 여기에는 m/z = 275(293-H2O), 257(293-(2xH2O)), 230(275-COOH), 212(257-COOH), 168(3-부타-1,3-디에닐-1H-인돌 카르보늄 이온), 158(1H-인돌-3-카르브알데하이드 카르보늄 이온), 144(3-에틸-1H-인돌 카르보늄 이온), 130(3-메틸렌-1H-인돌 카르보늄 이온) 및 118(인돌 카르보늄 이온)의 단편 이온을 포함한다. 이 중 대부분은 MP에서 수득된 것과 같았는데(실시예 4), 이것은 분자의 인돌 부분에서 유래된 것이라면 예상된 것이었다. 몇 가지는 MP에서 관찰된 것보다 1질량 단위 정도 더 높았는데, 이는 케톤 대신에 아미노 기의 존재 때문인 것으로 사료된다.
고해상능의 MS 분석. 도 8은 Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-star 혼성 사중극/비행시간 질량분석계를 이용하여 정제 모나틴에 대해 수득한 질량 스펙트럼을 도시한 것이다. 내부 질량 조정 표준물로서 트립토판을 사용하여 측정한 양성자화된 모나틴의 질량은 293.1144였다. C14H17N2O5 원소 조성에 기초하여 계산된 양성자화된 모나틴의 질량은 293.1137이었다. 이러한 2ppm 미만의 질량 측정 오차는 효소적으로 생성된 산물이 모나틴의 원소 조성이라는 결정적 증거를 제공하는 것이다.
NMR 분광학. NMR 실험은 Varian Inova 500 MHz 장치를 사용하여 수행하였다. 모나틴 시료(약 3mg)는 0.5ml D2O에 용해하였다. 먼저, 용매(D2O)를 4.78ppm으로서 내부 대조물로 사용하였다. 물의 피크는 크기 때문에 물 피크를 억제하면서 1H-NMR을 진행시켰다. 물 피크의 광폭성으로 인해, 이어서 모나틴의 C-2 양성자를 대조 피크로 사용하고 공지값인 7.192ppm으로 첨가하였다.
13C-NMR을 위해 1차적으로 수백회의 스캔을 실시한 결과, 시료가 할당된 시간 내에 적당한 13C 스펙트럼을 제공하기에는 지나치게 묽은 것으로 확인되었다. 따라서, 이종핵간 다중 양자 응집성(HMQC) 실험을 수행하였는데, 이것은 수소와 부착된 탄소의 상관관련성 및 탄소의 화학적 이동에 대한 정보를 제공해준다.
1H 및 HMQC에 대한 결과는 표 2와 3에 정리하였다. 공지의 값과 비교한 결과, NMR 데이터는 효소적으로 생산된 모나틴이 (S,S), (R,R) 또는 이의 혼합물임을 시사하였다.
키랄 LC /MS 분석. 시험관내 생산된 모나틴이 (R,R) 및 (S,S) 거울상이성체의 혼합물이 아닌 단일 이성체임을 확인하기 위하여, 실시예 10에 제시된 장치를 사용하여 키랄 LC/MS 분석을 수행하였다.
키랄 LC 분리는 실온에서 Chirobiotic T(Advanced Separations Technology) 키랄 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수행하였다. 공급자에 의해 제공된 프로토콜에 기초한 분리 및 검출은 트립토판의 R-(D) 및 S-(L) 이성체에 대하여 최적화된 것이다. LC 이동상은 A) 0.05%(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 물; B) 0.05%(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 메탄올로 구성된 혼합물을 사용하였다. 용출은 70% A와 30% B에서 등용매성이었다. 유속은 1.0ml/min로 하고 PDA 흡광도는 200nm 내지 400nm에서 모니터하였다. 모나틴과 트립토판의 키랄 LC/MS 분석 시 사용된 장치의 변수는 LC/MS 분석에 대해 실시예 10에서 기술한 것과 동일하게 사용하였다. 영역 m/z 150 내지 400에서 질량 스펙트럼을 수집하였다. 양성자화된 분자 이온에 대해 선발된 이온 크로마토그램(R-트립토판과 S-트립토판에 대해서는 [M+H]+=205, 모나틴에 대해서는 [M+H]+=293)으로, 혼합물 내 이 피분석물들의 존재를 직접 알 수 있었다.
키랄 크로마토그래피로 분리되고 MS로 모니터된 R- 및 S-트립토판과 모나틴에 대한 크로마토그램은 도 9에 도시하였다. 모나틴 크로마토그램에서 나타나는 단일 피크는 이 화합물이 단일 이성체이고 체류 시간이 S-트립토판과 거의 동일함을 시사하였다.
표 2
1H NMR 데이터
1Vleggaar et al.(J.C.S. PerKin Trans. 1:3095-8, 1992).
2Takeshi and Shusuke(JP2002060382, 2002-02-26).
표 3
13C NMR 데이터(HMQC 스펙트럼을 통해)
1Vleggaar et al.(J.C.S. PerKin Trans. 1:3095-8, 1992).
편광측정법 . 선광성은 Rudolph Autopol III 편광계로 측정하였다. 모나틴은 14.6mg/ml 수용액으로 제조하였다. S,S 모나틴(염 형태)의 예상 비선광성([α]D 20)은 1g/ml 수용액에서 -49.6이었다(Vleggaar et al.). 관찰된 [α]D 20은 효소적 생산 정제된 모나틴의 경우 -28.1이었고, 이것은 S,S 이성체임을 시사하는 것이었다.
개선안
시약 및 효소 농도를 비롯한 반응 조건을 최적화하고, 다음과 같은 시약 혼합물을 이용하여 10mg/ml의 수율을 수득하였다:
50mM 아세트산암모늄 pH 8.3, 2mM MgCl2, 200mM 피루브산염(나트륨 또는 암모늄염), 5mM 알파-케토글루타르산염(나트륨염), 0.05mM 피리독살 인산염, 효소 첨가 후 최종 부피를 1ml로 만들기 위한 탈기 수, 3mM 인산칼륨, 50㎍/ml의 재조합체 ProA 알돌라제(세포 추출물; 총 단백질 농도 167㎍/ml), 대장균 aspC 유전자에 의해 암호화된 L-아스파르트산염 아미노전이효소(세포 추출물; 총 단백질 농도 2500㎍/ml) 1000㎍/ml, 및 >60mM의 농도를 만들기 위한 고체 트립토판(포화됨; 반응 동안에는 일부는 미용해됨). 이 혼합물을 부드러운 교반이나 혼합하에 30℃에서 4시간 동안 항온처리하였다.
치환
알파-케토글루타르산염의 농도는 1mM로 감소시키고 9mM 아스파르트산염을 동량의 모나틴과 함께 보충할 수 있다. 제1 단계에서는 옥살로아세트산염과 같은 대안적 아미노산 수용체를 이용할 수 있다.
대장균 L-아스파르트산염 아미노전이효소 대신에 재조합체 L.메이저 광범위 기질 아미노전이효소를 이용한 결과 모나틴이 유사한 수율로 수득되었다. 하지만, 분자량이 292인 제2의 미확인 산물(주 산물의 3 내지 10%)이 LC-MS 분석시 검출되었다. 아미노전이효소로서 대장균 tyrB 암호화 효소, S.멜리로티 tat A 암호화 효소 또는 돼지 심장 유래의 글루탐산-옥살로아세트산 아미노전이효소(IIa형)를 첨가한 경우에는 모나틴 농도가 0.1 내지 0.5mg/ml로 수득되었다. 인돌-3-피루브산염으로부터 반응을 개시한 경우에는 마지막 단계에 글루탐산염 탈수소효소와 NADH를 이용하여 환원성 아민화를 수행할 수 있다(실시예 7과 같이).
모나틴을 효소적으로 생산하기 위하여 대장균 L-아스파르트산염 아미노전이효소와 함께 B.서브틸리스, 대장균 및 S.멜리로티 유래의 KHG 알돌라제도 사용하였다. 이 반응에는 다음과 같은 조건을 사용하였다: 50mM 아세트산암모늄 pH 8.3, 2mM MgCl2, 200mM 피루브산염, 0.05mM 피리독살 인산염, 효소 첨가 후 최종 부피를 0.5ml로 만들기 위한 탈기 수, 3mM 인산칼륨, 20㎍/ml의 재조합체 B.서브틸리스 KHG 알돌라제(정제된 것), 세포 추출물로부터 미정제된 대장균 L-아스파르트산염 아미노전이효소(AspC) 약 400㎍/ml, 및 12mM 인돌-3-피루브산염. 이 반응물을 진탕하에 30℃에서 30분 동안 항온처리하였다. B.서브틸리스 효소를 이용하여 생산한 모나틴의 양은 80ng/ml이었고, 증가량의 알돌라제에 의해 증가하였다. 인돌-3-피루브산염과 글루탐산염 대신에 포화량의 트립토판과 5mM 알파-케토글루타르산염으로 치환시킨 경우에는 모나틴의 생산량이 360ng/ml로 증가하였다. 50mM Tris pH 8.3에 용해시킨 각각 30㎍/ml의 상기 3가지 KHG 효소를 포화량의 트립토판과 함께 사용하여 반응을 반복하고 검출율을 향상시키기 위하여 1시간 동안 진행시켰다. 실시예 4에서와 같이 바실러스 효소가 최고의 활성을 나타내어, 모나틴 약 4000ng/ml을 생산하였다. 대장균 KHG는 3000ng/ml 모나틴을, S.멜리로티 효소는 2300ng/ml를 생산하였다.
실시예 7
MP와 모나틴과의 상호전환
모나틴을 형성하기 위한 MP의 아민화는 실시예 1과 6에서 동정된 바와 같은 아미노전이효소 또는 NADH 또는 NADPH와 같은 환원 보조인자를 요구하는 탈수소효소에 의해 촉매될 수 있다. 이 반응은 가역성이어서 양 방향으로 측정될 수 있다. 탈수소효소를 이용하는 경우 방향성은 암모늄 염의 농도에 의해 주로 조절될 수 있다.
탈수소효소 활성. 모나틴의 산화성 탈아민화는 NAD(P)+가 발색성이 더 큰 NAD(P)H로 전환될 때 340nm에서의 흡광도의 증가를 나타냄에 따라 모니터하였다. 모나틴은 실시예 6에 기술된 바와 같이 효소적으로 생산하고 정제하였다.
분석 혼합물은 50mM Tris-HCl, pH 8.0 내지 8.9, 0.33mM NAD+ 또는 NADP+, 2 내지 22 유닛의 글루탐산염 탈수소효소(시그마), 및 10 내지 15mM 기질을 0.2mL로 만든 전형적인 혼합물을 사용하였다. 분석은 Molecular Devices SpectraMax Plus platereader를 이용하여 UV 투과성 미량역가 평판에서 2반복으로 수행하였다. 효소, 완충액 및 NAD(P)+를 함유하는 혼합물을 기질을 함유하는 웰에 주입하고 잠시 혼합한 후 10초 간격으로 340nm에서의 흡광도의 증가를 모니터하였다. 이 반응액을 25℃에서 10분간 항온처리하였다. 음성 대조군은 기질 첨가없이 수행하였고, 글루탐산염은 양성 대조군으로 이용하였다. 소 간에서 수득한 III형 글루탐산염 탈수소효소(시그마 #G-7882)는 글루탐산에서 알파-케토글루타르산염으로의 전환 속도의 약 1/100의 전환속도로 모나틴의 모나틴 전구체로의 전환을 촉매했다.
아미노전이 활성. 모나틴 아미노전이효소 분석은 대장균 유래의 아스파르트산염 아미노전이효소(AspC), 대장균 유래의 타이로신 아미노전이효소(TyrB), L.메이저 유래의 광범위 기질 아미노전이효소(BSAT) 및 실시예 1에 기술된 2가지 상용화된 돼지 글루탐산염-옥살로아세트산염 아미노전이효소를 사용하여 수행했다. 옥살로아세트산염과 알파-케토글루타르산염을 모두 아미노 수용체로서 검사하였다. 분석에는 50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.05mM PLP, 5mM 아미노 수용체, 5mM 모나틴 및 25㎍의 아미노전이효소를 0.5ml로 혼합한 혼합물을 사용하였다. 분석은 30℃에서 30분 간 항온처리한 후 0.5ml 이소프로필 알코올을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 모나틴의 손실은 LC/MS(실시예 10)로 모니터하였다. 최대 활성은 아미노 수용체로서 옥살로아세트산염을 이용한 L.메이저 BSAT에 의해 나타났고, 그 다음으로 아미노 수용체로서 알파-케토글루타르산염을 이용한 동일 효소에 의해 나타났다. 옥살로아세트산염 이용 시의 상대적 활성은 다음과 같았다: BSAT > AspC > 돼지 IIa형 > 돼지 I형=TyrB. 알파-케토글루타르산염 이용 시의 상대적 활성은 다음과 같았다: BSAT > AspC > 돼지 I형 > 돼지 IIa형 > TyrB.
실시예 8
피루브산염 이외의 다른 C3 소스와 트립토판으로부터 모나틴의 제조
실시예 6에 전술한 바와 같이, 인돌-3-피루브산염 또는 트립토판은 C3 분자로서 피루브산염을 사용하면 모나틴으로 전환될 수 있다. 하지만, 몇몇 경우에는 피루브산염이 원료 물질로서 바람직하지 않을 수 있다. 예컨대, 피루브산염은 다른 C3 탄소원 보다 고가일 수 있고, 또는 배지에 첨가 시 발효에 악영향을 미칠 수 있다. 알라닌은 다수의 PLP 효소에 의해 아미노전이되어 피루브산염을 생성할 수 있다.
트립토파네이즈 유사 효소는 아미노전이효소와 같은 다른 PLP 효소 보다 더 빠른 속도로 베타-제거반응을 수행한다. 이 부류(4.1.99.-)의 효소는 L-세린, L-시스테인, 이탈이 양호한 기를 가진 세린과 시스테인의 유도체, 예컨대 O-메틸-L-세린, O-벤질-L-세린, S-메틸시스테인, S-벤질시스테인, S-알킬-L-시스테인, O-아실-L-세린, 3-클로로-L-알라닌으로부터 암모니아와 피루브산염을 생성할 수 있다.
EC 4.1.99.- 폴리펩타이드를 이용하여 모나틴을 생산하는 방법은 무라토우 등(Mouratou et al., J.Biol.Chem. 274:1320-5, 1999)의 방법에 따라 β-타이로시나제(TPL) 또는 트립토파네이즈를 변이시켜 개선시킬 수 있다. 무라토우 등은 β-타이로시나제를 이카르복실성 아미노산 β분해효소로 전환시키는 성질에 대해 설명하고 있는데, 이는 자연에서 발생하는 것으로 보고된 바 없는 것이다. 특이성의 변화는 발린(V) 283을 아르기닌(R)으로, 아르기닌(R) 100을 트레오닌(T)으로 치환시켜 수행하였다. 이러한 아미노산 변화는 분해효소가 가수분해성 탈아민화 반응에서 이카르복실성 아미노산(예, 아스파르트산염)을 수용하게 해준다. 따라서, 후속되는 알돌 축합 반응에는 피루브산염의 소스로서 아스파르트산염을 사용할 수 있다.
또한, 세포 또는 효소적 반응기에는 젖산염과 이 젖산염을 피루브산염으로 전환시키는 효소를 공급할 수 있다. 이 반응을 촉매할 수 있는 효소로는 젖산염 탈수소효소 및 젖산염 산화효소가 있다.
게놈 DNA 의 분리
트립토파네이즈 폴리펩타이드는 예컨대 무라토우 등(JBC 274:1320-5, 1999)에서 이미 보고된 바 있다. 트립토파네이즈 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 실시예 1에 기술한 바와 같은 PCR의 주형으로서 대장균 DH10B의 게놈 DNA를 사용하였다.
타이로신-페놀 분해효소의 유전자는 C.프룬디(ATCC 카달로그 번호 8090, ATCC 13316; NCTC9750)로부터 분리하고 영양고체배지(Difco 0001)와 영양액체배지(Difco 0003)에서 OD 2.0이 될 때까지 37℃에서 증식시켰다. 게놈 DNA는 Quiagen Genomic-tip™100/G 키트를 사용하여 정제하였다.
암호 서열의 PCR 증폭
실시예 1에 전술한 바와 같이 pET 30 Xa/LIC 벡터(Novagen, 위스콘신 매디슨 소재)의 상용성 오버행을 이용하여 프라이머를 디자인하였다.
대장균 tna(서열번호 41). pET30 Xa/LIC 클로닝용 N-말단 프라이머: (서열번호 43).
pET30 Xa/LIC 클로닝용 C-말단 프라이머: (서열번호 44).
C.프룬디 tpl(서열번호 42). pET30 Xa/LIC 클로닝용 N-말단 프라이머: (서열번호 45).
pET30 Xa/LIC 클로닝용 C-말단 프라이머: (서열번호 46).
모든 PCR 반응에는 열순환기(Eppendorf Mastercycler™ Gradient 5331 Thermal Cycler)를 사용하였다. 50㎕에 0.5㎍ 주형(게놈 DNA), 1.0μM의 각 프라이머, 0.4mM 각 dNTP, 3.5U Expand High Fidelity Polymerase(Roche), 1X Expand 완충액(Mg 함유), 및 5% DMSO(최종 농도)를 함유한 반응물을 사용하였다. 사용한 열순환기 PCR 프로그램은 다음과 같다: 96℃ 고온 개시(5분), 94℃-30초, 40 내지 60℃-1분 45초, 72℃-2분 15초; 30회 반복. 최종 중합 단계는 7분 동안 수행했고, 그 다음 시료를 4℃에 보관하였다.
클로닝
적당한 클론을 찾기 위하여 실시예 1에 상세히 설명했던 클로닝 및 양성 클론 동정 절차를 사용하였다.
유전자 발현 및 활성 분석
플라스미드 DNA(서열분석으로 확인함)는 발현 숙주 BL21(DE3)(Novagen)에 서브클로닝하였다. 배양물은 30mg/L 가나마이신을 함유하는 LB 배지에서 증식시키고, 플라스미드는 퀴아겐 미니프렙 키트를 사용하여 분리하였으며, 이어서 제한효소 분해로 동일성을 확인하였다.
50mg/L 가나마이신을 함유하는 LB 배지에서 37℃하에 증식시킨 BL21(DE3) 발현 숙주를 이용하여 유도 실험하였다. 배양물의 OD600이 약 0.6에 도달한 후 0.1mM IPTG를 이용하여 단백질 발현을 유도하였다. 세포는 30℃에서 4시간 동안 증식시킨 후 원심분리로 수거하였다. 세포를 그 다음 5㎕/ml 프로테아제 억제제 혼합물 세트 #III(Calbiochem) 및 1㎕/ml 벤조네이즈 뉴클레아제(Novagen)을 함유하는 5ml(습윤세포중량g당)의 Bugbuster™시약 (Novagen)을 사용하여 용균하고 실시예 1에 전술한 His-Bind 카트리지(실시예 1)를 사용하여 His-태그 재조합체 단백질을 정제하였다. 정제한 단백질은 PD-10(G25 Sephadex, Amersham Biosciences) 컬럼을 이용하여 탈염시키고 100mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 용출시켰다. 재조합체 융합 단백질의 추정 분자량에서 가용성 단백질의 농도를 검출하기 위하여 4 내지 15% 구배 겔의 SDS-PAGE를 통해 단백질을 분석하였다.
돌연변이유발
폴리펩타이드 부류 4.1.99.-(트립토파네이즈 및 β-타이로시나제)의 일부 성분들은 아스파르트산염이나 유사 아미노산을 사용하여 임의의 변형 없이 베타-분해효소 반응을 수행한다. 하지만, 이 부류의 일부 성분은 기질 이용성 및/또는 산물의 창조를 위해 돌연변이될 필요가 있을 수 있다. 더욱이, 몇몇 경우에는 전환을 수행할 수 있는 폴리펩타이드가 돌연변이유발을 통해 더욱 최적화될 수도 있다.
따라서, PLP-결합 폴리펩타이드의 3D 구조 분석에 근거하여 부위 지시성 돌연변이유발을 수행하였다. 폴리펩타이드의 기질 특이성을 변화시키는 2가지 예를 하기에 제시하였다.
트립토파네이즈의 돌연변이유발 예 1
이하에 제시한 돌연변이유발 프로토콜은 아미노산 서열에 2개의 점 돌연변이를 도입시켰다. 제1 점 돌연변이는 위치 103에 있는 아르기닌(R)을 트레오닌(T)으로 변화시키고 제2 점 돌연변이는 위치 299에 있는 발린(V)을 아르기닌(R)으로 변화시켰다(번호 시스템은 대장균 성숙 단백질의 것을 이용). 그 다음, ATG Laboratories(Eden Prairie, MN)에 의뢰하여 돌연변이유발 실험을 수행하였다. 이어서 유전자 단편의 PCR로 돌연변이를 도입시키고 그 단편의 재조립 역시 PCR로 수행하였다. 아르기닌(R) 103을 트레오닌(T)으로 전환시키는데 사용한 프라이머는 다음과 같다: (서열번호 47) 및 (서열번호 48).
발린(V)299을 아르기닌(R)으로 전환시키는데 사용한 프라이머: (서열번호 49) 및 (서열번호 50).
돌연변이체는 XbaI/HindIII 및 SphI으로 제한 분해하여 선별하고 서열분석으로 확인하였다.
타이로신 페놀 분해효소( β - 타이로시나제 )의 돌연변이유발 예 2
타이로신-페놀 분해효소 아미노산 서열에 2개의 점 돌연변이를 실시하였다. 이 돌연변이는 위치 100에 있는 아르기닌(R)을 트레오닌(T)으로 전환시키고 위치 283에 있는 발린(V)을 아르기닌(R)으로 전환시켰다(C.프룬디 성숙 단백질 서열에서).
R100T 전환용 프라이머는 다음과 같다: (서열번호 51) 및 (서열번호 52).
V283R 전환용 프라이머는 다음과 같다: (서열번호 53) 및 (서열번호 54).
전술한 방법을 사용하였고, KpnI/SacI 분해 및 BstXI 분해로 클론을 선별하였다. 서열은 디데옥시 사슬 종결 서열분석법으로 확인하였다. 야생형 효소에 상대적으로 재조합체 단백질은 전술한 바와 같이 생산하였다.
이 반응에는 50mM Tri-Cl pH 8.3, 2mM MgCl2, 200mM C3 탄소원, 5mM 알파-케토글루타르산염, 나트륨염, 0.05mM 피리독살 인산염, 효소 첨가 후 최종 부피가 0.5ml이 되게 하는 탈기 수, 3mM 인산칼륨 pH 7.5, 실시예 4에서 제조한 바와 같은 미정제 재조합체 C.테스토스테로니 ProA 알돌라제 25㎍, 실시예 1에서 제조한 바와 같은 미정제 L-아스파르트산염 아미노전이효소(AspC) 500㎍, 및 >60mM의 농도를 유지시키기 위한 고체 트립토판(포화됨; 반응 동안에는 일부는 미용해됨)로 구성된 혼합물을 사용하였다. 이 반응 혼합물을 혼합하면서 30℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 세린, 알라닌 및 아스파르트산염은 C3 소스로 공급하였다. 베타-제거반응 및 베타-분해효소 반응을 수행할 수 있는 제2 PLP 효소(정제물)(트립토파네이즈(TNA), 이중 돌연변이체 트립토파네이즈, β-타이로시나제(TPL))의 존재 및 부재하에 분석을 수행하였다. 그 결과는 표 4에 제시한 바와 같다:
표 4
대안적 C3 탄소원을 이용한 모나틴 제조
C3 탄소원 추가 PLP 효소 상대적 활성
무첨가 무첨가 0%
피루브산염 무첨가 100%
세린 무첨가 3%
세린 야생형 TNA(1U) 11㎍ 5.1%
세린 이중 돌연변이체 TNA 80㎍ 4.6%
알라닌 무첨가 32%
알라닌 야생형 TNA 11㎍ 41.7%
알라닌 돌연변이체 TNA 80㎍ 43.9%
아스파르트산염 야생형 TNA(10U) 110㎍ 7.7%
아스파르트산염 5U 야생형 TPL(미정제) 5.1%
아스파르트산염 돌연변이체 TNA 80㎍ 3.3%
C3 소스로서 알라닌과 세린을 이용하여 제조한 모나틴은 LC/MS/MS 딸 스캔 분석으로 확인하였고, 실시예 6에서 생산된 모나틴의 특성과 동일하였다. 알라닌는 시험된 최고의 대안적 소스로서 AspC 효소에 의해 아미노전이되었다. 생산된 모나틴의 양은 제2 활성으로 아미노전이를 수행할 수 있는 트립토파네이즈 첨가시 증가하였다. 탄소원으로 세린을 사용하여 제조한 모나틴의 양은 트립토파네이즈 효소를 아미노전이효소에 비해 1/5만 첨가하여도 트립토파네이즈 효소의 첨가로 거의 2배가 되었다. AspC는 약간의 베타 제거 활성만을 수행할 수 있다. 아스파르트산염을 이용한 결과는 아스파르트산염에 대한 트립토파네이즈 활성이 종래 β-타이로시나제에 대해 제안되었던 바와 동일한 부위 지시성 돌연변이에 의해서도 증가하지 않음을 시사한다. 돌연변이체 β-타이로시나제는 보다 증가된 모나틴 생산 활성을 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 9
모나틴의 화학적 합성
인돌-3-피루브산에 알라닌의 첨가는 모나틴을 생산하고 이 반응은 그리나드 또는 유기리튬 시약에 의해 합성적으로 수행될 수 있다.
예컨대, 카르복시기와 아미노기를 적당하게 차단시킨 3-클로로- 또는 3-브로모-알라닌에 무수 조건 하에 마그네슘을 첨가한다. 그 다음 인돌-3-피루브산염(적당하게 차단시킨)을 첨가하여 결합된 산물을 형성시킨 후, 보호기를 제거하면 모나틴이 형성된다. 특히 유용한 보호기로는 부착과 제거가 용이한 THP(테트라하이드로피라닐 에테르)가 있다.
실시예 10
모나틴 및 MP 의 검출
본 실시예는 모나틴 또는 이의 전구체인 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산의 존재를 검출하는데 사용된 방법을 설명한 것이다.
LC /MS 분석
모나틴의 알파-케토산 형태(모나틴 전구체, MP)와 시험관내 또는 생체내 생화학적 반응에 의해 유도된 모나틴의 혼합물 분석은 Waters 2690 액체 크로마토그래프와 Waters 996 Photo-Diode Array(PDA) 흡광도 모니터 및 Micromass Quatto Ultima 삼중 사중극 질량 분광광도계를 일렬로 구비하고 있는 Waters/Micromass 액체 크로마토그래피-직렬식 질량 분광학(LC/MS/MS) 장치를 사용하여 수행하였다. LC 분리는 2.1mmx150mm 크기의 Supelco Discovery C18 역상 크로마토그래피 컬럼이나 2.1mmx250mm 크기의 Xterra MS C8 역상 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 실온에서 수행하였다. LC 이동상은 A) 0.05%(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 물과 B) 0.05%(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 메탄올을 혼합하여 사용하였다.
구배 용출은 5% B에서 35% B로 선형(0 내지 9분), 35% B에서 90% B로 선형(9 내지 16분, 90% B로 등용매(16 내지 20분), 90% B에서 5% B로 선형으로 구성하였고, 각 용출 마다 10분의 재평형 기간을 두었다. 유속은 0.25ml/min으로 하고 PDA 흡광도는 200nm에서 400nm에서 모니터하였다. ESI-MS의 모든 변수는 최적화하였고, 당해 피분석물의 양성자화된 분자 이온([M+H]+)의 발생과 특징적인 단편 이온의 생성에 기초하여 선발하였다.
모나틴의 LC/MS 분석에는 다음과 같은 장치의 변수를 사용하였다: 캐필러리(capillary): 3.5kV; 콘(cone): 40V; Hex1: 20V; 틈(aperture): 0V; Hex 2: 0V; 소스 온도: 100℃; 탈용매화 온도: 350℃; 탈용매화 가스: 500L/h; 콘 가스: 50L/h; 낮은 질량 해상능(Q1): 15.0; 높은 질량 해상능(Q1): 15.0; 이온 에너지: 0.2; 입구: 50V; 충돌 에너지: 2; 출구: 50V; 낮은 질량 해상능(Q2):15; 높은 질량 해상능(Q2): 15; 이온 에너지(Q2): 3.5; 배율기: 650. 보고된 질량/전하 비(m/z) 및 분자 질량의 불확실성은 ±0.01%였다. 모나틴의 알파-케토산 형태(MP) 및 모나틴의 혼합물에서의 1차 검출은 m/z 150 내지 400 범위에서 질량 스펙트럼의 수집과 함께 LC/MS 모니터링을 통해 달성되었다. 양성자화된 분자 이온(MP의 경우에는 [M+H]+=292이고, 모나틴의 경우에는 [M+H]+=293임)들에 대해 선발된 이온 크로마토그램을 실시하면 혼합물에서 상기 피분석물을 직접 동정할 수 있다.
MS/MS 분석
LC/MS/MS 딸 이온 실험은 다음과 같이 모나틴에 대해 수행하였다. 딸이온 분석은 제1 질량 분석기(Q1)로부터 당해 모 이온(예, 모나틴의 경우 m/z=293)을 질량 분광광도계의 충돌 셀로 전달하는 것을 포함하고, 여기에서 아르곤이 도입되어 모이온을 단편(딸)이온으로 화학적으로 해리시킨다. 이러한 딸 이온은 그 다음 제2 질량 분석기(Q2)로 검출하고, 모이온의 구조 지정을 확인하는데 사용할 수 있다.
모나틴의 LC/MS/MS 분석에는 다음과 같은 장치의 변수를 사용하였다: 캐필러리(capillary): 3.5kV; 콘(cone): 40V; Hex1: 20V; 틈(aperture): 0V; Hex 2: 0V; 소스 온도: 100℃; 탈용매화 온도: 350℃; 탈용매화 가스: 500L/h; 콘 가스: 50L/h; 낮은 질량 해상능(Q1): 13.0; 높은 질량 해상능(Q1): 13.0; 이온 에너지: 0.2; 입구: -5V; 충돌 에너지: 14; 출구: 1V; 낮은 질량 해상능(Q2):15; 높은 질량 해상능(Q2): 15; 이온 에너지(Q2): 3.5; 배율기: 650.
모나틴의 고수율 분석
시험관내 또는 생체내 반응에서 얻어진 모나틴을 분석하기 위해, 혼합물의 고수율 분석(<5min/시료)을 전술한 장치와 LC/MS/MS에 기술한 것과 동일한 변수를 사용하여 수행하였다. LC 분리는 Waters Xterra MS C8(2.1mmx50mm) 크로마토그래피를 사용하여 실온에서 15% MeOH 수용액, 0.25% 아세트산을 0.3ml/min의 유속으로 등용매 용출시켜 수행하였다. 혼합물에 존재하는 모나틴의 검출은 선발 반응 모니터링(SRM)-직렬식 질량 분광학을 이용하여 수행하였다. 여기에는 모나틴을 검출하는 감도, 선택성 및 수율을 최대화하기 위해 특이적 충돌 유도식 모이온([M+H]+=293.1)의 딸이온(예, m/z=168.1에서의 단편 이온, 3-베타-1,3-디에닐-1H-인돌 카르보늄 이온으로 가지정됨)으로의 전이를 모니터하는 것을 포함한다. PDA 흡광도 데이터는 모나틴의 동질성을 추가 입증하기 위해 병행하여 수집하였다.
실시예 11
박테리아의 모나틴 생산
본 실시예는 대장균 세포에서 모나틴을 생산하는 방법을 설명한 것이다. 당업자라면 다른 박테리아 세포에서 모나틴을 생성하는 데에도 이와 유사한 방법을 사용할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 또한, 모나틴 합성 경로(도 2)에서 다른 유전자를 함유하는 벡터를 사용할 수도 있다.
대장균 세포에서 트립토판을 증가 생산하는데 사용된 바 있는 최소 배지인 Trp-1 + 글루코스 배지(Zeman et al., Folia Microbiol. 35:200-4, 1990)는 다음과 같이 제조하였다. 나노퓨어 수 700ml에 다음과 같은 시약을 첨가하였다: 2g (NH4)2SO4, 13.6g KH2PO4, 0.2g MgSO4·7H 2O, 0.01g CaCl2·2H2O 및 0.5mg FeSO4·7H2O. pH는 7.0으로 조정하고 부피를 850ml로 증가시킨 뒤 이 배지를 오토클레이브하였다. 50% 글루코스 용액은 별도로 준비하여 멸균여과하였다. 이 용액 40ml를 기본 배지(850ml)에 첨가하고 최종 부피를 1L로 조정하였다.
10g/L L-트립토판 용액은 0.1M 인산나트륨 pH 7으로 제조하고 멸균여과하였다. 이하에 명시한 배양물에 일반적으로 1/10 부피를 첨가하였다. 10% 피루브산 나트륨 용액도 제조하여 멸균여과하였다. 일반적으로 10ml 분액을 배양물 1L에 대해 사용하였다. 앰피실린(100mg/ml), 가나마이신(25mg/ml) 및 IPTG(840mM) 스톡도 제조하고, 멸균여과한 뒤 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다. Tween 20(폴리옥시에틸렌 20-소르비탄 모노라우레이트)은 최종 농도가 0.2%(v/v)인 양으로 이용하였다. 앰피실린은 비치사 농도, 일반적으로 1 내지 10㎍/ml의 최종 농도로 사용하였다.
대장균 BL21(DE3)::C.테스토스테로니 proA/pET30Xa/LIC(실시예 4에 기술된 것)의 새 평판을 50㎍/ml 가나마이신을 함유하는 LB 배지에 제조하였다. 가나마이신을 첨가한 LB 배지에 단일 콜로니의 접종물을 접종하고 30℃에서 하룻밤 배양하여 증식시켰다(5ml). 일반적으로, trp-1 + 글루코스 배지에서 유도 반응시키기 위하여 1:50 접종물을 사용하였다. 새로운 항생제는 50mg/L의 최종 농도로 첨가하였다. 유도에 앞서 진탕 플라스크를 37℃에서 증식시켰다.
OD600이 0.35 내지 0.8에 도달될 때까지 세포를 매시간 채취하였다. 그 다음, 0.1mM IPTG를 이용하여 세포를 유도하고 온도는 34℃로 감소시켰다. 유도하기 전에 시료(1ml)를 채취하여 5000xg에서 원심분리하였다. 상청액은 LC/MS 분석을 위해 -20℃에 동결시켜 두었다. 유도 후 4시간이 지나서 다시 시료 1ml을 취하여 원심분리하여 세포 펠릿과 배지를 분리하였다. 트립토판, 피루브산나트륨, 앰피실린 및 Tween은 전술한 바와 같이 첨가하였다.
세포는 유도 후 48시간 동안 증식시키고 다시 시료 1ml을 취하여 전술한 바와 같이 제조해 두었다. 48시간째, 트립토판과 피루브산염의 추가 분액을 첨가하였다. 배양물 전 부피를 증식(유도 후) 약 70시간 후 4℃에서 3500rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상청액은 버리고 배지와 세포는 -80℃에 동결시켰다. 배지 분획은 여과하고 LC/MS로 분석하였다. [M+H]+=293 피크의 높이와 면적은 실시예 10에 기술된 바와 같이 모니터하였다. 배지의 배경값은 감산하였다. 이 데이터는 [M+H]+=293 피크의 높이를 600nm에서의 배양물의 광학밀도로 나누어 플로팅함으로써 세포 증식에 대해 표준화하였다.
유도 시 보다 유도 4시간 후에 피루브산염, 앰피실린 및 Tween을 첨가한 경우 모나틴이 보다 많은 양으로 생산되었다. PLP, 추가 인산염 또는 추가 MgCl2와 같은 다른 첨가제는 모나틴의 생산을 증가시키지 못했다. 인돌-3-피루브산염 대신에 트립토판을 이용한 경우와, 접종 시 또는 유도 시 보다 유도 후 트립토판을 첨가한 경우에 보다 높은 역가의 모나틴이 수득되었다. 유도 전과 유도 4시간 후(기질 첨가 시기)에는 일반적으로 발효액이나 세포 추출물에 존재하는 모나틴의 농도가 검출하기가 불가능했다. 음성 대조군은 배양물에 트립토판과 피루브산염을 첨가하지 않고 pET30a 벡터만을 가진 세포를 이용하여 실험하였다. 모 MS 스캔 결과, (m+1)/z=293인 화합물은 보다 큰 분자에서 유도되지 않았고, 딸 스캔(실시예 10에서와 같이 실시)은 시험관내에서 제조된 모나틴과 유사함을 확인하였다.
Tween의 효과는 Tween-20의 최종 농도를 0, 0.2%(v/v) 및 0.6%로 하여 조사하였다. 진탕 플라스크에 의해 생산되는 모나틴의 최대량은 0.2% Tween에서 나타났다. 앰피실린의 농도는 0 내지 10㎍/ml로 다양하게 사용하였다. 세포 배양액 내의 모나틴의 양은 0 내지 1㎍/ml 사이에서 급격히(2.5X) 증가하였고, 앰피실린 농도가 1㎍/ml에서 10㎍/ml로 증가시킨 경우에는 1.3X로 증가하였다.
일반적인 결과를 보여주는 시간 경과에 따른 실험 결과를 도 10에 도시하였다. 세포 배양액에 분리된 모나틴의 양은 세포 증식에 맞추어 표준화시키더라도 증가하였다. 트립토판의 몰흡광계수를 사용하면 배양액내 모나틴의 양이 10㎍/ml 미만인 것으로 추정되었다. proA 삽입체가 없는 벡터를 함유하는 세포를 이용하여 동일 실험을 반복하였다. 수치의 대부분이 음성이어서, m/z=293에서의 피크 높이는 이 배양물에서 배지 단독의 경우 보다 더 낮게 나타났다(도 10). 트립토판과 피루브산염을 첨가하지 않은 경우에도 그 수치는 일정하게 더 낮았는데, 이로써 모나틴 생산이 알돌라제 효소에 의해 촉매되는 효소 반응의 결과임을 알 수 있었다.
모나틴의 박테리아 세포에서의 생체내 생산은 800ml 진탕 플라스크 실험과 발효기에서 반복하였다. 모나틴 250ml 샘플(무세포 배양물)은 음이온 교환 크로마토그래피 및 정제용 역상 액체 크로마토그래피로 정제하였다. 이 샘플을 증발시키고 고해상능 질량 분석(실시예 6 참조)으로 처리하였다. 고해상능 MS 결과 생산되는 대사물이 모나틴임을 알 수 있었다.
시험관내 분석은 아미노전이효소가 알돌라제 보다 다량으로 존재할 필요가 있음을 시사하는 바 모나틴의 생산량을 증가시키는 알돌라제 유전자와 함께 대장균 유래의 아스파르트산염 아미노전이효소를 과잉발현시켰다. aspC/pET30 Xa/LIC을 보유한 오페론에 C.테스토스테로니 proA를 도입하기 위하여 다음과 같은 프라이머를 디자인하였다: 5' 프라이머: (서열번호 67) 및 3' 프라이머: (서열번호 68). 5' 프라이머에는 클로닝을 위해 BamHI 부위를 포함시키고, 3' 프라이머에는 SalI 부위를 포함시켰다. PCR은 실시예 4에 기술한 바와 같이 수행하고 겔 정제하였다. aspC/pET30 Xa/LIC 작제물은 PCR 산물과 마찬가지로 BamHI 및 SalI으로 분해시켰다. 분해물은 퀴아겐 스핀 컬럼으로 정제하였다. proA PCR 산물은 Roche Rapid DNA Ligation 키트를 제조자의 지시에 따라 사용함으로써 벡터에 결찰시켰다. 그 다음, 실시예 1에 기술한 바와 같이 Novablues Sinles(Novagen)를 사용하여 화학적 변형을 수행하였다. 콜로니는 50mg/L 가나마이신을 함유하는 LB 배지에서 증식시키고 플라스미드 DNA는 퀴아겐 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 정제하였다. 제한 효소 분석으로 클론을 선별하고 Seqwright(Houston, TX)로 서열을 확인하였다. 작제물을 BLR(DE3), BLR(DE3)pLysS, BL21(DE3) 및 BL21(DE3)pLysS(Novagen)에 서브클로닝하였다. proA/pET30Xa/LIC 작제물 또한 BL21(DE3)pLysS에 형질전환시켰다.
전술한 표준 조건하에서의 BLR(DE3) 진탕 플라스크 시료는 초기에 비교했을 때에는 제2 유전자(aspC)의 첨가가 모나틴 생산량을 7배 증가시키는 것으로 관찰되었다. 증식 촉진을 위해 BL21(DE3) 유도된 숙주 균주를 사용하였다. proA 클론과 두 유전자 오페론 클론은 전술한 바와 같이 Trp-1 배지에서 유도하였고 pLysS 숙주에는 배지에 클로람페니콜(34mg/L)도 첨가하였다. 진탕 플라스크 실험은 0.2% Tween-20 및 1mg/L 앰피실린의 첨가 및 무첨가 하에 수행하였다. 배양액내 모나틴의 양은 시험관내 생산된 정제 모나틴을 표준물로서 사용하여 계산하였다. SRM 분석은 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하였다. 세포는 증식 0시간, 4시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간째 샘플링하였다.
배양액에 생산된 최대량에 대한 결과는 표 5에 나타내었다. 대부분의 경우에 두 유전자 작제물은 proA 작제물 단독 보다 모나틴을 다량으로 생성하였다. 보다 누설형인 세포 엔벨로프를 보유할 수 있는 pLysS 균주는 이 균주의 증식 속도는 일반적으로 보다 느리더라도 모나틴의 분비량은 더 많았다. Tween 및 앰피실린의 첨가는 유리한 영향을 미쳤다.
표 5
대장균 박테리아에 의해 생산된 모나틴의 양
작제물 숙주 Tween+Amp 모나틴 ㎍/ml 시간(hr)
proA BL21(DE3) - 0.41 72
proA BL21(DE3) + 1.58 48
proA BL21(DE3)pLysS - 1.04 48
proA BL21(DE3)pLysS + 1.60 48
aspC:proA BL21(DE3) - 0.09 48
aspC:proA BL21(DE3) + 0.58 48
aspC:proA BL21(DE3)pLysS - 1.39 48
aspC:proA BL21(DE3)pLysS + 6.68 48
실시예 12
효모내에서의 모나틴 생산
본 실시예는 진핵세포에서 모나틴을 생산하는데 사용되는 방법을 설명하는 것이다. 당업자라면 당해의 모든 세포에서 이와 유사한 방법을 사용하여 모나틴을 생산할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 또한, 본 실시예에 기술한 유전자 외에 다른 유전자도 사용할 수 있고(도 2에 도시한 것), 또는 본 실시예에 기술한 유전자 대신에 다른 유전자를 사용할 수도 있다.
대장균 aspC 및 C.테스토스테로니 proA 유전자를 사카로마이세스 세레비지에에 클로닝하고 발현시키기 위하여 pESC Yeast Epitope Tagging Vector System(Stratagene, La Jolla, CA)을 사용하였다. pESC 벡터는 대향 가닥에 상이한 다중 클로닝 부위와 함께 GAL1 및 GAL10 프로모터를 둘다 포함하여 동시에 두 유전자를 발현시킬 수 있다. pESC-His 벡터는 또한 숙주(YPH500)의 히스티딘 영양요구성을 보충하기 위하여 His3 유전자를 함유한다. GAL1 및 GAL10 프로모터는 글루코스에 의해 억제되고 갈락토스에 의해 유도된다; 효모에서 최적으로 발현시키는 데에는 코작(Kozak) 서열을 이용한다. pESC 플라스미드는 셔틀 벡터로서, 최초 작제물은 대장균에서 만들 수 있다(선발을 위한 bla 유전자 포함). 하지만, 다중 클로닝 부위에서 박테리아 리보솜 결합 부위를 제거하는 것이 좋다.
pESC-His에 클로닝하기 위하여 다음과 같은 프라이머를 디자인하였다(제한 부위는 밑줄로 표시하고 코작 서열은 진한 글씨체이다): aspC(BamHI/SaclI), GAL1: (서열번호 69) 및 (서열번호 70). proA(EcoRI/NotI), GAL10: (서열번호 71) 및 (서열번호 72).
두 성숙 단백질의 제2 코돈은 코작 서열의 도입으로 인해 방향족 아미노산에서 발린으로 변화시켰다. 당해 유전자는 주형으로 실시예 1 및 4에 기술한 클론들로부터 pET30Xa/LIC 미니프렙 DNA를 사용하여 증폭시켰다. PCR은 50㎕ 반응액에 다음과 같은 프로토콜과 열순환기(Eppendorf Master cycler gradient thermocycler)를 사용하여 수행하였다: 1.0㎕ 주형, 1.0μM 각 프라이머, 0.4mM 각 dNTP, 3.5U의 Expand High Fidelity Polymerase(Roche, 인디아나주 인디아나폴리스), 및 1X Expand™ 완충액(Mg 첨가). 사용된 열순환기 프로그램은 다음과 같이 구성하였다: 고온 개시 94℃, 5분, 그 다음 94℃ 30초, 50℃ 1분, 72℃ 2분으로 이루어진 사이클 29회 반복. 29회 반복 후에는 시료를 72℃에서 10분 동안 유지한 다음 4℃에 보관하였다. 이 PCR 산물은 1% TAE-아가로스 겔 분리로 정제한 뒤, QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아겐, 캘리포니아 발렌시아 소재)를 사용하여 회수하였다.
pESC-His 벡터 DNA(2.7㎍)는 BamHI/SalI으로 분해하고 전술한 바와 같이 겔 정제하였다. aspC PCR 산물은 BamHI/SalI으로 분해하고 QIAquick PCR Purification Column으로 정제하였다. 결찰은 Roche Rapid DNA Ligation Kit를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 탈염된 결찰물은 펄스 콘트롤러 플러스를 구비한 Biorad Gene Pulser II를 제조자의 지시에 따라 사용하여 0.2cm Biorad 일회용 큐벳에서 40㎕ Electromax DH10B 컴피턴트 세포(Invitrogen)에 전기침투시켰다. SOC 배지 1ml에 회수하여 1시간 경과한 후, 형질전환체는 100㎍/ml 앰피실린을 함유하는 LB 배지에 평판배양하였다. 클론들의 플라스미드 DNA 제조물은 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용하여 수행하였다. 플라스미드 DNA는 제한 분해로 선별하고 이 벡터용으로 디자인된 프라이머를 사용하여 확인하기 위해 서열분석했다(Seqwright).
aspC/pESC-His 클론은 proA PCR 산물과 마찬가지로 EcoRI 및 NotI으로 분해하였다. DNA는 전술한 바와 같이 정제하고 전술한 바와 같이 결찰시켰다. 두 유전자 작제물을 가지고 DH10B 세포를 형질전환시키고 제한분해 및 DNA 서열분석으로 선별하였다.
이 작제물을 가지고 S.c.EasyComp™ Transformation Kit(Invitrogen)를 이용하여 S.세리비지에 균주 YPH500을 형질전환시켰다. 형질전환 반응액은 2% 글루코스를 함유하는 SC-His 최소 배지(Invitrogen pYES2 manual)에 평판배양하였다. 전술한 PCR 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 통해 proA 및 aspC 유전자가 존재하는지 각 효모 콜로니를 선별하였다. 펠릿화된 세포(2㎕)는 1㎕ 자이몰라제를 함유하는 Y-Lysis Buffer(Zymo Research) 20㎕에 현탁시키고 37℃에서 10분 동안 가열하였다. 이 현탁액 4㎕를 전술한 PCR 반응 혼합물과 프로그램을 이용하는 50㎕ PCR 반응에 사용하였다.
배양액 5ml를 SC-His + 글루코스 상에서 30℃, 225rpm 하에 하룻밤 동안 증식시켰다. 갈락토스로 유도하기에 앞서 지연 기간을 최소화하기 위하여 세포를 라피노스 상에서 증식할 수 있도록 서서히 조정해 주었다. 약 12시간 동안 증식시킨 후, 600nm에서 흡광도를 측정하고, 적당량의 세포를 침전시킨 뒤 새 SC-His 배지에 OD 0.4가 되게 재현탁시켰다. 이어서 다음과 같은 탄소원을 사용하였다: 1% 라피노스 + 1% 글루코스, 0.5% 글루코스 + 1.5% 라피노스, 2% 라피노스 및 마지막으로 1% 라피노스 + 2% 갈락토스(유도용).
유도 배지에서 약 16시간 동안 증식시킨 후, 50ml 배양물을 25ml 배양물로 분할하고 한쪽 배양물에만 다음과 같은 성분을 첨가하였다: 1g/L L-트립토판, 5mM 인산나트륨 pH 7.1, 1g/L 피루브산나트륨, 1mM MgCl2(최종 농도). 비유도 배지 유래의 배양액 및 세포 펠릿 시료와, 모나틴 경로의 기질에 첨가하기 전에 16시간 배양한 배양물 유래의 배양액 및 세포 펠릿 시료는 음성 대조군으로 보관하였다. 또한, 기능성 aspC 유전자( 및 절두형 proA 유전자) 만을 함유하는 작제물은 다른 음성 대조군으로 사용하였다. 세포는 유도 후 총 69시간 동안 증식시켰다. 때로, 효모 세포는 보다 낮은 OD로 유도되었고, 트립토판과 피루브산염을 첨가하기 전 4시간 동안만 증식되었다. 하지만, 이러한 모나틴 기질은 증식을 억제하는 것으로 보이며 보다 높은 OD 량의 첨가가 보다 효과적이었다.
배양물에서 얻은 세포 펠릿은 이전 실시예에 기술된 바와 같이 프로테아제 억제제와 벤조나제 뉴클레아제의 첨가하에 5ml의 YeastBuster™ + 50㎕ THP(Novagen)/세포g(습윤중량)로 제조자의 프로토콜에 따라 용균시켰다. 배양액 및 배양 추출물은 여과하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 SRM으로 분석하였다. 이 방법을 사용한 결과, 배양액 시료에서는 모나틴이 전혀 검출되지 않았는데, 이는 세포가 이러한 조건하에서는 모나틴을 분리할 수 없음을 알 수 있었다. 이러한 조건 하에서는 양성자 기동력이 불충분하거나 일반적인 아미노산 전달인자가 트립토판으로 포화되어 있을 수 있다. 단백질 발현은 SDS-PAGE를 통해 변화를 검출할 수 있는 수준은 아니었다.
트립토판과 피루브산염을 배지에 첨가한 경우에는, 두 기능성 유전자를 가진 배양물의 세포 추출물에서 모나틴을 일시적으로 검출할 수 있었다(약 60㎍/ml). 하지만, 모든 음성 대조용 세포 추출물에서는 모나틴이 검출되지 않았다. 모나틴의 시험관내 분석은 실시예 6에 기술된 최적 분석법을 이용하여 4.4mg/ml의 총 단백질(일반적으로 대장균 세포 추출물에서 사용되는 양의 약 2배)을 가지고 2반복으로 수행하였다. 세포 추출물에서 제한성인 효소를 조사하기 위하여 32㎍/ml C.테스토스테로니 ProA 알돌라제 또는 400㎍/ml AspC 아미노전이효소 중 어느 하나를 첨가하여 다른 분석도 수행하였다. 음성 대조군은 효소를 첨가하지 않거나 AspC 아미노전이효소만을 첨가하여 수행하였다(알돌 축합은 효소 없이 어느 정도 일어날 수 있다). 양성 대조군은 부분 정제된 효소(30 내지 40%)를 가지고 알돌라제 16㎍/ml 및 아미노전이효소 400㎍/ml를 사용하여 수행하였다.
시험관내 결과는 SRM으로 분석하였다. 세포 추출물 분석 결과, 트립토판은 유도 후 배지에 첨가했을 때 세포로 유효하게 전달되어 트립토판이 추가되지 않은 세포에 비해 2차수 더 높은 트립토판 수준을 나타냄을 확인하였다. 시험관내 모나틴 분석 결과는 표 6에 나타내었다(수치는 ng/ml를 나타낸다).
표 6
효모 세포 추출물에 의한 모나틴 생산
aspC 작제물 +알돌라제 +AspC 두 유전자 작제물 +알돌라제 +AspC
억제(글루코스 배지) 0 888.3 173.5 0 465.2 829
24시간 유도 0 2832.8 642.4 0 1375.6 9146.6
69시간 유도 0 4937.3 340.3 71.9 1652.8 23693.5
69hr + 치환 0 556.9 659.1 21.9 755.6 16688.2
+ 대조군(정제 효소) 21853 21853
- 대조군(효소 무첨가) 0 254.3 0 254.3
증식 배지에 기질의 첨가 여부에 관계없이 전장의 두 유전자 작제물 세포 추출물에서는 양성 결과가 수득되었다. 이러한 결과는 양성 대조군과 비교해보면 이 효소가 효모에 존재하는 총 단백질의 약 1%의 수준으로 발현된다는 것을 알 수 있었다. aspC 작제물(절두형 proA를 보유)의 세포 추출물을 알돌라제 첨가하에 분석했을 때 생산되는 모나틴의 양은 세포 추출물만을 분석할 때 보다 유의적으로 더 많았는데, 이것은 재조합체 AspC 아미노전이효소가 효모 총 단백질의 약 1 내지 2%를 차지한다는 것을 시사한다. 미유도 배양물의 세포 추출물은 세포내 본래의 아미노전이효소의 존재로 인하여 알돌라제 첨가하에 분석하는 경우 소량의 활성을 나타냈다. AspC 아미노전이효소 첨가 하에 분석하는 경우에는 미유도 세포 유래의 추출물의 활성은 AspC(약 200ng/ml)를 첨가한 음성 대조군에 의해 생산되는 모나틴의 양까지 증가하였다. 이에 반해, 두 유전자 작제물 세포 추출물의 분석 시 관찰되는 활성은 알돌라제가 첨가되는 경우 보다 아미노전이효소가 보충되는 경우에 더욱 증가하였다. 두 유전자는 동일 수준으로 발현되어야 할 것이므로, 실시예 6에 제시된 결과와 마찬가지로 아미노전이효소의 농도가 알돌라제의 농도 보다 높을 때 모나틴의 생산량이 최대가 될 수 있음이 시사되어진다.
실시예 13
연계 반응을 이용한 효소 공정의 개선
이론적으로, 기질이나 중간체의 부반응이나 분해가 일어나지 않는다면 도 1에 예시한 효소 반응을 통해 형성되는 산물의 최대량은 각 반응의 평형 상수, 및 트립토판과 피루브산염의 농도에 정비례하게 된다. 하지만, 트립토판은 가용성이 큰 기질이 아니고, 피루브산염의 농도가 200mM 보다 많으면 수율에 악영향을 미치는 것으로 관찰된다(실시예 6).
이상적인 것은, 모나틴의 농도가 기질에 비례하여 최대화되어 분리 비용을 줄일 수 있는 방법이다. 반응 혼합물로부터 모나틴을 제거하기 위해 물리적 분리를 수행하여 역반응의 발생 가능성을 차단할 수 있다. 그 다음, 원료와 촉매를 다시 생성시킬 수 있다. 모나틴은 그 크기, 전하 및 소수성 측면에서 몇몇 시약 및 중간체와 유사하기 때문에 모나틴에 대해 높은 친화성(예, 친화성 크로마토그래피 기술)이 없는 한 물리적 분리는 곤란할 것이다. 하지만, 모나틴 반응은 반응계의 평형을 모나틴 생성 방향으로 전환시키는 다른 반응들과 연계될 수 있다. 다음은, 트립토판 또는 인돌-3-피루브산염으로부터 산출되는 모나틴의 수율을 향상시키는 방법을 예시한 것이다.
옥살로아세트산염 탈탄산효소(EC 4.1.1.3)를 이용한 연계 반응
도 11은 이 반응을 예시한 것이다. 이 반응에서는 인돌-3-피루브산염 생산 방향으로 반응을 유도하기 위하여 트립토판 산화효소 및 카탈라제를 이용한다. 카탈라제는 과산화수소가 역반응이나 효소 또는 중간체 손상에 이용될 수 없도록 과량을 사용한다. 카탈라제 반응 동안에서 산소가 재생된다. 또는, 인돌-3-피루브산염을 기질로서 사용할 수도 있다.
아스파트르산염은 MP의 아민화 시 아미노 공급체로서 사용되며, 아스파르트산염 아미노전이효소가 사용된다. 이상적인 것은, MP에서 모나틴으로의 반응에 비해 트립토판/인돌-3-피루브산염 반응에 대한 특이성이 낮은 아미노전이효소를 사용하여 아스파르트산염이 인돌-3-피루브산염을 재아민화하는데 사용되지 않는 것이다. 옥살로아세트산염을 피루브산염과 이산화탄소로 전환시키기 위하여 옥살로아세트산염 탈탄산효소(슈도모나스 종 유래)를 첨가할 수 있다. CO2는 휘발성이므로, 효소와 반응할 가능성이 적어서 역반응을 감소시키거나 심지어 차단한다. 이 단계에서 생산된 피루브산염은 알돌 축합 반응에 유용하게 사용될 수 있다. 다른 탈탄산 효소도 사용할 수 있고, 상동체는 다음과 같은 미생물에 존재하는 것으로 알려져 있다: 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스, 아퀴펙스애오리커스, 아케오글로버스 풀지두스, 아조토박터 비네란디, 박테로이즈 프라질리스, 몇몇 보르데텔라 종, 캄필로박터 제주니, 클로로븀 테피둠, 클로로플렉서스 아우란티아커스, 엔테로코커스 페컬리스, 푸소박테리움 뉴클레아텀, 크렙시엘라 뉴모니애, 레지오넬라 뉴모필라, 마그네토코커스 MC-1, 만하이미아 헤모리티카, 메틸로바실러스 플라젤라투스 KT, 파스퇴렐라 멀토시다 Pm70, 페트로토가 미오테르마, 포피로모나스 진지발리스, 몇몇 슈도모나스 종, 몇몇 파이로코커스 종, 로도코커스, 몇몇 살모넬라 종, 몇몇 스트렙토코커스 종, 써모크로마티움 테피둠, 써모토가 마리티마, 트레포네마 팔리둠 및 몇몇 비브리오 종.
트립토판 아미노전이효소의 분석은 대장균의 아스파르트산염 아미노전이효소(AspC), 대장균의 타이로신 아미노전이효소(TyrB), L.메이저 유래의 광범위 기질 아미노전이효소(BSAT) 및 실시예 1에 기술한 바와 같은 2가지 상용화된 돼지 글루탐산염-옥살로아세트산염 아미노전이효소를 사용하여 수행하였다. 아미노 수용체로서 옥살로아세트산염 및 알파-케토글루타르산염을 시험하였다. 모나틴 사용시의 활성(실시예 7) : 트립토판 사용시의 활성의 비를 비교하여 모나틴 아미노전이효소 반응에 가장 높은 특이성을 가진 효소를 결정하였다. 그 결과, 모나틴 반응 : 트립토판 반응에 가장 높은 특이성을 가진 효소는 돼지 II-A형 글루탐산염-옥살로아세트산염 아미노전이효소 GOAT(시그마 G7005)인 것을 알 수 있었다. 이 특이성은 사용된 아미노 수용체의 종류와는 무관하였다. 따라서, 이 효소를 옥살로아세트산염 탈탄산효소와의 연계 반응에 사용하였다.
인돌-3-피루브산염으로부터 시작하는 일반적인 반응에는 50mM Tris-Cl pH 7.3, 6mM 인돌-3-피루브산염, 6mM 피루브산 나트륨, 6mM 아스파르트산염, 0.05mM PLP, 3mM 인산칼륨, 3mM MgCl2, 25㎍/ml 아미노전이효소, 50㎍/ml C.테스토스테로니 ProA 알돌라제 및 3 유닛/ml 탈탄산효소(시그마 O4878)를 사용하였다. 이 반응은 26℃에서 1시간 동안 진행시켰다. 몇몇 경우에는 상기 탈탄산효소를 제외시키거나 아스파르트산염 대신에 알파-케토글루타르산염을 사용하였다(음성 대조군으로서). 전술한 아미노전이효소들을 GOAT 대신 사용하여 종래의 특이성 실험을 확인하였다. 시료는 여과하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 LC/MS로 분석하였다. 그 결과, GOAT 효소가 단백질 1mg 당 최대량의 모나틴을 생산하고 부산물로서 트립토판이 최소량이 생산됨을 확인하였다. 또한, 탈탄산효소를 첨가하였을 때 2 내지 3배 유리하였다. 대장균 AspC 효소 역시 다른 아미노전이효소에 비해서 다량의 모나틴을 생산하였다.
모나틴 생산은 1) 인돌-피루브산염, 피루브산염 및 아스파르트산염을 2mM씩 주기적으로 첨가하고(30분 내지 1시간 마다), 2) 반응을 혐기 환경이나 탈기된 완충액 중에서 수행하고, 3) 반응을 하룻밤 동안 진행시키고, 4) 여러번 동결-해동하지 않은 갓 제조한 탈탄산효소를 사용함으로써 증가되었다. 탈탄산효소는 피루브산염의 농도가 12mM 보다 많은 경우에 억제되었다. 인돌-3-피루브산염의 농도가 4mM 보다 높은 경우에는 인돌-3-피루브산염과의 부반응이 촉진되었다. 이 반응에 사용되는 인돌-3-피루브산염의 양은 알돌라제의 양을 증가시킨다면 또한 증가시킬 수 있다. 다량의 인산염(50mM)과 아스파르트산염(50mM)은 이 탈탄산효소에 대해 억제 작용을 하는 것으로 관찰되었다. 탈탄산효소의 첨가량은 1시간 반응 내에 모나틴 생산의 감소 없이 0.5U/ml로 감소시킬 수 있었다. 온도를 26℃에서 30℃로, 30℃에서 37℃로 증가시키는 경우에도 모나틴의 생산량이 증가하였다. 하지만, 37℃에서는 인돌-3-피루브산염의 부반응도 촉진되었다. pH 7에서 7.3으로 증가시켜도 모나틴 생산량이 증가하였고, pH 7.3 내지 8.3 사이에서는 비교적 안정하였다.
트립토판으로부터 개시되는 일반적인 반응에는 50mM Tris-Cl pH 7.3, 20mM 트립토판, 6mM 아스파르트산염, 6mM 피루브산 나트륨, 0.05mM PLP, 3mM 인산칼륨, 3mM MgCl2, 25㎍/ml 아미노전이효소, 50㎍/ml C.테스토스테로니 ProA 알돌라제, 4 유닛/ml 탈탄산효소, 5 내지 200mU/ml L-아미노산 산화효소(시그마 A-2805), 168U/ml 카탈라제(시그마 C-3515) 및 0.008mg FAD를 사용하였다. 이 반응은 30℃에서 30분 동안 진행시켰다. 탈탄산효소의 첨가 시 반응이 향상되었다. 50mU/ml 산화효소가 사용되었을 때 최대량의 모나틴이 생산되었다. 인돌-3-피루브산염이 기질로서 사용되었을 때에도 유사한 개선이 관찰되었다. 또한, 1) 트립토판 농도가 낮고(즉, 아미노전이효소의 Km 이하로서 활성 부위에 있는 MP와 경쟁할 수 없는 정도), 2) 산화효소 : 알돌라제와 아미노전이효소의 비가 인돌-3-피루브산염이 축적할 수 없을 정도의 수준으로 유지될 때 모나틴의 생산량이 증가하였다.
인돌-3-피루브산염 또는 트립토판으로부터의 개시 여부에 관계없이 항온처리 시간이 1 내지 2시간인 분석에서 생산되는 모나틴의 양은 효소 비가 동일하게 유지되면서 모든 효소의 양이 2 내지 4배가 사용될 때 증가하였다. 어떤 기질이 사용되든지 간에 약 1mg/ml 농도의 모나틴이 수득되었다. 인돌-피루브산염으로부터 개시되는 경우 생산되는 트립토판의 양은 일반적으로 산물 양의 20% 미만으로서, 연계 반응의 유용성을 보여주었다. 또 다른 최적화와 중간체 및 부반응 농도의 조절을 통해 생산성과 수율은 크게 향상시킬 수 있다.
리신 엡실론 아미노전이효소(EC 2.6.1.36)를 이용한 연계 반응
리신 엡실론 아미노전이효소(L-리신 6-아미노전이효소)는 몇몇 유기체, 예컨대 로도코커스, 마이코박테리움, 스트렙토마이세스, 노카디아, 플라보박테리움, 칸디다 유틸리스 및 스트렙토마이세스 등에서 관찰된다. 제1 단계로서 일부 베타-락탐 항생제 생산에 사용되는 유기체가 유용하다(Rius and Demain, J.Microbiol.Biotech., 7:95-100, 1997). 이 효소는 아미노 수용체로서 알파-케토글루타르산염을 이용하여 리신의 C6를 PLP 매개 아미노전이화하여 리신을 L-2-아미노아디페이트 6-세미알데하이드(알리신)으로 전환시킨다. 알리신은 불안정하고 자발적으로 세포내 탈수반응을 진행하여 고리형 분자인 1-피페리데인 6-카르복실레이트를 형성한다. 이것은 임의의 역반응이 발생되지 않도록 효과적으로 억제한다. 이 반응식은 도 12에 도시하였다. 대안적 효소로서 리신-피루브산염 6-아미노전이효소(EC 2.6.1.71)도 사용할 수 있다.
일반적인 반응에는 1ml 중에 50mM Tris-Cl pH 7.3, 20mM 인돌-3-피루브산염, 0.05mM PLP, 6mM 인산칼륨 pH 8, 2 내지 50mM 피루브산나트륨, 1.5mM MgCl2, 50mM 리신, 100㎍ 아미노전이효소(리신 엡실론 아미노전이효소 LAT-101, BioCatalytics Pasadena, CA) 및 200㎍ C.테스토스테로니 ProA 알돌라제를 사용하였다. 피루브산염의 농도를 증가시킴에 따라 모나틴의 생산량도 증가하였다. 이 반응 조건(50mM 피루브산염)하에서의 최대량은 옥살로아세트산염 탈탄산효소(약 0.1mg/ml)를 사용하는 연계 반응시 관찰되는 양 보다 10배 이하로 적었다.[M+H]+=293의 피크는 모나틴의 예상 시간에 용출되었고, 질량 스펙트럼 결과 다른 효소 반응에서 관찰되는 것과 같은 단편을 몇가지 함유하고 있었다. 질량/전하 비가 정확한(293) 제2 피크는 실시예 6에서 관찰된 S,S 모나틴에서 일반적으로 관찰된 시간 보다 약간 빠르게 용출되었는데, 이것은 모나틴의 다른 이성체의 존재를 암시할 수 있다. 이 효소에 의해 생산되는 트립토판의 양은 매우 적었다. 하지만, 피루브산염에 약간의 활성을 미칠 가능성이 있다(부산물로서 알라닌 생성). 또한, 이 효소는 불안정한 것으로 알려져 있다. 따라서, 안정성을 증가시키고, 피루브산염에 대한 활성을 감소시키고 MP에 대한 활성을 증가시키기 위하여 유도 진화 실험을 수행하여 개선시킬 수도 있다. 이 반응은 또한 전술한 바와 같이 L-아미노산 산화효소/카탈라제와 연계시킬 수도 있다.
다른 연계 반응
트립토판 또는 인돌-피루브산염으로부터 모나틴의 수율을 증가시킬 수 있는 다른 연계 반응을 도 13에 도시하였다. 포름산염 탈수소효소(EC 1.2.1.2 또는 1.2.1.43)은 공통적인 효소이다. 일부 포름산염 탈수소효소는 NADH를 필요로 하는 반면 다른 탈수소효소는 NADPH를 필요로 한다. 글루탐산 탈수소효소는 암모늄계 완충액을 사용하여 이전 실시예에서 모나틴 전구체와 모나틴 사이의 상호전환을 촉매했다. 포름산염 암모늄과 포름산염 탈수소효소의 존재는 보조인자의 재생에 효율적인 시스템이고, 이산화탄소 생성은 역반응 속도를 감소시키는 효과적인 방법이다(Bommarius et al., Biocatalysis 10:37, 1994 and Galkin et al. Appl.Environ.Microbiol. 63:4651-6, 1997). 또한, 다량의 포름산암모늄은 반응 완충액에 용해될 수 있다. 글루탐산 탈수소효소 반응(또는 유사한 환원성 아민화)에 의해 생산되는 모나틴의 수율은 포름산염 탈수소효소와 포름산암모늄의 첨가로 향상될 수 있다.
모나틴 생산 방향으로 평형을 유도하는 다른 방법을 사용할 수도 있다. 예컨대, MP의 모나틴으로의 전환 반응에서 아미노산 공급체로서 아미노프로판이 사용되고 이와 함께 미국 특허 제5,360,724호 및 제5,300,437호에 기술된 것과 같은 오메가-아미노산 아미노전이효소(EC 2.6.1.18)가 사용된다면 그 결과 산출되는 산물 중 하나는 기질인 아미노프로판 보다 휘발성이 강한 산물인 아세톤일 것이다. 이 아세톤을 증발시키기 위해서 온도를 주기적으로 단시간 동안 상승시킬 수 있다. 이에 따라 평형이 줄어들게 된다. 아세톤의 비등점은 47℃로서, 이 온도는 단시간 동안 사용된다면 중간체를 분해시킬 가능성은 적은 온도이다. 알파-케토글루타르산염에 활성을 나타내는 대부분의 아미노전이효소는 모나틴 전구체에도 활성을 나타낸다. 이와 유사하게, 글리옥실산염/방향족 산 아미노전이효소가 아미노 공급체로서의 글리신과 함께 사용된다면 글리옥실산염이 생산되고, 이것은 비교적 불안정하며 글리신에 비해 현저히 감소된 비등점을 갖고 있다.
실시예 14
재조합체 발현
시중에서 입수용이한 효소, cDNA 및 아미노산 서열과, 본 발명에서 개시된 효소 및 서열, 예컨대 서열번호 11 및 12, 뿐만 아니라 이의 변형체, 다형태, 돌연변이체, 단편 및 융합체를 이용하면 표준 실험실 기술로 효소 등의 임의의 단백질을 발현 및 정제할 수 있다. 당업자라면 이러한 효소 및 이의 단편이 당해의 임의의 세포 또는 유기체에서 재조합으로 생산되고 사용전에, 예컨대 서열번호 12 및 이의 유도체의 생산 전에 정제될 수 있음을 잘 이해할 것이다.
재조합체 단백질을 생산하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 즉, 본 발명의 범위는 효소 등의 임의의 단백질 또는 이의 단편의 재조합체 발현을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,342,764(Johnson et al.); 미국 특허 제5,846,819호(Pausch et al.); 미국 특허 제5,876,969호(Fleer et al.) 및 Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Ch. 17) 참조.
간략히 설명하면, 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 부분, 전장 또는 변형 cDNA 서열을 박테리아 또는 진핵세포 발현 벡터 등의 발현 벡터에 결찰시킨다. 이 cDNA 서열의 상류에 프로모터를 배치하면 단백질 및/또는 펩타이드를 생산할 수 있다. 프로모터의 예로는 lac, trp, tac, trc, 파지 람다의 주 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 조절 영역, SV40의 조기 및 후기 프로모터, 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 바큘로바이러스 및 시미안 바이러스 유래의 프로모터, 3-포스포글리세르산염 키나제의 프로모터, 효모 산 인산화효소의 프로모터, 효모 알파 정합 인자의 프로모터 및 이의 조합이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본래의 천연 단백질의 생산에 적합한 벡터로는 pKC30(Shimatake and Rosenberg, 1981, Nature 292: 128), pKK177-3(Amann and Brosius, 1985, Gene 40:183) 및 pET-3(Studier and Moffatt, 1986, J.Mol.Biol.189:113)이 있다. DNA 서열은 다른 클로닝 매개체, 예컨대 다른 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, 동물 바이러스 및 효모 합성 염색체(YAC) 등으로 전달할 수 있다(Burke et al., 1987, Science 236:806-12). 이 벡터들은 체세포. 및 단순 또는 복잡 유기체, 예컨대 박테리아, 진균(Timberlake and Marshall, 1989, Science 244:1313-7), 무척추동물, 식물(Gasser and Fraley, 1989, Science 244:1993) 및 포유동물(Pursel et al., 1989, Science 244:1281-8) 등의 각종 숙주에 도입될 수 있고, 이 숙주는 이종 cDNA의 도입으로 돌연변이화된다.
포유동물 세포에서의 발현을 위해, cDNA 서열은 이종 프로모터, 예컨대 시미안 바이러스 SV40, pSV2 벡터(Mulligan and Berg, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072-6) 중의 프로모터 등에 결찰시키고 원숭이 COS-1 세포(Gluzman, 1981, Cell 23:175-82) 등의 세포에 도입시키면 일시적 또는 장기적 발현을 달성할 수 있다. 키메라 유전자의 안정된 통합은 생화학적 선택 마커, 예컨대 네오마이신(Southern and Berg, 1982, J.Mol.Appl.Genet. 1:327-41) 및 마이코페놀산(Mulligan and Berg, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072-6)을 통해 포유동물 세포에서 유지시킬 수 있다.
인간이나 다른 포유동물 세포로의 DNA의 전이는 통상적인 기술이다. 벡터는 다음과 같은 방법 등에 의해 순수 DNA로서 수용체 세포에 도입시킨다(형질감염): 인산칼슘을 이용한 침전(Graham and vander Eb, 1973, Virology 52:466), 인산스트론튬을 이용한 침전(Brash et al., 1987, Mol.Cell Biol. 7:2013), 일렉트로포레이션(Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841), 리포펙션(Felgner et al., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:7413), DEAE 덱스트란(McCuthan et al., 1968, J.Natl.Cancer Inst. 41:351), 미량주입(Mueller et al., 1978, Cell 15:579), 원형질체 융합(Schafenr, 1980, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:2163-7), 또는 펠릿 건(Klein et al., 1987, Nature 327:70). 또는, 바이러스 벡터를 이용한 감염을 통해 cDNA를 도입시킬 수 있는데, 그 벡터의 예로는 레트로바이러스(Bernstein et al., 1985, Gen.Engrg. 7:235), 아데노바이러스(Ahmad et al., 1986, J.Virol.57:267) 또는 헤르페스(Spaete et al., 1982, Cell 30:295)가 있다.
본 발명의 원리가 적용될 수 있는 가능한 많은 구체예를 검토해 볼 때, 예시된 구체예는 본 발명의 일부 특정 예일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 자명하게 알 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 다음 청구의 범위에 따라 한정되어야 한다. 따라서, 이러한 청구의 범위와 취지에 속하는 모든 발명은 본 출원인의 발명으로 주장한다.
SEQUENCE LISTING <110> Cargill, Incorporated <120> Polypeptides and Biosynthetic Pathways <130> 6682-65741 <150> 60/374,831 <151> 2002-04-23 <160> 74 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA <213> Sinorhizobium meliloti <400> 1 atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc 60 aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc 120 ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag 180 gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctctgggaa 240 ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtccagac gcccggcggc 300 tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg 360 ctcgggctgc cgagctggcc gaaccacgcg ccgatcttca aggcggccgg gctcgatatc 420 gccacctacg acttcttcga cattccgtcg cagtcggtca tcttcgataa tctggtgagc 480 gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg 540 accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc 600 ggcctgctgc cgctcgtcga tctcgcctat caggggttcg gccgcggcct 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Asp Leu Val Phe Leu Asp Arg Leu Trp Glu 65 70 75 80 Leu Val Gly Gly Asp Thr Ile Glu Arg Ser His Val Ala Gly Val Gln 85 90 95 Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala 100 105 110 Arg Met Gly Gly Arg Gly Ile Trp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Pro Asn 115 120 125 His Ala Pro Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Ala Thr Tyr Asp 130 135 140 Phe Phe Asp Ile Pro Ser Gln Ser Val Ile Phe Asp Asn Leu Val Ser 145 150 155 160 Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Val Leu Leu His Ala Ser 165 170 175 Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Val Leu Ser Glu Ala Gln Trp Met Glu 180 185 190 Ile Ala Ala Leu Val Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Val Asp Leu 195 200 205 Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gln Asp Val Ala Gly Leu 210 215 220 Arg His Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Ala Leu Val Ala Val Ser Cys 225 230 235 240 Ser Lys Ser Phe Gly Leu Tyr Arg Glu Arg Ala Gly Ala Ile Phe Ala 245 250 255 Arg Thr Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Ser Asn Leu Ala 260 265 270 Gly Leu Ala Arg Thr Ser Tyr Ser Met Pro Pro Asp His Gly Ala Ala 275 280 285 Val Val Arg Thr Ile Leu Asp Asp Pro Glu Leu Arg Arg Asp Trp Thr 290 295 300 Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser 305 310 315 320 Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gln Ser Leu Gly Ala Val Ala 325 330 335 Asp Gln Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Val 340 345 350 Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly Ile Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg 355 360 365 Ile Asn Ile Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu Ile Ala Gly 370 375 380 Lys Phe Thr Ser Leu 385 <210> 3 <211> 1260 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 3 atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga 60 aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa 120 ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc 180 tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg 240 ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat 300 gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt 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22 agaggagagt tagagcctca gccggggaag ctccggg 37 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 23 ggtattgagg gtcgcatgtc cacgcaggcg gccat 35 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 24 agaggagagt tagagcctca ctcacgattc acattgc 37 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 25 ggtattgagg gtcgcatgcc agaattagct aatga 35 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 26 agaggagagt tagagcctta ttcgtcctct tgtaaaa 37 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 27 ggtattgagg gtcgcatgcg ctctacgacg gctcc 35 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 28 agaggagagt tagagcctca gccgcgcagc accttgg 37 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 29 ggtattgagg gtcgcatgtt tgagaacatt accgc 35 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 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agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat 480 acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt 540 gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca 600 ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac 660 gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag 720 cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat 780 gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg 840 tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg 900 caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta 960 ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat 1020 ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca 1080 ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg 1140 ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg 1200 ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta 1260 accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa 1320 catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta 1380 ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa 1416 <210> 42 <211> 1371 <212> DNA <213> Citrobacter freundii <400> 42 atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg 60 cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg 120 aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag 180 tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg 240 gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt 300 ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat 360 atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc 420 gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt 480 aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg 540 gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg 600 cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa 660 aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc 720 gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780 gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag 840 ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa 900 gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag 960 caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta 1020 ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag 1080 ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag 1140 cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg 1200 gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg 1260 gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320 tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a 1371 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 43 ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct 35 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 44 agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg 37 <210> 45 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 45 ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc 35 <210> 46 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 46 agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg 37 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 47 ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t 31 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 48 tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt 30 <210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 49 tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt 32 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 50 ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca 30 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 51 aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg 29 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 52 tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at 32 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 53 gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat 29 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 54 gtagacgcgg actaactctt tggcagaag 29 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 55 ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt 35 <210> 56 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 56 agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc 37 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 57 ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca 35 <210> 58 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 58 agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca 37 <210> 59 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 59 ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg 35 <210> 60 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 60 agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca 37 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 61 ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa 35 <210> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 62 agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc 37 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 63 ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa 35 <210> 64 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 64 agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga 37 <210> 65 <211> 684 <212> DNA <213> C. testosteroni <400> 65 atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac 60 ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc 120 aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg 180 ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc 240 gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg 300 gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac 360 gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc 420 acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc 480 acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt 540 gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc 600 aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag 660 gccggcctga aatatattga ctaa 684 <210> 66 <211> 227 <212> PRT <213> C. testosteroni <400> 66 Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg 1 5 10 15 Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu 20 25 30 Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr 35 40 45 Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro 50 55 60 Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly 65 70 75 80 Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe 85 90 95 Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu 100 105 110 Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp 115 120 125 Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala 130 135 140 Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val 145 150 155 160 Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val 165 170 175 Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu 180 185 190 Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly 195 200 205 Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys 210 215 220 Tyr Ile Asp 225 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 67 actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct 42 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 68 cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc 33 <210> 69 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 69 cgcggatcca taatggttga gaacattacc g 31 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 70 acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg 30 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 71 ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt 32 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 72 gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc 33 <210> 73 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 73 ggtattgagg gtcgc 15 <210> 74 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 74 agaggagagt tagagcc 17

Claims (57)

  1. 글루코스를 모나틴(monatin)으로 전환시키는 것을 포함하는 모나틴 제조방법.
  2. 트립토판 또는 인돌-3-젖산을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 제1 폴리펩타이드와 트립토판 또는 인돌-3-젖산을 접촉시키는 단계;
    상기 인돌-3-피루브산염과 C3 탄소원을 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산으로 전환시키는 제2 폴리펩타이드 및 C3 탄소원과 상기 인돌-3-피루브산염을 접촉시키는 단계; 및
    상기 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산을 모나틴으로 전환시키는 제3 폴리펩타이드와 상기 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산을 접촉시키는 단계를 포함하는 것이 특징인, 트립토산 및/또는 인돌-3-젖산을 모나틴으로 전환시키는 것을 포함하는 모나틴 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 트립토판 아미노전이효소(EC 2,6,1,27), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 타이로신(방향족) 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), 트립토판 산화효소, L-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.2), D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1), D-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.3), D-트립토판 아미노전이효소, D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21), 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2-4), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20) 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것으로서, 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 것인, 모나틴 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 인돌젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.110), R-4-하이드록시페닐젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.222), 3-(4)-하이드록시페닐피루브산염 환원효소(EC 1.1.1.237), 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일)젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.111) 및 젖산염 산화효소(EC 1.1.3.-)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이거나 또는 이의 혼합물로서, 인돌-3-젖산을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 것인, 모나틴 제조방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및/또는 제3 폴리펩타이드가
    서열번호 2,4,6,8,10,12,14,32, 진뱅크 수탁번호 NP_388848.1, 진뱅크 수탁번호 ZP00005082.1 또는 진뱅크 수탁번호 AAC74014.1에 제시된 아미노산 서열;
    서열번호 2,4,6,8,10,12,14,32, 진뱅크 수탁번호 NP_388848.1, 진뱅크 수탁번호 ZP00005082.1 또는 진뱅크 수탁번호 AAC74014.1에 제시된 서열과 적어도 90%의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열; 또는
    50개 미만의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 2,4,6,8,10,12,14,32, 진뱅크 수탁번호 NP_388848.1, 진뱅크 수탁번호 ZP00005082.1 또는 진뱅크 수탁번호 AAC74014.1에 제시된 서열과 상이하지만, 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 아미노산 서열
    을 포함하는 것이 특징인 모나틴 제조방법.
  6. 제2항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 EC 4.1.2.- 또는 EC 4.1.3.- 효소인 것이 특징인 모나틴 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, EC 4.1.3.-효소가 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 글리옥실산염 분해효소(EC 4.1.3.16), 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 피루브산염 분해효소(EC 4.1.3.17) 또는 이의 혼합물인 것이 특징인 모나틴 제조방법.
  8. 제2항에 있어서, 제3 폴리펩타이드가 타이로신(방향족) 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), 트립토판 아미노전이효소(EC 2.6.1.27), 아스파르트산염 아미노전이효소(2.6.1.1), D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21), D-트립토판 아미노전이효소, 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2-4), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1) 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  9. 제2항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 아미노산 산화효소(EC 1.4.3.-) 및 카탈라제(EC 1.11.1.6)를 포함하며, 트립토판을 인돌-3-피루브산염으로 전환시키는 것인, 모나틴 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 아미노산 산화효소가 트립토판 산화효소를 포함하는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  11. 제2항에 있어서, C3 탄소원이 피루브산염, 포스포에놀피루브산염, 알라닌, 세린, 시스테인 또는 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 모나틴 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 피루브산염이 알라닌 및 알라닌의 아미노기전이를 행할 수 있는 폴리펩타이드; 세린 및 세린의 베타-제거를 행할 수 있는 폴리펩타이드; 시스테인 및 시스테인의 베타-제거를 행할 수 있는 폴리펩타이드; 아스파르트산염 및 이카르복실성 아미노산과 베타-분해효소 반응을 행할 수 있는 폴리펩타이드; 젖산염 및 젖산염 산화효소(EC 1.1.3.-) 또는 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3); 또는 이의 혼합물에 의해 생성되는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  13. 제2항에 있어서, 트립토판이 인돌-3-피루브산염으로 전환될 때 생성된 과산화수소를 카탈라제와 접촉시켜 그 과산화수소의 양을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  14. 제2항에 있어서, 제2 폴리펩타이드는
    서열번호 66, 진뱅크 수탁번호 CAC46344, 진뱅크 수탁번호 CAB14127.1, 진뱅크 수탁번호 AAC74920.1 또는 진뱅크 수탁번호 CAC47463.1;
    서열번호 66, 진뱅크 수탁번호 CAC46344, 진뱅크 수탁번호 CAB14127.1, 진뱅크 수탁번호 AAC74920.1 또는 진뱅크 수탁번호 CAC47463.1과 적어도 90%이 서열 동일성이 있는 아미노산 서열; 또는
    50개 미만의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 66, 진뱅크 수탁번호 CAC46344, 진뱅크 수탁번호 CAB14127.1, 진뱅크 수탁번호 AAC74920.1 또는 진뱅크 수탁번호 CAC47463.1과 상이하지만 인돌-3-피루브산염과 피루브산염을 MP로 전환시키는 아미노산 서열
    로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  15. 제8항에 있어서, 제3 폴리펩타이드가 아스파르트산염 아미노전이효소를 포함하여 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산이 아스파르트산염과 접촉하면 옥살로아세트산염과 모나틴을 생성하는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 추가로 옥살로아세트산염을 탈수소효소와 접촉시키는 단계를 포함하는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  17. 제2항에 있어서, 제3 폴리펩타이드가 리신 엡실론 아미노전이효소를 포함하여, 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산을 추가로 리신과 접촉시키는 단계를 포함하는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  18. 제2항에 있어서, 제3 폴리펩타이드는 환원적 아민화 활성을 가진 효소를 포함하여 NAD(P)H를 재순환시킬 수 있는 폴리펩타이드인 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 환원적 아민화 활성을 가진 효소가 글루탐산염 탈수소효소, 페닐알라닌 탈수소효소, 트립토판 탈수소효소 또는 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 모나틴 제조방법.
  20. 제18항에 있어서, NAD(P)H를 재순환시킬 수 있는 폴리펩타이드가 추가로 휘발성 산물을 생성하는 것이 특징인 모나틴 제조방법.
  21. 제20항에 있어서, NAD(P)H를 재순환시킬 수 있고 휘발성 산물을 생성할 수 있는 폴리펩타이드가 포름산염 탈수소효소를 포함하고 생성되는 휘발성 산물이 이산화탄소인 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  22. 제2항에 있어서, 인돌-3-젖산을 모나틴으로 전환시키는 것을 포함하는, 모나틴 제조방법.
  23. 제2항에 있어서, 모나틴이 10g/L 이상 생성되는 것이 특징인 모나틴 제조방법.
  24. 인돌-3-피루브산염을 모나틴으로 전환시키는 것을 포함하는 모나틴 제조방법.
  25. 트립토판을 모나틴으로 전환시키는 것을 포함하는 모나틴 제조방법.
  26. 모나틴 제조 경로 중의 제1 중간체를 제2 중간체 또는 모나틴으로 전환시키는 폴리펩타이드를 1종 이상 암호화하는 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하여, 모나틴을 생성할 수 있는 세포.
  27. 제26항에 있어서, 폴리펩타이드 1종 이상이 트립토판 아미노전이효소(EC 2,6,1,27), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 타이로신(방향족) 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), 트립토판 산화효소, L-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.2), 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1), D-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21), D-트립토판 아미노전이효소, 인돌젖산염 탈수소효소(EC11.1.1.110), R-4-하이드록시페닐젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.222), 3-(4)-하이드록시페닐피루브산염 환원효소(EC 1.1.1.237), 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일)젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.111), 젖산염 산화효소(EC 1.1.3.-), 합성효소/분해효소(4.1.2.-), 합성효소/분해효소(4.1.3.-), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20), 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4) 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 세포.
  28. 제27항에 있어서, 폴리펩타이드 1종 이상이 트립토판 아미노전이효소(EC 2,6,1,27), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 타이로신(방향족) 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), 트립토판 산화효소, L-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.2), D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1), D-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21), D-트립토판 아미노전이효소, 합성효소/분해효소(EC 4.1.3.-), 합성효소/분해효소(4.1.2.-), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20), 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4) 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인, 세포.
  29. 제27항에 있어서, 폴리펩타이드 1종 이상이 인돌젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.110), R-4-하이드록시페닐젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.222), 3-(4)-하이드록시페닐피루브산염 환원효소(EC 1.1.1.237), 젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일)젖산염 탈수소효소(EC 1.1.1.111) 및 젖산염 산화효소(EC 1.1.3.-), 합성효소/분해효소(4.1.3.-), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), 트립토판 아미노전이효소(EC 2.6.1.27), 타이로신(방향족) 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20), D-트립토판 아미노전이효소, D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1), D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21) 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인, 세포.
  30. 제27항에 있어서, 합성효소/분해효소(EC 4.1.3.-)가 4-하이드록시-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.16) 또는 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산염 알돌라제(EC 4.1.3.17)을 포함하는 것이 특징인, 세포.
  31. 제26항에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 것이 특징인, 세포.
  32. 제26항에 있어서, 세포가 효모 세포인 것이 특징인, 세포.
  33. 제27항에 있어서, 세포가 추가로 적어도 하나의 외인성 핵산 서열에서 암호화되는, 카탈라제, 옥살로아세트산염 탈탄산효소, 리신 엡실론 아미노전이효소, 포름산염 탈수소효소로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 활성을 포함하는 폴리펩타이드를 1종 이상 포함하는 것이 특징인, 세포.
  34. 진뱅크 수탁번호 P00913, 진뱅크 수탁번호 NP_290344, 진뱅크 수탁번호 CAA34096, 진뱅크 수탁번호 NP_246359, 진뱅크 수탁번호 AAB96579. 진뱅크 수탁번호 NP_232561, 진뱅크 수탁번호 Q59342, 진뱅크 수탁번호 P28796, 진뱅크 수탁번호 1AX4_A, 진뱅크 수탁번호 BAA34638, 진뱅크 수탁번호 P31014, 진뱅크 수탁번호 P31015, 진뱅크 수탁번호 NP_280989, 진뱅크 수탁번호 AAC33284, 진뱅크 수탁번호 NP_147838, 진뱅크 수탁번호 AAF63441, 진뱅크 수탁번호 AAA24679 및 이카르복실산 아미노산 기질을 용인하는 폴리펩타이드의 특이성을 확대시키는 변화가 아미노산 위치 103번 및 299번의 잔기에 이루어진 진뱅크 수탁번호 NP_418164로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  35. 제34항에 있어서, 아미노산 서열의 변화가 103번 아르기닌에서 트레오닌으로의 변화; 103번 아르기닌에서 트레오닌으로의 변화와 299번 발린에서 아르기닌으로의 변화; 및 299번 발린에서 아르기닌으로의 변화로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리펩타이드.
  36. 진뱅크 수탁번호 2TPL_A, 진뱅크 수탁번호 P31012, 진뱅크 수탁번호 P31013, A49493, 진뱅크 수탁번호 P31011, 진뱅크 수탁번호 AAB24234, 진뱅크 수탁번호 1TPL_A, 진뱅크 수탁번호 1TPL_B, 진뱅크 수탁번호 NP_245748, 진뱅크 수탁번호 AAB41499, 진뱅크 수탁번호 Q08897, 진뱅크 수탁번호 T45297, 진뱅크 수탁번호 AAA71928, 및 이카르복실산 아미노산 기질을 용인하는 폴리펩타이드의 특이성을 확대시키는 변화가 아미노산 위치 100번 및 283번 잔기에 이루어진 진뱅크 수탁번호 X66978로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  37. 제36항에 있어서, 아미노산 서열의 변화가 100번 아르기닌에서 트레오닌으로의 변화; 100번 아르기닌에서 트레오닌으로의 변화와 283번 발린에서 아르기닌으로의 변화; 및 283번 발린에서 아르기닌으로의 변화로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리펩타이드.
  38. 제34항 또는 제36항에 있어서, 기질이 아스파르트산염인 것이 특징인 폴리펩타이드.
  39. 카르복실기와 아미노기가 차단된 알라닌 유도체 1종 이상과 카르복실기가 차단된 인돌-3-피루브산염 유도체 1종 이상을 반응시키는 것을 포함하는 모나틴 제조방법.
  40. 제39항에 있어서, 알라닌 유도체가 3-클로로-알라닌 또는 3-브로모-알라닌이고, 인돌-3-피루브산염이 그리나드 또는 유기리튬 반응을 통해 알라닌 유도체와 반응하는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  41. 트립토판, 인돌-3-젖산, 인돌-3-피루브산염 및 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 기질을 1종 이상의 중간체로 전환시키는 것을 포함하고 모나틴이 제조되는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  42. 제41항에 있어서, 1종 이상의 중간체 산물이 화학 반응을 통해 전환되는 것이 특징인 모나틴 제조방법.
  43. 제41항에 있어서, 1종 이상의 중간체 산물이 폴리펩타이드를 통해 전환되는 것이 특징인 모나틴 제조방법.
  44. 서열번호 11과 90% 이상의 서열 동일성이 있는 분리된 핵산.
  45. 제44항에 있어서, 핵산이 서열번호 11을 포함하는 것이 특징인 분리된 핵산.
  46. 제44항에 있어서, 핵산이 서열번호 11의 뉴클레오타이드 중 적어도 20개 이상의 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 특징인 분리된 핵산.
  47. 제44항에 기재된 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  48. 제47항에 기재된 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  49. 제44항에 기재된 분리된 핵산에 의해 암호화된 분리된 단백질.
  50. 제49항에 있어서, 단백질이 서열번호 12와 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것이 특징인 분리된 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 단백질이 서열번호 12를 포함하는 것이 특징인 분리된 단백질.
  52. 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산을 모나틴으로 전환시키는 것을 포함하는, 모나틴 제조방법.
  53. 제52항에 있어서, 추가로 질량 분광분석을 통한 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산의 분석 단계를 포함하는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  54. 2-하이드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산을 포함하는 조성물.
  55. 제2항에 있어서, 트립토판이 EC 4.1.99.1의 폴리펩타이드를 사용하여 인돌로부터 생성되는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
  56. 폴리펩타이드 1종 이상과 트립토판을 반응시키는 것을 포함하는, 모나틴 제조방법.
  57. 제56항에 있어서, 폴리펩타이드 1종 이상이 트립토판 아미노전이효소(EC 2,6,1,27), 트립토판 탈수소효소(EC 1.4.1.19), 타이로신(방향족) 아미노전이효소(EC 2.6.1.5), 트립토판-페닐피루브산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.28), 다중 기질 아미노전이효소(EC 2.6.1.-), 아스파르트산염 아미노전이효소(EC 2.6.1.1), 트립토판 산화효소, L-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.2), D-아미노산 탈수소효소(EC 1.4.99.1), D-아미노산 산화효소(EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노전이효소(EC 2.6.1.21), D-트립토판 아미노전이효소, 합성효소/분해효소(EC 4.1.3.-), 합성효소/분해효소(4.1.2.-), 페닐알라닌 탈수소효소(EC 1.4.1.20), 글루탐산염 탈수소효소(EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4) 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인, 모나틴 제조방법.
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