KR20040108321A

KR20040108321A - 뇌혈관장벽 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20040108321A
Application number: KR1020030073538A
Authority: KR
Inventors: 김규원
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2003-06-14
Filing date: 2003-10-21
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2023-10-21
Also published as: KR100601361B1

Abstract

본 발명은 SSeCKS(src-suppressed C kinase substrate) 단백질 또는 이러한 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터를 포함하는, 뇌혈관 신생과 뇌혈관 내피세포의 폐쇄연접 형성을 조절함으로써 뇌혈관장벽 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

뇌혈관장벽 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing disorders of blood-brain barrier}

본 발명은 SSeCKS(src-suppressed C kinase substrate) 단백질 또는 이러한 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 뇌혈관장벽 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 뇌혈관 신생과 뇌혈관 내피세포의 폐쇄연접 형성을 조절하는 SSeCKS 단백질 또는 이러한 단백질의 발현 재조합 발현 벡터를 포함하는 뇌혈관장벽 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

신경조직에는 특정한 물질들이 혈관으로부터 들어가는 것을 막는 일종의 장벽이 존재한다. 이러한 기능적인 장벽을 뇌혈관장벽(blood-brain barrier: BBB, 또는 뇌혈관관문)이라고 한다. 뇌혈관장벽은 신경의 미세 환경의 항상성을 유지하는뇌모세혈관이 매우 분화되어 있는 형태이다. 뇌혈관장벽은 신경조직에 있는 모세혈관이 다른 조직에 비해 낮은 혈관 투과성을 유지함으로써 쓸모없는 물질들의 이동을 최소한으로 유지할 수 있도록 형성된 구조이다. 뇌혈관장벽을 이루는 주된 구조는 모세혈관 내피세포(capillary endothelial cell)에 있는 폐쇄연접(tight junction) 또는 폐쇄띠(zonula occluden)으로 구성되어 있다. 내피세포의 세포질에는 다른 여러 부위의 모세혈관에서 볼 수 있는 창(fenestra)이 없으며, 포음소포(pinocytotic vesicle)도 아주 드물게 존재한다. 신경조직에 필요한 작은 분자량의 물질은 세포막에 있는 운반물질(carrier)과 결합되어 내피를 통해 뇌실질로 들어간다.

뇌혈관장벽은 이온이나 단백질, 기타 물질이 중추신경계 환경으로 불특정 유입되는 것을 차단하므로, 이러한 장벽으로서의 역할은 혈액으로부터 공급되는 해로운 성분들로부터 신경원을 보호하며 필수적인 물질들은 투과되도록 한다. 뇌경색, 외상 및 뇌종양과 같은 뇌 손상의 대부분은 뇌혈관장벽의 붕괴와 연관되며 이는 신경원의 이차적인 손상을 초래한다. 따라서, 뇌혈관장벽의 발생 기전과 조절에 대한 연구는 중추신경계 질환을 이해하고 치료하는데 매우 중요하다.

또한, 많은 종류의 약물과 대사물질이 뇌혈관장벽을 투과하지 못하므로, 뇌혈관장벽의 적절한 조절은, 치매를 포함한 여러가지 뇌질환을 치료함에 있어서 약물을 적재적소에 투여할 수 있는 아주 중요한 부분이 된다고 할 수 있다. 뇌혈관장벽은 염증성질환(inflammatory disease), 종양(tumor) 등 여러 질환에서 손상되며, 외상(injury) 후에도 2 내지 3 주일 정도 기능을 못하는 경우가 있다. 이러한 성질을 이용하여 혈액 내로 추적물질(tracer substance)을 준 후 이 물질이 뇌의 어느 부분으로 투과해 들어가는지를 관찰하면 병변이 있는 장소를 추측할 수 있다. 그러나, 지금까지 이러한 뇌혈관장벽의 조절에 관하여는 연구가 거의 되어있지 않은 상황이다.

뇌혈관장벽의 발생은 크게 두 단계, 뇌혈관 신생과 뇌혈관장벽의 분화로 분류할 수 있다. 첫 단계에서는 투과 가능한 혈관에서 유도된 뇌혈관 내피세포가 무혈관성 신경외배엽으로 침투하여 신경내 혈관을 형성한다. 두 번째 단계에서는 후기 배아 상태와 초기 출생 후 기간동안 뇌모세혈관이 성상교세포와 함께 분화하고, 점차적으로 성숙하며 비투과성을 가진 뇌혈관장벽으로서 개조된다.

이러한 뇌혈관장벽 발생의 두 단계는 여러 조직이나 기관의 혈관 발생 과정에서 중요한 역할을 하는 산소 분압에 의하여 조절될 수 있다(Risau, W., Nature, 386, 671-674, 1997; Maltepe, E. & Simon, M.C., J. Mol.Med., 76, 391-401, 1998; Lee, Y.M. et al., Dev. Dyn., 220, 175-186, 2001). 본 발명 이전, 생체내서의 발생 과정 중인 래트의 대뇌피질에서 저산소 영역이 점진적으로 사라진다는 사실이 보고되었다(Lee, Y.M. et al., Dev. Dyn., 220, 175-186, 2001). 특히, 성상교세포가 재산소화(reoxygenation) 환경에서 뇌혈관 신생을 억제하며 내피세포가 뇌혈관장벽으로서의 성질을 갖추어 나가는 데에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Song, H.S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 290, 325-331, 2002). 그러나, 뇌혈관장벽 발생과정의 분자적 기전은 정확히 규명되지 않았으며 뇌질환 치료에 있어서 뇌혈관장벽의 분자기전 연구가 절실히 요구된다.

상기한 바와 같이, 뇌혈관장벽은 뇌의 항상성과 낮은 투과도 유지에 필수적이다. 뇌혈관장벽은 알츠하이머 병, 허혈성 뇌질환 등을 포함한 뇌 관련 이상 질환과 관련하여 많이 파괴되어 있다. 이와 같이 뇌 관련 질환과 뇌혈관장벽이 많은 부분 관련되어 있으므로 이러한 장벽의 유지는 중추신경계의 유지와 올바른 신호전달을 위해 아주 중요하다.

이러한 배경하에서, 본 발명자는 SSeCKS(src-suppressed C kinase substrate)가 AP-1의 감소 과정을 거쳐 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 발현을 억제하고 성상교세포(astrocyte)상에서 반투과성 물질로 작용하는 안기오포이에틴-1(angiopoietin-1)의 발현은 촉진시킨다는 사실을 확인하였다. 또한, SSeCKS를 과도하게 발현하는 성상교세포의 조건-조절된 배지(SSeCKS CM)가 생체내(in vivo)및 시험관내(in vitro)에서 혈관 신생을 저해한다는 것을 확인하였다. 또한, SSeCKS CM은 내피세포 내의 폐쇄연접 단백질을 증가시켜 [³H]슈크로즈 투과도를 감소시킨다는 것을 확인하였다. 또한, 뇌혈관장벽이 성숙되는 시기에 SSeCKS의 면역학적 반응성이 점차적으로 증가하고 SSeCKS를 발현하는 성상교세포가 ZO-1을 발현하는 혈관과 밀접하게 생체내에서 상호 작용함을 확인하였다. 이상과 같이, 본 발명자는 SSeCKS가 뇌혈관 신생과 폐쇄연접 형성을 조절함으로써 뇌혈관장벽의 분화를 유도-조절하는 중요한 인자임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

도 1은 산소농도에 따른 SSeCKS(src-suppressed C kinase substrate) 발현의 조절을 나타낸다. 도 1a와 도 1b에서 성상교세포(astrocyte)는 각각 24시간 동안 1) 정상 산소 농도(N), 2) 저산소 농도(H) 및 3)저산소 후 1,3,6,9시간 동안 다시 산소를 공급하는 3가지 조건에서 배양하였다. 각 시간대별로 총 세포 추출물과 RNA를 분리하여 각각 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)과 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 수행하였다. 알파-튜블린(α-tubulin)과 베타-액틴(β-actin)을 내부 대조군으로 사용하였다. 세 번의 실험결과로부터 얻은 정량 그래프를 우측에 제시하였다. 도 1c에서 성상교세포는 각각 1) 정상 산소 농도(N), 2) 저산소 농도(H) 및 3) 산소 재공급 단독 및 3시간 동안 액티노마이신 D (acionomycin D) (25 또는 50 ug/ml)을 처리한 산소 재공급 상태에서 배양하고 RT-PCR을 수행하였다. 세 번의 실험결과로부터 얻은 정량그래프를 우측에 제시하였다.

도 2는 생체내와 시험관내에서의 SSeCKS의 혈관 신생 억제 작용을 나타낸다. 도 2a는 CAM(chick chorioallantoic membrane) 검정 결과로서, 대조군CM(conditioned medium) (Mock)과 SSeCKS군 CM (SSe)의 혈관 신생 억제를 정량적으로 측정한 결과이다. 1ug의 레티노산(retinoic acid, RA)은 음성 대조군으로 사용하였다. 도 2b는 매트리겔 플러그 검정(Matrigel plug assay) 결과로서, 대조군 CM (Mock) 또는 SSeCKS군 CM (SSe)을 매트리겔 및 헤파린 (8u/ml)과 함께 C57BL/6 마우스에 주사하였고, 7일 후에 매트리겔 플러그를 제거하여 헤모글로빈 함량을 측정하였다(*: bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 Mock CM과 비교시 P<0.5). 도 2c 및 도 2d는 각각 HBMEC(human brain microvascular endothelial cell)의 이동(도 2c, 16시간) 및 관형성(도 2d, 24시간)을 관측한 결과이다. Mock는 성장배지와 Mock CM을, SSe는 성장배지와 SSeCKS CM을 합한 것이다(*: Mock CM과 비교시 P<0.01). 도 2의 결과는 모두 독립적인 세번의 반복 실험에 의한 것이다.

도 3은 SSeCKS 과다발현에 의한 VEGF(vascular endothelial growth factor)발현과 AP-1 전사능력의 감소를 나타낸다. 도 3a는 VEGF의 발현을 SSeCKS를 과발현시킨 성상교세포에서 측정한 결과이다. 재현성있는 웨스턴 블럿 결과를 나타내었다(n=3). 도 3b는 Mock 또는 SSeCKS 트랜스펙턴트(transfactant)로부터의 CM을 모아서 HBMEC에 각각을 처리하여 배양한 결과이다. 재현성있는 웨스턴 블럿 결과를 보였다(n=5). 도 3c는 JNK, ERK, AP-1의 발현에 대한 SSeCKS의 영향을 나타낸다. 웨스턴 블럿은 Mock 또는 SSeCKS를 트랜스펙션시킨 CTX-TNA2로부터 얻은 총세포 추출물을 사용하여 실시하였다. 재현성 있는 웨스턴 블럿 결과를 나타내었다(n=3). 도 3d는 전기이동 쉬프트 검정(Electromobility shift assay)으로서, AP-1 결합 서열의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 CTX-TNA2에서 수행하였다[M, Mock 트랜스펙턴트; S, SSeCKS 트랜스펙턴트; 경쟁자, 표지하지 않은 올리고뉴클레오타이드]. 도 3e는 SSeCKS에 의한 AP-1의 전사능 억제효과를 나타낸다. pAP1-Luc(2ug)을 pcDNA3 또는 pcDNA3-SSeCKS 발현벡터와 함께 CTX-TNA2에 트랜스펙션시켰다[*: pAP1-Luc 트랜스펙턴트 활성과 비교시 P<0.01]. 각각 독립적으로 반복실험을 실시하였다.

도 4는 SSeCKS가 과다발현되는 성상교세포에 의한 혈관 투과성과 BBB(blood-brain barrier) 마커 유전자 발현의 조절을 나타낸다. 도 4a는 '무접촉(without contact)' 시스템에서 [³H] 슈크로즈 투과성을 측정한 결과이다. Con, 성상교세포가 없는 HBMEC 단독; AST, 공벡터를 트랜스펙션시킨 성상교세포와 HBMEC를 함께 배양; SSeCKS, SSeCKS를 트랜스펙션시킨 성상교세포와 HBMEC를 함께 배양[*: HBMEC-AST 동시배양군과 비교시 P<0.01]. 세번의 독립적인 실험을 수행하였다. 도 4b는 Ang-1의 발현을 측정한 결과이다. AST: sense-SSeCKS (S)와 antisense-SSeCKS (Anti-S)를 트랜스펙션시킨 성상교세포에서 Ang-1의 발현, CM: CM에서 Ang-1의 발현. 웨스턴 블럿은 동용적의 CM으로 수행하였다. 재현성있는 웨스턴 블럿 결과를 보였다(n=4). 도 4c는 Ang-1을 중화시킨 SSeCKS CM이 HBMEC에서 폐쇄연접 단백질의 발현을 감소시키고 VEGF의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다. HBMEC에 적용하기 전에 Ang-1(5ug/ml) 항체는 SSeCKS CM과 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세번의 실험에 대한 정량 그래프가 우측에 제시되었다. 대조군 IgG로 중화시킨 SSeCKS CM을 대조군으로 사용하였다. M, Mock CM (밝은 회색); S, SSeCKS CM (검은색); S/A, Ang-1 항체로 중화시킨 SSeCKS CM (흰색); S/I, 대조군 IgG 항체로 중화시킨 SSeCKS CM (어두운 회색). 도 4d는 HBMEC를 트랜스웰 필터에 시딩하고 [³H]슈크로즈 투과성을 검정한 결과를 나타낸다. Anti-S, antisense-SSeCKS CM [*: Mock CM으로 배양한 HBMEC과 비교시 P<0.01, #: SSeCKS CM으로 배양한 HBMEC과 비교시 P<0.5]. 각 실험은 세번 반복했다. 도 4e는 ZO-1(zonular occluden-1) 특이 항체와 이어서 FITC-결합된 이차 항체를 이용한 면역형광염색 결과를 나타낸다. M, Mock CM; SSe, SSeCKS CM; AnS, antisense-SSeCKS CM. 재현성있는 결과를 나타내었다(n=3). Scale bar, 70uM. 화살촉, ZO-1의 발현이 억제됨.

도 5는 마우스 뇌의 발생과정에서의 SSeCKS, VEGF 및 ZO-1의 면역조직화학염색을 나타낸다. 도 5a는 머리를 두정 절개(coronal section)한 다음 SSeCKS(왼쪽), VEGF(중간) 및 ZO-1(오른쪽)에 대한 각각의 항체를 이용해 면역염색한 결과이다. SSeCKS와 ZO-1의 양성 면역반응성은 DAB의 갈색으로 확인하였고, VEGF에 대한 것은 AEC의 적색으로 확인하였다. 음성 대조군은 토끼 IgG로 염색하였다; 화살표, 각 특정 항체의 면역반응성. Scale bar, 50uM. 도 5b는 각각의 염색된 면적을 분석해서 면역반응성을 정량화한 것이다. 개개의 상대적인 염색 면적(%)은 성체(SSeCKS와 ZO-1)과 P3(VEGF)의 염색면적을 100%로 하여 나타내었다.

도 6은 성체 마우스의 뇌에서 SSeCKS, GFAP(glial fibillary acidic protein) 및 ZO-1의 이중면역염색 결과를 나타낸다. 도 6a에서 성체의 뇌는 SSeCKS, GFAP, ZO-1 및 PECAM으로 염색하였다. 대조군 IgG로 염색한 음성 대조군에서는 양성 면역 염색되지 않았다(자료 나타나지 않음). 도 6b는 이중 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다. SSeCKS의 양성 면역반응성은 NBT/BCIP의 파란색으로 확인되었으며 ZO-1의 것은 Fast red의 적색으로 확인되었다. SSeCKS를 발현하는 성상교세포(화살표)는 ZO-1을 발현하는 혈관(화살촉)으로 둘러 쌓여있다. Scale bar, 100uM. 도 6c는 SSeCKS(녹색)와 성상교세포의 특이 마커인 GFAP(적색)의 이중 면역형광염색 결과를 나타낸다. SSeCKS와 GFAP는 선명하게 겹쳐졌다. 녹색과 적색의 중첩은 노란형광으로 나타났다. Scale bar, 70uM.

SSeCKS(src-suppressed C kinase subtate)는 PKC(protein kinase C)의 기질이며 잠재적인 암 억제 인자로 공지되어 있다(미국 특허 제6,582,956호, 2003년 6월 24일). 상기 미국 특허에는 SSeCKS 단백질의 아미노산 서열이 개시되어 있다. 설치류의 SSeCKS와 유사체로 알려진 인간에서의 그라빈(gravin)은 PKC, PKA, 칼모둘린(calmodulin), 사이클린(cyclin), 베타 아드레날린성 수용체와 같은 신호 전달 단백질의 선택적 결합을 통한 유사분열, 염증반응, 발생 및 분화의 조절인자로 작용한다. SSeCKS의 발현은 몇몇 발암 유전자에 의해서 저해되며, 전립선암, 난소암, 유방암 등 다양한 암에서 강하게 억제된다. SSeCKS의 재발현이 전립선의 발암 과정의 진행을 억제한다는 증거가 존재함에도 불구하고 SSeCKS의 암 억제 활성은 규명된 바 없으며, 혈관 신생과 정상적인 뇌발생 과정에서 SSeCKS의 역할에 대해서도 전혀 알려진 바 없었다.

본 발명자는 본 발명 이전의 보고에서 산소의 농도차가 뇌 발생 동안 뇌혈관장벽의 성숙에 강한 견인력으로 작용할 것이라고 제시한 바 있었으나, 어떤 요소들이 관여를 하는지, 그리고 어떤 신호전달이 이 과정에 작용하는지는 불확실하였다. 본 발명자는 성상교세포내에서 산소에 의해 조절되는 뇌혈관장벽의 성숙 인자를 찾기 위하여 cDNA RDA(representational difference analysis)를 수행하여 SSeCKS를 포함하는 15개의 유전자를 수득하였으며, 이중 SSeCKS mRNA와 단백질이 산소 농도에 의해 매우 밀접하게 조절된다는 것을 알아내었다.

cDNA RDA 기술은 두 개의 다른 조직 표본으로부터 얻은 cDNA를 동시에 비교할 수 있다. 예를 들어 암세포의 대사가 정지된 상태에서 얻은 표본과 대사가 정지되지 않은 상태에서 계속적으로 진행되고 있는 표본을 비교하는 것이다. 또한 시험관내 실험으로 동일한 세포에서 여러가지 화학물질 또는 스트레스에 의해 변화하는 인자들을 비교분석 할 수 있는 방법이다.

뇌혈관장벽이 발생하는 동안, 뇌의 혈관 신생은 멈추고 뇌의 모세혈관은 점차 뇌혈관장벽으로 분화된다(Plate, K.H., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 58, 313-320, 1999; Breier, G. et al., Development 114, 521-532, 1992). 뇌혈관장벽에는 폐쇄연접(tight junction)이 존재하며, 이것은 높은 내피세포투과 전기저항을 가지게 하며 물질 투과성을 감소시킨다(Nico, B. et al., Brain Res. Dev. Brain Res. 114, 161-169, 1999; Rubin, L.L. et al., J. Cell Biol., 115, 1725-1735, 1991). 투과성이 있는 혈관이 뇌혈관장벽으로 분화되는 동안, 대뇌의 미세혈관은 뇌의 내피세포 사이의 접합 형성을 스위칭(switching)하고 유지하는 성상교세포의 끝에 의해 둘러 쌓이게 된다(Janzer, R.C., et al., Nature, 325, 253-257, 1987). 본 발명자는 혈관 신생이 생체내에서 SSeCKS CM에 의해 현저히 저해되며, SSeCKS CM이 HBMEC의 이동과 혈관 형성을 저해하고(도 2), SSeCKS를 과다발현시킨 성상교세포가 [³H]슈크로즈에 대한 투과도가 감소되는 특징을 유도함으로써 혈관내피세포 사이의 폐쇄연접의 형성을 확연히 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 4a 및 4d).

Ang-1(angiopoietin-1)과 VEGF(vascular endothelial growth factor)는 혈관 형성 동안에 상보적인 역할을 한다. Ang-1은 혈관의 재생성과 성숙화 및 안정화 과정이라는 후반부에 작용을 하는 반면에 VEGF는 초반에 작용을 한다(Thurston, G. et al., Nat. Med., 6, 460-463, 2000). VEGF는 그 발현이 뇌의 혈관 신생과 연관되는 혈관 신생 성장 인자이다. 이의 발현은 혈관 신생 동안 배아의 뇌에서 매우 높으며, 혈관 신생이 정상의 생리학적 상태로 하향-조절되는 성체의 뇌에서는 낮다(Breier, G. et al., Development, 114, 521-532, 1992). 초기에 혈관투과성 유도인자로 불리우던 VEGF를 처리하는 경우 오클루딘(occludin) 및 ZO-1의 발현 정도가 감소하였다(Dvorak, H.F. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 237, 97-132, 1999; Wang, W. et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 280, H434-H440, 2001; Fisher, S. et al., Microvasc. Res., 63, 70-80, 2002). 이 단백질들의 손실에 의한 폐쇄연접의 붕괴는 HIV-1 뇌염에서 뇌혈액 관문의 누출을 증가시켰다(Dallasta, L.M. et al., Am. J. Pathol., 155, 1915-1927, 1999). 본 발명자는 SSeCKS가 VEGF의 발현을 감소시키고, VEGF 조절부위에 결합하는 전사인자 중 하나인 AP-1의 전자조절 능력과 DNA 결합성을 모두 강하게 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 3)(Levy, A.P. et al., J. Biol. Chem., 270, 13333-13340, 1995). Ang-1은 강력한 물질투과성 저해 인자이고, 혈관의 누출을 감소시킬 수 있다. 뇌혈관장벽이 파괴되면, 손상을 입은 혈관들에서는 Ang-1 면역반응성이 감소되며, 이는 Ang-1이 누출을 막는 역할을 수행한다는 것을 제시한다(Thurston, G. et al., Science, 286, 2511-2514, 1999). 또한, Ang-1은 피부에서 VEGF에 의해 유도되는 혈관의 투과성을 억제시키고, 당뇨성 망막증을 억제한다(Thurston, G. et al, Nat. Med., 6, 460-463, 2000; Joussen, A.M. et al., Am. J. Pathol., 160, 1683-1693,2002). 본 발명자는 SSeCKS가 Ang-1의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 4b). VEGF의 발현은 JNK 활성화에 의해 증가되며, Ang-1의 발현은 JNK가 활성화된 세포에서 감소된다(Alfranca, A. et al., Mol. Cell Biol., 22, 12-22, 2002; Krikun, G. et al., Am. J. Pathol., 161, 979-986, 2002). SScCKS가 JNK의 인산화를 확연히 감소시켰으므로(도 3c), SSeCKS는 JNK의 인산화를 저해함으로써 VEGF와 Ang-1의 발현을 조절할 수 있다.

SSeCKS CM을 처리하는 경우, HBMEC에서 ZO-1(zonula occluden-1), ZO-2(ZO-1-associated protein), 클라우딘-1(claudin-1) 및 오클루딘의 발현이 증가되었다(도 4c). 또한, antisense-SSeCKS CM을 처리시에는 HBMEC의 세포의 가장자리에서 ZO-1의 선형(lineage) 구조가 파괴되었다(도 4e). 이러한 결과들은 "SSeCKS의 발현이 뇌혈관장벽의 성숙에 대한 활성화 시그날"이라는 가정을 지지하는 것이다. Ang-1 중화된(neutralized)-SSeCKS CM과 antisense-SSeCKS CM은 HBMEC의 [³H]슈크로즈의 투과성을 증가시켰으므로(도 4d), SSeCKS에 의한 혈관의 치밀함이 촉진되는 것은 부분적으로는 Ang-1을 통해서 이루어질 수 있다.

초기 SSeCKS 단백질의 발현(E8.5-11)은 신경 튜브(neural tube)의 루미날 표면(luminal surface)인 느슨한 간엽(loose mesenchyme), 초기 심장, 심막(pericardium)에서 나타난다. 후기 상태에서 SSeCKS의 발현은 간엽 세포(mesenchymal cell)에서 넓게 나타난다(Gelman, I.H. et al., Histochem, J., 32, 13-26, 2000; Gelman, I.H., Front. Biosci., 7, d1782-1797, 2002). 성체 마우스에서 SSeCKS 발현은 생식선, 평활근, 심근, 폐, 심장, 뇌에서 높은 발현과 함께 비교적 전반적으로 발현한다(Gelman, I.H. et al., Histochem, J., 32, 13-26, 2000; Gelman, I.H., Front. Biosci., 7, d1782-1797, 2002). SSeCKS의 발현이 발생단계의 뇌 피질에서 연구되지 않았기 때문에, 본 발명자는 대뇌피질(cerebral cortex)에서 SSeCKS의 발현과 ZO-1, 오클루딘 및 VEGF의 동시발현을 조사하였으며, SSeCKS, ZO-1(도 5) 및 오클루딘(자료 제공되지 않음)의 발현이 점차적으로 후기 배형성(late embryogenesis)에서 시작으로 신대뇌피질(neoparillal cortex)에서 증가되었고, 성체의 뇌에서 이러한 단백질들은 상당한 수준으로 안정적으로 발현되었다. 반면에, VEGF의 면역반응성은 E11로부터 출생 3일까지 높았으나, 점차적으로 감소되었고 성체의 뇌에서 관측되지 않았다(도 5). 이러한 생체내 결과들은 본 발명자의 시험관내 연구들과 일치한다: 즉, VEGF의 발현이 SSeCKS-트랜스펙턴트(transfectant)에서 감소되었으며, SSeCKS CM은 폐쇄연접 단백질의 발현을 증가시켰다. 또한, 본 발명자는 SSeCKS 면역반응이 명확하게 GFAP(glial fibillary acidic protein)와 같은 위치에서 발현되며, SSeCKS를 발현하는 성상교세포가 혈관과 밀접하게 상호작용한다는 것을 확인하였다(도 6b 및 6c).

상기한 결과들은, SSeCKS를 발현하는 성상교세포가 뇌의 혈관 신생을 억제함으로써 폐쇄연접 단백질 발현을 증가시키고, 이로 인해 투과성 혈관의 성숙과 안정을 유도하며, 성체의 뇌에서 SSeCKS의 일정한 발현은 생리적 조건하에서 뇌혈관장벽을 안정화시키는 신호를 제공할 수 있다는 것을 지지한다.

따라서, 본 발명은 하나의 양태로서, SSeCKS 단백질을 포함하는 뇌혈관 신생과 뇌혈관 내피세포의 폐쇄연접 형성을 조절함으로써 뇌혈관장벽의 장애와 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

SSeCKS 단백질의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 미국 특허 제6,582,956호에 개시되어 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 SSeCKS 단백질은 뇌혈관 신생과 뇌혈관 내피세포의 폐쇄연접 형성을 조절할 수 있는 모든 천연 기원의 단백질, 재조합 기원의 단백질, 또는 이러한 단백질들의 변이체 등을 포함하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 SSeCKS 단백질은 재조합 기원의 단백질이다.

아미노산 서열 변이체중 치환 변이체에서 하나 이상의 아미노산은 유사한 극성의 또다른 아미노산 서열로 치환될 수 있다. 아미노산의 치환은 그 아미노산이 속하는 부류의 다른 아미노산으로 치환될수 있으며, 이러한 아미노산의 부류는 비극성 (소수성) 아미노산(예: 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 등), 극성 중성 아미노산(예: 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등), 양전하 (염기성) 아미노산(예: 아르기닌, 리신, 히스티딘 등), 은전하 (산성) 아미노산 (예: 아스파트산, 글루탐산 등)를 예시할 수 있다.

또다른 변이체로는 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 변이체를 예시할 수 있다.

아미노산 변이체는 통상 카세트 돌연변이유발 또는 기타 당 분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 SSeCKS 단백질을 암호화하는 DNA에서 뉴클레오타이드의 부위 지정 돌연변이를 유발하여 변이체를 코딩하는 DNA를 작제한 후 이 DNA를 재조합 세포 배양을 통해 발현시킴으로써 제조된다. 이러한 아미노산 서열 변이체는 전형적으로 천연형과 기능적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는 것이다. 아미노산의 치환은 전형적으로 단일 염기의 치환이나, 기능적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는한 하나 이상의 치환도 가능하며, 삽입은 통상적으로 약 1개 내지 20개 아미노산의 연속 서열로 이루어질 수 있으나, 보다 큰 삽입 또한 가능할 수 있다. 결실의 범위는 통상 약 1개 내지 30개의 잔기이나, 일부의 경우에는 도메인중 하나가 결실될 수있는 것과 같이 보다 큰 결실 또한 가능할 수 있다. 변이체는 전형적으로 천연형과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이나, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체가 선택될 수 있다.

또한, SSeCKS 단백질은, 이에 한정되는 것은 아니나, 미리스틸화, 포스포릴화, 글리코실화, 단백 분해 절단 등을 포함한 해독후 변형을 포함한다.

이러한 SSeCKS 단백질은 당업자에 통상적으로 알려진 방법을 이용하여 천연 기원의 공급원으로부터 분리하거나 화학적 합성 방법을 이용하여 합성하거나 SSeCKS 단백질을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 적합한 숙주내로 도입하여 트랜스펙턴트를 배양한후 이로부터 분리할 수 있다.

배양액 또는 세포 추출물에 함유된 SSeCKS 단백질의 분리 및 정제는 많은 공지 방법에 의해 실시할 수 있다. 이들 방법의 예로는 염 침전 및 용매 침전과 같은 용해성을 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용한 방법, 이온-교환 컬럼 크로마토그리피와 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 친수성의 차이를 이용한 방법 및 등전점 포커싱 전기영동과 같은 등전점의 차이를 이용한 방법 등을 예시할 수 있다.

또다른 양태로서, 본 발명은 SSeCKS 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 뇌혈관 신생과 뇌혈관 내피세포의 폐쇄연접 형성을 조절함으로써 뇌혈관장벽 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적상 상기한 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 핵산 서열은 SSeCKS 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.

이러한 핵산 서열은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 포함하는 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자 및 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 또한, 추가의 암호화 서열 또는 비암호화 서열을 포함할 수도 있다.

상기한 바와 같은 SSeCKS 암호화 핵산 서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종성의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 SSeCKS 단백질 암호화하는 핵산 서열은 이를 발현하는 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 벡터에 제공된다. SSeCKS 유전자 발현벡터는 플라스미드, 파아지, 코스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

SSeCKS 핵산 분자는 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것 뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 트랜스펙션시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 조성물에 포함되는 SSeCKS 단백질을 발현하는 발현 벡터는 바이러스 벡터이며, 예를 들어 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다. 세포내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.

뇌혈관장벽 붕괴와 관련된 많은 뇌질환이 공지되었으며, 예를 들어 다발성 경화증(multiple sclerosis;Rosenberg G.A., Neuroscientist, 8(6):586-95,2002), 실험적 알레르기성 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis; Proescholdt M.A. et al., J Neuropathol Exp Neurol., 61(10):914-25, 2002), 세균성 수막염(bacterial meningitis; Infect Dis Clin North Am., 13(3):527-48, v-vi. Review., 1999), 허혈(ischemia; Gashe Y. et al., J Cereb Blood Flow Metab., 21(12):1393-400, 2001), 뇌 부종(brain edema;Dempsey RJ et al., Neurosurgery. 47(2):399-404; discussion 404-6, 2000), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; Banks W.A. et al., Peptides, 23(12):2223-6, 2002), 후천성 면역 결핍 증후군 치매 합병증(Acquired immune deficiency syndrome dementia complex; Krebs F.C. et al., Adv Pharmacol., 49:315-85, 2000), 뇌종양(brain tumor; Davies D. C. et al., J Anat., 200(6):639-46, 2002), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury; Esen F. et al., J Neurosurg Anesthesiol., 15(2):119-25, 2003), 고혈압(hypertension; Kucuk M. et al., Life Sci. 71(8):937-46 2002) 등을 포함한다. 바람직한 양태로서, 본 발명은 상기 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 투여대상, 연령, 개인차, 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 함유되는 SSeCK 단백질 또는 이의 암호화 핵산의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여 방법, 표적 세포, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여된다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사 및 정맥주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 이외의 본 발명 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

또한, 추가의 양태로서, 본 발명은 SSeCKS 단백질을 발현하는 성상교세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 성상교세포를 시험하고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계; 및 시험 화합물과 접촉된 성상교세포에서의 SSeCKS 단백질 발현양을 시험 화합물과 접촉되지 않은 대조군의 발현양과 비교하는 단계를 포함하여, SSeCKS 단백질의 발현을 촉진시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서, 화합물은 단일 물질 또는 동일하거나 동일하지 않을 수 있는 다수의 물질을 포함한다. 이러한 화합물은 예를 들어 합성 화합물이거나, 식물, 동물 또는 미생물로부터의 세포 추출물도 포함할 수 있다.

실시예

실시예 1: 성상교세포에서 산소분압에 따라 조절되는 SSeCKS 발현

실험방법 :

산소분압에 의해 조절되는 인자들을 동정하기 위하여 cDNA RDA법을 이용하였다. cDNA RDA 방법을 이용하기 위하여 먼저 쥐(대한바이오링크)의 뇌 성상교세포에서 Trizol 용액 (Life Technologies, New York)을 사용하여 전체 RNA를 수득하였다. 동정된 인자들 중 SSeCKS cDNA를 서열 1 및 서열 2의 프라이머를 이용하여 증폭하였다:

[서열 1]

5'-GCCAGTCCTGACACTTG-3'

[서열 2]

5'-TGAGCCCATGCCTCCAGAA-3'

동정된 SSeCKS가 cDNA RDA에서와 같이 산소분압에 의해 조절이 되는지를 RT-PCR과 노던 블럿 분석을 이용하여 다시 확인하였다. RT-PCR 및 RDA는 문헌(Lisitsyn, N. et al., Science, 259, 946-951, 1993; Lee, M. S. et al., Cancer Res., 61, 3290-3293, 2001)에 기술된 바와 같이 수행하였다.

결과 :

cDNA RDA를 수행하여 산소분압에 의해 조절되는 15개의 클론을 동정하였다.이러한 cDNA 클론 중 하나가 종양 억제인자로 동정된 바 있는 쥐의 SSeCKS 유전자였다. SSeCKS 단백질의 발현은 저산소화에 의해서 뚜렸하게 감소하였고 재산소화에 의해서 시간이 경과함에 따하 확연하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1a). 또한, SSeCKS mRNA도 단백질 발현 경향과 유사하게 재산소화에 의해 증가하였다(도 1b). 재산소화에 의한 mRNA의 증가가 새로운 mRNA 합성을 필요로 하는 가를 결정하기 위해, 세포를 재산소화 상태에서 전사 억제제인 액티노마이신 D(actinomycin D)로 처리하였다. 액티노마이신 D는 재산소 상태에서 SSeCKS mRNA의 증가를 억제하였다(도 1c). 이는 SSeCKS 발현이 산소분압에 따라 적어도 전사 수준에서 조절된다는 것을 제시한다.

실시예 2: SSeCKS가 과다발현된 성상교세포의 혈관 신생 저해

실험방법 :

동물: 대한 바이오링크에서 구입한 임신한 SD(Sprague-Dawley) 래트와 6주된 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 모든 동물에 대한 연구는 서울대학교 약학대학의 승인을 받아 이루어졌다.

세포 배양: 신선한 성상교세포는 갓 태어난 SD 래트의 대뇌피질으로부터 정제하였다. 같은 부위에서 유래한 CTX TNA2 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 특징적인 성상교세포의 조절 신호를 정확하게 검사하기 위해 VEGF 감소의 신호 전달 연구에 CTX TNA2 세포를 사용하였다. 갓 태어난 마우스의 대뇌피질에서 분리한 성상교세포와 CTX TNA2 세포를 10% 소혈청액(LifeTechnologies, New York)과 항생제가 들어있는 DMEM 배지에서 배양하였다. 태반에서 분리한 HBMEC(human brain microvascular endothelial cell; passage 5-8)는 Cell Systems(Kirkland, Washington)에서 구입하였다. 이 세포를 부착 인자가 코팅되어 있는 배양 용기에서 Cell System에서 구입한 CS-C 완전 SFM 배지를 사용하여 배양하거나, 20% 소혈청액, 3ng/ml bFGF, 5u/ml 헤파린이 들어있는 M199배지에서 배양하였다. 저산소 조건은 Forma Scientific Inc.에서 구입한 저산소 배양실에서 이루어졌다. 이 배양실 안은 낮은 산소 농도, 즉 5% 이산화탄소, 질소와 균형을 맞춘 1% 산소 농도로 유지되고 있다. 세포를 저산소에 노출된 후 다시 신선한 배지와 정상적인 공기를 공급하였다.

일시적 트랜스펙션 및 CM 제조: sense와 antisense-SSeCKS를 발현하는 벡터를 제조하기 위해, 실시예 1에서 제조된 SSeCKS cDNA를 pcDNA3 플라스미드 (Promega)에 각각 정방향과 반대 방향으로 삽입하였다. 이 벡터들을 리포펙타민 시약(Lipofectamine Reagent; Life Technologies, New York)을 사용하여 세포에 일시적 트랜스펙션시켰다. 이는 벡터가 리포좀과 결합하여 지질막인 세포막을 통과할 수 있는 원리를 이용한 것이다. CM을 제조하기 위해서 트랜스펙션시킨 세포의 배지를 1% FBS 함유 M199배지로 바꾸어 준 후, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 배지를 모아서 0.22μm 크기의 세공막(Millipore, Bedford, Massachusetts)을 통해여과시켰다. CAM(chick chorioallantoic membrane) 검정 및 매트리겔 플러그(Matrigel plug) 검정을 하기 위해, 상기에서 수득된 배지를 한외-여과 키트(ultrafiltration kit, 10 kDa cut-off, Millipore)을 사용하여 농축하였다.벡터가 세포내로 삽입되었는가를 확인하기 위해서 β-갈락토시다제를 발현하는 벡터(1μg)를 공동-트랜스펙션시켰다.

웨스턴 블럿 분석: 벡터로 트랜스펙션시킨 성상교세포 또는 이 세포에서 얻은 배지를 처리한 HBMEC로부터 정제된 전체 단백질(10 내지 25μg)을 각각의 특정 항체를 이용하여 면역블럿팅하였다: SSeCKS(Dr. Gelman I. H.으로부터), Flt-1, KDR, VEGF, JNK, ERK, c-fos, p-c-jun, ZO-1, ZO-2, 오클루딘(SantaCruz Biotechnology, California), Ang-1(Chemicon International, California or Calbiochem, California), 클라우딘-1(Zymed, California), α-튜불린(Innogenex, California). 핵 단백질을 정제하였으며, 전기이동 쉬프트 검정을 수행하였다. AP-1 결합 서열의 이중쇄 올리고뉴클레오타이드는 서열 3을 나타낸다:

[서열 3]

5'-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3'.

CAM 검정 및 생체내 마우스 매트리겔 플러그 검정: CAM 검정을 이용하여 4.5일이 된 병아리 배아를 사용하여 시약 처리시 혈관 생성이 어떻게 되는지 검사하였다. 매트리겔 플러그 검정을 이용하여 마우스의 복부에 매트리겔을 시약과 함께 넣은 후 손으로 가만히 눌러주고 일주일 후에 꺼내어 혈관 생성을 검사하였다. 꺼낸 매트리겔에서의 헤모글로빈의 양을 Drabkin reagent kit 525(Sigma, Missouri)를 이용하여 측정하였다. 이들은 모두 혈관 신생을 알아보는 실험들이다(Lee, M.S. et al., Cancer Res., 61, 3290-3293, 2001; Kim, M.S. et al., Nat. Med., 7, 437-443, 2001).

상처 이동 검정(wounding migration assay) 및 튜브 형성 검정: HBMEC를 60mm 용기에서 90% 자랄 때까지 인큐베이션한 후, 상처를 주고 세포들의 이동을 관측하였다(Lee, M. S. et al., Cancer Res., 61, 3290-3293, 2001). 또한, HBMEC를 폴리머를 형성하고 있는 매트리겔에 시딩한 후, 튜브 형성을 관측하였다(Lee, M. S. et al., Cancer Res., 61, 3290-3293, 2001).

데이타 분석 및 통계학: 밴드의 강도 정량은 α-튜불린, β-액틴의 밀도를 이용하여 구하였으며, TINA2.0으로 분석하였다. 모든 데이타는 평균 ± 표준편차 또는 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 통계적인 비교는 스튜던츠 시험(Student's test)을 이용하였다. P<0.5가 통계적으로 의미있는 값이다.

결과 :

재산소화에 의한 SSeCKS의 과다발현이 혈관 신생에 영향을 주는지 알아보기 위해 생체내에서 CAM 검정을 수행하였으며, 그 결과 SSeCKS로 트랜스펙션시킨 성상교세포의 조건-조절된 배지(SSeCKS CM)가 새로운 혈관 생성을 강하게 억제하였다(도 2a). SSeCKS CM의 혈관 신생 저해 활성은 74%였으나 Mock 벡터로 트랜스펙션시킨 트랜스펙턴트의 조건-조절된 배지(Mock CM)의 저해 활성은 병아리 CAM에 공(empty) 커버슬립만을 처리한 것과 유사한 14%였다.

또한, 생체내에서 마우스 매트리겔 플러그 검정을 수행하였으며, 헤파린만으로 처리한 매트리겔 플러그에서는 혈관이 거의 생성되지 않았으나 bFGF(basic fibroblast growth factor)에 Mock CM을 동시에 처리한 경우에는 플러그에 혈관이 많이 생성되었으며 SSeCKS CM을 처리한 경우에는 bFGF에 의한 혈관 신생 유도가 강력히 억제되었다(자료 제공되지 않음). 기능적인 혈관 구조를 정량하기 위해 매트리겔 플러그의 헤모글로빈 양을 측정하였으며, 그 결과 SSeCKS CM은 헤모글로빈의 수준을 0.58 ± 0.19 g/dl (n=7) (도 2b)로 낮추었다. 이러한 결과들은 SSeCKS CM이 생체내에서 강력한 혈관 신생 저해 활성이 있음을 나타낸다.

SSeCKS의 혈관 신생 저해 활성 작용을 조사하기 위해 시험관내에서 혈관형성 검정을 수행하였으며, 그 결과 SSeCKS CM은 HBMEC에 대해 세포독성 및 항-증식 효과를 나타내지 않았으나 모세혈관 구조 형성 및 세포의 이동을 현저하게 감소시켰다(도 2c 및 도 2d). SSeCKS의 혈관 신생 활성 저해를 확인하기 위해 혈관 신생 연구에 자주 사용되는 HUVEC(human umbilica vein endothelial cell)를 이용하여 같은 실험을 하였다. HBMEC에서와 비슷하게 SSeCKS CM은 HUVEC의 세포 이동과 혈관 형성을 분명하게 저해하였다. 이러한 결과들은 SSeCKS의 과다 발현된 성상교세포가 주변의 내피세포들의 이동과 튜브 형성을 억제함으로써 혈관 신생을 억제한다는 것을 강하게 제시한다.

실시예 3: SSeCKS에 의한 VEGF의 발현 및 AP-1의 DNA 결합 감소

실험방법 :

루시페라제(luciferase) 검정: 성상교세포를 pAP1-Luc 리포터 벡터, pCMV-β-gal(Promega) 및 pcDNA3-SSeCKS 벡터로 트랜스펙션시켰다. 루시퍼라제 검정 시스템(Promega, Wisconsin) 및 발광측정기(Turner Design, California)을 이용하여 루시퍼라제 검정을 수행하였다. 루시퍼라제에 의해 나타나는 빛의 단위는 β-갈락토시다제 활성에 의해 나타낼 수 있다.

결과 :

SSeCKS의 혈관 신생 저해 활성에 대한 분자 기전을 조사하기 위해 SSeCKS 유전자로 성상교세포를 트랜스펙션시켜 내피 분열촉진제이며 혈관 투과성에 관여하는 유력한 조정자인 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 발현을 조사하였다. SSeCKS는 VEGF의 발현을 상당히 감소시켰다(도 3a) (Dvorak, H.F. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 237, 97-132, 1999; Liekens, S., et al., Biochem. Pharmacol., 61, 253-270, 2001).

SSeCKS가 과다 발현된 성상교세포로부터 분비된 인자들에 의해 주변의 내피세포들이 영향을 받을 수 있는지를 확인하기 위해 SSeCKS CM을 처리한 HBMEC에서 몇몇 혈관 신생 관련 유전자들의 발현 수준을 조사하였다. 성상교세포에서와 같이 HBMEC에서 VEGF 발현이 SSeCKS CM에 의해 감소하였으나(도 3b), 혈관 신생 반응에 관여하는 내피세포 특이적인 수용체인 Flt-1(VEGFR-1)과 KDR/Flk-1(VEGFR-2)의 발현은 변하지 않았다(도 3b)(Yancopoulos, G.D.et al., Nature 407, 242-248, 2000).

또한, VEGF 발현이 JNK 와 ERK 활성에 의존적이므로, SSeCKS가 JNK 와 ERK 활성화에 영향을 주는지 실험하였다. 흥미롭게도, SSeCKS 는 두드러지게 JNK 의 인산화를 감소시키는 반면 ERK 인산화에는 작용하지 않았다(도 3c).

또한, SSeCKS는 AP-1 전사 활성에 필요한 c-fos 와 p-c-jun을 상당히 감소시켰으며, AP-1의 DNA 결합 활성을 감소시켰다.

또한, AP-1의 전사 활성도를 확인하기 위해 AP-1 리포터 루시페라제 분석을 수행하였으며, 그 결과 SSeCKS는 AP-1 루시페라제 활성을 상당히 감소시켰으며 이는 AP-1이 SSeCKS에 의한 내부 VEGF 감소에 관련이 있음을 나타낸다.

실시예 4: [³H]슈크로즈 투과성 변화

실험방법 :

동시배양(coculture) 시스템 및 [³H]슈크로즈 투과성 검정: HBMEC 및 래트의 대뇌 성상교세포를 "무접촉(without contact)" 시스템으로 동시배양하였다(Rubin, L.L. et al., J. Cell Biol., 115, 1725-1735, 1991). 성상교세포를 12-웰 플레이트 바닥에 시딩하고 HBMEC를 트랜스웰 필터(Corning Costar, New York)에 플레이팅하였다. 컨플루언스(confluence)하게 되면 이들을 함께 배양하였다. Amersham Parmacia(1Ci/l)에서 구입한 [³H]슈크로즈(1μCi/μl, Amersham Pharmacia, Aylesbury, United Kingdom) 50μl(0.8μCi/ml)를 상단 구획(upper compartment)에 가하였다. 방사능의 상단 구획에서 하단 구획으로의 확산양을 액체 섬광 계수기(Wallac, PerkinElmer,New York)를 사용하여 30분 후에 측정하였다.

결과 :

뇌혈관 분화 과정에서 투과성 있는 뇌 모세혈관은 점점 낮은 혈관 투과성과 폐쇄연접 단백질의 증가로 특징지어지는 뇌혈관장벽이 된다. 혈관 투과성이 SSeCKS에 의해 조절되는지를 시험하기 위해 [³H]슈크로즈 투과성 분석을 수행하였으며, 그 결과 [³H]슈크로즈는 트랜스웰의 미세한 구멍을 통해 확산되지만, 뇌혈관장벽에 의해서는 받아들여지지 않았다. [³H]슈크로즈 투과성은 HBMEC 단층배양과 비교하여 SSeCKS로 트랜스펙션시킨 성상교세포와 동시배양된 HBMEC에서 상당히 감소하였다(도 4a). 문헌(Prat, A. et al., Blia, 36, 145-155, 2001; Janzer, R.C. et al., Nature, 325, 253-257, 1987)에 보고된 바에 따르면, [³H]슈크로즈 투과성은 성상교세포와 동시배양된 HBMEC(HBMEC-AST 동시배양)에서도 감소를 하는 것으로 알려져 있으며, 본 실시예에서의 HBMECs-SSeCKS 동시배양에 의한 투과성의 감소는 HBMECs-AST 동시배양시 보다 그 정도가 상당하였다. 이러한 결과들은 SSeCKS가 성상교세포에서 분비되는 분자를 통해 뇌혈관장벽 형성에 관여한다는 것을 나타낸다.

실시예 5: 폐쇄연접 단백질에서 Ang-1 매개된 SSeCKS의 영향

실험방법 :

세포의 면역형광염색: Lab-Tek^TMII 챔버 커버글래스(Nunc, Denmark)에서 배양한 컨플루언트(confluent) 성상교세포를 CM 처리후 고정시키고 면역염색하였다. 냉동 절편을 이중 면역염색하였으며, FITC-결합된 IgG 및 TRITC-결합된 IgG(Zymed, California)를 2차 항체로 사용하였다. 공초점(confocal) 현미경으로 형광 염색을 측정하였다.

결과 :

본 실시예는 혈관 투과성의 억제제이며 혈관의 낮은 투과성을 유도하는 Ang-1의 발현을 관측하였으며, Ang-1의 발현이 성상교세포에서 SSeCKS에 의해 강하게 증가되었다(도 4b). Antisense-SSeCKS 벡터로 성상교세포를 트랜스펙션시킴으로써 Ang-1 발현이 mock 트랜스펙턴트 보다 감소하였다. 또한, CM으로 분비된 Ang-1의 수준을 확인하였다. CM중의 Ang-1은 SSeCKS에 의해 비슷하게 증가되었지만, antisense-SSeCKS에 의해서는 감소되었다(도 4b). 본 발명자는 Ang-1이 산소 분압에 의해 조절되며 성상교세포에서 재산소화에 의해 증가된다고 보고한 바 있으며(Song, H.S. et al., Biophys. Res. Commun. 290, 325-331, 2002), 또한 Ang-1 발현이 JNK-활성화된 내피 세포 및 p38-활성화된 내피세포에서도 억제된다는 것이 보고된 바 있으므로(Krikun, G. et al., Am. J. Pathol. 161, 979-986, 2002), SSeCKS가 JNK 인산화를 상당히 감소시킨다는 결과(도 3c)는 SSeCKS가 JNK의 인산화를 억제해서 Ang-1의 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

뇌혈관장벽의 분자적 연구는 세포간의 투과성 조절시 폐쇄연접 구조의 배열과 역할이 중요하다고 알려져 있으므로, 폐쇄연접 단백질, ZO-1), ZO-2, 클라우딘-1 및 오클루딘(트랜스막 폐쇄연접 단백질)의 발현에 대한 SSeCKS CM의 효과를 관측하였다. SSeCKS CM을 처리한 결과, HBMEC에서 ZO-1, 클라우딘-1의 발현이 상당히 증가하였고 ZO-2, 오클루딘의 발현도 조금 증가하였다(도 4c).

SSeCKS가 과다발현된 성상교세포가 Ang-1을 매개로 하여 뇌혈관장벽 형성을 유도하는지 조사하기 위해 Ang-1에 대한 항체를 SSeCKS CM에 처리하여 인큐베이션하였다. Ang-1 중화된(neutralized)-SSeCKS CM은 HBMEC에서 ZO-1, ZO-2, 클라우딘-1, 오클루딘의 발현을 상당히 감소시켰다. 반면에, VEGF 발현은 HBMEC에서 Ang-1 중화된-SSeCKS CM에 의해 강하게 증가하였다(도 4c). 뇌혈관장벽 분화에서 Ang-1의 활성도를 [³H]슈크로즈 투과성 분석으로 확인하였으며, SSeCKS CM은 혈관 투과성을 상당히 감소시켰지만 Ang-1 중화된-SSeCKS CM은 혈관 투과성을 감소시키지 않았다(도 4d). 또한, [³H]슈크로즈 투과성은 Mock CM과 비교하여 antisense-SSeCKS CM에 의해 증가되었다(도 4d). 이것은 antisense-SSeCKS CM에서 Ang-1 발현이 Mock CM에서 보다 낮은 결과와 상응한다(도 4b). 이러한 결과들은 성상교세포에서 SSeCKS가 발현되면 Ang-1을 매개로 하여 폐쇄연접 단백질들이 증가하고 이로써 내피 세포의 방어 기능이 향상될 수 있음을 나타낸다.

ZO-1은 폐쇄연접 단백질의 위치 확인과 BBB 형성시 증가한다는 점에서 중요하기 때문에 HBMEC에서의 ZO-1 분포를 조사하였다. 특히, ZO-1은 뇌혈관장벽 형성을 유지하는 중요한 폐쇄연접 단백질이다. Mock CM을 처리한 후에, 세포끼리의 접촉이 일어나는 HBMEC 가장자리에서 ZO-1의 직선적인 분포가 관측되었다(도 4e). 또한, SSeCKS CM을 처리한 후에, 더욱 뚜렷한 ZO-1의 분포가 관측되었다. SSeCKS가 ZO-1 조직화에 영향을 주는지 조사하기 위해서 HBMEC에 antisense-SSeCKS CM을 가했으며, 놀랍게도 antisense-SSeCKS CM을 넣은 HBMEC에서는 ZO-1 발현이 불연속적이었다(도 4e). 따라서, SSeCKS가 발현되는 성상교세포는 ZO-1을 포함한 폐쇄연접 단백질의 직선적 분포와 발현 증가를 통해 뇌혈관장벽 형성을 안정화시킬 것으로보인다.

실시예 6: 발생과정의 마우스 뇌에서 SSeCKS, VEGF 및 ZO-1의 발현

실험방법 :

조직 준비와 조직의 면역염색: 마우스의 뇌를 고정시키고 OCT 화합물(Miles)로 냉동시킨 후 -20℃에서 5 내지 10μm 두께로 잘랐다. 면역조직화학 및 이중 면역조직화학을 InnoGenex^TMIHC 키트(Innogenex, California)를 사용하여 수행하였다. 염색된 부위의 정량적인 분석을 위해 Image-Pro Plus(Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland)를 이용하였다. 최소한 3마리의 동물을 배아 11.5일로부터 성체까지 각각의 단계의 실험에서 사용하였다.

결과 :

시험관내에서 SSeCKS에 의해 혈관 투과성이 감소하였고, 폐쇄연접 단백질의 발현이 증가하였으므로 이러한 실험 결과들을 확인하기 위해서 뇌혈관장벽 형성시기 동안에 생체내에서 SSeCKS의 면역활성을 관측하였다. SSeCKS의 발현은 같은 조직에서 같은 시간대에 비교시 ZO-1의 발현과 일치하였으나, VEGF와는 일치하지 않았다(도 5a).

SSeCKs의 일시적인 발현 수준을 시험하기 위해서, 면역염색된 영역을 정량적으로 분석하였다(도 5b). 신대뇌피질(neopallial cortex)(후에 대뇌피질)에서의 SSeCKs 면역반응성은 E15.5까지 관찰되지 않았다. 그 후에 SSeCKs의 발현은 E16.5까지 점진적으로 증가하였으며, 출생 후 19일째에 희미한 염색이 관찰되었고, 성체 시기까지 SSeCKS 발현이 풍부하였으며, 뇌혈관을 둘러싼 조직에서 SSeCKS 발현을 많이 관찰할 수 있었다(도 5b).

또한, 뇌의 혈관 신생과 산소 상태를 조사하기 위해서 같은 단계에 있는 근접한 얇은 부분에서의 VEGF 발현 패턴을 확인해보았다. VEGF 면역반응성은 E11.5까지 점진적으로 증가하였고, 강한 면역반응성이 출생 후 3일째에는 전체적으로 뇌의 피질에서 넓게 나타났다. VEGF 발현 패턴은 뇌의 혈관 신생과 명확하게 일치했다. 초기 출생 후 시기에서 출생 후 10일까지가 최대이고 출생 후 20일쯤에서 발현이 거의 사라지는 것을 확인할 수 있었고, 점진적으로 감소하여 성장 완료된 성체의 뇌에서는 완전히 사라졌다(도 5b). 본 발명자가 이전의 연구에서 뇌 발생 동안에 저산소에서 정상 산소에 이르는 산소 분압이 존재한다고 추측했던 것처럼 이 발현 패턴은 저산소 부위와 연관성이 있음을 확인할 수 있었다.

뇌혈관장벽 발생 동안에 폐쇄연접 형성을 확인하기 위해서 ZO-1 발현을 살펴보았다. E13.5까지 ZO-1 면역반응성은 신대뇌피질의 어느 부위에서도 관측되지 않았다. 발생이 진행될수록 ZO-1 면역반응성은 점진적으로 증가하였다. 성체의 뇌에서 대부분의 혈관은 ZO-1을 발현하고 있었다(도 5b). 오클루딘의 발현 경향도 ZO-1의 경향과 비슷했다(자료 제공되지 않음). 뇌혈관장벽의 성숙과정 동안에 VEGF 염색부위는 감소하고 SSeCKS와 ZO-1의 염색부위는 증가한다는 것을 본 실험을 통하여 확인할 수 있었다.

실시예 7: SSeCKS를 발현하는 성상교세포와 ZO-1 발현되는 혈관내피세포와의 상호 작용

SSeCKS, GFAP, ZO-1, PECAM의 상응하는 위치를 확인하기 위해서 본 발명자는 혈관 주위의 조직을 관측하였다(도 6a). SSeCKS 및 성상교세포 특이적 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)가 혈관주위에 가는 실 모양을 나타내었고, 이 두 가지 인자는 같은 위치에서 발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 혈관을 내피세포 특이적 마커인 PECAM으로 염색한 결과, ZO-1의 면역염색 영역과 PECAM의 영역이 부분적으로 일치하였다.

SSeCKS를 발현하는 성상교세포와 ZO-1을 발현하는 뇌혈관장벽의 혈관들 사이의 상호작용을 보여주기 위해, 뇌의 같은 부위에서 이중 면역조직염색법을 수행 하였다. SSeCKS(파란색)은 ZO-1(빨간색)으로 염색된 혈관 주변을 둘러싸는 섬유와 같이 염색되는 양상을 나타냈다(도 6b). 또한, SSeCKS 면역반응성이 GFAP 면역반응성과 함께 같은 위치에 나타난다는 것을 다음과 같이 확인하였다: SSeCKS(초록색)의 면역형광법은 GFAP(빨간색)과 분명하게 겹쳐서 나타났고, 그 색상은 노란색을 나타냈다. 이것은 SSeCKS가 뇌의 성상교세포에서 발현된다는 것을 나타내는 것이다(도 6c). 이러한 결과들은 뇌 발생의 후기 단계 동안 재산소화가 성상교세포에서의 SSeCKS 발현을 증가시키고, 발현이 증가되면서 이웃하는 내피세포중의 폐쇄연접 단백질들의 발현을 향상시키며, 결과적으로 SSeCKS가 성체 뇌의 뇌혈관장벽을 안정화시킨다는 것을 제시한다.

SSeCKS 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 약제학적 조성물은 뇌혈관 신생과 뇌 내막세포의 폐쇄연접 형성을 조절함으로써 뇌혈관장벽의 분화를 유도-조절하므로, 뇌혈관장벽과 관련한 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 약제학적 조성물은 다발성 경화증, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 세균성 수막염, 허혈, 뇌부종, 알츠하이머병, 후천성 면역 결핍 증후군 치매 합병증, 뇌종양, 외상성 뇌 손상, 고혈압 등의 뇌혈관장벽의 장애를 예방 또는 치료하는데 유용하다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Pharmaceutical composition for treating or preventing disorders of blood-brain barrier <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for the amplification of SSeCKS gene <400> 1 gccagtcctg acacttg 17 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for the amplification of SSeCKS gene <400> 2 tgagcccatg cctccagaa 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for the AP-1 binding sequence <400> 3 cgcttgatga gtcagccgga a 21

Claims

약제학적 유효량의 SSeCKS(src-suppressed C kinase substrate) 단백질을 포함하는, 뇌혈관 신생과 뇌혈관 내피세포의 폐쇄연접(tight junction) 형성을 조절함으로써 뇌혈관장벽(blood-brain barrier) 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, SSeCKS 단백질이 재조합 단백질인 약제학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 뇌혈관장벽 장애가 다발성 경화증, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 세균성 수막염, 허혈, 뇌부종, 알츠하이머병, 후천성 면역 결핍 증후군 치매 합병증, 뇌종양, 외상성 뇌 손상 및 고혈압으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
약제학적 유효량의 SSeCKS 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 뇌혈관 신생과 뇌혈관 내피세포의 폐쇄연접 형성을 조절함으로써 뇌혈관장벽 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
제4항에 있어서, SSeCKS 단백질을 암호화 하는 핵산 서열이 재조합 백터인 약제학적 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 뇌혈관장벽 장애가 다발성 경화증, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 세균성 수막염, 허혈, 뇌부종, 알츠하이머병, 후천성 면역 결핍 증후군 치매 합병증, 뇌종양, 외상성 뇌 손상 및 고혈압으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
SSeCKS 단백질을 발현하는 성상교세포를 배양하는 단계;

상기 배양된 성상교세포를 시험하고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계; 및

시험 화합물과 접촉된 성상교세포에서의 SSeCKS 단백질 발현양을 시험 화합물과 접촉되지 않은 대조군의 발현양과 비교하는 단계를 포함하여, SSeCKS 단백질의 발현을 촉진시키는 화합물을 확인하는 방법.