KR20030078250A - 마이크로-웰 플레이트를 이용한 미세체적 반응장치 겸미생물 판별장치 및 그 이용방법 - Google Patents

마이크로-웰 플레이트를 이용한 미세체적 반응장치 겸미생물 판별장치 및 그 이용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 부피가 0.1 nℓ 내지 10 ㎕인 마이크로-웰이 복수 개 형성된 마이크로-웰 플레이트와, 영상촬영기가 부착된 현미경으로 구성된 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 마이크로-웰 플레이트의 웰에 미생물이 포함된 피검액을 점적한 다음, 영상촬영기가 장착된 현미경을 사용하여 각 마이크로-웰의 영상을 촬영하고, 촬영된 각 마이크로-웰의 영상을 육안 또는 패턴분석 프로그램을 이용하여 확인하여 미생물을 동정하고 그 수를 확인하는 과정으로 이루어진 미생물 동정 및/또는 수 측정방법에 관한 것이다.
본 발명의 장치를 사용하여 미생물을 동정하고 그 수를 측정할 경우, 종래의 방법보다 소요시간이 대폭 단축되고, 간단하며 정확하게 측정할 수 있게 된다.

Description

마이크로-웰 플레이트를 이용한 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치 및 그 이용방법{Micro-Reactor or Apparatus for Identifying Microbes using Micro-well Plate, and Method for Using Thereof}
본 발명은 마이크로-웰 플레이트를 이용한 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치 및 그 이용방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 미세한 웰(well)이 복수개 형성되어 있는 마이크로-웰 플레이트를 이용하여 매우 적은 부피의 화학반응장치 및/또는 미생물을 동정하거나 계수할 수 있는 장치 및 방법에관한 것이다.
현재, 실험실 수준에서의 각종 화학, 생물적 반응은 통상 시험관에서 이루어지거나, 경우에 따라서는 소형 튜브에서 이루어지는 것이 현실이다. 이 경우 반응액의 부피는 0.1∼100㎖에 이르고 있는데, 일반적으로 화학실험 생물학 실험의 시료들은 매우 고가이기 때문에 반응액의 부피는 실험의 경제성을 낮게하는 요인이 되고 있다. 또한 반응액의 부피가 크기 때문에 전체 반응이 균일하게 일어나기 어렵다는 단점도 있다.
따라서 미세 부피의 반응액을 이용하여 원하는 결과를 얻을 수 있는 반응장치 및 반응방법이 개발될 필요성이 있다.
한편, 검체중의 미생물 동정 및 그 수의 측정은 미생물학 분야에서뿐만 아니라, 우리의 실생활에서 그 응용 범위가 다양하다. 예를 들면, 대량생산된 식품, 유제품, 육류, 해산물, 화장품 및 약품의 생산 및 가공 공정시 발생될 수 있는 미생물로 인한 오염 검사에 가장 기초적인 방법으로 널리 이용되고 있다.
그러나, 종래의 미생물 동정 및 수 측정방법으로는 배양방법, 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP) 측정방법, 면역분석방법 및 DNA 또는 RNA 탐침을 이용한 검출방법 등이 있으나, 각각이 내포하고 있는 단점 및 한계로 인하여 널리 활용되지 못하고 있는 실정이다.
배양방법은 미생물을 평판배지에 배양하여 어느 정도 성장이 이루어진 다음,그 수를 육안으로 측정하는 방법으로서, 소요되는 시간이 길고 정확성이 떨어지는 단점을 지니고 있다. ATP 측정방법은 모든 살아있는 개체에 존재하는 세포내 구성요소인 ATP의 양을 측정하여 미생물의 수를 산출하는 방법으로서, 생장하는 것과 사멸한 것에 상관없이 전체 미생물수를 얻어 신뢰도가 떨어질 뿐 아니라 미생물의 종류를 판별할 수 없는 단점이 있다. 면역분석 방법은 목적하는 미생물에 특이적인 항체를 이용하여 특정 미생물의 존재 및 그 수를 산출하는 방법으로서, 특정 미생물에만 한정되며, 분석을 위해 고가의 장비 및 경비가 소요되는 단점이 있다. DNA 또는 RNA 탐침을 이용한 검출방법은 단계가 매우 복잡하고, 인체에 유해한 시약을 사용하게 된다는 단점을 갖고 있다.
따라서, 종래의 미생물 동정 및 계수방법의 단점을 극복하며, 간단하며 신속하고 정확하게 미생물을 동정하고 그 수를 측정하는 장치 및 방법을 개발하여야할 필요성이 대두되고 있다.
이에, 본 발명자들은 미세체적의 반응액으로도 실험이 가능한 미세체적 반응장치, 및 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 미생물을 동정하고 그 수를 측정할 수 있는 장치 및 방법을 개발하고자 예의 연구·노력한 결과, 복수 개의 마이크로 웰을 만들어 제작한 마이크로-웰 플레이트를 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 마이크로-웰 플레이트와 영상촬영기가 부착된현미경으로 구성되어 있는 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 장치를 이용하여 미생물을 편리하게 동정하고, 미생물의 수를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 마이크로-웰 플레이트를 제작하는 과정을 보여주는 모식도.
도 2는 본 발명에 의한 마이크로-웰 플레이트의 평면도 및 부분확대도.
도 3은 본 발명에 의한 마이크로-웰 플레이트를 이용하여 피검액 중의 미생물을 촬영한 사진.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 부피가 0.1 nℓ 내지 10 ㎕인 마이크로-웰(Micro-well)이 복수 개 형성된 마이크로-웰 플레이트와, 영상촬영기가 부착된 현미경으로 구성된 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치에 관한 것이다.
본 발명에서 웰의 부피는 화학적, 생물학적 반응의 규모 또는 측정하고자 하는 미생물의 특징에 따라 조절될 수 있으며, 웰의 깊이(즉, 두께)는 상기 현미경의 초점조절이 필요 없을 정도의 깊이(즉, 현미경의 초점이 잡히는 거리 범위)이면서, 세균의 평균 사이즈(1 ∼3 ㎛) 보다는 깊고 미생물이 웰내에서 층상으로 배치되지 않도록 할 수 있는 정도의 깊이로 정할 수 있다. 다만, 실험에 의하면 웰의 깊이가 25 ㎛가 되어도 피검액을 점적한 후 약 1∼2분 경과하면 세포가 웰의 바닥으로 침강하는 현상이 발견되었다. 따라서 실질적으로 웰의 깊이는 세균의 평균 사이즈(1 ∼3 ㎛) 보다 깊기만 하면 적용상의 제한이 없다.
본 발명에서 마이크로-웰 플레이트의 재질은 취급이 용이하고 미세가공이 가능한 임의의 재질이라도 가능하다. 예를들면, 마이크로-웰 플레이트를 위한금형(mold)에 통상의 열가소성수지 또는 열경화성수지를 사출(injection molding)하여 제작할 수 있다. 또한 종래 반도체 공정에서 사용되는 단결정 실리콘 또는 단결정 게르마늄을 적용할 수도 있다.
단결정 실리콘 또는 단결정 게르마늄 재질의 것은 표면결함이 거의 없기 때문에 미생물 또는 미세입자를 배경과 용이하게 구분할 수 있는 장점이 있다. 또한 실리콘이나 게르마늄은 유기용매, 산, 알칼리에 대하여 내부식성이 있다. 따라서 다양한 화학적, 생물학적 실험을 위해 여러 가지 시약(staining 등)을 자유롭게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 용매선택에 제약이 없게 된다. 또한 현재 반도체산업에서 널리 사용되고 있는 반도체 공학기술을 활용하여 수십 nm 이하의 수평오차 보정기능, 수십 nm 정도의 정밀한 micro-stepping 기능 등을 활용하여 미세하고 정교한 웰을 구성할 수 있게 된다.
본 발명에서 마이크로-웰 플레이트상에 형성되는 웰의 수는 필요에 따라 다양하게 선택할 수 있다. 통상 많이 사용하고 있는 96-웰을 적용할 수도 있으며, 관찰의 집적도를 높이기 위해 20 개의 96-웰로 구성되는 총 1920-웰이 적용될 수도 있다.
통상적인 96-웰의 부피(working volume)가 약 200-250 ㎕인데 반하여 본 발명에 의한 마이크로-웰 플레이트에 형성된 웰의 부피는 0.1 nℓ 내지 10 ㎕이므로 약 이십만분의 일의 부피 감소효과가 있다. 화학 또는 생물학 실험에서 사용되는 시약 등이 비교적 고가임을 감안한다면 시약 사용에 있어 원가절감 효과뿐만 아니라, 실험 대상물의 부피가 매우 적기 때문에 반응속도 향상의 효과를 얻을 수 있을것이다.
한편, 본 발명에 의한 마이크로-웰 플레이트의 웰에는 각 웰마다 고유번호를 부여하여 관련장비들이 필요위치로 이동하는 것을 자동으로 제어할 수 있는 기준을 마련하는 것이 바람직하다. 이에 의해 각 웰마다 요구되는 반응 및 분석을 동시에 독립적으로 처리할 수 있게 된다.
본 발명에서 상기 영상촬영기는, 종래 영상분야에서 개발되어 사용되고 있는 기기 중 적절한 것을 선택할 수 있다. 그러나 촬영된 영상은 추후 디지털 처리를 거치는 것이 바람직하므로, 디지털 영상촬영기인 것이 바람직하다. 상기 영상촬영기는 광학 현미경을 통해 관찰되는 영상을 입력받게 된다.
상기 광학현미경은, 예컨대, 미생물과 이물질의 외형이 구분될 수 있도록 적절한 배율의 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 마이크로-웰 플레이트는 불투명한 재질(예를들면, 단결정 실리콘)이기 때문에, 일반적인 투광형 현미경(transmitted microscope)이 아닌 반사형 현미경(reflective microscope)이 적용된다. 일반적으로 반사형 현미경은 재료공학분야에서 많이 사용되지만, 본 발명자들이 확인한 결과 반사형 현미경이 반응액의 상태나 미생물을 관찰함에 있어 해상도 및 조작에 적절함을 알 수 있었다.
나아가 본 발명에서는 상기 영상촬영기를 통해 입력된 마이크로-웰내의 반응액 영상을 분석하여 반응의 진행도를 측정하는 반응분석 프로그램이 장착된 컴퓨터를 추가함으로써 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치에서의 반응상황을 자동으로 모니터링할 수 있게 된다. 예컨대, 반응이 진행되면서 반응액의 색상이 변화하는 반응인 경우, 촬영된 영상에서 반응액의 색상 변화를 분석함으로써 반응의 정도를 파악할 수 있게 되는 것이다.
또한 상기 장치에, 각종 미생물의 영상이 저장되어 있는 영상DB와, 영상촬영기를 통해 입력된 마이크로-웰의 영상을 패턴분석하여 피사물 중에서 배경과 미생물과 이물질을 구분하고, 영상DB를 참조하여 미생물을 동정 및/또는 계수하는 패턴분석 프로그램이 설치된 컴퓨터를 부가적으로 장착하여 사용하는 것이 바람직하다.
패턴분석 프로그램은 종래 영상처리 분야에서 개발된 적절한 프로그램을 적용할 수 있을 것이다.
또한 본 발명은, 전술한 미생물수 측정장치를 이용한 미생물 동정 또는 미생물 수 측정방법을 제공한다.
즉, 마이크로-웰 플레이트의 웰에 피검액을 점적한 다음, 영상촬영기가 장착된 현미경을 사용하여 각 마이크로-웰의 영상을 촬영하고, 촬영된 각 마이크로-웰의 영상을 육안으로 확인하여 미생물의 종류 및 그 수를 확인하는 과정을 통해 용이하게 미생물을 판별하는 방법을 제공하는 것이다. 이때 필요에 따라서 촬영된 영상을 확대증폭시키는 것도 바람직하다.
또한, 상기 패턴인식 프로그램을 적용하는 경우, 마이크로-웰 플레이트에 피검액을 점적하고, 영상촬영기가 장착된 현미경을 사용하여 각 마이크로-웰의 영상을 촬영한 다음, 패턴분석 프로그램을 이용하여 상기 촬영된 각 마이크로-웰의 영상을 패턴분석하여 피사물 중에서 미생물과 이물질을 형태적으로 구분하고, 영상DB를 참조하여 미생물의 종류를 판별(동정)하거나 미생물의 수를 자동으로 계수하는 과정을 통한 미생물 동정 및 그 수의 측정방법이 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 실리콘 웨이퍼를 재료로 한 마이크로-웰 플레이트의 제작
24,200 ×16,200㎛ 크기의 반도체용 단결정 실리콘 웨이퍼로부터 제작(dice)된 실리콘 칩의 표면에 가로200×세로200×깊이25㎛ 크기의 웰을 40 rows ×48 column 으로 1920개 형성시켰다. 제작공정을 도 1에 도시하였는데, 통상적인 반도체 제작공정에 적용되는 기술을 차용하였다. 구체적으로는 다음과 같은 단계를 거쳐 제작하였다.
① 결정구조가 <100>인 단결정 실리콘 웨이퍼(silicon wafer) 양 표면에 장시간 식각액(etchant 용액)에 견딜 수 있는 보호막(protection layer)을 증착시켰다.
② 웨이퍼의 일측면(polish side)에 포토레지스트(photo resist)를 얇게 코팅하였다.
③ 마이크로-웰 플레이트를 위한 패턴마스크를 인쇄한 후 노광(expose)하여 현상(develop)하였다.
④ 노광된 보호막을 식각(etch)한 후 남아있는 포토레지스트를 제거하였다.
⑤ 패턴이 식각된 웨이퍼를 식각액에 담가 약 25 ㎛ 정도 식각하였다.
⑥ 보호막을 제거하여 소수성 마이크로-웰 플레이트를 완성하였다.
⑦ 필요한 경우 상기 소수성 마이크로-웰 플레이트의 표면을 산화시켜 친수성 마이크로-웰 플레이트를 제작하였다.
1920개의 각 웰에는 각각 고유번호를 부여하였다. 제작된 마이크로-웰 플레이트의 평면사진과 부분 확대사진을 도 2에 A 및 B로 도시하였다.
추정실시예 2 : 압출성형에 의한 마이크로-웰 플레이트의 제작
실시예 1에서와는 반대로 패턴된 마스크를 이용하여 단결정 실리콘 재질로 된 금형(mold)의 제작이 가능할 것이다.
상기 제작된 금형에 다양한 소재의 플라스틱 수지를 사출성형(injection molding)함으로써 플라스틱 재질의 마이크로-웰 플레이트를 다량 제조할 수 있을 것이다.
실시예 3 : 마이크로-웰 플레이트를 이용한 미생물 개체의 확인
실시예 1에서 제작된 마이크로-웰 플레이트를 이용하여 과연 미생물과 배경 및 이물질을 구분할 수 있는지를 확인하였다. 샘플 피검체로는 배양된 수 종의 미생물 배양액을 이용하였다.
사용된 현미경 및 영상촬영장치는 Metallugical microscope(Nikon ME600D)였으며, 촬영된 영상은 digital image capture system(Nikon DXM1200)을 이용하였다.
필요한 경우 미생물의 가시화를 위해 미생물을 cristal violet(7% v/v)으로 염색하였다.
피검액을 점적한 후 약 1∼2분 경과하면 세포가 웰의 바닥으로 침강하는 현상이 발견되었다. 이 상태에서 촬영된 영상을 도 3에 도시하였다. 도에서 좌측은 하나의 웰 사진이고, 우측은 좌측 웰의 확대사진이다. 도에서 A, B 및 C는 각각Saccharomyces cerevisiae,Bacillus subtilis및E. coli의 배양액을 점적한 것이다.
도 3에서 볼 수 있듯이, 이스트와 세균 모두 본 발명에 의한 마이크로-웰 플레이트를 이용한 웰에서 개략적인 세포의 형상을 확인할 수 있었으며(즉, 넓은 범주의 동정이 가능하였으며), 세포가 이물질 및 배경과 구분되어 계수가 가능하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 장치 및 방법에 의하면① 각종 화학적, 생물학적 반응을 미세한 체적의 반응장치에서 수행할 수 있게 되어 실험의 경제성과 완전성을 얻을 수 있으며, ② 자동 또는 수동으로 피검액 중의 미생물을 동정하고, 미생물의 수를 측정할 수 있어 종래 미생물 분석방법에 비해 시간과 비용이 대폭 절약이 가능하게 된다.
따라서 특히 미생물학 연구 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 대량생산된 식품, 유제품, 육류, 해산물, 화장품 및 약품의 생산 및 가공 공정시 발생될 수 있는 미생물로 인한 오염 검사시 산업현장에서 널리 이용될 수 있을 것이다.

Claims (6)

  1. 부피가 0.1 nℓ 내지 10 ㎕인 마이크로-웰이 복수 개 형성된 마이크로-웰 플레이트와, 영상촬영기가 부착된 현미경으로 구성된 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    마이크로-웰 플레이트는 플라스틱, 단결정 실리콘 또는 단결정 게르마늄을 재질로 하는 것을 특징으로 하는 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 영상촬영기를 통해 입력된 마이크로-웰내의 반응액 영상을 분석하여 반응의 진행도를 측정하는 반응분석 프로그램이 장착된 컴퓨터가 추가된 것을 특징으로 하는 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치.
  4. 제 1항에 있어서,
    각종 미생물의 영상이 저장되어 있는 영상DB와;
    상기 영상촬영기를 통해 입력된 마이크로-웰의 영상을 패턴분석하여 피사물 중에서 배경과 미생물과 이물질을 구분하고, 상기 영상DB를 참조하여 미생물을 동정 및/또는 계수하는 패턴분석 프로그램;이 장착된 컴퓨터가 추가된 것을 특징으로 하는 미세체적 반응장치 겸 미생물 판별장치.
  5. 제 1 항의 장치를 이용한 미생물 동정 및/또는 수 측정방법으로서,
    (A) 마이크로-웰 플레이트의 마이크로-웰에 피검액을 점적하는 단계;
    (B) 영상촬영기가 장착된 현미경을 사용하여 각 마이크로-웰의 영상을 촬영하는 단계;
    (C) 촬영된 각 마이크로-웰의 영상을 육안으로 확인하여 미생물을 동정하거나 미생물의 수를 측정하는 단계;를 포함하는 미생물 동정 및/또는 수 측정방법.
  6. 제 4 항의 장치를 이용한 미생물수 측정방법으로서,
    (A) 마이크로-웰 플레이트에 피검액을 점적하는 단계;
    (B) 영상촬영기가 장착된 현미경을 사용하여 각 마이크로-웰의 영상을 촬영하는 단계;
    (C) 패턴분석 프로그램이, 촬영된 각 마이크로-웰의 영상을 패턴분석하여 피사물 중에서 미생물과 이물질을 형태적으로 구분하고, 영상DB를 참조하여, 미생물을 동정하거나 미생물의 수를 측정하는 단계;를 포함하는 미생물 동정 및/또는 수 측정방법.
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