KR20040105417A - 폐렴구균의 에스 피 알 1310 유전자 또는 그로부터발현되는 단백질을 포함하는 항생물질 스크리닝용 조성물및 이를 이용하는 항생물질 스크리닝 방법 - Google Patents
폐렴구균의 에스 피 알 1310 유전자 또는 그로부터발현되는 단백질을 포함하는 항생물질 스크리닝용 조성물및 이를 이용하는 항생물질 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폐렴구균의 spr1310 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질을 포함하는 항생물질 스크리닝용 조성물 및 이를 이용하는 항생물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝용 조성물이 포함하는 spr1310 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질은 폐렴구균의 생존에 필수적인 기능을 수행한다.
따라서, 본 발명의 조성물을 이용하는 스크리닝 방법은 폐렴구균을 비롯한 병원성 세균들에 대해 효과적으로 작용할 수 있는 항생물질의 탐색 및 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 필수유전자(essential gene) 또는 그로부터 발현되는 단백질을 포함하는 항생물질 스크리닝용 조성물 및 이를 이용하는 항생물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
신규 항생물질의 개발은 항생제 내성균 감염증의 치료법 혁신이라는 임상적 중요성 외에도 산업경제적으로 막대한 부가가치를 창출할 수 있다는 점에서 매우 중요한 분야이다.
그러나 전통적인 항생제 개발방법, 즉 천연물 혹은 세균으로부터 무작위적으로 항생물질을 탐색하거나, 기존에 합성된 화합물의 구조를 일부 변경하는 식의 항생제 개발방법은 이미 한계에 부딪혀, 지난 30여년간 새로운 계열의 항생제 개발이 거의 없는 상태이다.
최근에는 비약적으로 발전하고 있는 생물정보학, 미생물 유전체학, 단백체학, HTS(high throughput screening) 등의 신기술 결합을 통해 병원성 세균 내에서의 신규 항생물질의 표적유전자를 탐색하고, 이를 억제할 수 있는 새로운 항생물질을 개발하고자 하는 연구가 진행되고 있다.
이때 표적유전자가 될 수 있는 대표적인 유전자로 필수유전자를 들 수 있는데, 필수유전자란 세균의 생존이나 발병 기작에 필수적으로 요구되는 유전자이다. 따라서, 필수유전자의 발현 기작 또는 필수유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제할 수 있는 물질은 이상적인 신규 항생물질로서의 가능성을 지닌다. 또한 상기 물질은 세균의 생장에만 필수적으로 요구되는 유전자 및 단백질의 활성을 억제하므로, 인체 독성에 있어서도 안전하다는 장점을 지닌다.
또한 표적유전자 발굴로 새로운 개념의 항생물질이 개발되면, 게놈에 근거를 둔 신약 개발(genome-based drug development)의 기반이 마련되며, 세계적인 신약 시장을 형성하여 막대한 산업경제적 부가가치를 창출할 수 있다.
그러나 아직까지는 특정 병원균의 필수유전자가 어떠한 것인지에 대한 정보가 거의 알려지지 않아, 필수유전자의 발굴 및 이를 이용한 항생물질 스크리닝 방법에 대한 발명이 시급한 실정이다.
본 발명에서는 폐렴구균의 필수유전자인 spr1310 유전자, 또는 그로부터 발현되는 단백질을 포함하는 스크리닝용 조성물 및 이를 이용하는 스크리닝 방법을 제공함으로써, 효과적인 항균력과 인체 안전성을 함께 갖춘 신규 항생물질의 개발 시스템을 확립하고자 한다.
도 1은 폐렴구균의 spr1310 유전자를 결실시키기 위한 카세트의 제조과정을 나타낸 도이다.
도 2는 형질전환을 통해 폐렴구균의 spr1310 유전자를 결실시키는 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 특정유전자가 결실된 폐렴구균 형질전환균주를 선택배지에서 배양하여, 필수유전자의 결실 여부를 확인하는 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 spr1310 유전자가 결실된 폐렴구균 형질전환균주가 선택배지에서 자라지 못함을 나타낸 도이다.
도 5는 비필수유전자인 spr0476 유전자를 결실시킨 폐렴구균 형질전환균주에서, 결실 카세트가 제대로 삽입되었음을 나타낸 도이다.
본 발명은 폐렴구균의 spr1310 유전자를 포함하는 스크리닝용 조성물을 제공한다.
spr1310 유전자는 폐렴구균의 생장에 필수적으로 요구되는 유전자로, 서열번호 1의 염기서열 구조, 또는 서열번호 1의 염기서열에 하나 이상의 붕괴(disruption), 결실(deletion), 삽입(insertion), 점(point), 치환(substitution), 논센스(nonsense), 미스센스(misense), 다형(polymorphism), 재배열 돌연변이(mutation)가 일어난 것 중 선택된 하나일 수 있다.
본 발명은 폐렴구균의 spr1310 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함하는 스크리닝용 조성물을 제공한다.
spr1310 유전자로부터 발현되는 단백질은 펩티드 디포밀라아제(peptide deformylase)인 N-포밀메티오닐아미노아실-tRNA 디포밀라아제(N-formylmethionylaminoacyl-tRNA deformylase)이다.
N-포밀메티오닐아미노아실-tRNA 디포밀라아제는 단백질 번역 단계에서 리보솜 생합성에 관여하는 효소로, 구체적으로는 N-포밀-L-메티오닌(N-formyl-L-methionine)으로부터 포메이트(formate)와 L-메티오닌(L-methionine)을 생성하는 반응을 촉매한다.
본 발명에서 spr1310 유전자로부터 발현되는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 구조, 또는 서열번호 1의 염기서열에 하나 이상의 붕괴, 결실, 삽입, 점, 치환, 논센스, 미스센스, 다형현상, 또는 재배열 돌연변이가 일어난 염기서열 중 선택된 하나로부터 발현될 수 있으며, N-포밀메티오닐아미노아실-tRNA 디포밀라아제와 동등한 생리적 활성을 나타내는 폴리펩티드 단편일 수 있다.
이하, 폐렴구균에 대한 spr1310 유전자의 필수성에 대해 설명한다.
상기 유전자가 폐렴구균의 생장에 필수적인지를 확인하기 위해, 우선 spr1310 유전자에 대해 두 차례의 PCR을 수행하여 상기 유전자가 결실(deletion)된 카세트(cassette)를 제조한다(도 1).
1차 PCR에서는 spr1310를 치환할 유전자, 그리고 spr1310 유전자의 왼쪽 측면 부위(flanking region)와 오른쪽 측면 부위를 증폭시켜 총 3종류의 1차 PCR 산물을 얻는다.
본 발명에서 spr1310를 치환할 유전자는 원래의 폐렴구균에는 없던 형질을 획득하게 해주는 마커유전자를 사용하여, 이후의 과정에서 치환된 유전자가 형질전환 균주의 게놈에 제대로 삽입되었는지를 선택배지 상에서 확인할 수 있도록 한다. 본 발명에서는 카나마이신(kanamycin)에 대해 저항성을 지니게 하는aphIII유전자(이하 'KanR'이라 명명한다)를 사용한다.
본 발명에서 사용되는 프라이머 중, spr1310 유전자의 왼쪽 측면 부위의 PCR에 사용되는 역방향 프라이머와 오른쪽 측면 부위의 PCR에 사용되는 정방향 프라이머는 각각 KanR의 5' 쪽의 말단 부위와 KanR의 3' 말단 일부를 포함하고 있다.
2차 PCR에서는 1차 PCR 산물들에 대해 왼쪽 측면 부위의 PCR에 사용되는 정방향 프라이머와 오른쪽 측면 부위의 PCR에 사용되는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써, 1차 PCR 산물들이 하나로 연결된 단일 폴리뉴클레오티드를 얻는다.
최종적으로 얻어진 폴리뉴클레오티드는 원래의 spr1310 유전자 부위에 KanR가 삽입되어 spr1310 유전자가 결실되고, spr1310 유전자의 좌측 및 우측 부위는 그대로 보존되어 있으며, 이후 균주의 게놈에 삽입될 카세트로 사용된다.
상기에서 제조한 카세트를 이용하여 균주 게놈 내의 spr1310 유전자를 결실시키기 위해, 상기 카세트를 이용하여 폐렴구균을 형질전환시킨다. 이때 형질전환된 균주를 배양하는 선택배지는 카나마이신을 첨가하여 준비한다.
형질전환이 일어나면, 도 2에 나타난 바와 같이, 균의 게놈 상에 존재하던spr1310 유전자는 상동적 재조합(homologous recombination) 기작에 의해 외부로부터 도입된 카세트 내의 KanR로 치환이 되어, 결론적으로 게놈 상의 대상유전자가 녹아웃(knockout)된다.
이때 결실된 유전자가 필수유전자라면, 형질전환된 균주는 생장이 불가능하기 때문에 선택배지에서 집락을 형성할 수 없다(도 3). 반면 결실된 유전자가 비(非)필수유전자라면 형질전환된 균주는 대상유전자 없이도 생존이 가능하기 때문에 선택배지에서 집락을 형성하게 된다(도 3).
spr1310 유전자를 결실시킨 형질전환균주는 카나마이신 함유 선택배지에서 생장하지 못한다. 즉, spr1310 유전자는 폐렴구균의 생장에 반드시 필요한 필수유전자이므로, 상기 유전자가 결실되거나 그로부터 발현되는 단백질의 기능에 이상이 생기면 폐렴구균의 생장에 치명적인 영향을 미치게 된다.
이러한 원리를 이용하여, 본 발명은 spr1310 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물을 표적물질로 이용하는 항생물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 상기 조성물과 시험대상물질을 접촉시킨 후, 그들 사이의 반응을 확인하여, 상기 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 단백질의 기능을 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 spr1310 유전자를 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응 확인은, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.
예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) 상기 유전자와 시험대상물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 폐렴구균세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석을 통한 상기 유전자의 발현률 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세균세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다.
이러한 경우 본 발명의 조성물은 spr1310 유전자 외에도, 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 spr1310 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.
예를 들면, 상기 단백질과 시험대상물질을 반응시킨 후 효소활성을 측정하는 방법, 또는 효모 이중 혼성법(yeast two-hybird) 등을 사용할 수 있다.
이러한 경우 본 발명의 조성물은 spr1310로부터 발현된 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 폐렴구균, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 폐렴구균을 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 항생물질로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물 등이 될 수 있으나, 바람직하게는 단시간 내에 대량검색이 가능하도록 화학물질 라이브러리(chemical library)를 사용한다.
화학물질 라이브러리는 고형의 칩 상에 다양한 구조를 가진 화학물질들이 수천, 수만개가 결합되어 있는 것으로, 본 발명의 조성물을 화학물질 라이브러리와 반응시키면, 1:1의 반응 확인에 그쳤던 기존의 스크리닝 방법에 비해 훨씬 빠르고 효과적으로 항생효과를 나타내는 후보물질을 검출할 수 있다.
이와 같이 화학물질 라이브러리를 검색하여 얻은 후보물질은 이후의 항생물질 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질에 대해 본 발명의 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 항생물질을 개발할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 물질은 폐렴구균의 spr1310 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질에 대해 부분적 또는 완전한 활성 억제효과를 나타내게 되므로, 폐렴구균의 생장을 억제할 수 있다. 또한, 폐렴구균과 그 유전자 발현 구조가 유사한 기타 병원성 세균들에 대해서도 생장 억제효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물 및 이를 이용하는 스크리닝 방법은 폐렴구균을 비롯한 병원성 세균들에 대한 항생물질의 탐색 및 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 실시예에서 본 발명을 보다 상세히 설명하되, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 국한되는 것은 아니다.
[실시예] 본 발명에서 사용하는 spr1310 유전자의 필수성 확인
본 발명에서 사용하는 spr1310 유전자의 필수성을 확인하기 위해, 다음과 같이 상기 유전자의 결실 카세트를 제조하여 폐렴구균의 spr1310 유전자를 결실시킨 후, 그 영향을 관찰하였다.
1) spr1310 유전자의 결실 카세트 제조
spr1310 유전자의 결실 카세트 및 비교군으로 사용될 비(非)필수유전자 spr0476의 결실 카세트를 다음과 같이 제조하였다.
카세트 제조를 위해, 카나마이신 저항성을 지니게 하는 KanR, 그리고 대상유전자의 왼쪽 측면 부위와 오른쪽 측면 부위를 증폭할 수 있는 프라이머들을 제조하였다. 이때 왼쪽 측면 부위의 역방향 프라이머(spr1310 L-R)는 KanR의 5' 쪽의 프로모터(promoter) 부위와 상보적인 21개의 염기서열(5'-GACGAACTCCAATTCACTGTT-3')을 포함하며, 오른쪽 측면 부위의 정방향 프라이머(spr1310 R-F)는 KanR의 3' 말단과 상보적인 21개의 염기서열(5'-AGATTTAGATGTCTAAAAAGC-3')을 포함하도록 제작하였으며, 각 프라이머들의 서열은 하기 표 1과 같다.
| 증폭할 부분 | 프라이머 | 염기서열 | 서열번호 | |
| KanR | Kan F | 5'-aacagtgaattggagttcgtcttgtt-3' | 3 | |
| Kan R | 5'-gctttttagacatctaaatctaggta-3' | 4 | ||
| spr1310 | 왼쪽 | spr1310 L-F | 5'-tccagcacatgataacctgcctc-3' | 5 |
| spr1310 L-R | 5'-gacgaactccaattcactgtttgtaatacgttctattgcagaca-3' | 6 | ||
| 오른쪽 | spr1310 R-F | 5'-agatttagatgtctaaaaagctgaccgtaacgtgcctggctatg-3' | 7 | |
| spr1310 R-R | 5'-tggcaaggagtaccgttcatatc-3' | 8 | ||
| spr0476 | 왼쪽 | spr0476 L-F | 5'-catcagtggaaggaatggttgacc-3' | 9 |
| spr0476 L-R | 5'-gacgaactccaattcactgttatctacccacaagagcttga-3' | 10 | ||
| 오른쪽 | spr0476 R-F | 5'-agatttagatgtctaaaaagccatgaaaagcgtcgtttgac-3' | 11 | |
| spr0476 R-R | 5'-gttgcgattgcgtccacctcctca-3' | 12 |
상기 프라이머 중 Kan F와 Kan R을 사용하고 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 염색체 DNA를 주형(template)으로 하여 KanR을 증폭하였다. 그리고 spr1310 L-F와 spr1310 L-R를 사용하여 spr1310의 왼쪽 측면 부위를 증폭하고, spr1310 R-F과 spr1310 R-R를 사용하여 spr1310의 오른쪽 측면 부위를 증폭하였다.
PCR 반응은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복수행하였다.
이와 같이 하여 얻은 3 종류의 1차 PCR 산물들을 하나의 폴리뉴클레오티드로 연결하기 위해, 2차 PCR을 수행하였다.
spr1310의 왼쪽 부위 PCR 산물이 가지고 있는 3' 말단 부위의 21개 염기서열은 KanR의 5' 말단 부위와 염기서열이 상보적이기 때문에 PCR에 의해 서로 상보가닥을 합성할 수 있다. 또한 spr1310의 오른쪽 부위 PCR 산물이 가지고 있는 5' 말단 부위의 21개 염기서열은 KanR의 3' 말단 부위와 염기서열이 상보적이기 때문에 PCR에 의해 서로 상보가닥을 합성할 수 있다.
이러한 원리를 이용하여, 1차 PCR 반응에서 얻은 3 종류의 PCR 산물에 대해 spr1310 L-F와 spr1310 R-R을 이용하여 2차 PCR을 수행하였다. 2차 PCR 반응은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분의 조건으로 30회 반복수행하였다.
그 결과, 원래의 spr1310 유전자 부위에 KanR이 삽입되어 목적유전자가 결실되고, spr1310 유전자의 좌측 및 우측 부위는 그대로 보존된 spr1310 유전자의 결실 카세트를 최종적으로 얻었다.
spr0476에 대한 결실카세트의 경우에도 spr0476 L-F과 spr0476 L-R를 사용하여 spr0476의 왼쪽 측면 부위를 증폭하고, spr0476 R-F과 spr0476 R-R를 사용하여 spr0476의 오른쪽 측면 부위를 증폭하였다. 이들 1차 PCR 산물에 대해 상기와 같은 방법으로 2차 PCR을 수행하여, 원래의 spr0476 유전자 부위에 KanR이 삽입되어 목적유전자가 결실되고 spr0476 유전자의 좌측 및 우측 부위는 그대로 보존된 spr0476 유전자의 결실카세트를 최종적으로 얻었다.
2) 유전자 결실 카세트를 이용한 대상유전자의 녹아웃(knockout)
상기 1)에서 제조한 유전자 결실 카세트를 이용하여 다음과 같이 각각 폐렴구균을 형질전환시킴으로써, 각각의 목적유전자를 녹아웃시켰다.
본 실시예에서는 형질전환에 사용할 균주로 폐렴구균 D39 균주와 R6 균주를 선택하였다.
냉동보관해 두었던 상기 균주들을 0.5% 효모 추출물(yeast extract)을 함유한 Todd-Hewitt 한천배지에 접종하여, 5∼10% CO2가 유지되는 배양기에서 세균을 배양하였다. 각 균주를 10㎖ 한천배지에 하룻밤 배양한 후 이 배양액의 5㎖을 45㎖의 새 한천배지에 첨가하여, 600㎚에서의 흡광도가 0.25가 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이때의 배양시간은 대략 4∼5시간 정도 소요되었다. 세균 배양액에 최종농도 10%가 되도록 글리세롤(glycerol)을 첨가하고, 각각 1㎖씩 분취하여 드라이아이스와 에탄올의 혼합액에서 얼린 후, 형질전환실험 전까지 -80℃에 보관해 두었다.
폐렴구균의 형질전환은 다음과 같이 수행하였다.
먼저 1㎍의 DNA 와 200㎕의 형질전환용 세포를 형질전환용 배지(competence medium: 0.5% 효모 추출물, 0.2% BSA, 0.01% 염화칼슘을 함유한 Todd-Hewitt 배양액)에 1:10의 비율로 희석하였다. 희석액을 37℃에서 1시간 정도 배양한 후, 100ng/㎖ 펩티드 페로몬 Csp-1(peptide pheromone Csp-1: EMRLSKFFRDFILQRKK)을 첨가하였다. 이후 37℃에서 3시간 정도 배양하고, 400㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 선택배지에 도말하여, 48시간 동안 37℃에 배양하였다.
3) spr1310 유전자의 필수성 확인
spr1310 유전자의 필수성을 확인하기 위해, 상기 2)의 형질전환균주들이 카나마이신 함유 배지에서 성장하는지를 관찰하였다.
그 결과, spr1310를 결실시킨 PCR 산물로 형질전환된 균의 경우, 콜로니가 전혀 생성되지 않았다(도 4, 왼쪽). 따라서, spr1310는 폐렴구균의 생존에 반드시 요구되는 필수유전자임을 알 수 있다.
반면 대조군인 비필수유전자 spr0476를 결실시킨 PCR 산물로 형질전환된 균의 경우, 수백 개의 콜로니들이 관찰되었다(도 4, 오른쪽).
이들 콜로니의 게놈에서 실제로 spr0476 대신 KanR로의 치환이 일어났는지를 확인하기 위해, 무작위로 몇 개의 콜로니들을 선정하여 녹아웃 여부를 확인한 결과, 형질전환된 폐렴구균 D39 균주와 R6 균주 모두에서 KanR이 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
따라서, spr1310 유전자를 표적으로 사용하는 방법은 신규항생물질 개발의 좋은 방법이 될 수 있다.
본 발명의 스크리닝용 조성물이 포함하는 spr1310 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질은, 폐렴구균의 생존에 필수적으로 요구된다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 폐렴구균, 그리고 더 나아가 병원성 세균들에 대한 효과적인 항생물질의 탐색 및 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> SONG, Jae Hoon
<120> Antibiotics screening composition comprising Streptococcus
pneumoniae spr1310 gene or its protein product, and antibiotics
screening method using said composition
<130> 03P-62
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 609
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<220>
<221> gene
<222> (1)..(609)
<223> Streptococcus pneumoniae spr1310 gene
<400> 1
atgtctgcaa tagaacgtat tacaaaagct gctcacttaa ttgatatgaa cgatattatc 60
cgtgaaggga atcctactct acgcacggtt gctgaggaag tcactttccc cctatctgac 120
caggaaatca tcctaggcga aaagatgatg caattcctta aacattccca agatcctgtc 180
atggctgaaa aaatgggact ccgcggtggt gttggactgg ctgctcccca gttagatatc 240
tcaaaacgca ttatcgctgt tttggtacct aatattgttg aagaaggcga aactccacag 300
gaagcctacg atttggaagc cattatgtac aatccaaaaa tcgtctctca ctctgttcaa 360
gatgctgctc ttggcgaagg agaaggttgc ctgtctgttg accgtaacgt gcctggctat 420
gttgttcgcc atgcccgcgt tactgttgac tactttgaca aagatggaga aaaacaccgt 480
atcaaactca aaggctacaa ctccattgtt gttcagcatg aaattgacca cattaacggt 540
atcatgtttt acgatcgcat caatgaaaaa gacccatttg cagttaaaga tggtttactg 600
attcttgaa 609
<210> 2
<211> 203
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(203)
<223> N-formylmethionylaminoacyl-tRNA deformylase
<400> 2
Met Ser Ala Ile Glu Arg Ile Thr Lys Ala Ala His Leu Ile Asp Met
1 5 10 15
Asn Asp Ile Ile Arg Glu Gly Asn Pro Thr Leu Arg Thr Val Ala Glu
20 25 30
Glu Val Thr Phe Pro Leu Ser Asp Gln Glu Ile Ile Leu Gly Glu Lys
35 40 45
Met Met Gln Phe Leu Lys His Ser Gln Asp Pro Val Met Ala Glu Lys
50 55 60
Met Gly Leu Arg Gly Gly Val Gly Leu Ala Ala Pro Gln Leu Asp Ile
65 70 75 80
Ser Lys Arg Ile Ile Ala Val Leu Val Pro Asn Ile Val Glu Glu Gly
85 90 95
Glu Thr Pro Gln Glu Ala Tyr Asp Leu Glu Ala Ile Met Tyr Asn Pro
100 105 110
Lys Ile Val Ser His Ser Val Gln Asp Ala Ala Leu Gly Glu Gly Glu
115 120 125
Gly Cys Leu Ser Val Asp Arg Asn Val Pro Gly Tyr Val Val Arg His
130 135 140
Ala Arg Val Thr Val Asp Tyr Phe Asp Lys Asp Gly Glu Lys His Arg
145 150 155 160
Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Asn Ser Ile Val Val Gln His Glu Ile Asp
165 170 175
His Ile Asn Gly Ile Met Phe Tyr Asp Arg Ile Asn Glu Lys Asp Pro
180 185 190
Phe Ala Val Lys Asp Gly Leu Leu Ile Leu Glu
195 200
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying KanR
<400> 3
aacagtgaat tggagttcgt cttgtt 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying KanR
<400> 4
gctttttaga catctaaatc taggta 26
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying left flanking region of spr1310
gene
<400> 5
tccagcacat gataacctgc ctc 23
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying left flanking region of spr1310
gene
<400> 6
gacgaactcc aattcactgt ttgtaatacg ttctattgca gaca 44
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying right flanking region of spr1310
gene
<400> 7
agatttagat gtctaaaaag ctgaccgtaa cgtgcctggc tatg 44
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying right flanking region of spr1310
gene
<400> 8
tggcaaggag taccgttcat atc 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying left flanking region of spr0476
gene
<400> 9
catcagtgga aggaatggtt gacc 24
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying left flanking region of spr0476
gene
<400> 10
gacgaactcc aattcactgt tatctaccca caagagcttg a 41
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying right flanking region of spr0476
gene
<400> 11
agatttagat gtctaaaaag ccatgaaaag cgtcgtttga c 41
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying right flanking region of spr0476
gene
<400> 12
gttgcgattg cgtccacctc ctca 24
Claims (9)
- 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 spr1310 유전자를 포함함을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝용 조성물
- 제 1항에 있어서, spr1310 유전자는 서열번호 1의 염기서열임을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝용 조성물
- 제 1항에 있어서, spr1310 유전자는 서열번호 1의 염기서열에 하나 이상의 붕괴, 결실, 삽입, 점, 치환, 논센스, 미스센스, 다형현상, 또는 재배열 돌연변이가 일어난 것 중 선택된 하나임을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝용 조성물
- 폐렴구균의 spr1310 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함함을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝용 조성물
- 제 4항에 있어서, spr1310 유전자로부터 발현되는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 N-포밀메티오닐아미노아실-tRNA 디포밀라아제(N-formylmethionylaminoacyl-tRNA deformylase)임을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝용 조성물
- 제 4항에 있어서, spr1310 유전자로부터 발현되는 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 하나 이상의 붕괴, 결실, 삽입, 점, 치환, 논센스, 미스센스, 다형현상, 또는 재배열 돌연변이가 일어난 염기서열로부터 발현되는 폴리펩티드 단편임을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝용 조성물
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물을 표적물질로 이용함을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝 방법
- 제 7항에 있어서, 상기 조성물과 시험대상물질을 접촉시킨 후, 그들 사이의 반응을 확인하여, 상기 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 단백질의 기능을 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝 방법
- 제 8항에 있어서, 화학물질 라이브러리(chemical library)를 스크리닝함을 특징으로 하는 항생물질 스크리닝 방법
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030036785A KR20040105417A (ko) | 2003-06-09 | 2003-06-09 | 폐렴구균의 에스 피 알 1310 유전자 또는 그로부터발현되는 단백질을 포함하는 항생물질 스크리닝용 조성물및 이를 이용하는 항생물질 스크리닝 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030036785A KR20040105417A (ko) | 2003-06-09 | 2003-06-09 | 폐렴구균의 에스 피 알 1310 유전자 또는 그로부터발현되는 단백질을 포함하는 항생물질 스크리닝용 조성물및 이를 이용하는 항생물질 스크리닝 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20040105417A true KR20040105417A (ko) | 2004-12-16 |
Family
ID=37380476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020030036785A KR20040105417A (ko) | 2003-06-09 | 2003-06-09 | 폐렴구균의 에스 피 알 1310 유전자 또는 그로부터발현되는 단백질을 포함하는 항생물질 스크리닝용 조성물및 이를 이용하는 항생물질 스크리닝 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20040105417A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180119890A (ko) * | 2017-04-26 | 2018-11-05 | 서울대학교산학협력단 | 박테리아 RppH를 표적으로 하는 항생물질 스크리닝 방법 |
-
2003
- 2003-06-09 KR KR1020030036785A patent/KR20040105417A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180119890A (ko) * | 2017-04-26 | 2018-11-05 | 서울대학교산학협력단 | 박테리아 RppH를 표적으로 하는 항생물질 스크리닝 방법 |
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