KR20030084508A

KR20030084508A - 인간 육종성 간세포암 세포주 ｓｈ-ｊ1

Info

Publication number: KR20030084508A
Application number: KR1020020023268A
Authority: KR
Inventors: 김대곤; 유경란
Original assignee: 대한민국(전북대학교 총장); 김대곤
Priority date: 2002-04-27
Filing date: 2002-04-27
Publication date: 2003-11-01
Also published as: KR100473839B1

Abstract

본 발명은 인체 간내 간세포암 세포주에 관한 것으로 보다 구체적으로는 육종성 항원인 비멘틴(vimentin)을 발현하는 침습성과 전이성이 강한 육종성 간세포암 세포주 SH-J1에 관한 것이다.

본 발명에 의한 인간 육종성 간세포암 세포주 SH-J1은 간세포암에서 탈분화되어 육종성 항원 및 형질을 갖는 악성 세포주이며 장차 간세포암의 발암원인, 전이, 침습 등에 관련된 진단 및 치료제 개발에 유익하게 이용될 수 있다.

Description

인간 육종성 간세포암 세포주 ＳＨ-Ｊ1{Human Sarcomatoid Liver Cancer Cell Line}

본 발명은 인체 간내 간세포암 세포주에 관한 것으로 구체적으로는 육종성 변화를 초래한 악성 간세포암 세포주에 관한 것이다.

국내에는 특히 B형 만성간염 또는 알콜성 간경변 등의 원인으로 간세포암의 빈도가 외국에 비해 높으며 임상적으로 항암화학요법이나 방사선요법에 내성을 가지기 때문에 간이식이나 수술적 절제 이외는 효과적인 치료 방법이 없다. 더구나 육종성 간세포암은 모든 간세포암의 1∼9% 정도이나 (Kakizoe S et al. Cancer 1987;59:310-6, Maeda T et al. Cancer 1996;77:51-7) 공격적 간내 전이와 빈번한 전이 등의 이유로 보통의 간세포암보다 불량한 예후를 보인다. 새로운 조기진단 및 항암 화학요법제의 개발을 위해 육종성 간세포암에 대한 생물학적 특성 규명이 필요하며, 이를 위해 세포주의 자체 확립과 그 유전학적 분석을 필요로 하고 있다. 사람의 간세포암 세포주는 다수가 확립되고 동정되었으나 아직 전세계적으로 육종성 간세포암 세포주는 보고된 바 없다. 또한 이 세포주에 대한 연구가 국내외적으로도 전무한 형편이다.

따라서 본 발명의 목적은 육종성 간세포암 세포주를 동정하기 위해 국내의 육종성 간세포암 환자로부터 세포주를 분리 확립하고, 이를 대상으로 염색체 및 생물학적 특성을 분석하여 간암의 진단 및 치료를 위한 도구를 제공함에 있다.

도 1 은 본 발명의 인간 육종성 간세포암 세포주의 세포배양시 도립현미경상 플라스크에 단일층 부착 성장 양식을 보이는 사진이다. A는 배양초기, B는 배양 후기사진이다.

도 2 는 환자 조직의 현미경학적 소견으로 육종상 간세포암 세포주는 HE염색에서 방추형 및 섬유교차형 육종성 종양 패턴을 보이며(H&E), 사이토케라틴 염색 양성(CKs+), 상피세포막항원 양성(EMA) 및 중간엽항원(mesenchymal antigen) 비멘틴(vimentin) 강양성(VMT+)을 보이는 사진이다.

도 3 은 종양형성능을 보기 위해 누드마우스의 어깨 피부에 접종한 후 형성된 종양에서 실시한 조직학적 화학염색으로 A는 상피세포 항원인 사이토케라틴 양성 결과이고, B는 중간엽항원 비멘틴에 대한 강양성 결과이다.

도 4 는 본 발명의 인간 육종성 간세포암(SH-J1)에서 G-밴드 핵형을 나타내는 그림으로 화살표는 구조적 이상소견의 절단점을 지시한다.

도 5 는 본 발명의 인간 육종성 간세포암(SH-J1) 세포주에서 Fas 수용체 발현을 관찰하고 항암제 parthenolide 처리 후 parthenolide 발현 변화를 분석한 결과도이다.

도 6 은 본 발명의 육종성 간세포암(SH-J1) 세포주의 친발암유전자 (protooncogene) Bcl-2와 그의 계통유전자인 Bcl-X_L발현을 관찰한 소견이다.

본 발명은 육종성 항원인 비멘틴(vimentin)을 발현하는 침습성과 전이성이 강한 육종성 간세포암 세포주 SH-J1을 포함한다.

상기 본 발명의 세포주는 한국생명공학 연구원 유전자 은행에 2002년 3월 19일자 기탁번호 KCTC 10204BP로 기탁되었다.

본 발명의 육종성 간세포암 세포주 SH-J1는 다른 세포주로 오염되지 않았으며 유전자적으로 독특한 세포주로서 장차 간암의 진단 치료 및 예후에 있어 매우 효과적이고도 귀중한 도구로 이용될 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명하나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 육종성 간세포암 세포주의 수립

간내 인간 육종성 간세포암 환자로부터 각각 암조직을 채취하고 잘게 잘라Opti-MEM(Gibco) 배지에 넣고 여기에 글루타민 2mM, 나트륨 피루베이트 0.5mM를 혼합시켜 56℃에서 30분간 가열한 후 비활성화된 우태혈청 10%를 추가하였다. 또한 페니실닌, 스트렙토마이신 및 메트로니다졸을 첨가하여 37℃에서 탄산가스 5%-대기95%, 100% 습도하에서 배양하여 관찰하고 섬유모세포가 자랄 때는 세포제거봉을 이용하여 제거하거나 필요에 따라 G418 항생제(100 μg/ml)를 이용하여 제거하였다.

암세포가 플라스크 용기 바닥에서 단일층으로 부착 배양되어 포화되면 트립신을 처리하여 암세포를 탈락시켜 다시 1:2 정도로 새로운 플라스크에 계대배양하였다. 이때 계대배양에 사용되는 배지와 배양조건은 상기한 배지 및 배양조건과 동일하였다. 계대배양중 각 계대 배양 단계별로 일부의 세포를 동결배지에 혼합하여 액체질소에 동결하여 보관하였다. 그 결과 도 1 A, B에 나타낸 바와 같은 1종의 간내 인간 육종성 간세포암 세포주를 순수분리할 수 있었으며 이를 SH-J1으로 명명하였다.

도 1 의 A에 의하면 단층으로 플라스크바닥에 부착하여 성장하는 초기 배양시 본 발명의 세포주는 방추형이며 섬유모세포적인 양상을 관찰할 수 있었다. 도 1의 B에 의하면 본 발명의 세포주는 후기 배양시 섬유교차형의 밀집모양을 보이며 2배 분열 속도가 12시간 정도로 성장속도가 빠른 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 인간 육종성 간세포암 세포주가 유래된 환자의 특성은 표 1에 요약되어 있으며 주요 특징으로는 간암표지혈청단백인 알파태아단백(AFP)이 정상이며, B형이나 C형 간염바이러스항원 음성으로 간염바이러스와는 무관한 발암과정을보였다.

<표 1> 인간 육종성 간세포암 세포주 유래환자 특성

세포주	계대수	나이/성별	암병기	HBV	HCV	AFP	치료	조직병리
SH-J1	20	56/M	IV	음성	음성	3.2 ng/ml	수술	육종성간세포암

<실시예 2> 육종성 간세포암 종양형성능 및 면역조직화학

육종성 간세포암 세포주의 종양형성능을 측정하기 위해 3∼4주 된 누드마우스(BALB/c, nu/nu, Kist)의 어깨에 본 발명의 세포주 수를 1×10⁶/ml을 접종하여 무균상태로 사육하여 관찰하였다. 약 4주 후에 종괴의 지름이 1.5cm 이상일 때 절제하여 파라핀매몰 조직 블록을 제조한 후,헤마톡실린-에오신(HE) 염색을 실시하여 조직양상을 결정하고 특수 면역화학 염색을 실시하여 육종성 간세암환자의 조직 특수 면역화학 염색과 비교한 바 그 결과는 표 2와 같다.

환자 조직에서의 육종성 간세포암 조직은 방추형 및 섬유모세포 양상을 보이며, 마우스 사이토케라틴 양성, 상피 세포막 항원 양성, 및 비멘틴 강양성이었다(도 2).

누드마우스 이식종양에서의 육종성 간세포암에서는 상피 세포 항원 사이토케라틴과 육종 세포 항원 비멘틴에서 강양성 소견을 보였다(도 3). 또한 간세포 유래 특이항원인 알부민, 피브리노젠 및 알파1안티트립신 항원 등이 양성으로 간세포암임을 입증하였으며 중간엽성 항원인 비멘틴이 강양성으로 육종성임을 지시하고 있다. 상기 결과는 표 2에 요약되어 있다.

<표 2> 육종성 감세포암 환자 조직과 배양세포 이식종양의 병리학적 특성과 면역화학염색소견

특수항체	환자간암조직	누드마우스접종 간암조직
CK	+	+
EMA	+	+/-
비멘틴	++	++
알파1-안티트립신	++	+
피브리노젠	+	-
알부민	++	+
CEA	-	-
AFP	-	-
CD34	-	-
CK7	-	-
CK19	-	-

참조: -, 음성; + 양성; ++, 강양성; +/-; 약양성 또는 미량

<실시예 3> 인간 육종성 간세포암 세포주의 핵형과 염색체 분석

세포가 75∼80% 정도 자라 세포분열이 왕성하게 일어나는 시기를 택하여 수확하였으며, 전날 배양액을 교환하였다. 일반적인 세포 유전학적 방법으로 수확하기 30분∼2시간 전에 colcemid 0.1ug/ml를 처리하고, 0.025% 트립신-EDTA를 2∼3분 처리하여 세포를 플라스크로부터 분리시켰다. 세포가 담긴 배양액을 시험관에 옮겨 1000rpm에서 5분간 원심분리하고 부유물을 버린 후 저장액(0.075M KCl)을 넣어 37℃에 20분간 두었다. 고정액(메탄올:아세트산=3:1)으로 3회 교환 후 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드 일부는 G-밴딩하여 염색체를 분석하였고, FISH에 사용할 슬라이드는 알코올로 탈수하여 사용 전까지 -20℃에 보관하였다. G-밴딩을 위한 슬라이드는 56℃에 12시간 이상 두어 숙성시켰다가 0.05% 트립신으로 20∼40초 처리하여 PBS로 씻은 후 4% Giemsa로 10분 염색한 후 1000배 배율하에서 관찰하여 사진을 찍고 핵형 분석을 하였다. 그 결과는 표 3에 요약되어 있으며 사진은 도 4에서와 같다. 본 발명의 SH-J1 세포주에서는 6p 및 17의 획득이 있으며 3p21-pter, 3q27-qter, 4, 6q, 13pter-q11, 16, 18, 19p13, 및 Y 염색체의 손실이 관찰되었다(도 4).

<표 3> 인간 육종성 간세포암 세포주에서 핵형

세포주	G-밴딩 and FISH karyotype
SH-J1	57-63,XX,-Y<3n>, +1,der(1)t(1;8)(p36;q11),der(1;16)(p10;q10),der(1;21)(q10;q10)t(1;2)(q44;q11),2,der(3)t(3;13)(p21;q12)del(3)(q26),-4,6,der(6;13)(p10;q10)2,der(8;14)(p10;q10),der(14;15)(q10;q10),der(15;16)(q10;p10),16,17,18,der(19)t (2;19)(p11;p13.1)[cp55].

<실시예 4> 육종성 간세포암 세포주에서 암억제 유전자 p53의 변이

p53 유전자 돌연 변이는 인간의 암에서 가장 많이 발견되는 유전자 돌연변이로서 암종의 약 60%에서 발견된다(Hollistein M et al., Science 1991;253:49-53; Levin AJ et al., Nature 1991; 351:453-456). 따라서 담관암에서도 p53변이가 예측되며 장차 암세포 병태생리를 파악하는데 중요한 가치가 있다.

p53 유전자 변이를 탐색하기 위해 PCR 단일나선 구조다형성 방법(PCR SSCP, Wen WH et al., Int J Gynecol Pathol 1999;1829-41)을 실시하였다. PCR SSCP 후에 직접 염기서열에 의하여 p53 변이 부위를 결정하였다.

PCR은 엑손 3에서 10까지 부위를 각 시발자 셋(표 3)를 이용하여 시행하였다. PCR은 0.12 μg DNA, 100 μM 각 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 mM MgCl₂, 1.5 unit Taq polymerase(Perkin-Elmer), 5 μCi[α-32p] dATP(NEN), 300 nM 시발자를 이용하였다. DNA는 94℃에서 5분간 변성시키고 94℃에서 50초간 55∼62℃에서 변성, 40초간 55∼62℃ 부치(annealing), 72℃에서 40초간 확장시키고 최종 확장은 72℃에서 5분간 시행하였다.

PCR 산물은 0.5×변이탐지 촉진 젤에 전기영동으로 전개하여 X-ray 필름에 감광하였다. 비정상 밴드에 해당하는 젤을 절제하여 DNA를 용출시키고 PCR를 이용하여 상동의 시발자를 이용하여 재증폭시킨 후 ABI kit(Perkin Elmer)를 이용하여 염기서열을 결정하였다

<표 4> p53 돌연변이 탐색 시발자 염기서열

시발자	서열(5'→3')	PCR 산물의 크기(bp)	어닐링 온도(℃)
엑손 3	3-F	TAG CAG AGA CCT GTG GGA AGC (서열 1)	159	62
	3-R	AGA GCA GTC AGA GGA CCA GGT (서열 2)
엑손 4	4A-F	CGT TCT GGT AAG GAC AAG GGT (서열 3)	304	58
	4A-R	CTG GGA AGG GAC AGA AGA TGA (서열 4)
	4B-F	GTG GCC CCT GCA CCA GCA GCT (서열 5)	226	62
	4B-R	AAG AAA TGC AGG GGG ATA CGG (서열 6)
엑손 5	5-F	CTG TTC ACT TGT GCC CTG AC (서열 7)	271	58
	5-R	AAC CAG CCC TGT CGT CTC TC (서열 8)
엑손 6	6-F	GCT GGA GAG ACG ACA GGG CT (서열 9)	228	62
	6-R	CAA CCA CCC TTA ACC CCT CC (서열 10)
엑손 7	7-F	CTT GCC ACA GGT CTC CCC AA (서열 11)	237	62
	7-R	AGG GGT CAG CGG CAA GCA GA (서열 12)
엑손 8	8-F	TTC CTT ACT GCC TCT TGC TT (서열 13)	231	55
	8-R	AGG CAT AAC TGC ACC CTT GG (서열 14)
엑손 9	9-F	AGC AAG CAG GAC AAG AAG CG (서열 15)	264	58
	9-R	GCA AAT GCC CCA ATT GCA GG (서열 16)
엑손 10	10-F	CGA TGT TGC TTT TGA TCC GTC A (서열 17)	257	58
	10-R	ATC CTA TGG CTT TCC AAC CTA G (서열 18)

육종성 간세포암 세포주에서 p53 엑손 3,4,5,6,7,8,9,10에 대한 변이를 조사한 결과 변이가 발견되지 않아 본 발명의 SH-J1 세포는 야생형(Wild-type) p53 유전자형임을 확인할 수 있다.

<실시예 5> 인간 육종성 간세포암 세포주에서 Fas 발현

세포막에 발현하는 Fas 수용체와 여기에 반응하는 Fas 리간드(Fas-L)는 암의 면역감시체계에 세포사멸을 유도하는데 작동된다고 한다. 또한 항암제 유도성 세포사멸에 Fas 수용체의 관련성이 밝혀졌다. 따라서 인간 육종성 간세포암 세포주에서 Fas 발현의 검토는 장차 이 세포주의 생물학적 특성과 항암치료전략에 매우 귀중한 접근 자료로서 사용될 것으로 보인다. 전기한 바와 같이 총 RNA를 각 세포주에서 추출하여 cDNA를 제조하고 Fas 시발자로는 순행시발자 5'-CGGAGGATTGCTAACAAC-3'(서열 19)와 역행시발자 5'-TTGGTATTCTGGGTCCG-3'(서열 20: Panayiotidis P et al. Leukemia 1995;9:1227-1232)를 사용하였고, 내부 대조 실험으로서는 액틴 단백 유전자를 사용하였다. 액틴 단백 유전자는 순행시발자 5'-CGTTCTGGCGGCACCACCAT-3'(서열 21) 와 역행 시발자 5'-GCAACTAAGTCATAGTCCGC-3'(서열 22: Wong H et al. Anal Biochem 1994;223:251-258)를 이용하였다. PCR 산물은 각 반응순환에서는 94℃에서 1분 57℃에서 1분, 72℃에 1분간 확장하여 30회 반응시켰다. 그 결과는 도 5에서 보여주고 있으며 Fas 수용체는 인간 육종성 간세포암 세포주에서 발현되며 항암제(파르텔노이드)를 처리했을 때에도 변화가 없었다. 대조 세포로는 정상간 유래 간세포주인 창간 세포주, 인체 간암세포주인 Hep 3B 및 SK-HEP-1이 이용되었다.

<실시예 6> 인간 육종성 간세포암 세포주에서 Bcl-2 및 Bcl-X_L발현 분석

10cm 직경의 디쉬에 배양된 인간 육종성 간세포암 세포를 TE처리에 의해 수확한 후 50mM 트리스염화수소(Tris-HCl, pH 8.0), 150mM 소디움클로라이드(NaCl), 1% 트리톤-X 100(Triton X-100), 5mM 이디티에이(EDTA), 5mM 이지티에이(EGTA), 10mM 소디움 불소(NaF), 1 mM 소디움바나데이트(Na₃VO₄), 1mM 피엠에스에프(PMSF), 2μg/ml 류펩틴(leupeptin), 1mM 펩스타틴(pestatin), 및 1μg/ml 아프로티닌(aprotinin) 함유 완충액에 용해시키고 약 30μg의 단백질을 정량하여 램리 완충액에 혼합시켜 끓인 다음 15% 에스디에스 페이지(SDS-PAGE)에 전기영동하고 나이트로셀룰로스막에 전기전이 시켰다. 티비에스 5% 지방 밀크액으로 1시간 차단시킨 후 마우스 안티-Bcl-2 단클론항체(Ab-1, Calbiochem 사제품) 및 마우스 안티-Bcl-X_L단클론항체(H-5, Santa Cruz사 제품)를 넣은 티비에스용액에 4℃에서 하룻밤 교반하고 티비에스 완충액으로 3회 세척한 후 다시 2차 항체를 가하여 1시간 교반시킨 후 3회 세척한 후 이시엘(ECL) 웨스턴 블롯 키트를 이용하여 오토래디오그램을 제작하였다. 이때 기존의 간암세포 SK-HEP-1와 Hep 3B 세포를 각각 Bcl-2 단백 양성 및 음성 대조실험으로 각각 사용하였으며 그 결과 도 6에서처럼 SH-J1 인간 육종성 간암세포주에서 Bcl-2 단백을 잘 발현하고 있으며, Bcl-X_L단백은 양성대조세포 SK-HEP-1와 Hep 3B세포에서 잘 발현되고 있슴을 보여주고 있다.

본 발명에 해당하는 인간 육종성 간세포암세포주 SH-J1세포주는 간세포암에서 탈분화되어 육종성 항원 및 형질을 갖는 악성 세포주이며 장차 간세포암의 발암원인, 전이, 침습 등에 관련된 진단 및 치료제 개발에 유익하게 이용될 수 있다.

Claims

육종성 항원 및 육종성 형질을 특징으로 하는 인간 육종성 간세포암세포주 SH-J1(KCTC 10204BP)
인간 육종성 간세포암 세포주 SH-J1(KCTC 10204BP)에 의해 발현되는 육종성 항원인 비멘틴을 포함하는 분비 단백질