KR20030077119A - 독소 생산 마이크로시스티스 검출방법 - Google Patents

독소 생산 마이크로시스티스 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 독소 생산 마이크로시스티스를 특이적으로 검출할 수 있는 유전자 탐침을 이용하여 정확하고 신속하게 독소 생산 마이크로시스티스를 검출하는 방법에 관한 것으로,
서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하여 구성된 유전자 탐침을 이용하여 조류를 포함하는 시료로부터 독소 생산 마이크로시스티스(Microcystis)를 검출하는 방법 및 상기 염기서열을 포함하여 구성되는 독소 생산 마이크로시스티스 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 방법은 남조류 균주들이 혼합되어 있는 시료에서도 독소 생산 여부에 따라 독소 생산 마이크로시스티스를 정확히 검출해 낼 수 있어, 녹조 발생 시 큰 문제가 되고 있는 유독 마이크로시스티스의 조기 감지를 위한 환경 모니터링에 있어 획기적인 표지 수단으로 사용될 수 있다.

Description

독소 생산 마이크로시스티스 검출방법{METHOD FOR DETECTING TOXIN-PRODUCING MICROCYSTIS}
본 발명은 독소 생산 마이크로시스티스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 독소 생산 마이크로시스티스를 특이적으로 검출할 수 있는 유전자 탐침을 이용하여 정확하고 신속하게 독소 생산 마이크로시스티스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
녹조 현상은 수화 현상의 한 종류로 남조류의 대량증식으로 인해 호수, 강, 저수지 등과 같은 담수호의 물이 녹색으로 변하는 현상을 의미하며, 이러한 녹조 현상에 의한 폐해 및 생태계에 미치는 영향은 다음과 같이 요약될 수 있다.
우선 시각적인 측면에서, 조류오염에 의한 착색 또는 녹조현상시료(scum)의 형성, 물고기의 집단 폐사 등으로 인한 시각적인 불쾌감 유발 및 이로인한 레크레이션 활동의 저해 등을 들 수 있다. 또한, 생태학적인 면에서, 생태계 파괴로인한 토종 생물의 사멸 또는 서식처 이동, 개체군 변화, 먹이 손실 등을 들 수 있다. 경제적으로도 조류에 의한 오염은 레크레이션 활동 및 여행의 저해로 인한 지역경제의 손실, 농업용수 및 산업용수 부족으로 인한 경제적 손실을 가져다준다. 그리고, 동물 건강에도 해로운 영향을 미칠 수 있으며, 예를들어 남조류 독소에 의한 가축이나 야생 동물의 폐사, 대량 증식한 조류의 사멸시 세균의 분해작용에 의해 산소가 소모됨으로써 수중 용존 산소의 부족으로 인한 물고기 및 수중 생물의 폐사를 들 수 있다. 또한 상수원에 미치는 영향으로서, 남조류 독소 발생, 이취미 생성, 상수처리과정중 여고지 폐쇄 및 불충분한 정수처리시의 응집침전 저해 등이 발생할 수 있다.
녹조 현상에 의한 영향 중에서 최근 가장 주복을 받고 있고 수이용상 큰 문제가 되고 있는 것이 바로 남조류가 생산하는 독소 문제이며, 남조류 가운데 마이크로시스티스(Microcystis) 속이 생산하는 독소가 가장 큰 문제를 일으키는 것으로 알려져 있다(Carmichael, 1994; Sivonenet al., 1995). 남조류가 대량 발생한 물을 인간이 직접 섭취함으로써 발생할 수 있는 급성 독성의 피해 가능성은 희박하지만, 마이크로시스틴(microcystin)이 함유된 물이 상수원으로 이용될 수 있고 정수처리과정이 불충분할 경우 미량이라도 인간에게 노출될 가능성이 있으므로 상수원수를 대상으로하여 독성물질을 생산하는 마이크로시스티스에 대한 현황파악 및 지속적인 모니터링이 필요하다. 특히 마이크로시스티스가 생산하는 마이크로시스틴은 수체내에서 생성후 2-3개월동안 분해되지않을 만큼 안정한 구조를 가지므로(Kiviranta et al., 1991), 녹조 대발생 이전의 초기 감지가 무엇보다 중요하다.
현재 국내에서는 마이크로시스티스를 비롯한 남조류에 의한 대발생을 모니터링하기위해 팔당호를 비롯한 대청-주암-충주호 등 4개 지역에 조류예보제를 실시하고 있으며 상수원으로 이용하는 전국의 모든 담수지역에 확대실시할 예정이다. 조류예보제란, 1) 조류주의보가 발령되었을 때, 취정수장은 염소소독을 강화하고, 활성탄 처리를 통해 고도정수처리를 해야하며, 동시에 독소검사를 강화하고, 2) 조류경보시에는 취수구를 이동하는 등의 대체수원을 확보해야하고, 간이 정수장의 급수를 중단하며, 3) 녹조 대발생의 원인균인 남조류 등이 생산한 마이크로시스틴 등의 독소가 검출되면, 급수를 중단하는 것이다(환경부, 2000). 조류 예보는 주의보, 경보, 대발생, 해제의 4단계로 되어있고, 각 단계는 다음의 기준에 의하여 발령된다(환경부, 2000). 1)주의보: 2회 연속 채취시 클로로필 a 농도 15-25mg/㎥, 남조류 세포수 500-5,000 cells/ml(이상의 조건 모두 해당시), 2) 경보: 2회 연속 채취시 클로로필 a 농도 25mg/㎥ 이상, 남조류 세포수 5,000 cells/ml이상(이상의 조건에 모두 해당시), 3) 대발생: 2회 연속 채취시 클로로필 a 농도 100mg/㎥ 이상, 남조류 세포수 1,000,000 cells/ml이상이며 녹조현상시료 발생시(이상의 조건에 모두 해당시), 4) 해제: 클로로필 a 농도 5mg/㎥ 이하.
녹조 발생에 대한 현재의 모니터링 방법은 주기적인 현미경 관찰을 통해 세포수를 측정하고 동정을 함으로써 수행되고 있다. 그러나 군체를 형성하는 마이크로시스티스 속의 계수의 어려움, 각 종간 분류에 중요한 형태학적인 특징들이 불분명하고 환경 조건에 따라 쉽게 변화됨으로 인한 정확한 동정의 어려움, 녹조 발생 초기시 적은 세포수로 인해 현미경 관찰을 통한 감지의 어려움 등이 있어 한계를 보이고 있다. 이러한 한계점들에 대한 해결 방법으로 분자생물학적 기술을 사용한 모니터링 방법들이 개발되었고, 16S rDNA 유전자,mcy유전자 등을 대상으로 한 유전자 탐침이 제작되었다(Schonhulberet al., 1999; Matsunaga, T.et al., 1999, Electrochimica Acta, 44:3779-3784; Rudiet al., 1998, 2000; Tillett, D.et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol., 67(6):2810-2818).
그러나, 기존의 16S rDNA, mcy 유전자 등을 대상으로 한 유전자 탐침의 개발 및 적용 실험들은 환경수 내의 다양한 미생물 중 마이크로시스티스만을 선별적으로 검출해낼 수 있는 범위를 가지고 있을뿐, 독소 생산 마이크로시스티스 균주를 검출해 낼 수는 없으므로, 독소 생산 마이크로시스티스 균주만을 검출하기위한 유전자탐침으로서는 적용의 한계를 나타내고있다.
이에 본 발명의 목적은 조류를 포함하는 시료에서 독소를 생산하는 마이크로시스티스만을 특이적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 독소 생산 마이크로시스티스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
도 1 -서로 다른 12 개의 마이크로시스티스속(Microcystis sp.)균주들에 대하여 본 발명의 유전자 탐침을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시한 후 전기 영동한 사진(M:Marker, 1:NIER-10001, 2:NIER-10008, 3:NIER-10010, 4:NIER-10015, 5:NIER-10037, 6:NIER-10039, 7:NIER-10051, 8:K-AG10073, 9:KOWACO, 10:Inje, 11:BC10, 12:PCC7005).
도 2 -서로 다른 12 개의 마이크로시스티스속 균주들에 대하여 본 발명의 유전자 탐침을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시한 후 전기 영동한 사진(M:Marker, 1:PCC7806, 2:PCC7820, 3:PCC7941, 4:CCAP1450/1, 5:CCAP1450/3, 6:CCAP1450/4, 7:CCAP1450/6, 8:NIER-10021, 9:NIER-10030, 10:NIER-10045, 11:NIER-10022, 12:NIER-10029).
도 3 -서로 다른 8 개의 마이크로시스티스속 균주들과 4 개의 아나베나속(Anabaena sp.)균주들에 대하여 본 발명의 유전자 탐침을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시한 후 전기 영동한 사진(M:Marker, 1:BC18, 2:NIER-10004,3:NIER-10025, 4:NIER-10056, 5:NIER-10017, 6:NIER-10020, 7:PUCC-1002, 8:NC5, 9:K-AG10008, 10:K-AG10011, 11:K-AG10082, 12:K-AG10083).
도 4 -서로 다른 4 개의 아나베나속 균주들, 2 개의 오실래토리아속(Oscillatoria sp.)균주들, 1 개의 노스톡속(Nostoc sp.)균주, 2 개의 시네코코쿠스속(Synechococcus sp.)균주들, 3 개의 세균주들에 대하여 본 발명의 유전자 탐침을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시한 후 전기 영동한 사진(M:Marker, 1:NIER-10016, 2:ATCC-22664, 3:K-AG10059, 4:K-AG10064, 5:NIER-10027, 6:NIER-10042, 7:CCAP1453/18, 8:CCAP1479/7, 9:CCAP1479/1B, 10:씨. 아시도보란스(C. acidovorans), 11:피. 애루지노사(P. aeruginosa), 12:피.푸티다(P. putida)).
도 5 -독소 생산 여부에 따라 남조류 균주들을 서로 다르게 혼합한 후, 본 발명의 유전자 탐침을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시한 후 전기 영동한 사진(M:마커, 1:음성 대조구, 2:양성 대조구, 3:Mix 1, 4:Mix 2, 5:Mix 3, 6:Mix 4, 7:Mix 5).
본 발명자들은 마이크로시스틴 합성 효소 유전자(microcystin synthetase gene(mcyA)의 일부 염기서열을 이용하는 경우, 환경수 내의 다양한 미생물 중 독소 생산 마이크로시스티스 균주만을 특이적으로 검출해 낼 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 일견지에 의하면, 서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하여 구성된 유전자 탐침을 이용하여 조류를 포함하는 시료로부터 독소 생산 마이크로시스티스(Microcystis)를 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 유전자 탐침을 포함하여 구성되는 독소 생산 마이크로시스티스 검출용 키트가 제공된다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 유전자 탐침은 마이크로시스티스(Microcystis)의 마이크로시스틴 합성효소 유전자(mcyA)를 구성하는 염기서열의 일부이다.
본 발명의 유전자 탐침은 GenBank의 DNA 및 단백질 서열 데이타베이스로부터 21개의 서로 다른 마이크로시스티스 균주들의mcyA유전자의 염기서열을 얻어 나열하고, 이를 통하여 특이적으로 보존력있는 부분을 찾아 제작하였으며,mcyA유전자의 2153 - 2173(bp) 및 3265- 3283에 위치하는 것이다. 본 발명의 독소 생산 마이크로시스티스 검출용 유전자 탐침의 염기서열을 서열번호 1(Cho09F) 및 2(Cho10R)에 나타내었다.
기존의 분자생물학적 기술을 사용한 마이크로시스티스에 대한 모니터링 방법은 16S rDNA 유전자,mcy유전자 등을 대상으로 한 유전자 탐침을 이용하고 있으나(Schonhulberet al., 1999; Matsunaga, T.et al., 1999, Electrochimica Acta, 44:3779-3784; Rudiet al., 1998, 2000; Tillett, D.et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol., 67(6):2810-2818), 이러한 기존의 검출방법은 마이크로시스티스를 검출해낼 수 있을뿐, 실제로 중요한 독소를 생산하는 마이크로시스티스 균주에 대한 검출이 이루어지지않았다. 그러나, 본 발명의 유전자 탐침을 이용하는 경우, 독소를 생산하는 마이크로시스티스만을 특이적으로 신속하게 검출할 수 있다.
본 발명의 유전자 탐침을 이용하여 독소 생산 마이크로시스티스 균주에 대하여 PCR을 수행하면, 약 1.1Kb의 PCR 산물이 형성되며, 이는 남조류 독소 합성에 관여하는 마이크로시스틴 합성 효소 유전자(microcystin synthetase gene(mcyA)의 2153(nt)에서부터 3283(nt)까지의 위치에 해당하는 부분이다. 따라서, 본 발명의 유전자 탐침은 PCR용 프라이머로서 이용되어 조류를 포함하는 시료로부터 PCR을 수행함으로써 독소 생산 마이크로시스티스의 유무를 특이적으로 검출할 수 있다. 특히, 본 발명의 유전자 탐침은 담수에서 주요 마이크로시스틴인 마이크로시스틴-LR, -LA, -RR, -YR 과 노둘라린(nodularin) 등을 생산하는 마이크로시스티스 균주를 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 유전자 탐침을 이용하여 검출가능한 독소 생산 마이크로시스티스속 균주들의 종류는 예를들어, 마이크로시스티스 에루지노사(M. aeruginosa),마이크로시스티스 비리디스(M. viridis),마이크로시스티스 이치티오블래이베(M. ichthyoblabe),마이크로시스티스 노바세키이(M. novacekii)를 포함한다.
본 발명의 방법은 호수나 강의 환경수 시료로부터, 특히 남조류가 혼합된 시료로부터 독소 생산 마이크로시스티스를 특이적으로 검출해내는데 유용하다.
또한, 본 발명의 유전자 탐침을 포함하는 남조류 독소 합성에 관여하는 유전자 또는 마이크로시스티스의 mcyA 유전자가 독소 생산 마이크로시스티스를 특이적으로 검출해내는데 이용가능할 있을 것으로 예측된다.
또한, 본 발명의 유전자 탐침은 유전자 칩과 같은 검출용 키트에 포함되어 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
<실시예 1> 시료의 준비
분리되어 배양되는 마이크로시스티스(Microcystis) 균주 혹은 녹조가 발생한 담수를 채수하여 원심분리를 통한 세포조체를 수집한 후, DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 서로 다른 12개의 마이크로시스티스 균주(1:마이크로시스티스 에루지노사(M. aeruginosa) NIER-10001, 2:M.aeruginosaNIER-10008, 3:M.aeruginosaNIER-10010, 4:M.aeruginosaNIER-10015, 5:M.aeruginosaNIER-10037, 6:M.aeruginosaNIER-10039, 7:M.aeruginosaNIER-10051, 8:M.aeruginosaK-AG10073, 9:M.aeruginosaKOWACO, 10:M.aeruginosaInje, 11:M.aeruginosaBC10, 12:M.aeruginosaPCC7005)들에 대한 지노믹 DNA를 추출하였다.
<실시예 2> 각 균주의 독소 생산 여부 조사(ELISA를 통한 분석)
상기 추출된 시료로부터 서로 다른 12개의 마이크로시스티스 균주들의 독소 생산 여부를 상업적으로 판매되는 ELISA(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay) Kit(Microcystin Tube Kit, Cat.# ET022, EnviroLogix, USA)를 사용하여 측정하였다. 매 실험시마다 0.5 ppb 캘리브레이터(calibrator)와 3 ppb 캘리브레이터를 사용하여 각 시료마다의 색 변화 측정과 OD(450nm에서 UV 스펙트로포토미터로 측정) 값을 측정하고 이를 비교하여 대략적인 마이크로시스틴의 농도를 예측하여 0.5ppb와 3ppb 캘리브레이터와의 상관관계를 회귀직선으로 나타내어 각 시료의 마이크로시스틴 농도를 계산하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
ELISA 분석에 의한 12개의 서로 다른 마이크로시스티스 균주들의 독소 생산 여부 측정 결과
시료/균주 O.D.* 계산된 마이크로시스틴 농도(ppb)
0.5ppb 캘리브레이터 1.252 0.5
3ppb 캘리브레이터 0.801 3
NIER-10001 >2 ND**(-3.65>)
NIER-10008 >2 ND(-3.65>)
NIER-10010 0.152 6.60
NIER-10015 0.378 5.34
NIER-10037 1.023 1.77
NIER-10039 0.064 7.09
NIER-10051 1.555 ND(-1.18)
K-AG 10073 1.643 ND(-1.67)
KOWACO >2 ND(-2.51)
Inje 1.907 ND(-2.23)
BC 10 1.902 ND(-2.22)
PCC7005 1.719 ND(-1.68)
*O.D.는 450nm에서 측정됨.
**ND(검출한계이하로 측정되지않음)
ELISA 분석 결과, 크로시스티스 에루지노사(M. aeruginosa) NIER-10010, NIER-10015, NIER-10037 및 NIER-10039에서 독소를 생산하는 것으로 확인되었다.
<실시예 3> 각 시료에 대한 PCR(중합효소 연쇄반응) 반응
상기 실시예 1로 부터 얻은 서로 다른 12개의 마이크로시스티스 균주들의 DNA 시료를 이용하여, 프라이머로서 서열번호 1 및 2에 나타낸 본 발명의 유전자 탐침(각각, Cho09F 및 Cho10R)을 사용하여 PCR을 수행한 후, 그 반응 생성물을 전기영동하여 하기 도 1에 나타내었다(0.8% 아가로즈겔(BMA, USA), 마커: 1kb DNA ladder(Gibco, USA).
PCR은 다음과 같은 조건으로 수행되었다.
반응 혼합물의 구성:
지노믹 DNA 1㎕
100 pmol Cho09F 2㎕
100 pmol Cho10R 2㎕
10 mM dNTP 혼합물 2㎕
10 ×Han-OMNI PCR 완충액 5㎕
Taq DNA 중합효소(Genenmed, Korea) 0.2㎕
dH2O 38.8㎕
반응 조건(초기 변성 및 최종 연장과정을 제외하고 25회 반복):
초기 변성 과정 - 95℃, 4분
변성 과정 - 95℃, 20초
어닐링 과정 - 63℃, 30초
중합 과정 - 72℃, 1분
최종 연장 과정 - 72℃, 7분
좌측에서부터 각 래인은 M:마커(1kb DNA ladder, Gibco, USA), 1:마이크로시스티스 에루지노사(M. aeruginosa) NIER-10001, 2:M.aeruginosaNIER-10008, 3:M.aeruginosaNIER-10010, 4:M.aeruginosaNIER-10015, 5:M.aeruginosaNIER-10037, 6:M.aeruginosaNIER-10039, 7:M.aeruginosaNIER-10051, 8:M.aeruginosaK-AG10073, 9:M.aeruginosaKOWACO, 10:M.aeruginosaInje, 11:M.aeruginosaBC10, 12:M.aeruginosaPCC7005를 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 각 균주들의 ELISA 실험 결과를 통하여 독소를 생산하는 것으로 확인된 마이크로시스티스 에루지노사(M.aeruginosa)NIER-10010(3), NIER-10015(4), NIER-10037(5) 및 NIER-10039(6)에서만 중합효소 연쇄반응의 산물이 형성되었다.
<실시예 4> 본 발명의 유전자 탐침을 이용한 독소 생산 남조류 검출효과에 대한 다른 균주들에 대한 확인 시험
1. 실시예 1-3에 나타낸 방법과 동일한 방법을 사용하여, 서로 다른 12개의 마이크로시스티스 균주들에 대하여 상기 유전자 탐침을 사용하여 독소 생산 남조류 검출효과에 대한 확인 시험을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다(M:마커, 1:M. aeruginosaPCC7806, 2:M. aeruginosaPCC7820, 3:M. aeruginosaPCC7941, 4:M. aeruginosaCCAP1450/1, 5:M. aeruginosaCCAP1450/3, 6:M. aeruginosaCCAP1450/4, 7:M. aeruginosaCCAP1450/6, 8:M. ichthyoblabeNIER-10021, 9:M. ichthyoblabeNIER-10030, 10:M. ichthyoblabeNIER-10045, 11:M. novacekiiNIER-10022, 12:M. novacekiiNIER-10029).
그 결과, 각 균주들의 ELISA 실험 결과를 통하여 독소를 생산하는 것으로 확인된 마이크로시스티스 에루지노사(M. aeruginosa)PCC7806(1), PCC7820(2), PCC7941(3) 및 CCAP1450/6(7)에서만 중합효소 연쇄반응의 산물이 형성되었다.
2. 실시예 1-3에 나타낸 방법과 동일한 방법을 사용하여, 서로 다른 8개의 마이크로시스티스 균주들과 서로 다른 4개의 아나베나 균주들에 대하여 상기 유전자 탐침을 사용하여 독소 생산 남조류 검출효과에 대한 확인 시험을 행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다(M:마커, 1:M. novacekiiBC18, 2:M. sp.NIER-10004, 3:M. sp.NIER-10025, 4:M. sp.NIER-10056, 5:M. viridisNIER-10017, 6:M. viridisNIER-10020, 7:M. viridisPUCC-1002, 8:M. wesenbergiiNC5, 9:A. affinis K-AG10008, 10:A. flos-aquaeK-AG10011, 11:A. flos-aquaeK-AG10082, 12:A. flos-aquaeK-AG10083).
그 결과, 각 균주들의 ELISA 실험 결과를 통하여 독소를 생산하는 것으로 확인된 마이크로시스티스 속 NIER-10004(2), 마이크로시스티스 비리디스(M. viridis)NIER-10017(5), NIER-10020(6)에서만 중합효소 연쇄반응의 산물이 형성되었다.
3. 실시예 1-3에 나타낸 방법과 동일한 방법을 사용하여, 3종류의 균주들 즉, 서로 다른 4개의 아나베나(Anabaena) 균주들, 2개의 오실래토리아(Oscillatoria)균주들, 1개의 노스톡(Nostoc) 균주, 2개의 시네코코쿠스(Synechococcus) 균주들에 대하여 상기 유전자 탐침을 사용하여 독소 생산 남조류 검출효과에 대한 확인 시험을 행하였다. 또한 대조군으로 다른 세균인 코마모나스(Comamonas), 슈도모나스(Pseudomonas) 균주들에 대해서도 동일한 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다(M:마커, 1:아나베나 마크로스포라(A. macrospora) NIER-10016, 2:아나베나 속(A. sp) ATCC-22664, 3:A. sp.K-AG10059, 4:아나베나 스페셜(A. special) K-AG10064, 5:오실래토리아 상타(O. sancta) NIER-10027, 6:오실래토리아 상타(O. sancta) NIER-10042, 7:노스톡 엘립소스포럼(Nostoc ellipsosporum)CCAP1453/18, 8:시네코코쿠스 바실라리스(Synechococcus bacillaris) CCAP1479/7, 9:시네코코쿠스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus)CCAP1479/1B, 10:코마모나스 아시도보란스(C. acidovorans), 11:슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa), 12:슈도모나스 푸티다(P. putida)).
그 결과, 각 균주들의 ELISA 실험을 통하여 독소 생산 균주가 없음을 확인하였고, 모든 균주들에서 중합효소 연쇄반응의 산물이 형성되지 않았다.
4. 실시예 1-3에 나타낸 방법과 동일한 방법을 사용하여, 독소 생산 여부에 따라 남조류 균주들을 서로 다르게 혼합한 후, 상기 유전자 탐침을 사용하여 독소 생산 남조류 검출효과에 대한 확인 시험을 행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다(M:마커, 1:음성 대조구, 2:양성 대조구, 3:Mix 1(독소를 생산하지않는 M.aeruginosaInje와 독소를 생산하는M. sp.NIER-10004, NIER-10039, PCC7806),PCC7820의 혼합), 4:Mix 2(독소를 생산하지않는 M.aeruginosaInje, M.aeruginosaK-AG10073과 독소를 생산하는 M.aeruginosaNIER-10039, PCC7806, PCC7820의 혼합), 5:Mix 3(독소를 생산하지않는 M.aeruginosaInje, K-AG10073, CCAP1450/1과 독소를 생산하는 PCC7806, PCC7820의 혼합), 6:Mix 4(독소를 생산하지 않는 Inje, K-AG10073, CCAP1450/1, BC18과 독소를 생산하는 PCC7820의 혼합), 7:Mix 5(MicrocystisPCC7806,AnabaenaK-AG10082,OscillatoriaNIER-10027,NostocCCAP1453/18 및SynechococcusCCAP1479/1B의 혼합).
그 결과, 독소 생산 마이크로시스티스 균주가 혼합되지 않은 lane 1의 경우를 제외하고 독소 생산 마이크로시스티스 균주가 1 종 이상 혼합된 시료에서 모두 중합효소 연쇄반응의 산물이 형성되었다.
따라서, 상기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유전자 탐침을 이용하여 각 시료로부터 PCR을 수행함으로써 독소를 생산하는 마이크로시스티스 균주를 비교적 간단하면서도 신속, 정확하게 검출해낼 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 방법은 독소 생산 마이크로시스티스를 특이적으로 검출하는 표지 수단으로서, 분리되어 배양되는 독소 생산 마이크로시스티스 균주 뿐만 아니라, 남조류 균주들이 혼합되어 있는 시료에서도 독소 생산 여부에 따라 독소 생산 마이크로시스티스를 정확히 검출해 낼 수 있어, 녹조 발생시 큰 문제가 되고 있는 유독 마이크로시스티스의 조기 감지를 위한 환경 모니터링에 있어 획기적인 표지 수단으로 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하여 구성된 유전자 탐침을 이용하여 조류를 포함하는 시료로부터 독소 생산 마이크로시스티스(Microcystis)를 검출하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자 탐침은 중합효소 연쇄반응에 적용됨으로써 조류를 포함하는 시료로부터 독소 생산 마이크로시스티스(Microcystis)를 검출하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 시료는 호수나 강의 환경수임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 시료는 남조류가 혼합된 시료임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 유전자 탐침은 남조류 독소 합성에 관여하는 유전자로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 유전자 탐침은 마이크로시스티스의 mcyA 유전자로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하여 구성되는 독소 생산 마이크로시스티스 검출용 키트.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100451062B1 (ko) * 2002-05-08 2004-10-02 한국과학기술원 중합효소 연쇄반응을 이용한 마이크로시스틴을 생산하는남조류의 검색 방법
CN100387985C (zh) * 2003-12-05 2008-05-14 浙江大学 水中痕量微囊藻毒素的检测方法
KR100863325B1 (ko) * 2007-03-29 2008-10-15 한국생명공학연구원 수체에 존재하는 마이크로시스티스 속과 독성마이크로시스티스 속을 동시에 검출 및 정량화하는 방법
CN102109515A (zh) * 2010-08-13 2011-06-29 许昌学院 一种节球藻毒素多抗免疫亲和柱的制备和使用方法
CN103113877A (zh) * 2013-01-11 2013-05-22 长春理工大学 一种检测水中微囊藻毒素-lr的荧光探针
WO2014137196A1 (ko) * 2013-03-07 2014-09-12 한국생명공학연구원 한국 담수 수계의 위해성 남조류의 검출과 정량측정을 위한 ｄｎａ 칩
CN113652472A (zh) * 2021-07-27 2021-11-16 壹健生物科技(苏州)有限公司 一种检测产毒微囊藻菌型的探针组合、芯片、试剂盒及方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0452596A1 (en) * 1990-04-18 1991-10-23 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of non-viral microorganisms
JPH1057055A (ja) * 1996-08-21 1998-03-03 Shin Nippon Kishiyou Kaiyo Kk アオコ原因微生物のミクロキスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属をモノクローナル抗体で識別する方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100451062B1 (ko) * 2002-05-08 2004-10-02 한국과학기술원 중합효소 연쇄반응을 이용한 마이크로시스틴을 생산하는남조류의 검색 방법
CN100387985C (zh) * 2003-12-05 2008-05-14 浙江大学 水中痕量微囊藻毒素的检测方法
KR100863325B1 (ko) * 2007-03-29 2008-10-15 한국생명공학연구원 수체에 존재하는 마이크로시스티스 속과 독성마이크로시스티스 속을 동시에 검출 및 정량화하는 방법
CN102109515A (zh) * 2010-08-13 2011-06-29 许昌学院 一种节球藻毒素多抗免疫亲和柱的制备和使用方法
CN103113877A (zh) * 2013-01-11 2013-05-22 长春理工大学 一种检测水中微囊藻毒素-lr的荧光探针
WO2014137196A1 (ko) * 2013-03-07 2014-09-12 한국생명공학연구원 한국 담수 수계의 위해성 남조류의 검출과 정량측정을 위한 ｄｎａ 칩
CN113652472A (zh) * 2021-07-27 2021-11-16 壹健生物科技(苏州)有限公司 一种检测产毒微囊藻菌型的探针组合、芯片、试剂盒及方法

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