KR20050004130A - 한국인에서 분리된 ｈｉｖ-1 아형 ｂ의 게놈 ｄｎａ의염기서열, 이를 포함하는 분자클론 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 게놈 DNA의 염기서열, 이를 포함하는 분자클론 및 그 제조방법에 관한 것으로, PCR 재조합 기술을 이용하여 HIV-1 게놈 DNA의 전장을 포함한 한국인 아형 B의 분자클론을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

또한, 본 발명은 한국인 아형 B의 게놈 DNA의 염기서열을 분석함으로써 국내 AIDS/HIV 연구의 기초자료로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명 국내 특이적인 HIV-1 아형 B의 전장 클론은 국내 HIV 치료제 및 백신 개발에 사용될 수 있다.

Description

한국인에서 분리된 ＨＩＶ-1 아형 Ｂ의 게놈 ＤＮＡ의 염기서열, 이를 포함하는 분자클론 및 그 제조방법{A nucleotide sequence of HIV-1 subtype B genomic DNA from Korean, a molecular clone comprising the nucleotide sequence and a method for preparation thereof}

본 발명은 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 게놈 DNA의 염기서열, 이를 포함하는 분자클론 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HIV-1의 염기서열 전장을 분석하여 한국인 아형 B 군에 속하는 대상군을 선정하고 이로부터 게놈 DNA를 분리하고 이를 주형으로 하여 PCR을 실시하여 HIV-1 게놈 DNA의 전장을 얻고 이를 벡터에 도입하여 HIV-1 게놈의 전장을 포함한 분자클론을 얻고 상기 클론의 염기서열을 분석하여 유전적 특성을 조사하는 것에 관한 것이다.

HIV-1은 유전적으로나 표현형적으로 큰 다양성을 지니므로 여러 종류의 분리주들에서 세포굴성(cell tropism), 세포변성효과(cytopatic effect), 약제 감수성,그리고 병원성 등과 같은 생물학적 특징에서 많은 차이점을 나타내고 있다(Olivareset al.1998). HIV는 대륙별, 지역별로 유행하는 아형(subtype) 양상이 다르며(Louwagieet al., 1995; Miuraet al., 1990), 이러한 특성이 질병진전도의 차이를 가져올 것으로 생각되므로 그 지역에 유행하는 유행주에 따라 AIDS의 잠복기 또는 생존율 등 자연사가 달라질 수 있을 것이다.

HIV에서 유전적으로 높은 변이율이 나타나는 이유는 역전사효소(reverse transcriptase)의 높은 에러율(prestonet al., 1988; Robertset al., 1988), 바이러스가 복제하는 동안에 발생하는 재조합(Clavelet al., 1989; Coffin, 1979), 그리고 숙주의 면역체계에 의해 일어나는 선택압(selective pressure) 들이다(Borrowet al., 1997). 이러한 염기서열의 다양성은 세포굴성(O'Brienet al., 1990; Shiodaet al., 1992; Westerveltet al., 1991), 복제 속도(replication kinetics)(Fenyoet al., 1988), 세포변성활성(Tersmetteet al., 1989), 중화항체에 대한 반응(Albertet al., 1990; Naraet al., 1990), 그리고 세포독성 T-림프구(cytotoxic T lympocyte)에 대한 반응을 변화시키는(phillipset al., 1991) 등 다양한 생물학적 특징으로 나타난다.

한편, HIV에 감염된 사람의 질병 진전율은 바이러스 양(viral load)의 증가(Mellorset al., 1996), 바이러스의 전사 및 전이의 증대( Connoret al., 1994; Furtadoet al., 1995; Michaelet al., 1991; sakselaet al., 1994), 병원성이 강한 바이러스의 출현(Connoret al., 1993; Mullinset al., 1991), 숙주 면역계의 변화에 의해 빨라지며(Kleinet al., 1995), 질병진전이 느린 경우에는 불활성화된 바이러스의 감염(Deaconet al., 1995; Desrosiers 1992), 또는 케모카인 공수용체(chemokine coreceptor)의 돌연변이에 의해 일어난다(Smithet al., 1997).

이와 같이 HIV-1이 지니는 다양한 항원성은 AIDS 백신 개발에 큰 문제점으로 작용하고 있으며(Esparzaet al., 1991; Osmanovet al., 1996), 여러 연구자들은 이 같은 문제를 해결하고자 유전적 변이(genetic variation)를 지닌 여러 아형의 HIV-1을 대상으로 그 특성을 밝히고 이를 기초로 다양한 분자클론(molecular clone)을 제작하여 HIV의 유전자 발현과 질병기전과의 관계를 규명하고자 노력하고 있다.

분자클론은 HIV-1의 유전적 다양성에 관여하는 바이러스 복제와 병인의 기본 메카니즘 연구에 중요한 방법으로서 HIV-1 유전자의 생물학적, 면역학적 특성의 체계적 정보를 제공하고 AIDS 예방 백신의 개발에 중요한 자료가 된다.

HIV-1 감염 시 숙주 내에서 나타나는 바이러스 게놈의 변이로 인하여 유용 가능한 분자클론을 얻기는 쉽지 않으나 이를 얻기만 한다면 HIV-1 바이러스의 진단 및 특성 연구, 기존 치료제의 효능 분석과 새로운 치료제의 개발 그리고 다양한 아형에 따른 효과적인 백신 개발 연구에 있어 유용하게 사용될 것이다.

전 세계적으로 HIV에 관한 연구는 1992년 WHO에서 AIDS에 관련한 Global Programme(GPA/WHO)을 실험실 네트웍으로 구축하여 HIV를 분리하고 그 특성을 밝히는 연구를 수행하여 세계적으로 HIV 다양성에 관하여 지속적으로 관찰하고 연구하는 시스템이 마련되어 있다. 그리고 미국의 경우에는 1988년 National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)에서 NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program을 설치, 운영하면서 AIDS 연구자들에게 다양한 HIV 분리주, 감염성 분자클론(infectious molecular clone), 세포주, HIV 항원, 단일클론 항체 등 HIV 연구에 관련되는 모든 기본 시료를 제공하여 HIV 연구의 중심 기관으로서의 역할을 수행하고 있다. 그 외에도 The Joint United Nations Program on HIV/AIDS(UNAIDS)와 영국의 National Institute for Biological Agency and Control(NIBSC), 그리고 프랑스의 National Agency for AIDS Research들이 AIDS 연구를 위한 다양한 연구 자료들을 제공하고 있다.

한편, 우리 나라에서는 HIV에 대한 다양한 분야의 연구가 이루어지고 있기는 하지만 대부분 외국 분리주를 대상으로 하고 있으며, 대부분 게놈 전장이 아닌 유전자 일부를 통한 연구가 이루어지고 있어 유전자 발현과 질병기전과의 관계를 총체적으로 구명하기에는 어려운 점이 많다. 그러므로 국내 HIV-1의 특성 연구 및 백신 개발을 위해서는 국내 유행주에 적합한 표준화된 시료를 확보하여 클론을 제작하고, 공급하여 AIDS/HIV 연구를 활성화할 수 있는 체계적인 시스템의 도입이 요구되고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 우리 나라에서 유행하는 HIV-1 아형 B의 게놈 DNA의 전장 염기서열을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 국내 HIV 치료제와 백신 개발을 위해 상기 HIV-1 아형 B의 게놈 전장을 포함하는 분자클론 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 HIV-1의 염기서열 전장을 분석하여 한국인 아형 B 군에 속하는 대상군을 선정하여 게놈 DNA를 분리하고 이를 주형으로 하여 PCR을 실시하여 HIV-1의 5'-LTR 부위, 3'-LTR 부위 및 전장길이에 가까운 PCR 산물을 얻고 이를 벡터에 도입하여 HIV-1 게놈의 전장을 포함한 클론을 얻고 상기 클론의 염기서열을 분석하여 유전적 특성을 조사함으로써 달성하였다.

이후, 본 발명의 구체적인 구성을 설명한다.

도 1은 본 발명의 한국인 아형 B 군에 속하는 대상군을 선정하기 위한 각 피험자에 대한 HIV-1의env유전자의 V3-V5 부위의 계통 분석을 도식화한 것이다.

도 2는 한국인 대상군에서 분리한 HIV-1 전장 게놈의 계통수를 도식화한 것이다.

도 3은 8.8 kb의 HIV-1 DNA 단편에 대한 long PCR 증폭 결과를 나타낸 아가로우즈 젤 사진도이다.

도 4는 PCR 증폭 후 얻은 8.8 kb HIV-1 PCR 산물이 HIV-1의 DNA 인지를 확인한 결과를 나타낸 아가로우즈 젤 사진도이다.

도 5는 PCR 증폭 후 얻은 5' LTR 부위의 660bp와 3' LTR 부위의 1045bp HIV-1 DNA 단편에 대한 PCR 증폭 결과를 나타낸 아가로우즈 젤 사진도이다.

도 6은 PCR 재조합 기술을 이용한 HIV-1 게놈 전장을 포함한 클론의 재조합 과정을 도식화한 것이다.

도 7은 한국인 아형 B 군으로 선정된 대상군 KRB5041의 HIV-1의 5' LTR에서3' LTR 부분의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 8은 한국인 아형 B 군으로 선정된 대상군 KRB5041과 다른 대상군의 염기서열 재조합 현상을 조사한 그래프이다.

도 9는 한국인 아형 B 군으로 선정된 대상군 KRB5041의 LTR 부분의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 10은 한국인 아형 B 군으로 선정된 대상군 KRB5041의env(V3)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 11은 한국인 아형 B 군으로 선정된 대상군 KRB5041의nef의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

본 발명은 HIV-1의 한국인 아형 B 군에 속하는 대상군의 선정 단계; 상기 대상군으로부터 게놈 DNA 분리 단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 하여 HIV-1의 5'-LTR 부위, 3'-LTR 부위 및 전장길이에 가까운 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을 이용하여 HIV-1 게놈 전장을 얻고 이를 벡터에 도입하여 클로닝하는 단계; 상기에서 얻은 클론의 염기서열 분석 단계로 구성된다.

본 발명 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 전장 클론의 제조방법은 다음의 단계를 포함함을 특징으로 한다:

HIV-1의 염기서열 전장을 분석하여 한국인 아형 B 군에 속하는 대상군을 선정하여 게놈 DNA를 분리하고,

상기 게놈 DNA를 주형으로 하여, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 8분간 10 사이클을 수행한 후, 94℃ 15초, 55℃ 45초, 72℃ 1분간 30 사이클을 반복한 다음, 72℃에서 30분간 최종적으로 중합시키는 PCR 반응 조건에서, 서열목록 서열 1과 2에 기재된 프라이머를 이용하여 660 bp의 5'-LTR을, 서열목록 서열 3과 4의 프라이머를 이용하여 1,045 bp의 3'-LTR을, 서열목록 서열 5와 6의 프라이머를 이용하여 8,800bp의 전장에 가까운 길이를 포함하는 세 종류의 PCR 산물을 얻고,

상기 PCR 산물들로부터 2차 PCR을 통해 9.8 kb의 HIV-1 게놈 전장을 얻은 다음 이를 pCR 2.1 TOPO 벡터에 도입하여 클로닝하여 얻음.

본 발명은 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 게놈 전장을 포함하는 분자클론 대장균(Escherichia coli) KRB 5041.7 KFCC-11332을 제공함을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명 클론은 PCR을 이용한 재조합 기술을 사용하여 HIV-1 코딩 유전자의 전장길이를 포함하는 클론을 제작한다. 이는 제한효소를 이용한 클로닝이 정확하게 원하는 부위를 절단하여 얻어진 단편을 이용하여 클로닝할 수 있다는 장점이 있지만 제한효소 중에서 이용 가능한 것을 찾기에는 많은 제한이 있으므로 이와 같은 제한을 극복하기 위하여 제한효소 위치를 고려하지 않는 PCR을 이용한 재조합 기술의 장점을 이용한 것이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 한국인 HIV-1 아형 B 군에 속하는 대상군의 선정

한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B군에 속하는 HIV-1의 게놈 DNA의 전장을 포함하는 분자클론을 제작하기 위해, 우선 1985년부터 1999년까지 발견된 국내 HIV 감염자 중 무작위로 74명을 선정하여env부위의 유전자를 분석하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 무작위로 선정된 74명의 국내 AIDS 감염자로부터env(V3-V5) 유전자 부위를 분석한 결과, 독특한 "한국인 아형 B군(Korean subtypeB cluster)" 을 이루는 대상자 중 7명을 선정하여 HIV-1 전체 유전자를 분석하였다. 그 결과,env(V3-V5) 유전자 부위에서 나타낸 결과와 유사하게 대부분 독특한 "한국인 군집"을 이루는 것으로 나타났다. 이 결과를 바탕으로 계통수(phylogenetic tree) 상 전형적인 한국인 군집을 이루는 KRB5041를 최종 선정하여 HIV-1 전장 클론 제작에 이용하였다. 상기 계통수는 도 2에 도시하였다.

실시예 2: 한국인 HIV-1 아형 B 군의 게놈 DNA의 분리

env유전자의 특성에 따라 선정된 국내 유행주의 전장클론을 제작하기 위하여 상기에서 선정된 대상군의 배양된 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 이소퀵 키트(Isoquick, kit, 핵산추출키트 No. MXT-020-100, ORCA Research Inc., WA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하고 이를 PCR을 위한 주형으로 사용하였다.

게놈 DNA를 분리하기 위해, 배양된 PBMC에 PBS(phosphate buffered saline) 100 ㎕를 첨가하여 충분히 진탕하여 5∼15분 정도 실온에서 정치한 후 동량의 용균용액 1제(lysis solution)를 섞어서 세포를 용해시키면서 핵산을 안정화시켰다. 그 후 용균액(lysate)에 700 ㎕의 추출용액 2제(Extraction solution)를 첨가하여 잘 섞은 후, 400 ㎕의 추출용액 3제(Extraction buffer)를 넣고 10초간 진탕시켜 15,000 rpm에서 5분간 실온에서 원심분리하였다. 핵산이 포함된 상층액은 조심스럽게 새로운 튜브로 옮긴 후 상층액의 0.1배에 해당하는 3M 소듐 아세테이트를 첨가하였다. 그리고 전체 용액에 동일한 양의 이소프로판올을 넣고 부드럽게 혼합한 후에 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 펠렛을 제외한 모든 용액은 제거하고 모아진 펠렛에 70% 에탄올 1 mL을 첨가하여 5분 동안 실온에서 원심분리하고 상층액을 제거한 침전물을 건조시켰다. 건조된 DNA는 100 ㎕의 멸균증류수를 첨가하여 완전히 녹이고 흡광광도계를 이용하여 DNA 양을 정량하고 PCR 전까지 냉동 보관하였다.

실시예 3: PCR 재조합 기술을 이용한 HIV-1 게놈 DNA의 전장길이를 포함한 분자클론의 제작

본 발명 HIV-1 전장을 포함한 분자클론을 제작하기 위해, PCR을 이용한 재조합 방법을 변형하여 클론을 제작하였다. 이를 위해, 세 단계의 PCR을 수행하였다. 우선, 상기에서 얻은 게놈 DNA를 주형으로 하고 FGF61(정방향:5'-TAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTG-3')과 FGR94(역방향; 5'- CTCGATGTCAGCAGTTCTTGAAGTACTC-3')의 프라이머를 사용하여 Fang(1996)의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl,(pH8.3), dNTP(각각 2.5 mM) 8 ㎕, 0.125 mM MgCl₂, 0.4 pmole의 각 프라이머, 5 U/㎕의 엑스 택 폴리머라아제(Ex Taq polymerase, 다카라사 제품) 0.5 ㎕를 섞은 혼합액에 DNA(0.1-1 ㎍/㎕) 1 ㎕를 첨가하고 증류수로 50 ㎕를 적정하여 PCR를 수행하였다. PCR 반응 조건은 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 8분간 10 사이클을 수행한 후, 94℃ 15초, 55℃ 45초, 72℃ 1분간 30 사이클을 반복한 다음, 72℃에서 30분간 최종적으로 중합시켰다.

PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 확인하기 위하여, 1% 아가로우즈 젤에서 TAE 완충용액으로 80 V에서 50분간 전기 영동한 후, 에티디움 브로마이드 용액으로 염색하여 PCR 산물을 확인하였다(도 3). 도 3의 레인 1은 사이즈 마커, 레인 2는 KRB5041, 레인 3은 네거티브 컨트롤을 나타낸다.

도 3에 나타난 바와 같이, 상기에서 선정한 대상군의 PCR 산물은 8.8 kb의 단일밴드를 나타냈다.

상기에서 얻은 전장에 가까운 길이의 8.8 kb PCR 산물로부터 HIV-1의 구조 유전자 부위인env와pol부위에 대해 PCR을 수행하여 상기 산물이 HIV-1의 DNA인지를 아가로우즈 젤에서 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 각 대상군들은 예상대로 1.2 kb의env와 1.2 kb의pol부위를 나타내어 상기 PCR 산물이 HIV-1임을 확인하였다.

상기에서 대표적인 국내 유행주로부터 전장길이에 가까운 클론을 확보하였으나 완전한 전체 게놈의 특성을 밝히기 위해, 5’LTR과 3’LTR 부위의 클론들도 확보하고자 하였다. 5’LTR부위(660bp)의 증폭은 Salminenet al.(2000)의 방법을 변형하여 사용하였으며, PCR 반응 용액 및 반응 조건은 상기와 동일하다. 이때 프라이머는 MSF13(정방향: 5'-GGCTAGTCTAGATGGAAGGGCTAATTTGGTCCCAAA-3')과 MSR7(역방향: 5'GCATGCGGATCCGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGATT-3')을 변형하여 사용하였다.

3'-LTR과Nef유전자(1045 bp)의 증폭을 위해서는 위와 동일한 조건의 반응액에 프라이머는 Nef6(정방향: 5'-TCGCCACACCTAGAAGAATAAG-3')와 MSR8(역방향: 5'-GCATGCGAATTCCTGCTAGAG ATTTTCCACACTGA-3')를 사용하였다.

도 5에 나타난 PCR 결과와 같이, 각각 5’LTR(660bp)과nef유전자와 일부 중첩된 3’LTR(1,045bp) 부위의 PCR 산물들을 얻었다.

본 발명 HIV-1 전장을 포함한 클론을 제작하기 위해, 상기에서 얻은 HIV-1의 5' LTR(660 bp) 부분, 전장길이에 가까운 부분(8,800 bp), 그리고 3' LTR(1,045 bp) 부분 등 크기가 다른 세 종류의 PCR 산물들을 퀴아젠 젤 추출 키트(Qiagen gel Extraction Kit)를 이용하여 정제하였다. 정제된 산물들은 HIV-1 전장을 만들기 위해 5'-LTR (660 bp)과 3’LTR (1045 bp) 부위의 PCR 산물들은 2 ㎍, 8.8 kb PCR 산물 0.1 ㎍, 2.5 U rTth 폴리머라아제, 0.004 U pfu 폴리머라아제, 10 ㎛ dNTP, 1.2 mM Mg(OAc)₂, 그리고 1 x XL PCR 완충용액의 조건으로 두번째 PCR을 수행하여 HIV-1 전장길이의 게놈을 얻었다.

HIV-1 유전자임이 확인된 DNA는 pCR 2.1-TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠 사)를 이용하여 클로닝하였다.

우선, pCR 2.1-TOPO 클로닝을 위해 정제된 PCR 산물의 pCR 2.1 TOPO 벡터로의 삽입 효율을 증가시키기 위해 dATP와 Taq 폴라머라아제를 첨가하여 72℃에서 15분간 3' A 오버행잉과정을 수행하였다. PCR 산물 2 ㎕, 증류수 2 ㎕ 및 토포아이소머라아제(topoisomerase)가 포함된 벡터 1 ㎕를 혼합하여 상온에서 5분간 방치한 후, 컴피턴트 세포(competent cell)인 TOP 10 세포에 42℃에서 30초간 열 처리하고 얼음에서 2분간 정치하였다. 그 후 SOC 배지 250 ㎕/mL을 첨가하여, 진탕배양기에서 150 rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 그리고 X-gal(50 ㎍/㎕)을 도말 해 둔 앰피실핀(ampicillin, 5 ㎍/㎕)을 포함한 LB 평판배지에 형질전환된 세포들을 도말하고 37℃에서 14∼16시간 동안 배양하였다. 배양 후 형질전환된 흰색 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에 접종시켜 37℃ 진탕배양기에서 14∼16시간 동안 배양하였다.

HIV-1의 전장을 포함한 클론의 제작과정은 도 6에 도시하였다.

상기의 형질전환 결과 얻은 클론의 HIV-1 게놈 DNA 전장의 삽입여부를 알아보기 위해, 각 클론의 플라스미드를 분리하였다. 플라스미드의 분리는 알칼리 용균방법(alkaline lysis, Birnboin and Doly, 1979; Ish-Horowicz and Burke, 1981)을 사용하여 추출하였다. 우선, 현탁액을 8,000 rpm에서 원심분리하여 세포를 수집하고, 제 I 용액(50 mM 글루코우즈, 25 mM Tris-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA(pH 8.0)) 100 ㎕로 수거된 펠렛을 다시 현탁시켰다. 그 후, 제 II 용액(0.2 N NaOH, 1% SDS) 200 ㎕를 가해서 세포를 용균시키고 제 III 용액(5 M 포타슘 아세테이트 60 mL, 글라시알 아세트산(glacial acetic acid) 11.5 mL, 증류수 28.5 mL) 150 ㎕를 처리하여 DNA를 안정화 시켰다. 이를 15,000 rpm에서 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고 동일 부피의 페놀:클로로포름:아이소아밀알콜 (25:24:1) 용액을 처리하여 DNA를 회수하였다.

회수된 DNA는 70% 에탄올로 세척하여 건조시킨 후 RNase(20 ㎍/㎕)를 포함한 증류수에 용해하였다. DNA는EcoRI으로 절단하여 각 유전자의 삽입여부를 확인하였다.

상기로부터 얻은 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 게놈 전장을 포함하는형질전환체(전장 클론)를 대장균(Escherichia coli) KRB 5041.7로 명명하고, 이를 2004년 6월 17일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KFCC-11332로 기탁하였다.

실시예 4: 본 발명 HIV-1 전장을 포함한 클론의 유전체 분석

우리나라에서 유행하고 있는 HIV-1 전장 게놈의 특징을 조사하고자 상기 실시에 3에 따라 확보된 클론을 대상으로 시퀀싱을 실시하였다. 상기 실시예 3에서 얻은 본 발명 HIV-1 전장을 포함한 클론의 유전체 분석을 위해, 클로닝된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 ABI PRISM Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit(퍼킨 엘머)을 사용하여 시퀀싱하였다.

시퀀싱 PCR은 PEG로 정제한 DNA 시료 1 ㎕, 전반응혼합액(premixture) 2 ㎕, 10 pmol/㎕의 시퀀싱 프라이머 0.3 ㎕에 증류수 1.7 ㎕를 첨가하여 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분으로 25 사이클을 실시하였다. 이 PCR 산물에 증류수 15 ㎕, 소듐 아세테이트 0.1배와 에탄올 2배를 첨가하여 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전시켰다. 그리고 70% 에탄올로 세정하여 건조시키고 시퀀싱 염료 2 ㎕를 첨가하여 90 에서 2분 동안 변성시킨 후, 시퀀싱 젤에 로딩하여 염기서열을 결정하였다.

결정된 염기서열은 HIV-1 분리주 간의 유전적 거리를 계산하기 위하여 DNA 스타 팩키지(DNA star package, 미국 DNA 스타사 제품)에 있는 MegAlign program을 이용하여 clustal V method로 정렬하고 neighbor-joining method로 정렬된 분리주들의 계통수를 확인함으로써 이들의 유연관계를 분석하였다. 그리고 염기서열의 변이와 아미노산 서열의 변이는 MegAlign program을 이용하여 정렬한 후 연구 대상군의 유연관계 및 분자유전학적 변이를 분석하였다. 또한 Los Alamos Database에 보고되어 있는 여러 HIV-1 염기서열을 이용하여 비교 분석하였다.

외국에서 보고된 각 아형별 참조주들과 KRB5041.7의 유전자를 비교한 결과, 국내 분리주가 독특한 한국인 군집을 이루는 것으로 나타났다. 독특한 한국인 군집을 이루는 원인을 규명하고자 클론 KRB5041.7의 전체 유전자의 특성을 살펴보고 이를 도 7에 나타내었다(서열목록 서열 7 참조).

또한 최근 보고되는 모자이크 게놈으로 구성되는 재조합 현상이 국내 분리주에서 나타나는지 여부를 조사하고자 Los Alamos Database에서 제공하는 RIP(Recombinant Identification Program)을 이용하여 분석하였다(도 8).

도 8에 나타난 바와 같이, HIV-1 M 타입의 모든 아형과 비교하였으나 국내 유행주인 KRB5041는 전체 게놈에서 아형 B 참조주인 HXB2와 가장 높은 상동성을 나타내었으며 어떤 유전자 부위에서도 다른 아형과의 재조합이 관찰되지 않았다.

또한, 전형적인 한국인 아형 B의 특징을 나타내는 KRB5041를 기존에 보고된 외국의 대표적인 아형 B 참조주와 유전자를 비교하였다.

	gag	pol	env	vif	vpu	vpr	tat	rev	nef	평균
HXB2	94.1	95.5	86.2	91.7	81.7	92.1	87.6	81.6	84.5	88.3
pNL43	94.6	95.5	86.4	91.9	84.1	88.2	88.1	81.6	84.5	88.3
JRFL	93.7	95.6	84.9	93.4	89.0	93.5	88.5	85.5	86.6	90.1
MN	91.9	94.7	94.5	92.7	91.1	91.4	89.9	89.5	89.3	90.6
NY5	94.1	95.3	87.8	91.7	-	93.8	89.0	88.2	-	91.4
OYI	93.9	95.3	83.5	91.7	88.2	93.8	89.4	90.8	87.4	90.4
RF	91.3	95.0	84.6	91.2	-	92.4	87.2	78.9	83.3	88.0
Weau160	91.9	94.6	84.1	92.7	89.8	91.8	88.5	82.9	85.6	89.1

표 1에 나타난 바와 같이, 각 유전자별 차이는 있으나 약 80∼95%의 상동성을 나타내었다. 비교된 8종의 참조주 중 어느 특정 참조주와 두드러진 상동성을 보이지는 않았으며 각 유전자마다 모든 참조주에서 고른 상동성을 보였다.

유전자를 부위별로 분석하자면 다음과 같다:

(1) LTR: LTR 부위에서 한국인 B군에 속하는 대상군들이 보여주는 가장 독특한 특징은 -23 위치의 TATA 박스에서 TATAA가 TAAAA로 변형되어 나타나는 현상이다(도 9). 여러 종류의 참조주들과 비교 시 이 같은 결과는 아형 E에 제한적으로 나타나는 것으로서 국내 분리주의 LTR 부위에서 아형 E의 특징이 존재함을 알 수 있다. 또한, TATAA가 TAAAA로 변형되면서 TCF-1α 부위에 중첩되는 경향이 나타나는데 이는 TATA box의 변형된 기능을 보강하고자 나타나는 변이의 결과라는 주장이 제기되기도 하였다. 이 밖에 LTR 부위에서 바이러스 복제에 절대적으로 필요하지는 않지만 LTR 활성을 자극하여 세포 활성화 신호에 반응하여 바이러스 생성에 영향을 주는 NF-kB 부위는 KRB5041에서 비교적 잘 보존되어 있었으며 글리신이 풍부한 부위로서 바이러스의 유전자 조절과 복제에 관여하는 SPI^I, SPI^II, SPI^III부위도 잘 보존되어 있었다. 그리고 바이러스의 Tat 트랜스 활성 단백질과 세포 단백질의 결합에 관여하여 2차 구조에 영향을 주는 것으로 알려진 TAR 부위는 +23 위치가 C로 나타나는데 이는 기존의 외국 분리주 아형 B 참조주에서 나타나는 U와 달리 아형 E에서 나타나는 특징적인 염기배열이다. 이상과 같이 LTR 부위의 염기서열을 분석한 결과 전체적으로는 아형 B와 유사한 경향을 보이지만 일부 부위에서는 아형 E의 특징적인 염기배열이 나타나 이 같은 염기의 변화가 바이러스 기능에 미치는 영향은좀 더 진전된 연구를 통하여 규명되어야 할 것으로 사료된다.

(2)gag: 약 1.5 kb의gag부위의 유전자를 분석한 결과, 아미노산 구성에서 25∼33까지의 nuclear localization signal에서 30번째 아미노산이 국내 분리주에서 나타나는 R과는 달리 K로 나타나 외국 분리주 B와 유사하였으며 203번째 아미노산은 B 타입을 제외한 다른 타입에서 나타나는 D로 확인되었다.gag유전자에서 상동한 부위로 알려진 285∼304까지의 아미노산은 잘 보존되어 있었으며 basic region인 징크 핑거(zinc finger)의 398, 427번째 아미노산은 E와 T가 각각 I와 N으로 치환된 것으로 나타났다.

(3)pol: 역전사효소, 프로테아제 및 인티그라아제의 발현을 암호화하는pol유전자 부위에서 KRB5041.7은 역전사효소의 촉매 활성에 중요한 역할을 하는 YMDD 모티프는 완전하게 보존되어 있었고, 프로테아제 코딩 부위의 활성 사이트와 기질 결합 부위에서도 변이가 나타나지 않았다. 그리고 인티그라아제 코딩 부위의 징크 핑거 부분에서 20번째 아미노산이 I로 이루어져 외국 분리주들에서 나타나는 V와는 다른 배열을 지녔으며 중앙 촉매 도메인(central catalytic domain)의 62번째 아미노산이 N으로 나타나 국내의 다른 분리주들과 일치되었다. 그리고 비특이 DNA 결합 부위의 두번째 아미노산은 비교된 다른 모든 균주들이 I로 이루어졌으나 KRB5041.7만 M으로 이루어졌다.

(4)env : env는 160 kD의 한 스플라이스드 mRNA(spliced mRNA) 로부터 발현되는 유전자로 세포내 프로테아제에 의해 gp41과 gp120으로 나뉘어 특정 도메인에의해 HIV와 세포 표면에 있는 CD4 수용체 사이의 상호작용을 매개하는 HIV의 중요한 구조 유전자이다. gp120은 9개의 매우 보존적인 18개의 시스테인 잔기에 의해 사슬 간에 이황화 결합(intrachain disulfide bond)을 가지고 있고 5개의 다변부위(hypervariable(V1-V5))과 5개의 보존 부위(conserved region(C1-C5)를 가지고 있다. KRB5041.7 클론의 염기서열을 분석한 결과 V1 부위에서 높은 변이를 나타내었으며 아형 B 참조주인 HXB2와 비교시 하나의 아미노산이 결손된 것으로 나타났다. V2 부위 역시 다양한 아미노산 변이가 관찰되었으나 바이러스 복제에 중요하다고 알려진 207번 아미노산인 Asp는 잘 보존되어 있었다. 또한 당단백질 중화 도메인(glycoprotein neutralizing domain)으로 알려진 V3 부위의 끝에 위치하는 4개의 모티프는 GPGS로 이루어졌으며(도 10), V4 부위는 N-당화 사이트(N-glycosylation site)가 다른 부위에 비해 많이 존재하는 것으로 나타났다.

(5)vif: 이 부위는 192개의 아미노산으로 구성되어 HIV에 감염된 세포의 세포질에서 높은 수준으로 발현되어 HIV-1 비리온의 감염성을 증진시키는데 관여하는 유전자로서 KRB5041의 염기서열을 분석한 결과, 이 부위의 중심역할을 하는 114, 133 위치의 시스테인이 모두 잘 보존되어 있고 변이가 없는 아미노산 모티프인 SLQYLA도 잘 보존되어 있어 뚜렷한 유전자의 변이가 관찰되지 않았다.

(6)vpr:vpr은 96개의 아미노산으로 이루어진 유전자 산물로 핵 유입과 세포의 제어에 관여하는 것으로 알려져 있다. 비리온 조합에 관여하는 주요 지점인 +29 ∼ +36과 세포주기의 정지에 관여하는 +85 ∼ +95 부위에서 KRB5041.7은 변이가 나타나지 않았다.

(7)vpu: 이 유전자 부위는 감염된 세포로부터 비리온의 방출을 증진시키고세포내 소포체의 선택적인 분쇄를 유도하는 일련의 과정을 조절한다. 특히 53, 57번의 세린 잔기의 인산화는 CD4 분해에 필수적인 부분으로 알려져 있는데 KRB5041.7의 경우 두 위치의 아미노산 모두 잘 보존되어 있었으며 CD4의 세포질쪽 꼬리 부착에 관여하는 α-헬릭스 구조에서 35번 위치의 아미노산이 다른 외국 아형 B에서 나타나는 R과 달리 K로 이루어져 있었다.

(8)nef: KRB5041.7의nef유전자를 분석한 결과 계통수 상에서는 다른 국내 분리주들과 같은 유연 관계를 나타내었으며, 아미노산의 구성에서는 N-말단의 글리신에 미스트산(mystic acid)이 결합하는 미리스토일레이션 사이트( myristoylation site)와 acid cluster region의 EEEE 모티프는 변이없이 잘 보존된 것으로 확인되었으며 β-턴 모티프(turn motif)인 GPGI(V)는 GPGV로서 다른 국내 분리주들과 동일한 양상으로 나타났다(도 11).

(9)tat: tat 유전자는 3’LTR에 존재하는 tat-반응 요소(responsive element)라 불리는 RNA 루프 구조와 상호 작용하는 단백질로 HIV 복제를 상승시켜주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 58번째의 아미노산이 알라닌에서 트레오닌으로 치환될 경우 복제에 영향을 준다는 보고가 있으나, KRB5041.7에서는 아미노산 치환이 관찰되지 않았으며 시스테인이 풍부한 부위인 21번 아미노산은 P로 이루어졌는데 이는 C, D, G 등의 아형에서 나타나는 아미노산 배열이다. 그리고 62번째의 N은 아형 A에서 관찰되는 아미노산으로 위 결과들은 모두 비교한 다른 국내 분리주들과 유사한 경향이다. 한편 9, 46, 78번째의 아미노산은 다른 국내 분리주들과 달리 각각 D, Y, P로 이루어 졌다. 그러나 이 같은 일부 염기 서열의 변이에도 불구하고 계통학적으로는 다른 유전자 부위에서 나타나는 결과와 마찬가지로 역시 아형 B의 가장자리에 위치하고 있었다.

(10)rev: KRB5041.7의rev유전자의 분석 결과 16번 위치가 아형 A에서 나타나는 I로 조사되었는데 이는 다른 외국 여러 분리주들에서 나타나는 V와 달리 국내 분리주에서만 나타나는 특징적인 결과이다.rev는 바이러스 외막 mRNA에 위치한 rev 반응요소라는 RNA 루프 구조를 활성화하여 바이러스 자손 형성에 필요한 전장 길이의 바이러스 단백질을 핵에서 세포질로 들어오게 하는 역할을 하는 유전자로서 KRB5041.7에서는 염기서열상의 결과에서 뚜렷한 변이가 나타나지는 않았다.

상기 실시예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 게놈 DNA의 염기서열, 이를 포함하는 분자클론 및 그 제작방법에 관한 것으로, PCR 재조합 기술을 이용하여 HIV-1 게놈의 전장을 포함한 한국인 아형 B의 분자클론을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

또한, 본 발명은 한국인 아형 B의 게놈 DNA의 염기서열을 분석함으로써 국내 AIDS/HIV 연구의 기초자료로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명 국내 특이적인 HIV-1 아형 B의 전장클론은 국내 HIV 치료제 및 백신 개발에 사용될 수 있으므로 약학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

<110> National Institute of Health <120> A nucleotide sequence of HIV-1 subtype B genomic DNA from Korean, a molecular clone comprising the nucleotide sequence and a method for preparation thereof <150> KR2003-0044521 <151> 2003-07-02 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for PCR amplification of 5'LTR <400> 1 ggctagtcta gatggaaggg ctaatttggt cccaaa 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for PCR amplification of 5' LTR <400> 2 gcatgcggat ccgttcgggc gccactgcta gagatt 36 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for PCR amplification of sequence with 3'LTR <400> 3 tcgccacacc tagaagaata ag 22 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for PCR amplification of sequence with 3'LTR <400> 4 gcatgcgaat tcctgctaga gattttccac actga 35 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for PCR amplification of seqence containing near full length <400> 5 tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtg 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for PCR amplification of sequence containing near full length <400> 6 ctcgatgtca gcagttcttg aagtactc 28 <210> 7 <211> 9737 <212> DNA <213> Homo sapiens(Korean) <400> 7 tggaagggct aatttggtcc caaaagagac aagatatact tgatttatgg gtatatcaca 60 cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120 tgacctttgg gtggtgcttc aagctagtac cagttgatcc agaaaagtta gaagaggcca 180 ctgtaggaga gaacaactgc ttgttacatc ccataaacac gcatggaatg gatgacccgg 240 agaaagaagt gttacagtgg aagtttgaca gccgcctggc atttcatcac ttggcccgag 300 agaaacatcc ggagttctac aaggactgct gacactgaac tttctacaag ggactttccg 360 ctggggactt tccaggggag gcgtggcctg ggcgggaccg gggagtggcg agccctcaga 420 tgctgcataa aagcagctgc tttctgcctg tactgggtct ctctggttag accagatccg 480 agcctgggag ctctctggct gactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc 540 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aacaaaatcc agacatagtt atctatcaat acatggatga tttatatgta 3120 ggatctgact tagaaatagg gcagcataga acaaaaatag aggaactgag acaacatctg 3180 tggaagtggg ggttttacac accagacaaa aaacatcaga aagaaccccc attcctttgg 3240 atgggttatg aactccatcc tgataagtgg acagtacagc ctatagtgct accagaaaaa 3300 gacagctgga ctgtcaatga catacagaag ttagtgggaa aactgaattg ggcaagtcag 3360 atttatgcag ggattaaagt aaagcagtta tgtaaactcc ttaggggaac caaggcacta 3420 acagaagtag taccactaac agaagaagca gagctagaac tggcagaaac cagggagatt 3480 ctaaaagaac cagtacatgg agtttattat gacccatcaa aagacttaat agcagaaata 3540 cagaagcagg ggcaaggcca atggacatat caaatttatc aagagccatt taaaaatctg 3600 aaaacaggaa aatatgcaaa aatgagaagt gcccacacta atgatgtaaa acaattaaca 3660 gaggtagtgc aaaaaatagc cacagaaagc atagtaatat ggggaaagac tcctaaattt 3720 agactaccca tacaaaaaga aacatgggaa gcatggtgga cagagtattg gcaggccact 3780 tggattcctg agtgggagtt tgtcaatacc cctcctttag tgaaattatg gtaccagtta 3840 gaaaaagaac ccatagtagg agcagaaact ttctatgtag atggagcagc taatagggaa 3900 actagattag 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Claims (3)

1. HIV-1의 염기서열 전장을 분석하여 한국인 아형 B 군에 속하는 대상군을 선정하여 게놈 DNA를 분리하고,

   상기 게놈 DNA를 주형으로 하여, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 8분간 10 사이클을 수행한 후, 94℃ 15초, 55℃ 45초, 72℃ 1분간 30 사이클을 반복한 다음, 72℃에서 30분간 최종적으로 중합시키는 PCR 반응 조건에서, 서열목록 서열 1과 2에 기재된 프라이머를 이용하여 660 bp의 5'-LTR을, 서열목록 서열 3과 4의 프라이머를 이용하여 1,045 bp의 3'-LTR을, 서열목록 서열 5와 6의 프라이머를 이용하여 8,800 bp의 전장에 가까운 길이를 포함하는 세 종류의 PCR 산물을 얻고,

   상기 PCR 산물들로부터 2차 PCR을 통해 9.8 kb의 HIV-1 게놈 전장을 얻은 다음 이를 pCR 2.1 TOPO 벡터에 도입하여 클로닝하여 얻음을 특징으로 하는 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 전장 클론의 제조방법.
2. 서열목록 서열 7에 기재된 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 HIV-1 게놈 DNA의 염기서열.
3. 제 1항에 기재된 방법에 의해 제작되고, 서열목록 서열 7에 기재된 한국인에서 분리된 HIV-1 아형 B의 게놈 전장을 포함함을 특징으로 하는 대장균(Escherichia coli) KRB 5041.7 KFCC-11332.