KR20050010175A - Diagnosis Kits for Severe Acute Respiratory Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from SARS Corona Virus Expressed in Plants - Google Patents

Diagnosis Kits for Severe Acute Respiratory Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from SARS Corona Virus Expressed in Plants Download PDF

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KR20050010175A
KR20050010175A KR1020030049087A KR20030049087A KR20050010175A KR 20050010175 A KR20050010175 A KR 20050010175A KR 1020030049087 A KR1020030049087 A KR 1020030049087A KR 20030049087 A KR20030049087 A KR 20030049087A KR 20050010175 A KR20050010175 A KR 20050010175A
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정남준
이인희
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유제근
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Abstract

PURPOSE: Diagnostic kits for severe acute respiratory syndrome comprising nucleocapsid protein from Sars corona virus expressed in plants are provided, thereby cheaply producing the recombinant nucleocapsid protein of Sars corona virus having improved antigenicity, and diagnosing the severe acute respiratory syndrome with improved sensitivity and specificity using the nucleocapsid protein. CONSTITUTION: A plant expression vector comprises (i) a polynucleotide encoding the nucleocapsid protein of Sars corona virus of SEQ ID NO:1; (ii) a promoter which is operably linked to the polynucleotide and forms RNA molecules in a plant cell; and (iii) 3'-untranslated region causing polyadenylation of 3'-terminal of the RNA molecule. A method for producing the nucleocapsid protein of Sars corona virus from plants comprises the steps of: (a) transforming plant cells with the plant expression vector; (b) selecting a transformed plant cell; (c) regenerating the transformed plant cell into a plant to obtain a transformed plant; and (d) obtaining the nucleocapsid protein of Sars corona virus from the transformed plant. The diagnostic kit for severe acute respiratory syndrome comprises the nucleocapsid protein of Sars corona virus as an antigen.

Description

식물체에서 발현된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 중증급성호흡기증후군 진단 키트{Diagnosis Kits for Severe Acute Respiratory Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from SARS Corona Virus Expressed in Plants}Diagnosis Kits for Severe Acute Respiratory Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from SARS Corona Virus Expressed in Plants}

본 발명은 식물체에서 발현된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 중증급성호흡기증후군 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규 폴리뉴클레오타이드, 그를 포함하는 식물발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물체, 중증급성호흡기증후군의 항체 진단용 키트 및 중증급성호흡기증후군의 항체 측정 방법에 관한 것이다.The present invention relates to acute respiratory syndrome diagnostic kit comprising a nucleocapsid protein of SARS corona virus expressed in a plant, and more particularly, a novel polynucleotide encoding a nucleocapsid protein of SARS corona virus, including The present invention relates to a plant expression vector, a plant transformed by the vector, an antibody diagnostic kit for acute respiratory syndrome, and a method for measuring antibodies for acute respiratory syndrome.

중증급성호흡기증후군 (Severe Acute Respiratory Syndrom, SARS, 사스)는 2002년 11월부터 중국 광동 지역을 중심으로 발생하여 홍콩, 싱가포르, 캐나다 등 전세계로 확산된 질환으로 발열과 기침, 호흡곤란, 비정형 폐렴 등을 보이는 증후군이다.Severe Acute Respiratory Syndrom (SARS, SARS) has been around the world since November 2002, and has spread worldwide in Hong Kong, Singapore, Canada, and other countries, including fever, coughing, shortness of breath, and atypical pneumonia. Is a syndrome.

사스는 주로 비말 (작은 침방울)을 통해 전파되는 것으로 밝혀졌는데 즉 사스 환자가 기침, 재채기, 말할 때 배출되는 호흡기 비말에 의해 전파되며, 또한 환자의 체액에 오염된 물건을 통해서도 전파될 수 있는 것으로 알려졌다. 잠복기는 2-7 일로 최장 잠복기가 10 일인 것으로 밝혀졌다. 일반적으로 발열 (38℃ 이상)이 초기증상이며, 고열인 경우가 흔하며, 오한이나 경직, 두통, 전신 쇠약감, 근육통이 동반될 수 있다. 3일에서 7일 후에는 객담이 없는 마른기침, 호흡곤란, 빈호흡이 발생하여 저산소혈증 (hypoxemia)으로 진행이 된다. 환자는 2개 그룹으로 나뉘는데, 80-90% 정도의 대부분 환자는 6-7일째 증상이 호전이 되는 반면, 10% 정도의 환자는 증상이 악화되어 급성호흡곤란증후군 (acute respiratory distress syndrome)이 발생하여 기계호흡이 필요할 정도 중증으로 발전한다. 사망율은 14-15%정도이며, 연령이 많을수록 그리고 기저질환이 있을 경우에 사망률이 높다.SARS has been found to spread primarily through droplets (small droplets), that is, by respiratory droplets, which are released when a SARS patient coughs, sneezes, or speaks, and may also be transmitted through objects contaminated with the patient's body fluids. . The incubation period was found to be 2-7 days with a long incubation period of 10 days. In general, fever (38 ℃ or more) is the initial symptom, high fever is common, can be accompanied by chills, stiffness, headache, general weakness, muscle pain. After three to seven days, dry cough, shortness of breath, and empty breathing occur without sputum, leading to hypoxemia. The patients are divided into two groups, most of whom are between 80-90% of the patients with symptoms improving on 6-7 days, while about 10% of patients have worsening symptoms and develop acute respiratory distress syndrome. Develops severe enough to require mechanical breathing. The mortality rate is around 14-15%, with a higher age and higher mortality rates.

이 질환은 지금까지의 연구결과를 종합한 결과, 변종 코로나바이러스가 원인병원체로 알려졌다. 미국 질병예방통제센터 (Centers for Disease Control and Prevention, CDC)가 환자의 콩팥과 폐에서 이들을 분리해내 전자현미경으로 확인하는 데 성공하였다.Based on the results of the previous studies, the coronavirus is known to be the causative agent of the disease. The Centers for Disease Control and Prevention (CDC) has successfully isolated them from patients' kidneys and lungs and confirmed them with an electron microscope.

코로나 바이러스란 왕관 모양의 구조를 지닌 바이러스를 모두 이르는 말로 감기 바이러스 등 수십 종이 여기에 속한다. 현재까지 코로나 바이러스는 3개군 13종이 알려져 있다.Corona virus refers to a virus that has a crown-like structure, and dozens of species, including the cold virus, belong to it. To date, 13 kinds of coronaviruses are known in three groups.

코로나바이러스는 1937년 닭에서 처음 발견된 뒤 개·돼지·조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에게서도 발견되었다. 개기일식(皆旣日蝕) 때 태양의 광구(光球)가 달에 가려졌을 때 그 둘레에서 하얗게 빛나는 현상인 코로나 현상과 생김새가 비슷해 이런 이름이 붙었다. 코로나 바이러스는 사람에게는 거의 감염되지 않고 주로 개·돼지·소등의 동물에 감염되는 병원균으로 인식되어 왔다. 사람에게 감염될 때에도 호흡기 증상을 유발하는 여러 바이러스 가운데 하나로 단순한 감기를 유발하거나, 어린이의 설사 등 장 질환을 일으키는 경우가 있기는 하지만 위험성이 높지 않았다.Coronaviruses were first discovered in chickens in 1937 and then in dogs, pigs, and other animals, and in humans in 1965. When the solar eclipse was covered by the moon during the total eclipse, it was named because it had a similar appearance to the corona phenomenon, the phenomenon of white shining around it. Corona virus has been recognized as a pathogen that is hardly infected by humans but mainly by animals such as dogs, pigs and cattle. Even when infected with humans, one of several viruses that cause respiratory symptoms may cause a simple cold or a bowel disease such as diarrhea in children.

코로나 바이러스는 개·돼지·소·조류 등 일부 동물의 경우 때로 발열·호흡곤란·구토·설사·탈수 등을 유발해 치명적인 병원균으로 작용하기도 한다. 또 전염성이 강하고 다른 병원균과 결합하는 능력이 뛰어나 증상을 더욱 악화시키는 바이러스로 알려져 있다. 이런 결합 능력을 이용해 사스를 유발하는 신종 코로나 바이러스 역시 동물의 몸 속에 있던 코로나 바이러스가 변형되어 사람의 몸 속으로 들어와 질병을 일으킨 것으로 전문가들은 추정하고 있다. 즉 높은 결합률이 평범한 코로나 바이러스를 치명적인 것으로 변화시켰다는 것이다.Corona viruses sometimes cause fever, dyspnea, vomiting, diarrhea, and dehydration in some animals, such as dogs, pigs, cattle, and birds. It is also known as a virus that is highly contagious and combines with other pathogens to make symptoms worse. The new coronavirus, which uses this binding ability to cause SARS, also predicts that the corona virus in the animal's body has been altered into the human body causing disease, experts estimate. In other words, the high binding rate changed the ordinary corona virus to lethality.

연구결과 사스를 전염시키는 신종 코로나바이러스는 사향 고양이로부터 나온 것이라고 홍콩대 의과대학 바이러스 연구팀이 밝혔다. 사향고양이와 너구리에서발견된 바이러스와 사스의 코로나바이러스가 거의 100% 일치하는 것을 발견한 것이다. 남아프리카와 남아시아에 주로 분포하는 사향 고양이는 족제비 또는 고양이와 비슷하고 몸길이 60 ㎝ 가량에 꼬리는 3 0㎝ 정도이며, 회갈색 몸에 흑색 반점을 가진 식육류이다.The new coronavirus, which infects SARS, comes from musk cats, according to a virus research team at Hong Kong University School of Medicine. The virus found in muskrat and raccoon and the SARS coronavirus were found to be nearly 100% identical. Musk cats, distributed mainly in South Africa and South Asia, are similar to weasels or cats. They are 60 cm in length and 30 cm in tail, and are grayish brown with black spots.

사스 코로나 바이러스는 유전자 분석 결과 이제까지 인류가 접하지 못한 새로운 종류인 것으로 밝혀졌다. 이 경우 바이러스는 대개 치명적인 존재로 탈바꿈한다. 왜냐하면 인간은 이 돌연변이체에 대한 면역성을 갖고있지 못하기 때문이다. 이 괴질을 치료하는 방법은 현재로선 없으며, 미국 질병통제예방센터는 여러 가지 항(抗)바이러스 약품과 스테로이드 치료법 등을 동원했으나, 이 질환에 효과를 보지 못하고 있다고 밝혔다. 개·돼지 등 동물의 경우에는 이미 백신이 나와 있으나, 2003년 현재 신종 코로나 바이러스 백신은 미개발 상태이고, 효과적인 치료제도 없다.SARS coronavirus has been identified by genetic analysis as a new kind of humanity. In this case, the virus usually turns into a deadly existence. Because humans are not immune to this mutant. There is currently no way to treat this anomaly, and the US Centers for Disease Control and Prevention has mobilized various antiviral drugs and steroid treatments, but said it has no effect on the disease. Vaccines are already available for animals such as dogs and pigs, but as of 2003, the new coronavirus vaccine is underdeveloped and there is no effective treatment.

2003년 5월 미국 질병예방통제센터는 중증급성호흡기증후군의 원인균으로 유력한 변형 코로나 바이러스의 게놈(유전자 지도)을 완성했다고 발표하여 지금까지 답보상태에 머물던 사스 치료 및 예방 대책이 이번 사스 코로나 바이러스의 염기 서열 완전 해독으로 급진전을 이룰 것으로 보인다. 또 이번 발견은 사스 코로나바이러스의 발병 원인을 규명하는 데에도 크게 기여할 것으로 예상된다. 사스 코로나 바이러스의 게놈은 29700 여 개의 염기로 구성되어 있으며 지금까지 알려진 코로나 바이러스들과는 전혀 다른 종류의 것으로 판명됐다.In May 2003, the US Centers for Disease Control and Prevention announced the completion of the genome (genetic map) of a modified strain of coronavirus, a causative agent of Severe Respiratory Syndrome. It seems that radical progression will be achieved by complete sequence translation. The findings are also expected to help determine the cause of SARS coronavirus. The genome of SARS corona virus consists of 29700 bases and proved to be completely different from the known corona viruses.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, numerous citations and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited documents and patents are incorporated herein by reference in their entirety, so that the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.

본 발명자들은 사스 코로나 바이러스의 전체 유전자 중에서 항원성이 가장 우수한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 식물체에 형질전환하여 식물 형질전환체를 얻은 다음, 이로부터 분리·정제된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 항원 단백질이 바이러스와 동일한 면역학적 항원성을 나타내는 것을 확인하고, 이를 사스 코로나 바이러스에 의한 중증급성호흡기증후군을 진단하는 데 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors obtained a plant transformant by transforming a plant with a nucleocapsid protein gene having the highest antigenicity among all genes of SARS corona virus, and then the SARS corona virus nucleocapsid antigen protein isolated and purified therefrom is a virus. The present invention has been completed by confirming that it shows the same immunological antigenicity, and confirming that it can be used for diagnosing acute respiratory syndrome caused by SARS coronavirus.

따라서, 본 발명의 목적은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel polynucleotide encoding a nucleocapsid protein of SARS corona virus.

본 발명의 다른 목적은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를을 포함하는 식물발현용 벡터를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a plant expression vector comprising a novel polynucleotide encoding a nucleocapsid protein of SARS corona virus.

본 발명의 또 다른 목적은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a transgenic plant expressing the nucleocapsid protein of SARS corona virus.

본 발명의 다른 목적은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 식물 형질전환체를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a plant transformant expressing the nucleocapsid protein of SARS corona virus.

본 발명의 다른 목적은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide a method for producing a nucleocapsid protein of SARS corona virus.

본 발명의 다른 목적은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a nucleocapsid protein of SARS corona virus.

본 발명의 다른 목적은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 중증급성호흡기증후군의 항체 진단용 키트를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing antibodies of acute respiratory syndrome comprising the nucleocapsid protein of SARS corona virus as an antigen.

본 발명의 다른 목적은 중증급성호흡기증후군의 항체 측정 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide an antibody measuring method of acute respiratory syndrome.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

도 1은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 식물형질전환용 벡터의 제조과정 및 유전자 지도를 나타내는 모식도.Figure 1 is a schematic diagram showing the manufacturing process and gene map of a plant transformation vector comprising the nucleocapsid protein gene of SARS corona virus.

도 2는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자가 클로닝된 pHS737 벡터를 제한효소XbaI과BamHI로 절단하여 전기영동한 결과를 나타내는 사진. M, 1 kb DNA 래더; 레인 1,XbaI과BamHI로 절단한 pHS737 벡터; 레인 2, 삽입 서열의 PCR 산물; 및 레인 3,XbaI과BamHI로 절단한 뉴클레오캡시드 유전자를 포함하는 pHS737 벡터.Figure 2 is a photograph showing the results of electrophoresis by cleavage of the pHS737 vector cloned with nucleocapsid protein gene of SARS corona virus with restriction enzymes Xba I and Bam HI. M, 1 kb DNA ladder; Lane 1, pHS737 vector digested with Xba I and Bam HI; Lane 2, PCR product of the insertion sequence; And a pHS737 vector comprising a nucleocapsid gene cleaved with lane 3, Xba I and Bam HI.

도 3은 형질전환 식물체에서 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 PCR 분석 결과를 나타내는 사진. M, 1 kb DNA 래더; 레인 1, 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 양성 표준 플라스미드의 PCR 산물; 레인 2, 야생종 담배의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물; 및 레인 3-9, 선발된 담배 형질전환체의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물.Figure 3 is a photograph showing the results of PCR analysis of SARS coronavirus nucleocapsid protein gene in transgenic plants. M, 1 kb DNA ladder; Lane 1, PCR product of a positive standard plasmid comprising the nucleocapsid protein gene of SARS corona virus; Lane 2, PCR product based on the chromosomal DNA of wild tobacco; And lanes 3-9, PCR products based on the DNA of the selected tobacco transformants.

도 4는 형질전환 식물체에서 발현된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과 사진. M, 분자량 마커; 레인 1, 야생종 담배의 단백질; 및 레인 2, 형질전환 식물체 내 발현된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질.Figure 4 is a photograph of the results of electrophoresis of SARS coronavirus nucleocapsid protein expressed in transgenic plants on SDS-polyacrylamide gel. M, molecular weight marker; Lane 1, protein of wild tobacco; And lane 2, nucleocapsid protein of SARS corona virus expressed in the transgenic plant.

도 5는 형질전환 식물체에서 발현된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여주는 사진. M, 분자량 마커; 레인 1, 1 구간 용출액; 레인 2, 2 구간 용출액; 레인 3, 3 구간 용출액; 및 레인 4, 야생형 담배Figure 5 is a photograph showing the results of Western blot analysis of nucleocapsid protein of SARS corona virus expressed in transgenic plants. M, molecular weight marker; Lane 1, section 1 eluate; Lane 2, section 2 eluate; Lane 3, section 3 eluate; And lane 4, wild type tobacco

도 6은 형질전환 식물체에서 발현된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성을 보여주는 그래프.6 is a graph showing the antigenicity of nucleocapsid proteins of SARS corona virus expressed in transgenic plants.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부를 포함하는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a polynucleotide encoding a nucleocapsid protein of SARS corona virus comprising a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or a portion thereof.

본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 항원으로 작용할 수 있는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 것으로서, 식물체내에서의 발현을 최적화 하기 위하여 변형된 서열을 갖는다.The novel polynucleotides of the present invention encode a nucleocapsid protein of SARS corona virus that can act as an antigen and have a modified sequence to optimize expression in plants.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 디자인은 다음과 같은 기준에 의해 실시된다: (ⅰ) GC 함량을 50% 이상으로 하고, (ⅱ) 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하며, (ⅲ) 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다.The design of the polynucleotides of the invention is carried out by the following criteria: (i) to make the GC content at least 50%, (ii) to have the plant's preferred codons, and (i) to remove intron-like sequences. will be.

본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 일부의 서열도 포함한다. 즉, 상기 일부 서열에 의 해 코딩되는 아미노산 서열이 항원성을 나타내는 경우에는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함된다.The novel polynucleotides of the invention include some sequences as well as the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1. That is, when the amino acid sequence encoded by the above partial sequence shows antigenicity, it is included in the polynucleotide of the present invention.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides an antibody comprising (i) the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or a portion thereof; (Ii) a promoter operably linked to the polynucleotide of (iii) and acting on plant cells to form RNA molecules; And (iii) a 3'-non-detoxification site that acts on plant cells to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 형질전환을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 쌀 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, a promoter suitable for the present invention can be used any conventionally used in the art for the transformation of plants, for example, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter , Nopaline synthase (nos) promoter, pigwarm mosaic virus 35S promoter, sugacran basilisform virus promoter, commelina yellow mottle virus promoter, ribulose-1,5-bis-phosphate carboxylase small sub Photoinduced promoter of ssRUBISCO, rice cytosol triosphosphate isomerase (TPI) promoter, adenine phosphoribosyltransferase (APRT) promoter of arabidopsis and octopine synthase promoter.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al.,Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the 3'-non-detoxification site causing the polyadenylation suitable for the present invention is derived from the nopalin synthase gene of Agrobacterium turmeration (nos 3 'end) ( Bevan et al., Nucleic Acids Research , 11 (2): 369-385 (1983)), derived from the Octopine synthase gene of Agrobacterium tuberculosis, of the protease inhibitor I or II gene of tomato or potato 3 'terminal portion and CaMV 35S terminator.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.Optionally, the vector additionally carries a gene encoding a reporter molecule (eg, luciferase and β-glucuronidase). In addition, the vector of the present invention is a selection marker antibiotics (e.g., neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin, etc.) resistant gene (e.g., neomycin phospho-transferase dehydratase (nptⅡ), high thereof Mycin phosphotransferase ( hpt ), and the like).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) transforming a plant cell with the plant expression vector of claim 2; (b) selecting the transformed plant cells; And (c) regenerating the plant from the transformed plant cells to obtain a transformed plant. The method provides a method for producing a transformed plant expressing a nucleocapsid protein of SARS corona virus.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 본 발명의 방법에 의해 제조된 식물 형질전환체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a plant transformant produced by the method of the present invention described above.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공 (Neumann, E. et al.,EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트 (Yang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 및 아그로박테리움-매개 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-매개 형질전환이 가장 바람직하다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 일반적으로 잎 디스크, 그리고 다른 조직 (자엽 및 배축)을 가지고 실시된다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효율적이다.In the method of the present invention, the transformation of plant cells can be carried out according to a conventional method known in the art, which is electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J. , 1: 841 (1982) ), Particle bombardment (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 87: 9568-9572 (1990)) and Agrobacterium-mediated transformation (US Pat. Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011) Include. Of these, Agrobacterium-mediated transformation is most preferred. Agrobacterium-mediated transformation is generally carried out with leaf discs and other tissues (cotyledon and hypocotyls). Agrobacterium-mediated transformation is most efficient in dicotyledonous plants.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다.Selection of transformed plant cells can be carried out by exposing the transformed culture to a selection agent (eg metabolic inhibitors, antibiotics and herbicides). Plant cells that are transformed and stably contain marker genes that confer selective resistance are grown and divided in the cultures described above.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 형성된 형질전환 발근 신초는 적합한 식물 성장 배지에 치상된다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).Methods for the development or regeneration of plants from plant protoplasts or various exploits are well known in the art. The transformed root shoots formed are imbedded in a suitable plant growth medium. Development or regeneration of plants comprising foreign genes introduced by Agrobacterium can be accomplished according to methods known in the art (US Pat. Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011).

한편, 본 발명자들은 신규한 형질전환 식물체 (예: 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채)를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 특정 식물체의 형질전환을 위한 가장 효율적인 방법을 구축하였다. 이러한 방법은 PCT/KR02/01461,PCT/KR02/01462 및 PCT/KR02/01463에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.On the other hand, the present inventors have made extensive research efforts to develop novel transgenic plants (eg, tobacco, melons, cucumbers, watermelons and rapeseeds), and as a result, have established the most efficient method for the transformation of specific plants. Such a method is disclosed in PCT / KR02 / 01461, PCT / KR02 / 01462 and PCT / KR02 / 01463, which patent documents are incorporated herein by reference.

본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채에 적용된다.The method of the invention is applied to a variety of plants, but preferably to tobacco, melons, cucumbers, watermelons and rapeseeds.

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.In the present invention, the preferred transformation method is carried out using the Agrobacterium system, more preferably using the Agrobacterium tumefaciens -binary vector system.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 재분화 신초를 얻는 단계; 및 (c') 상기 재분화 신초를 발근 배지에서 배양하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.In a method using the Agrobacterium system, one specific embodiment includes the following steps: (a ') an Agrobacterium tumer embedded in a genome DNA of a plant cell and having a vector having the sequence Infecting an plant plant with Agrobacterium tumefaciens : the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or a portion thereof; (Ii) a promoter operably linked to the polynucleotide of (iii) and acting on plant cells to form RNA molecules; And (iii) a 3'-non-detoxification site that acts in plant cells to cause 3'-end polyadenylation of the RNA molecule; (b ') re-differentiating the infected implant in a regeneration medium to obtain a redifferentiated shoot; And (c ') culturing the re-differentiated shoots in a rooting medium to obtain a transformed plant.

상기한 구체적인 일 실시예에서, 형질전환에 적합한 익스플랜트는 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함하며, 바람직하게는 자엽 및 배축이고, 가장 바람직하게는 자엽이다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건하에서 실시된다. 식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation byAgrobacteriumplasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)).In one specific embodiment described above, suitable implants for transformation include any tissue derived from the germinated seed, preferably cotyledon and hypocotyl, most preferably cotyledon. Seed germination is carried out under suitable dark / light conditions using a suitable medium. Transformation of plant cells is carried out with Agrobacterium trimers comprising Ti plasmids (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids.In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983) ).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320 및 pHS737과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); R. K. Jain, et al.,Biochem. Soc. Trans.28:958-961(2000)).More preferably, binary vector systems such as pBin19, pRD400, pRD320 and pHS737 are used (An, G. et al., Binary vectors "In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York (1986); RK Jain, et al., Biochem. Soc. Trans. 28: 958-961 (2000)).

아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 자엽을 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움 튜머페이션스는 식물내로 감염된다. 공동배양액에는 바람직하게는 아세토시링곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다.Infection of implants with Agrobacterium trimmers includes methods known in the art. Most preferably, the infection process comprises coculture by impregnating cotyledon in a culture of Agrobacterium tumerification. As a result, Agrobacterium trimmers are infected into plants. Co-cultures preferably include acetosyringone, which is intended to help transform Agrobacterium into plants.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 신초의 재분화를 성공적으로 야기한다. 본 발명에 따르면, 재분화 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 식물 성장 조절제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고,고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.Explants transformed with Agrobacterium trimerization are re-differentiated in regeneration medium, which successfully leads to regeneration of shoots. According to the present invention, the regeneration medium includes, but is not limited to, nutrient basal mediums, energy sources and plant growth regulators such as MS, B5, LS, N6 and White's. The energy source is more preferably a saccharide, most preferably sucrose. On the other hand, the re-differentiation medium of the present invention may additionally include MES to serve as a pH buffer, and may further include agar as a solid support.

본 발명의 재분화 배지에는 식물 성장 조절제가 포함된다. 식물 성자 조절제 중 함유되는 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린 (BAP), 키네틴, 제아틴, 이소펜틸아데노신 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 6-벤질아미노퓨린이 이용된다. 한편, 옥신계 성장 조절제 (예: 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산, (2,4-디클로로페녹시) 아세트산)도 재분화배지에 포함될 수 있다.The regeneration medium of the present invention includes plant growth regulators. Cytokinins contained in plant saint modulators include, but are not limited to, 6-benzylaminopurine (BAP), kinetin, zeatin, isopentyl adenosine, and the like, most preferably 6-benzylaminopurine. On the other hand, auxin-based growth regulators such as 1-naphthalene acetic acid, indole acetic acid, and (2,4-dichlorophenoxy) acetic acid may also be included in the regeneration medium.

재분화된 조직은 발근 배지에서 발근되어 형질전환 식물이 생산된다.Re-differentiated tissue is rooted in the rooting medium to produce a transgenic plant.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)). 한편, 형질전환 시 이용되는 벡터에 β-글루쿠로니다아제 유전자가 있는 경우에는 재분화된 자엽 조직의 일부를 X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 등의 기질 용액에 침지시켜 발색되는 양상을 육안으로 관찰함으로써 형질전환 여부를 용이하게 확인할 수 있다.Plants transformed according to the present invention is confirmed whether or not transformed by methods known in the art. For example, PCR can be performed using DNA samples obtained from tissues of transformed plants to identify foreign genes inserted into the genome of the transformed plants. Alternatively, Northern or Southern blotting can be performed to confirm transformation (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). On the other hand, if the vector used for transformation contains the β-glucuronidase gene, a part of the re-differentiated cotyledon tissues may be treated with X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid By visually observing the color development by immersion in a substrate solution, such as) can be easily confirmed whether the transformation.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포를 상술한 본 발명의 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 형질전환 식물체로부터 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) transforming a plant cell with the above-described vector of the present invention; (b) selecting the transformed plant cells; (c) regenerating the plant from the transformed plant cells to obtain a transformed plant; And (d) obtaining a nucleocapsid protein of SARS corona virus from the transgenic plant.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a nucleocapsid protein of SARS corona virus produced by the method described above.

본 발명의 식물 형질전환체의 다양한 기관 (예: 줄기, 잎, 뿌리, 열매, 종자 등)으로부터 유래된 조직으로부터 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 얻을 수 있으며, 상기 조직으로부터 얻은 추출액을 통상적인 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.Nucleocapsid proteins of SARS corona virus can be obtained from tissues derived from various organs (e.g. stems, leaves, roots, fruits, seeds, etc.) of the plant transformants of the present invention, and extracts obtained from the tissues Can be obtained by purification. In the present invention, the purification step may be carried out by employing a purification method commonly used in the art. For example, solubility fractionation using ammonium sulfate or PEG, ultrafiltration separation according to molecular weight, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. Various methods may be used and are usually purified using a combination of the above methods.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단에 6 x His이 있는 경우에는, Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 을 이용하여 소망하는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 신속하고 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, when there is 6 x His at the N-terminus of the nucleocapsid protein of the SARS corona virus of the present invention, a Ni-NTA His-binding resin column is used to express the desired SARS corona virus. Cleocapsid proteins can be isolated and purified quickly and easily.

본 발명의 방법에 따르면, 식물 형질전환체를 이용함으로써 저렴한 비용으로사스 코로나 바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질을 대량 생산할 수 있다.According to the method of the present invention, it is possible to mass produce SARS corona virus-derived nucleocapsid proteins at low cost by using plant transformants.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시험 대상의 개체로부터 시험액 (testing fluid)을 수득하는 단계; (b) 상기 본 발명의 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 상기 시험액과 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 항원-항체 반응의 발생 (occurrence) 여부를 측정하는 단계를 포함하는 중증급성호흡기증후군의 항체 측정 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a test fluid, comprising the steps of: (a) obtaining a testing fluid from a subject under test; (b) inducing an antigen-antibody reaction with the test solution using the nucleocapsid protein of SARS corona virus of the present invention as an antigen; And (c) provides a method for measuring the antibody of acute respiratory syndrome comprising the step of measuring the occurrence (occurrence) of the antigen-antibody reaction in step (b).

본 발명에서는 다양한 생체액 (예: 혈액, 혈청, 오줌, 땀 등)에 적용될 수 있지만, 바람직하게는 혈액이고, 보다 바람직하게는 혈청이다.In the present invention, it can be applied to various biological fluids (eg, blood, serum, urine, sweat, etc.), but is preferably blood, and more preferably serum.

본 발명의 방법은 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 분석방법이 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assy) 방법에 따라 실시하는 것이다. 보다 구체적으로는, (ⅰ) 웰 플레이트에 항-인간 항체를 흡착시키는 단계; (ⅱ) 상기 웰 플레이트에 검체의 혈청을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; (ⅲ) 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅳ) 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단일클론 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅴ) 상기 웰 플레이트를 세척한 후 발색효소 또는 형광물질이 결합된 2차 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (ⅵ) 2차 항체의 결합여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법으로 실시된다.The method of the present invention can be used for all assays based on antigen-antibody binding. Most preferably, it is performed according to an enzyme-linked immunosorbent assy (ELISA) method. More specifically, (i) adsorbing an anti-human antibody to the well plate; (Ii) reacting and washing the sample by adding serum of the sample to the well plate; (Iii) adding SARS corona virus nucleocapsid protein to react; (Iii) adding and reacting a monoclonal antibody against SARS corona virus nucleocapsid protein; (Iii) washing the well plate and reacting by adding a secondary antibody bound to a chromophore or a fluorescent substance; And (iii) determining whether or not the secondary antibody is bound.

상기 발색 효소는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀, ABTS (2,2´-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 등이 이용된다.The color development enzymes include, but are not limited to, alkaline phosphatase, β-galactosidase, horse radish peroxidase, and the like. In addition, when using alkaline phosphatase, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), ECF substrate, etc. are used as a substrate, and when using a horse radish peroxidase, Chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, luminol, ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) and the like are used as the substrate.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 중증급성호흡기증후군의 항체 진단용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a kit for diagnosing antibodies of acute respiratory syndrome comprising the nucleocapsid protein of SARS corona virus of the present invention as an antigen.

본 발명의 진단 키트가 포함하는 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 식물체에서 발현된 재조합 단백질로서, 인간 및 동물에는 감염성이 없으면서, 사스 코로나 바이러스 항체에 대한 특이성 및 민감성이 매우 우수하며, 이러한 하기의 실시예에서 증명되어 있다.SARS coronavirus nucleocapsid protein included in the diagnostic kit of the present invention is a recombinant protein expressed in plants, which is highly infectious in humans and animals, and has excellent specificity and sensitivity to SARS coronavirus antibodies. Proven in the example.

본 발명의 진단 키트가 기본적으로 ELISA 용으로 개발되는 경우에는, 플레이트 (또는 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질로 표면 코팅된 플레이트), 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.When the diagnostic kit of the present invention is primarily developed for ELISA, plates (or plates coated with SARS coronavirus nucleocapsid protein), secondary antibodies labeled with buffers, chromophores or fluorescent materials, chromogenic substrates And the like.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention more specifically, and the scope of the present invention is not limited to these examples according to the gist of the present invention.

실시예 1: 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 신규 유전자의 합성Example 1 Synthesis of Novel Genes of SARS Corona Virus Nucleocapsid Protein

천연의 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자와 동일하게 429개의 아미노산 (참조: 서열목록 제 2 서열)을 암호화하면서도, 기존의 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과는 다르게, 식물체가 선호하는 최적의 뉴클레오타이드 서열을 디자인하였다. 신규 유전자의 디자인 기준은, 첫째, GC 함량을 50% 이상으로 하고, 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하였으며, 그리고 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다. 이렇게 디자인된 뉴클레오타이드 서열은 Plant Biotechnology Institute (이하 "PBI"로 표시), National Research Centre (SK, 캐나다)에서 화학적으로 합성하였다. 합성된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 DNA는 서열목록 제 1 서열에 기재되어 있다.The plant prefers 429 amino acids (see SEQ ID NO: 2 sequence) identically to the native SARS coronavirus nucleocapsid protein gene, but unlike the nucleotide sequence encoding the existing SARS coronavirus nucleocapsid protein, the plant is preferred. The optimal nucleotide sequence was designed. The design criteria for the new gene is first, to make the GC content above 50%, to have the plant's preferred codons, and to remove intron-like sequences. The nucleotide sequences thus designed were chemically synthesized at the Plant Biotechnology Institute (hereinafter referred to as "PBI") and the National Research Center (SK, Canada). DNA encoding the synthesized SARS corona virus nucleocapsid protein is described in SEQ ID NO: 1.

실시예 2: 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 식물 발현용 벡터의 제작Example 2 Construction of Plant Expression Vectors of SARS Corona Virus Nucleocapsid Protein Gene

사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드를 코딩하는 합성 유전자는 1287 bp로 구성되어 있으며, 5'-말단에XbaI과 3'-말단에BamHI의 인식부위를 가질 수 있도록 합성되어 있다.The synthetic gene encoding the nucleocapsid of SARS corona virus is composed of 1287 bp, and synthesized to have a recognition site of Bam HI at the Xba I and 3'-ends at the 5'-end.

식물 발현용 바이너리 벡터인 pHS737 (PBI, National Research Centre, 캐나다)을 제한효소XbaI과BamHI 효소로 함께 처리하여 절단한 후 분리·정제하였다.상기 1287 bp 합성 유전자와 절단된 pHS737 벡터를 혼합하고, 이 혼합물에 라이게이션 완충액 (KOSCO, 한국) 및 T4 리가아제 (KOSCO, 한국)를 첨가한 후 1시간 이상 16℃에서 반응 시켰다. 그런 다음, 반응물을 CaCl2로 처리된 컴피턴트 세포 (E. colistrain DH5α(Promega, 미국)에 형질전환시킨 후 항생제 카나마이신 (100 mg/㎖)이 포함된 LB 배지에서 항생제 저항성 균주를 선별하였다.PHS737 (PBI, National Research Center, Canada), a plant expression binary vector, was digested, digested, and purified by treatment with restriction enzymes Xba I and Bam HI enzyme. The 1287 bp synthetic gene and the cleaved pHS737 vector were mixed. To this mixture, ligation buffer (KOSCO, Korea) and T4 ligase (KOSCO, Korea) were added and reacted at 16 ° C. for at least 1 hour. The reactants were then transformed into competent cells treated with CaCl 2 ( E. coli strain DH5α (Promega, USA) and then antibiotic resistant strains were selected in LB medium containing the antibiotic kanamycin (100 mg / ml).

선발된 클론으로부터 알칼리 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였고, 정방향 프라이머 5'-AAT CTA GAA TCT AGA AAT GAG-3'과 역방향 프라이머 5'-AAG GAT CCC GGA TCC CCT TAA-3'를 사용해서 중합효소연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. PCR 증폭에서 이용된 효소는 Taq 중합효소(솔젠트, 한국)이고, 온도 조건은 다음과 같이 세팅하였다: 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 하였다.Plasmid DNA was isolated from the selected clones using an alkaline method and polymerized using forward primer 5'-AAT CTA GAA TCT AGA AAT GAG-3 'and reverse primer 5'-AAG GAT CCC GGA TCC CCT TAA-3'. Enzyme chain reaction (PCR) was performed. The enzyme used in the PCR amplification was Taq polymerase (Solgent, Korea), and the temperature conditions were set as follows: predenature for 2 minutes at 96 ° C, denature for 1 minute at 94 ° C, and connect for 1 minute at 55 ° C. The reaction was repeated 35 times at 72 ° C. for 2 minutes, and further extended at 72 ° C. for 10 minutes.

이어, 증폭 생성물을 1.0% 아가로스 겔에서 분석하여 목적하는 인서트 서열이 플라스미드에 있음을 확인하였다 (참조: 도 2).The amplification product was then analyzed on a 1.0% agarose gel to confirm that the desired insert sequence was in the plasmid (see Figure 2).

실시예 3: 식물체의 형질전환Example 3: Transformation of Plants

실시예 3-1:아그로박테리움 튜머페이션스 ( Agrobacterium tumefaciens ) GV3101 감염 브로스의 제조 Example 3-1 Preparation of Agrobacterium tumefaciens GV3101 Infected Broth

실시예 2에서 제작한 재조합 pHS737 벡터를 접합 (conjugation)에 의하여 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101 (Mp90)에 도입하였다. 재조합 pHS737 벡터를 가진 대장균 S17-1과 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101 (Mp90)를 각각 액체 LB배지에서 대수기까지 배양하였다. 이들 각각의 세포들을 에펜도르프 튜브에 1:1로 함께 혼합한 다음 30초간 원심분리하여 세포들을 농축시킨 후 28℃에서 1-2일 동안 정치배양을 하였다. 시간이 경과한 세포들이 든 에펜도르프 튜브는 살살 흔들어 주어 농축된 세포를 부유화시킨 다음, 50 mg/L 카나마이신 및 30 mg/L 겐타마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 다음, 28℃에서 2일 동안 배양한 후 콜로니를 선별하였다. 상기 벡터가 도입된 균주를 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/SACV로 명명하였다 (Alt-Morbe et al.,J. Bacteriol.178:4248-4257(1996)).Recombinant pHS737 vector prepared in Example 2 was introduced into Agrobacterium tamperation GV3101 (Mp90) by conjugation. Escherichia coli S17-1 and Agrobacterium tuberization GV3101 (Mp90) with recombinant pHS737 vectors were incubated in liquid LB medium to log phase. Each of these cells were mixed together 1: 1 in an Eppendorf tube and then centrifuged for 30 seconds to concentrate the cells, followed by stationary culture at 1-2C for 1-2 days. The Eppendorf tube containing the cells over time was gently shaken to float the concentrated cells, and then plated in LB solid medium to which 50 mg / L kanamycin and 30 mg / L gentamicin were added. Colonies were selected after incubation for days. The strain into which the vector was introduced was named Agrobacterium turmeration GV3101-pHS737 / SACV (Alt-Morbe et al., J. Bacteriol. 178: 4248-4257 (1996)).

재조합 pHS737를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/SACV 를 슈퍼브로스 (BHI 배지, pH 5.6)에 접종한 후 28℃에서 2일간 배양하였으며, 이 배양물을 식물체의 감염에 사용하였다.Agrobacterium turmerics GV3101-pHS737 / SACV with recombinant pHS737 were inoculated in Superbros (BHI medium, pH 5.6) and incubated at 28 ° C. for 2 days, and the culture was used for infection of plants.

실시예 3-2:식물세포의 형질전환 및 재분화 Example 3-2 Transformation and Regeneration of Plant Cells

먼저 소독한 담배의 종자를 파종하여 2 주 이상 무균 배양한 신선하고 어린 잎을 채취하였다. 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 유전자를 가진 pHS737 벡터 (pHS737/SACV)를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101(Mp90)를 100 μM 아세토시링곤 (acetosyringone)이 함유된 수퍼 브로스 (Super broth: 37 g/l Brain heart infusion broth(Difco), 0.2% 수크로스, pH 5.6)에서 18시간 동안 배양한 다음, 이 배양액에 상기 자엽 절편을 침지시켜 20 분간 혼합하였다.First, the seeds of the sterilized tobacco were sown, and fresh young leaves which were sterilely cultured for two weeks or longer were collected. Super broth: 37 g / l Brain containing 100 μM acetosyringone was added to the Agrobacterium turmerics GV3101 (Mp90) with pHS737 vector (pHS737 / SACV) with SARS coronavirus nucleocapsid gene. heart infusion broth (Difco), 0.2% sucrose, pH 5.6) for 18 hours, and then the cotyledon fragments were immersed in the culture and mixed for 20 minutes.

그런 다음, 25℃에서 암배양 조건으로 공동배양 배지 [3.0% 수크로스 , 0.5 g/L MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate) , 1.0 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA가 함유된 MSB5 (Murashige & Skoog medium including Gamborg B5 vitamins)]에서 2 일 동안 공동배양하였다. 그리고 나서, 세균을 제거하는 클린 업 (clean up) 단계를 거쳐, 잎 절편을 선발 배지 (MSB5, 0.5 g/L MES , 3 % 수크로스 및 0.6 % 피타겔을 기본으로 하는 배지에 BAP 1.0 mg/L , NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L 및 카나마이신 100 mg/L 포함)에 이식하여 2 주 동안 배양하여 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하여, 재분화 배지 (MSB5, 500 mg/L 의 MES, BAP 0.01 mg/L, NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L, 카나마이신 100 mg/L, 3% 수크로스, 0.6% 아가)에서 배양하였다. 재분화된 신초를 발근 배지 (MSB5, 500 mg/L 의 MES, NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L, 카나마이신 100 mg/L, 3% 수크로스, 0.6% 아가)에 옮겨 배양하여 발근한 개체를 형질전환체로 추정하여 하기 실시예 4의 방법을 이용하여 분석하였다.Then, coculture medium [3.0% sucrose, 0.5 g / L MES (2- (N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate), 1.0 mg / L BAP, 0.1 mg / L NAA under cancer culture conditions at 25 ° C. Co-cultured with MSB5 (Murashige & Skoog medium including Gamborg B5 vitamins) for 2 days. Then, through a clean up step to remove bacteria, leaf sections were removed in a medium based on selection medium (MSB5, 0.5 g / L MES, 3% sucrose and 0.6% pitagel 1.0 mg / L, NAA 0.1 mg / L, carbenicillin 500 mg / L and kanamycin 100 mg / L) were cultured for 2 weeks and rooted shoots presumed to be transformed were selected and re-differentiated medium (MSB5, 500 incubated in mg / L of MES, BAP 0.01 mg / L, NAA 0.1 mg / L, carbenicillin 500 mg / L, kanamycin 100 mg / L, 3% sucrose, 0.6% agar). The regenerated shoots were transferred to rooting medium (MSB5, 500 mg / L of MES, NAA 0.1 mg / L, carbenicillin 500 mg / L, kanamycin 100 mg / L, 3% sucrose, 0.6% agar) for rooting. One individual was estimated as a transformant and analyzed using the method of Example 4 below.

실시예 4: 형질전환 식물체의 PCR 분석Example 4 PCR Analysis of Transgenic Plants

상기 실시예 3에서 확보한 형질전환 식물체의 확인은 다음과 같이 실시하였다: 선발 배지에서 형질전환체로 선발된 신초 10 mg을 에드워드 (Edward) 방법 (Nucleic Acids Research, 19:1349(1991))을 사용하여 식물 지놈 DNA를 분리한 후, 이를 주형 DNA로 하여 PCR 분석을 실시하였다.Confirmation of the transformed plants obtained in Example 3 was carried out as follows: 10 mg of shoots selected as transformants in selection medium using the Edward method ( Nucleic Acids Research , 19: 1349 (1991)) After the plant genome DNA was isolated, PCR was carried out using this as template DNA.

사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 형질전환 식물체의 PCR 분석에 사용된 프라이머는 뉴클레오캡시드 단백질 유전자 의 염기 서열에 대응하는 것으로서, 정방향 프라이머는 5'-AAT CTA GAA TCT AGA AAT GAG-3', 역방향 프라이머는 5'-AAG GAT CCC GGA TCC CCT TAA-3' 이다. PCR 반응은 Taq 중합효소 (솔젠트, 한국)를 이용하여 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 한 후 반응산물은 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다 (참조: 도 3). 도 3에서 M 열은 분자량 마커, 1 열은 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 양성 표준 플라스미드의 PCR 산물, 2 열은 야생종 담배의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물, 3 열부터 10 열까지는 선발된 담배 형질전환체의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물들을 나타낸 것이다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 식물 형질전환체에서 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자에 해당하는 약 1.3 kb DNA 밴드가 관찰되어 형질전환되었음을 확인할 수 있었다.The primers used for PCR analysis of the transgenic plant of SARS corona virus nucleocapsid protein gene correspond to the nucleotide sequence of the nucleocapsid protein gene, and the forward primer is 5'-AAT CTA GAA TCT AGA AAT GAG-3 ', The reverse primer is 5'-AAG GAT CCC GGA TCC CCT TAA-3 '. PCR reaction was performed by Taq polymerase (Solgent, Korea), total denaturation at 96 ° C for 2 minutes, denaturation at 94 ° C for 1 minute, connection at 55 ° C for 1 minute, and polymerization at 72 ° C for 2 minutes. Repeated a further time, after further extension for 10 minutes at 72 ℃ reaction product was analyzed on 1.0% agarose gel (see Figure 3). In Figure 3, column M is the molecular weight marker, column 1 is the PCR product of the positive standard plasmid containing the SARS coronavirus nucleocapsid protein gene, column 2 is the PCR product of the chromosomal DNA of wild tobacco, columns 3 to 10 Up to now shows PCR products based on the DNA of the selected tobacco transformant. As can be seen in Figure 3, about 1.3 kb DNA band corresponding to SARS corona virus nucleocapsid protein gene was observed in the plant transformant of the present invention was confirmed that the transformation.

실시예 6: 형질전환 식물체에서 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 분리 및 정제Example 6: Isolation and Purification of SARS Corona Virus Nucleocapsid Protein in Transgenic Plants

적당량의 액체질소가 들어있는 막자사발에 형질전환 식물체의 잎 1 g을 잘라서 넣고 식물조직을 분쇄하였다. 식물 생중량 0.5 g 당 단백질 분해효소 제거제가 함유된 추출완충액 (250 mM Sucrose, 1 M Hepes, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT) 2 ㎖ 를 첨가하여 미세하게 갈았다. 추출액을 12,000 rpm, 4℃에서 30분 이상 원심분리한 후 상등액을 취하여 새 튜브로 옮겼다. 이 용해된 세포용액을 니켈 수지가 함유된 프로본드 (Probond) 컬럼 (Quiagen GmbH, 독일)에 첨가하여 실온에서 10분간 약하게 흔들어주면서 세포용액내의 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 니켈 수지에 잘 흡착되도록 하였다.In a mortar containing an appropriate amount of liquid nitrogen, 1 g of the leaves of the transformed plant were cut and pulverized. 2 ml of extract buffer (250 mM Sucrose, 1 M Hepes, 1 mM MgCl 2 , 1 mM DTT) containing protease remover per 0.5 g of plant weight was finely ground. The extract was centrifuged at 12,000 rpm and 4 ° C. for at least 30 minutes, then the supernatant was removed and transferred to a new tube. The lysed cell solution was added to a nickel-containing Probond column (Quiagen GmbH, Germany) and gently shaken for 10 minutes at room temperature so that SARS coronavirus nucleocapsid protein in the cell solution was well adsorbed onto the nickel resin. It was.

뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 수지를 동량의 pH 7.8 흡착 완충용액 (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)으로 2회 세척하여 수지에 흡착된 식물세포 유래 단백질을 제거하였다. 이와 같이 세척된 수지에 동량의 pH 6.0 세척 완충용액 (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)을 첨가하여 실온에서 약하게 흔들어주어 수지를 재차 세척하고, 다시 동량의 pH 4.0 용출 완충용액 (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)을 첨가하여 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 용출시켰다.The resin to which the nucleocapsid protein was adsorbed was washed twice with the same amount of pH 7.8 adsorption buffer solution (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride) to remove plant cell-derived protein adsorbed on the resin. The same amount of pH 6.0 washing buffer (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride) was added to the washed resin, and the mixture was gently shaken at room temperature to wash the resin again, and then the same amount of pH 4.0 elution buffer (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride) was added to elute SARS corona virus nucleocapsid protein.

식물 형질전환체에서 발현된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 아미노 말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가지고 있어 양이온을 띠는 니켈 수지에 결합되어 쉽게 분리된다. 이러한 과정을 거쳐 식물세포 단백질들이 모두 제거된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질만을 순수하게 정제하였다. 이와같이 용출된 단백질을 센트리콘 (Amicon Co., U.S.A.)을 사용하여 농축하였다.SARS coronavirus nucleocapsid proteins expressed in plant transformants have six histidine residues at the amino terminus and are readily isolated by binding to a cationic nickel resin. Through this process, only SARS corona virus nucleocapsid protein from which all plant cell proteins were removed was purified. The eluted protein was concentrated using Centricon (Amicon Co., U.S.A.).

도 4에 나타낸 바와 같이, 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동한 후 쿠마시블루로 염색한 결과 야생형 담배에서는 검출되지 않는 47.5 kD의 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 세포 용출액에서 검출되었고, 특히 니켈 수지 칼럼으로 용출한 경우는 식물세포 단백질이 모두 제거된 순수한 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 검출됨을 확인하였다.As shown in FIG. 4, 47.5 kD of SARS coronavirus nucleocapsid protein, which was not detected in wild-type tobacco, was electrolyzed on SDS-PAGE gel and electrophoresed with SARS coronavirus nucleocapsid protein. In the case of eluting with a nickel resin column, it was confirmed that pure SARS corona virus nucleocapsid protein was completely removed.

상기의 방법으로 정제된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 브래드포드 (Bradford) 방법에 의해 염색제 (Protein assay kit, Bio-Rad)를 넣고 UV-분광광도계로 595 nm에서 흡광도를 측정하고 BSA (Bovine Serum Albumin) standard와 비교해서 단백질 정량을 실시하였다. 추출된 단백질은 양이 동일하도록 조정하여 각 시료를 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 하였고, 이에 대해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다 (참조: Peter B. Kaufma et al.,Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 웨스턴 블럿 분석은 아래와 같은 방법으로 시행되었다. 상기 SDS-PAGE 겔에 있는 단백질을 Semi-Dry Transfer Units (Hoefer, 미국)를 이용하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 겔에 있는 단백질 전부가 PVDF 막에 이동한 것을 확인한 다음 PVDF막을 건조시켰다. 이 PVDF막을 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 (Center of disease control, Georgia, USA)가 첨가된 0.5% BSA/TBS (Tris-Buffered Saline) 용액에 1시간 동안 반응시킨 다음 TBS 용액으로 PVDF 막을 5분씩 세 번 세척하였다. 그런 다음 퍼옥시다아제 표지 2차항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)와 1시간 동안 반응시킨 후 다시 TBS 용액으로 PVDF 막을 10분씩 세 번 세척하였다. 마지막으로 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가된 왼충액에 PVDF 막을 넣고 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 그 결과를 판독하였다(참조: 도 5). 도 5 에서 확인할 수 있듯이, 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과 상기 결과와 동일하게 47.5 kD의 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 확인되었다.SARS coronavirus nucleocapsid protein purified by the above method was added to the stain assay (Bradford) method (Protein assay kit, Bio-Rad) and measured the absorbance at 595 nm with a UV-spectrophotometer and BSA (Bovine Serum Protein quantification was performed as compared to the Albumin standard. The extracted protein was adjusted to the same amount and each sample was subjected to 8% polyacrylamide gel electrophoresis, and Western blot analysis was performed (see Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine , 108-121, CRC press). Western blot analysis was performed as follows. The protein in the SDS-PAGE gel was transferred to PVDF membrane using Semi-Dry Transfer Units (Hoefer, USA). After confirming that all proteins in the gel had migrated to the PVDF membrane, the PVDF membrane was dried. This PVDF membrane was reacted for 1 hour in a 0.5% BSA / TBS (Tris-Buffered Saline) solution containing a monoclonal antibody (Center of disease control, Georgia, USA) that specifically reacts to SARS coronavirus nucleocapsid protein antigen. The PVDF membrane was then washed three times for 5 minutes with TBS solution. Then, after reacting with peroxidase labeled secondary antibody (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, USA) for 1 hour, the PVDF membrane was washed three times for 10 minutes with TBS solution again. Finally, a PVDF membrane was added to the left buffer solution to which the ABTS color developing substrate solution (KPL, USA) was added and reacted for 30 minutes at room temperature, and the result was read (see FIG. 5). As can be seen in Figure 5, Western blot analysis was carried out to confirm the same as the results of 47.5 kD SARS corona virus nucleocapsid protein.

실시예 7: 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 96-웰 플레이트를 이용한 중증급성호흡기증후군의 진단Example 7: Diagnosis of Severe Respiratory Syndrome Using 96-well Plate Adsorbed with SARS Corona Virus Nucleocapsid Protein

실시예 7-1 :사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체 역가 측정 Example 7-1 Determination of Antibody Titers against SARS Corona Virus Nucleocapsid Protein

식물 형질전환체에서 분리·정제된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 중증급성호흡기증후군의 진단에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 뉴클레오캡시드 단백질을 항원-항체 반응을 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 측정하였다.To determine whether SARS coronavirus nucleocapsid protein isolated and purified from plant transformants can be used for the diagnosis of severe respiratory syndrome, the nucleocapsid protein was subjected to antigen-antibody reaction in 96-well microtiter plates. It measured using.

96-웰 마이크로타이터 플레이트에 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 인산염 완충용액에 연속적으로 희석하여, 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항원을 웰에 고정시켰다. 단백질 항원이 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항원을 제거하고, 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원에 대한 단일클론항체 (Centers of disease control, Georgia, USA)를 희석액(0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시켜 항원-항체반응을 유도하였다. 그런 다음 세척 완충용액으로 각각의 웰을 3회 세척한 후에 블롯킹 완충액을 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 상기와 동일하게 세척하였다. 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA) 로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 표의 가로축은 정제된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 희석 배수를 나타내며 (희석 전 양: 73 ng, 20480 배 희석: 36 pg), 세로축은 상기 단백질에 대한 항체의 초기 역가를 1로 보았을 때 희석한 배수를 나타낸 것이다. 표 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 뉴클레오캡시드 단백질은 우수한 항원성을 나타낸다.The purified nucleocapsid protein in a 96-well microtiter plate was serially diluted in phosphate buffer, dispensed 100 μl per well, and left at 4 ° C. for at least 8 hours to fix the antigen in the well. Protein-adsorbed plates were washed three times with wash buffer (0.05% Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6) to remove non-adsorbed antigens and monoclonal against SARS coronavirus nucleocapsid protein antigen. Antibodies (Centers of disease control, Georgia, USA) were diluted in diluted dilution (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl) in aliquots of 100 μl per well and then 1 hour at room temperature. The reaction was induced to induce an antigen-antibody reaction. Then, each well was washed three times with washing buffer, and then the blocking buffer was dispensed into each well, and reacted at room temperature for 1 hour, followed by washing in the same manner as above. Peroxidase labeled secondary antibody (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.) was aliquoted and reacted and washed in the same manner as above. Finally, the color was reacted for 30 minutes at room temperature by adding ABTS color substrate (KPL, USA) to each well, and the result was read at 405 nm using an ELISA reader (ELISA Reader, Titertek, USA). Table 1 shows. The horizontal axis of the table represents the dilution fold of the nucleocapsid protein of the purified SARS corona virus (amount before dilution: 73 ng, 20480 fold dilution: 36 pg), the vertical axis diluting when the initial titer of the antibody to the protein is 1 It represents a multiple. As can be seen in Table 1, the nucleocapsid proteins of the present invention exhibit excellent antigenicity.

도 6은 정제 완료 된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 36 pg과 반응하는 항체 역가군을 야생형 식물체에서 분리한 단백질과 비교하여 도식화 한 것이다. 그림에서와 같이 재조합 식물체에서 분리 정제한 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성은 탁월하게 나타났으며, 이와 비교하여 야생형 식물체에서 분리한 단백질은 전혀 항원성을 나타내지 않았다.Figure 6 is a schematic of the antibody titers that react with 36 pg of purified SARS corona virus compared to proteins isolated from wild-type plants. As shown in the figure, the antigenicity of the nucleocapsid protein isolated and purified from recombinant plants was excellent, whereas the protein isolated from wild-type plants showed no antigenicity at all.

뉴클레오캡시드 단백질의 희석 배수Dilution multiples of nucleocapsid protein 항체 희석배수Antibody Dilution Factor 1010 2020 4040 8080 160160 320320 640640 12801280 25602560 51205120 1024010240 2048020480 100100 < 3.0<3.0 < 3.0<3.0 < 3.0<3.0 < 3.0<3.0 2.732.73 2.312.31 2.212.21 2.182.18 2.112.11 1.921.92 1.711.71 1.511.51 200200 < 3.0<3.0 < 3.0<3.0 < 3.0<3.0 2.912.91 2.462.46 2.222.22 2.092.09 2.032.03 2.032.03 1.831.83 1.601.60 1.401.40 400400 < 3.0<3.0 < 3.0<3.0 2.942.94 2.792.79 2.302.30 2.192.19 2.002.00 2.012.01 1.981.98 1.671.67 1.551.55 1.371.37 800800 2.982.98 2.952.95 2.752.75 2.612.61 2.112.11 2.052.05 1.991.99 1.951.95 1.931.93 1.541.54 1.501.50 1.201.20 16001600 2.792.79 2.632.63 2.512.51 2.352.35 1.981.98 1.831.83 1.801.80 1.781.78 1.811.81 1.481.48 1.321.32 1.131.13 32003200 2.652.65 2.402.40 2.312.31 2.262.26 1.891.89 1.771.77 1.701.70 1.451.45 1.771.77 1.241.24 1.131.13 0.890.89 64006400 2.372.37 2.322.32 2.192.19 2.152.15 1.731.73 1.611.61 1.451.45 1.191.19 1.641.64 1.151.15 0.890.89 0.670.67 1280012800 2.162.16 1.941.94 1.751.75 1.671.67 1.311.31 1.271.27 0.940.94 0.90.9 0.650.65 0.660.66 0.650.65 0.610.61

실시예 7-2 :중증급성호흡기증후군의 진단 Example 7-2 Diagnosis of Severe Respiratory Syndrome

식물 형질전환체에서 분리·정제된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 실질적으로 중증급성호흡기증후군의 진단에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 중증급성호흡기증후군 환자의 혈청 내의 항체 역가를 측정하였다.To determine whether SARS coronavirus nucleocapsid protein isolated and purified from plant transformants can be used for the diagnosis of severe respiratory syndrome, antibody titers in serum of patients with severe respiratory syndrome were measured.

96-웰 마이크로타이터 플레이트에 인산염 완충용액으로 일정량 희석된 항-인간 IgM 항체 (goat anti-human IgM, KPL, U.S.A.) 를 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항체를 웰에 고정시켰다. 항체가 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항체를 제거하고, 환자 혈청을 희석액 (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시키고 상기와 동일한 세척액으로 3회 세척하였다.100 μl of anti-human IgM antibody (goat anti-human IgM, KPL, USA) diluted in phosphate buffer in 96-well microtiter plates was dispensed per well, and the antibody was left at 4 ° C. for at least 8 hours. Fixed to wells. The antibody-adsorbed plate was washed three times with washing buffer (0.05% Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6) to remove the antibody that did not adsorb on the plate, and the patient serum was diluted (0.1% BSA, 0.05% Tween 20). , 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl) was diluted with a constant dilution factor and dispensed 100 μl per well, followed by reaction at room temperature for at least 1 hour, and washed three times with the same washing solution.

농도별로 희석액에 용해된 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 각 웰에 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 방치하여 2차 항원-항체반응을유도하였다. 다시 세척 완충용액으로 각각의 웰을 세척한 후에 희석액에 10 ug/ ㎖ 농도로 용해된 뉴클레오캡시드 항원 단백질에 대한 단일클론항체 (Center of disease control, Georgia, USA)를 각 웰당 100 ㎕씩 분주하여 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 후 세척액으로 3회 세척하였다.100 μl of SARS coronavirus nucleocapsid protein dissolved in the diluent by concentration was dispensed into each well and left at room temperature for 1 hour or more to induce a second antigen-antibody reaction. After washing each well again with washing buffer, 100 μl of each monoclonal antibody (Center of disease control, Georgia, USA) against the nucleocapsid antigen protein dissolved in the diluent at a concentration of 10 ug / ml After reacting for 1 hour at room temperature, the solution was washed three times with a washing solution.

그런 다음 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA) 로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 결과는 흡광도 값이 1.5 이상인 희석배수를 양성으로 판독하였다.Then peroxidase labeled secondary antibody (peroxidase labeled-anti human IgG, KPL, U.S.A.) was dispensed and reacted and washed in the same manner as above. Finally, the color was reacted for 30 minutes at room temperature by adding ABTS color substrate (KPL, USA) to each well, and the result was read at 405 nm using an ELISA reader (ELISA Reader, Titertek, USA). Table 2 shows. The result was positive reading of dilution factor with absorbance value of 1.5 or more.

번호number 혈청serum 항체 역가Antibody titers 1One 환자 1Patient 1 800800 22 환자 2Patient 2 400400 33 환자 3Patient 3 64006400 44 환자 4Patient 4 64006400 55 환자 5Patient 5 16001600 66 환자 6Patient 6 64006400 77 환자 7Patient 7 200200 88 환자 8Patient 8 400400 99 환자 9Patient 9 2560025600 1010 환자 10Patient 10 64006400 1111 환자 11Patient 11 16001600 1212 환자 12Patient 12 1280012800 1313 환자 13Patient 13 2560025600 1414 환자 14Patient 14 1280012800 1515 환자 15Patient 15 2560025600 1616 환자 16Patient 16 16001600 1717 환자 17Patient 17 200200 1818 환자 18Patient 18 1280012800 1919 환자 19Patient 19 64006400 2020 환자 20Patient 20 1280012800 2121 정상인 1Normal 1 < 100<100 2222 정상인 2Normal 2 < 100<100 2323 정상인 3Normal 3 < 100<100 2424 정상인 4Normal 4 < 100<100 2525 정상인 5Normal 5 < 100<100 2626 정상인 6Normal 6 < 100<100 2727 정상인 7Normal 7 < 100<100 2828 정상인 8Normal 8 < 100<100 2929 정상인 9Normal 9 < 100<100 3030 정상인 10Normal 10 < 100<100

표 2에 나타낸 바와 같이 정상인의 혈청은 항체 역가가 모두 100 이하를 나타낸 반면, 중증급성호흡기증후군 환자의 혈청에서는 항체 역가가 200-25600을 나타내어 중증급성호흡기증후군 환자와 정상인의 감별이 뚜렷하게 나타났다. 이는 재조합 식물체에서 분리한 사스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원을 이용한 항원-항체 반응이 높은 특이성으로 발생함을 보여주는 것으로서, 이를 통해 중증급성호흡기증후군 환자를 감별할 수 있음을 확인하였다.As shown in Table 2, the serum of normal subjects showed all antibody titers of 100 or less, whereas the serum titers of patients with acute respiratory syndrome showed 200-25600. This shows that the antigen-antibody reaction using SARS coronavirus nucleocapsid protein antigen isolated from recombinant plants occurs with high specificity, and it was confirmed that this can discriminate patients with acute respiratory syndrome.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the present invention, it is apparent to those of ordinary skill in the art that this specific technology is only a preferred embodiment, which is not intended to limit the scope of the present invention. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드 및 그를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물 형질전환체를 제공한다. 본 발명은 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법 및 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다. 한편, 본 발명은 중증급성호흡기증후군의 항체 진단용 키트 및 중증급성호흡기증후군의 항체 측정 방법을 제공한다.As described in detail above, the present invention provides a novel polynucleotide encoding a nucleocapsid protein of SARS corona virus and a plant expression vector comprising the same. The present invention also provides a method for producing a transgenic plant expressing a nucleocapsid protein of SARS corona virus and a plant transformant. The present invention provides a method for producing a nucleocapsid protein of SARS corona virus and a nucleocapsid protein of SARS corona virus. On the other hand, the present invention provides a kit for diagnosing the antibody of acute respiratory syndrome and a method for measuring the antibody of acute respiratory syndrome.

본 발명에 따르면, 저비용으로 우수한 항원성을 나타내는 사스 코로나 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 얻을 수 있고, 이를 이용하는 경우에는 우수한 민감도 및 특이성으로 중증급성호흡기증후군을 진단할 수 있다.According to the present invention, a recombinant nucleocapsid protein of SARS corona virus exhibiting excellent antigenicity at low cost can be obtained, and when using this, severe respiratory syndrome can be diagnosed with excellent sensitivity and specificity.

<110> NEXGEN BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> Diagnosis Kits for Severe Acute Respiratory Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from SARS Corona Virus Expressed in Plants <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1287 <212> DNA <213> nucleotide sequence encoding nucleocapsid of sars corona virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1287) <400> 1 atg gca act atg gaa gag atc cag agg gaa atc agt gca cac gag ggg 48 Met Ala Thr Met Glu Glu Ile Gln Arg Glu Ile Ser Ala His Glu Gly 1 5 10 15 cag ctt gtg ata gca cga caa aag gtc aag gat gca gaa aag cag tac 96 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Lys Asp Ala Glu Lys Gln Tyr 20 25 30 gaa aag gat cct gat gat cta aac aag agg gca ctg cat gac cgg gaa 144 Glu Lys Asp Pro Asp Asp Leu Asn Lys Arg Ala Leu His Asp Arg Glu 35 40 45 agt gtg gca gct tca atc caa tca aag att gat gag ttg aag cgc cag 192 Ser Val Ala Ala Ser Ile Gln Ser Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln 50 55 60 ctt gcc gat agg att gca gca ggg aag aac atc ggg cag gat cgg gat 240 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Ala Gly Lys Asn Ile Gly Gln Asp Arg Asp 65 70 75 80 cct acg gga gta gag cca ggt gac cac ctc aaa gag aga tca gca cta 288 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Ala Leu 85 90 95 agc tat ggg aat aca ctg gat ctg aac agc ctt gac att gat gag cca 336 Ser Tyr Gly Asn Thr Leu Asp Leu Asn Ser Leu Asp Ile Asp Glu Pro 100 105 110 aca gga cag aca gct gat tgg ttg act ata att gtt tac cta aca tca 384 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Thr Ile Ile Val Tyr Leu Thr Ser 115 120 125 ttc gtt gtc cca atc atc ttg aag gca ctt tat atg tta aca aca aga 432 Phe Val Val Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Thr Thr Arg 130 135 140 ggc cgg cag act tca aaa gac aac aaa ggg atg aga att aga ttt aaa 480 Gly Arg Gln Thr Ser Lys Asp Asn Lys Gly Met Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 gat gac agc tca tat gaa gat gtt aac ggg att cgg aaa cca aag cat 528 Asp Asp Ser Ser Tyr Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Lys His 165 170 175 ttg tat gtg tca atg cct aat gcc caa tct agc atg aag gct gaa gag 576 Leu Tyr Val Ser Met Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys Ala Glu Glu 180 185 190 atc aca cct ggg agc ttc cgc act gca gtt tgt ggg cta tat cct gca 624 Ile Thr Pro Gly Ser Phe Arg Thr Ala Val Cys Gly Leu Tyr Pro Ala 195 200 205 aca ata aaa gca agg aat atg gtg agt cct gtt atg agt gta gtt ggg 672 Thr Ile Lys Ala Arg Asn Met Val Ser Pro Val Met Ser Val Val Gly 210 215 220 ttc ctg gca ctg gca aag gat tgg aca tca agg att gaa gat tgg ctc 720 Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Thr Ser Arg Ile Glu Asp Trp Leu 225 230 235 240 ggg gcc cca tgc aag ttt atg gct gag tct ccc att gcc ggg agc tta 768 Gly Ala Pro Cys Lys Phe Met Ala Glu Ser Pro Ile Ala Gly Ser Leu 245 250 255 tcc ggg aat cct gta aac cgt gat tac atc cga caa agg caa ggt gca 816 Ser Gly Asn Pro Val Asn Arg Asp Tyr Ile Arg Gln Arg Gln Gly Ala 260 265 270 ctg gca ggg atg gag cct aaa gag ttt caa gcc ctc agg cag cat tca 864 Leu Ala Gly Met Glu Pro Lys Glu Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Ser 275 280 285 aaa gat gcc ggt tgt aca atg gtg gaa caa atc gaa tca cca tca tcg 912 Lys Asp Ala Gly Cys Thr Met Val Glu Gln Ile Glu Ser Pro Ser Ser 290 295 300 ata tgg gtg ttt gcc ggg gcc cct gat cgg tgc cca cca aca tgt ttg 960 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 ttt gtt ggg gga atg gct gag cta ggt gcc ttc ttc tcc ata ctt caa 1008 Phe Val Gly Gly Met Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln 325 330 335 gac atg agg aac aca att atg gct tct aag act gtg ggc act gct gat 1056 Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ala Asp 340 345 350 gag aag ctg cga aag aaa tca tca ttc tac caa tct tac ctc cgg cgc 1104 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg 355 360 365 aca caa tca atg gga att caa ctg gat cag aga ata att gtt atg ttc 1152 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Arg Ile Ile Val Met Phe 370 375 380 atg gtt gcc tgg ggc aaa gag gca gta gat aac ttt cat ctt ggt gat 1200 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 gat atg gat cca gag ctt cgt agc ctg gct cag atc ctg att gat caa 1248 Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Ser Leu Ala Gln Ile Leu Ile Asp Gln 405 410 415 aag gtg aag gag ata tca aac cag gag ccc atg aag tta 1287 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Met Lys Leu 420 425 <210> 2 <211> 429 <212> PRT <213> nucleotide sequence encoding nucleocapsid of sars corona virus <400> 2 Met Ala Thr Met Glu Glu Ile Gln Arg Glu Ile Ser Ala His Glu Gly 1 5 10 15 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Lys Asp Ala Glu Lys Gln Tyr 20 25 30 Glu Lys Asp Pro Asp Asp Leu Asn Lys Arg Ala Leu His Asp Arg Glu 35 40 45 Ser Val Ala Ala Ser Ile Gln Ser Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln 50 55 60 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Ala Gly Lys Asn Ile Gly Gln Asp Arg Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Ala Leu 85 90 95 Ser Tyr Gly Asn Thr Leu Asp Leu Asn Ser Leu Asp Ile Asp Glu Pro 100 105 110 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Thr Ile Ile Val Tyr Leu Thr Ser 115 120 125 Phe Val Val Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Thr Thr Arg 130 135 140 Gly Arg Gln Thr Ser Lys Asp Asn Lys Gly Met Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 Asp Asp Ser Ser Tyr Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Lys His 165 170 175 Leu Tyr Val Ser Met Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys Ala Glu Glu 180 185 190 Ile Thr Pro Gly Ser Phe Arg Thr Ala Val Cys Gly Leu Tyr Pro Ala 195 200 205 Thr Ile Lys Ala Arg Asn Met Val Ser Pro Val Met Ser Val Val Gly 210 215 220 Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Thr Ser Arg Ile Glu Asp Trp Leu 225 230 235 240 Gly Ala Pro Cys Lys Phe Met Ala Glu Ser Pro Ile Ala Gly Ser Leu 245 250 255 Ser Gly Asn Pro Val Asn Arg Asp Tyr Ile Arg Gln Arg Gln Gly Ala 260 265 270 Leu Ala Gly Met Glu Pro Lys Glu Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Ser 275 280 285 Lys Asp Ala Gly Cys Thr Met Val Glu Gln Ile Glu Ser Pro Ser Ser 290 295 300 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 Phe Val Gly Gly Met Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ala Asp 340 345 350 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg 355 360 365 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Arg Ile Ile Val Met Phe 370 375 380 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Ser Leu Ala Gln Ile Leu Ile Asp Gln 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Met Lys Leu 420 425<110> NEXGEN BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> Diagnosis Kits for Severe Acute Respiratory Syndrome Comprising          Nucleocapsid Protein from SARS Corona Virus Expressed in Plants <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1287 <212> DNA <213> nucleotide sequence encoding nucleocapsid of sars corona virus <220> <221> CDS (222) (1) ... (1287) <400> 1 atg gca act atg gaa gag atc cag agg gaa atc agt gca cac gag ggg 48 Met Ala Thr Met Glu Glu Ile Gln Arg Glu Ile Ser Ala His Glu Gly   1 5 10 15 cag ctt gtg ata gca cga caa aag gtc aag gat gca gaa aag cag tac 96 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Lys Asp Ala Glu Lys Gln Tyr              20 25 30 gaa aag gat cct gat gat cta aac aag agg gca ctg cat gac cgg gaa 144 Glu Lys Asp Pro Asp Asp Leu Asn Lys Arg Ala Leu His Asp Arg Glu          35 40 45 agt gtg gca gct tca atc caa tca aag att gat gag ttg aag cgc cag 192 Ser Val Ala Ala Ser Ile Gln Ser Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln      50 55 60 ctt gcc gat agg att gca gca ggg aag aac atc ggg cag gat cgg gat 240 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Ala Gly Lys Asn Ile Gly Gln Asp Arg Asp  65 70 75 80 cct acg gga gta gag cca ggt gac cac ctc aaa gag aga tca gca cta 288 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Ala Leu                  85 90 95 agc tat ggg aat aca ctg gat ctg aac agc ctt gac att gat gag cca 336 Ser Tyr Gly Asn Thr Leu Asp Leu Asn Ser Leu Asp Ile Asp Glu Pro             100 105 110 aca gga cag aca gct gat tgg ttg act ata att gtt tac cta aca tca 384 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Thr Ile Ile Val Tyr Leu Thr Ser         115 120 125 ttc gtt gtc cca atc atc ttg aag gca ctt tat atg tta aca aca aga 432 Phe Val Val Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Thr Thr Arg     130 135 140 ggc cgg cag act tca aaa gac aac aaa ggg atg aga att aga ttt aaa 480 Gly Arg Gln Thr Ser Lys Asp Asn Lys Gly Met Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 gat gac agc tca tat gaa gat gtt aac ggg att cgg aaa cca aag cat 528 Asp Asp Ser Ser Tyr Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Lys His                 165 170 175 ttg tat gtg tca atg cct aat gcc caa tct agc atg aag gct gaa gag 576 Leu Tyr Val Ser Met Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys Ala Glu Glu             180 185 190 atc aca cct ggg agc ttc cgc act gca gtt tgt ggg cta tat cct gca 624 Ile Thr Pro Gly Ser Phe Arg Thr Ala Val Cys Gly Leu Tyr Pro Ala         195 200 205 aca ata aaa gca agg aat atg gtg agt cct gtt atg agt gta gtt ggg 672 Thr Ile Lys Ala Arg Asn Met Val Ser Pro Val Met Ser Val Val Gly     210 215 220 ttc ctg gca ctg gca aag gat tgg aca tca agg att gaa gat tgg ctc 720 Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Thr Ser Arg Ile Glu Asp Trp Leu 225 230 235 240 ggg gcc cca tgc aag ttt atg gct gag tct ccc att gcc ggg agc tta 768 Gly Ala Pro Cys Lys Phe Met Ala Glu Ser Pro Ile Ala Gly Ser Leu                 245 250 255 tcc ggg aat cct gta aac cgt gat tac atc cga caa agg caa ggt gca 816 Ser Gly Asn Pro Val Asn Arg Asp Tyr Ile Arg Gln Arg Gln Gly Ala             260 265 270 ctg gca ggg atg gag cct aaa gag ttt caa gcc ctc agg cag cat tca 864 Leu Ala Gly Met Glu Pro Lys Glu Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Ser         275 280 285 aaa gat gcc ggt tgt aca atg gtg gaa caa atc gaa tca cca tca tcg 912 Lys Asp Ala Gly Cys Thr Met Val Glu Gln Ile Glu Ser Pro Ser Ser     290 295 300 ata tgg gtg ttt gcc ggg gcc cct gat cgg tgc cca cca aca tgt ttg 960 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 ttt gtt ggg gga atg gct gag cta ggt gcc ttc ttc tcc ata ctt caa 1008 Phe Val Gly Gly Met Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln                 325 330 335 gac atg agg aac aca att atg gct tct aag act gtg ggc act gct gat 1056 Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ala Asp             340 345 350 gag aag ctg cga aag aaa tca tca ttc tac caa tct tac ctc cgg cgc 1104 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg         355 360 365 aca caa tca atg gga att caa ctg gat cag aga ata att gtt atg ttc 1152 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Arg Ile Ile Val Met Phe     370 375 380 atg gtt gcc tgg ggc aaa gag gca gta gat aac ttt cat ctt ggt gat 1200 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 gat atg gat cca gag ctt cgt agc ctg gct cag atc ctg att gat caa 1248 Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Ser Leu Ala Gln Ile Leu Ile Asp Gln                 405 410 415 aag gtg aag gag ata tca aac cag gag ccc atg aag tta 1287 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Met Lys Leu             420 425 <210> 2 <211> 429 <212> PRT <213> nucleotide sequence encoding nucleocapsid of sars corona virus <400> 2 Met Ala Thr Met Glu Glu Ile Gln Arg Glu Ile Ser Ala His Glu Gly   1 5 10 15 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Lys Asp Ala Glu Lys Gln Tyr              20 25 30 Glu Lys Asp Pro Asp Asp Leu Asn Lys Arg Ala Leu His Asp Arg Glu          35 40 45 Ser Val Ala Ala Ser Ile Gln Ser Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln      50 55 60 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Ala Gly Lys Asn Ile Gly Gln Asp Arg Asp  65 70 75 80 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Ala Leu                  85 90 95 Ser Tyr Gly Asn Thr Leu Asp Leu Asn Ser Leu Asp Ile Asp Glu Pro             100 105 110 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Thr Ile Ile Val Tyr Leu Thr Ser         115 120 125 Phe Val Val Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Thr Thr Arg     130 135 140 Gly Arg Gln Thr Ser Lys Asp Asn Lys Gly Met Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 Asp Asp Ser Ser Tyr Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Lys His                 165 170 175 Leu Tyr Val Ser Met Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys Ala Glu Glu             180 185 190 Ile Thr Pro Gly Ser Phe Arg Thr Ala Val Cys Gly Leu Tyr Pro Ala         195 200 205 Thr Ile Lys Ala Arg Asn Met Val Ser Pro Val Met Ser Val Val Gly     210 215 220 Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Thr Ser Arg Ile Glu Asp Trp Leu 225 230 235 240 Gly Ala Pro Cys Lys Phe Met Ala Glu Ser Pro Ile Ala Gly Ser Leu                 245 250 255 Ser Gly Asn Pro Val Asn Arg Asp Tyr Ile Arg Gln Arg Gln Gly Ala             260 265 270 Leu Ala Gly Met Glu Pro Lys Glu Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Ser         275 280 285 Lys Asp Ala Gly Cys Thr Met Val Glu Gln Ile Glu Ser Pro Ser Ser     290 295 300 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 Phe Val Gly Gly Met Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln                 325 330 335 Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ala Asp             340 345 350 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg         355 360 365 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Arg Ile Ile Val Met Phe     370 375 380 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Ser Leu Ala Gln Ile Leu Ile Asp Gln                 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Met Lys Leu             420 425

Claims (8)

서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부를 포함하는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.A polynucleotide encoding a nucleocapsid protein of SARS corona virus comprising a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or a portion thereof. (ⅰ) 상기 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터.(Iii) the polynucleotide of claim 1; (Ii) a promoter operably linked to the polynucleotide of (iii) and acting on plant cells to form RNA molecules; And (iii) a 3'-non-detoxification site that acts on plant cells to cause 3'-end polyadenylation of the RNA molecule. 다음의 단계를 포함하는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법:A method for producing a transgenic plant expressing a nucleocapsid protein of SARS corona virus comprising the following steps: (a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계;(a) transforming a plant cell with the plant expression vector of claim 2; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및(b) selecting the transformed plant cells; And (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.(c) regenerating the plant from the transformed plant cells to obtain a transformed plant. 상기 제 3 항의 방법에 의해 제조된 식물 형질전환체.Plant transformant prepared by the method of claim 3. 다음의 단계를 포함하는 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법:Method for preparing a nucleocapsid protein of SARS corona virus comprising the following steps: (a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계;(a) transforming a plant cell with the plant expression vector of claim 2; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계;(b) selecting the transformed plant cells; (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및(c) regenerating the plant from the transformed plant cells to obtain a transformed plant; And (d) 상기 형질전환 식물체로부터 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 수득하는 단계.(d) obtaining a nucleocapsid protein of SARS corona virus from the transgenic plant. 상기 제 5 항의 방법에 의해 제조된 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질.Nucleocapsid protein of SARS corona virus prepared by the method of claim 5. 상기 제 6 항의 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 중증급성호흡기증후군의 항체 진단용 키트.Kit for diagnosing acute respiratory syndrome of claim 6 comprising the nucleocapsid protein of SARS corona virus of claim 6 as an antigen. 다음의 단계를 포함하는 중증급성호흡기증후군의 항체 측정 방법:A method for measuring antibodies of acute respiratory syndrome comprising the following steps: (a) 시험 대상의 개체로부터 시험액 (testing fluid)을 수득하는 단계;(a) obtaining a testing fluid from the subject under test; (b) 상기 제 4 항의 사스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 상기 시험액과 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 및(b) inducing an antigen-antibody reaction with the test solution using the nucleocapsid protein of SARS corona virus of claim 4 as an antigen; And (c) 상기 단계 (b)에서 항원-항체 반응의 발생 (occurrence) 여부를 측정하는 단계.(c) measuring the occurrence (occurrence) of the antigen-antibody response in step (b).
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