KR20030097059A - Agent Containing Cu(II) ion as an Effective Component to Inhibit Activities of Cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 구리 2가 이온을 유효성분으로 포함하는 시토크롬 P450 효소의 및 NADPH-시토크롬 P450 환원효소의 활성 저해제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 구리 2가 이온을 유효성분으로 포함하는 시토크롬 P450 효소 및 NADPH-시토크롬 P450 환원효소의 활성 저해제, 혹은 이를 이용하여 단백질 수준에서 시토크롬 P450 효소 및 NADPH-시토크롬 P450 환원효소의 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an activity inhibitor of cytochrome P450 enzyme and NADPH-cytochrome P450 reductase comprising copper divalent ions as an active ingredient. More specifically, the present invention is an activity inhibitor of cytochrome P450 enzyme and NADPH-cytochrome P450 reductase containing copper divalent ions as an active ingredient, or at the protein level of cytochrome P450 enzyme and NADPH-cytochrome P450 reductase. It relates to a method of inhibiting activity.
진핵 세포에서 마이크로좀(microsome)의 시토크롬 P450 시스템은 스테로이드, 약물, 발암물질과 같은 생체 물질(endogenous compound) 혹은 외래 물질(xenobiotic compound)을 산화시키며, 이 효소 시스템은 시토크롬 P450 효소(이하, 편의상 'P450'이라 함)와 NADPH-시토크롬 P450 환원효소(이하, 편의상 'NPR'이라 함)으로 구성되어 있다. P450은 생체 내에 매우 많은 종류가 존재하며 그 해당 기질의 존재 여부에 따라서 발현이 조절된다. 이에 반해서 NPR은 한 종류가 존재하며, P450에 비해서 그 발현 정도도 거의 일정하게 유지된다. 생체 내에서 NPR과 P450의 비율은 대략 1:10에서 1:25 정도이기 때문에 NPR과 P450의 상호 작용이 P450 활성에 중요한 역할을 할 것으로 생각되고 있다. NPR은 NADPH에서 P450으로 전자를 전달하는 역할을 하며, P450은 NPR으로부터 받은 전자를 이용하여 물질을 산화시키는 작용을 한다.In eukaryotic cells, the microsome's cytochrome P450 system oxidizes endogenous compounds or xenobiotic compounds, such as steroids, drugs, and carcinogens, and the enzyme system is a cytochrome P450 enzyme (hereafter for convenience) P450 ') and NADPH-cytochrome P450 reductase (hereinafter referred to as' NPR' for convenience). P450 has a large number of species in vivo and its expression is regulated depending on the presence or absence of its substrate. In contrast, there is one type of NPR, and its expression level is almost constant compared to P450. Since the ratio of NPR and P450 in vivo is about 1:10 to 1:25, the interaction of NPR and P450 is thought to play an important role in P450 activity. NPR serves to transfer electrons from NADPH to P450, and P450 oxidizes materials using electrons received from NPR.
금속 이온들은 세포의 중요한 구성 성분이며 다양한 세포 활성에 관여하고 있으며, 윌슨씨 병, 알츠하이머 병, 파킨슨씨 병과 같은 다양한 질환에 금속 이온의 불균형이 관여하고 있는 것으로 밝혀지고 있다(참조: Rolfs, A. and Hediger, M.A. (1999) J. Physiol. (London) 518, 1-12). 또한, 대부분의 금속 이온을 과량으로 섭취하면 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구 문헌에 따르면 간세포(hepatocyte)에 구리 이온을 투여하면 윌슨씨 병 환자에서 발견되는 간세포의 apoptosis가 유도된다(참조: Strand, S. et al. (1998) Nature Med. 4, 588-593). 이러한 사실들은 많은 물질들의 대사 과정에 중요한 역할을 하는 시토크롬 P450 시스템의 활성을 조절하는 조절 인자로 금속 이온이 작용할 가능성을 시사한다.Metal ions are important constituents of cells and are involved in a variety of cellular activities, and metal ions are found to be involved in various diseases such as Wilson's disease, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease (Rolfs, A. and Hediger, MA (1999) J. Physiol. (London) 518, 1-12). In addition, ingestion of most metal ions is known to be toxic. According to a recent study, the administration of copper ions to hepatocytes induces apoptosis in hepatocytes found in Wilson's disease patients (Strand, S. et al. (1998) Nature Med. 4, 588-593). . These facts suggest the potential for metal ions to act as regulators to regulate the activity of the cytochrome P450 system, which plays an important role in the metabolism of many substances.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 여러 금속 이온 중에서 구리 2가 이온에 의해서만 시토크롬 P450 시스템의 활성이 저해됨을 발견하였다. 특히, 시토크롬 P450 시스템을 구성하고 있는 P450 효소와 NPR 효소의 활성이 동시에 저해됨을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Under this background, the inventors have found that the activity of the cytochrome P450 system is inhibited only by copper divalent ions among the various metal ions. In particular, it was found that the activity of the P450 enzyme and the NPR enzyme constituting the cytochrome P450 system was simultaneously inhibited, thereby completing the present invention.
결국, 본 발명의 목적은 구리 2가 이온을 유효성분으로 포함하는 P450 효소와 NPR 효소의 활성 저해제를 제공하는 것이다.After all, an object of the present invention is to provide an activity inhibitor of the P450 enzyme and NPR enzyme containing a copper divalent ion as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 전기 활성 저해제를 이용하여 P450 효소와 NPR 효소의 활성을 저해하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a method for inhibiting the activity of the P450 enzyme and NPR enzyme using an electrical activity inhibitor.
제 1(A)도는 금속 이온 농도에 따른 βNF 마이크로좀의 EFC-O-deethylation 활성 그림Figure 1 (A) shows EFC-O-deethylation activity of βNF microsomes according to metal ion concentration
제 1(B)도는 금속 이온 농도에 따른 PB 마이크로좀의 EFC-O-deethylation 활성 그림Figure 1 (B) shows EFC-O-deethylation activity of PB microsomes according to metal ion concentration
제 1(C)도는 구리 2가 이온 농도에 따른 P4501A2와 P4503A4의 활성 그림Figure 1 (C) shows the activity of P4501A2 and P4503A4 according to the copper divalent ion concentration.
제 2(A)도는 금속 이온 존재하에서 NPR의 활성 그림Figure 2 (A) shows the activity of NPR in the presence of metal ions
제 2(B)도는 구리 2가 이온 농도에 따른 NPR의 활성 그림Figure 2 (B) is a plot of NPR activity according to copper divalent ion concentration.
제 2(C)도는 구리 2가 이온과/혹은 EDTA 존재하에서 NPR의 활성 그림Figure 2 (C) shows the activity of NPR in the presence of copper divalent ions and / or EDTA.
제 3(A)도는 구리 2가 이온과/혹은 EDTA 존재하에서 tert-butyl hydroperoxide를 이용한 P4501A2의 활성 그림Figure 3 (A) shows the activity of P4501A2 with tert-butyl hydroperoxide in the presence of copper divalent ions and / or EDTA.
제 3(B)도는 구리 2가 이온과/혹은 EDTA 존재하에서 tert-butyl hydroperoxide를 이용한 P4503A4의 활성 그림Figure 3 (B) shows the activity of P4503A4 with tert-butyl hydroperoxide in the presence of copper divalent ions and / or EDTA.
제 3(C)도는 구리 2가 이온과/혹은 EDTA 존재하에서 NPR과 NADPH를 이용한 P4501A2의 활성 그림Figure 3 (C) shows the activity of P4501A2 using NPR and NADPH in the presence of copper divalent ions and / or EDTA.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
P450 시스템의 활성을 측정할 모델 시스템인 마이크로좀을 얻기 위해서 랫트에 5,6-벤조플라본(5,6-benzoflavone; 이하, 편의상 'βNF'라고 함)과 페노바비탈(phenobarbital; 이하, 편의상 'PB'라고 함)을 각각 투여하고, 일정 시간 경과 후 랫트를 치사한 다음, 즉시 그로부터 간(liver)을 절취하고 마이크로좀을 분리하였다.In order to obtain a microsome, a model system for measuring the activity of the P450 system, rats were treated with 5,6-benzoflavone (hereinafter referred to as 'βNF') and phenobarbital (hereinafter referred to as 'PB' for convenience). Respectively, and after a certain time, the rats were killed, and then the liver was immediately excised from the microsomes.
구리, 칼슘, 코발트, 망간, 마그네슘, 아연을 포함한 다양한 금속 2가 양이온들을 0-100μM의 농도로 βNF 마이크로좀과 PB 마이크로좀에 처리하고, EFC-O-deethylation 활성을 이용하여 마이크로좀 P450 시스템의 활성을 조사하였다. 마이크로좀에 처리한 금속 2가 양이온 중에서 구리 2가 이온만이 실험 조건 내에서 마이크로좀 P450 시스템의 활성을 95% 이상 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 구리 2가 이온과 결합하고 있는 음이온의 종류가 P450 활성에 영향을 미치는 지의 여부를 확인하기 위하여 구리 2가 염화물과 구리 2가 황산화물을 비교 실험하였으며 동일한 실험 결과를 얻었다. 이는 구리 2가 이온이 P450 활성을 저해하는 주원인임을 의미한다.Various metal divalent cations including copper, calcium, cobalt, manganese, magnesium and zinc were treated to βNF microsomes and PB microsomes at concentrations of 0-100 μM, and the EFC-O-deethylation activity was used to prepare the microsome P450 system. The activity was investigated. Among the metal divalent cations treated with the microsomes, only copper divalent ions were found to reduce the activity of the microsome P450 system by more than 95% within experimental conditions. In addition, copper divalent chloride and copper divalent sulfur oxide were compared and tested to determine whether the type of anion bound to copper divalent ion affects P450 activity. This means that copper divalent ions are the main cause of inhibition of P450 activity.
구리 2가 이온이 P450 활성을 저해하는 현상은 정제된 P450 효소(P4501A2, P4503A4)와 정제된 NPR 효소를 이용하여 재구성된 시스템에서도 동일하게 관찰할 수 있었다. 이러한 사실로 미루어 구리 2가 이온은 P450 효소와/혹은 NPR 효소에 직접 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.The inhibition of P450 activity by copper divalent ions could be observed in the system reconstituted using purified P450 enzymes (P4501A2, P4503A4) and purified NPR enzyme. This fact suggests that copper divalent ions directly affect the P450 enzyme and / or NPR enzyme.
구리 2가 이온의 NPR 효소에 대한 영향을 조사하기 위해서 시토크롬 c를 환원시키는 정도를 비교하였다. 칼슘, 구리, 코발트, 마그네슘, 망간, 아연 등의 금속 이온 중에서 구리 이온만이 NPR 효소의 활성을 저해하였다. 구리 2가 이온의 P450 효소에 대한 영향을 조사하기 위해서 tert-butyl hydroperoxide를 이용하여 NPR 효소 없이 P4501A2와 P4503A4의 활성을 조사하였으며, P450 효소의 활성이 저해됨을 관찰하였다.To investigate the effect of copper divalent ions on the NPR enzyme, the degree of reduction of cytochrome c was compared. Among metal ions such as calcium, copper, cobalt, magnesium, manganese and zinc, only copper ions inhibited NPR enzyme activity. In order to investigate the effect of copper divalent ion on P450 enzyme, the activity of P4501A2 and P4503A4 without NPR enzyme was investigated using tert-butyl hydroperoxide, and the activity of P450 enzyme was inhibited.
이러한 사실들을 미루어 칼슘, 코발트, 망간, 마그네슘, 아연, 구리를 포함한 금속 2가 양이온 중에서 구리 2가 이온만이 P450 시스템을 저해하며, 특히, P450 효소와 NPR 효소에 동시에 작용하여 P450 활성을 저해하는 것을 알 수 있었다.In view of these facts, among the metal divalent cations including calcium, cobalt, manganese, magnesium, zinc and copper, only copper divalent ions inhibit the P450 system. In particular, P450 and NPR enzymes act simultaneously to inhibit P450 activity. I could see that.
따라서, 본 발명의 구리 2가 이온을 유효 성분으로 포함하는 시토크롬 P450 효소의 활성 저해제는 모든 종류의 P450을 동시에 저해하는 방법으로 이용할 수 있을 것이다.Therefore, the activity inhibitor of cytochrome P450 enzyme containing copper divalent ion of the present invention may be used by a method of simultaneously inhibiting all kinds of P450.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것을, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을가진 자에게 있어서 자명할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that these examples are only intended to illustrate the present invention more specifically, and that the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1:P450 활성에 대한 금속 2가 양이온의 효과 Example 1 Effect of Metal Divalent Cations on P450 Activity
P450 활성에 대한 금속 2가 양이온의 효과를 마이크로좀 P450 활성을 이용하여 측정하였다. 모델 시스템으로 βNF와 PB를 각각 투여한 랫트의 간에서 얻은 마이크로좀을 사용하였다. 0.2mg 단백질/ml의 마이크로좀 용액에 0-100μM의 농도로 구리, 칼슘, 코발트, 망간, 마그네슘, 아연과 같은 금속 2가 염화물을 첨가하여 5분간 상온에 방치한 후에 NADPH를 첨가하여 37℃에서 10분간 EFC-O-deethylation 반응이 일어나도록 하였다. EFC-O-deethylation 활성 정도는 385nm에서 여기시켜 502nm에서 방출된 형광을 측정하여 계산하였다. 제 1(A), 1(B)도는 각각 βNF 마이크로좀과 PB 마이크로좀의 EFC-O-deethylation 활성을 나타낸다. 제 1(A), 1(B)도에서 보듯이, 구리, 칼슘, 코발트, 망간, 마그네슘, 아연 중에서 오직 구리 2가 이온만이 P450 활성을 저해하는 것을 알 수 있다. 구리 2가 이온의 경우에 100μM의 농도에서 βNF 마이크로좀과 PB 마이크로좀의 EFC-O-deehtylation 활성을 95% 이상 저해하였으며, βNF 마이크로좀과 PB 마이크로좀은 각각 11±2.6μM과 5.7±1.8μM의 IC50 값을 나타내었다. 금속과 결합한 음이온의 영향을 조사하기 위하여 CuSO4를 이용하여 위의 실험을 반복하였으며, CuCl2와 동일한 결과를 얻었다. 따라서, 구리 2가 이온이 P450 활성을 저해하는 주원인임을 알 수 있었다.The effect of metal divalent cations on P450 activity was measured using microsome P450 activity. As a model system, microsomes obtained from livers of rats treated with βNF and PB, respectively, were used. In a 0.2 mg protein / ml microsome solution, metal divalent chlorides such as copper, calcium, cobalt, manganese, magnesium and zinc were added at a concentration of 0-100 μM and allowed to stand at room temperature for 5 minutes, followed by NADPH at 37 ° C. EFC-O-deethylation reaction was allowed to occur for 10 minutes. The degree of EFC-O-deethylation activity was calculated by measuring the fluorescence emitted at 502 nm by exciting at 385 nm. 1 (A) and 1 (B) show the EFC-O-deethylation activity of βNF microsomes and PB microsomes, respectively. As shown in FIGS. 1 (A) and 1 (B), only copper divalent ions among copper, calcium, cobalt, manganese, magnesium, and zinc inhibit P450 activity. In case of copper divalent ion, EFC-O-deehtylation activity of βNF microsome and PB microsome was inhibited by 95% or more at 100μM concentration. IC50 value is shown. In order to investigate the effect of the anion bound to the metal, the above experiment was repeated using CuSO 4, and the same results as in CuCl 2 were obtained. Therefore, it was found that copper divalent ions are the main cause of inhibiting P450 activity.
또한, P450 시스템에 대한 구리 2가 이온의 직접적인 효과를 알아보기 위해서 마이크로좀 대신에 재구성된 P450 시스템을 사용하였다. 모델 P450 효소로P4501A2와 P4503A4를 선택하였다. 문헌에 보고된 방법에 따라서 재구성된 P4501A2와 P4503A4에 대한 활성을 각각 EFC와 테스토스테론을 기질로 사용하여 측정하였다(참조: Buters, J.T. et al. (1998) Biochem, Pharmacol. 46, 1577-1584; Yamazaki, H. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 27438-27444). 제 1(C)도에서 보듯이, 재구성된 P450 시스템에서도 구리 2가 이온은 P450 활성을 저해하였으며, P4501A2와 P4503A4에 대해서 각각 5.7±2.6μM과 8.4±2.1μM의 IC50 값을 나타내었다.In addition, a reconstituted P450 system was used in place of the microsomes to determine the direct effect of copper divalent ions on the P450 system. P4501A2 and P4503A4 were selected as model P450 enzymes. Activity for P4501A2 and P4503A4 reconstituted according to methods reported in the literature was measured using EFC and testosterone as substrates, respectively (Buters, JT et al. (1998) Biochem, Pharmacol. 46, 1577-1584; Yamazaki , H. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 27438-27444). As shown in FIG. 1 (C), copper divalent ions inhibited P450 activity even in the reconstituted P450 system, and showed IC50 values of 5.7 ± 2.6 μM and 8.4 ± 2.1 μM for P4501A2 and P4503A4, respectively.
실시예 2:NRR 효소 활성에 대한 구리 2가 양이온의 효과 Example 2: Effect of Copper Divalent Cation on NRR Enzyme Activity
P450 시스템을 구성하고 있는 NPR 효소 활성에 대한 금속 이온들의 효과를 측정하였다. NPR 효소의 활성 정도는 문헌에 보고된 방법에 따라서 시토크롬 c의 환원 정도를 측정하여 계산하였다(Guengerich, F.P. (1994) Principles and Methods of Toxicology (Hayers, A.W.), 3판. 1259-1313). 제 2(A)도에서 보듯이 100μM의 농도에서 구리 2가 이온만이 NPR 활성을 저해하였으며, 아연, 코발트, 칼슘, 마그네슘, 망간 이온들은 효과가 전혀 없었다. 제 2(B), 2(C)도에서 보듯이 구리 2가 이온은 NPR에 대해서 5.8±1.2μM의 IC50를 나타내었으며, 50μM인 경우에 NPR 활성을 95% 이상 저해하지만, 킬레이터인 EDTA를 1mM이 되게 첨가하는 경우에 원래의 활성에 40%까지 회복된다는 사실을 발견하였다.The effect of metal ions on the NPR enzyme activity making up the P450 system was measured. The degree of NPR enzyme activity was calculated by measuring the degree of reduction of cytochrome c according to the method reported in the literature (Guengerich, FP (1994) Principles and Methods of Toxicology (Hayers, AW), 3rd edition. 1259-1313). As shown in FIG. 2 (A), only copper divalent ions inhibited NPR activity at a concentration of 100 μM. Zinc, cobalt, calcium, magnesium and manganese ions had no effect. As shown in Figs. 2 (B) and 2 (C), copper divalent ions exhibited an IC 50 of 5.8 ± 1.2 μM against NPR, and at 50 μM, they inhibited NPR activity by 95% or more, but the chelator EDTA Was found to recover to 40% of its original activity when added to 1 mM.
실시예 3:P450 효소 활성에 대한 구리 2가 양이온의 효과 Example 3: Effect of Copper Divalent Cation on P450 Enzyme Activity
P450 시스템을 구성하고 있는 P450 효소에 대한 구리 2가 양이온의 직접적인 효과를 측정하기 위해서 tert-butyl hydroperoxide를 이용하여 NPR 효소 없이 P4501A2와 P4503A4의 활성을 조사하였다. NPR과 NADPH를 제외한 나머지는 실시예 1에서 상기한 방법과 동일한 조건에서 5mM tert-butyl hydroperoxide를 첨가하여 반응을 시작하는 방법으로 P4501A2와 P4503A4의 활성을 측정하였다. 제 3(A), 3(B)도에서 보듯이 50μM CuCl2 존재하에서 P4501A2와 P4503A4는 86%와 62% 정도 활성이 저해되었으며, 킬레이터인 EDTA를 1mM이 되게 첨가하는 경우에 원래의 활성의 35%와 57% 정도로 활성이 회복된다는 사실을 알게 되었다.In order to measure the direct effect of copper divalent cations on the P450 enzyme that constitutes the P450 system, the activity of P4501A2 and P4503A4 without NPR enzyme was investigated using tert-butyl hydroperoxide. Except for NPR and NADPH, the activities of P4501A2 and P4503A4 were measured by adding 5 mM tert-butyl hydroperoxide and starting the reaction under the same conditions as described above in Example 1. As shown in Figs. 3 (A) and 3 (B), P4501A2 and P4503A4 were inhibited by 86% and 62% in the presence of 50μM CuCl2, and when the chelator EDTA was added at 1 mM, 35 It is found that the activity is restored to about 57% and 57%.
NPR 효소와 P450 효소가 구리 2가 이온에 의해서 활성이 저해되지만, EDTA에 의해서부분적으로 활성이 회복된다는 사실을 바탕으로 NPR 효소가 존재하는 재구성된 P450 시스템에서도 EDTA에 의해서 활성이 회복되는지를 실험하였다. 제 3(C)도에서 보듯이 NPR 효소가 존재하는 재구성된 P450 시스템에서는 구리 2가 이온에 의해서 저해된 P450 활성이 EDTA에 의해서 회복되지 않았다. 이는 각각의 활성은 독립적으로 회복될 수는 있지만, 이러한 복구는 불완전한 것으로 NPR과 P450이 서로 상호작용을 하지는 못하는 것을 의미한다. 즉, 구리 2가 이온에 의한 마이크로좀과 같은 P450 시스템에서의 활성 저해는 비가역적인 것으로 생각된다.Based on the fact that NPR and P450 enzymes were inhibited by copper divalent ions, but partially restored by EDTA, we tested whether EDTA was restored by EDTA even in a reconstituted P450 system with NPR enzyme. . As shown in Figure 3 (C), in the reconstituted P450 system in which the NPR enzyme is present, P450 activity inhibited by copper divalent ions was not recovered by EDTA. This means that each activity can be restored independently, but this recovery is incomplete, meaning that NPR and P450 do not interact with each other. In other words, inhibition of activity in P450 systems such as microsomes by copper divalent ions is thought to be irreversible.
이상에서 설명하였듯이, 본 발명은 구리 2가 이온을 유효 성분으로 포함하는시토크롬 P450 효소 및 NADPH-시토크롬 P450 환원효소의 활성 저해제, 혹은 이를 이용하여 단백질 수준에서 시토크롬 P450 효소 및 NADPH-시토크롬 P450 환원효소의 활성을 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명의 활성 저해제 혹은 저해 방법은 NADPH-시토크롬 P450 환원효소와 모든 종류의 P450 활성을 동시에 저해한다.As described above, the present invention is an activity inhibitor of cytochrome P450 enzyme and NADPH-cytochrome P450 reductase comprising copper divalent ions as an active ingredient, or at the protein level of cytochrome P450 enzyme and NADPH-cytochrome P450 reductase. Provided are methods for inhibiting activity. The activity inhibitor or inhibition method of the present invention simultaneously inhibits NADPH-cytochrome P450 reductase and all kinds of P450 activity.
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| KR20160139781A (en) | 2015-05-28 | 2016-12-07 | 한국과학기술연구원 | Multiplex cytochrome p450 isoenzyme assay |
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2002
- 2002-06-19 KR KR1020020034212A patent/KR20030097059A/en not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
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| Biochem. Pharmacol. 35(17), 1986, 2903-2909 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160139781A (en) | 2015-05-28 | 2016-12-07 | 한국과학기술연구원 | Multiplex cytochrome p450 isoenzyme assay |
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