KR20040085240A - 총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 이용한 연안환경 생물 모니터링 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 이용한 연안 환경 생물 모니터링 방법에 관한 것이다.

Description

총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 이용한 연안 환경 생물 모니터링 방법{Coastal environment monitoring method using cadmium concentration accumulated in internal organ of Asian periwinkle Littorina brevicula}
본 발명은 총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 이용한 연안 환경 생물 모니터링 방법에 관한 것이다.
1970년대에 들어 중화학 공업이 중점 추진되면서 많은 오염 물질들은 해양생태계의 변화를 유발하고 있다. 특히 카드뮴, 구리, 아연 등의 중금속은 극히 미량일지라도 일단 생체 내에 들어오면 유기 염화물이나 탄화수소 등의 기타 오염물질보다 상대적으로 긴 반감기를 갖고(Phillips and Segar, 1986), 모든 조직에 축적되어 생리적, 기능적, 형태적 또는 그 밖의 여러 장해를 일으킨다.
특정 해역에서 중금속 오염도를 측정하는 방법에는 해수, 해저 퇴적물 또는 그 해역에 서식하는 오염 지표종을 이용하는 방법 등이 있다.
해수를 이용하면 중금속의 오염 현황과 시간적 변화 추세를 파악할 수 있다. 그러나 해수 중의 중금속 농도는 10-12~10-15g/g (Goldberg et al., 1978) 으로 극히 낮아 분석이 어렵고, 시간에 따라 오염물질의 농도 변이도 심하다.
해수 퇴적물을 이용하는 경우도 환경오염의 역사와 지화학적으로 환경 변화를 잘 알릴 수 있지만, 생물활동이 활발한 곳에서는 난류와 생물교란 (bioturbation) 때문에 규칙적인 퇴적을 기대하기 어려워 효율적인 환경모니터링에 제한이 있다.
이와같이 해수나 해저 퇴적물을 이용한 중금속 측정으로는 생물 유용한 중금속 오염 물질에 대한 판단이 불가능하다.
따라서, 특정 해역의 중금속 오염을 반영할 수 있는 생물체를 이용한 생물감시법이 중요한 방법으로 대두되고 있다.
이러한 해양 오염 지표로 사용될 수 있는 생물체는 일생을 통해 활동범위가 한 지역에 국한되면서도 오염물질을 수백 내지 수백만 배 농축시키기 때문에 분석이 용이하고 또한 그들 조직 내에 존재하는 오염물질의 양을 측정하는 것이므로 환경 내 존재하는 오염물질의 총량 중 특히 생물 유용한 오염물질에 대한 판단을 가능하게 한다(phillips and Rainbow, 1988). 그리고 세계적으로 널리 분포되어 있는 생물종을 이용하면 오염물질의 지역간, 국가간 오염도 비교가 가능하며 오염에 대한 내성이 강하기 때문에 일반 생물이 폐사된 오염 해역에 대해서도 정보를 제공해 줄 수 있다는 장점을 지니고 있다(Goldberg, 1986). 전 세계적으로 널리 이용되고 있는 지표 생물로는 홍합과 굴 등이 있으며 이들을 이용한 해양 환경오염 연구는 1960년대 말부터 본격적으로 시작되었고(Butler et al., 1971), 가장 널리 수행되고 있는 홍합 감시 (Mussel Watch) 프로그램은 연안 해역에 대한 장기적인 정보를 제공하고 오염의 조기 경고 체제(early warning system) 역할을 목적으로 활발한 오염 감시활동을 펼치고 있다. 그러나 1970년대부터 생물 감시를 위한 종으로 관심을 끌고 있는 홍합이나 굴은 채집이 어렵고 오염이 심한 지역에서는 잘 서식하지 않는다는 단점이 있다. 이 밖에 다양한 복족류도 생물 감시활동에 이용되고 있으며 이 중 세계적으로 조간대에 널리 분포하고 있는 고둥은 카드뮴 등 여러 중금속을 축적하고 내성을 보인다는 여러 연구 결과가 보고된 바 있어 효과적인 오염 지표종으로 확인되고 있다(Bryan et al., 1983: Mason and Simkiss, 1983; Langston and Zhou, 1986; 1987).
최근에는 독성 중금속에 의해 유도되는 금속결합단백질(Metal-binding protein; MBP)이 발견됨에 따라 이를 중금속 오염에 대한 생화학적 지표로서 이용하고자 하는 관심이 높아지고 있다. 금속결합단백질 중에서 가장 대표적인 단백질은 금속티오네인(Metallothionein; MT)이다. 이 단백질은 말의 신장에서 가장 먼저 발견된 단백질로서 분자량이 6~7 kDa 정도로 작고, 시스테인 함량이 높으며, 방향족 아미노산을 적게 포함하고 있는 세포질 단백질이다. 그리고 열과 산에 안정하며 구리, 카드뮴, 납, 아연, 수은 등의 중금속에 큰 친화력을 보이고 중금속에 노출될 경우 유도된다는 특성을 지니고 있다(Frazier et al., 1985). 이들은 생체 필수금속의 항상성을 조절하며(Engel and Brouwer,1987), 금속단백질(metalloprotein)로 중금속을 공급하는 역할을 한다(Brouwer et al.,1986). 그러나 금속티오네인을 비롯한 금속결합단백질의 가장 중요한 역할로 부각되고 있는 것은 비필수금속군에 대한 무독화작용으로 세포 내의 다른 구조물에 결합하여 나타날 수 있는 기능 장해를 방지한다고 알려져 있다(Hamer, 1986). 해양 무척추 동물의 조직에서도 이러한 특징을 갖는 금속결합단백질이 많이 보고된 바 있고 생체 내 금속결합단백질 합성과 환경 내 중금속 농도가 높은 상관관계를 보인다고 증명되었다(Olafson et al.,1979; Carpene et al.,1983; Viarengo et al., 1985; Langston and Zhou, 1986; Pavicic et al., 1987; Mackay et al.,1990; Unger et al., 1991; Baudrmont et al.,1993). 로지자디가 처음으로 금속결합단백질을 오염 감시 계획에 적용하는 것을 제안한 이후(1981), 홍합(Viarengo et al., 1981b; Nolan and Duke, 1983)과 굴(Thompson and Cosson, 1984; Roesijadi et al., 1997)의 금속티오네인이 오염감시 계획에 적용 연구되었다. 생물체 내의 금속결합단백질을 오염감시 계획에 이용할 때 또 하나의 중요한 이점은 치사나 아치사 효과가 나타나기 이전에 환경의 중금속 오염의 지시자로서 사용할 수 있다는 점이다(Kramer, 1994). 이러한 특성은 해양 오염의 새로운 조기 경고 지표(early warning marker)로서 금속결합단백질의 활용 가능성을 더욱 뒷받침한다.
본 발명자는 이러한 금속결합단백질이 지표종 생물의 내장기관에 주로 분포할 것이라는 점에 착안하여, 연안환경의 중금속 오염 감시를 위한 지표종으로 총알고둥의 내장기관에 축적되어 있는 카드뮴의 농도를 이용하여 해양 환경을 모니터링하는 방법을 연구함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 우리나라의 삼면에 고루 분포하고, 채집이 용이하며, 체내에 중금속을 고농도로 축적하면서도 생존률이 높은 총알고둥을 이용하여 해양 환경 오염 모니터링 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 총알고둥을 실험실 내에서 카드뮴에 노출시켜, 기간별로 총알고둥내에 축적된 카드뮴의 농도를 나타낸 도이다.
도 2는 총알고둥을 실험실 내에서 카드뮴에 노출시켜, 농도별로 총알고둥내에 축적된 카드뮴의 농도를 나타낸 도이다.
도 3은 총알고둥을 채집한 온산만 해역을 나타낸 도이다.
도 4는 겔여과크로마토그래피에 의해 분배된 가용성분획에서 총알고둥의 카드뮴-결합단백질의 피크를 나타낸 도이다.
도 5는 MALDI-TOF MS로 측정한 총알고둥내 카드뮴-결합단백질의 분자량을 나타낸 도이다.
도 6은 산분해 후 총알고둥내 카드뮴-결합단백질의 염기 서열을 나타낸 도이다.
본 발명은 총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 이용한 연안 환경 생물 모니터링 방법을 제공한다.
총알고둥(Littorina brevicula)은 우리나라 삼면에 골고루 분포하고, 채집이 용이하며, 체내에 중금속을 고농도로 축적하면서도 생존율이 높은 복족류이다.
실험실 내 노출 실험 및 온산만 해수의 현장 노출 실험 수행 시, 총알고둥이 해수에 노출되는 시간이 길어질수록 총알고둥의 내장기관 내에 축적되는 카드뮴 농도가 증가한다. 또한, 해수에 오염 중금속의 노출농도가 증가할수록 총알고둥의 내장기관 내에 축적되는 카드뮴 농도가 증가한다.
따라서, 본 발명의 연안 환경 생물 모니터링 방법은 해수의 중금속 측정농도의 뚜렷한 지표가 될 수 있다.
또한, 총알고둥의 내장기관에서 카드뮴의 축적농도는 신장에서 가장 높게 나타난다.
총알고둥내 중금속에 의해 유도되는 금속결합단백질의 농도 또한 환경의 중금속 유입량에 대해 유의적으로 증가된다.
총알고둥의 내장기관 내에서 측정되는 카드뮴은 약 10 kDa크기의 카드뮴-결합단백질과 결합한 것으로 나타난다. 이 카드뮴-결합단백질은 아미노산 조성중 시스테인 함량이 21%이며, 방향족 아미노산 함량이 매우 낮고, 히스티딘이 없으며, 아미노산 서열분석은 Cys-XXX-Cys-XXX-Cys와 같은 전형적인 금속티오네인의 구조를 갖고 있다. 따라서, 총알고둥에서 카드뮴 노출에 의해 유도되는 카드뮴-결합단백질은 해양 무척추동물에서 중금속 무독화 기작에 관여하는 금속티오네인인 것으로 보인다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 총알고둥의 내장기관 내 카드뮴 축적 농도
총알고둥을 해수에 노출시키고, 노출 시간 및 노출 농도에 따라 내장기관 내에 축적되는 카드뮴의 농도를 알아보기 위하여 실험실 내 노출 실험 및 현장 실험을 시행하였다.
1. 실험실내 노출실험
1-1) 노출 시간에 따른 총알고둥의 내장기관 내 카드뮴 축적농도 측정
총알고둥은 청정지역인 안면도에서 채집하여, 해수가 들어있는 용기에 담아 10℃로 유지한 채 실험실까지 운반하였다. 채집된 개체들은 노출에 앞서 해수에서 24시간 청장시킨 후, 염도 34‰, 수온 10℃의 해수에서 일주일동안 적응시켰으며, 시간에 따른 축적률을 조사하기 위하여 100마리를 카드뮴 400㎍/L(CdCl2)에 90일 동안 노출시켰다.
대조군으로는 카드뮴을 첨가하지 않은 청정해수에 100마리를 노출하여 사용하였다.
카드뮴에 노출한 지 0,7,21,35,70 및 90일째에 대조군 및 실험군에서 총알고둥을 20마리씩 수거하였다. 총알고둥 내에 있는 소화기관 및 생식선, 아가미, 신장 등을 핀셋으로 분리하였다.
각각의 개체들을 5mM 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol)과 0.1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(Phenylmethylsulfonyl fluoride; PMSF)가 포함된 20mM 트리스-아세테이트 완충용액(Tris-acetate buffer, pH 8.1)으로 균질화(homogenization)하여 중금속 함량 분석을 위해 산분해(acid digestion)를 수행하였다. 균질화된 시료를 마이크로웨이브용 분해용기에 넣고, 65% 질산 5㎖를 넣은 후, 1시간 이상 실온에서 방치하여 이산화탄소를 날려보내고 Microwave digestion system(MDS-2000, CEM, USA)을 이용하여 분해하였다(Maccarthy and Ellis, 1991). 분해된 시료를 3차 증류수로 희석하여 원자흡광분석기(Atomic Absorption Spectroscopy; AAS, Perkin Elmer Analyst 100, USA)로 카드뮴의 농도를 측정하였다. 분석방법은 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology)에서 공인된 표준물질인 Standard Reference Material 1566a(oyster tissue)의 분석을 통해 확인하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와같이, 총알고둥을 카드뮴 400 ㎍/L에 노출하였을 때, 노출기간이 길어질수록 총알고둥 내 카드뮴 축적량은 점차 증가하여 70일 후에는 72㎍ Cd/g wet weight까지 증가하였다.
1-2) 노출 농도에 따른 총알고둥의 내장기관 내 카드뮴 축적농도 측정
노출 농도별 총알고둥 내 카드뮴 축적률을 조사하기 위하여, 총알고둥을 100개체씩 카드뮴 농도 4,40,400 ㎍/L에 66일 동안 노출시켰다. 각 수조의 해수는 일주일에 한번씩 교환하였으며 노출 후 10, 29, 50, 66일째 되었을 때, 20개체씩 꺼내어 상기 1-1)과 같은 방법으로 중금속 농도를 측정하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와같이, 노출농도가 증가할수록 그리고 노출기간이 증가할수록 총알고둥 내 카드뮴 축적률 또한 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있으며, 66일 이후에는 포화됨을 알 수 있다. 총알고둥의 경우 dry weight 1g당 640㎍ 이상의 카드뮴을 축적함을 알 수 있다.
1-3) 총알고둥의 내장기관에 따른 카드뮴 축적농도 측정
상기 1-2)에서 카드뮴 농도 40 ㎍/L에 66일 동안 노출시킨 총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 각 내장기관별로 측정하였다.
결과는 표 1에 나타내었다.
카드뮴(Cd)
소화기관 및 생식선 17.0%
아가미 23.4%
신장 41.3%
나머지 조직 18.3%
표 1에 나타난 바와 같이, 총알고둥의 내장기관 중 신장에서 카드뮴의 농도가 가장 높음을 알 수 있다.
2. 현장 노출실험(온산만 해수)
2-1) 해수와 총알고둥의 내장기관 내 카드뮴 축적농도 측정
온산만의 오염 하수 유입원인 대정천을 중심으로 정점간 거리가 약 1㎞인 11개 정점에서 해수를 채취하였고, 육상연안 정점에서 총알고둥(A~F)을 채집하였다(도 3).
해수는 미리 산으로 세척된 500㎖들이 고밀도 폴리에틸렌 병을 약 3m 길이 PVC막대에 플라스틱관(Tygon tubing)을 사용하여 매달아 약 1~2노트로 항해하는 동안 병 입구를 수면보다 20~30㎝ 정도 깊이 넣어 채취하였다(Boyle et al., 1981).
채집된 총알고둥은 24시간 청장시킨 후 분석 전까지 -70℃에서 냉동 보관하였다.
해수는 실험실로 옮겨 산으로 세척된 0.4㎛ Nuclepore filter로 여과한 후 시료 1ℓ당 증류된 6N 염산 4㎖를 가한 후 용기에 흡착된 금속들이 다시 용출되어 나오도록 기다리기 위해 최소 3일이 경과한 후 실시하였다.
중금속의 분리 농축은 브루랜드(Bruland)의 용매추출법을 변형시켜 수행하였으며 각 과정은 다음과 같다.
시료 100㎖를 미리 산으로 세척된 250㎖ 테플론 분액 깔대기에 넣고 1% 메틸오렌지(Methyl orange) 지시약 2방울을 첨가한 후 암모니아수를 용액의 색이 적색에서 주황색으로 변할 때까지 가하였다. 필요에 따라 염산을 사용하여 pH를 재조정하였다. 여기에 시트레이트 완충액(Citrate buffer) 2㎖와 APDC-DDTC(Ammonium Pyrrolidine Dithiocarbamate - Diethyl Dithiocarbamate) 혼합용액 2㎖를 넣고 약 30초 후 프레온(Freon) 10㎖를 가하고 2분 동안 진탕시킨 후 용액층이 분리되면 다시 30㎖ 테플론 바이알(Teflon vial)에 넣는다. 여기에 재증류한 진한 질산 100㎕를 넣고 가열판 위에서 120℃ 온도로 가열하여 모든 프레온과 산을 증발시켰다. 여기에 2% 질산 2㎖를 정확히 넣고 뚜껑을 닫은 후 1시간 동안 가열한 후 상온으로냉각시켜 고해상 ICP-MS(Fison Plasma Trace)로 분석하였다. 분석 방법은 캐나다 NRC-Canada(National Research Council of Canada)에서 공인된 표준물질 분석을 통해 확인하였다. 총알고둥의 중금속 분석은 상기 1-1)의 방법과 동일하게 수행하였다.
각 정점별로 해수에서 측정한 중금속 농도는 표 2에 나타내었고, 각 육상연안 정점에서 채집한 총알고둥의 내장기관으로부터 측정한 중금속의 농도는 표 3에 나타내었다.
(단위 : ㎍/L)
위치 카드뮴(Cd) 구리(Cu) 아연(Zn)
1 0.072 0.50 3.00
2 1.705 24.55 35.12
3 0.037 0.24 3.11
4 0.059 0.22 3.09
5 0.311 0.40 10.35
6 0.026 0.20 2.16
7 0.015 0.12 0.52
8 0.010 0.08 0.21
9 0.013 0.10 0.41
10 0.009 0.0.09 0.23
11(대조구) 0.009 0.12 0.32
표 2에 나타난 바와 같이, 온산만의 대정천 유입구인 정점 2에서 가장 높은 중금속 농도를 보여주었다. 이 농도는 대조구인 정점 11의 농도 보다 카드뮴은 189배, 구리는 205배, 아연은 110배나 높다. 또한 대정천 유입구에서 외해로 갈수록 중금속 농도가 감소하여, 정점 2,3,4,5의 해수내 중금속 농도는 정점 8,9,10의 그것에 비해 높았다. 즉 대정천을 통해 높은 농도의 카드뮴, 구리, 아연을 함유한 담수가 해안으로 유입되어 해수와 혼합되면서 점차로 희석되어 가는 과정을 관찰할 수 있다.
(단위 : ㎍/L dry weight)
위치 카드뮴(Cd) 구리(Cu) 아연(Zn)
A 3.87 238/9 86.2
B 11.08 334.5 426.0
C 0.92 362.5 412.2
D 2.35 212.5 499.2
E 1.23 99.3 61.2
F 1.17 74.9 53.1
표 3에 나타난 바와 같이, 6개 정점(A~F)에서 채집한 총알고둥 내 중금속의 농도는 대정천과 가장 가까운 정점 B에서 채집한 개체들 보다 중금속 함량이 높다. 정점 B에서 채집한 개체 내 농도는 정점 F에서 채집한 개체 내 농도보다 카드뮴은 8.5배, 구리는 4.8배, 아연은 9.4배 높은 것으로 나타났다. 특히 카드뮴의 경우 해수내 카드뮴 농도와 개체 내 농도간의 높은 상관관계를 보이는 것을 관찰할 수 있다.
2-2) 총알고둥의 내장기관에 따른 카드뮴 축적농도 측정
상기 2-1)에 의해서 얻은 총알고둥 중에서, 가장 오염된 곳인 정점 B에서 채집한 총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 각 내장기관별로 측정하였다.
결과는 표 4에 나타내었다.
카드뮴(Cd)
소화기관 및 생식선 14.8%
아가미 15.6%
신장 55.2%
나머니 조직 14.4%
표 4에 나타난 바와 같이, 총알고둥의 내장기관 중 신장에서 카드뮴의 농도가 가장 높음을 알 수 있다.
따라서, 실험실내와 현장실험에서 노출시킨 총알고둥 모두 신장에서 각각 41.3 %, 55.2 %의 카드뮴이 축적되어 있으므로, 생물 유용한 지표종임을 알 수 있다.
실시예 2 : 카드뮴-결합단백질의 양상
총알고둥 내에서 카드뮴과 결합하여 무독화 기작을 수행하는 카드뮴-결합단백질(Cd-binding protein; Cd-BP)의 양상을 노출 농도별 및 노출 기간별로 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
1. 노출 시간에 따른 총알고둥 금속결합단백질 내 카드뮴 축적률 실험
0,7,21,35,70,90일 동안 카드뮴 400 ㎍/L에 노출한 총알고둥을 20개체씩 수거하여 상기 실시예 1의 1-1)과 동일한 방법으로 준비한 균질화액을 4℃에서 100,000×g의 속도로 90분간 원심분리하였다. 원심분리 후 얻어진 상등액을 가용성분획(soluble fraction)이라 명하고, 침전물을 불용성분획(insoluble fraction)이라 명하였다. 이 가용성분획을 Sephacryl S-100 HR column(3×33㎝, AmershamPharmacia Biotech, Sweden)을 사용하여 겔여과크로마토그래피(Gel-filtration chromatography)를 수행하였다. 용출완충액(elution buffer)은 5mM 2-머캅토에탄올이 포함된 20mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 8.1)을 사용하였으며, 유속은 0.8㎖/min으로 유지하였다. 각 분획은 3㎖씩 모아 산 분해 과정 없이 직접 원자흡광분석으로 중금속 함량을 측정하였고, 280㎚에서 흡광도를 측정하였다. 교정표준 (Calibration standard)으로는 소혈청알부민(bovine serum albumin) 66kDa, 알파-키모트립신(α-chymotrypsin) 25kDa, 말 신장 금속티오네인(horse kidney metallothionein) 6.5kDa, 비타민 B121.35kDa를 사용하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 카드뮴에 노출한 후 7,35,70일째가 될수록 이 하나의 단백질 피크는 커지는 것으로 나타나 많은 양의 카드뮴이 체내로 유입될수록 이의 무독화를 위하여 체내에서 유도되는 것으로 생각된다.
2. 카드뮴-결합단백질의 아미노산 조성 및 배열
총알고둥에서 카드뮴에 대한 무독화 기작으로 유도되는 카드뮴-결합단백질을 동정하여 분자 생물학적 탐침을 위한 기틀을 마련하고자 이 단백질의 아미노산 조성 분석 및 아미노산 서열 분석을 다음과 같이 수행하였다.
2-1) 카드뮴-결합단백질의 아미노산 조성
상기 실시예 2의 1에서 얻은 겔여과크로마토그래피의 용출 분획 중 카드뮴을 포함하는 피크를 모아 DEAE-sepharose(1.5×3cm)에 로딩하였다. 1.5 ㎖/min의 속도로, 25㎖의 20mM 트리스-염산액(pH 8.0)으로부터 25㎖의 200mM 트리스-염산액(2mM 2-머캅토에탄올을 포함, pH 8.0)까지 직선구배용출법(linear gradient elution)으로 용출하였다. 0.8㎖ 씩 분획을 받은 후 카드뮴 농도와 흡광도(254㎚, 280㎚)를 측정하였다.
DEAE-sepharose에서 카드뮴을 포함하는 피크는 초여과(ultrafiltration , 3kDa cut-off)하여 농축시킨 후, Superose 12로 팩킹된 겔여과크로마토그래피 (1×32㎝)로 더 정제하였다. 20 mM 트리스-염산액, 2mM 2-머캅토에탄올(pH 8.0)을 0.2㎖/min의 속도로 흘려주었으며, 0.5㎖ 분획들을 모아 카드뮴 농도를 측정하였다. Superose 12의 카드뮴을 포함하는 분획을 모아 처음 부피의 1/5(v/v)까지 농축 (3kDa cut off)한 후, μBondapak C18 reverse-phase column(0.39×30 cm, 10-μm particle size, 125- pore size)을 사용해 HPLC system으로 1㎖씩 분획화 하였다. 1.0 ㎖/min의 속도로 1시간 동안, 0~100%의 직선기울기용매 B(linear gradient solvent B; 60% 아세토니트릴을 포함하는 20mM 트리스-염산액, pH 8.0)를 흘려주었으며, 기울기는 용매 A(20mM 트리스-염산액, pH 8.0)를 사용하여 형성하였다.
정제된 단백질의 일부는 초여과(Amicon, YM 3, 3kDa cut off)하여 염을 제거하였다. 이 시료를 과산화(peroxidization)한 후 염산으로 분해하여 아미노산 조성 분석을 하였다. 페닐이소티오시나틸 유도체(phenylisothiocynatyl derivative)들을 검출하는 데 사용한 컬럼은 Eclipse WDB C18 column(Hewlett-Packard)이며, 역상HPLC(Hewlett-Packard 1100)로 분석하였다.
결과는 도 5 및 표 5에 나타내었다.
도 5 및 표 5에 나타난 바와 같이, 총알고둥 내에 있는 카드뮴-결합단백질의 분자량은 9.8kDa이며, 카드뮴-결합단백질의 아미노산 조성은 시스테인 함량이 21%이며, 방향족 아미노산 함량이 매우 낮고, 히스티딘이 없는 것으로 보인다. 즉 총알고둥에서 카드뮴 노출에 의해 유도되는 카드뮴-결합단백질은 해양 무척추동물에서 중금속 무독화 기작에 관여하는 금속티오네인인 것으로 사료된다.
2-2) 카드뮴-결합단백질의 아미노산 서열 분석
카드뮴-결합단백질의 카르복시기 말단의 아미노산 서열 분석을 위하여 카르복시펩티다제-Y(Carboxypeptidase-Y; CPY) 20p㏖을 0.5M 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT)로 환원시킨 정제된 단백질 시료 100pmol과 반응시킨 후 그 중 1㎕를 매트릭스용액(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; CHC) 4㎕와 혼합하였다.
5,10,20,40,60,90분 동안 반응시킨 후 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(Voyager DE-STR, PE Biosystems, USA)에서 질량분석을 하였다. 추출전압(extraction voltage)은 20㎸ 였으며, 질소레이저(337㎚)로 장착하였다.
매트릭스용액은 0.1% TFA를 이용하여 50% 아세토니트릴(v/v)을 준비하여 상기의 방법대로 만들었다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 총알고둥 내에 있는 카드뮴-결합단백질은 Cys-XXX-Cys-XXX-Cys와 같은 전형적인 금속티오네인의 구조를 갖는 것을 볼 수 있다.
본 발명의 연안 환경 생물 모니터링 방법은 총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 이용하므로 연안 환경의 중금속 오염 감시에 효율적이다.

Claims (2)

  1. 총알고둥의 내장기관에 축적된 카드뮴 농도를 이용한 연안 환경 생물 모니터링 방법
  2. 제 1항에 있어서, 내장기관은 신장인 것을 특징으로 하는 연안 환경 생물 모니터링 방법
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KR100630973B1 (ko) * 2004-10-25 2006-10-02 삼성전자주식회사 디스플레이장치

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