KR20040079393A - Rheumatoid arthritis treating agent having (-)-epigallocatechin gallate as active ingredient - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 녹차의 폴리페놀 추출물질의 일종인 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)의 류마티스 관절염 치료효과에 관한 것이다.The present invention relates to the therapeutic effect of rheumatoid arthritis of (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), a kind of polyphenol extract of green tea.
녹차는 B.C.3000년경부터 중국에서 즐기던 음료이다. 녹차는 낮은 온도에서 우려낸 것으로 카페인 함량이 낮고 여러 치료효과를 가진다고 알려져 각광을 받고 있다. 사실 녹차는 단순히 위를 안정화시키는 효과를 가진 음료수라고 생각되어져 왔으나 최근에는 여러 가지 건강문제와 관련하여 연구가 진행되고 있다.Green tea has been enjoyed in China since B.C.3000. Green tea has been spotlighted at low temperatures because it is known for its low caffeine content and many therapeutic effects. In fact, green tea has been thought to be simply a drink with a stabilizing effect on the stomach, but recently, research is being conducted on various health problems.
녹차는 항산화성이 있는 폴리페놀이라는 물질이 있는데 그 성분으로는 에피카테킨류와 에피갈로카테킨 3-갈레이트가 있는데 이러한 구성성분은 노화 및 항암과 성인병에 효과적인 성분이다. 폴리페놀은 항암성분으로써 암세포에 영향을 끼쳐 그 세포를 사멸시키고 암세포의 증식을 막는 것으로 알려져 있다. 한편 치매는 뇌에 베타-아밀로이드 펩타이드 단백질이 침착함으로써 신경 세포에 독성을 유발하는데 녹차의 성분은 이러한 베타-아밀로이드의 독성을 강하게 억제함으로써 치매를 억제하고 있다.Green tea has an antioxidant called polyphenol, which contains epicatechins and epigallocatechin 3-gallate, which are effective for aging, anti-cancer and adult diseases. Polyphenols are known as anticancer compounds that affect cancer cells, kill them and prevent the growth of cancer cells. On the other hand, dementia induces toxicity to nerve cells by depositing beta-amyloid peptide protein in the brain, and green tea component inhibits dementia by strongly inhibiting the toxicity of beta-amyloid.
류마티스 질환은 면역기능의 조절 실패로 인해 관절을 포함한 근골격계가 파괴되는 만성질환이다. 류마티스 관절염의 발병기전은 밝혀졌지만 그 원인은 아직 밝혀지지 않고 있다. 발병기전은 외부에서 침입한 세균이나 바이러스와 싸우는 우리 몸의 백혈구가 세균과 체내의 정상세포를 구분하지 못하고 정상적인 우리 몸, 특히 관절을 공격하여 신체조직을 파괴하는 것이다. 이러한 질환을 자가 면역질환이라고 하는데(Autoimmune disease.N Engl J Med.2000;345:340-50, Molecular mimicry and autoimmunity.N Engl J Med. 1999;341:2068-74) 여러 가지 자가면역 질환 중에서 관절에 주로 병을 일으키는 질환을 류마티스 관절염이라고 한다(Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis.N Engl J Med. 2001;344:907-16, Rheumatic Arthritis.N Engl J Med. 1997;337:505-506). 이 병의 원인으로 유전적인 요인과 감염, 호르몬의 이상 등이 추정되고 특히 특이한 체질의 사람에게 특정 바이러스나 박테리아가 감염되어 병을 유발한다는 가설에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(The role of antibodies in mouse models ofrheumatoid arthritis, and relevance to human disease.Adv Immunol.2004;82:217-48, Toll-like receptors direct antimicrobial immune response and driving arthritis?Curr Rheumatoid Rep.2003;5:407-8).Rheumatoid disease is a chronic disease in which the musculoskeletal system, including joints, is destroyed by failure to regulate immune function. The pathogenesis of rheumatoid arthritis is known, but the cause is not yet known. The pathogenesis is that the white blood cells of the body fighting bacteria or viruses invading the outside cannot distinguish between bacteria and normal cells in the body, and attack the normal body, especially the joints, to destroy body tissues. These diseases are called autoimmune diseases (Autoimmune disease. N Engl J Med. 2000; 345: 340-50, Molecular mimicry and autoimmunity. N Engl J Med . 1999; 341: 2068-74). Diseases that primarily cause disease are called cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis.N Engl J Med . 2001; 344: 907-16, Rheumatic Arthritis.N Engl J Med . 1997; 337: 505-506 . The causes of the disease are genetic factors, infections, hormone abnormalities, etc. are estimated, and research on the hypothesis that certain viruses or bacteria can cause disease in people with unusual constitutions is being actively conducted. mouse models of rheumatoid arthritis, and relevance to human disease.Adv Immunol. 2004; 82: 217-48, Toll-like receptors direct antimicrobial immune response and driving arthritis? Curr Rheumatoid Rep. 2003; 5: 407-8).
이 질환은 지속적인 인구의 증가와 고령화에 따라 유병률이 계속 증가하여 인구의 10∼20% 정도가 류마티스 질환을 가지고 있을 정도로 사회 및 경제에 미치는 영향이 점차 커지고 있다. 미국의 경우 류마티스 치료에 필요한 약물투여 및 합병증에 따른 직접비용이 약 150억 달러에 이르며 그 규모는 계속 증가하고 있다. 또한 환자의 1/3 이상은 작업능력이 상실되고, 가정에서의 역할 수행에 장애를 겪으며 경제활동에 종사하지 못해서 생기는 간접비용은 직접비용의 3배에 이르고 있어 류마티스로 인한 사회, 경제적 손실은 엄청나다고 할 수 있다. 따라서 류마티스의 높은 유병률, 유병기간, 경제적 손실 등을 고려할 때 류마티스의 원인을 규명하고 치료하기 위한 연구 개발이 절실히 요구되고 있다.The prevalence continues to increase as the population continues to grow and age, with 10-20% of the population having rheumatoid disease increasing its social and economic impact. In the United States, the direct cost of drug administration and complications needed to treat rheumatism has reached approximately $ 15 billion and continues to grow. In addition, more than one-third of patients suffer from inability to play their roles at home, and indirect costs due to their inability to engage in economic activities are three times the direct costs, so the social and economic losses from rheumatism are enormous. It can be said. Therefore, considering the high prevalence, duration, and economic loss of rheumatism, research and development are urgently needed to identify and treat the causes of rheumatic diseases.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 상기와 같은 류마티스 관절염을 효과적으로 치료하기 위한 의약품으로 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 유효성분으로 하는 새로운 류마티스 관절염 치료제를 개발하고자 한다.The technical problem to be achieved in the present invention is to develop a new rheumatoid arthritis therapeutic agent as an active ingredient epigallocatechin gallate (EGCG) as a drug for effectively treating the rheumatoid arthritis as described above.
도 1은 콜라겐유도관절염군(collagen induced arthritis) 조직에서 병변부위인 관절을 대상으로 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 결과를 나타낸 사진이다. 도 1A는 정상 대조군, 도 1B는 콜라겐으로 관절염을 유도한 후 염색을 나타낸 조직의 사진이고 도 1C는 EGCG를 25㎎/㎏를 투여한 군의 조직을 나타낸 사진이며, 도 1D는 EGCG를 50㎎/㎏으로 투여한 군의 조직을 나타낸 사진이다.1 is a photograph showing the results of staining with hematoxylin and eosin in the joints of the lesion in the collagen induced arthritis tissue (collagen induced arthritis) tissue. Figure 1A is a normal control, Figure 1B is a picture of the tissue showing staining after inducing arthritis with collagen and Figure 1C is a picture showing the tissue of the group receiving 25mg / kg EGCG, Figure 1D is 50mg EGCG The photograph showing the tissue of the group administered at / kg.
도 2는 정상 대조군, 콜라겐으로 관절염을 유도한 후 PBS 투여군, 콜라겐으로 관절염을 유도한 후 EGCG 25㎎/㎏ 투여군 이나 EGCG 50㎎/㎏ 투여군 들에서 체액성 면역반응의 지표로써 IgG1과 IgG2a의 특이적인 생성 관찰 결과값을 표시한 그래프이다. 도 2a는 4개 시험군의 IgG1과 IgG2a의 생성량을 나타낸 그래프이고 도 2b는 4개 시험군의 항 CⅡ IgG1의 생성량의 측정을 위한 옵티컬 덴시티를 측정치이고 도 2c는 4개 시험군의 항 CⅡ IgG2a의 생성량을 측정을 위한 옵티컬 덴시티의측정치를 나타낸 그래프이다.Figure 2 shows the specificity of IgG1 and IgG2a as an indicator of humoral immune response in the normal control group, induction of arthritis with collagen, PBS administration group, arthritis with collagen and EGCG 25mg / kg or EGCG 50mg / kg administration This graph shows the results of typical generation observations. Figure 2a is a graph showing the amount of IgG1 and IgG2a production of the four test groups, Figure 2b is an optical density for measuring the amount of anti-CII IgG1 production of the four test groups and Figure 2c is an anti-CII of the four test groups It is a graph showing the measurement of optical density for measuring the amount of IgG2a production.
도 3은 세포성 면역반응을 나타내는 지표로써 상기 4개의 시험군에 사이토카인의 분비를 관찰하여 그래프로써 나타낸 것이다. 각각의 시험군은 무자극군의 비장세포(Nil), 제2형 콜라겐(CⅡ)으로 자극한 군의 비장세포, 제2형 콜라겐으로 자극 후 100μM의 EGCG를 투여한 군의 비장세포에서 사이토카인의 분비량을 나타낸 것이다.Figure 3 is a graphical representation of the observation of cytokine secretion in the four test groups as an indicator of cellular immune response. Each test group was cytokine in splenocytes of the non-irritating group (Nil), splenocytes stimulated with type 2 collagen (CII) and splenocytes of 100 μM EGCG after stimulation with type 2 collagen. It shows the amount of secretion.
도 3A는 IL-17의 분비량을 나타낸 그래프이고 도 3B는 IL-10의 분비량을 나타낸 그래프이며 도 3C는 IFN-γ의 분비량을 나타낸 그래프이고 도 3D는 TNF-α의 분비량을 나타낸 그래프이다.Figure 3A is a graph showing the secretion amount of IL-17, Figure 3B is a graph showing the secretion amount of IL-10, Figure 3C is a graph showing the secretion amount of IFN-γ and Figure 3D is a graph showing the secretion amount of TNF-α.
도 4는 콜라겐 유도 관절염 조직에 PBS만을 투여한 군, 콜라겐 유도 관절염 마우스에 EGCG 25㎎/㎏을 투여한 군, 콜라겐 유도 관절염 마우스에 EGCG 50㎎/㎏을 투여한 군에서 T 세포 증식반응을 나타낸 그래프이다. 각각의 시험군은 무자극군(Nil)의 림프절 또는 비장세포, 제2형 콜라겐(CⅡ)으로 자극한 군의 림프절 또는 비장세포, 제2형 콜라겐으로 자극 후 10μM의 EGCG를 투여한 군의 림프절 또는 비장세포, 제2형 콜라겐으로 자극 후 50μM의 EGCG를 투여한 군의 림프절 또는 비장세포, 제2형 콜라겐으로 자극 후 100μM의 EGCG를 투여한 군의 림프절 또는 비장세포의 T 세포의 증식량을 나타낸 것이다.Figure 4 shows the T cell proliferation response in the group administered with PBS only to collagen-induced arthritis tissue, the group administered with EGCG 25mg / kg to collagen-induced arthritis mice, the group administered with EGCG 50mg / kg to collagen-induced arthritis mice It is a graph. Each test group was lymph nodes or splenocytes of non-irritating group (Nil), lymph nodes or splenocytes of group 2 stimulated with collagen (CII), lymph nodes of group treated with 10 μM EGCG after stimulation with type 2 collagen. Or lymph nodes or splenocytes of a group treated with 50 μM of EGCG after stimulation with splenocytes, type 2 collagen, or lymph nodes or spleen cells of a group administered with 100 μM of EGCG after stimulation with type 2 collagen. It is shown.
도 5는 콜라겐유도관절염군에 PBS만을 투여한 군, 콜라겐유도관절염군에 EGCG 25㎎/㎏을 투여한 군, 콜라겐유도관절염군에 EGCG 50㎎/㎏을 투여한 군에서 T 세포 분열유발인자에 대한 T 세포 증식반응을 나타낸 그래프이다.5 is a T cell division-causing factor in the group administered with PBS alone to the collagen-induced arthritis group, the EGCG 25mg / kg group to the collagen-induced arthritis group, and the EGCG 50mg / kg to the collagen-induced arthritis group. It is a graph showing the T cell proliferation response.
본 발명은 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 유효성분으로 하는 류마티스 관절염 치료제에 있어서, 상기 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트의 투여량이 1∼100㎎/㎏인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 치료제를 제공하는 것이다.The present invention provides a therapeutic agent for rheumatoid arthritis using (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) as an active ingredient, wherein the dosage of the (-)-epigallocatechin gallate is 1 to 100 mg / kg. It is to provide a therapeutic agent for rheumatoid arthritis.
한편 상기 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)는 약제학적 허용 담체를 더 포함할 수 있다. 이때 약제학적 허용 담체가 생리식염수인 것을 특징으로 한다.Meanwhile, the epigallocatechin gallate (EGCG) may further include a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier is characterized in that the saline solution.
또한 상기 에피갈로카테킨 갈레이트를 PLGA(Poly/lactide/glycolide)고분자에 함침시켜 EGCG-PLGA 복합체로 투여되는 류마티스 관절염 치료제를 특징으로 한다.In addition, the epigallocatechin gallate is characterized in that it is impregnated with PLGA (Poly / lactide / glycolide) polymer to be treated with rheumatoid arthritis, which is administered as EGCG-PLGA complex.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 류마티스 관절염 치료효과는 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)가 유효성분으로 작용하는 것으로 한다.The therapeutic effect of rheumatoid arthritis of the present invention is that (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) acts as an active ingredient.
류마티스 관절염의 원인으로 가장 잘 알려진 항원중의 하나로는 관절내 연골의 구성성분 중 하나인 제2형 콜라겐(CII)이다. 최근 이 콜라겐 항원에 대한 비정상적인 자가 면역반응이 실험 동물 뿐만 아니라 인체 관절염 환자에서도 일어나는 현상이 보고되어 있다. 류마티스는 원인 항원으로 한 번 자극을 받게 되면 지속적으로 자가 면역 시스템이 작동하고, 반복적으로 항원에 자극을 받게 되면 질병이 발생되는 것으로 알려져 있다.One of the best known antigens for rheumatoid arthritis is collagen type 2 (CII), one of the components of intraarticular cartilage. Recently, abnormal autoimmune responses to this collagen antigen have been reported to occur in human arthritis patients as well as experimental animals. Rheumatoids are known to cause a continuous autoimmune system once stimulated with the causative antigen and to cause disease when repeatedly stimulated with the antigen.
관절에는 연골이라고 하는 부분이 있는데 이 부분에는 5∼10% 아그리캔(aggrecan)이라는 큰 프로테오글리칸(proteoglycan)과 1% 미만의 다른 프로테오글리칸 그리고 10∼15%의 콜라겐으로 구성되어 있다. 연골에 존재하는 콜라겐 중에는 제 2형 콜라겐이 전체 콜라겐 중에서 90% 정도를 차지하는 것으로 알려져 있다.The joints are called cartilage, which consists of a large proteoglycan called 5-10% aggrecan, less than 1% other proteoglycans, and 10-15% collagen. Among collagen present in cartilage, type 2 collagen is known to account for about 90% of all collagen.
이러한 제2형 콜라겐의 구조는 300nm의 트리플 헬릭스(triple helix) 구조와 67 nm의 반복 밴딩 패턴(repeated banding pattern)으로 알려져 있다. 자가조직 연골에 반응하는 콜라겐이 자가면역에 의한 관절염에 주요한 타겟으로 제공되어진다는 보고가 있다.The type 2 collagen is known as a triple helix structure of 300 nm and a repeated banding pattern of 67 nm. Collagen in response to autologous cartilage has been reported to be a major target for autoimmune arthritis.
제2형 콜라겐(TypeⅡ collagen, CII)을 일부 설치류와 원숭이에 피하주사(immunization)함으로써 유도되는 콜라겐 유도 관절염 동물 모델(collagen induced arthritis)은 관절의 병변이 류마티스 관절염에서 관찰되는 병변과 매우 흡사하여 사람의 류마티스 관절염에 대한 실험동물 모델로써 사용되고 있다.Collagen-induced arthritis induced by subcutaneous injection of type II collagen (CII) into some rodents and monkeys is very similar to the lesions observed in rheumatoid arthritis in humans. It has been used as an experimental animal model for rheumatoid arthritis.
CII주사 전에 CD4+T 세포 및 T 세포 수용체에 대한 단일 클론 항체를 전처치하는 경우 관절염이 억제되며, CII에 반응하는 T 세포주(CII-reactive T-cell line)를 정상 마우스에 양자 트랜스퍼(adoptive transfer)시 관절염 유도가 가능하다는 예가 보고되면서 자가항원으로 CII와 T 세포 모두 관절염 발생에 매우 중요하다는 결과가 보고되어 있다.Pretreatment of monoclonal antibodies against CD4 + T cells and T cell receptors prior to CII injection inhibits arthritis and transfers CII-reactive T-cell lines to normal mice in adolescent mice. In the case of arthritis induction, it is reported that both CII and T cells as autoantigens are very important for the development of arthritis.
류마티스 관절염은 위의 사항에서도 알 수 있듯이 자가항원에 반응하는 세포의 면역반응을 조절하는 것이 병을 완화시키고 치료하는데 중요하다고 알려져 있다. 그 중에서도 관절염 실험동물모델인 CIA에서 알려져 있듯이 자가항원에 반응하는 CD4+T 세포의 면역반응을 조절하는 것은 질환을 극복하는 중요한 표적이라고 할 수 있다. 관절염 질환연구에서는 아직 알려져 있지 않지만, 정상인 혈청의 면역세포에서 EGCG가 반응할 때 직접적으로 CD4+T 세포에 결합하여 반응성을 조절한다는 보고가 있었다(Epigallocatechin gallate, the main component of tea polyphenol, binds to CD4 and inteferes with gp120 binding.J Allergy Clin Immunol2003; 112: 951-7).Rheumatoid arthritis is known to control the immune response of cells that respond to autoantigens, as can be seen in the above is known to be important in alleviating and treating the disease. Among them, controlling the immune response of CD4 + T cells in response to autoantigens is known as an important target for overcoming the disease, as is known from CIA, an arthritis experimental animal model. Arthritis disease studies are not yet known, but it has been reported that when EGCG reacts in normal serum immune cells, it directly binds to CD4 + T cells and regulates its reactivity (Epigallocatechin gallate, the main component of tea polyphenol, binds to CD4). and inteferes with gp120 binding.J Allergy Clin Immunol 2003; 112: 951-7).
EGCG는 류마티스 관절염 질환모델에서 관절염을 억제시킨다는 사실은 아직까지 알려지지 않았으며, 1999년 Hasan Mukhtar group에서 녹차의 전체 폴리페놀 프랙션이 관절염 질환모델에서 질환억제효과가 있다는 보고가 유일한 연구결과이다.그러나 결과상에서 콜라겐유도관절염모델의 특성상 나타나는 항원에 대한 반응성 조사는 전혀 확인되지 않은 연구내용이었다(Prevention of collagen-induced arthritis in mice by a polyphenolic fraction from green tea.Proc. Natl. Acad. Sci. USA1999; 96: 4524-29).The fact that EGCG suppresses arthritis in rheumatoid arthritis disease models is not known yet.In 1999, the Hasan Mukhtar group reported that the total polyphenol fraction of green tea had a disease suppression effect in arthritis disease models. As a result, the investigation of reactivity with antigens due to the characteristics of the collagen-induced arthritis model has not been confirmed at all (Prevention of collagen-induced arthritis in mice by a polyphenolic fraction from green tea.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96: 4524-29).
본 발명에서는 녹차의 폴리페놀 프랙션 중 EGCG를 대상으로 연구하여 EGCG만의 효과 특이성을 구별하였으며 연구방법과 결과의 해석에 있어서도 항원에 특이적인 세포성 면역반응과 체액성 면역반응이 조절되는지 연구하여 보다 질환 치료에 접근할 수 있는 연구결과를 획득하였다. 이 외에 전신적 자가면역질환인 류마티스 관절염과는 다르지만 관절내에 골세포의 파괴가 관찰되는 질환으로 골관절염(Osteoarthritis, OA)환자에서 연골세포(chondrocyte)를 분리하여 in vitro에서 EGCG를 처리하여 염증성사이토카인 IL-1b에 의해 유도되는 MAPK(mitogen activated protein kinase) 활성을 억제시키며(Epigallocatechin-3-gallate selectively inhibits interleukin-1beta-induced activation of mitogen activated protein kinase subgroup c-Jun N-terminal kinase in human osteoarthritis chondrocytes.J Orthop Res.2003 Jan;21(1):102-9), Nitric Oxide의 생성을 NF-kB 신호전달경로에 의존적으로 억제시킨다고 보고되었으며(Epigallocatechin-3-gallate inhibits interleukin-1beta-induced expression of nitric oxide synthase and production of nitric oxide in human chondrocytes: suppression of nuclear factor kappaB activation by degradationof the inhibitor of nuclear factor kappaB.Arthritis Rheum. 2002 Aug;46(8):2079-86) 마지막으로 COX2의 발현 또한 억제시키는 것으로 밝혀졌다(Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate inhibits the IL-1 beta-induced activity and expression of cyclooxygenase-2 and nitric oxide synthase-2 in human chondrocytes.Free Radic Biol Med. 2002 Oct 15;33(8):1097-105). 이러한 연구들조차 최근 1∼2년 사이에 이루어진 결과로 류마티스 관절염 질환에서 직접적인 관절염 치료효과에 대한 규명은 전혀 알려져 있지 않은 상황이다.In the present invention, EGCG among the polyphenol fractions of green tea was studied to distinguish the specificity of EGCG effects, and in the analysis of the method and the results, it was investigated whether the cellular immune response and the humoral immune response specific for antigen are regulated. The results of the study were accessible to approach the treatment of diseases. In addition to the rheumatoid arthritis, which is a systemic autoimmune disease, osteoarthritis is observed in the joints. Chondrocytes are isolated from osteoarthritis (OA) and treated with EGCG in vitro to treat inflammatory cytokine IL. sikimyeo inhibit (mitogen activated protein kinase) MAPK activity induced by -1b (Epigallocatechin-3-gallate selectively inhibits interleukin-1beta-induced activation of mitogen activated protein kinase subgroup c-Jun N-terminal kinase in human osteoarthritis chondrocytes. J Orthop Res. 2003 Jan; 21 (1): 102-9), reported to inhibit nitric oxide production dependently on NF-kB signaling pathway (Epigallocatechin-3-gallate inhibits interleukin-1beta-induced expression of nitric oxide) synthase and production of nitric oxide in human chondrocytes: suppression of nuclear factor kappa B activation by degradation of the inhibitor of nuclear factor kappa B. Arthritis Rheum . 2002 Aug; 46 (8): 2079-86) Finally, Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate inhibits the IL-1 beta-induced activity and expression of cyclooxygenase-2 and nitric oxide synthase-2 in human chondrocytes.Free Radic Biol Med . 2002 Oct 15; 33 (8): 1097-105). Even these studies have been conducted in the last year or two, and there is no known evidence of direct arthritis treatment in rheumatoid arthritis.
발명자들은 관절염질환모델에서 면역관용을 유도하기 위하여 항원을 정맥 내 혹은 코점막을 통해 투여하여 관용유도를 시도해 보았으나 생체내 전달의 효과가 뚜렷하지 않고 부작용이 뒤따라 인체에 적용되기에는 어려움이 있다. 따라서 면역관용 유도를 성공적으로 야기시키기 위해서는 항원의 성분을 변화시키지 않은 채 서서히 효과적으로 생체내에 침투시키기 위한 새로운 생체물질 전달 시스템 (delivery system)을 개발하였다.The inventors attempted to induce tolerance by administering antigen through intravenous or nasal mucosa in order to induce immune tolerance in arthritis disease model, but the effect of in vivo delivery is not clear and side effects are difficult to be applied to the human body. Therefore, in order to successfully induce immune tolerance, a new biomaterial delivery system has been developed for infiltrating in vivo slowly and effectively without changing the components of the antigen.
인체에 무해한 생분해성 고분자(polymer)를 펩티드 또는 단백질로 된 약물의 전달 수송체로 이용하려는 시도가 여러 연구진들에 의해 행해지고 있었다. 본 발명자들의 연구결과에서는 생분해성 고분자(polymer)를 이용할 경우, 기존의 면역관용 유도를 이루어 치료적 효과를 거두는데에 있어 약물의 투여에서 단점으로 작용할 수 있는 투약횟수, 약물의 양 등을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 약물의 일정양 방출을 통해 충분한 기간 동안 GALT 와 면역반응을 유발시킬 수 있었다.Attempts have been made by several researchers to use harmless biodegradable polymers as delivery vehicles for peptides or proteins. According to the results of the present inventors, the use of biodegradable polymers can reduce the number of doses, the amount of drugs, etc., which can act as disadvantages in the administration of the drug to achieve a therapeutic effect by inducing the conventional immune tolerance. Not only that, but a certain amount of drug release could trigger GALT and immune response for a sufficient time.
본 발명자들이 사용한 생분해성 고분자(polymer)는 Poly/lactide/glycolide(이하 PLGA로 표시)이며 이러한 고분자를 이용한 약물 전달 시스템은 주로 경구 백신화를 유도하기 위해 사용되어 왔으며 CsA, TGF-b1 등 면역 억제를 위한 약물 전달에도 응용된 바가 있다.The biodegradable polymers used by the present inventors are Poly / lactide / glycolide (hereinafter referred to as PLGA), and drug delivery systems using these polymers have been mainly used to induce oral vaccination and suppress immunosuppression such as CsA and TGF-b1. It has also been applied to drug delivery for.
본 발명자들은 콜라겐-PLGA 복합체의 제조에 성공하였고 이를 관절염 질환 마우스에 단 1회만 투여하여도 관절염이 억제됨을 최초로 발견하여 2002년 미국 류마티스 학회지에 발표하였다. 따라서 EGCG는 EGCG-PLGA 복합체를 만들어 투여한다면 보다 효과적인 치료효과를 얻을 수 있을 것으로 기대한다.The present inventors succeeded in the preparation of the collagen-PLGA complex, and it was first discovered that arthritis was inhibited by only one administration to arthritis disease mice and published in the 2002 American Journal of Rheumatology. Therefore, EGCG is expected to obtain more effective therapeutic effect if the EGCG-PLGA complex is made and administered.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 범위를 이러한 실시예들로 한정하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
(실시예 1) 실험 동물모델의 구축Example 1 Construction of Experimental Animal Model
본 실험에서는 수컷 DBA-1 마우스(몸무게 : 22ㅁ 4g) 80마리를 사용하였다.In this experiment, 80 male DBA-1 mice (weight: 22 ㅁ 4 g) were used.
CII를 2㎎/ml이 되도록 0.1N 아세트산 용액에 녹이고, 이렇게 녹인 CII를 2㎎/ml complete Freud's 애주번트(CFA, Chondrex)와 동량으로 섞은 후 DBA-1마우스의 꼬리에 마리당 100㎕ (즉 100㎕/100㎍)으로 주사하였다(1st주사).Dissolve CII in 0.1 N acetic acid solution to 2 mg / ml, mix this dissolved with 2 mg / ml complete Freud's adjuvant (CFA, Chondrex) in an equal amount and 100 μl per horse (100 Μl / 100 μg) (1 st injection).
이로부터 2주 후 2nd주사는 동일한 CII를 동량의 incomplete Freud's 애주번트(IFA, Chondrex)와 섞은 후 100㎕(즉 100㎕/100㎍)를 한쪽 뒷다리에 주사한다(2nd주사).Two weeks later, a 2 nd injection mixes the same CII with the same amount of incomplete Freud's adjuvant (IFA, Chondrex) and injects 100 μl (ie 100 μl / 100 μg) into one hind limb (2 nd injection).
위와 같이 DBA-1 마우스에 2번의 주사를 진행하는 것이 일반적으로 관절염을 유도하는 방법이다. 이때 EGCG(SIGMA Aldrich, cat no:E4143)는 PBS에 녹인 후 25㎎/㎏와 50㎎/㎏로 마우스의 복강에 100㎕의 부피를 1주일에 3번씩 3주를 주사한다. EGCG는 2nd 주사가 끝난 후 일주일 후부터 (즉 1st 주사 후 3주째) 3주간 주사하게 된다. 관절염 평가는 1st 주사후 12주까지 평가하며 시험관 내 어세이를 하기 위하여 1st 주사 후 7주후 (EGCG 주사후 1주일 뒤에) 희생하여 실험한다.As described above, two injections into DBA-1 mice generally induce arthritis. At this time, EGCG (SIGMA Aldrich, cat no: E4143) was dissolved in PBS, and injected 3 weeks a week with a volume of 100 μl into the abdominal cavity of mice at 25 mg / kg and 50 mg / kg three times a week. EGCG will be injected for 3 weeks from 1 week after the end of the 2nd injection (ie 3 weeks after the 1st injection). Arthritis assessment is assessed up to 12 weeks after the 1st injection and sacrificed 7 weeks after the 1st injection (one week after EGCG injection) for in vitro assays.
시험군 1은 DBA-1 스트레인의 정상 마우스군이고 시험군 2는 EGCG 약제효과를 시험하기 위한 대조군으로써 관절염 유도 동물 모델군이며, 시험군 3은 관절염을 유도한 후 EGCG 약제를 25㎎/㎏으로, 시험군 4는 50㎎/㎏으로 투여한 군을 말한다. 관절염 평가는 12주까지 진행하여 평가하고 정리하였다.Test group 1 is a normal mouse group of the DBA-1 strain, test group 2 is a control group to test the effects of EGCG drugs, arthritis-induced animal model group, test group 3 to 25 mg / kg EGCG drugs after inducing arthritis , Test group 4 refers to the group administered at 50 mg / kg. Arthritis was evaluated and summarized up to 12 weeks.
첫 번째 접종을 시작점으로 하여 3주 후부터 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 네 명이 일주일에 세 번씩 관절 염증의 위중도를 평가하여 12주까지 관찰하였다. 이 때 관절염 평가는 Rossoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수(평균 관절염 인덱스)에 기준하여 마우스 당 2차 접종 때 CII/CFA를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 마우스에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.Three weeks after the first inoculation, four observers, who did not know the contents of the experiment, evaluated the severity of joint inflammation three times a week and observed until 12 weeks. At this time, arthritis evaluation was divided by the sum of the scores according to the following scales on the three legs except the legs to which CII / CFA was administered at the second inoculation per mouse based on the average arthritis index (average arthritis index) by Rossoliniec et al. The average value was obtained, and the average obtained by dividing the values obtained by three observers in each mouse was used. The scores and criteria according to arthritis evaluation are as follows.
0점 : 부종이나 종창이 없다.0 points | pieces: There is no edema or swelling.
1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적1 point: Mild swelling and redness limited to the foot or ankle joint
2점 : 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적2 points: Mild swelling and redness from the ankle joint to the metatarsal
3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적3 points: moderate swelling and redness from the ankle joint to the ankle bone
4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우4 points: swelling and redness from the ankle to the leg
시험결과Test result
CII/CFA의 1차 접종 후 4주째 되는 시점까지 네 군에서 별다른 차이를 보이지 않았다. 5주에서 6주가 지나면서 대조군(류마티스 관절염)의 평균 관절염 지수는 이후 계속 증가하여 8주에서 10주째까지 최대치를 이루며 12주째에는 감소하였으나 여전히 다른 군과 확연한 차이를 보였다.There was no significant difference in the four groups until 4 weeks after the first inoculation of CII / CFA. After 5 to 6 weeks, the average arthritis index of the control group (rheumatic arthritis) continued to increase afterwards, reaching a maximum from 8 to 10 weeks, and decreasing at 12 weeks, but still markedly different from other groups.
EGCG 25㎎과 50㎎을 투여한 군의 경우 4주에서 6주째 까지는 대조군과 비슷하게 관절염지수가 계속 증가하였으나 EGCG 25㎎의 경우 6주 이후부터는 대조군과 차이를 보이기 시작해 12주까지 지속적으로 낮은 수치의 관절염지수를 보였으며 이러한 결과는 EGCG의 농도가 높을수록 더욱 명확히 드러났다. 그러나 DBA-1의 정상마우스의 경우는 12주까지 위중도가 거의 관찰되지 않았다.In the EGCG 25 mg and 50 mg groups, the arthritis index continued to increase from 4 weeks to 6 weeks, similar to the control group. However, after EGCG 25 mg, the EGCG 25 mg began to show a difference from the control group until 12 weeks. Arthritis index was shown, and this result was more evident with higher concentration of EGCG. However, in the normal mice of DBA-1, gastric gravity was hardly observed until 12 weeks.
(실시예 2) 시험 동물의 관절염 치료효과Example 2 Arthritis Treatment Effect of Test Animal
도 1은 EGCG의 효과를 조직에서 직접 관찰하기 위해 마우스의 관절조직을 적출, 파라핀에 포매하여 serial section 과정을 거친 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 것이다. 관절염 동물모델의 경우, 관절염 지수에서 보여진 것처럼 전형적인 관절염 파괴로 콘드로사이트 사멸(chondrocyte death)과 연골 표면침식(cartilage surface erosion) 등이 심하게 일어났으며, 염증 세포의 경우 과립세포와 호중구, 마크로파지와 같은 세포들이 연골조직 주위에 침윤되어 있는 것이 관찰되었다. 또한 관절조직의 뼈와 연골에 판누스(pannus)와 같은 조직내 과립형성을 관찰할 수 있었으며 관절강(articular cavity)에 뼈 조직의 일부가 퇴화된 것이 관찰되었다. 그러나 EGCG 25㎎을 투여한 군의 관절 조직에서는 염증 정도가 대조군에 비해 눈에 띄게 감소되어 있었고, 염증 인자 세포의 침윤 정도 역시 관절염군에 비해 유의적으로 감소되어 있는 것이 관찰되었다. 이러한 EGCG 효과는 농도 의존적으로 25㎎에 비해 50㎎을 투여하였을 때 더욱 유의적으로 나타났는데 그림에서 보는 바와 같이 50㎎을 투여한 군에서 관절의 이상증식(hyperplasia), 뼈의 침식(erosion)과 염증 세포들의 침윤 정도는 거의 보이지 않았고 관절 파괴나 염증의 심화도 역시 거의 정상 마우스에 가깝게 호전되어 있는 것이 관찰되었다.Figure 1 shows the effect of EGCG directly on the tissue of the tissue of the mouse was extracted, embedded in paraffin and subjected to serial section process and stained with hematoxylin and eosin. In the arthritis animal model, as shown in the Arthritis Index, typical arthritis destruction caused severe chondrocyte death and cartilage surface erosion.Inflammatory cells, granulocytes, neutrophils, macrophages and The same cells were observed to infiltrate around the cartilage tissue. In addition, granulation such as pannus was observed in the bone and cartilage of the joint tissue, and a part of the bone tissue was degenerated in the articular cavity. However, it was observed that the degree of inflammation was significantly decreased in the joint tissues of the EGCG 25 mg group compared with the control group, and that the invasion of the inflammatory cell was also significantly reduced in the arthritis group. The effect of EGCG was more significant when 50 mg was administered compared to 25 mg in a concentration-dependent manner. As shown in the figure, hyperplasia, bone erosion and joint hyperplasia were observed in the 50 mg group. The degree of infiltration of inflammatory cells was almost invisible, and joint destruction and severity of inflammation were also improved to near normal mice.
결과적으로 EGCG는 관절염 동물 모델에서 관절의 염증을 호전시키는데 중요한 약제임을 관절조직 사진을 통해 확인할 수 있었고 이러한 관절파괴의 감소효과는 농도 의존적으로 25㎎에 비해 50㎎을 투여하였을 때 더욱 효과적임을 확인할 수 있었다.As a result, EGCG was found to be an important drug for improving joint inflammation in animal models of arthritis through articular tissue photos, and the effect of reducing this destruction was more effective when administered 50mg compared to 25mg. there was.
(실시예 3) 실험 동물의 면역체계의 변화Example 3 Change in Immune System of Experimental Animal
도 2는 체액성 면역반응의 지표로 총 IgG와 CII 특이적인 IgG 생성 관찰 결과값을 표시한 그래프이다. 마우스의 경우 IgG 항체의 여러 아형 중 IgG1은 염증을 주로 억제하는 조절자의 역할을 하는 반면, IgG2a는 염증반응을 촉진하고 매개하는 인자로 작용한다고 알려져 있다.Figure 2 is a graph showing the total IgG and CII specific IgG production observations as an indicator of humoral immune response. In mice, IgG1 acts as a regulator of inflammation, whereas IgG2a acts as a mediator and mediator of inflammatory responses.
DBA-1 마우스에서는 관절염을 유도할 경우 주로 Th1 반응을 일으키는 IgG2a가 특이적으로 증가되는 것으로 알려져 있다. 본 실험 결과 EGCG로 25㎎, 50㎎을 투여한 군과 용매를 대신 먹인 관절염군 마우스의 혈청을 5000배로 희석한 뒤 각각 IgG1과 IgG2a를 ELISA로 분석해 본 결과, EGCG를 투여한 군의 IgG1의 농도는 25㎎을 투여한 군에서 보다 50㎎을 투여한 군에서 높게 관찰되었으며 이러한 IgG1의 농도 변화는 관절염 군과 비교하면 두 군 모두 유의적으로 증가된 것이 관찰되었다.In DBA-1 mice, the induction of arthritis is known to specifically increase IgG2a, which mainly causes the Th1 response. As a result of this experiment, the serum of the mice treated with 25 mg and 50 mg of EGCG and the arthritis group fed with the solvent was diluted 5000 times, and then the IgG1 and IgG2a were analyzed by ELISA. Was higher in the 50 mg group than in the 25 mg group. The change in IgG1 concentration was significantly increased in both groups compared to the arthritis group.
IgG2a의 경우 관절염군과 EGCG 25㎎을 투여한 군과의 차이가 미비하였으나 50㎎을 투여한 군에서는 35%정도 감소되어 있는 것이 관찰되었다. 이러한 IgG의 차이는 콜라겐(CII)특이적인 IgG를 측정한 결과에서도 의미있는 차이가 관찰되었다. CII에 특이적인 IgG1의 경우, 대조군에 비해 EGCG 25㎎과 50㎎을 투여한 군에서 모두 증가되었다. 반면 IgG2a의 경우는 총 IgG2a와 마찬가지로 대조군과 EGCG 25㎎을 투여한 군과는 차이가 미비하였으나 EGCG 50㎎을 투여한 군에서 의미있게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이때 정상인 마우스에서는 매우 낮은 수준으로 측정되었다.In the case of IgG2a, the difference between the arthritis group and the EGCG 25 mg group was insignificant, but it was reduced by 35% in the 50 mg group. This difference in IgG was also observed in the collagen (CII) specific IgG measurement results. IgG1 specific to CII was increased in both EGCG 25 mg and 50 mg groups compared to the control group. On the other hand, in the case of IgG2a, the difference between the control group and the EGCG 25 mg group was similar to the total IgG2a but was significantly reduced in the group administered the EGCG 50 mg. Very low levels were measured in normal mice.
(실시예 4) 시험 동물의 사이토카인 생성변화Example 4 Cytokine Production Changes in Test Animals
도 3은 세포성 면역반응을 나타내는 지표로써 사이토카인의 분비를 관찰하여 그래프로써 나타낸 것이다. EGCG 효과가 세포 면역반응에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 시험관 내 시스템을 이용하여 세 군의 비장세포로부터 단핵구세포를 얻은 다음 제2형 콜라겐과 EGCG를 농도별로 처리하여 사이토카인의 변화를 ELISA로 측정하였다.Figure 3 is a graphical representation of the observation of cytokine secretion as an indicator of cellular immune response. To determine the effect of EGCG effect on cellular immune responses, monocytes were obtained from three groups of splenocytes using an in vitro system, followed by concentration of collagen type 2 and EGCG, and cytokine changes measured by ELISA. It was.
도 3에 나타난 바와 같이 염증과 관련된 활성물질로 알려진 IL-17, IFN-γ, TNF-α와 같은 사이토카인은 관절염 유발 모델의 비장세포에서 CII로 자극하였을 때 자극하지 않은 세포(Nil)에 비해 유의적으로 증가함을 알 수 있었고, 이러한 증가는 외부에서 EGCG 100μM을 처리하였을 때 60%가까이 감소된다는 사실을 아울러 확인할 수 있었다. EGCG 25㎎과 50㎎을 투여한 군의 비장세포의 경우 관절염 군과 비교해 시험관 내에서 CII로 자극을 하여도 IL-17과 TNF-α발현은 감소하였으며 IFN-σ의 경우 더욱 현저하게 감소되는 결과를 확인할 수 있었다. 그러나 항염증인자로 알려진 IL-10의 경우는 관절염 모델에서는 극히 낮은 수치로 생성이 되는 것으로 알려져 있으며, 관절염이 치료 되었을 때 이러한 IL-10의 생성이 증가되는 것을 확인 할 수 있다. EGCG 25㎎과 50㎎을 투여한 군에서 관절염군과 비교해 CII로 자극했을 시 1.5배에서 3배까지 증가하였으며 IL-10의 효과는 외부로부터 EGCG자극을 주었을 때에도 높이 생성되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 관절염군에서도 외부에서 EGCG를 투여하였을 경우 IL-10의 농도가 증가되는 것을 확인할 수 있다. 따라서 EGCG는 관절염에서 염증인자인 IL-17, IFN-γ, TNF-α는 감소시키고 항염증인자인 IL-10은 증가시키는 것으로 나타났다.As shown in FIG. 3, cytokines such as IL-17, IFN-γ, and TNF-α, which are known to be active agents associated with inflammation, are compared to non-stimulated cells (Nil) when stimulated with CII in splenocytes of arthritis-induced models. It was found that the increase was significant, and this increase was also confirmed that the decrease was nearly 60% when the EGCG 100μM was treated externally. In splenocytes treated with 25 mg and 50 mg of EGCG, IL-17 and TNF-α expression decreased even more in vitro when stimulated with CII than in arthritis group. Could be confirmed. However, IL-10, known as an anti-inflammatory factor, is known to produce extremely low levels in arthritis models, and it can be seen that the production of IL-10 is increased when arthritis is treated. In the EGCG 25 mg and 50 mg groups, the CII stimulation increased 1.5 to 3 times compared to the arthritis group, and the effects of IL-10 were generated even when the EGCG stimulation was given externally. In addition, in the arthritis group, the concentration of IL-10 is increased when EGCG is administered externally. Therefore, EGCG was found to reduce IL-17, IFN-γ, TNF-α, and anti-inflammatory factors, IL-10, in inflammatory arthritis.
(실시예 5) 실험동물의 T 세포 증식반응의 변화Example 5 Changes in T Cell Proliferation in Experimental Animals
도 4는 CII에 반응하는 T 세포 증식반응을 관찰하여 그래프로 나타낸 것이다.4 is a graph illustrating the observation of T cell proliferation in response to CII.
기존의 보고에서 류마티스 관절염 환자의 혈청, 활액 및 연골에서 CII에 대한 항체가 발견되었으며, 활막 또는 말초 혈액내 림프구에서 CII에 대한 T 세포 면역 반응과 증식반응이 모두 증가되어 있는 것이 관찰되었다. 따라서 관절염에 있어 CII에 대한 T 세포면역 반응을 확인하는 것이 의미있는 세포실험의 지표가 될 수 있다. 본 실험에서는 림프절에서 CII항원에 대한 T 세포의 증식반응을 관찰하는 방법으로 3H-싸이미딘(Thymidine)을 이용하여 측정하였다. 방법으로는 각 군의 림프절과 비장을 적출하여 인산 완충용액으로 세척한 뒤 잘게 잘라 세포 스트레이너(cell strainer)로 거른 다음 세포층을 RPMI1640 배양액에 재부유시켜 96 웰 플레이트에 비장과 혈액 림프절을 각각 1 ㅧ105세포씩 넣고 40㎍/㎖ 농도의 CII로 3일간 자극하여 배양하였다. 배양종료 18시간 전에 3H-티미딘을 넣어준 후 배양이 종료되면 기구로 동위 원소양을 측정하였다. T 림프구 증식반응의 결과를 나타내는 자극지수(자극 인덱스(Stimulation index) : SI)는 자극한 세포에서 측정된 cpm 값이 자극하지 않은 군에서 측정된 cpm 값으로 나누었을 때를 나타내어지는 지수를 말한다. 이때 이러한 SI 값이 2이상인 경우를 양성 증식반응이 일어난 경우로 간주하였다.In previous reports, antibodies to CII were found in serum, synovial fluid, and cartilage of rheumatoid arthritis patients, and both T cell immune and proliferative responses to CII were observed in lymphocytes in synovial or peripheral blood. Therefore, the identification of T cell immune response to CII in arthritis may be an indicator of meaningful cell experiments. In this experiment, 3H-thymidine was used as a method of observing the proliferative response of T cells to CII antigens in lymph nodes. In each method, lymph nodes and spleens of each group were extracted, washed with phosphate buffer, chopped, filtered with a cell strainer, and resuspended in a RPMI1640 medium. 10 5 cells were added and cultured by stimulating with CII at 40 µg / ml for 3 days. 18 hours before the end of the culture, 3H-thymidine was added and the culture was terminated. Stimulation index (Stimulation index: SI) indicating the result of the T lymphocyte proliferation response is an index indicating when the cpm value measured in the stimulated cells divided by the cpm value measured in the non-stimulated group. At this time, the SI value of 2 or more was considered as the case of a positive proliferative reaction.
그 결과 CII를 자극한 경우 관절염 유도군에서 SI 값이 4이상으로 강력한 증식반응을 보인 반면 EGCG 25㎎, 50㎎을 투여한 군에서는 CII로 자극한 경우 관절염유도군에 비해 낮은 증식반응을 보였다. 다음은 시험관 내에서 EGCG의 효과를 극대화하기 위해 EGCG를 10μM부터 100μM로 농도별로 넣어주었을 때 T 림프구의 증식반응을 살펴본 결과, 세 군(CIA, EGCG 25㎎, 50㎎) 모두에서 CII에 대한 T 림프구의 반응은 EGCG 농도에 의존적으로 감소하는 현상을 보였다.As a result, the CII-stimulated group showed strong proliferative response with an SI value of 4 or more in the arthritis-induced group, whereas the EGCG 25mg, 50mg-treated group showed a lower proliferative response than the arthritis-induced group. In order to maximize the effect of EGCG in vitro, we examined the proliferative responses of T lymphocytes when EGCG was added at a concentration of 10 μM to 100 μM. In all three groups (CIA, EGCG 25 mg, 50 mg), Lymphocyte response decreased depending on EGCG concentration.
(실시예 6) 실험 동물의 T 세포 유발인자에 대한 T 세포 증식반응Example 6 T Cell Proliferation Response to T Cell Inducers of Experimental Animals
도 5는 T 세포분열 유발인자에 대한 T 세포 증식반응을 나타낸 그래프이다. 세포분열 유발인자인 마이토젠을 사용하여 T 세포의 증식반응을 살펴본 결과 그림에서 보는 바와 같이 관절염 유도군에서 아무것도 자극하지 않은 조건에서 T림프구 증식반응에 의해 마이토젠인 PHA로 자극하였을 경우 SI가 8이상으로 매우 높은 증식반응을 보인 반면, EGCG 25㎎ 또는 50㎎을 투여한 군에서는 PHA로 자극하여도 관절염 유도군에 비해 비교적 낮은 증식반응을 나타내었다. 이로써 관절염 모델에서 보이는 T 세포의 과증식을 EGCG를 통해 전체적으로 억제시킬 수 있는 것을 확인하였다.5 is a graph showing the T cell proliferation response to the T cell division inducing factor. As shown in the figure, when the proliferative response of T cells was used using the cytostatic factor mitogen, SI was 8 when stimulated with mitogen PHA by T lymphocyte proliferation in the condition that nothing was stimulated in the arthritis-induced group. While the proliferative response was very high, the group administered with 25 mg or 50 mg of EGCG showed a relatively low proliferative response even when stimulated with PHA compared to the arthritis induction group. As a result, it was confirmed that the hyperproliferation of T cells seen in the arthritis model can be completely suppressed through EGCG.
본 발명의 효과는 EGCG의 류마티스 관절염에 대해 치료 효과를 실험적으로 확인하였다. 본 발명은 EGCG가 콜라겐유도 관절염모델에서 류마티스 관절에 대한 치료효과를 밝혀낸 것으로 EGCG는 류마티스 관절염의 병소부위에서 염증반응과 항원에 특이적으로 반응하는 세포의 면역반응을 조절함으로써 류마티스 관절염질환을 치료하는 효과를 지닌다.The effect of the present invention has experimentally confirmed the therapeutic effect of EGCG against rheumatoid arthritis. The present invention revealed that EGCG has a therapeutic effect on rheumatoid joints in a collagen-induced arthritis model. Has an effect.
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