KR20050016371A - Methods and compositions for treating, preventing or delaying onset of a neoplasm - Google Patents
Methods and compositions for treating, preventing or delaying onset of a neoplasmInfo
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Abstract
본 발명은 개체에게 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 투여하는 것을 포함하는 종양 발생의 치료, 예방 또는 지연 방법에 관한 것이다. 또한, 개체에게 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 투여하는 것을 포함하는 종양의 무게 또는 부피를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또한 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 함유하는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method of treating, preventing or delaying tumor development comprising administering to a subject an anti-tumor agent and a growth hormone receptor antagonist. It also relates to a method of reducing the weight or volume of a tumor comprising administering an antitumor agent and growth hormone receptor antagonist to the subject. It also relates to a composition containing an antitumor agent and a growth hormone receptor antagonist.
Description
본 발명은 종양(neoplasm) 발생을 치료, 예방 및/또는 지연시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 방법은 개체에게 항종양제 (anti-neoplastic agents)와 성장 호르몬 수용체 길항제 (growth hormone receptor antagonist)를 투여하는 것을 포함한다.The present invention relates to methods and compositions for treating, preventing and / or delaying neoplasm development. The method comprises administering to the subject anti-neoplastic agents and growth hormone receptor antagonists.
많은 개체들이 양성(benign) 또는 악성(malignant) 종양 중 하나를 갖고 있다. 또한, 어떤 개체들은 종양 발생 위험에 처해있다. 예컨대, 전염병학을 기초로 하는 둔 몇몇 대규모 연구들은, 정상 범위의 상위 부분의 인슐린 유사 성장 인자 (insulin-like growth factor, IGF-I) 농도를 갖는 개체들에게서 유방암, 결장암 및/또는 전립선암 등과 같은 많은 다양한 악성 종양의 발생 위험이 증가한다는 것을 보여주었다. 또한, 말단 비대증(acromegalic) 개체에게서 특정 유형의 종양, 특히 결장암 발생의 위험이 증가한다는 보고가 있었다.Many individuals have either a benign or malignant tumor. In addition, some individuals are at risk of developing tumors. For example, some large-scale studies based on epidemiology, such as breast cancer, colon cancer and / or prostate cancer, in individuals with insulin-like growth factor (IGF-I) concentrations in the upper range of the normal range It has been shown that the risk of developing many different malignancies increases. In addition, there have been reports of an increased risk of developing certain types of tumors, particularly colon cancer, in acromegalic individuals.
이리노테칸(Irinotecan)과 같은 캄프토테신(camptothecin) 등의 항종양제가 다양한 종양 치료에 사용된다고 알려져 있다. 그러나, 종양 치료를 위한 개선된 방법과 조성물에 대한 요구는 끊임없이 지속되고 있다. Antitumor agents, such as camptothecin, such as Irinotecan, are known to be used in the treatment of various tumors. However, there is a continuing need for improved methods and compositions for treating tumors.
발명의 요약Summary of the Invention
따라서, 본 발명의 목적은 종양 발생을 치료, 예방 및/또는 지연시키는 방법 및 조성물을 제공하는 것이다. It is therefore an object of the present invention to provide methods and compositions for treating, preventing and / or delaying tumor development.
본 발명의 방법과 조성물에 의하여 이러한 목적과 부가적인 목적이 제공된다. 한 측면에 있어서, 본 발명은 종양의 발생을 치료, 예방 및/또는 지연시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 개체에게 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 투여하는 것을 포함한다. These and additional objects are provided by the methods and compositions of the present invention. In one aspect, the invention relates to a method of treating, preventing and / or delaying the development of a tumor. The method includes administering an antitumor agent and growth hormone receptor antagonist to the individual.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 종양 발생을 치료, 예방 및/또는 지연시키는 방법에 관한 것으로, 개체에게 이리노테칸 하이드로클로라이드와 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 변형된 인간 성장 호르몬을 투여하는 것을 포함하고, 상기 방법에 있어서, PEG 변형된 인간 성장 호르몬은 약 4 내지 약 5 개의 공유적으로 결합된 PEG 분자를 함유하고, 각각의 PEG 분자는 약 5,000 Da의 평균 분자량을 갖는다. In another embodiment, the invention relates to a method of treating, preventing and / or delaying tumor development, comprising administering to a subject irinotecan hydrochloride and polyethylene glycol (PEG) modified human growth hormone. The PEG modified human growth hormone contains about 4 to about 5 covalently bound PEG molecules, each PEG molecule having an average molecular weight of about 5,000 Da.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 종양의 무게 또는 부피를 감소시키는 방법에 관한 것으로, 개체에게 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 투여하는 것을 포함한다. In another embodiment, the present invention relates to a method of reducing the weight or volume of a tumor, comprising administering an antitumor agent and a growth hormone receptor antagonist to a subject.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. In another embodiment, the present invention relates to a composition comprising an antitumor agent and a growth hormone receptor antagonist.
본 발명의 방법과 조성물은 조양의 발생을 치료, 예방 및/또는 지연시키는데 유용하다. 특정 구체예에서 전이(metastasis)의 치료 및/또는 예방이 달성될 수 있다. 본 발명의 추가적인 구체예, 목적 및 이점들은 하기의 발명의 상세한 설명에 의하여 보다 충분히 분명해질 것이다. The methods and compositions of the present invention are useful for treating, preventing and / or delaying the development of nursing care. In certain embodiments the treatment and / or prevention of metastasis can be achieved. Further embodiments, objects and advantages of the present invention will become more fully apparent from the following detailed description of the invention.
도 1A 내지 1D는, 실시예에 기재된 바와 같이, 마우스 결장 암종 세포주 CT-26이 주입된 BALB/c 마우스에서의 비장 종양의 간 전이(hepatic metastases) 부피, 수 및 질량에 대한, 담체(vehicle) 단독 투여, 페그비소만트(Pegvisomant) 단독 투여, 이리노테칸 단독 투여, 및 페그비소만트와 이리노테칸의 복합 투여시의 각각의 효과를 보여주는 것이다. 1A-1D are vehicle for hepatic metastases volume, number and mass of splenic tumors in BALB / c mice injected with mouse colon carcinoma cell line CT-26, as described in the Examples. It shows the effects of the single administration, Pegvisomant alone administration, irinotecan alone administration, and the combined administration of pegbisomant and irinotecan.
본 발명은 종양 발생을 치료, 예방 및/또는 지연시키기 위한 방법 및 종양 무게 또는 부피를 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 개체에게 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to methods for treating, preventing and / or delaying tumor development and methods for reducing tumor weight or volume. These methods include administering an antitumor agent and growth hormone receptor antagonist to the individual. The invention also relates to a composition comprising an antitumor agent and a growth hormone receptor antagonist.
본 명세서에 있어서, "개체(individual)"은 종양을 갖거나 종양 발생의 위험이 있는 인간, 포유류 또는 설치류를 포함하지만 이에 한정되지 않는 동물을 의미하기 위하여 사용된다. 종양 발생의 위험이 있는 개체는 선천적이거나 후천적인 유전자 이상을 갖는 개체, 또는 말단 비대증 개체와 같이 종양 발생의 소질을 갖는 개체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 명세서에 있어서, "치료(treatment)"는 종양의 무게 및/또는 부피의 감소를 의미하는 반면, 예방과 지연은 항종양제와 성장 호루몬 수용체 길항제 투여 후 종양의 임상적 발생 또는 징후(manifestation) 각각 있어서의 예방 또는 지연을 의미하기 위하여 사용된다. 본 발명의 구체예에 있어서, 종양은 결장암, 유방암, 전립선암 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 악성 종양 (암)이다. 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 종양은 뇌수막종(meningioma)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 양성 종양이다. As used herein, “individual” is used to mean an animal, including but not limited to humans, mammals, or rodents with or at risk of having a tumor. Individuals at risk of tumor development include, but are not limited to, individuals with congenital or acquired genetic abnormalities, or individuals with predisposition to tumor development, such as terminal hypertrophic individuals. As used herein, "treatment" refers to a reduction in the weight and / or volume of a tumor, while prevention and delay refers to the clinical occurrence or manifestation of the tumor after administration of antitumor and growth hormone receptor antagonists. ) Is used to mean prevention or delay in each case. In an embodiment of the invention, the tumor is a malignant tumor (cancer), including but not limited to colon cancer, breast cancer, prostate cancer or a combination thereof. In another embodiment of the present invention, the tumor is a benign tumor, including but not limited to meningioma.
본 발명의 개발에 있어서, 본 발명자들은 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제를 함께 투여하는 것이 항종양제만을 단독으로 투여하는 것 보다 우수한 효과를 갖는다는 것을 확인하였다. In the development of the present invention, the inventors have confirmed that the administration of the anti-tumor agent and the growth hormone receptor antagonist together has a superior effect than the administration of the anti-tumor alone.
이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 종양의 발생을 치료, 예방 또는 지연시키는 것으로 알려진 다양한 항종양제를 알 수 있을 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 항종양제는, 예컨대, 이리노테칸 등의 캄프토테신 유도체(camptochetic derivative)와 같은 캄프토테신(camptothecin), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르를 포함한다. 이리노테칸은, 본 명세서에 참조로서 포함되어 있는 미국 특허 제4,604,463호 (Miyasaka 등)에 개시되어 있으며, 결장암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 종양의 치료에 널리 사용되는 제제이다. 이리노테칸 하이드로클로라이드(irinotecan hydrochloride)는 캄프토테신의 반합성(semisynthetic) 유도체인, 희수나무(Ascamptotheca acuminats)와 같은 식물로부터 얻은 알칼로이드 추출물이며, 토포아이소머라아제-1 (topoisomerase-1) 억제제이다. 이리노테칸의 화학명은 (4S)-4,11-디에틸-4-하이드록시-9-((4-피페리디노피페리디노)카르보닐옥시)-1H-피라노(3',4':6,7)인돌리지노(1,2-b)퀴놀린-3,14(4H,12H)디온 하이드로클로라이드 [(4S)-4,11-diethyl-4-hydroxy-9-((4-piperidinopiperidino)carbonyloxy)-1H-pyrano(3',4':6,7)indolizino(1,2-b)quinoline-3,14(4H,12H) dione hydrochloride]이다. 그 구조식은 다음과 같다:One of ordinary skill in the art would recognize a variety of anti-tumor agents known to treat, prevent or delay the development of tumors. In one embodiment, the antitumor agent comprises, for example, camptothecin, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, such as a camptochetic derivative such as irinotecan. Irinotecan is disclosed in US Pat. No. 4,604,463 (Miyasaka et al.), Incorporated herein by reference, and is a widely used agent for the treatment of tumors, including but not limited to colon cancer. Irinotecan hydrochloride is an alkaloid extract obtained from plants such as Ascamptotheca acuminats , a semisynthetic derivative of camptothecin, and is a topoisomerase-1 inhibitor. The chemical name of irinotecan is (4S) -4,11-diethyl-4-hydroxy-9-((4-piperidinopiperidino) carbonyloxy) -1 H -pyrano (3 ', 4': 6,7) indole ridges no (1,2-b) quinoline -3,14 (4 H, 12 H) -dione hydrochloride [(4S) -4,11-diethyl- 4-hydroxy-9 - ((4- piperidinopiperidino) carbonyloxy) -1 H- pyrano (3 ', 4': 6,7) indolizino (1,2-b) quinoline-3,14 (4H, 12H) dione hydrochloride]. The structural formula is:
이리노테칸은, 예컨대, Pharmacia사로부터 상표명 Catnptosar인 하이드로클로라이드염 형태로서 상업적으로 입수할 수 있다.Irinotecan is, for example, the brand name Catnptosar from Pharmacia. Commercially available as phosphorus hydrochloride salt form.
다른 항종양제들이 관련 기술 분야에 알려져 있으며 본 발명의 방법과 조성물에 사용되기에 적합하다. 예컨대, 다양한 활성제를 종양 치료에 사용하는 것이 관련 기술 분야에 알려져 있다. 이러한 제제는 항종양제로서 본 발명의 범위에 포함된다고 간주되며, 독소루비신(doxorubicin) 및 에피루비신(epirubicin)과 같은 안트라사이클린(anthracyclines), 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)과 같은 탁산(taxanes), 에포틸론(epothilones), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)과 같은 다른 알킬화제, 시스-플라틴(cis-platin), 카보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)과 같은 백금계 제제, 5-FU 및 캡시티딘(capcitidine)과 같은 플루오로피리마딘(fluoropyrimadines), 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 항대사 물질(antimetabolite), SERMs, 아로마타아제 억제제(aromatase inhibitors), LHRH 작용제(agonist) 및 길항제, 에스트르무스틴(estrmustine), 겜시타빈(gemcytabine)과 같은 리보뉴클레오사이드 환원 효소 억제제(ribonucleoside reductase inhibitors), EGFR 길항제, 및 항혈관형성제(antiangiogenesis agents)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. Other antitumor agents are known in the art and are suitable for use in the methods and compositions of the present invention. For example, the use of various active agents in the treatment of tumors is known in the art. Such agents are considered to be within the scope of the present invention as antitumor agents and include taxanes such as anthracyclines such as doxorubicin and epirubicin, paclitaxel and docetaxel. ), Other alkylating agents such as epothilones, cyclophosphamide, platinum based agents such as cis-platin, carboplatin and oxaliplatin, 5-FU And fluoropyrimadines such as capcitidine, antimetabolites such as methotrexate, SERMs, aromatase inhibitors, LHRH agonists and antagonists, ests Ribonucleoside reductase inhibitors such as estmusmus, gemcytabine, EGFR antagonists, and antiangiogenic agents s agents), but is not limited thereto.
성장 호르몬 수용체 길항제에 사용되는 성장 호르몬 (GH)은 인간 성장 호르몬, 야생형 또는 재조합체, 또는 성장 호르몬 활성을 나타내는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 인간 성장 호르몬 (hGH)은, 다른 것들 중에서, 선 성장(linear growth) [체세포발생(somatogenesis)], 젖 분비, 대식 세포 활성화, 및 인슐린 유사 효과 및 당뇨 유발(diabetogenic) 효과를 포함하는, 많은 생물학적 효과를 보여주는 것으로 알려진 22,000 달톤의 뇌하수체 호르몬이다 [Chawla, Annu. Rev. Med., 34:519 (1983); Edwards 등, Science, 239:769 (1988); Isaksson 등, Annu. Rev. Physio., 47:483 (1985); Thorner 등, J. Clin. Invest., 82:745 (1988); Hughes 등, Annu. Rev. Physiol., 47:469 (1985)]. 이러한 생물학적 효과는 hGH와 특정 세포 수용체 간의 상호 작용으로부터 유래한다. Growth hormone (GH) used in growth hormone receptor antagonists may include human growth hormone, wild type or recombinant, or variants thereof that exhibit growth hormone activity. Human growth hormone (hGH) has many biological properties, including linear growth (somatogenesis), lactation, macrophage activation, and insulin-like and diabetogenic effects, among others. 22,000 Daltons of the pituitary hormone known to show effects [Chawla, Annu. Rev. Med., 34: 519 (1983); Edwards et al., Science, 239: 769 (1988); Isaksson et al., Annu. Rev. Physio., 47: 483 (1985); Thorner et al., J. Clin. Invest., 82: 745 (1988); Hughes et al., Annu. Rev. Physiol., 47: 469 (1985). This biological effect results from the interaction between hGH and specific cellular receptors.
hGH는 태반성 락토겐(placental lactogens), 프로락틴, 및 성장 호르몬의 다른 유전자 및 종 변이체를 포함하는 동종 호르몬 계통 중 일원이다. hGH는 광범위한 종 특이성을 보이고 클로닝된 체세포 유래 또는 프로락틴 수용체에 결합한다는 점에서 상기 호르몬들 중에서 특이한 것이다. hGH를 위하여 클로닝된 유전자를 대장균(E. coli)에서 분비형으로 발현시킨 바 있으며 [Chang 등, Gene, 55: 189 (1987)], 그 DNA 서열 및 아미노산 서열이 보고된 바 있다 [Goeddel 등, Nature, 281: 544 (1979); Gray 등, Gene, 39: 247 (1985)]. hGH의 수용체 및 항체 에피토프를 상동체-스캐닝 변이 유발 (homolog-scanning mutagenesis) 및 알라닌-스캐닝 변이 유발 (alanine-scanning mutagenesis)에 의하여 동정한 바 있다 [Cunningham 등, Science, 243:1330 (1989); Cunningham 등, Science, 244:1081 (1989); WO 97/11178].hGH is a member of the allohormonal lineage, including placental lactogens, prolactin, and other gene and species variants of growth hormone. hGH is unique among these hormones in that it shows a wide range of species specificities and binds to cloned somatic derived or prolactin receptors. Genes cloned for hGH have been secreted in E. coli [Chang et al., Gene, 55: 189 (1987)], and their DNA and amino acid sequences have been reported [Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979); Gray et al., Gene, 39: 247 (1985). Receptor and antibody epitopes of hGH have been identified by homolog-scanning mutagenesis and alanine-scanning mutagenesis [Cunningham et al., Science, 243: 1330 (1989); Cunningham et al., Science, 244: 1081 (1989); WO 97/11178].
hGH와 그 수용체(hGHbp)의 세포외 도메인 간의 호르몬-수용체 복합체가 알려져 있다 [Wells 등,Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22: 329 (1993)]. 고 해상도 구조 및 변이 분석 및 구조 분석은 hGH의 하나의 분자가 부위 1 및 부위 2라고 불리는 호르몬 상의 분리된 부위를 이용하여 두 개의 수용체 분자에 연속적으로 결합한다는 것을 보여주었다 [Cunningham 등, Science, 244:1081 (1989); Cunningham 등, Science, 254:821 (1991); De Vos 등, Science, 255:306 (1991)]. Hormone-receptor complexes between the hGH and the extracellular domain of its receptor (hGHbp) are known [Wells et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22: 329 (1993). High resolution structure and mutation analysis and structural analysis have shown that one molecule of hGH binds continuously to two receptor molecules using separate sites on hormones called site 1 and site 2 [Cunningham et al., Science, 244 : 1081 (1989); Cunningham et al., Science, 254: 821 (1991); De Vos et al., Science, 255: 306 (1991).
GH의 광범위한 종 특이성에 더하여, GH 자신 및 GH 자극된 펩타이드 인슐린 유사 성장 인자 I (IGF-I)포함하는 GH 축(axis)이 정상 및 종양 조직 모두의 성장을 자극할 수 있는 것으로 알려져 있다. 고형 또는 혈액학적인 인간 종양의 성장은, 적어도 통제된 실험실 환경에서, 통상적으로 GH 축을 변경시킴으로써 조절된다. In addition to the broad species specificity of GH, it is known that the GH axis, including GH itself and GH stimulated peptide insulin-like growth factor I (IGF-I), can stimulate growth of both normal and tumor tissues. The growth of solid or hematological human tumors is usually regulated by altering the GH axis, at least in a controlled laboratory environment.
hGH의 많은 자연 발생적 및 재조합적 돌연변이 또는 변이체가 알려져 있고 본 발명에 있어서 성장 호르몬 수용체 길항제로서 적합하다. 예컨대, Kostyo 등, Biochem. Biophys. Acta, 925:314 (1987); Lewis 등,J Biol. Chem., 253:2679 (1978); Tokunaga 등, Eur.J. Biochem., 153:445 (1985); WO 91/05853; WO 92/09690; WO 92/19736; WO 92/21029; 및 WO 97/11178 참조하라. 본 명세서에 있어서, "변이체(variant)"라는 용어는 여전히 hGH 활성을 나타내며 하나 이상의 아미노산이 치환되거나 결실되어 있는 hGH의 자연 발생적 및 재조합적 유도체를 포함하는 것으로 사용된다. 한 구체예에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 참조로서 포함되어 있는 WO 97/11178에 기재된 hGH 변이체 B2036를 본 발명의 방법에 사용한다. Many naturally occurring and recombinant mutations or variants of hGH are known and are suitable as growth hormone receptor antagonists in the present invention. See, eg, Kostyo et al., Biochem. Biophys. Acta, 925: 314 (1987); Lewis et al., J Biol. Chem., 253: 2679 (1978); Tokunaga et al., Eur. J. Biochem., 153: 445 (1985); WO 91/05853; WO 92/09690; WO 92/19736; WO 92/21029; And WO 97/11178. As used herein, the term “variant” is used to include naturally occurring and recombinant derivatives of hGH that still exhibit hGH activity and have one or more amino acids substituted or deleted. In one embodiment, as described herein, the hGH variant B2036 described in WO 97/11178, incorporated herein by reference, is used in the methods of the present invention.
상기 hGH 변이체 B2036는 다음과 같은 치환을 갖는다: The hGH variant B2036 has the following substitutions:
H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T. H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T.
WO 97/11178는 G120K 치환이 부가되어 보다 우수한 길항제 후보자를 생성할 수 있음을 기재하고 있지만, 그 위치에서의 다른 치환도 허용 가능하다. 모든 아미노산이 G120에서 치환되어 길항제를 생성할 수 있으며; 보다 바람직하게는, 상기 치환은 리신, 아르기닌, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 또는 글루타메이트이다. K168A 및 K172R 치환이 부가되어 경계면에 결합하는 호르몬-수용체 부위 1에서의 PEG화(pegylation)에 이용 가능한 부위의 수를 감소시킨다. 이와 대조적으로, G120K 치환은, 유효한 부위 2 블럭을 제공하면서, PEG화를 위한 부가의 리신을 사용 가능하도록 한다. B2036이 잔기 120에 글리신을 복귀시켜, 852d와 같은 다른 유도체와 비교할 때, 인간에서 항원성(antigenicity)을 감소시킬 것으로 기대되는 작용제(agonist)로서 사용되기 위한 후보자를 생성시킬 수 있을 것으로 기대된다.WO 97/11178 describes that G120K substitutions can be added to produce better antagonist candidates, but other substitutions at those positions are also acceptable. All amino acids can be substituted at G120 to yield an antagonist; More preferably, the substitution is lysine, arginine, tryptophan, tyrosine, phenylalanine, or glutamate. K168A and K172R substitutions are added to reduce the number of sites available for PEGylation at hormone-receptor site 1 that binds to the interface. In contrast, G120K substitutions make available additional lysine for PEGylation while providing an effective site 2 block. It is expected that B2036 may return glycine to residue 120 to produce candidates for use as agonists that are expected to reduce antigenicity in humans when compared to other derivatives such as 852d.
대장균 (E. coli)에서 B2036 변이체를 발현시기기 위하여 사용한 벡터는 pMY233. 플라스미드 pMY223는 잘 특징화되어 있는 플라스미드 pBR322를 기초로 한 것이며, B2036 코딩 서열이 hGH 코딩 서열을 대체하는 것을 제외하고, hGH 생산 플라스미드 pHGH4R와 유사하다 [Chang 등, Gene, 55: 189 (1987)]. pMY223는 테트라사이클린 항생제에 대한 저항성을 코딩하지만, pBR322와는 달리 B-락탐 항생제 (페니실린, 암피실린, 등)에 대하여 민감성을 갖는다.The vector used to express the B2036 variant in E. coli was pMY233. Plasmid pMY223 is based on the well characterized plasmid pBR322 and is similar to the hGH producing plasmid pHGH4R except that the B2036 coding sequence replaces the hGH coding sequence [Chang et al., Gene, 55: 189 (1987)]. . pMY223 codes for resistance to tetracycline antibiotics, but unlike pBR322, it is sensitive to B-lactam antibiotics (penicillin, ampicillin, etc.).
야생형 인간 성장 호르몬 서열 및 pMY223에 의하여 코딩되는 B2036 변이체 간의 아미노산 차이를, 이들 부위에서의 코돈과 함께, 다음에 나태내었다. Amino acid differences between the wild type human growth hormone sequence and the B2036 variant encoded by pMY223 are shown next, along with codons at these sites.
야생형 아미노산 아미노산 # B2036 아미노산 B2036 코돈Wild-type Amino Acid Amino Acid # B2036 Amino Acid B2036 Codon
His 18 Asp GAC His 18 Asp GAC
His 21 Asn AAC His 21 Asn AAC
Gly 120 Lys AAG Gly 120 Lys AAG
Arg 167 Asn AAC Arg 167 Asn AAC
Lys 168 Ala GCG Lys 168 Ala GCG
Asp 171 Ser AGC Asp 171 Ser AGC
Lys 172 Arg AGG Lys 172 Arg AGG
Glu 174 Ser AGC Glu 174 Ser AGC
Ile 179 Thr ACC Ile 179 Thr ACC
구체적인 제조예를 포함하여, B2036 변이체의 보다 상세한 사항이 본 명세서에 참조로서 포함되어 있는 WO 97/11178에 개시되어 있다. More details of the B2036 variant, including specific preparation examples, are disclosed in WO 97/11178, which is incorporated herein by reference.
한 구체예에 있어서, 성장 호르몬 수용체 길항제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변이된 성장 호르몬이다. 본 명세서에 있어서, "폴리에틸렌 글리콜 변이된 (polyethylene glycol modified)","PEG 변이된 (PEG-modified)" 및 "PEG화된 (pegylated)"이란 용어는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜기가 공유적으로 결합되어 있는 성장 호르몬을 의미하는 동의어로 사용된다. In one embodiment, the growth hormone receptor antagonist is polyethylene glycol (PEG) mutated growth hormone. As used herein, the terms "polyethylene glycol modified", "PEG-modified" and "PEGylated" refers to growth in which one or more polyethylene glycol groups are covalently bound. It is used as a synonym for hormone.
성장 호르몬 수용체 길항제는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜기에 공유적으로 부착되거나 접합되어 있을 수 있다. 이러한 접합은 비변형된 성장 호르몬보다 큰 실 분자량을 갖는 성장 호르몬 접합체를 생산한다. 본 명세서에 있어서, "실 분자량 (actual molecular weight)"이란 용어는, 예컨대, 질량 분석기 [예컨대, 고분해능 매트릭스 보조 레이져 이온화 질량 분석기 (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry)]에 의하여 측정된 분자량을 의미하는 것으로 사용된다. 예컨대, hGH 변이체 접합체의 실 분자량은 일반적으로 약 30 kD 이상이며, 바람직하게는 약 35 kD 내지 약 55 kD 범위이고, 보다 바람직하게는 약 40 kD 내지 약 50 kD 범위이다. 일반적으로, hGH 변이체 접합체의 실 분자량은 100 kD을 넘지 않는다. Growth hormone receptor antagonists may be covalently attached or conjugated to one or more polyethylene glycol groups. This conjugation produces growth hormone conjugates that have a greater net molecular weight than unmodified growth hormone. As used herein, the term "actual molecular weight" refers to a molecular weight measured by, for example, a mass spectrometer (e.g., a high resolution matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry). It is used to. For example, the actual molecular weight of hGH variant conjugates is generally at least about 30 kD, preferably in the range of about 35 kD to about 55 kD, and more preferably in the range of about 40 kD to about 50 kD. In general, the actual molecular weight of the hGH variant conjugate does not exceed 100 kD.
폴리에틸렌 글리콜은, 리신 잔기를 포함하여, 하나 이상의 아미노산 잔기에서 성장 호르몬 분자와 접합할 수 있다. 선형 또는 분지된 사슬을 갖는 하나 이상의 부가적인 수용성 폴리(알킬렌 산화물) 폴리머를 폴리에틸렌 글리콜에 부가하여 사용할 수 있지만, 폴리에틸렌 글리콜을 단독으로 사용하는 것이 바람직하다. PEG의 평균 분자량은 약 500 달톤(Da) 내지 약 30,000 달톤이며, 바람직하게는, 약 1,000 내지 약 25,000 Da이며, 보다 바람직하게는, 약 4,000 내지 약 20,000 Da이다. 한 구체예에 있어서, 평균 분자량이 약 5,000 Da인 PEG [이하 "PEG(5000)"]를 사용하여 PEG화를 수행한다. 다른 구체예에 있어서, 평균 분자량이 약 20,000 Da인 PEG를 사용하여 PEG화를 수행한다. Polyethylene glycols can be conjugated with growth hormone molecules at one or more amino acid residues, including lysine residues. One or more additional water soluble poly (alkylene oxide) polymers having linear or branched chains may be used in addition to the polyethylene glycol, although preference is given to using polyethylene glycol alone. The average molecular weight of PEG is about 500 Daltons (Da) to about 30,000 Daltons, preferably about 1,000 to about 25,000 Da, more preferably about 4,000 to about 20,000 Da. In one embodiment, PEGylation is performed using PEG (hereinafter “PEG (5000)”) having an average molecular weight of about 5,000 Da. In another embodiment, PEGylation is performed using PEG with an average molecular weight of about 20,000 Da.
한 구체예에 있어서, 1 개 내지 6 개의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 접합된 성장 호르몬의 생산을 최대화하기 위하여 반응 조건을 조절할 수 있으며, 다른 보다 바람직한 구체예에 있어서, 1 개 내지 5 개의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 접합된 성장 호르몬의 생산을 최대화하기 위하여 반응 조건을 조절할 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 1 개의 PEG 분자에 접합된 성장 호르몬의 생산을 최대화하기 위하여 반응 조건을 조절할 수 있다. 이러한 구체예들의 변형으로, 분지된 사슬의 PEG를 사용할 수 있다. In one embodiment, the reaction conditions may be adjusted to maximize the production of growth hormone conjugated to one to six polyethylene glycol molecules, and in another more preferred embodiment, conjugated to one to five polyethylene glycol molecules. The reaction conditions can be adjusted to maximize production of the growth hormone. In another embodiment, the reaction conditions can be adjusted to maximize the production of growth hormone conjugated to one PEG molecule. As a variation of these embodiments, branched chain PEG can be used.
상업적으로 구입 가능하고 본 발명의 사용에 적합한 PEG 제제는 평균 분자량에 따라 판매되는 비동종(nonhomnogeneous) 제제이다. 예컨대, PEG (5000) 제제는 통상 일반적으로 ± 500 Da 정도 범위에서 약간 상이한 분자량을 갖는 분자를 함유한다. PEG formulations that are commercially available and suitable for use in the present invention are nonhomnogeneous formulations sold according to average molecular weight. For example, PEG (5000) formulations typically contain molecules having slightly different molecular weights, typically in the range of about ± 500 Da.
단백질을 PEG화시키기 위한 다양한 방법이 개시된 바 있다. 예컨대, 다수의 호르몬과 효소가 PEG 및 폴리프로필렌 글리콜과 접합하여 생리적으로 활성인 비면역원성 조성물을 생산하는 것을 기재하고 있는 미국 특허 제4,179,337호 (Davis 등)를 참조하라. 일반적으로, 하나 이상의 말단 하이드록시기가 커플링제와 반응하여 말단 반응기를 갖는 활성화된 PEG를 형성한다. 그리고 나서, 이러한 반응기는 단백질의 α- 및 ε-아민과 반응하여 공유 결합을 형성한다. 편의적으로, PEG 분자의 다른 말단을 메톡시기와 같은 비반응성 화학기로 "차단(blocked)"시켜 단백질 분자의 PEG 가교된 복합체의 형성을 감소시킬 수 있다. Various methods have been disclosed for PEGylating proteins. See, for example, US Pat. No. 4,179,337 (Davis et al.), Which describes a number of hormones and enzymes conjugated with PEG and polypropylene glycol to produce physiologically active non-immunogenic compositions. In general, one or more terminal hydroxyl groups react with the coupling agent to form an activated PEG having a terminal reactor. This reactor then reacts with the α- and ε-amines of the protein to form covalent bonds. Conveniently, the other end of the PEG molecule can be "blocked" with a non-reactive chemical group, such as a methoxy group, to reduce the formation of PEG crosslinked complexes of the protein molecule.
hGH 또는 hGH 변이체의 PEG화를 위하여, 활성화된 PEG는 부위 1 결합 활성을 파괴하지 않는 조건 하에서 변이체와 반응할 수 있는 것이다. 작용제 hGH 변이체에 있어서, 부위 2 결합 활성 또한 보호될 수 있다. 게다가, 작용제 및 길항제 hGH 변이체에 있어서, 접합체 내로 독성 연결기(linking group)를 도입시키는 활성화된 PEGs가 일반적으로 회피될 수 있다. 적합한 활성화된 PEGs는 많은 통상적인 반응에 의하여 생산 가능하다. 예컨대, PEG의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (M-NHS-PEG)를, Buckmann 등의 Makromol. Chem., 182:1379 (1981)의 방법에 따라서, N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC)와 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)와의 반응에 의하여 PEG-모노메틸 에테르 (Union Carbide로부터 상업적으로 입수 가능)로부터 제조할 수 있다. 또한, 예컨대, 티오닐 브로마이드과 반응하여 PEG-Br을 형성한 후 과량의 암모니아로 아민 첨가 분해 반응(aminolysis)시켜 PEG-NH2를 형성하는 반응에 의하여, PEG 말단 하이드록시기를 아미노기로 변환시킬 수 있다. 그리고 나서, Woodward's Reagent K과 같은 표준 커플링 시약을 사용하여 PEG-NH2를 원하는 성장 호르몬에 접합시킬 수 있다. 또한, 예컨대, MnO2로 산화사킴으로써, PEG 말단 -CH2OH기를 알데하이드기로 변환시킬 수 있다. 시아노보로하이드라이드와 같은 시약을 사용하는 환원성 알킬화에 의하여 알데하이드기를 단백질에 접합시켰다.For PEGylation of hGH or hGH variants, activated PEG is one capable of reacting with a variant under conditions that do not destroy site 1 binding activity. For agonist hGH variants, site 2 binding activity may also be protected. In addition, for agonist and antagonist hGH variants, activated PEGs that introduce toxic linking groups into the conjugate can generally be avoided. Suitable activated PEGs can be produced by many conventional reactions. For example, N-hydroxysuccinimide ester of PEG (M-NHS-PEG) is described by Makromol. According to the method of Chem ., 182: 1379 (1981), PEG-monomethyl ether (Union) by reaction of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) with N-hydroxysuccinimide (NHS) Commercially available from Carbide). In addition, the PEG terminal hydroxyl group may be converted into an amino group by, for example, reacting with thionyl bromide to form PEG-Br, followed by aminolysis with an excess of ammonia to form PEG-NH 2. Standard coupling reagents such as Woodward's Reagent K can then be used to conjugate PEG-NH2 to the desired growth hormone. Further, for example, by oxidation with MnO 2 sakim, it is possible to convert an aldehyde PEG terminal -CH 2 OH group. The aldehyde group was conjugated to the protein by reductive alkylation using a reagent such as cyanoborohydride.
대안적으로, 본 발명에 사용하기 적합한 활성화된 PEGs를 많은 제조사로부터 구입할 수 있다. 예컨대, Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL)는, 메톡시-PEG의 숙신이미딜 카보네이트 ("SC-PEG")와 메톡시-PEG 숙신이미딜 프로피오네이트 ("SPA-PEG"; 이하 "M-SPA-PEG"라고 칭하며, 이는 메톡시 차단기의 존재를 의미한다) 이외에도, "SCM-PEG"로서 M-NHS-PEG를 시판한다. Shearwater Polymers사는 또한 두 개의 10,000 D 사슬을 갖는 분지된 사슬 PEG (이하, "NHS-PEG2 (20,000)")를 시판한다. Alternatively, activated PEGs suitable for use in the present invention can be purchased from many manufacturers. See, eg, Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL) refers to succinimidyl carbonate ("SC-PEG") of methoxy-PEG and methoxy-PEG succinimidyl propionate ("SPA-PEG"; hereafter referred to as "M-SPA-PEG"). Which means the presence of a methoxy blocker), in addition to M-NHS-PEG as "SCM-PEG". Shearwater Polymers also markets a branched chain PEG with two 10,000 D chains (hereinafter “NHS-PEG2 (20,000)”).
특히 PEG화되지 않은 해당 성장 호르몬과 비교하여, 예컨대 폐 경로를 통하여 전달시, 성장 호르몬의 생체 이용률, 물리 화학적 안정성 및/또는 순환 반감기를 바람직하게 증가시키기 위하여, 본 발명에서의 사용을 위한 성장 호르몬의 PEG화 정도를 조절할 수 있다. Growth hormones for use in the present invention, in order to advantageously increase the bioavailability, physicochemical stability and / or circulatory half-life of growth hormones, particularly when delivered via the pulmonary route, as compared to the corresponding growth hormones not PEGylated The degree of PEGylation of can be controlled.
성장 호르몬의 PEG화 부위는 또한 다양한 일차 아민의 반응성에 의하여 다소 억제된다. 예컨대, B2036 변이체 (K41)의 부위 1 호르몬-수용체 결합 계면의 잠재적 리신은 N-SPA-PEG(5000)와 상대적으로 비작용성이다. 따라서, 변이체 분자당 약 4 개 내지 6 개의 PEG를 갖는 적당하게 PEG화된 B2036 변이체 제제는, 이 결합 계면에 잠재적인 PEG화 부위가 존재함에도 불구하고, 부위 1에서 hGH 수용체와 결합하는 활성을 보유한다. The PEGylation sites of growth hormone are also somewhat inhibited by the reactivity of various primary amines. For example, the potential lysine of the site 1 hormone-receptor binding interface of the B2036 variant (K41) is relatively inactive with N-SPA-PEG (5000). Thus, a moderately PEGylated B2036 variant formulation having about 4 to 6 PEGs per variant molecule retains the activity of binding to the hGH receptor at site 1, despite the presence of a potential PEGylation site at this binding interface. .
표준 돌연변이 유발 기술을 사용하여 성장 호르몬 내의 리신의 수를 변화시킬 수 있다. 따라서, 아미노산 치환이 리신을 도입하거나 또는 리신을 대체한다는 점에서, 본 발명의 hGH 변이체는 야생형 hGH 보다 많거나 적은 수의 잠재적 PEG화 부위를 포함할 수 있다. B2036 변이체는 9 개의 잠재적 PEG화 부위를 가지고 있으며, 이는 야생형 hGH 보다 1 개 적은 것이다. 또한, 리신을 도입하거나 대체하는 아미노산 치환은 잠재적 PEG 부위의 위치를 변경시킨다. 예컨대, B2036 변이체의 경우, K168A 및 K172R 치환은 호르몬-수용체 부위 1 결합 계면에서의 PRG화에 사용 가능한 부위의 수를 감소시킨다. G120를 다른 아미노산으로 대체하는 것은 부위 2에서의 hGH 결합을 파괴하여 상기 분자를 hGH 길항제로 변환시킨다. 이 위치에서 글라이신을 리신으로 치환하는 것은 부위 2에 추가적인 잠재적 PEG화 부위를 제공하며, 이는 이 부위에서의 모든 잔기의 결합을 감소시킬 것으로 예상된다. PEG화의 정도 및 부위는 또한, pH 뿐 아니라 활성화된 PEG 및 단백질의 상대 농도와 같은 반응 조건을 조절함으로써 조작될 수 있다. 소망하는 PEG화 정도를 위한 적절한 조건은 실험적으로 결정 가능하다. Standard mutagenesis techniques can be used to vary the number of lysines in growth hormone. Thus, in the sense that amino acid substitutions introduce lysine or replace lysine, the hGH variants of the invention may comprise more or less potential PEGylation sites than wild type hGH. The B2036 variant has nine potential PEGylation sites, one less than wild type hGH. In addition, amino acid substitutions that introduce or replace lysine alter the position of the potential PEG moiety. For example, for the B2036 variant, K168A and K172R substitutions reduce the number of sites available for PRGation at the hormone-receptor site 1 binding interface. Replacing G120 with another amino acid disrupts hGH binding at site 2, converting the molecule into an hGH antagonist. Substitution of glycine with lysine at this position provides an additional potential PEGylation site at site 2, which is expected to reduce the binding of all residues at this site. The degree and site of PEGylation can also be manipulated by adjusting reaction conditions such as the pH as well as the relative concentrations of activated PEG and protein. Appropriate conditions for the desired degree of PEGylation can be determined experimentally.
B2036와 같은 hGH 변이체의 PEG화는 모든 편리한 방법에 의하여 수행할 수 있다. 이러한 유형의 상업적으로 입수 가능한 제품에는 페그비소만트(Pegvisomant) 등이 있다. 하나의 대표적인 예에 있어서, hGH 변이체를 H-SPA-PEG(5000)으로 PEG화시킨다. 간단히 말해서, 실온에서 교반하면서 고형 SPA-PEG (5000)를 hGH 수용액에 첨가한다. 통상적으로, 반응이 수행될 pH (일반적으로 약 pH 4-10)에 가까운 pK를 갖는 완충제로 상기 수용액을 완충시킨다. pH 7.5에서의 PEG화에 적합한 완충제에는, 예컨대, HEPES, 포스페이트, 보레이트, Tris-HCI, EPPS 및 TES 등이 있다. pH를 계속적으로 모니터링하고 필요한 경우 조정한다. 반응을 약 1 시간 내지 약 2 시간 동안 지속시킨다. 그리고 나서, 반응 생성물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피하여 PEG화된 hGH 변이체의 모든 고분자량 복합체 및 유리 H-SPA-PEG (5000)로부터 PEG화된 hGH 변이체를 분리한다. 고분자량 복합체는 차단되지 않은(unblocked) PEG가 분자 양쪽 말단에서 활성화되어 hGH 변이체 분자를 가교시킬 때 형성된다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피 동안의 조건은 유리 M-SPA-PEG (5000)는 컬럼에 전개되는 반면, 모든 가교된 PEG화된 hGH 변이체 복합체는 하나 이상의 PEG기에 접합된 하나의 hGH 변이체 분자를 함유하는 소망하는 형태 후에 용출하도록 하는 것이다. 적합한 조건은 소망하는 접합체에 대한 가교된 복합체의 상대적 크기에 따라 달라지며, 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 결정할 수 있다. 소망하는 접합체를 함유하는 용출물(eluent)을 한외여과(ultrafiltration)에 의하여 농축하고 투석여과(diafiltration)에 의하여 탈염시킨다. PEGylation of hGH variants such as B2036 can be carried out by any convenient method. Commercially available products of this type include Pegvisomant. In one representative example, hGH variants are PEGylated with H-SPA-PEG (5000). In short, solid SPA-PEG (5000) is added to the hGH aqueous solution while stirring at room temperature. Typically, the aqueous solution is buffered with a buffer having a pK close to the pH at which the reaction will be carried out (generally about pH 4-10). Suitable buffers for PEGylation at pH 7.5 include, for example, HEPES, phosphate, borate, Tris-HCI, EPPS and TES. Continuously monitor pH and adjust if necessary. The reaction is continued for about 1 hour to about 2 hours. The reaction product is then hydrophobic interaction chromatography to separate PEGylated hGH variants from all high molecular weight complexes of PEGylated hGH variants and free H-SPA-PEG (5000). High molecular weight complexes are formed when unblocked PEG is activated at both ends of the molecule to crosslink hGH variant molecules. Conditions during hydrophobic interaction chromatography allow free M-SPA-PEG (5000) to develop on the column, while all crosslinked PEGylated hGH variant complexes contain one hGH variant molecule conjugated to one or more PEG groups. To elute after form. Suitable conditions depend on the relative size of the crosslinked composite to the desired conjugate and can be readily determined by one of ordinary skill in the art. The eluent containing the desired conjugate is concentrated by ultrafiltration and desalted by diafiltration.
이러한 제제는 hGH 변이체의 각 분자당 3 개 내지 6 개의 PEG기를 갖는 PEG-hGH 변이체 접합체의 이종 혼합물을 나타낸다. 한 구체예에 있어서, 이러한 혼합물을 PEG화된 hGH 변이체의 이종 제제를 보다 많이 생산하는 추가적 정제 단계를 거치게 할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 혼합물을 양이온 교환 크로마토그래피하여 PRG화 정도에 따라서 PEG화된 hGH 변이체를 분리할 수 있다. Such agents represent heterogeneous mixtures of PEG-hGH variant conjugates with 3 to 6 PEG groups per molecule of hGH variants. In one embodiment, such mixtures may be subjected to additional purification steps to produce more heterogeneous formulations of PEGylated hGH variants. More specifically, the mixture may be subjected to cation exchange chromatography to separate PEGylated hGH variants according to PRG degree.
상기 조건은 많은 수의 PEG기를 갖는 고도로 PEG화된 hGH 변이체가 농도 구배 초기에 보다 많이 용출하도록 하는 것이다. 이러한 방법으로, 일차적으로 하나 또는 두 개의 형태를 갖는 PEG화된 hGH 변이체의 풀을 얻을 수 있다. 이하, PEG화된 hGH 변이체의 "형태(form)"는 특정 수의 PEG기를 갖는 PEG-hGH 변이체 접합체를 의미하는 것으로 사용된다. 따라서, PEG화된 hGH의 상이한 "형태(forms)"는 동일한 hGH 변이체에 접합하는 상이한 수의 PEG기를 갖는다. 한 대표적인 예에 있어서, 일차적으로 두 개의 형태를 함유하는, 즉, hGH 변이체 각 분자당 4 또는 5 개의 PEG를 갖는 접합체(이하, "PEG-4/5hGH 변이체 제제"라 함)인, PEG화된 hGH 변이체의 풀이 얻어진다. 그리고 나서, 이러한 풀을 농축 및 탈염하고 투여용으로 제제화할수 있다. The condition is such that highly PEGylated hGH variants with a large number of PEG groups elute more at the beginning of the concentration gradient. In this way, it is possible to obtain a pool of PEGylated hGH variants having primarily one or two forms. Hereinafter, “form” of PEGylated hGH variants is used to mean PEG-hGH variant conjugates having a certain number of PEG groups. Thus, different "forms" of PEGylated hGH have different numbers of PEG groups conjugated to the same hGH variant. In one representative example, a PEGylated hGH that is primarily a conjugate containing two forms, i.e., a conjugate having 4 or 5 PEGs per molecule of the hGH variant (hereinafter referred to as "PEG-4 / 5hGH variant formulation"). A pool of variants is obtained. This pool can then be concentrated and desalted and formulated for administration.
본 발명에 사용되기 위한 PEG화된 hGH 변이체를 함유하는 조성물은 이종적, 즉, 몇 가지 또는 많은 PEG-hGH 형태를 함유하거나, 동종적, 즉, 단일 PEG-hGH 형태를 함유할 수 있다. 통상적으로, 상기 조성물은 적어도 70 % 이상의 하나 또는 두 개의 형태의 PEH-hGH 변이체 접합체를 함유하는 것이 바람직하며, 적어도 80 % 이상의 하나 또는 두 개의 형태를 함유하는 것이 보다 바람직하며, 적어도 90 % 이상의 하나 또는 두 개의 형태를 함유하는 것이 보다 더 바람직하다. Compositions containing PEGylated hGH variants for use in the present invention may contain heterogeneous, ie several or many, PEG-hGH forms or homogeneous, ie, single PEG-hGH forms. Typically, the composition preferably contains at least 70% or more of one or two forms of PEH-hGH variant conjugate, more preferably at least 80% or more, and at least 90% or more Or more preferably two forms.
성장 호르몬 수용체 길항제의 PEG화된 형태가 본 발명의 사용에 적합한 반면, 성장 호르몬 수용체 길항제의 PRG화되지 않은 형태를 사용하는 것 또한 동일하게 본 발명의 방법 및 조성물의 범위 내이다. While PEGylated forms of growth hormone receptor antagonists are suitable for use in the present invention, the use of non-PRGylated forms of growth hormone receptor antagonists is equally within the scope of the methods and compositions of the present invention.
이 발명이 속하는 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자는 항종양제와 성장 호르몬 수용체 길항제 투여에 사용될 수 있는 다양한 방법을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 한 구체예에 있어서, 항종양제를 비경구적, 국부적 또는 전신적으로 투여한다. 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 성장 호르몬 수용체 길항제를 폐 전달, 비경구적, 국부적 또는 전신적, 또는 이들의 조합으로 투여한다. 비경구적 투여의 예는 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 및 복막내 투여를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 비경구적 투여는 지속적인 주입 (예컨대, 삼투 펌프와 같은 미니펌프를 사용) 또는 예컨대, 정맥내 또는 피하적 수단을 이용하는 주사에 의할 수 있다. 한 구체예에 있어서, 상기 성장 호르몬 수용체 길항제 및/또는 항종양제를 피하 투여한다. 상기 투여는 또한 단일 환약으로서 또는 서방성(slow-release) 디포트 제제에 의할 수 있다. 성장 호르몬 수용체 길항제는 또한 액체 또는 고체 형태로 폐 경로를 통하여 전달할 수 있다. 성장 호르몬 수용체 작용제의 PEG화된 형태는 이러한 구체예에 사용하기에 적합하다. 한 구체예에 있어서, PEG화된 성장 호르몬을 소적 또는 입자가 지름이 약 1 내지 약 3 마이크론의 크기를 갖는 미세 액체 에어로졸 형태로 전달한다. 상기 액체 에어로졸을 성장 호르몬 수용체 길항제의 액체 제제로부터 형성하며, 이는 또한 동결 건조된 분말을 물에 풀어서(reconstitution) 형성할 수 있다. 또한, 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 성장 호르몬 수용체 길항제와 항종양제를 함께 또는 개별적으로 투여할 수 있음을 알 것이다. One of ordinary skill in the art will recognize a variety of methods that can be used to administer antitumor and growth hormone receptor antagonists. In one embodiment of the invention, the antitumor agent is administered parenterally, locally or systemically. In another embodiment of the invention, the growth hormone receptor antagonist is administered in pulmonary delivery, parenteral, local or systemic, or a combination thereof. Examples of parenteral administration include, but are not limited to, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, and intraperitoneal administration. Parenteral administration can be by continuous infusion (eg using a minipump such as an osmotic pump) or by injection using eg intravenous or subcutaneous means. In one embodiment, the growth hormone receptor antagonist and / or antitumor agent is administered subcutaneously. The administration can also be as a single pill or by a slow-release depot preparation. Growth hormone receptor antagonists can also be delivered through the lung pathway in liquid or solid form. PEGylated forms of growth hormone receptor agonists are suitable for use in this embodiment. In one embodiment, the PEGylated growth hormone is delivered in the form of a fine liquid aerosol in which the droplets or particles have a size of about 1 to about 3 microns in diameter. The liquid aerosol is formed from a liquid formulation of growth hormone receptor antagonist, which can also be formed by reconstitution of the lyophilized powder in water. Those skilled in the art will also appreciate that the growth hormone receptor antagonist and antitumor agent may be administered together or separately.
항종양제 및 성장 호르몬 수용체 길항제를 치료적 유효량으로 개체에게 투여한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 이들 화합물의 투여량과 투약 계획이 항종양제의 효과, 투여 방법, 환자의 연령 및 체중, 치료할 증상의 경중 등과 같은 몇 가지 인자에 따라서 달라진다는 것을 알 것이다. 이는 당업자의 기술 범위내로 간주되며, 최적의 투약을 결정하기 위한 성분에 대한 기존의 문헌을 검토할 수 있다. Antitumor and growth hormone receptor antagonists are administered to the subject in a therapeutically effective amount. Those skilled in the art will appreciate that the dosage and dosage regimen of these compounds will depend on several factors such as the effectiveness of the antitumor agent, the method of administration, the age and weight of the patient, the severity of the symptoms to be treated, and the like. Will know. This is considered to be within the skill of one of ordinary skill in the art and one can review existing literature on ingredients for determining the optimal dosage.
본 명세에 있어서, "약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)"은 그 특성 및/또는 물질이 약리학/독성학적 관점에서 환자에게 인용 가능하고, 조성, 제제화, 안정성, 환자의 용인 가능성 및 생체 이용률과 관련하여 물리/화학적관점에서 의약 조제사들에게 인용 가능한 것을 의미하는 것으로 사용된다. In the present specification, "pharmaceutically acceptable" means that the properties and / or substances are quotable to the patient from a pharmacological / toxicological point of view, and that the composition, formulation, stability, patient acceptability and bioavailability In this context it is used as meaning something that can be quoted to pharmaceutical formulators from a physical / chemical point of view.
항종양제는 종종 제곱 미터(m2)의 체표면적(BSA)에 의하여 분량된다. BSA는 두 가지 이유 때문에 계산의 기준으로서 체중보다 자주 선택된다. 첫 번째는, BSA가 특정 약물에 대하여 보다 정확한 활성 및 독성의 종간(cross-species) 비교를 제공하는 것으로 나타났다는 것이다. 두 번째는, BSA가 간과 신장으로의 혈류를 결정하여 약물 배출에 영향을 주는 심박출량(cardiac output)과 보다 밀접하게 상호 관련될 수 있다는 것이다. 비 제한적인 의미로서, BSA의 대표적인 평균값은 대략 다음과 같다: 성인 남자: 1.9 m2; 성인 여자: 1.6 m2; 9 세 어린이: 1.07 m2 ; 10 세 어린이: 1.14 m2; 및 12-13 세 어린이: 1.33 m2. 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 수치가 단지 일반적인 기준에 지나지 않음을 잘 알 것이며, 이들의 능력 내의 기술을 사용하여 상기 수치의 편차를 결정할 수 있을 것이다. 투여량은, 예컨대, 각 투여당 약 50 내지 약 500 mg/m2 범위이며, 투약 계획의 설계는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 기술 범위내이다.Antitumor agents are often divided by the body surface area (BSA) in square meters (m 2 ). BSA is often chosen over weight as a basis for calculation for two reasons. The first is that BSA has been shown to provide more accurate cross-species comparisons of activity and toxicity for certain drugs. Second, BSA can more closely correlate with cardiac output, which affects drug release by determining blood flow to the liver and kidneys. In a non-limiting sense, representative mean values of BSA are approximately: adult males: 1.9 m 2 ; Adult female: 1.6 m 2 ; 9 year old children: 1.07 m 2 ; 10 year old children: 1.14 m 2 ; And children 12-13 years old: 1.33 m 2 . Those skilled in the art will appreciate that the figures are only general criteria, and that techniques within their capabilities will be able to determine the deviation of the figures. Dosages range, for example, from about 50 to about 500 mg / m 2 for each dose, and the design of the dosage plan is within the ordinary skill in the art to which this invention belongs.
보다 구체적인 예로서, 이리노테칸을 25 mg/m2의 투여량으로 90 분에 걸쳐서 일주일에 한 번씩 4 주일 동안 정맥내 투여한 후, 2 주간의 휴지기를 갖는 투약 계획으로 이리노테칸을 투여할 수 있다. 그리고 나서, 추가적인 치료 과정을 매 6 주마다 반복할 수 있다 (4 주간 치료 후, 2 주간 휴지). 이어지는 투여량은, 주치의의 판단에 따라, 개개의 환자의 치료 용인성에 따라, 150 mg/m2의 많은 양으로 조절되거나 또는 50 mg/m2의 적은 양으로 25- mg/m2 내지 50- mg/m2의 증분으로 조절될 수 있다; 또는 이리노테칸 350 mg/m2을 90 분에 걸쳐서 3 주일마다 정맥내 투여하는 치료 계획도 적합할 수 있다.As a more specific example, irinotecan can be administered intravenously for 4 weeks once a week over 90 minutes at a dose of 25 mg / m 2 , followed by a dosing schedule with a 2-week rest period. The additional course of treatment can then be repeated every six weeks (after four weeks of treatment, two weeks off). Subsequent dosages may be adjusted in large amounts of 150 mg / m 2 or in small amounts of 50 mg / m 2 , 25- 50 mg / m 2 to 50-, depending on the treatment tolerance of the individual patient, at the discretion of the attending physician. can be adjusted in increments of mg / m 2 ; Or a treatment plan in which irinotecan 350 mg / m 2 is administered intravenously every three weeks over 90 minutes may be suitable.
일반적인 처방안으로서, 각 투여량 당 투여되는 성장 호르몬 수용체 길항제의 약학적으로 허용 가능한 총량은 환자 체중의 약 1 ㎍/kg/day 내지 약 100 mg/kg/day 범위이며, 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 수치는 치료적 재량으로 정할 수 있다. 일반적으로, 이러한 투여량은 약 0.01 내지 약 10 mg/kg/day 범위이며, 보다 일반적으로 인간의 경우 약 0.01 내지 약 1 액/kg/day 범위이다. 지속적으로 투여되는 경우, 성장 호르몬 수용체 길항제를 약 1 ㎍/kg/hour 내지 약 50 ㎍/kg/hour의 투약 속도로, 하루에 한 번 내지 4 번 주사 또는, 예컨대, 미니 펌프를 사용하는, 지속적인 피하 주입에 의하여 통상적으로 투여한다. 또한, 정맥내 백 솔루션을 사용할 수도 있다. As a general prescription, the pharmaceutically acceptable total amount of growth hormone receptor antagonist administered per dose ranges from about 1 μg / kg / day to about 100 mg / kg / day of the patient's body weight, as can be seen above. Likewise, the value can be determined at therapeutic discretion. In general, such dosages range from about 0.01 to about 10 mg / kg / day, and more generally from about 0.01 to about 1 liquid / kg / day in humans. When administered continuously, the growth hormone receptor antagonist is administered at a rate of about 1 μg / kg / hour to about 50 μg / kg / hour, one to four injections per day, or continuous, eg using a mini pump. It is usually administered by subcutaneous infusion. In addition, an intravenous bag solution may be used.
이 실시예는 항종양제, 이리노테칸의 투여와 조합하여 성장 호르몬 수용체 길항제, 페그미소만트를 투여하는 것이 이리노테칸을 단독으로 투여하는 경우와 비교하여 이리노테칸의 치료 효과가 상당히 개선됨을 보여준다. 단독 및 복합 투여시의 페그비소만트 및 이리노테칸의 효과를 BALB/c 마우스의 비장에 주입된 CT-26 세포 (마우스 결장 암종 세포주) 상에서 평가하였다. 이러한 모델은 일차적 종양 (비장) 및 간 전이에 대한 치료 효능의 평가를 가능하게 한다. This example shows that administration of a growth hormone receptor antagonist, pegmysomant, in combination with administration of an anti-tumor agent, irinotecan, significantly improves the therapeutic effect of irinotecan compared to the administration of irinotecan alone. The effects of pegbisomant and irinotecan, both alone and in combination, were evaluated on CT-26 cells (mouse colon carcinoma cell line) injected into the spleen of BALB / c mice. This model enables the evaluation of the therapeutic efficacy against primary tumors (spleen) and liver metastases.
성장 호르몬 수용체 길항제Growth hormone receptor antagonists
페그비소만트는 각각의 평균 분자량이 약 5,000 Da인 폴리에틸렌 글리콜 분자를 평균적으로 약 5 개 내지 약 5 개 함유하는, 통상적인 인간 성장 호르몬의 PEG 변형된 191 아미노산 잔기 유사체, 특히 B2036를 포함한다. 상기 B2036 단백질은, 상기한 바와 같이, hGH 골격(backbone)의 아미노산 잔기를 교환하여 hGH 수용체의 길항제로서 작용하도록 설계된다. 상기 PEG 관련 B2036 단백질이 hGH와 동일한 수의 아미노산 잔기를 갖기 때문에, 이러한 PEG 관련 단백질을 PEG 관련 hGH의 변이체 모형이라고 간주할 수 있다. Pegbisomants include PEG modified 191 amino acid residue analogs of conventional human growth hormone, in particular B2036, containing on average about 5 to about 5 polyethylene glycol molecules each having an average molecular weight of about 5,000 Da. The B2036 protein is designed to act as an antagonist of the hGH receptor by exchanging amino acid residues in the hGH backbone, as described above. Since the PEG-related B2036 protein has the same number of amino acid residues as hGH, such PEG-related protein can be considered a variant model of PEG-related hGH.
세포 배양/피검 동물Cell Culture / Test Animal
CT-26 세포 (마우스 결장 암종)를 10 % 우태혈청(fetal bovine serum)을 함유하는 DMEM에서 세포가 약 50 % 융합할 때까지 세포를 배양하였다. 트립신을 사용하여 부착 세포를 조직 배양 플라스크의 표면으로부터 끌어올렸다. 그리고 나서, 세포를 세척하고 Hank's 완충 살린 용액에 현탁시켰다. 5-8 주령의 BALB/c 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 본 실시예에 사용하였다. 우선, 좌측 옆구리 절개법을 사용하여 비장을 동원하였다. CT-26 세포를 직접적으로 비장에 주입하였다 (생존 세포수: 1x104, 총부피: 0.05 ml). 나선상 클립을 사용하여 절개부위를 봉합하였다. 이는 공통 유전형(syngenic) 결장 암 모형이며, 숙주 동물은 면역 타협(immunocompromised)되지 않았다.The cells were cultured until CT-26 cells (mouse colon carcinoma) were fused about 50% in DMEM containing 10% fetal bovine serum. Trypsin was used to draw adherent cells from the surface of the tissue culture flask. Cells were then washed and suspended in Hank's buffered saline solution. 5-8 week old BALB / c mice (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) were used in this example. First, the spleen was mobilized using the left flank incision. CT-26 cells were injected directly into the spleen (viable cell number: 1 × 10 4 , total volume: 0.05 ml). A spiral clip was used to close the incision. This is a common syngenic colon cancer model and the host animal has not been immunocompromised.
치료cure
담체 (살린) 단독, 하루에 한 번씩 페그비소만트 (3.33, 5.0, 또는 10.0 mg) 피하 주사액, 이리노테칸 (100 mg/kg, 접종일 후 7, 14, 21일)과 살린, 또는 이리노테칸 및 페그비소만트의 배합물로 마우스를 치료하였다. 추가적인 실험에 있어서, 하루에 두 번씩 옥트레오타이드(octreotide) 주사액을 피하 투여하였다. 투베르쿨린 주사기 상의 25-게이지 바늘을 사용하여 비장 주입으로부터 나선형 클립의 반대쪽 옆구리 상에 주사액을 투여하였다. Carrier (saline) alone, once daily Pegbisomant (3.33, 5.0, or 10.0 mg) subcutaneous injection, irinotecan (100 mg / kg, 7, 14, 21 days after inoculation) and saline, or irinotecan and peg Mice were treated with a combination of arsenic. In a further experiment, octreotide injections were administered subcutaneously twice a day. Injections were administered on the opposite flank of the helical clip from spleen infusion using a 25-gauge needle on a tuberculin syringe.
종양 수집Tumor collection
24 일째에 마우스를 희생시켰다. 일차적 종양 (비장), 전이 종양 존재량 (간 중량) 및 평균 간 전이 수를 측정하였다. 표준 t-테스트를 사용하여 치료군을 비교하였다. 담체 및 이리노테칸과 비교하여 P < 0.05.Mice were sacrificed on day 24. Primary tumors (spleen), metastatic tumor abundance (liver weight) and average liver metastases were measured. Standard t-tests were used to compare treatment groups. P <0.05 compared to carrier and irinotecan.
혈청 IGF-1 분석Serum IGF-1 Analysis
마우스 혈청 IGF-1을 산-에탄올 추출 후 방사 면역 측정법 (radioimmunoassay, RIA)을 사용하여 측정하였다. 간단히 말해서, 혈청/ 추출물 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 배양하고, 원심분리하고, 분석을 위하여 상청액을 1:200으로 희석하였다. 폴리클로날 래빗 항체 (Nicohls Institute, San Juan Capistrano, CA)를 사용하여 RIA에 의하여 IGF-I 농도를 측정하였다. 재조합 인간 IGF-I (Amersham International, Bucks, UK)으로 상기 분석 기준이 수립되었다. Mouse serum IGF-1 was measured using radioimmunoassay (RIA) after acid-ethanol extraction. In brief, the serum / extract mixture was incubated for 2 hours at room temperature, centrifuged and the supernatant diluted 1: 200 for analysis. IGF-I concentrations were measured by RIA using polyclonal rabbit antibodies (Nicohls Institute, San Juan Capistrano, Calif.). The assay criteria were established with recombinant human IGF-I (Amersham International, Bucks, UK).
RNA-PCRRNA-PCR
Semi-quantitive 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여 수집된 종양 표본의 IGF-I 및 IGF-II 전령 RNA의 상대량을 측정하였다. 각각의 반응에서, 전체 RNA가 1 ㎍의 양으로 사용되었다. 역전사를 수행하였다. 하기의 각각의 PCT 프라이머쌍에 대한 하류 프라이머를 역전사에 있어서 유전자 특이적 프라이머로서 사용하였다. Semi-quantitive polymerase chain reaction (PCR) was performed to determine the relative amounts of IGF-I and IGF-II messenger RNA in the collected tumor samples. In each reaction, total RNA was used in an amount of 1 μg. Reverse transcription was performed. Downstream primers for each of the following PCT primer pairs were used as gene specific primers in reverse transcription.
말단 표지된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 (25 회), 아크릴아마이드 겔을 통한 전기영동에 의하여 산물을 비병합된 방사선 표지된 프라이머로부터 분리하였다. 포스포리메이저(phosphorimager)를 사용하여 각각의 개체 시료의 표적 메세지의 양을 정량하였다. 담지량(loading) 차이를 보정하기 위하여, 시료값을 β-액틴 메세지 함량에 대하여 표준화하였다. PCR was performed using terminal labeled primers (25 times) and the product was separated from non-merged radiolabeled primers by electrophoresis through acrylamide gels. Phosphorimagers were used to quantify the amount of target message in each individual sample. In order to correct the loading difference, the sample values were normalized to the β-actin message content.
도 1A-1D는 4 개의 치료군, 즉, 페그비소만트 (5.0 mg/day), 이리노테칸 (100 mg/kg 접종일 후 7, 14, 21), 및 페그비소만트+이리노테칸에서의 비장의 일차적 종양 및 간 전이 수 및 질량에 대한 치료 효과를 보여주는 것이다. 특히, 도 1A는 혈청 IGF-1 농도 (㎍/L)를 보여주는 것이고; 도 1B는 간 중량 (grams)을 보여주는 것이고; 도 1C는 일차적 종양 부피 (ccs)를 보여주는 것이고; 도 1D는 상기 4 개의 치료군에서의 간 전이 수를 보여주는 것이다. CT-26 결장 암 세포를 사용하는 실험에서 측정된 모든 파라미터에 대하여, 페그비소만트 및 이리노테칸를 사용하는 복합 치료가 이리노테칸만을 단독으로 사용하는 치료보다 우수하였다. 이리노테칸과 배합된 페그비소만트의 유리한 효과는 일차적 종양 및 간 전이 모두에서 나타난다. 페그비소만트 요법은, 특히 간에서의 전이성 질병의 발달을 억제하는 것과 관련하여, 이리노테칸 작용을 강화시킨다. 1A-1D are primary of spleen in four treatment groups: pegbisomant (5.0 mg / day), irinotecan (7, 14, 21 after 100 mg / kg inoculation day), and pegbisomant + irinotecan To show the therapeutic effect on the number and mass of tumor and liver metastases. In particular, FIG. 1A shows serum IGF-1 concentration (μg / L); 1B shows liver weights (grams); 1C shows primary tumor volume (ccs); 1D shows the number of liver metastases in the four treatment groups. For all parameters measured in experiments using CT-26 colon cancer cells, the combination treatment with pegbisomant and irinotecan was superior to the treatment with irinotecan alone. The beneficial effect of pegbisomant in combination with irinotecan is seen in both primary tumor and liver metastasis. Pegbisomant therapy enhances irinotecan action, particularly with regard to inhibiting the development of metastatic disease in the liver.
피검 동물의 희생 및 분석시에 수집된 혈청의 IGF-I 농도(㎍/L)에 대한 평균치±표준 오차는 다음과 같다: (혈청) 87.6±9.1, (페그비소만트) 50±5.3, (이리노테칸) 128.6±5.9, (페그비소만트+이리노테칸) 53±2.9. 종양 존재량이 없는 마우스의 기준선 값은 약 200 ㎍/L이었다. 살린군에서의 낮은 수치는 피검 동물이 희생되기 전에 상당히 진행된 질병을 앓고 있었음을 반영하는 것으로 보인다. Mean ± standard error for IGF-I concentration (μg / L) of serum collected at sacrifice and analysis of the test animals is as follows: (serum) 87.6 ± 9.1, (Pegbisomant) 50 ± 5.3, ( Irinotecan) 128.6 ± 5.9, (pegbisomantsant + irinotecan) 53 ± 2.9. Baseline values of mice without tumors were about 200 μg / L. Low levels in the live group appear to reflect that the subjects had a disease that advanced significantly before sacrifice.
페그비소만트 및 이리노테칸의 배합물로 치료된 10 마리 중에서, 4 마리만이 간 전이를 진행시켰다. 이는 플라시보 또는 이리노테칸 치료를 받은 경우의 전이가 진행된 피검 동물의 수의 50 % 밖에 되지 않는 수치이다. 간으로의 전이성 질병이 가장 치료하기 어려운 합병증 중 하나이고, 결장 암 사망에 크게 기여함을 감안할 때, 이러한 전이를 감소시키는 페그비소만트/이리노테칸 복합 치료 효과는 임상적으로 매우 중요하다. Of the 10 dogs treated with the combination of pegbisomant and irinotecan, only 4 advanced liver metastases. This is only 50% of the number of subjects with advanced metastases when receiving placebo or irinotecan treatment. Given that metastatic disease to the liver is one of the most difficult complications and contributes greatly to colon cancer death, the effect of pegbisomant / irinotecan combination treatment to reduce this metastasis is clinically very important.
이러한 실시예는 페그비소만트와 같은 성장 호르몬 수용체 길항제를 이리노테칸과 같은 항종양제와 함게 투여하는 것이 GH 및/또는 IGF-I에 반응하는 것으로 알려진 3 가지 유형의 종양 (결장암, 유방암 및 뇌수막종)을 앓는 동물 모형에 대하여 우수한 항종양 효과를 갖는다는 것을 보여준다. This example shows three types of tumors known to respond to GH and / or IGF-I (colon cancer, breast cancer and meningioma) when administering a growth hormone receptor antagonist such as pegbisomant with an anti-tumor agent such as irinotecan. It has been shown to have good anti-tumor effects on animal models with disease.
상기한 본 발명의 다양한 실시예들은 본 발명의 예시적 설명을 위하여 제시된 것이다. 이는 본 발명을 소모하거나 설명된 특정 형태로 제한하고자 하는 것이 아니다. 많은 대안, 변조 및 변형이 상기 기술 분양의 통상의 지식을 가진 자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 논의된 모든 대안, 변조 및 변형, 및 청구의 범위의 광의 및 정신에 속하는 다른 것들도 포함하는 것으로 해석된다. The various embodiments of the invention described above are presented for illustrative purposes of the invention. It is not intended to be exhaustive or to limit the invention to the precise forms described. Many alternatives, modifications and variations will be apparent to those of ordinary skill in the art. Accordingly, the present invention is to be construed as including all alternatives, modifications and variations discussed herein, and others within the broader and spirit of the claims.
Claims (30)
Priority Applications (1)
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| KR10-2004-7017226A KR20050016371A (en) | 2002-04-26 | 2003-04-25 | Methods and compositions for treating, preventing or delaying onset of a neoplasm |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60/375,890 | 2002-04-26 | ||
| KR10-2004-7017226A KR20050016371A (en) | 2002-04-26 | 2003-04-25 | Methods and compositions for treating, preventing or delaying onset of a neoplasm |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20050016371A true KR20050016371A (en) | 2005-02-21 |
Family
ID=41783347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2004-7017226A KR20050016371A (en) | 2002-04-26 | 2003-04-25 | Methods and compositions for treating, preventing or delaying onset of a neoplasm |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20050016371A (en) |
-
2003
- 2003-04-25 KR KR10-2004-7017226A patent/KR20050016371A/en not_active Application Discontinuation
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