KR20030094519A

KR20030094519A - 올리고뉴클레오티드칩을 이용한 생태계 기능군집 미생물의분석방법, 올리고뉴클레오티드칩 및 올리고뉴클레오티드의염기서열

Info

Publication number: KR20030094519A
Application number: KR1020020027659A
Authority: KR
Inventors: 김성천; 이동훈; 장덕진; 이규호; 박정재; 김성민; 박경제; 임재규; 이현경; 김혜령; 안난희
Original assignee: 제노프라 주식회사; 김성천; 이동훈; 장덕진; 이규호
Priority date: 2002-05-20
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2003-12-18

Abstract

본 발명은 미생물의 유전정보를 이용하여 제작된 올리고뉴클레오티드칩 이용하여 생태계 시료에 존재하는 기능군집 미생물의 유전자 발현 양상을 분석하여 특정 미생물군의 생태 및 생화학적인 특징을 탐색 및 분석하는 방법, 상기 분석방법에 이용되는 올리고뉴클레오티드칩 및 상기 올리고뉴클레오티드의 염기서열에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 생태계에 존재하는 각종 물질을 분해하는 미생물들에서 상기 미생물들의 분해작용에 관여하는 효소에 대응하는 유전자와 상보적으로 결합하는 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드들을 포착프로브로서 제작하는 단계; 상기 포착프로브로서의 상기 올리고뉴클레오티드들을 슬라이드에 정렬 및 부착하여 올리고뉴클레오티드칩을 제작하는 단계; 생태계로부터 시료를 취득하여 상기 시료에 포함된 미생물들에 함유된 RNA를 표지시킴으로써 표적프로브 시료용액을 제작하고, 상기 표적프로브 시료용액과 혼성화 용액의 혼합물로 올리고뉴클레오티드칩을 처리하여 혼성화시키는 단계; 및 혼성화시킨 상기 올리고뉴클레오티드칩을 세척, 원심분리 및 건조하여 그 표지를 검출함으로써 상기 시료에 존재하는 목적하는 미생물들을 탐색 및 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드칩을 이용한 생태계 기능군집 미생물의 분석방법이 제공된다.

Description

올리고뉴클레오티드칩을 이용한 생태계 기능군집 미생물의 분석방법, 올리고뉴클레오티드칩 및 올리고뉴클레오티드의 염기서열{Method for Assaying Functional Population Microorganism in Ecosystem, Oligonucleotide Chip and Base Sequence of Oligonucleotide}

(기술분야)

본 발명은 미생물의 유전정보를 이용하여 제작된 올리고뉴클레오티드칩 이용하여 생태계 시료에 존재하는 기능군집(Functional Population) 미생물의 유전자 발현 양상을 분석하여 특정 미생물군의 생태 및 생화학적인 특징을 탐색 및 분석하는 방법, 상기 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드칩 및 상기 올리고뉴클레오티드의 염기서열에 관한 것이다.

(배경기술)

현대 산업 사회에 있어서의 환경오염방지 및 그 해소 문제는 쾌적한 생활을 영유하기 위한 선택적 조건이 아니라 인류 생존의 필요조건이며 산업의 발달과 더불어 환경에 대한 인식이 높아짐으로 해서 수계, 토양오염에 대한 문제점들이 많이 노출되고 있다.

현대사회의 산업화는 인류에게 많은 물질적 풍요를 주지만, 반면에 이에 상응하는 심각한 대기, 토양, 수질환경 오염을 가져왔다. 현재 우리나라에 등록된 화학물질의 수는 약 3만종에 이르고 있으며, 선진국의 경우 6만종이 넘는 화학물질이 사용되고 있는 실정이다. 세계보건기구(WHO)에 의하면 수계에는 2,000여종의 화학물질이 존재하며, 음용수 중에는 600종 이상의 유기물질을 비롯하여 여러 종의 발암물질이나 발암유발물질, 돌연변이성을 나타내는 물질들을 포함하여 약 750종의 화학물질이 검출되었다고 보고하고 있다.

생태계는 환경에 노출된 독성물질을 미생물, 식물, 동물을 이용하여 전환(transform), 분해(degrade), 또는 고정(immobilize)등 순서로 독성을 감소시키거나 제거하는 생물정화를 수행하고 있다. 그러나 종래에는 오염문제에 대하여 피상적 거시지표인 BOD, COD, DO 등에만 집착하여 왔다고 할 수 있다.

생태계에서 미생물은 오염원을 광물화시키고 그 결과물이 다시 일차생산에 이용 가능하도록 물질 순환작용을 주도하는 주체적인 역할하고 있어 미생물 군집의 다양성 분석에 대한 근본적인 접근방법이 요구되고 있는 실정이다. 따라서 생태계에 존재하는 특수한 기능을 보이는 기능군집(Functional Population)의 미생물에 대한 생태 및 생화학적인 특징을 탐색하는 방법에 대한 필요성이 매우 높다.

최근에 수계 및 토양오염에 대한 체계적인 연구가 활발히 진행되어 수계 및 토양의 경우 화학물질 및 유기물질의 오염정도가 보고되고 있으나 이들을 분해하는 미생물에 대한 연구는 미진한 상황이다.

식물이나 동물 군집은 군집 크기가 비교적 작아 전체 군집을 파악할 수 있으며, 군집분석방법으로서 형태적 특징에 따른 분류하고 있다. 그러나 미생물은 형태적으로 매우 단순하여 구분이 힘들기 때문에 분류는 주로 생리적, 생화학적 특성에 의존하고 있으며, 각 분류군의 분포는 가시적 플레이트 계수법(viable plate count technique)과 최적 확수법(most-probable-number technique)을 이용하고 있으나, 실제로 생태계 전체에 존재하는 모든 미생물들을 배양하고 동정하는 것은 불가능하다.

19세기 초반 Winogradsky와 Beijerinick에 의해 개발되어진 증균배양기술은 자연 미생물 생태계의 복잡성의 일부분을 일깨워주고 환경 순환의 화학적 근거를 특수 미생물의 활성으로 돌릴 수 있는 방법을 제시해주었다. 실제 환경 생태계에서 분리 배양할 수 있는 미생물은 약 5,000여종 내외이며, 배양이 가능한 세균을 기초로 하여 미생물 생리학적인 연구결과는 극히 제한적인 정보만을 제공하였다.

이러한 제한점을 극복하고 실제 환경과 근접한 세균 군집의 구조와 다양성을 이해하기 위하여 분자생물학적 방법을 많이 응용하고 있다. 이러한 분야는 주로 16S rDNA 유전자의 염기서열 결정과 분석이며, 시료에서 직접 추출된 핵산뿐만이아니라 다양한 수계 생태계에서 분리 배양된 균주의 16S rDNA 염기서열을 계통분류학적으로 분석함으로써 동정과 이를 응용한 연구가 진행되고 있다.

이러한 분석방법은 과거 전통적인 배양기술의 제한성을 충분히 해결할 수 있으며 미생물 군집의 변화와 다른 환경요인의 영향을 배제한 상태에서 유전자형 수준(genotypic level)으로 정확한 미생물 군집구조를 분석할 수 있다. 최근 미생물의 방대한 유전정보를 이용하여 미생물 다양성 조사뿐만이 아니라 미생물 생리,생화학적 분석도 가능하게 되었다.

분자생물학의 비약적인 발전에 힘입어 최근에 개발한 새로운 기술은 복잡한 미생물 군집의 개체군 역학관계의 조사 등에 상당한 가능성을 제시하고 있다. 이 기술들은 근본적으로 배양 없이 바로 환경으로부터 추출한 핵산에 대한 연구로서, 이상적인 경우 모든 각 생명체는 명확하게 구분되어지는 DNA 염기서열로 표기 및 분류할 수 있다는 사실에 기초하고 있다. 따라서 특별한 형태의 개체군은 곧 동정되어지며 이러한 기술들은 많은 시료에 대해 고속으로 모니터링을 할 수 있는 수단을 제공하고 있다.

많은 이런 기술들은 민감도 및 처리속도는 PCR(polymerase chain reaction)에 기초하고 있다. 최근까지는 상기에 기술한 기술 즉, PCR 산물들의 제한효소에 의한 단편의 길이의 차이(ARDRA(amplified ribosomal DNA restriction endonuclease analysis))를 분석하거나, DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)와 같은 기술에 의해 DNA 단편의 길이는 같지만 염기서열이 다른 단편들을 분간하는 등의 방법을 주로 사용하였다.

그러나, 이들 기술은 생태계에서 소규모의 분석은 가능하나 실제적인 생태계의 다양성에는 근접할 수 없다. 자연 생태계는 생산자, 소비자, 분해자라는 먹이사슬 관계가 성립되어 이들 관계가 유기적으로 상호 보완된 상태를 유지하고 있다. 이러한 자연 생태계의 기능 중 생산자와 분해자 역할을 동시에 수행하는 미생물을 제어하기 위해서는 미생물 생태학적인 조사를 통한 군집분포와 생화학적 역할 설정에 대한 연구가 필수적이라고 할 수 있다.

최근에 사용되는 기술은 분석할 수 있는 유전정보의 범위, 군집 내 종수 및 자동화 등에 문제점 등을 극복할 수 있는 방법으로 특정한 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드가 배열된 올리고뉴클레오티드칩이 개발되고 있다. 올리고뉴클레오티드칩 기술은 상기 기술들이 제공하는 기능뿐만이 아니라 대량 고속으로 시료내 생물의 유전자발현 양상을 분석하여 생리-생화학적인 특징을 탐색하는 것이 가능하다.

수계 및 토양 생태계에 서식하는 미생물의 유전정보를 확보하여 미생물의 생화학적인 특징을 표시하는 유전자를 선정하고 이를 지시하는 염기서열을 분석하여 생물학적 표지(biomarker)로 사용할 수 있는 20 내지 80여 개의 염기서열을 결정한 후, 이를 유리슬라이드 등에 부착시켜 단시간에 대량의 시료로부터 수천 단위 이상 유전정보를 탐색하는 방법을 사용하는 것이다.

지금까지는 미생물의 유기물질 및 화학물질 등의 분해에 관련된 주요 효소를 지시하는 유전자의 발현정도를 측정하여 생태계에서 이들 미생물의 생태적 지위 및 생화학적인 특징을 연구하는 시도가 소규모로 수행되어 왔다. 이렇게 얻어진 생물학적 정보를 이용하여 생물정화에 활용할 수 있는 미생물 균주를 찾아내고 또한 이균주의 생태를 모니터링 하는데 활용하고 있다. 그러나 이런 소규모의 개별적인 분자생태학적인 조사는 실제 생태계에 근접한 미생물 군집 구조를 이해할 수 없어 새로운 기술개발의 필요성이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은, 올리고뉴클레오티드칩 기술로 생태계에서 각종 물질의 분해에 분해에 관련된 미생물의 유전정보를 분석하여 수계 및 토양 생태계 내에서 특정 미생물군의 생태학적 및 생화학적 특성을 분석하는 방법을 제시하여 수계 및 토양생태계의 생물정화에 이용할 수 있도록 하고자 하는 것이다.

본 발명의 목적은, 미생물의 유전정보를 이용하여 생태계내의 생태 및 생리적인 특징을 분석할 수 있는, 유전자의 염기서열 및 슬라이드 등을 이용하여 제작된 올리고뉴클레오티드칩으로 생태계에서의 미생물 기능군집의 특징을 분석하는 방법의 기초를 제공하고자 하는 것이다.

도1은 리파제 관련 유전자들의 상동성 정도에 따라 얻어진 계통도,

도2는 리파제 관련 유전자들의 아미노산 서열의 상동성을 보여주는 도면,

도3은 표8의 올리고뉴클레오티드들로 된 올리고뉴클레오티드칩의 배열도,

도4는 도3의 올리고뉴클레오티드칩을 표적프로브와 혼성화시킨 후 얻은 형광사진도면.

본 발명에 따라, 미생물의 유전정보를 기초로 하여 결정된 염기서열로 제작된 포착프로브로서의 올리고뉴클레오티드와, 형광이 표지된 표적프로브로서의 시료 DNA의 혼성화를 통해 시료내의 기능군집의 미생물의 유전정보를 분석하고 이로부터 생태계 내에서의 기능군집 미생물의 생태 및 특징을 분석하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따라, 생태계에 존재하는 각종 물질을 분해하는 미생물들에서 상기 미생물들의 분해작용에 관여하는 효소에 대응하는 유전자와 상보적으로 결합하는 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드들을 포착프로브로서 제작하는 단계; 상기 포착프로브로서의 상기 올리고뉴클레오티드들을 슬라이드에 정렬 및 부착하여 올리고뉴클레오티드칩을 제작하는 단계; 생태계로부터 시료를 취득하여 상기 시료에 포함된 미생물들에 함유된 RNA를 표지시킴으로써 표적프로브 시료용액을 제작하고, 상기 표적프로브 시료용액과 혼성화 용액의 혼합물로 올리고뉴클레오티드칩을 처리하여 혼성화시키는 단계; 및 혼성화시킨 상기 올리고뉴클레오티드칩을 세척, 원심분리 및 건조하여 그 표지를 검출함으로써 상기 시료에 존재하는 목적하는 미생물들을 탐색 및 분석하는 단계; 를 포함하는, 올리고뉴클레오티드칩을 이용한 생태계 기능군집 미생물의 분석방법이 제공된다.

본 발명에 따라, 생태계에 존재하는 각종 물질을 분해하는 미생물들에서 상기 미생물들의 분해작용에 관여하는 효소에 대응하는 RNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 구비하는 올리고뉴클레오티드들을 슬라이드에 부착한 것을 특징으로 하는, 생태계 기능군집 미생물의 분석을 위한 올리고뉴클레오티드칩이 제공된다.

본 발명에 따라, 미생물에 존재하는 톨루엔-2-모노옥시게나제, 톨루엔-3-모노옥시게나제, 톨루엔-4-모노옥시게나제, 톨루엔디옥시게나제 효소, 벤질숙신산 합성효소(Benzylsuccinate synthase), 페놀히드록시라제(Phenol hydroxylase), 클로로벤젠 디옥시게나제(Chlorobenzene dioxygenase), 벤조산-4-모노옥시게나제(Benzoate-4-mono oxygenase), 에틸벤젠 디옥시게나제(Etylbenzene dioxygenase), 질산환원효소 및 아질산환원효소에 밀접하게 관련된 RNA와 각각 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호1 내지 서열번호32의 올리고뉴클레오티드의 염기서열이 제공된다.

바람직하게 상기 물질은 오염된 환경에서 증가되는 각종 유기물과 중금속을 포함하는 오염물질이다.

바람직하게 상기 슬라이드로는 유리슬라이드가 사용되고, 상기 표적프로브에는 그 표지로서 형광을 표지하며, 상기 혼성화시킨 상기 슬라이드는 포착프로브와 표적 프로브의 하이브리드의 Tm값을 고려한 37℃ 내외에서 세척한다.

본 발명에 있어서, 상기 물질들을 분해하는데 결정적인 역할을 하는 효소를 지시하는 유전자는 NCBI에서 조사하고 각 기질마다 서열이 알려진 효소를 서브유닛 별로 나누어서 유사유전자(homologous genes)를 결정한 후, 이들을 Clustal X 프로그램으로 정렬하고 혼성화조건 및 세척조건 등을 고려하여 프로브로 사용할 적당한 DNA 염기서열을 확보할 수 있다.

결정된 염기서열로 올리고뉴클레오티드를 제작하여 포착프로브로서 이 뉴클레오티드가 부착된 슬라이드(올리고뉴클레오티드칩)를 제조함에 있어서, 포착프로브가 슬라이드 표면에 부착할 때 발생하는 문제를 고려하여 스페이저인 5'-region에 T(Thymine)₁₀을 첨가된 프로브를 디자인하여 뉴클레오티드를 합성하고 5'-region을 아민 그룹으로 변형을 시킨다. 다음에 뉴클레오티드를 HPLC로 정제한다. 그리고 합성된 뉴클레오티드를 용매에 녹여 미크로어레이어를 이용하여 화학적으로 처리된 슬라이드에 스포팅하고 이를 변형 및 건조하는 방법 등 공지된 방법에 의해 뉴클레오티드 칩으로 제작할 수 있다.

상기 혼성화는 포착프로브의 슬라이드에 표지된 표적프로브 용액과 혼성화용액을 혼합하여 처리함으로써 실행한다.

혼성화 처리된 슬라이드는 워시버퍼로의 세척, 원심분리 및 건조처리를 한 후에 그 표지를 분석하여 혼성화 정도를 정량적으로 확인함으로써 시료내 특정미생물의 유전자 발현 양상을 비교, 분석할 수 있고, 따라서 특정미생물의 시료내의 생태적 및 생화학적인 특징을 탐색할 수 있게 된다.

본 발명에서 상기 표지로 사용된 형광의 정도는 포착프로브에 형광 표지된 표적프로브의 결합정도에 따라 다르게 표시된다. 포착프로브와 표적프로브의 결합정도에 의한 형광정도를 사용하여 시료내 표적프로브의 정량분석이 가능하며, 따라서 본 발명에 의하면 시료내 특정한 미생물의 기능성 유전자의 발현 양상을 분석할 수 있다. 즉, 특정한 미생물의 기능성 유전자의 발현 양상은 시료내 표적프로브의 양에 영향을 주고 이는 포착프로브와 표적프로브의 이중가닥 정도를 결정하여 형광정도에 영향을 준다. 따라서 형광정도를 분석하면 시료내 특정미생물의 기능유전자의 발현양상을 확인할 수 있게 된다.

본 발명에 따르면 간단하고 저렴한 비용으로 다양한 시료에서 짧은 시간 내에 특정 생태계에서의 특정미생물의 생태 및 생화학적인 특징을 탐색하고 분석할 수 있다.

이하, 실시예와 첨부도면을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

실시예1: 포착프로브의 제작

각종 물질을 분해하는 미생물을 검출할 수 있는 포착프로브로서의 (올리고)뉴클레오티드들을 제작한다. 먼저, 수계 및 토양 생태계에서 주요 BOD 유발물질인 다양한 유기물, 중금속, 방향족 화합물을 분해하는 미생물들에서 이들을 분해하는 것에 결정적인 역할을 하는 효소를 지시하는 유전자들(아래의 표1 내지 표6에 리스트된 유전자들 참조)을 NCBI(National Center for Biotechnology Information; 인터넷사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 참조)에서 조사하고 각 기질마다 서열이 알려진 효소를 서브유닛 별로 나누어서 유사유전자(homologous genes)를 결정한 후, 이들을 Clustal X 프로그램으로 정렬하고 혼성화조건 및 세척조건 등을 고려하여 프로브로 사용할 적당한 DNA 염기서열을 확보하였다.

1. 탄수화물(전분 및 셀룰로스) 분해 유전자

균주명

유전자명

Amylase 계열 1. Listeria monocytogenes strain EGD2. Listeria innocua Clip112623. Salmonella enterica subsp. entericaserovar Typhi4. Thermotoga maritime5. Bacillus halodurans6. Salmonella enterica serovar Typhi(Salmonella typhi) strain CT1811. Escherichia coli O157:H7 EDL93312. Escherichia coli K1213. Streptococcus pyogenes14. Mesorhizobium loti15. Mycobacterium leprae strain TN16. Yersinia pestis strain CO9217. Bacillus subtilis18. Lactococcus lactis subsp. Lactis19. Streptococcus pneumoniae R620. Yersinia pestis strain CO9224. Sulfolobus solfataricus25. Clostridium acetobutylicum ATCC82426. Agrobacterium tumefaciens strain C5827. Mycobacterium tuberculosis CDC155128. Vibrio cholerae chromosome II29. Arabidopsis thaliana30. Streptomyces coelicolor cosmidBAC17A631. Actinoplanes sp32. Streptococcus pyogenes strain SF370serotype M133. Streptomyces coelicolor cosmid 6A1134. Mesorhizobium loti35. Streptomyces coelicolor cosmidBAC1A6

1) lmo21261) lin22311) amyA 2) malS1) TM1650 2) TM18401) BH0413 2) BH15163) BH2927 4) BH30071) amyA 2) malS1) amyA 2) malS1) mlr1020 2) mlr4205 3) mlr56081) glgX 2) malS 3) mal Z1) amyA1) amyL 2) amyY 3) ecsB 4) ecsA1) SSO0988 2) SSO0990 3) SSO24731) CAC2252 2) CAC28101) AGR_L_18631) MT0134 2) MT1369 3) MT25471) VCA0250 2) VCA08601) At5g01260 2) At5g186703) At5g45300 4) At5g557001) adoE1) peplA1) mlr56081) scBAC1A6.02C 2) scBAC1A6.05C

균주명

유전자명

36. Lactococcus lactis subsp. lactis IL140337. Escherichia coli O157:H738. Bacillus subtilis39. Streptomyces coelicolor cosmid 10B740. Streptomyces coelicolor cosmid 1H1041. Bacillus sp. KYJ963 e42. Escherichia coli K-12 MG165543. Paenibacillus polymyxa44. Streptococcus bovis gene for lpha-amylase45. Bacillus subtilis46. Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes47. B. subtilis1) a-amylase precursor48. Aeromonas hydrophila49. Aeromonas hydrophila

1) amy1) SC10B7.21c 2) aglA1) aml 2) amlB1) amyB 2)amyE 3) amyD4) amyC 5)amyA1) a-amylase precursor1) amylase precursor1) amyA

균주명

유전자명

CELLULASE 계열 1. Mesorhizobium loti2. Sulfolobus solfataricus3. Clostridium acetobutylicum ATCC8244. Mycobacterium tuberculosis CDC15515. Mycobacterium tuberculosis H37Rv6. Arabidopsis thalianA7. Salmonella typhimurium8. Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus9. Streptomyces coelicolor cosmid E2010.11. Streptomyces coelicolor cosmid 10F412. Streptomyces coelicolor cosmid 5F113. Streptomyces coelicolor cosmid G2214. Streptomyces coelicolor cosmid F1115. C. stercorarium16. Erwinia chrysanthemi17. B. subitilis

1) mlr0199 2) mlr2086 3) mlr38931) cel B1) CAC0561 2) CAC0915 3) CAC35461) MT0067 2) MT11221) cel A 2) Rv10921) A65g16700+ 2) At5g49720+1) bcsZ1) celA1) SCE 20.12C1) aepH+ 2)aepA1) SC10F4.10c1) SC5F1.371) SCG22.07c1) SCF11.34c1) bglZ1) celZ1) Pbag10

2. 단백질분해 유전자

균주명

유전자명

1. Listeria monocytogenes strain EGD2. Listeria innocua Clip112623. Salmonella enterica subsp. entericaserovar Typhi4. Burkholderia pseudomallei5. Thermotoga maritima6. Vibrio cholerae7. Bacillus halodurans8. Salmonella enterica serovar Typhi(Salmonella typhi) strain CT1818. Escherichia coli O157:H7 EDL93319. Escherichia coli K1220. Listeria innocua Clip1126221. Streptococcus pyogenes22. Mesorhizobium loti23. Synechocystis sp. PCC 680324. Sinorhizobium meliloti plasmid pSymA25. Staphylococcus aureus subsp.aureus N315

1) lmo0292 2) lmo0960 3) lmo09614) clpE 5) clpY 6) lmo13927) lmo1393 8) lmo1585 9) lmo20771) lin0320 2) lin0959 3) lin09604) clpE 5) clpY 6) lin14291) lon 2)sppA 3) pgtE 4) degQ5) degS1) TM0571 2) TM07473) TM1633 4) TM18691) VC0157 2) VC0554 3) VC0565(P)4) VC0566(P) 5) VC1496(T)6) VC1709(M) 7) VC1920(A)1) alp(K) 2) apr(K) 3) vpr(S)4) BH0855(K) 5) BH1273(P)6) BH1274(P) 7) gpr(R)8) BH1491(P) 9) clpY(A)10) spoIIGA(P) 11) spoIVFB(P)12) BH3763(S) 13) BH4022(S)) htrA(S) 2) lon(A) 3) spp(A)4) prc(C) 5) ptrB(P) 6)ptr(P)7) degQ(S) 8)degS(S)1) htrA(S) 2) lon(A) 3) sppA4) prc(C) 5) ptr(P) 6) ptr(P)7) degQ(S) 8) degS(S)1)mll2416(S) 2)mlr2417(S)3)mlr3201(P) 4)mll3882(M)5)mlr4000(C) 6)mll5022(S)7)mll5116(P) 8)mlr6132(S)9)mlr7692(S) 10)mlr8255(P)11)mlr8256(P) 12)mlr8476(A)1) ctpB(C) 2) hhA(S) 3) htrA(S)4) prc(C) 5)sppA(P) 6)hhoB(S)7)pggE(p) 8)sppA(P) 9) clpP(A)1) degP4(S)1) htrA(S) 2)sspA(S) 3) clpX(A)4) splF(S) 5) splD(S) 6) splC(S)7) splB(S) 8) splA(S)

균주명

유전자명

26. Staphylococcus aureus strain Mu5027. Mycobacterium leprae strain TN28. Yersinia pestis strain CO9229. Bacillus subtilis30. Lactococcus lactis subsp. Lactis31. Streptococcus pneumoniae R632. Xylella fastidiosa 9a5c33. Yersinia pestis strain CO9244. Sulfolobus solfataricus45. Clostridium acetobutylicum ATCC82446. Agrobacterium tumefaciens strain C5847. Mycobacterium tuberculosis CDC155148. Deinococcus radiodurans R149. Deinococcus radiodurans R150. Neisseria meningitidis serogroup Astrain Z2491

1) htrA(S) 2)sspA(S) 3) clpX(A)4) splF(S) 5) splD(S) 6) splC(S)7) splB(S) 8) splA(S)1) sppA(P) 2) ptrB(P)1) sppA(P) 2) lon(A) 3) degQ(S)4) degS(S) 5) YPD3973(m)1) mer(M) 2) aprE(K) 3) nprB(P)4) htrA(S) 5) nprE(M) 6) spoIIGA(P)7)aprX(K) 8) gpr(R) 9) sppIIFB(P)10) lonA 11) vpr(S) 12) epr(S)1) clpX(A) 2) yueE(P) 3) yueF(P)4) yugD(P) 5) yuhB(p) 6) htrA(S)1) zmpB(M) 2) clpE(A) 3) iga(I)4) ptrB(P) 5) spr1284(p)6) sphtra(S)1) XF0156(Y) 2) XF0267(S)3)XF0452(P) 4) XF0816(M)5)XF1026(S) 6) XF1823(T)7) XF1851(S) 8) XF2241(P)9)XF2685(P) 10) XF2704(C)1) SSO2045(P) 2)SSO2098(P)3) SSO2612(S)1) lonA(A) 2) CAC0463(S)3) CAC0499(C) 4) CAC0746(M)5) CAC0955(A) 6) CAC1275(R)7) CAC1654(M) 8) CAC2135(S)9) nprE(M) 10)CAC2433(S)11) nrpE(M) 12) CAC2518(M)13) lonA(A) 14) ftsH1) MT0749 2) MT0805 3) MT18454) MT3555 5) MT37721) DRA0064 2) DRA0283 3) DRA03411) DR0349 2) DR0812 3) DR11994) DR1459 5) DR1536 6) DR19377) DR19741) iga(I)

균주명

유전자명

51. Campylobacter jejuni52. Deinococcus radioduransplasmid MP153. Mycobacterium tuberculosis H37Rv54. Vibrio cholerae55. Aquifex aeolicus56. Arabidopsis thaliana57. Sinorhizobium meliloti plasmid pSymA58. Erwinia carotovora subsp.59. Mycobacterium tuberculosis H37Rv60. Mycobacterium tuberculosis H37Rv61. Synechocystis sp. PCC 680362. Alteromonas sp. AS1163. Staphylococcus aureus subsp.aureus N31565. Streptococcus pyogenes69. Streptococcus pyogenes M1 GASstrain SF37070. Staphylococcus aureus subsp.aureus Mu5099. Mesorhizobium loti plasmid pMLa100. Mesorhizobium loti101. Bacillus stearothermophilus102. Mesorhizobium loti plasmid pMLa103. Lactococcus lactis subsp. lactisIL1403104. Escherichia coli O157:H7105. Pseudomonas brassicacearum107. Mycobacterium leprae strain TN110. Streptomyces coelicolorcosmid 10F4111. Shigella flexneri virulence plasmidpWR100112. Bacillus pseudofirmus OF4113. Bacillus halodurans116. Deinococcus radiodurans R1megaplasmid MP1117. Escherichia coli plasmid pO157118. Neisseria meningitidis serogroup Astrain 22491122. Zymomonas mobilis strain ZM4fosmid 44B6

1) papA 2) lon 3) htrA1) drb00691) VCA0063 2) VCA0223 3) VCA08651) lon 2) sms 3) pfpI 4) prc5) clpC 6) htrA 7) npr 8) aprV1) prtW1) apa265. Streptococcus pyogenes1) clpX 2) splF 3) splD 4) splC5) splB 6) splA1) spn31) icsP 2) sepA1) DRB00691) espP

단백질분해 유전자

균주명

유전자명

123. Campylobacter jejuni NCTC11168124. Campylobacter jejuni NCTC11168125. Streptomyces coelicolor cosmid2/G61126. Streptomyces coelicolor cosmid8E4A127. Streptomyces coelicolor cosmid E59128. Streptomyces coelicolor cosmid C24129. Aeromonas sobria130. Streptomyces coelicolor cosmid6D11131. Streptomyces lividans132. Bacillus brevis133. Streptomyces albogriseolus134. T. aquaticus aquI135. Bacillus cereus136. Vibrio metschnikovii137. Escherichia coli K-12 MG1655138. Deinococcus radiodurans R1139. Pseudomonas fluorescens140. Haemophilus influenzae141. Streptomyces coelicolor cosmid 51A142. Aeromonas caviae143. Dichelobacter nodosus144. Streptomyces coelicolor cosmid I11145. Bacillus subtilis146. Aeromonas hydrophila147. Azospirillum sp.148. Streptomyces lividans149. Escherichia coli plasmid pO157150. Streptomyces albogriseolus151. Shewanella sp. Ac10152. Pseudomonas tolaasii153. E. coli 8.6 kb DNA from plasmidp0157154. Pseudomonas fluorescens155. Streptomyces coelicolor cosmid 3C3

1) mprA21) aprAPF331) iga1) bpr1) SCI11.35c1) ahsp(S)1) espP(S)1) SC3C3.08

균주명

유전자명

156. Porphyromonas gingivalis157. Erwinia chrysanthemi158. Paenibacillus polymyxa159. Pseudomonas aeruginosa160. Aeromonas hydrophila161. Bacillus subtilis167. Vibrio cholerae168. Bacillus subtilis169. Serratia (sp. E-15)170. N. meningitidis172. Neisseria gonorrhoeae175. E. chrysanthemi176. X. campestris177. V. metschnikovii178. Bacillus amyloliquefaciens179. Dichelobacter nodosus181. V.parahaemolyticus182. Dichelobacter nodosus183. Vibrio cholerae184. Lactococcus lactis185. V. proteolyticus186. Streptococcus pyogenes194. Streptomyces lividans195. Serratia marcescens196. E. carotovora197. B. subtilis198. Bacillus natto199. B. licheniformis200. B. subtillis201. Bacillus cereus202. B. subtilis204. B. amyloliquefaciens205. Dichelobacter nodosus

1) npr1) eprAI1) prtV1) vapT1) aprV21) bprB1) tcpJ1) snpA1) prt1) vpr1) nprB1) NPRC1) aprV5

3. 지질분해 유전자

균주명

유전자명

1. Listeria monocytogenes strain EGD2. Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi3. Thermotoga maritima4. Vibrio cholerae5. Bacillus halodurans8. Salmonella enterica serovar Typhi(Salmonella typhi) strain CT1810. Escherichia coli O157:H7 EDL93311. Escherichia coli K1212. Mesorhizobium loti13. Bacillus licheniformis14. Bacillus licheniformis15. Staphylococcus aureus subsp.aureus N31516. Staphylococcus aureus strain Mu5017. Mycobacterium leprae strain TN18. Yersinia pestis strain CO9219. Bacillus subtilis20. Lactococcus lactis subsp. Lactis21. Xylella fastidiosa 9a5c22. Yersinia pestis strain CO9227. Sulfolobus solfataricus28. Clostridium acetobutylicum ATCC82429. Agrobacterium tumefaciens strain C5830. Mycobacterium tuberculosis CDC155131. Deinococcus radiodurans R132. Neisseria meningitidis serogroup Astrain Z249133. Mycobacterium tuberculosis H37Rv34. Vibrio cholerae35. Arabidopsis thaliana

1) lmo0110 2) lmo20893) plcA 4) plc B1) STY3846 2) ybfF3) ybhO 4) pldB 5) pldA1) TM13501) VC0135 2) VC20971) BH2248 2) BH32881) STY38461) ybaC 2) yhjY 3) pldA 4)pldB1) ybaC 2) yhjY 3) yiaL 4)pldA1) mll4497 2) mlr30341) SA06101) SAV06551) yplA 2) pldB 3) pldA1) lipA 2) lipB1) yscE1) XF12531) lip-1 2) lip-21) CAC1658 2) CAC22461) AGR_C_423 2) AGR_C_45031) MT0192 2) MT02273) MT1444 4) MT17995) MT2414 6) MT24157) MT2416 8) MT30481) DR0334 2) DR08213) DR1537 4) DR15375) DR2078 6) DR25221) VCA0221 2) VCA04903) VCA0754 4) VCA0863

균주명

유전자명

36. Streptomyces rimosus37. Staphylococcus aureus subsp. aureus N31538. Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu5039. Lactococcus lactis subsp. lactis IL140340. Escherichia coli O157:H741. Pseudomonas brassicacearum42. Mycobacterium leprae strain TN43. Mycobacterium leprae strain TN44. Neisseria meningitidis serogroup A strain Z249145. Pseudomonas chlororaphis46. Aeromonas hydrophila, H347. Escherichia coli K-12 MG165548. Pseudomonas fluorescens49. Pseudomonas aeruginosa50. Streptomyces coelicolor51. Streptomyces coelicolor cosmid 6E1052. Streptomyces coelicolor cosmid I1153. Serratia marcescens54. Bacillus subtilisillus subtilis56. Streptomyces cinnamoneus57. Vibrio cholerae58. P. acnes59. Serratia marcescens60. Pseudomonas wisconsinensis61. Aeromonas hydrophila62. Streptomyces sp.63. P. aeruginosa64. P. aeruginosa65. A. calcoaceticus66. Serratia marcescens SM6

1) SA06101) lipA1) lipN1) lip1) lipAPF331) lipC1) lipA1) SCI11.24c1) lipB1) lipA1) lipA1) lipA1) lipA1) lpwA1) lip1) lipA1) lipH1) lipA1) lipB1) lipA

4. 핵산분해 유전자(dNase)

균주명	유전자명
1.Escherichia coli O157:H7 EDL9332.Escherichia coli K123.Streptococcus pyogenes4.Lactococcus lactis subsp. Lactis5.Clostridium acetobutylicum ATCC8246.Streptococcus pyogenes strain S.F370 serotype M17.Lactococcus lactis subsp. lactis IL14038.Escherichia coli O157:H79.Vibrio cholerae10.Aeromonas hydrophila	1) Z60471) tatD 2)yjjV1) mf21) ybfB1) CAC2754 2) recD1) mf21) ybfB1) Z60471) dns

5. 수은 관련 유전자

균주명

유전자명

1. Yersinia pseudotuberculosis strain 9314/742. Salmonella enterica serovar Typhi(Salmonellatyphi) strain CT18 plasmid pHCM13. Neisseria meningitidis serogroup B strain MC584. Streptococcus pyogenes5. Mesorhizobium loti6. Escherichia coli partial transposon Tn50577. Escherichia coli partial transposon Tn50578. Pseudomonas putida partial transposonTn5053v49. Pseudomonas putida partial transposonTn5053v410. Enterobacter sp. CH2-4 transposon Tn5057v111. Mycobacterium leprae strain TN12. Klebsiella sp. LS13-39 partial transposonTn505613. Klebsiella sp. LS13-39 partial transposonTn505614. Klebsiella sp. LS13-39 partial transposonTn505618. Esherichia coli partial transposon Tn505719. Esherichia coli partial transposon Tn505720. Esherichia coli partial transposon Tn505721. Esherichia coli partial transposon Tn505722. Klebsiella sp. LS13-39 partial transposonTn505623. Klebsiella sp. LS13-39 partial transposonTn505624. Klebsiella sp. LS13-39 partial transposonTn505625. Acinetobacter sp. plasmid pKLH20726. Acinetobacter sp. plasmid pKLH20727. Streptococcus pneumoniae R628. Sulfolobus solfataricus29. Mycobacterium tuberculosis CDC155130. Pseudomonas sp. transposon Tn5041

1) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA 6) merD7) merD 8) merA 9) merC1) NMB12711) mlr2769 2) mll52411) merA 2) merD1) merA1) merB21) merR21) merG 2) merB11) merD11) merB1 2) merD11) merR1) merA1) merR 2) merA1) merR 2) merI 3) merP4) merC 5) merA 6) merD

균주명

유전자명

31. Exiguobacterium sp. plasmid pKLH3partial transposon Tn508532. Bacillus cereus plasmid pKLH6,transposon Tn508433. Exiguobacterium sp. plasmid pKLH3partial transposon Tn508534. Pseudomonas sp. ADP atrazinecatabolic plasmid pADP-135. Mycobacterium tuberculosis H37Rv36. Yersinia pseudotuberculosis superantigen YPMc37. Streptococcus pneumoniae R638. Thiobacillus ferrooxidans transposon Tn503739. Yersinia pseudotuberculosis superantigenYPMa gene locus44. Mycobacterium tuberculosis H37Rv45. Bacillus cereus transposon Tn508446. Acinetobacter calcoaceticus KHP18 partialpKLH2 plasmid47. Exiguobacterium sp. plasmid pKLH3 partialtransposon Tn508548. Bacillus cereus plasmid pKLH6 partialtransposon Tn508449. Bacillus cereus plasmid pKLH6 partialtransposon Tn508450. Bacillus sphaericus plasmid pKLH30152. Bacillus megaterium strain MK64-1 plasmidpKLH30453. Bacillus megaterium plasmid pKLH30454. Streptococcus pyogenes strain SF370serotype M155. Streptococcus pyogenes M1 GASstrain SF37056. Acinetobacter sp. strain ED45-25, partialplasmid pKLH20557. Acinetobacter sp. strain ED45-25, partialpKLH20558. Acinetobacter sp. LS57-6 plasmid pKLH20459. Acinetobacter sp. LS56-7 plasmid pKLH20460. Mesorhizobium loti

1) merE 2) merD 3) merA4) merT 5) merP 6) merF7) merR1) merT1) merA1) merR 2) merT 3) merP4) merA 5) merD44. 1) merT1) merB3 2) merR1 3)merE4) merT 5) merP 6) merA7) merR2 8) merB2 9)merB11) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA 6) merD1) merA 2) merD1) merR 2) merT1) merR 2) merT1) mlr2769

균주명

유전자명

61. ycobam tuberculosis CDC155162. Shigella flexneri virulence plasmid pWR50163. Shigella flexneri large virulence plasmid pWR50164. Assembled sequence of transposon Tn2165. Pseudomonas putida partial mercuryresistance transposon Tn5041C66. Aeromonas hydrophila67. Acinetobacter calcoaceticus68. Mycobacterium leprae strain TN69. Xanthomonas sp. W17 mercury resistancetransposon Tn505370. Pseudomonas putida partial transposon Tn5041C71. Sphingomonas paucimobilis strain 660H72. Sphingomonas paucimobilis strain 660H73. Sphingomonas paucimobilis strain 661H74. Klebsiella oxytoca strain 722H75. Citrobacter koseri strain EPS22476. Sphingomonas paucimobilis strain 661H77. Pseudomonas aeruginosa strain 298B78. Pseudomonas sp. 39679. Pseudomonas sp. 317B80. Pseudomonas putida strain 394B81. Pseudomonas aeruginosa strain 260082. Stenotrophomonas maltophilia strain 687H83. Leclercia adecarboxylata strain 742H84. Escherichia coli strain 209A85. Comamonas testosteroni strain SE2386. Escherichia coli strain 1312A87. Citrobacter freundii strain 699H88. Escherichia coli strain 517H89. Escherichia coli strain 1349B90. Uncultured bacterium yo11

1) MT29451) merR 2) merA1) merE 2) merD 3) merA4) merC 5) merP 6)merT7) merR1) merR 2) merT 3) merP4) merF 5) merA 6) merD7) merE1) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA1) merR 2) merT3) merP 4) merA1) merP 2) merC 3) merA1) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA1) merP 2) merC 3) merA1) merP 2) merC 3) merA1) merT 2) merP 3) merA1) merT 2) merP 3) merA1) merP 2) merC 3) merA1) merT 2) merP3) merF 4) merA1) merT 2) merP3) merF 4) merA1) merT 2) merP3) merF 4) merA1) merP 2) merC 3) merA1) merP 2) merC 3) merA

균주명

유전자명

91. Uncultured bacterium yo1092. Uncultured bacterium yo993. Uncultured bacterium yo894. Uncultured bacterium yo795. Uncultured bacterium yo696. Uncultured bacterium yo597. Uncultured bacterium yo498. Uncultured bacterium yo399. Uncultured bacterium yo2100. Uncultured bacterium yo1101. Uncultured bacterium NAZ8102. Uncultured bacterium NAZ7103. Uncultured bacterium NAZ6104. Uncultured bacterium NAZ5105. Uncultured bacterium NAZ4106. Uncultured bacterium NAZ3107. Uncultured bacterium NAZ2108. Uncultured bacterium NAZ1109. Pseudoalteromonas haloplanktis110. Pseudomonas sp.111. Pseudomonas sp. BW13112. Bacillus macroides113. Bacillus licheniformis114. Bacillus sphaericus transposon Tn5082115. Bacillus megaterium partial transposon Tn5083116. Bacillus cereus partial transposon Tn5084117. Pseudomonas fluorescens strain TC29-5transposon Tn5041B118. Saltmarsh clone LCP-5119. Saltmarsh clone LCP-72120. Saltmarsh clone LCP-84121Saltmarsh clone LCP-6122Saltmarsh clone LCP-67123Saltmarsh clone LCP-79124Saltmarsh clone LCP-80125Saltmarsh clone LCP-68

1) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA 6) merD1) merR1 2) merT 3) merP4) merA 5) merE 6) merB17) merD1 8) merR2 9) merB210) merD21) merR 2) merT3) merP 4) merA1) merR 2) merA1) merR 2) merA

균주명

유전자명

126. Saltmarsh clone LCP-89127. Saltmarsh clone LCP-26128. Serratia marcescens129. Streptomyces coelicolor cosmid D10130. Neisseria meningitidis serogroup B strain MC58131. Shigella flexneri transposon Tn10132. Streptomyces sp. CHR28133. Xanthomonas campestris Tn5044134. Acinetobacter lwoffii NC7-1 partial mobilizableplasmid pKLH103135. Acinetobacter lwoffii NC7-1136. Acinetobacter lwoffii NC2-1137. Acinetobacter lwoffii NC2-1138. Acinetobacter lwoffii139. Acinetobacter lwoffii140. Acinetobacter lwoffii141. Acinetobacter calcoaceticus KHP18142. Acinetobacter calcoaceticus KHP18143. Bacillus cereus144. Bacillus megaterium145. Bacillus megaterium146. Streptomyces coelicolor cosmid M1147. Acinetobacter148. Acinetobacter149. Acinetobacter150. Bacillus sp. RC607151. Clostridium butyricum152. Clostridium butyricum153. Clostridium butyricum154. Pseudomonas fluorescens155. S. fradiae156. Amycolatopsis orientalis cosmid pCZA382157. Bacillus megaterium158. Bacillus megaterium159. Bacillus megaterium160. Streptomyces coelicolor cosmid I30A

1) merB1) orfIV 2) merT 3) merP4) merR 5) merA 6) merB1) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA 6) merD1) merA 2) merD1) merR1) merA 2)merD1) merR1) merD1) merA1) merR1) merA 2) merD1) merR 2) merT 3) merP1) merB31) merR2 2) merB21) merB31) merR1) merA1) merR1) merR1 2) merA 3) merR24) merB2 5) merB11) merR1 2) merE-like 3) merT4) merP 5) merA 6) merR27)merB2 8) merB1

균주명

유전자명

161. Escherichia coli162. Pseudomonas sp.163. eclercia adecarboxylata 665H164. Leclercia adecarboxylata 505H165. Unidentified enterobacterium 354A166. Leclercia adecarboxylata 742H167. Escherichia coli 402H168. Escherichia coli 388H169. Klebsiella oxytoca 509H170. Escherichia coli 92H171. Leclercia adecarboxylata 533H172. Escherichia coli 47H173. Klebsiella pneumoniae 280174. Escherichia coli 1352175. Escherichia coli 1323A176. Citrobacter freundii 300C-A177. Unidentified enterobacterium 1532178. Escherichia coli 390179. Serratia marcescens plasmid pR831b180. Pseudomonas aeruginosa plasmid pCER100181. Escherichia coli 343182. Unidentified enterobacterium 2705A183. Escherichia coli 2701184. Mercury resistant bacterium '96 SE13185. Streptomyces coelicolor cosmid E39186. Pseudomonas SB3 Class C187. Klebsiella oxytoca Class B188. Enterobacter cloacae Class A189. Streptomyces sp. CHR28190. Streptomyces sp. CHR3191. Pseudomonas stutzeri plasmid Ppb192. Pseudomonas stutzeri plasmid Ppb193. Pseudomonas stutzeri plasmid Ppb194. Escherichia coli195. Escherichia coli196. Escherichia coli197. Enterobacter cloacae198. L. monocytogenes199. Thiobacillus T.3.2200. P. fluorescens

1) Hg(II) reductase1) merR 2) merT 3) merP1) merR 2) merT1) merD1) merA 2) merD1) merR 2) merB 3) merT4) merP 5) merC 6) merA1) merR 2) merT 3) merP4) merA 5) merD1) merA 2) merD1) merR 2) merT 3) merP1) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA 6) merD1) merR 2) merT3) merP 4) merA

균주명

유전자명

205. E.agglomerans pKLH272206. Alcaligenes sp. pMER610207. S. marcescens208. Escherichia coli plasmid R831b209. S. lividans210. P. putrefaciens211. P. testosteroni (SE3MERR)212. Peudomonas sp. (SB3MERR)213. E. cloacae (SO1MERR)214. E. aerogenes215. P. fluorescens (SB4MERR)216. P. fluorescens217. A. radiobacter (T217MERR)218. A. faecalis (SE20MERR)219. K. oxytoca (SE31MERR)220. A. calcoaceticus (SE12MERR)221. A. calcoaceticus (SE11MERR)222. Acinetobacter223. Acinetobacter224. Acinetobacter225. E. coli226. E. coli mercuric ion resistance transposon(Tn501)227. E. coli mercuric ion resistance transposon(Tn501)228. E. coli mercuric ion resistance transposon(Tn501)

1) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA 6) merD7) urf-1(merE)1) merR 2) merT 3) merP4) merC 5) merA 6) merD7) urf-1(merE)1) merA1) merR 2) merB1) Hg transport 2) orf33) orf2(merT) 4)orf1(merR)1) merT 2) merP3) merC 4) merA1) merR1) merR1) merR1) merR1) merR1) merR 2) merT 3) merP4) orfF(merF) 5) merA 6) merD1) merR1) merR1) merR1) merR1) merR1) merA1) merA1) merA

6. 카드늄 관련 유전자

균주명

유전자명

1. Listeria monocytogenes strain EGD2. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi3. Bacillus stearothermophilus4. Streptococcus pneumoniae5. Helicobacter pylori 266956. Bacillus halodurans7. Salmonella enterica serovar Typhi(Salmonella typhi) strain CT188. Listeria innocua plasmid pLI1009. Listeria monocytogenes strain EGD10. Neisseria meningitidis serogroup B strain MC5811. Streptococcus pyogenes12. Mesorhizobium loti13. Mycobacterium leprae strain TN14. Yersinia pestis strain CO9215. Lactococcus lactis subsp. Lactis16. Streptococcus pneumoniae R617. Xylella fastidiosa 9a5c18. Yersinia pestis strain CO9219. Neisseria meningitidis serogroup A strain Z249120. Campylobacter jejuni21. Staphylococcus aureus C55 plasmid pC55s22. Streptococcus pneumoniae R623. Staphylococcus aureus24. Streptococcus pneumoniae TIGR425. Bacillus thuringiensis strain DM5526. G139 Gemmata obscuriglobus27. Xylella fastidiosa 9a5c28. Streptococcus pyogenes strain SF370 serotype M129. Streptococcus pyogenes M1 GAS strain SF37030. Mesorhizobium loti31. Mesorhizobium loti32. Mesorhizobium loti33. Lactococcus lactis subsp. lactis IL140334. Lactococcus lactis subsp. lactis IL140335. Pseudomonas putida36. Lactococcus lactis subsp. lactis IL140337. Mycobacterium leprae strain TN38. Lactococcus lactis subsp. Lactis plasmid pAH8239. Pseudomonas fluorescens ATCC 1352540. Bacillus halodurans41. Bacillus halodurans42. Bacillus halodurans43. Neisseria meningitidis serogroup A strain Z2491

1) cadA1) cadA1) HP07911) BH0744 2) BH12383) BH40361) plio0611) cadA1) NMB19551) cadA1) mll4454 2) mll5060 3)mlr64901) cadA 2)yuiA1) XF08661) cad1) XF08661) cadD1) mlr64901) mlr50601) mlr44541) yuiA1) cadA1) cadA1) cadA1) BH4036

균주명

유전자명

44. Staphylococcus lugdunensis plasmidpLUG1045. Lactococcus lactis plasmid pND30246. Lactococcus lactis47.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352548.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352549.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352550.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352551.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352552.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352553.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352554.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352555.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352556.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352557.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352558.Pseudomonas fluorescens ATCC 1352559.Klebsiella sp. Cd-160.Stenotrophomonas maltophilia61.Campylobacter jejuni NCTC1116862.Campylobacter jejuni NCTC1116863.Z9 Pseudomonas64.Z1 Pseudomonas65.Neisseria meningitidis serogroup Bstrain MC5866.Shigella flexneri67.Ralstonia sp. CH3468.Acidiphilium symbioticum69.Bradyrhizobium japonicum70.Helicobacter felis171.Lactobacillus plantarum72.Pseudomonas aeruginosa73.Listeria monocytogenes74.Staphylococcus aureus plasmid pRW00175.Helicobacter pylori 2669576.Helicobacter pylori 2669577.Bacillus stearothermophilus78.Suberites domuncula79.Synechococcus PCC794280.Rhodobacter capsulatus strain SB100381.Pseudomonas aeruginosa strain CW-96-182.Staphylococcus lugdunensis strain 99583.Lactococcus lactis plasmid pND30184.Bacillus simplex85.Alcaligenes xylosoxidans86.Staphylococcus aureus87.Bacillus firmus

1) cadB 2) cadX1) cadAP. fluorescens genomic clone C7P. fluorescens genomic clone C6p. fluorescens genomic clone C4P. fluorescens genomic clone C2P. fluorescens genomic clone C17P. fluorescens genomic clone C16P. fluorescens genomic clone C15P. fluorescens genomic clone C13P. fluorescens genomic clone C11P. fluorescens genomic clone C10P. fluorescens genomic clone C9P. fluorescens genomic clone C81) cadA1) NMB19551) cadA1) mutA1) cadA1) HP09701) HP07911) cadB 2) cadX1) cadA1) cadA

이하, 일련의 분석과정을 대표적으로 지질분해효소(lipase)를 예를 들어 설명하며, 다른 종류의 분해효소 코딩 유전자도 동일한 방법으로 수행되었다.

일차적으로 NCBI 데이터베이스를 검색(lipase + bacteria + extracellular)하여 이에 해당되는 단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 유전자 염기서열을 확보하였다.

확보된 정보 중 아미노산 서열을 상호 비교하여 그룹화하여 그 유사도를 알아보았다. 도1에서 보는 바와 같이 리파제의 경우, 크게 두 그룹(리파제와 포스포리파제)으로 묶여질 수 있으며, 각 그룹은 다시 아미노산서열의 동일-유서성에 따라 더 소그룹으로 나뉘어진다.

유사성을 보이는 소그룹(예를 들면, 하나의 계통을 형성하는 lip31-1, 49, 57, 60, 64) 내의 각 효소의 아미노산 서열을 정렬하여 그 보존지역을 탐색하였다(도2 참조; 파란색 및 별표표시는 그룹 내 모든 효소가 동일한 아미노산임을 표시하는 것임).

색출된 아미노산 서열에 해당되는 염기서열을 다시 데이터베이스로부터 회수하여 이번에는 염기서열을 정렬하였다. 이렇게 정렬된 결과로부터 칩에 고정시킬 포착프로브로서의 후보 염기서열을 확인하였다.

최종적으로 포착프로브로서의 자격 요건을 알아보기 위하여 프로브의 길이, GC-함량, 혼성화 온도(melting temperature) 등을 조사하였으며, 최종 결정된 이들 포착프로브들의 염기서열을 표7과 같다.

7. 포착프로브의 염기서열

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
1. 유기물 분해관련α-amylaseGroup 1Group 2Group 3Group 4Group 5Group 6Group 7β-amylase	TATATGTTTGGCGGCATCAAGCTTGGCCGCRTCGTCTGAAAACCAATGTCCCCCATGTGCTTAACCGCATCAGTATCGACCCGAAAACCATCTTTTGGCAGTATCGATCCGTGGCAGTATCAACCCGAAAGACGGTGTCGATGCGAAATGTGCACGGCCGTGTCGTCGATGCGGAAGCCCGATGCCCAAGCCGAATCTATTCTGAATCCATCAAACACCTTTGTCCAACCAAAGGCTGTATCATGGCTATCAAGCTCATGACTACCGAGCAAATTAAACGGGCAGTATCATGGCTATCTGCTCGGCGCGCCCGGGCCCGCAGTGCATCAACCACACTGTGTTGGCAGGTACACCACGTCGAAGGTAGACGACGTCGAAGCCGCAATCCGCAGCATCAGATTGTGATGCACTTCTATCCGAATTCTGGGCAGACTCATCTTCCCATAGRTCATGTTCCTCCCATATGGATGATCCTCTTCCCAGCGGTCTTTTTCTATATCAGCCCACGATCCGGAGCAATCGAAGCCCGGAACAATCGATGCCGGTGAAGTCGGTGATCCAGTATTTGTCGTAACACTGGAACTCTCTAGCAATTGTGAGTACCAATTTAATTGTCATGGCATTGGAATTC	57.5954~57.2555.1355.8256.8656.8557.0355.6555.6758.2856.5846.5354.8155.2555.7157.1455.2155.7954.5854.8654.9456.5249.0556.4222~3356.5755.6855.5657.2057.1457.1756.5155.0356.37

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
CellulaseGroup 1Group 2Group 3Group 4DNaseGroup 1Group 2Group 3LipaseGroup 1	TGCGGTGGCGGCTATGCAGATGCTTGTGGAGCGTCGGTGGTGACCTCCACATTGGTTGTTACTTCCGCCACATGCCATCCTGAACCCAGACCCACACCGTCGCTGACGTCCAGGCACTTGCTGATGCGGCCGGTGAACTACATTTGATGATATCTTACTTATCGCCGCTCCGGTGTAAGGGCGCGCCCTGGCCAGGTAGCAGCATTGAGACTTCCCTGGCTTTTATGGAGTTGCCTTGCACTTTTTCAAGCCCTGCAGCTTGCCCTCCTCATTACCACCACCGTTCATCGTTTAATCCACAAAATTTTCATTATTTAGACCTGAAAATTGCGCATCAGTTTCGATCAGTAAGCGTCGGTTTCCAGCACGAGTTGCTCCAGGCGATCCAATTGTTCTAGACGTGCAGAACCACCGGCGTTTCAATAGCCCGTGGTTACGCAGATAAACCATGATTGCGCATATGAAACCCTCACTCGCAAACGAAGCCCTGGGACGATCTTCAAAAAGTTCATGGTATCCGTCGTTGAGAGTTCGTGATACC	55.1655.2855.3854.9955.3755.8954.2254.8851.5956.8256.2756.4256.5656.5255.3055.6656.6153.9756.4755.8755.6057.5457.7057.0956.0255.9656.5156.7756.39

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
LipaseGroup 2Group 3PhospholipaseGroup 1	ATGTCCGACGAAGTCGACCGTGGCCGACGAGGTCGTGCGACACGATGTCCACTTTGAGCSACAATATCCACTTTGACCGGCACCAGGCAACATACGCCCACCAGACCTGGCCGACCAGACCGACTGCAGGTTGCGACCAAACTGCAGGTGCCGACCACTTGAGCACGGAYGCGGAAGCGGATGCGGTCGAGCAATGCCGATTTTCTCTTCGGAGTCGGGGTTCCATTCCGAGTCGGGATTCCTCCGAATCGGGGTTCCTTGATGATCACTATCCCAGGTACGCCGTGGCCGCGCTCACCGAAGCGCCAATCTTGTTTCCCACACCAAGATCATCCTCGGCGGTAAAGAAACTCCGCACTGGCTATAAGGTGCCGACGCCGAACTCGGCCGTGATGATCAGAATTCGGCGGTCAGGACCGGCGACMGCGATATCTTTCTCAGCAGTTTGGATCATCAAATTCAGCAGTCGCAACAAACTCAGCAGTTACAACAAAGCATATTCGGCGGTAATTATTAACGGGTCATATTCTGCTGTTATTATTAACGAATTCGGCAGTAATGATGCCGCCCCGGCAATAGCTATCTCCAACAGATAAAAATGTTCACCATAGGCCTTTTCGATGCCGTAGGCCTTTTCAATCGCCGTAGGCCTTTTCCTCCGTAGGCTTTTTCGATCCGCCCATGCTGTGSC	57.6457.7757.3747.9655.9357.7355.9857.5757.9455.655.7456.8857.1155.6156.1954.1557.0755.3056.6957.5355.4457.0657.0456.7854.0355.5356.6355.2356.4857.0956.0456.5456.7455.0755.2254.3654.7756.80

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
PhospholipaseGroup 1Group 2Group 3Alkaline proteaseGroup 1Group 2Group 3MetalloproteaseGroup 1Group 2	ACCGCTCCGGCTGAATAATTGCTCCTCCCATAGAATGTCGCGCCACCCATAGAGCGCCCCCCATTGACCCCCATTGAGTGCGCGCACCGCCCATCGAATGTTATCTAAAATAGTAACCTTGTCCATCAGCGCCACTTTTAATACTGCCACGCACCGTAATACTGCCACGCACTGCATGATACTTCCCCGTACTGCATAGTCCGCTTTCGCCCTATTGTCCGCTTTGGAAGCTCAATCGTTGCTTCTTCAGCGTCATAACCAGAATCAATAATACAGATAGGTCGTAACCAGAATCAATAATACAAAATCTCGTGGGTCAGGGTCTATTTCGTGGGTCAGGGTCTCCTGCCACATGTGTACCGTCCCGCAACATGAGTACCATCCAGCTACGTGCGTACCATCGCAACATGGGTTCCGTCAGCCACGTGAGTTCCGCGGCTACATGCGTACCGTCCCTGCTACATGAGTACCATGCCTGCACAGTGTGTGCCATAGAGCATGGCCGATCTCATCCTAGCGCATGACCGATTCTTGTCCAAGTGCAGTATAATTTTGTCTAGGTGAAGTATAATGTCAACTAAGACTTCCCAGTTATCAACAAAAACATCCCAATTCGGATATGACGAACCATTGAGGACCGGAATATCCGTTAGTCCCCCAAAATCACCCC	56.2856.2356.3555.8857.8657.4041.0056.1755.8755.2857.2756.2555.7556.3057.5557.5256.0156.3056.7756.1656.7757.5555.3457.5255.4957.6357.4956.6049.8844.0250.3454.0754.1356.1057.95

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
MetalloproteaseGroup 2Group 3ATP-dependentproteaseGroup 1Group 2Group 3ProteaseGroup 1	TCATTTTTGACCACGCCACTTCATTGTAAACAACACCATTTCAAAACCAAAGTATGGGTCACACCTACGTAACCAACTTCTGTACCCACATAGCCAACTTCTGTGCCTACATAACCAGCTTCAGTTCCAACATAACCAGCTTCAGTGCAGTTTTACCAACACCTGGCCGTTTTTCCGACACCAGGCCGTCTTACCAACTCCGGCGTTCTCATCCCGGACTATCAAATCTACCTGGACGAAGAATATCAAATCTACCTGGTCTCAAGAGGGGAAGATTCTTCTCTCGACAGGGAACGTTTTTCTCTTTACAACTTGTTTTACCTGTTCCAGGAGAAGTTTTACCCACGCCAGGCGTCTTCCCCACTCCTGGAGTCTTACCTACACCCGGAGGAGGTCTTGCCCACGCCAGTCCGGCGATGACCGGTAAGTACGGCGGTGACCACCGTCCGACGGTGACCACGTAGGTGCGGCGGTGACATAGGTGCGCCGATGGATAGGTCCGTCTGTGTCCGATATGTTCTTCTGTGACCTCTTATCTCCAGGCTCGTCTTGCCCAGCTTCATTTAAAGCCCCTGTCCGAGAAAGCCTCATTCATCAGAAATGGACTCATTTAATGCTCACGTCAGACAGCGATTCTCGGACAGCGATTCATTTAGGATATCCGAGAATGCTTCGTTCGCTTCGTTCATACCACCATGACTGAGCAAAACGCTGACGCGGCCCGCTTGAT	57.1750.7356.9350.9656.2554.0854.8855.5456.7256.0157.6857.7257.0855.9454.3357.4057.6257.9757.6056.4657.3457.8257.5157.2154.9355.1157.2257.9255.2356.1956.7454.2756.3256.3757.4656.9055.50

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
ProteaseGroup 2Group 3	ATTGAATAAAATAAAGTAAAGGTTTATGAGTAAGTATTTTAAGTTCTCTGCTAAAAGTGCCAACTGGTTACCGGAATCAATCACAACTGATTTCCGCTATCGAGATTTCCGTCAACTATAAAACTTCTTGGGCGACGACGAACATGAGCAATGACAAACATCATTCGGCGTAGACAAAGCCACGAACAGCCAGAAAGACAAACAACACTATTAAAAAGGTAAGTACAAGCCTGAGCGATCGCGTAAATCGAACTATAGCATAAATAAAACCTGCAACYTCACGCGCTAAAACAACTTCCCGTGCAAGAACACACGGGCAAGCACGATATTTCACGGGCAAGCACGCAATTCACGTGCAAGAACAGGTTCCCGAGCAAGTACCGTTCCCGAACATTGGTAAAGATCGCGAACGTTGATAAAGATCCGCGAACAGGCGTCACGCAGATTTTGGTTTATCCACCAGCGCCTGGTAGAGCCACTAGGGATTGATAAAGGCATGCTCTAAGAAATGGGCGTTCAAGGTAATGTGCCAGCACCGAGCCCCCCGCTGCCGCCTGGGCTACCGCCAGGGCTGTTTACTGCCCCCTGGGCTATCTCCACCGGGAGAATTCACGCACTGCCACCGGGATCAAGACGTAAGTCATCGACATAAGGGGAATCGATGCGGTCCACCAGGAGAGTCTATAACAAGCCACCTGGTGAATTAACATGCCGGGGGAATCGATGTTATTGGTTACCGCAGCTGCCGGCCACATGGTCGGGCCGAGATCCTTTGGACCGAGGTCCTTCG	42.3739.9955.2355.7456.3256.1556.9756.0057.1355.1756.5455.0955.0451~5456.1254.4660.3354.6956.0155.6955.0754.4955.6656.9156.0549.7055.5354.4656.0256.7756.4655.5755.9355.4156.4656.0854.8056.0251.1854.6256.0956.50

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
Group 3Group 4Serine proteaseGroup 1Group 2	TTAATGGGTACGTCGGTTTGTGATGGCGGCATCGGTTGATTGCGGCATCAGTTTTATTGCGAAAAATCCCGTTCGGCCACGAGGTCATAACTTGAATCTGCCTATATTTTACACCGTGCAATCACCGCCTGGAGCCGCCATTGATGTAGGCCGCGAAAGACGTAGCCGCCTCGCTCGTTTCCACCACGGCCACATTACCCGTTCGGCCAATCAACACCAGTACGGCCAATCGGTCGCAATGTCATAGGTGTTGTTAGTTACGATTGTATTTTTACCAACGGTAATGATTGTATGATTTCCAACTAGGTAATGATTGTATGATTCCCAACATTTGTTAAAATAGTATTCTTTCCAACTACGGTGATAATTGTATTTTTTCCAATTAGTTTATTTGTTAAAAGAGTATCTTTACCTACCGAGTATTTCTTTTCCTCTGTCTCTCAGCGCGCCCTTGCCAGAGTTACCWGGGTTCGCCGCTGTTACCTGGCCGCTGTTCCCAGGGTCCTCCGCTGTTTCCAGGCCTCCTGAATTTCCCGGCCTCCACTGTTTCCCGGTCCACCTGAATTTCCTGGATCCTCCACTATTACCGGGGTCACCGCTGTTGCCGGCCACCCGAGTTACCTGGACGCACCGCCGGAATCGCCAGAGTTACCGTGGTCCGGAGTTRCCGCGCAGAGCACCGCCAGAATTCACCGGAGTTACCACGGTTCGGGCCACCCGAA	56.2257.2355.0256.0054.6656.4155.7157.1155.4957.9357.6156.3755.3757.4156.4257.2657.5257.9757.0957.4456.7654.7446.2555.7646.2956.4855.4656.0656.6056.3057.0255.8556.3656.2450~5756.4355.8256.36

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
Group 2Group 3Group 42. 방향족화합물질 분해관련Toluene-2-monooxygenaseToluene-3-monooxygenaseToluene-4-monooxygenaseToluenedioxygenaseBenzylsuccinate synthase(anaerobic)Phenol hydroxylase	CGCCGGAATTGCCGACCGGAATTGCCTGGATGGACCACCAGAGTTACCAGGACGGGCCACCGGAATCGGAATTGCCGGGGCGGAATTCCCCGGGTGGAGTTGTTTTGGATACGCAGCAGCGATCATGTCAGCAAGATGTTGATCACCGACGCGGAGATATTGATCACCGAAGCTCAGGCTTAATCATCCACGTATGCAACCACATCAGGCTTCGTCCACCTGGCTGCCGGATATCGATTTGTGCTTTTGTTTCTTGATCGGCGCCTTGCGTCGACCGACGGGTCGAACAGCGGTGAGGCCACTTATTGTTCGGCGCGTAGTGTTTTCCCGTGTATAGACCTATGAAGCGCACGATCACGAGAGTTCCGTACATGGCCATGGCAGCGTCTTGTTGTAGAAGGGTATTGATGCGCACCCAGATGTCTTATAGGGCTCATCATAGACCTTATAGGGGGCATCATATCCTTCGACCTTGACGGTAACGCTGAACCTCTGTATTTCGGTGATGCACTCGAAAACCCAGCAGGTCTGGCACAGCATCCCAGCGTCATATGGCGGCGCCAGAACCATTTGTCCGAAGATCGCGTAGAGCTTCGGCAGCATGTAGTCCATCATCCATGTAGTCCATCATCATCCCAGTAGCTCTTGGGCACCGATCTCTTGGGCACCGACA	57.1855.2156.5056.4455.7056.0256.0556.1055.9756.3855.9457.1157.7756.3455.7457.5557.6655.6655.9857.1656.8156.3158.2255.1255.0857.1356.2254.2256.8558.4056.6757.9057.6954.6558.0155.08

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
4-hydroxybenzoatedecarboxylase (anaerobic)Chlorobenzene dioxygenaseBenzoate-4-monooxygenaseEtylbenzene dioxygenaseNaphthalene 1,2-dioxygenaseEthylbenzene dehydrogenaseXylene monooxygenaseBenzylalcohol dehydrogenaseBenzaldehyde dehydrogenase	TTGTGCCGCGGTTATACCCGATTGCGATACACGATGAAGTCTACTGGGTAACCTCCATGATGAAAGACAAAACTTCGATCTGTGAGTGGGCGACTCGACACAATCGACAGCACCGGTTGCGCCGCACAGGTAGGGTAGCGTAGATTTCGCCTTGCCGTATTTGGAGGTCATTTGCAACCATAGATGAAGCCATGCCGTACAGATCTTTTTCAAATCCACGCAGTGCTCTAACCATTTTGCGGATCCAGTTGATGCTTGCCGACACGCTTTATTCTTGCCAGATAGAAGAAGAAGCAATCATGCTGCCGTTATACATTTAATTGGAGCAAGCCTGGGTCATGCTCTGCAAAAAGAACAACAACACATCACGCTGACGTAGAAGACTCTTCGGACAGGAATAAGCTCGAAACGTCCCCTCGCACAGCCGTTGTGGAAGAGTTGGCACACCACTATAGCGTGGAAACCAGTGGTCCGAAAGTCGCCATATTCAAACCAGATCCGTATGACACACGAATCAGCACTTCGTCGTTGACCAGCACTTCGCCATCAAATCGGTGTGGCACATGCGACCACTTGGGAAA	57.5557.7455.2555.256.056.257.256.756.855.056.157.656.157.555.256.854.857.955.456.356.757.957.055.655.955.255.155.057.355.4

Group	프로브 염기서열	Tm(℃)
Toluate 1,2-dioxygenasecis-p-toluate-dihydrodioldehydrogenase (xylL)Catechol 2,3-dioxygenase3. 질소 순환 관련Ammonia monooxygenase amoAHydroxylamine reductase haoNitrite oxidoreductase norB	CGCTTGCAGCGGTAGATGTGGATCGGTGAACATCTCCGGCCGGCATCCAGAAAGGTGCGGATGCGGAATAGGCACTTGCAGATTGACGTAGGGTACCTGGAGGTTGACGGCTCGGCGGTTTCAAAGTACCAGACCTTCTCCTGCTCTTCGGTGGTGTATTCCCAATTTGGCAATCGGCGAACTCCTTGAAACCCATAAAATCCATCTTGAAACCCATGAAATCCATGCCAAAGTTGAGCAGGTCATACCTGCTCGGCCAGGTATACGAACCGCAGACGTAAGTACGTCGTTCTTCATGGTGACCAGACGGTGAACATGAGCATCTCGTCAACCATTCGCCTACGATACAAAGGCCGAGAAGAAATGGTCGATGGCAGTACAAACAAAGTTCATGGGGTAATGTGAGATACAAACGCCGCAAAGAACAACAGGGTGCCTTCTACTACCAACCAGTTACGTGTCAGATACAGCCGCTTTCAGGATTTCTAATTCCTACGATCGGTGTCACGGTCAGATTGGAATAACGGGCAGTAATCTCCCATCGTCCCGGTCGACCAGTTGAAGTAGGT	55.057.057.657.956.957.255.455.457.657.757.956.757.556.555.9855.1756.1958.0054.7256.157.6657.1455.5755.5755.0656.5556.956.6555.73

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
Nitrate reductase narGnarHnapAnarBNitrite reductase nirKnirBnirDnirS	ATAACTTTGACGTCCTGTTAATGTTCCTGCCCCACGTAATGACTTCGGAGAATTTCTTCGCTAGTCGGTCTGCTGGGTTTCGAGGATACCTGCGTGGAAGTACGTTCCAGATCCTCGTAGGTTACCTGGGAACGAATCTTCATTAGGTCCACGGCTCGTAGTACATGTGGGCTCTAACCTTCATTTGACCTGCACCCAGTAGAACCCATGGTCCAGAAGGACCCCATGGTCCAGAAGGACGATGCTCTAGAGTCGACAGCAGATCTTGTGCTACCGCATGTATCTTCACCATACATGATCTTAGCAAAAGAGATCAGCCAGCCAGTCGCGTAGTAACCTATGAATTCTCGAGGATCAACCACAATCAACGTAGTAATCCTCTGTCTGCATATTGACTTTGCACAGACGCAGCCAAGTGCAGGTTACAGATGCAGTTGTGCATGTTAAGCATCCATGATCGCACCATTCATTCGACGTAGTCGTCCTGATGTGCTGTGGATGAACAGCACTGGCGCGCAGTGGTAGACACGTGCCAGGGGATCATGACGAGTATCATCCCGAACATCATTCAACATCGTCTTCTCCAGCCGGTGATCTTGGTGTAACCGGCGACAGCATGATGCTTGTGCCATCCTTGAATCCACTGGTTGTCGATGCAGATCCTTTGTAGCGGTTTTCCAGTTGACTTGCACCATACCGTCGCTCAAGTAGCACTTGCAGTACCGAGAACCAGACCTCGT	55.1654.8956.3957.5456.9656.5256.3855.8756.7856.1754.8355.8555.3456.357.1656.3555.5756.5255.4457.2455.0456.456.7156.4456.7857.6255.6356.4155.7654.0657.0557.8256.1957.7456.4757.3256.38

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
Nitrite reductase nirANitric oxide reductase norBnorCNitrous oxide reductase nosZ4. 인 순환 관련Exo-polyphosphatase	TCTGATCGCTGGTGAGGATATTTCTCAACTTGTGAGCGGAATCCGCCAACTAGGATATTGACATGCTGTAGAGTACTCAAGCCCATGCTGTAGAGTACTCAAGCCGCATTAAGAGGAATGGCTGGACCCACCACCAGTATTGCTTAGGTTTTCCGGGTTGTAGAAAGACCGACGATGACATAGAGCGAACAGGAAGAAGATCGCAACACCGGAAGTACTCGTCAATACCAATAGGGTGATGGGATCTGACCGCGAAGAAGTACTTGCCAGGTCGACATACTCATAGCGGGTCATAACGATCTCCTGTTGTCGTTCGGTGGCCAGTACGAACACGGCTATGAAGAACTGATCTCCATGCTCACGCCCGTAGTATTCGTCCAACTCAGAACTTGTTCAGCACCATCAGGAGAACTTGTTCAGCGACACCGGTCTTCATCACGTCGCATTGAAGATGACGACCCAGTCCTCCTGTGGATTGACGATGAACCTGACGCGTCTTGATGATGTGATCTTCACGGTGACCTTTTATCGAGGCTATAGGATGGGCTATAACCGCCGCCGCTATAACCACCACCGAGCTGCTGTAGCCACCGCCTAGCTATAACCGCCGCCWAGCTATAGCCGCCGCCCACGCCGCCTAGTTGTCTCGCCGCCAAGCTGTCTTCACCGCCGAGCTGACTTCCGCCCAGGTGCCTCCTATAACCACCACCAAGATGC	56.0556.5156.7254.6455.857.4456.7756.5256.6855.2254.955.8756.3654.7755.756.4255.1956.6655.4555.3957.1454.8355.256.0157.654.2656.656.6157.4556.6156.5256.7557.4555.9257.8757.3854.69

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
Exo-polyphosphatasePolyphosphate kinaseEndo-polyphosphatase5. 중금속 전환 관련Cadmium Transporting ATPaseCadmium Efflux ATPaseGroup 1Group 2Group 3	CTGTAACCACCGCCAAGATGCTGTAGCCGCCGCCCCGCCGCCGAGCCTATAGCCGCCGCCGCTATAACCGCCGCCTAGCTATAACCGCCGCCTAGCGCGCGAAGCTACTTCGCGCAAAGCTGCTTTTTCGAGCGAAACTACTTCTTTTTCGTGCGAAACTACTTCTTCAATTTTCGTTCTAAACTACTTCTTTCCGAGCGAAGCTGCTTTCCGGGCAAAACTACTTCTTTCGGGCTAAACTACTTCTTTCGGGCCAAACTACTCGGGCGAAGCTACTCCTCCGCAAAGCTGCTCCTCCGCGAAGCTGCTCCTCGCGCAAAGCTGCTTCTCCGGGCGAAGCTGCTTGGTCACATGAATATTGACCACTTCCAGCGTGCCGGTCTTGTCGTCAATGTTCCTGTTTTATCTGTTCCCGTTTTGTCGGTGATAGTGCCGGTCTTGTTGTTAAGGTTCCAGTCTTATCTGTTAATGTCCCGGTTTTATCCATCATTGACCCCATCTCCATCATTAACGCCATCGCCCGCATCATTAATACCGTCTCCGCATCATTAATGCCGTCGATCATTGACGCCGTCACCCGCATCGTTGATTCCATCAGCGTCATTGATGCCATCGGAGCATCATTAACTCCATCTCGGTTGACGGCAATTTTTATATC	57.6456.6154.4858.2256.5257.3754.2654.2657.3758.0257.7157.0657.6157.6155.5956.5357.8554.7755.8655.9157.9957.882.5842.2757.1748.9954.8155.0056.4757.5355.2356.5554.6354.0455.7056.49

그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
Cadmium ResistanceGroup 1Group 2Group 3Mercury resistanceGroup 1Group 2Group 3	GGTTCTGGCTCATCGAAAACGGGTTGCGAGTGATCGAAGATGGCGAACAATGGAATATGTACACGGTAGGACGCACCGTGGCGGCACATCGAGTAGATCGCATCTCCAGCCTTATGAACGTGTCCTGCACGAACATCGCCCGCACGTAAGCAACACTCATTTTCAATATTAAAGCACCAGCGACGCGAGTAGCGCGGAAAGTCGCGACTACAACAAGCAAAGCAATAAATCAAGCCGAGCAAACCTAAGAATCAAACCGAGCAAACCTCAAACCCAAGACGGCAATGAATCAAGCCGAGCAAACCCGGTATTAACCCTAATAATCCTAATATTCGTGGAGCATTTCGTGAAACTGGCACCGGTGGCGCACCCGTGGCGACTAAAGGTCTTAGAAGGAACGCATCGGAACGCATCCGACGTTATGAAGGAACACAGCCGATGCACGCAGCCGACGTTCGTTGGGATACAACCGATGTTGTGGGATGCAGCCGATATTAATTGTCTTGGTCGGGATGCCCTACATTAACGCAAGTTCCGCACACAACCAACGTTGACACAGGTACGCAGCCGACATTCTGTGTCAATGTAGGTTGTGTGCCATGATCTTAGAAGGGACGCAAGCCCACGTTGACGCACGCAACCGACATTCACGGGATGGTACGCAGCCTACATACGGCACACAACCGACATGCTCCAGCGCCACCACAGTTCCAGCGCGACCACTCCAGCGCCACCACAG	57.0856.9554.9855.7957.9755.2857.3756.3157.2455.7955.3255.1957.7556.8756.3058.0056.9557.8554.8257.9655.5857.2657.1656.3457.7157.2257.7358.0057.9756.7356.5957.8556.1256.4857.5056.9657.9556.8556.41

실시예2: 올리고뉴클레오티드칩의 제작

표7로부터 방향족 화합물 및 질소대사관련 유전자에 대한 포착프로브들에서 선정된 프로브의 염기서열을 기준으로 5'-region에 스페이저(spacer)인 T(Thymine)를 10mer와 첨가하여 표8에 표시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다.

이들 합성된 뉴클레오티드의 5'쪽을 아민 그룹으로 변형한 시킨 후, HPLC로 정제하였다. 유리슬라이드는 알데히드(aldehyde)로 도말된 유리슬라이드인 CSS(BMS사)를 사용하였으며, 표8의 올리고뉴클레오티드를 도3과 같이 배열하여 올리고뉴클레오티드칩으로 제작하였다. 칩의 제작은 핀(pin) 방식인 미크로어레이어 시스템(GenPak사)을 사용하였고 스포트 간격은 250μM(센터 대 센터)으로 하였다.

각각의 프라이머들을 0.1M NaOH에 녹인 후 3×SSC 버퍼를 첨가하여 농도를 조절하였다. 이때 어레이 안의 습도는 70%로 유지하여 스포팅을 수행하였다. 스포팅된 유리슬라이드들은 가습챔버(humidified chamber)에서 15분간 방치한 후, 80℃에서 2-4시간 방치하였다. 이후 끓는 물에 1분간 방치하고 바로 95% 에탄올에 1분간 방치한 후, 유리슬라이드를 바로 원심분리 및 건조시켜 4℃에서 보관을 하였다. 이상과 같은 방법으로 제조된 뉴클레오티드 칩을 포착프로브로 사용하여 이하의 혼성화와 분석을 행하였다.

번호	그룹	프로브 염기서열	Tm(℃)
1234567891011121314151617181920212223242526272829303132	방향족화합물질 분해 관련Toluene-2-monooxygenaseToluene-3-monooxygenaseToluene-4-monooxygenaseToluenedioxygenaseBenzylsuccinate synthase(anaerobic)Phenol hydroxylaseChlorobenzene dioxygenaseBenzoate-4-monooxygenaseEtylbenzene dioxygenase질소 순환관련Nitrate reductase narGNitrite reductase nirK	AGAGTTCCGTACATGGCCATGGCAGCGTCTTGTTGTAGAAGGGTATTGATGCGCACCCAGATGTCTTATAGGGCTCATCATAGACCTTATAGGGGGCATCATATCCTTCGACCTTGACGGTAACGCTGAACCTCTGTATTTCGGTGATGCACTCGAAAACCCAGCAGGTCTGGCACAGCATCCCAGCGTCATATGGCGGCGCCAGAACCATTTGTCCGAAGATCGCGTAGAGCTTCGGCAGCATGTAGTCCATCATCCATGTAGTCCATCATCATCCCAGTAGCTCTTGGGCACCGATCTCTTGGGCACCGACACGATTGCGATACACGATGAAGTCTACTGGGTAACCTCCATGATGAAAGACAAAACTTCGATCTATAACTTTGACGTCCTGTTAATGTTCCTGCCCCACGTAATGACTTCGGAGAATTTCTTCGCTAGTCGGTCTGCTGGGTTTCGAGGATACCTGCGTGGAAGTACGTTCCAGATCCTCGTAGGTCCATGATCGCACCATTCATTCGACGTAGTCGTCCTGATGTGCTGTGGATGAACAGCACTGGCGCGCAGTGGTAGACACGTGCCAGGGGATCATGACGAGTATCATCCCGAACATCATTCAACATCGTCTTCTCCA	56.8156.3158.2255.1255.087.1356.224.2256.8558.4056.6757.9057.6954.6558.0155.0857.7455.2555.255.1654.8956.3957.5456.9656.5256.7156.4456.7857.6255.6356.4155.76

실시예 3: 혼성화 및 분석

올리고뉴클레오티드칩의 포착프로브와 혼성화시킬 표적프로브로는 표준 균주인 톨루엔 디옥시게나제(toluene dioxygenase) 유전자를 플라스미드에 보유하고 있는 슈토모나스 푸티다(Pseudomonas putida)(tod gene in pHG2)를 LB(Luria Bertani) 배지에 앰피실린(Ampicillin)을 첨가하여 24시간 37℃에서 배양한 균체에서 표준방법에 의해 총 RNA를 분리한 후, 랜덤 프라이머 역전사(random primer reverse transcription) 방법을 사용하여 확보하였다.

표준균주들을 표준배양방법으로 배양한 후, 원심분리하여 수확하여 균체를 확보하였다. 확보된 균체에 구아니딘 이소티오네이트 버퍼(guanidine isothionate buffer)(4 M 구아니딘 이소디오네이트-25 mM 시트르산나트륨, pH 7.0-0.5% 사크로실-20 mM EDTA-0.1 M 2-메르켑토에탄올)를 처리하여 총 RNA를 분리, 농축하였다. 최종 반응 부피 50 ㎕의 역전사효소 완충액(50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 10 mM dithiothreitol (DTT), 3 mM MgCl2, 2.5 mM 트레할로스, pH8.3)에 RNA 5 ㎍, 뉴클레오티드 혼합물(dATP, dGTP, dTTP, 각 10 mM, Cy5-dUTP), RNase 인히비터 40 유닛, RNase H- 역전사효소 250 유닛을 첨가하여 55∼60℃에서 60분간 반응시켜 형광이 표지된 표적프로브를 준비하였다. QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen사)의 프로토콜에 준하여서 비결합된 Cy5-dUTP와 프라이머들을 제거하였다.

올리고뉴클레오티드칩의 포착프로브들에 대하여 표지된 표적프로브의 정제 용액과 150㎕L 혼성화 용액(3xSSC, 0.1% SDS)을 혼합하여 94℃에서 2-5분간 처리한 후, 바로 얼음에서 1-3분간 냉각하고 원심분리하여 얼음에 보관하였다. 혼성화는GeneTAC Hybstation장치(Genomic Solutions사)를 이용하여 55℃에서 12시간 수행하였다.

세척은 미디움 스트리젠시 워시버퍼(medium stringency wash buffer: Genomic Solutions사), 하이 스트리젠시 워시버퍼(high stringency wash buffer: Genomic Solutions사) 및 포스트 워시버퍼(post wash buffer: Genomic Solutions사)를 사용하여 각각 온도 55℃ 조건에서 플로타임(flow time) 10초, 홀드타임(hold time) 20초로 2번씩 수행하고 0.1xSSC로 1분간 추가적으로 세척하였다.

세척된 유리슬라이드는 15,000rpm, 90초간 원심분리하여 건조하였다. Genepix 4000 스캐너(Axon사)를 이용하여 Cy5-dUTP의 파장이 635nm에서 스캐닝해서 분석하였으며 그 결과는 도4와 같다.

결과

도4는 포착프로브인 뉴클레오티드 칩을 형광이 표지된 표적프로브와 함께 혼성화한 후, 상기 조건에서 세척한 후 스캐닝하여 얻은 형광을 사진 촬영한 것이다.

실시예에 사용된 시료는 톨루엔의 분해관련 균주인 슈토모나스 푸티다(tod gene in pHG2)이며 이를 앰피실린이 첨가된 LB배지에서 배양하는 동안에 세포내의 pHG2의 분자수가 증가하여 tod 유전자의 절대적인 수가 증가하며 이에 따라 발현산물인 tod mRNA가 많이 존재하게 된다. 따라서 이 시료를 형광으로 표지하여 표적프로브를 제작한 후, 상기 방법으로 혼성화한 이미지는 톨루엔 디옥시게나제 유전자에서 디자인된 염기서열로 제작된 표적프로브가 스포딩된 부위에서 가장 강력한 형광을 발산하게 되고 그 외의 부위에서는 매우 약한 형광이 존재하게 된다.

올리고뉴클레오티드칩은 표적프로브에 결합하는 포착프로브의 양에 따라 그 형광정도가 다르게 나타나며, 이것은 시료내 표적프로브의 양에 의해 결정되는 것임을 확인할 수 있다. 그러므로 올리고뉴클레오티드칩을 이용하여 표적프로브와 혼성화한 후, 표적프로브가 스포팅된 부위의 형광정도에 따라 특정 유전자들의 발현 정도를 확인할 수 있으며 표적프로브가 지시하는 유전자의 기능 및 발현정도로부터 시료내 기능군집의 특정 미생물의 생태 및 생화학적 특징을 명백하게 탐색할 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명에 의하면, 생태계에 존재하는 각종 물질을 분해하는 미생물들에서 분해작용에 결정적인 역할을 하는 효소에 대응하는 유전자에 특이적으로 결합하는 염기서열을 가지도록 올리고뉴클레오티드들을 제작하여 올리고뉴클레오티드칩을 제작하고, 생태계로부터 취득한 시료에 존재하는 미생물들에 함유된 RNA들을 적절히 표지시킨 다음, 시료와 올리고뉴클레오티드칩과 혼성화시켜 상기 표지를 검출하여 분석하는 일련의 방법을 통해, 생태계에 존재하는 특정미생물의 기능성 유전자의 발현양상을 간단하고 정밀하게 확인할 수 있으므로, 시료내 특정한 미생물의 기능성 유전자의 발현양상에 대한 탐색 및 분석 도구로서 유용하며, 특히 생태계의 오염원인을 분석하고 해결하는 것에 매우 유용할 것으로 예측된다.

Claims

생태계에 존재하는 각종 물질을 분해하는 미생물들에서 상기 미생물들의 분해작용에 관여하는 효소에 대응하는 유전자와 상보적으로 결합하는 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드들을 포착프로브로서 제작하는 단계; 상기 포착프로브로서의 상기 올리고뉴클레오티드들을 슬라이드에 정렬 및 부착하여 올리고뉴클레오티드칩을 제작하는 단계; 생태계로부터 시료를 취득하여 상기 시료에 포함된 미생물들에 함유된 RNA를 표지시킴으로써 표적프로브 시료용액을 제작하고, 상기 표적프로브 시료용액과 혼성화 용액의 혼합물로 올리고뉴클레오티드칩을 처리하여 혼성화시키는 단계; 및 혼성화시킨 상기 올리고뉴클레오티드칩을 세척, 원심분리 및 건조하여 그 표지를 검출함으로써 상기 시료에 존재하는 목적하는 미생물들을 탐색 및 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드칩을 이용한 생태계 기능군집 미생물의 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 물질은, 유기물과 중금속을 포함하는 오염물질인 것을 특징으로 하는 생태계 기능군집 미생물의 분석방법.
생태계에 존재하는 각종 물질을 분해하는 미생물들에서 상기 미생물들의 분해작용에 관여하는 효소에 대응하는 RNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 구비하는 올리고뉴클레오티드들을 슬라이드에 부착한 것을 특징으로 하는, 생태계 기능군집 미생물의 분석을 위한 올리고뉴클레오티드칩.
미생물에 존재하는 톨루엔-2-모노옥시게나제, 톨루엔-3-모노옥시게나제, 톨루엔-4-모노옥시게나제 또는 톨루엔디옥시게나제 효소에 밀접하게 관련된 RNA와 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호1 내지 서열번호6으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 염기서열.
미생물에 존재하는 벤질숙신산 합성효소(Benzylsuccinate synthase)에 밀접하게 관련된 RNA와 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호7 및 서열번호8로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 염기서열.
미생물에 존재하는 페놀히드록시라제(Phenol hydroxylase)에 밀접하게 관련된 RNA와 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호9 내지 서열번호16으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 염기서열.
미생물에 존재하는 클로로벤젠 디옥시게나제(Chlorobenzene dioxygenase)에 밀접하게 관련된 RNA와 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호17의 올리고뉴클레오티드의 염기서열.
미생물에 존재하는 벤조산-4-모노옥시게나제(Benzoate-4-mono oxygenase)에밀접하게 관련된 RNA와 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호18의 올리고뉴클레오티드의 염기서열.
미생물에 존재하는 에틸벤젠 디옥시게나제(Etylbenzene dioxygenase)에 밀접하게 관련된 RNA와 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호19의 올리고뉴클레오티드의 염기서열.
미생물에 존재하는 질산환원효소에 밀접하게 관련된 RNA와 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호20 내지 서열번호25로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 염기서열.
미생물에 존재하는 아질산환원효소에 밀접하게 관련된 RNA와 특이적으로 결합함으로써 상기 미생물의 존재를 탐색할 수 있는, 서열번호26 내지 서열번호32로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 염기서열.