KR20040098168A

KR20040098168A - 씨형 간염 바이러스 항-코아 단백질 항체 진단에 유용한민감도 높은 항원성 에피토프

Info

Publication number: KR20040098168A
Application number: KR1020030030426A
Authority: KR
Inventors: 오종원; 강수민; 이진규; 김의중; 반재구
Original assignee: 주식회사 제노포커스; 오종원
Priority date: 2003-05-14
Filing date: 2003-05-14
Publication date: 2004-11-20
Also published as: KR100605322B1

Abstract

본발명은 C형 간염바이러스(HCV) 항체 측정에 유용한 민감도 높은 코아 항원성 에피토프(epitope)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 대장균 세포 표면에 발현되는 슈도모나스 쉬링게(Pseudomonas syringae) 유래 빙핵 활성 단백질(ice nucleation protein: INP)을 이용한 외래 단백질의 대장균 세포표면 발현기술을 사용하여 HCV 코아 단백질의 주요 항원성 에피토프를 대장균 세포표면에 발현시키고 이 재조합 대장균 세포로 감염 환자의 혈청 내에 존재하는 HCV 항-코아 항체를 신속하고 경제적으로 검출하는 기술에 관한 것이다.

Description

씨형 간염 바이러스 항-코아 단백질 항체 진단에 유용한 민감도 높은 항원성 에피토프{Antigenic Epitope for Diagnosis of Herpatitis C Virus Antibody}

발명의 분야

본발명은 C형 간염바이러스(Hepatitis C virus, HCV) 항체 측정에 유용한 민감도 높은 코아 항원성 에피토프(epitope)에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 대장균 세포표면에 외래 단백질을 발현시키는 기술을 이용하여 HCV의 중요한 코아 항원성 에피토프들을 대장균 표면에 발현시켜 항체를 검출할 수 있는 기술 및 상기 기술을 사용하여 기존의 코아 항체 검출에 사용된 코아 항원성 에피토프보다 민감도가 높게 반응하는 항원성 에피토프를 신속하고 경제적으로 발굴하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

지구상의 각종 병원체 바이러스 중 하나인 간염 바이러스는 수혈, 주사 또는 출산할 때 감염되는 것으로 알려져 있다. 이러한 수혈로 인한 바이러스성 간염이 발병하는 예가 현재까지 다수 보고 되고 있으며, 이러한 바이러스성 간염은 일반적으로 A형, B형 및 비A형, 비B형으로 분류되어 있다. 종래에는 B형 간염 바이러스(HBV)가 수혈할 때 바이러스성 간염의 원인으로서 공지되어 있었다. 최근에 이러한 HBV의 존재를 검출하는 검사시약이 개발되고 있으며 수혈 전에 간편하게 HBV의 존재를 확인할 수 있게 되므로 수혈로 인한 HBV 감염자는 전무해졌다. 한편 명백하게 바이러스이면서 지금까지 감염을 일으키는 원인으로서 생각되는 A형 간염바이러스(HAV)로 인한 A형 또는 HBV로 인한 B형이 아닌 간염(비A형, 비B형: non A, non B) 의 존재가 공지되었으며 1989년 문헌에 의해 비A, 비B형 간염 바이러스의 존재가 명백하게 되었다[참조: Choo, Q. L. et al., Science, 244: 359-362(1989); Kuo, G. et al., Science, 244: 362-364(1989)]. HCV에 의한 감염은 만성 간염으로 전이되는 빈도가 높으며 감염기간이 장기화됨에 따라 간경변증(cirrhosis)과 간암(hepatocellular carcinoma)을 유발시키기도 한다고 보고되어 있다[참조: Choo, Q. L. et al., Science, 244: 359-362(1989); Kuo, G. et al., Science, 244: 362-364(1989); Saito, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6547-6549(1990)].

HCV는 약 9.5 kb크기의 유전자를 갖는 일본쇄(single strand) (+) RNA 바이러스로서 유전자 구조상 플라비바이러스(flavivirus)나 페스티바이러스 (pestivirus)와 연관성을 가지는 플라비바이러스과(Flaviviridae)에 속하며, 바이러스에 의해 세포가 감염되면 HCV RNA에서 번역이 일어나 3011개의 아미노산으로 구성된 하나의 거대 폴리펩타이드가 만들어지며, 이 폴리펩타이드는 숙주세포나 바이러스 유래 단백질분해효소에 의해 코아(core) 단백질(18-22 kDa) 및 글리코실화 (glycosylation)된 두 가지의 외피 단백질 E1(31-35 kDa)과 E2(58-74 kDa)로 구성된 구조단백질, 그리고 다섯 가지의 비구조단백질(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)로 나누어진다[참조: Fournillier, J. A. et al., J. Gen. Virol., 77: 1055-1064(1996); Grakoui, A. et al., J. Virol., 67: 1385-1395(1993); Lanford, R.E. et al., Virology, 197: 225-235(1993); Matsura, Y. et al., Virology, 205: 141-150(1991)].

현재 이러한 HCV의 감염은 주로 혈액에 의해 초래되므로 감염원을 검출하고 배제함으로써 감염 경로를 차단할 수 있다. 현재 감염원을 검출하는 방법으로는 주로 HCV 폴리펩타이드에 대한 HCV 항체의 특이적인 결합성을 이용한 면역 검정법을 사용하여 검체 속의 HCV 항체를 검출하는 방법과 HCV 유전자 RNA를 검출하는 방법이 채택되고 있다. 항원검출 방법에 있어서는 코아 항원이 HCV검출에 많이 이용되고 있으며 코아 단백질은 HCV RNA를 바깥에서 감싸고 있는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)로 높은 항원성을 나타내는 동시에 HCV의 여러 유전자형(genotype)들 중에서 아미노산 서열 차이가 가장 적은 것으로 보고되고 있다[참조: Houghton, M. et al., Hepatology, 14: 381-388(1991)]. 또한, 다른 항원인 E1, E2보다 변이율이 낮으므로 코아 항원성 에피토프를 검출하는 것은 HCV 항체 검출에 있어서 매우 필수적이고 유효하다. 코아 항체의 검출에 사용되는 항원은 HCV 코아 항원성 에피토프를 포함하는 펩타이드(c22p: 서열 1의 코아단백질에서 10번째 아미노산부터 53번째 아미노산) 또는 폴리펩타이드 등이 사용되고 있다. 그러나 HCV 감염 여부를 측정하는 항체 검출 방법에 있어 아직 많은 경우 민감도와 정밀도가 정확하지 못하여 보다 정확하고 효과적인 HCV 감염원 검출 방법이 요구되고 있다. 또한 파아지 증식단계가 필요하여 시간이 걸리는 무작위 펩타이드 발현 파아지 라이브러리를 사용한 항원성 에피토프 발굴 방법이나 비용이 많이 드는 다수의 항원성 에피토프를 화학합성하여 우수한 항원을 찾아내는 펩타이드 스크리닝 방법을대체 할 수 있는 기술개발이 필요하다.

이에 본발명자들은 HCV 대한 항체를 검출하는데 있어 기존에 사용되는 c22p, HCV 코아 항원성 에피토프보다 민감도 높게 항체를 검출할 수 있는 항원성 에피토프를 개발하기 위하여 미생물 세포표면 발현방법을 개발·이용하였다. 이를 위해 사용한 빙핵 활성 단백질을 이용한 미생물 표면 발현 시스템은 세포표면 발현모체(surface anchoring motif)를 사용하여 외래 단백질을 안정적으로 표면에 발현시키는 기술로, 발현 생산이 어려운 단백질도 융합시 다량 발현이 가능하며 이들 단백질이 대장균 세포표면에 나오는 특성을 이용하여 항체 검출에 사용될 수 있다.

슈도모나스 슈링게 유래 빙핵활성 단백질은 단백질 구조상으로 단백질의 중앙에 8개, 16개 또는 48개의 아미노산이 반복되는 서열이 있으며, 이는 과냉각된 물 분자들이 얼음 입자를 잘 배열하게 하는 틀을 제공하고, 그의 N-말단과 C-말단에는 분비신호 및 표적 신호가 있어 단백질이 세포 내막을 통과할 수 있다. 구체적으로 빙핵 활성 단백질은 총 1,200개의 아미노산으로 구성되는데 상기 N-말단과 C- 말단 사이에 존재하는 반복 서열은 빙핵 활성과 관련이 있고, 그 길이가 조절될 수 있으며, N-말단은 단순히 세포 외막에 부착하는 기능을 가지고, C-말단은 단백질을 세포 외막까지 분비, 표적한다고 보고되어 있다[Green, R. L., et al., Mol. Gen. Genet., 215: 165-172(1988)]. 빙핵 활성 단백질은 상기 특성으로 인하여 외래 단백질을 세포 표면에 발현시킬 수 있는 표면 발현 모체로서 유용하게 이용될 수 있다.

이에 본발명자들은 슈도모나스 슈링게(Pseudomonas syringae: KCTC 1832 BP)유래의 빙핵 활성 단백질의 N-말단(전체 단백질의 15%)과 C-말단(전체 단백질의 4%)을 표면발현 모체로 이용한 표면 발현벡터를 제작하고 이를 이용하여 HCV의 주요 코아 항원성 에피토프들을 대장균[E.coli BL21(DE3)]의 표면에 발현시킨 후, HCV 코아 항체 검출을 위한 기존 진단에 사용되는 합성 펩타이드(c22p)보다 효율적인 진단이 가능한 민감도 높은 항원성 에피토프들을 발굴하고 이들의 항체검출 우수성을 확인함으로써 본발명을 완성하였다.

본발명의 목적은 HCV 감염여부를 검출하기 위한 HCV 항체 측정 방법에 사용 될 수 있는 민감도 높은 HCV 코아 항원성 에피토프 및 상기 에피토프를 함유하는 HCV 검출 키트를 제공함에 있다.

본발명의 다른 목적은 상기 에피토프를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드와 분비유도 단백질의 유전자를 함유하는 세포표면 발현벡터를 제공함에 있다.

본발명의 또 다른 목적은 HCV 코아 항원 단백질을 생산할 수 있는 표면 발현 벡터 (pT7INC-core, pT7INC-c22p, pT7INC-C1 내지 pT7INC-C8)와 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본발명의 또 다른 목적은 항체인식 활성이 높은 항원성 에피토프를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본발명에 사용된 대장균의 세포표면에 단백질을 발현시킬 수 있는 빙핵 활성 단백질 발현벡터의 제조방법 및 구조이다.

도 2는 본발명에 사용된 HCV 코아 단백질을 코딩하는 유전자를 INC(INP의 N말단과 C말단을 결합한 재조합 단백질) 유전자 3'말단에 융합시킨 재조합 표면 발현벡터(pT7INC-core)의 모식도이다.

도 3은 본발명에서 HCV 코아 항원성 에피토프 표면 발현벡터를 제조하는데 사용한 HCV 코아 구조단백질의 9개 항원성 에피토프에 대한 모식도이다.

도 4는 표면 발현벡터를 이용하여 INC 단백질 또는 기존의 HCV 코아 항원성 에피토프(antigenic epitope)를 INC의 카르복실기 말단에 융합시킨 INC-c22p가 대장균의 세포 표면에 발현되는가 확인한 결과이다. 도 4(A)는 면역형광현미경을 통해, 도 4(B)와 도 4(C)는 각각 INP 항체와 HCV 감염 환자의 혈청을 사용한 웨스턴 브로팅(Western blotting) 분석으로 INC 또는 INC-c22p의 표면발현 여부를 확인한 것이다.

도 5는 HCV 코아 구조단백질의 주요 항원성 에피토프 절편들의 발현과 항체인식 여부를 웨스턴 브로팅을 통해 확인한 결과이다. 도 5(A)는 융합단백질을 발현하는 재조합대장균 세포단백질 전체를 SDS-폴리아크릴아미드겔에서 전기영동한 후 빙핵 활성 단백질에 대한 항체로 웨스턴 브로팅한 결과이다. 도 5(B)는 도 5(A)와 같이 단백질을 전기영동한 후 코아 항원에 대한 특이 항체가 존재하는 HCV 만성간염환자의 혈청을 이용하여 웨스턴 브로팅을 실시, 융합 단백질로 발현된 코아 항원성 에피토프들과 항체간의 특이적 반응 여부를 분석한 결과이다.

도 6은 재조합 HCV 코아 단백질 주요 항원성 에피토프와 HCV 양성 환자의 혈청 내 항체간 특이적 결합 정도를 알아 보기 위해 항원을 세포 표면에 발현하고 있는 대장균 세포를 사용하여 효소 면역 흡착 분석법(ELISA)을 실시한 결과이다.

도 7은 우수항원의 표면 발현 확인을 위하여 코아 항원에 대한 특이 항체가 존재하는 HCV 감염환자의 혈청을 사용하여 대장균 세포 표면에 코아 항원이 발현 됨을 형광-활성 세포 선별 측정 방법(FACS:fluorescence activated cell sorter)으로 측정한 결과이다.

도 8은 주요 HCV 코아 항원성 에피토프(c22p, C2 및 C3)의 HCV 감염환자 혈청 내 존재하는 코아 특이 항체 검출능력 정도를 10명의 HCV 감염환자 혈청을 이용한 ELISA 분석으로 비교 측정하여 기존의 HCV 코아 항원성 에피토프인 c22p보다 민감도가 높게 항체를 검출할 수 있는 신규 HCV 코아 항원성 에피토프 C2 및 C3에 대한 우수성을 확인한 결과이다.

본발명에서 C1은 서열 1의 아미노산 서열을 가지는 HCV 코아 단백질의 38번째 아미노산부터 53번째 아미노산으로 이루어진 펩티드이고, C2는 26번째 아미노산부터 53번째 아미노산, C3는 1번째 아미노산부터 38번째 아미노산, C4는 101번째 아미노산부터 121번째 아미노산, C5는 38번째 아미노산부터 75번째 아미노산, C6은 1번째 아미노산부터 26번째 아미노산, C7은 1번째 아미노산부터 75번째 아미노산이며 C8은 38번째 아미노산부터 121번째 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.

본발명에서는 기존의 HCV 검출 방법에 있어, HCV 코아 항체 측정에 사용되는 기존의 코아 항원성 에피토프보다 유효한 코아 항원성 에피토프를 개발하기 위해 세포 표면발현 기술을 이용하였다. 세포 표면발현 기술은 적당한 세포 외막 단백질과 외래 단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합단백질이 생합성되도록 유도한 다음, 안정하게 세포내막을 통과하여 세포 외막에 부착되어 유지하도록 하는 방법이다. 이러한 표면발현 방법은 단백질의 활성 측정이 용이하고 목적단백질에 융합된 앵커 단백질에 의해 발현량이 균일하게 조절되며 발현하기 어려운 단백질의 발현에 유리한 장점이 있다.

코아 항원의 특이적 항체 결합능력을 측정하기 위하여 주요 코아 항원성 에피토프 유전자를 삽입한 세포 표면 발현벡터를 제조하였다. 빙핵 활성 단백질을 이용한 표면 발현벡터를 얻기 위하여 슈도모나스 슈링게 유래의 빙핵 활성 단백질 유전자가 클론 된 기존의 플라스미드 벡터 pGINP21(기탁번호: KTCT 제 8608P호)을 이용하여 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자를 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 증폭한 다음 T7 프로모터에 의해 전사가 시작되는 pET22b(+) 벡터에 삽입하여 표면 발현벡터를 제작하였다. 이는 lacI 리프레서에 의해 발현이 조절되어 이소프로필-베타-디-티오칼락토시다제(isopropyl-(-D-thiogalactosidase,IPTG)를 배지에 첨가함으로써 발현이 유도가 되도록 제작된 벡터이다.

본발명에서는 먼저 한국인 HCV 양성환자의 혈청에서 추출한 RNA로부터 유래된 HCV cDNA로부터 PCR로 코아 항원에 해당하는 유전자를 증폭하고, 이들 유전자를 빙핵 활성 단백질 코딩 유전자에 번역 코돈을 맞추어 표면 발현벡터 pT7INC에 삽입함으로써 pT7INC-core 플라스미드를 제작하였다. 또한 이 pT7INC-core를 주형으로 현재 진단에 사용되는 HCV 코아 주요 항원성 에피토프인 c22p 코딩유전자와 본발명에 따른 C1 내지 C8의 에피토프를 표면 발현벡터 pT7INC에 삽입하여 pT7INC-c22p와 pT7INC-C1 내지 pT7INC-C8을 제작하였다.

코아 항원 단백질 및 그 단편이 세포 내에서 제대로 합성되고 세포 내막을 통과하여 안정적으로 세포 표면에 부착되는지를 확인하기 위하여, 상기 발현벡터로 대장균 E.coli BL21(DE3)을 형질전환시킨 다음, 배양함으로써 HCV 코아 항원 중 주요 항원성 에피토프가 표면 발현될 수 있도록 단백질 합성을 유도하였다.

면역형광현미경 관찰 및 코아 항원에 대한 항체가 존재하는 HCV 감염원의 혈청을 통한 웨스턴 브로팅 분석으로 세포 표면에 HCV 코아 항원 및 항원성 에피토프가 안정하게 발현된다는 것을 확인하였다.

이러한 주요 항원성 에피토프들이 세포표면에 발현되었는지 여부를 형광-활성 세포선별 방법(FACScan)을 통해 재확인한 결과, 코아 항원성 에피토프 절편들이 세포표면에 발현되고, 융합단백질이 대장균 세포표면에서 HCV 코아에 대한 항체와 특이적으로 반응한다는 것을 확인하였다.

결국, 본발명은 C2, C3, C6 및 C7로 구성된 군에서 선택된 HCV 검출용 항원성 에피토프를 제공하는 것을 특징으로 한다. 본발명은 또한 상기 에피토프를 코딩하는 올리고뉴클레오티드, 상기 에피토프 중 동일한 2개 이상의 에피토프가 융합되거나, 또는 서로 다른 2개 이상의 에피토프가 융합되어 있는 융합단백질을 제공한다.

융합단백질은 통상의 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 즉, 융합하고자 하는 단백질의 유전자와 상기 에피토프를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 재조합 발현벡터를 제작한 다음, 상기 재조합 발현벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여 통상적인 기법에 의해 융합단백질을 발현한다. 융합단백질 발현에 적당한 숙주세포로는 대장균, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 브레비스 등과 같은 세균, 스트렙토마이세스 리비단스와 같은 방선균류, 스트렙토마이세스 세레비시애와 같은 효모, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 니듈란스 및 아스퍼질러스 니거와 같은 곰팡이, COS-7, CHO, Vero, 생쥐 L 세포와 같은 동물세포, 곤충세포, 또는 식물세포 등이 이용될 수 있다. 본발명에서 사용되는 숙주세포는 대장균이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 E.coli BL21(DE3)가 사용될 수 있다. 융합하고자 하는 단백질은 특별히 제한되지는 않으나, 세포표면으로의 발현을 유도할 수 있는 분비유도 단백질을 이용하는 것이 바람직하다.

또, 본발명은 상기 올리고뉴클레오티드 합성에 유용한 서열 6과 서열 7, 서열 8과 서열 9, 서열 14와 서열 15 및 서열 16과 서열 17로 구성된 군에서 선택된 프라이머 쌍과 상기 에피토프 또는 상기 융합단백질을 포함하는 HCV 검출용 키트 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 에피토프 또는 융합단백질을 포함하는 HCV 검출용 키트는 통상적인 방법인 효소 면역 흡착 분석법(ELISA), 형광-활성 세포 선별 측정방법(FACS), 생세포 패닝(panning) 후 선별, 녹색 형광단백질(green fluorescence protein)과 같은 결합정도를 측정 가능하게 하는 물질을 세포내에서 함께 발현하여 이의 형광정도로 HCV 항체 검출정도를 선별하는 방법 등 다양한 방법으로 제조할 수 있다.

또, 본발명은 상기 올리고뉴클레오티드와 분비유도 단백질의 유전자를 함유하는 세포표면 발현벡터를 제공한다. 본발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물과 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 항원성 에피토프를 세포표면에 발현하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이 때 사용하는 미생물은 벡터의 프로모터를 인식할 수 있는 대장균이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 E.coli BL21(DE3)가 사용될 수 있다.

또, 본 발명은 상기 항원성 에피토프가 표면에 발현되어 있는 것을 특징으로하는 미생물 및 이 미생물을 함유하는 HCV 검출용 키트 및 조성물을 제공한다. 상기 분비 유도 단백질은 빙핵 활성 단백질 또는 그 일부일 수 있다. 또한, 상기 빙핵 활성 단백질은 슈도모나스 슈링게 유래일 수 있고, 빙핵 활성 단백질의 일부는 세포 부착부위 N말단과 세포 외막으로의 분비 및 표적기능을 갖는 부위 C말단일 수 있다. 상기 빙핵 활성 단백질의 N말단과 C말단 DNA는 HindⅢ와 BamHⅠ으로 절단한 단편일 수 있다.

본발명에서 사용되는 바람직한 세포표면 발현벡터는 HindⅢ와 BamHⅠ으로 절단한 빙핵 활성 단백질의 N말단과 C말단 유전자를 HindⅢ, BamHⅠ으로 절단한 기본벡터 pET22b(+)에 삽입하여 제조된 도 1에 기재된 유전자 지도를 갖는 표면 발현벡터 pT7INC이다. 상기 벡터에는 병원성 바이러스나 미생물의 항원 단백질 또는 그 일부를 코딩하는 DNA가 삽입되어 있을 수 있고, 상기 항원 단백질 또는 그 일부를 코딩하는 DNA는 본발명의 에피토프를 코딩하는 올리고뉴클레오티드, HCV 코아 단백질의 유전자 또는 c22p를 코딩하는 DNA일 수 있다. 상기 발현벡터는 pT7INC-core, pT7INC-c22p, pT7INC-C1, pT7INC-C2, pT7INC-C3, pT7INC-C4, pT7INC-C5, pT7INC-C6, pT7INC-C7 및 pT7INC-C8로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

또, 본발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물과 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 항원성 에피토프를 세포표면에 발현하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이 때 사용하는 미생물은 벡터의 프로모터를 인식할 수 있는 대장균이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 E.coli BL21(DE3)가 사용될 수 있다.

또, 본발명에서는 (a) 병원성 바이러스나 미생물의 항원 단백질 또는 그 일부를 코딩하는 DNA의 라이브러리를 제조하는 단계; (b) 상기 라이브러리를 빙핵 활성 단백질의 세포 부착부위 (N말단)와 세포 외막으로의 분비 및 표적기능을 갖는 부위 (C말단)을 코딩하는 DNA를 포함하는 세포표면 발현벡터에 삽입하여 발현벡터 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 상기 벡터 라이브러리로 미생물을 각각 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 항원 단백질 또는 그 일부를 세포표면에 발현시키는 단계; 및 (e) 상기 병원성 바이러스나 미생물에 감염된 환자의 혈청과 특이적으로 결합하는 항원성 에피토프를 검출하여 선택하는 단계를 포함하는 항체인식 활성이 높은 항원성 에피토프를 선별하는 방법을 제공한다.

여기서, 병원성 바이러스나 미생물의 항원 단백질 또는 그 일부를 코딩하는 DNA는 HCV 코아 단백질의 유전자 또는 그 단편일 수 있고, 빙핵 활성 단백질의 세포 부착부위 (N말단)와 세포 외막으로의 분비 및 표적기능을 갖는 부위 (C말단)을 코딩하는 DNA를 포함하는 세포표면 발현벡터는 pT7INC일 수 있다.

상기 방법에서 DNA 라이브러리는 항원 단백질 유전자를 이용하여 변형시킨 모든 DNA들을 말한다. 이러한 DNA 라이브러리의 제조방법은 항원 단백질의 구조를 분석하여 항원성 에피토프가 존재할 수 있으리라 예측되는 부분들을 PCR로 증폭하여 제조하거나, 항원 DNA에 무작위적인 돌연변이를 일으키거나 무작위적으로 절단하여 제조할 수 있다. 이 때 무작위적인 돌연변이를 일으키는 방법으로서는 DNA셔플링, 에러유발 PCR 방법 등이 사용 가능하다. 또한 항원의 일부분를 선택하여 동일한 부위를 서로 결합시켜서 멀티머(multimer)로 제조할 수도 있다.

최근 HCV 감염환자가 전세계적으로 늘어가고 있는 이유 중 하나는 수혈 등으로 인한 이들 감염원의 확산을 막기 위한 우수한 감염원 특정화 방법, 즉 민감도 높은 진단방법이 명확히 확정되어 있는 않다는 것이다. 예방 백신 및 효과적인 치료제가 없는 현재 상황에서, 코아 항체 측정 방법에 사용되는 합성 코아 항원 펩타이드(c22p)보다 민감도 높은 본발명에서 발굴한 상기 코아 항원성 에피토프는 진단시약 개발과 생백신 개발에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본발명을 예시하기 위한 것으로서, 본발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: 표면 발현벡터 pT7INC의 제조

빙핵 활성 단백질의 N-말단과 C-말단로 이루어진 INC(INP의 N말단과 C말단을 결합한 재조합 단백질) 재조합 앵커 모티프를 이용한 대장균 고발현 벡터를 제작하기 위하여 T7 프로모터를 이용하는 신규 발현 벡터 플라스미드를 제조하였다. INC 단백질 유전자는 기존의 빙핵 활성 단백질 발현 벡터 플라스미드 pANC3(KCTC 0326 BP)로부터 얻었다. 우선, T7 프로모터를 가지고 있는 pET-22b(+) (노바젠, 독일)과 pANC3 플라스미드를 각각 NdeI과 HindIII로 절단한 후, 클레나우 단편 (Klenow fragment)를 이용하여 평활말단화 하였다. 이후, 두가지 DNA 모두 BamHI으로 절단하여 T7 프로모터, 복제시작부위, 항생물질 저항 유전자 등이 포함된 벡터부위와 INC 유전자 부위를 얻었으며, 두 DNA 단편을 결합하여 약 6.4kbp 크기의 재조합벡터, pT7INC를 제작하였다(도 1).

실시예 2 : 재조합 융합 단백질 표면 발현 벡터 pT7INC-core, pT7INC-c22p, pT7INC-C1~8의 제조

한국형 HCV의 유전자를 확보하기 위해 감염환자 혈청으로부터 분리한 HCV RNA 유전자를 포함하는 총 RNA를 주형으로 무작위 헥사머와 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RNA와 무작위 헥사머를 섞은 후, 70℃에서 5분간 가열하고 얼음에서 빠르게 식혔다. 이 혼합액을 역전사효소 완충용액, 1 mM dNTP 각각, 20 U의 역전사 효소와 함께 37℃에서 60분간 배양하고 95℃에서 5분간 불활성화시켰다. HCV 의 코아 단백질(서열 1)의 전체 cDNA는 하기의 조건으로 증폭하였다.

HCV 코아 단백질 아미노산 서열 : (서열 1):

MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKASERSQPRGRRQPIPKARRPEGRAWAQPGYPWPLYGNEGLGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPGCSFSIFLLALLSCLTIPASA

PCR은 서열 2와 서열 3의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 54℃에서 1분 30초, 92℃에서 1분 30초, 92℃ 1분 30초 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 총 40회 PCR 반응을 실시하였다. 이 증폭된 DNA를 제한효소 BamHⅠ과EcoRⅠ으로 절단한 다음 동일한 효소들로 절단된 T7 프로모터가 존재하는 pT7INC벡터에 삽입하여 코아 항원 유전자 전체를 INC 유전자 3'말단에 지닌 6.9kbp 크기의 발현벡터를 제작하고 이를 표면 발현벡터 pT7INC-core라 명명하였다(도 2).

서열 2 : 5'-GATTGGGGGCGACACTCCACC-3'

서열 3 : 5'-GGAATTCCTTAAGCGGAGGCTGGGATGGTC-3'

도 3은 본발명에서 코아 항원성 에피토프 표면 발현벡터를 제조하는데 사용한 HCV 코아 구조단백질의 주요 항원성 에피토프 절편들의 모식도이다. 코아 항원의 친수성 부위를 중심으로 항원성 에피토프 C1 내지 C8을 추가로 제작하다. 검정색 부분은 HCV 코아 단백질 내 친수성 부위를 의미한다.

pT7INC-C1은 상기 발현 플라스미드(pT7INC-core)를 주형으로 사용하고 서열 4와 서열 5의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR (94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분의 조건으로 32회 수행)을 통해 얻은 약 45bp 크기의 코아 항원 절편 유전자를 제한효소 BamHⅠ과 EcoRⅠ으로 절단한 다음 동일한 효소로 절단된 T7 프로모터와 빙핵 활성 단백질의 반복구간이 약간 포함된 빙핵 활성 단백질의 N-말단과 C-말단 부위를 코딩하는 유전자로 구성된 pT7INC 발현벡터에 삽입하여 얻어진 약 6.45kbp 크기의 표면 발현벡터이다. pT7INC-C2는 p7INC-core를 주형으로 사용하고 서열 6과 서열 7의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 PCR을 수행한 뒤, 상기 같은 방법으로 제작하였다. 마찬가지로, pT7INC-C3의 경우는 서열 8과서열 9를 프라이머로, pT7INC-C4의 경우는 서열 10과 서열 11을 프라이머로, pT7INC-C5의 경우는 서열 12와 서열 13을 프라이머로, pT7INC-C6의 경우는 서열 14와 서열 15를 프라이머로, pT7INC-C7의 경우는 서열 16과 서열 17을 프라이머로, pT7INC-C8의 경우는 서열 18과 서열 19를 프라이머로 사용하여 동일한 방법으로 벡터를 제조하였다. 기존에 사용된 코아 항원인 c22p의 경우는 서열 20과 서열 21을 프라이머로 사용하여 동일한 방법으로 클로닝 하였고 pT7INC-c22p라 명명하였다(도 3).

서열 4 : 5'-CGGGATCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTG-3'

서열 5 : 5'-GGAATTCCTTAGGAAGTCTTCCTAGTCGCGC-3'

서열 6 : 5'-CGGGATCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGA-3'

서열 7 : 5'-GGAATTCCTTAGGAAGTCTTCCTAGTCGCGC-3'

서열 8 : 5'-GATTGGGGGCGACACTCCACC-3'

서열 9 : 5'-GGAATTCTTACGGCAACAGGTAAACTCCACCAAC-3'

서열 10 : 5'-CGGGATCCCCGTGGCTCCCGGCCTAGTTGGGGC-3'

서열 11 : 5'-GGAATTCCTTAACCCAAGTTACGCGACCTAC-3'

서열 12 : 5'-CGGGATCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTG-3'

서열 13 : 5'-GGAATTCTTACCAGGCCCTACCCTCGGGCTGGCG-3'

서열 14 : 5'-GATTGGGGGCGACACTCCACC-3'

서열 15 : 5'-GGAATTCTTACGGGAACTTGAACGTCCTGTGGGCG-3'

서열 16 : 5'-GATTGGGGGCGACA CTCCACC-3'

서열 17 : 5'-GGAATTCTTACCAGGCCCTACCCTCGGGCTGGCG-3'

서열 18 : 5'- CGGGATCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTG-3'

서열 19 : 5'-GGAATTCCTTAACCCAAGTTACGCGACCTAC-3'

서열 20 : 5'-CGGGATCCCAAAACCAAACGTAACACCAA-3'

서열 21 : 5'-GGAATTCCTTAGGAAGTCTTCCTAGTCGCGC-3'

실시예 3 : HGV 코아 단백질 내 주요 항원성 에피토프의 발현

상기 표면 발현 벡터 pT7INC-core, pT7INC-c22p, pT7INC-C1 내지 pT7INC-C8로 형질전환된 대장균에서 코아 항원들이 대장균 세포의 표면에 발현되어 항체와의 반응성을 갖게 되는지를 조사하기 위하여, T7 RNA 중합효소 유전자를 염색체 DNA상에 지니고 있는 E. coli BL21(DE3)를 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 균주에 각각의 재조합 플라스미드 DNA를 42℃에서 90초간 열 충격을 주어 도입하였다. 재조합 플라스미드 DNA가 도입된 재조합 BL21(DE3) 세포를 항생제 암피실린이 0.1 mg/ml 첨가된 5 ml의 LB 배지(효모엑기스 5 g/l, 트립톤 10 g/l, 소금 5 g/l, pH 7.0)에서 37℃, 200 rpm 진탕 배양조건 하에서 12시간 배양하였다. 이 배양액을 항생제 암피실린이 0.1 mg/ml 첨가된 5 ml LB 배지에 1:100으로 희석하여 37℃, 200 rpm 조건에서 2~3시간 배양하여 균주 생육이 600 nm에서 흡광도 0.4~0.5일 때 T7 RNA 중합효소 발현유도를 위해 IPTG를 1 mM의 농도로 첨가하여 25℃에서 6시간 단백질의 발현을 유도하였다.

실시예 4 : 면역형광 현미경을 이용한 INC 융합단백질의 세포표면 발현 확인

INC 또는 INC-c22p를 발현하는 재조합 세포를 배양하여 PBS 완충액으로 세척한 후, 3% BSA를 함유하는 PBS 완충액에 600 nm에서의 흡광도 0.5로 현탁하였다. HCV 감염환자 혈청을 1:1000으로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 시킨 후, PBS로 5회 세척하였다. 다음에 FITC가 결합된 항-인간 IgG(immunoglobulin)를 1:3000으로 희석하고 3% BSA를 함유하는 PBS 완충액에 현탁하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 PBS 완충용액으로 5회 세척한 후, 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscope)로 세포의 형광 정도를 측정하였다. 위의 실험으로부터 대표적 HCV 코아 항원성 에피토프인 c22p가 세포표면에 안정하게 발현됨을 확인할 수 있었다(도 4).

도 4는 발현벡터를 이용하여 재조합 단백질 INC 또는 재조합 항원 단백질 INC-c22p의 대장균 세포 표면에서의 발현여부를 확인한 결과이다. 도 4(A)는 INC 또는 INC-c22p의 표면발현 여부를 대장균 표면에 발현된 INC는 카르복시 말단에 달린 (His)6을 인식하는 단일 항체로, INC-c22p는 HCV 감염환자의 혈청과 반응시킨 뒤 FITC가 결합된 항-마우스 및 항-인간 Ig로 각각 처리하여 면역형광현미경을 통해 형광정도를 측정한 결과이다. 도 4(B)는 SDS-폴리아크릴아미드겔 상에서 재조합대장균 단백질체를 전기영동한 후, 빙핵 활성 단백질에 대한 항체를 사용하여 융합단백질의 발현을 웨스턴 브로팅으로 확인한 결과이다. 도 4(C)는 도 4(B)와 동일한 방법으로 단백질을 전기영동한 후 HCV 감염환자의 혈청 내 항-코아 항체가 c22p에특이성을 가지며 반응함을 웨스턴 브로팅 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 4(B)와 도 4(C)에서 1은 pT7INC 발현벡터가 삽입된 균주, 2는 pT7INC-c22p가 삽입된 균주의 단백질 분획을 전기영동하여 웨스턴 브로팅으로 분석한 결과이다.

실시예 5 : 웨스턴 브로팅을 통한 융합 단백질의 발현 확인 및 HCV 감염 환자 혈청과 특이적으로 반응하는 코아 항원성 에피토프의 발굴

빙핵활성 단백질의 N-말단과 C-말단을 지닌 INC 단백질에 융합된 코아 항원의 발현은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 코아 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 브로팅을 수행하여 확인하였다. 단백질 발현을 유도한 대장균 세포를 원심분리하여 단백질 분석시료 준비용액(50 mM 트리스-Cl, 100 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루, 10% 글리세롤)에 녹인 뒤 100℃에서 10분간 열 처리한 후, 전기영동을 수행하였다. 다음, 겔 내의 단백질을 니트로셀룰로오즈 막에 브로팅하고, TBST 완충용액(20 mM 트리스-Cl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)에 2% BSA(bovine serum albumin)를 첨가한 블로킹 용액에 1시간 처리하여 비 특이적인 결합을 막고, 항-INP 토끼 항체 또는 HCV 감염 환자의 혈청을 1:1000의 비율로 TBST 용액에 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 니트로셀룰로오즈 막들을 TBST 완충용액으로 10분씩 3번 세척하고, 1:5000의 비율로 TBST용액에 의해 희석된 ALP(alkaline phosphatase)가 결합 된 항-토끼 Ig 또는 항-인간 Ig와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 후 막을 TBST 완충용액으로 3번 세척한 뒤 NBT/BCIP(Sigma, USA)를 이용하여 항체와 반응성 있는 단백질을 검출하였다.

위의 실험 결과로부터 도 5에서 보는 것과 같이, 모든 재조합 균주들이 항-INP 항체에 의해 인식되는 것으로 보아 INC 단백질을 융합 모체로 이용하여 모든 융합 단백질이 예상되는 크기로 세포 표면에 발현됨을 확인하였다.

또한, 빙핵 활성 단백질에 대한 항체와 코아 항원에 대한 항체가 존재하는 HCV 감염환자 유래 혈청으로 웨스턴 브로팅 분석을 수행하여 융합 단백질(pT7INC-C1 내지 pT7INC-C8: 약 41~63 kDa)들이 빙핵 활성 단백질에 대한 항체 및 HCV 감염환자 유래 항체와 특이적으로 반응함을 확인하였다(도 5).

도 5(A)는 빙핵 활성 단백질 유전자를 이용해 세포 표면에 발현된 각 대장균 세포단백질 분획을 SDS-폴리아크릴아미드겔 상에서 전기영동한 후 빙핵 활성단백질에 대한 항체로 웨스턴 브로팅 분석한 결과이다.

도 5(B)는 도 5(A)와 같이 단백질을 전기영동한 후 HCV 만성간염환자의 혈청을 이용하여 웨스턴 브로팅 분석을 실시하여 환자의 혈청과 특이적으로 결합하는 코아 항원성 에피토프를 검출한 결과를 보여주고 있다.

도 5(A)와 도 5(B)에서 INC는 pT7INC 발현벡터가 삽입된 형질전환체를 발현 유도하여 대장균 세포단백질 분획을 SDS-폴리아크릴아미드겔에 전기영동한 후 웨스턴 브로팅한 분획이다. C1의 경우는 pT7INC-C1, C2의 경우는 pT7INC-C2, C3의 경우는 pT7INC-C3, C4의 경우는 pT7INC-C4, C5의 경우는 pT7INC-C5, C6의 경우는 pT7INC-C6, C7의 경우는 pT7INC-C7, C8의 경우는 pT7INC-C8로 각각 형질전환된 대장균을 사용하여 실시예 3과 같이 단백질 발현을 유도한 뒤 이들 대장균의 세포단백질 분획을 SDS-폴리아크릴아미드겔에 전기영동한 후 웨스턴 브로팅 분석한 결과이다.

그 결과, HCV 감염환자의 혈청에 존재하는 항-코아 항체에 C2, C3, C6 및 C7부위가 다른 펩타이드 항원성 에피토프에 비해 항-코아 항체와 특이적으로 결합하는 항체인식 부위를 포함함을 알 수 있었다.

실시예 6 : 항원성 에피토프를 세포 표면에 발현하는 대장균을 사용한 ELISA: 세포 표면 발현된 융합단백질의 항-코아 항체와의 반응성 여부 분석

융합단백질 발현을 유도시킨 재조합 대장균을 PBS 완충용액에 600 nm에서 흡광도가 1.0이 되도록 현탁시키고, 이를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에 1웰 당 현탁액을 200㎕씩 첨가하고 37℃에서 12시간 정치하여 세포를 마이크로 플레이트에 고상화하였다. 고상화되지 않은 잉여의 세포가 있는 PBS 완충용액을 제거한 다음, 각 웰에 2% BSA가 첨가된 PBS 완충용액을 200㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응하여 비특이적 결합을 막았다. 완충액을 제거하고 PBS 완충용액에 HCV 감염환자의 혈청을 1:1000으로 희석하여, 1웰 당 180㎕씩 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이어 비 결합 물질을 제거하고, 각 웰을 PBS 완충용액으로 3회 세정한 다음, ALP 결합된 항-인간 Ig가 1:5000비율로 희석된 PBS 용액을 1웰 당 180㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이어 비결합 물질을 제거하고, 각 웰을 PBS 완충용액으로 3회 세정한 다음, NPP(시그마)를 160㎕씩 첨가하여 발색반응을 유도한 후 405 nm의 흡광도에서 발색 정도를 측정하였다.

도 6은 재조합 HCV 코아 단백질 주요 항원성 에피토프와 HCV 양성 환자의 혈청 내 항-코아 항체간의 특이적 결합 정도를 알아 보기 위해 효소 면역 흡착 분석법(ELISA)을 실시한 결과이다.

코아 항원의 세포 표면 발현 여부와 HCV 항-코아 항체와의 특이성을 측정하기 위하여 효소 면역 흡착 측정법(ELISA)로 분석한 결과, 대장균 생세포 표면에 코아 주요 항원성 에피토프들이 표출되며 HCV 혈청 내 항-코아 항체가 이들을 특이적으로 인식함을 확인하였다.

이를 통해 C2, C3 코아 항원성 에피토프가 다른 INC 단백질에 결합된 코아 펩타이드 항원성 에피토프에 비해 HCV 감염환자의 혈청에 존재하는 항-코아 항체와 특이적으로 결합하는 우수한 항체인식 부위를 지니고 있음을 알 수 있었다(도 6).

실시예 7 : 형광-활성 세포 선별 측정방법(FACS)에 의한 융합단백질의 세포표면 발현 확인

재조합 플라스미드 pT7INC-core와 pT7INC-C2 및 pT7INC-C3가 도입된 재조합 대장균 BL21(DE3)와 재조합 플라스미드가 도입되지 않은 야생주 BL21(DE3)를 대조군으로 각각 1×10⁸씩 사용하여, 이들 코아 단백질 및 에피토프가 세포표면에 발현되는지 여부를 확인하였다. 실시예 3과 같이 단백질 발현을 유도시킨 대장균을 각각 1×10⁸씩 동일한 세포의 농도로 수확하고, 여기에 감염환자 혈청을 1:1000으로 희석한 PBS 완충용액에 현탁하여 4℃에서 20분간 결합시킨 다음, PBS 완충용액으로세 번 세척하였다. 다음 FITC가 결합된 항-인간 Ig가 1:5000으로 희석된 PBS 완충용액을 사용하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 다시 PBS 완충용액으로 세 번 세척한 후 형광 정도를 분석하였다.

도 7은 대장균에 표면 발현된 재조합 융합단백질을 코아 항원에 대한 특이항체가 존재하는 HCV 감염환자의 혈청을 사용하여 형광-활성 세포 선별 측정 방법으로 측정한 결과이다. 각 그래프의 X축은 형광도, Y축은 세포수를 나타낸다.

도 7(A)는 야생주 BL21(DE3)의 형광 정도이다.

도 7(B)는 pT7INC-C2가 도입된 재조합 균주의 형광 정도이다.

도 7(C)는 pT7INC-C3가 도입된 재조합 균주의 형광 정도이다.

도 7(D)는 pT7INC-core가 도입된 재조합 균주의 형광 정도이다.

이를 통해 형질전환되지 않은 대장균과 비교하여, 여러 표면 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균에서 본발명에서 발굴한 주요 우수 코아 항원성 에피토프인 C2 와 C3 및 이의 전구체인 코아 단백질 전체가 INC 단백질에 융합시 대장균 표면에서 발현됨을 확인하였다(도 7).

실시예 8 : 세포 표면 발현된 융합단백질의 ELISA를 통한 항-코아 항체와의 반응성 여부 분석

C2 및 C3 펩타이드 항원성 에피토프와 HCV 양성환자의 혈청 내 항-코아 항체간의 특이적 반응 우수성을 알아보기 위해 융합 INC-c22p, INC-C2, INC-C3를 세포의 표면에 발현하는 대장균 형질전환체와 10명의 HCV 감염환자의 혈청을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 실시예 6과 같이 각 단백질이 발현 유도된 세포로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 10명의 만성 감염환자 혈청을 1:1000으로 희석하여 반응시키고, ALP(alkaline phosphatase)가 결합된 항-인간 Ig를 1:5000으로 희석하여 결합한 후, 기질을 첨가하여 발색 정도를 INC 단백질만이 발현되는 세포가 든 웰의 발색 정도를 제한값으로 표현하여 비교하였다(도 8).

도 8은 주요 HCV 코아 항원성 에피토프(c22p, C2 및 C3)와 HCV 감염환자 혈청 내 코아 특이 항체와의 반응성을 10명의 HCV 감염 환자의 혈청을 사용하여 ELISA로 분석한 결과로 c22p 항원성 에피토프에 비해 C2 및 C3 항원성 에피토프가 민감하게 환자 혈청 내 항-코아 항체와 반응함을 나타냄으로써 이들 항원성 에피토프의 우수성을 보여주고 있다. 환자 번호 밑의 괄호 안에는 환자에 감염된 HCV의 유전자형과 바이러스 유전자 RNA의 카피 수를 표시하고 있다.

신규 검출된 HCV 코아 항체를 민감하게 인식할 수 있는 C2 및 C3 항원성 에피토프와 기존에 보고되어 사용되고 있는 항원성 에피토프 c22p를 사용하여 10명의 감염환자의 혈청으로 효소 면역 측정법을 이용한 항원-항체 반응을 한 결과, C2(30%) 와 C3(70%)가 기존에 사용되고 있는 코아 항원성 에피토프인 c22p보다 민감하게 항-HCV 코아 항체를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 8).

본발명은 미생물 세포표면 발현기술을 이용하여 기존에 사용되고 있는 항원보다 더 민감하게 항체와 반응하는 HCV 코아 항체인식 에피토프를 개발하였으며, 본발명에 따른 코아 항원성 에피토프는 HCV 감염 진단시약 및 HCV 생백신 제조에 효과적으로 이용될 수 있다.

본발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

<110> GenoFocus <120> Core Antigenic Epitope for Diagnosis of Herpatitis C Virus Antibody <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(53) <223> HCV core antigenic epitope(c22p) <220> <221> PEPTIDE <222> (38)..(53) <223> C1 <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(53) <223> C2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(38) <223> C3 <220> <221> PEPTIDE <222> (101)..(121) <223> C4 <220> <221> PEPTIDE <222> (38)..(75) <223> C5 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> C6 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(75) <223> C7 <220> <221> PEPTIDE <222> (38)..(121) <223> C8 <400> 1 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Ala Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for preparing pT7INC-core <400> 2 gattgggggc gacactccac c 21 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for preparing pT7INC-core <400> 3 ggaattcctt aagcggaggc tgggatggtc 30 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for preparing pT7INC-C1 <400> 4 cgggatccgc gcaggggccc caggttgggt gtg 33 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for preparing pT7INC-C1 <400> 5 ggaattcctt aggaagtctt cctagtcgcg c 31 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C2 <400> 6 cgggatccgg gcggtggtca gatcgttggt gga 33 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 ggaattcctt aggaagtctt cctagtcgcg c 31 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for preparing pT7INC-C3 <400> 8 gattgggggc gacactccac c 21 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C3 <400> 9 ggaattctta cggcaacagg taaactccac caac 34 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C4 <400> 10 cgggatcccc gtggctcccg gcctagttgg ggc 33 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C4 <400> 11 ggaattcctt aacccaagtt acgcgaccta c 31 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C5 <400> 12 cgggatccgc gcaggggccc caggttgggt gtg 33 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C5 <400> 13 ggaattctta ccaggcccta ccctcgggct ggcg 34 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C6 <400> 14 gattgggggc gacactccac c 21 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C6 <400> 15 ggaattctta cgggaacttg aacgtcctgt gggcg 35 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C7 <400> 16 gattgggggc gacactccac c 21 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C7 <400> 17 ggaattctta ccaggcccta ccctcgggct ggcg 34 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C8 <400> 18 cgggatccgc gcaggggccc caggttgggt gtg 33 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C8 <400> 19 ggaattcctt aacccaagtt acgcgaccta c 31 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C9 <400> 20 cgggatccca aaaccaaacg taacaccaa 29 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for prepring pT7INC-C9 <400> 21 ggaattcctt aggaagtctt cctagtcgcg c 31

Claims

C2, C3, C6 및 C7로 구성된 군에서 선택된 HCV 검출용 항원성 에피토프.
제1항의 에피토프를 코딩하는 올리고뉴클레오티드.
제1항의 에피토프 중 동일한 2개 이상의 에피토프가 융합되거나, 또는 서로 다른 2개 이상의 에피토프가 융합되어 있는 융합단백질.
제2항의 올리고뉴클레오티드와 분비유도 단백질의 유전자를 함유하는 세포표면 발현벡터.
제4항에 있어서, 분비유도 단백질은 빙핵 활성 단백질 또는 그 일부인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제5항에 있어서, 빙핵 활성 단백질은 슈도모나스 슈링게 유래인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제5항에 있어서, 빙핵 활성 단백질의 일부는 세포 부착부위 N말단과 세포 외막으로의 분비 및 표적기능을 갖는 부위 C말단을 코딩하는 DNA인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
제8항의 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항의 항원성 에피토프를 미생물 표면에 발현하는 방법.
제9항의 방법에 의해 제조되고 제1항의 항원성 에피토프가 표면에 발현되어 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
빙핵활성 단백질 또는 그 일부를 이용하여 제조한 미생물 표면 발현 벡터에 제2항의 올리고뉴클레오티드, HCV 코아 단백질의 유전자 또는 c22p를 코딩하는 DNA가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제11항에 있어서, pT7INC-core, pT7INC-c22p, pT7INC-C1, pT7INC-C2, pT7INC-C3, pT7INC-C4, pT7INC-C5, pT7INC-C6, pT7INC-C7 및 pT7INC-C8로 구성된 군에서 선택되는 발현벡터.
제11항 내지 제12항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
제13항의 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 항원 단백질 또는 그 단편을 미생물 세포표면에 발현하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 항체인식 활성이 높은 항원성 에피토프를 선별하는 방법 :

(a) 병원성 바이러스나 미생물의 항원 단백질 또는 그 일부를 코딩하는 DNA의 라이브러리를 제조하는 단계;

(b) 상기 라이브러리를 빙핵 활성 단백질 또는 그 일부를 코딩하는 DNA를 포함하는 세포표면 발현벡터에 삽입하여 발현벡터 라이브러리를 제작하는 단계;

(c) 상기 벡터 라이브러리로 미생물을 각각 형질전환하는 단계;

(d) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 항원 단백질 또는 그 일부를 세포표면에 발현시키는 단계; 및

(e) 상기 병원성 바이러스나 미생물에 감염된 환자의 혈청과 특이적으로 결합하는 항원성 에피토프를 검출하여 선택하는 단계.
제15항에 있어서, 병원성 바이러스나 미생물의 항원 단백질 또는 그 일부를 코딩하는 DNA는 HCV 코아 단백질의 유전자 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 빙핵 활성 단백질의 세포 부착부위 (N말단)와 세포 외막으로의 분비 및 표적기능을 갖는 부위 (C말단)을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터는 pT7INC인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 에피토프, 제3항의 융합단백질 또는 제10항의 미생물을 포함하는 HCV 검출용 키트.
제1항의 에피토프, 제3항의 융합단백질 또는 제10항의 미생물을 유효성분으로 함유하는 HCV 검출용 조성물.
서열 6과 서열 7, 서열 8과 서열 9, 서열 14와 15 및 서열 16과 서열 17로 구성된 군에서 선택된 프라이머 쌍.