KR20030075123A

KR20030075123A - 사람 정장을 함유한 항암 조성물

Info

Publication number: KR20030075123A
Application number: KR1020020014341A
Authority: KR
Inventors: 배석년; 박래옥
Original assignee: 배석년; 박래옥
Priority date: 2002-03-16
Filing date: 2002-03-16
Publication date: 2003-09-22

Abstract

본 발명은 활성 성분으로서 약제학적으로 유효한 양의 사람 정장과 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유한 항암 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항암 조성물은 암세포의 괴사를 유도하여 암세포를 사멸시킴으로써 여러 종류의 암을 치료하는데 효과적이다.

Description

사람 정장을 함유한 항암 조성물{Anticancer Composition Comprising Human Seminal Plasma}

본 발명은 사람 정장(human seminal plasma, 이하 “hSP”라 한다)을 포함함을 특징으로 하는 항암 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 활성성분으로서 약제학적으로 유효한 양의 hSP와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유하여 여러 종류의 암을 치료하는데 유용한 항암 조성물에 관한 것이다.

화학요법의 발전으로 암환자의 생존율 및 치유율은 개선되고 있으나 항암제의 강한 독성으로 정상 세포에 심각한 손상을 입는 것이 큰 문제점이다. 이러한 항암제의 부작용을 막기 위해 암세포의 증식을 특이적으로 억제할 수 있는 물질이 요구되고 있다.

화학요법에서 항암제로서 유용한 화합물은 국제특허공개 WO 96/40142호, WO 97/40142호, WO 97/13771호 및 WO 95/23141호에 기술되어 있다.

최근에 세포 사멸이 상이한 두 가지 유형으로 나타나는 것으로 밝혀졌다. 즉, 유전자에 의해 제어되는 세포 사멸 유형인 세포자살(apoptosis)과 유전자에 의해 제어되지 않는 세포 사멸 유형인 세포괴사(necrosis)이다. 생화학적 검사에 따르면 통상적인 항암제는 암세포의 괴사를 유발함으로써 항암효과를 나타낸다.

본 발명자들은 hSP가 암세포의 괴사를 유도하여 암세포를 사멸시키는 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 hSP를 포함함을 특징으로 하는 항암 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명의 항암 조성물이 사람 폐 섬유아세포 WI-38(A), 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3(B) 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(C)(복수)의 세포 생존력에 미치는 효과를 보여주는 MTT 검정 결과이다.

도 2는 본 발명의 항암 조성물이 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 마우스 근육 섬유아세포 NIH3T3, 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수), 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 사람 유선 상피암세포 MDA-MB-231의 세포생존력에 미치는 효과를 보여주는 MTT 검정 결과이다.

도 3은 본 발명의 항암 조성물 및 항암제 TAXOL, CISPLATIN이 사람 신장 상피세포 293cell의 세포 생존력에 미치는 효과를 보여주는 MTT 검정 결과이다.

도 4는 본 발명의 항암 조성물이 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수)의 세포 주기에 미치는 효과를 보여주는 유세포분석 결과이다.

도 5는 본 발명의 항암 조성물에 노출된 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수)로부터 추출된 DNA의 아가로즈 겔 전기영동 분석 결과이다(레인 1; WI-38세포, hSP 처리 안함, 레인 3; NIH:OVCAR-3세포, hSP 처리 안함, 레인 4; SK-OV-3세포, hSP 처리 안함, 레인 5; WI-38세포, hSP 6시간 처리, 레인 7; NIH:OVCAR-3세포, hSP 6시간 처리, 레인 8; SK-OV-3세포, hSP 6시간 처리, 레인 9, WI-38세포, hSP 12 시간 처리, 레인 11; NIH:OVCAR-3세포, hSP 12 시간 처리, 레인 12; SK-OV-3세포, hSP 12시간 처리).

도 6은 본 발명의 항암 조성물에 의한 사람 폐 섬유아세포 WI-38(A), 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3(B) 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(C)(복수)의 괴사 효과를 보여주는 BrdU 검정 결과이다.

도 7은 본 발명의 항암 조성물에 의해 처리 또는 비처리된 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수)의 형광현미경 분석 사진이다.

도 8은 본 발명의 항암 조성물에 의해 처리 또는 비처리된 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수)에 의해 형성된 피하 종양의 조직 사진이다.

본 발명의 항암 조성물은 사람 정액을 1차 원심분리하여 정자를 제거한 상청액을 새로운 시험관에 옮긴 후, 2차 원심분리하여 상청액을 제거한 나머지 용액을 가열한 후 약 1:20 내지 1:100의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제에 의한 희석비로 제조한다. hSP의 주요 성분은 알부민(albumin), 락토페린(lactoferrin),전달요소(transferring factors), 면역글로불린, 산 포스파타제(acid phosphatase), L-카르니틴(L-carnitine), 구연산(citric acid), 프락토즈(fructose), 마그네슘(magnesium), 아연(zinc), 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 글리세로포스포콜린(glycerophosphocholine)이다. 특히, 본 발명자들은 hSP의 구성성분 중 일부가 세포의 미토콘드리아에 작용하여 전자현미경 소견상 미토콘드리아가 깨어지는 반응을 관찰하였고, 암세포 및 정상세포 모두에 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 반면, 다른 일부 성분이 세포를 보호하는 역할이 있으며 정상세포를 암세포보다 더 많이 보호한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 항암제로서 치료에 유용하고 독성 및 부작용 모두의 관점에서 현재 이용되고 있는 항암 약물과 연관된 결함을 나타내지 않는다는 점에서 매우 유리하다.

본원에서는 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 많은 종류의 암 가운데 대표적으로 상피성 난소암을 대상으로 설명하고자 한다. 그러나, 당업자는 본원에 예시적으로 기재된 상피성 난소암에 대한 본 발명의 조성물 효과를 보고 다른 유형의 암에 대해서도 마찬가지로 동일하게 적용할 수 있음을 인식할 것이다.

상피성 난소암은 난소암중 가장 흔한 유형일 뿐만 아니라 부인과의학에서 악성에 의한 주된 사망 원인이다. 상피성 난소암 환자의 치사율이 가장 높게 나타나는 이유는 상피성 난소암의 잠행성 진행으로 인해 암이 상당히 진행된 단계에서 진단되는 것이 대부분이기 때문이다(Ozols, R. F., Semin. Oncol., vol. 22, pp61-66, (1995)). 비록 종양을 수술로 제거하거나 적극적인 화학요법이 난소암의 표준치료법이긴 하지만 전체 생존율은 약물 내성으로 인하여 단지 20 내지 30%에 불과하다.

현재까지도 상피성 난소암의 위험 요소와 원인에 관하여 잘 알려져 있지 않다. 많은 연구들은 배란의 빈도와 상피성 난소암의 발전 사이에 밀접한 관계가 있음을 공통적으로 보여주고 있다. 상피성 난소암의 발생률은 젊은 여성과 나이든 여성(이른 초경과 늦은 폐경기)(Franceshi, S. et al., Int. J. Cancer, vol. 49, pp 57-60, (1991)), 미혼(Taylor, S.R. et al., Cancer, vol. 12, p1207-, (1959); Fraumeni, H.F. et al., J. Natl. Cancer Inst., vol. 42, p455-, (1969); Dorn, H.F. et al., Public Health Monogr. 56, PHS Publication No. 590, (1959); Weiss, N.S. et al., J. Natl. Cancer Inst., vol. 58, p913-, (1977)) 및 미출산 여성(Nergri, E. et al., Int. J. Cancer, vol. 49, pp50-56, (1991))에서 증가하고 있다. 한편, 경구용 피임약은 상피성 난소암의 발전에 대해 방어 효과를 나타내는 것으로 일반적으로 알려져 있다(Stanford, J.L., Contraception 43, pp543-556, (1991); Negri, E. et al., Int. J. Cancer, vol. 49, pp50-56, (1991); Franceshi, S. et al., Int. J. Cancer, vol. 49, pp61-65, (1991)). 상피성 난소암의 발병을 설명하는 유력한 학설은 배란 동안 난소 상피 표면이 반복적으로 분열하고 회복하기 때문이라는 것이다(Fathalla M.F., Lancet., vol. 2, p163-, (1971)). 상피 표면이 회복되는 과정에 변형된 상피 세포는 자발적으로 돌연변이되고, 종양 억제 유전자가 불활성화되며 발암물질에 의해 온코진이 활성화되기 쉽다.

hSP는 림프구에 대한 세포독성 영향에 의한 성교 후의 면역학적 손상으로부터 정자를 보호한다고 알려져 있다(Stities, D.P. et al., Nature, vol. 253, pp727-729, (1975); James, K. et al., Immunol., vol. 6, pp61-70, (1985)). 또한, hSP는 체액성 면역의 발달과 생체내 종양 성장의 증진을 억제시킬 수 있다고 제시되었으며(Anderson, D.J. et al., Immunol., vol. 128, pp535-539, (1985); Michaelis, M. et al., Anticancer Drugs, vol. 11, pp369-376, (2000)), 자궁경부 상피성 암종세포에서 메탈로프로테이나제(metalloproteinase) (MMP)-2 및 MMP-9의 전령 RNA가 생성되는 것에 영향을 미친다. 이에 따라 성행위는 자궁경부암의 진행에 영향을 미칠 수 있다(Jeremias, J. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., vol. 181 pp591-595, (1999)).

최근 소의 정액 리보뉴클레아제(BS-RNase)는 사람 림프구와 사람 종양세포의 세포자살(apoptosis)을 시간과 농도에 의존적으로 유도하는 능력을 가지고 있다고 밝혀졌다. BN-RNase는 화학치료 약물에 대한 내성적인 NB 세포에 대하여 높은 효능을 나타내는 물질이다(Cinatl, J. et al., Anticancer Res., vol. 20, pp853-859, (2000); Cinatl, J. et al., Int. J. Oncol., vol. 15, pp1001-1009, (1999)). 조르고브(Gjorgov)는 사례-대조 연구 및 많은 생태학적 조사를 실시하여 사람 정액 요소에의 감소된 노출과 유방암 발생사이의 상호관계를 조사하였다. 그는 차단피임방법(콘돔)을 사용한 여성이 비차단 피임방법(피임약, IUD(Intra Uterine Device), 리듬 또는 난관 결찰)을 사용한 여성보다 유방암 발생 위험도가 5.2배 더 높다고 결론지었다(Gjorgov, A.N. et al., Folia Med., vol. 40, pp17-23, (1998)).

상술한 바와 같은 상피성 난소암과 정장사이의 관계에 관한 종래 지식으로부터 본 발명자들은 상피성 난소암이 배란기간동안 hSP에 대한 감소된 노출은 상피성 난소암의 발전에서 병인학적 위험요소 중 하나이며, hSP의 성분이 악성형질전환된 상피 세포를 제거하는데 기여할 수 있을 것으로 추론하였다.

본 발명자들은 생체내 및 시험관내에서 상피성 난소암 세포(SK-OV-3, OVCAR-3)에 미치는 정자-유리된 hSP의 영향을 연구하고, 또한 대조군으로서 섬유아세포 (Wi-38) 및 사람 신장 상피세포(293cell) 등에 미치는 정자-유리된 hSP의 영향을 시험하는 과정에서 정자-유리된 hSP가 상피성 난소암의 성장에 억제 활성을 나타낸다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명자들의 난소암 세포의 시험관내 검정에 따르면, hSP는 특히 약 1:20 내지 1:100의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제에 의한 희석비에서 상피성 난소암 세포의 괴사를 유도하는 반면 섬유아세포에는 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서 바람직한 양태로서, hSP는 약 1:20 내지 1:100, 가장 바람직하게는 약 1:50의 희석비를 사용한다.

SK-OV-3 난소암 세포주의 접종에 의해 종양이 생긴 누드(nude) 마우스(BALB-c)를 사용한 생체내 실험에서 본 발명의 조성물은 주요 기관에서 탐지될 정도의 독성 효과를 나타내지 않으면서 종양의 괴사를 유도하였다. 이러한 발견은 본 발명의 조성물이 안전하면서 상피성 난소암의 치료에 유용하다는 것을 증명한다.

본 발명의 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 여러 종류의 암을 치료하는데 유용할 수 있다: 방광, 유방, 장, 신장, 간, 폐(소세포폐암 포함), 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 경부, 갑상선, 전립선 및 피부(편평상피 세포 암종 포함)와 같은 암종; 백혈병, 급성 임파성 백혈병, 급성림프성 백혈병, B-세포 임파종, T-세포 임파종, 호지킨 임파종, 비호지킨 임파종, 모발상 세포 임파종 및 버킷 임파종을 포함한 림프계열의 조혈성 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군 및 전골수구성백혈병을 포함한 골수계열의 조혈성 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간충직 발원의 종양; 성상세포종, 신경모세포증, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소건피증, 각화극세포종, 갑상선 여포상암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양.

바람직한 양태로서, 본 발명의 조성물은 폐암, 뇌암, 유방암, 대장암의 억제 또는 치료에 유용하며, 특히 바람직하게는 상피성 난소암의 억제 또는 치료에 유용하다.

본 발명의 조성물은 단독으로 또는 방사선 요법 또는 화학 요법(세포성장정지 또는 세포독성 물질, 항생물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제(예를 들면, COX-2 억제제), 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 테로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합제, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료와 병용하여 투여할 수 있다.

예로서, 본 발명의 조성물은 리포좀 제제내에 임의로 함유된 하나 이상의 화학요법제(예를 들면, 택산, 택산 유도체, 캡슐화 택산, CPT-11, 캠프토테신 유도체, 안트라사이클린 글리코사이드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 나벨바인, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 시스플라틴, 에스트라무스틴, 셀레콕시브, 슈겐 SU-5416, 슈겐 SU-6668, 헤르셉틴 등)와 병용하여 투여할 수 있다.

일정한 용량으로 제형되는 경우, 이러한 조합물은 본 발명의 조성물을 하기된 용량 범위내에서 사용하고 다른 약제학적으로 활성 물질은 승인된 용량 범위내에서 사용한다. 본 발명의 조성물은 조합 제제가 부적절할 경우 알려진 항암제와 순차적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 활성 성분으로서 hSP를 약제학적으로 유효한 양으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 함유한 항암 조성물은 통상의 경로로 투여할 수 있다. 본 발명의 항암 조성물에서 활성 성분인 hSP의 일일투여 유효한 양은 환자의 연령, 성별, 적용부위, 투여회수, 투여시간, 제형, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있지만, 일반적으로 약 0.001g 내지 10g, 바람직하게는 약 0.05g 내지 1g이다.

용어 “약제학적으로 허용되는 담체”는 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 활성 성분을 수송하는 역할을 하는 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제 또는 용매와 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다.

hSP를 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 보통 통상적인 방법에 따라 제조하고 약제학적으로 적합한 형태로 투여한다. 본 발명의 항암 조성물은 여러 제형, 예를 들면 정제, 캡슐, 당의정 또는 필름 피막 정제, 액제 또는 현탁제의 경구 형태, 근육내, 정맥내 및/또는 척수강내 및/또는 척수내 주사 또는 주입의 비경구 형태로 투여할 수 있다.

예를 들면, 경구용 고형제는 활성 화합물과 함께 희석제(예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 자당, 셀룰로즈, 옥수수 전분 또는 감자 전분), 활탁제(예를 들면, 실리카, 탈크, 스테아린산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜), 결합제(예를 들면, 전분, 아라빅 검, 젤라틴 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 피롤리돈), 붕해제(예를 들면, 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이트), 포르말 혼합물, 염료, 감미제, 습윤제(예를 들면, 레시틴, 폴리솔베이트, 라우릴설페이트) 및 일반적으로 약제에 사용되는 약물학적 불활성 물질을 함유할 수 있다. 이들 약제는 공지된 방법, 예를 들면 혼합, 과립화, 타정, 당의 또는 필름-피복 공정의 수단에 의해 제조할 수 있다.

경구 투여용 액체 분산액은 예를 들면 시럽, 유화액 및 현탁액일 수 있다. 현탁액 및 유화액은 담체로서, 예를 들면 천연 검, 한천, 나트륨 알기네이트, 펙틴, 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 알코올을 함유할 수 있다.

근육내 주사를 위한 현탁액 또는 용액은 활성 화합물과 함께 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면 멸균수, 올리브유, 에틸 올레에이트, 글리콜(예, 프로필렌 글리콜) 및 필요한 경우 적합한 양의 리도카인 하이드로클로라이드를 함유할 수 있다.

정맥내 주사 또는 주입용 용액은 담체로서, 예를 들면 멸균수를 함유하거나 바람직하게는 멸균, 수성, 등장성 염수 용액의 형태일 수 있거나 담체 프로필렌 글리콜을 함유할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1

본 발명의 항암 조성물의 제조

정액은 성병의 병력이 없고 사람 면역결핍 바이러스 및 사람 유두종 바이러스를 포함한 생식기 감염 징후 및 증세를 보이지 않는 건강한 기혼자로부터 무균 플라스틱 용기를 사용하여 수음(masturbation)에 의해 획득하였다. 이를 실온에서 20분 동안 방치한 다음 12,000g에서 10분간 원심분리하여 정자가 제거된 상청액을 새로운 시험관으로 이동하였다. 그 다음 디에틸 에테르(diethyl ether)를 첨가하여 정제하고 지방산이 용해되도록 2분동안 흔들어 혼합하였다. 이 혼합액을 원심분리하여 두 층이 생기도록 분리하였다. 분리된 지방 상청액을 제거한 나머지 용액을 끓는 수욕에서 20분간 가열하여 정장의 효소 활성을 제거하여 hSP를 얻었다. hSP는 세공크기 0.22㎛ 밀리포어(미국 매사추세츠 베드포드 소재 Millipore Corporation) 여과기로 여과하여 살균하였다.

배양 배지에 처리할 희석비 1:50의 조성물을 제조하기 위해 hSP 2g을 멸균수에 용해하여 100㎖로 조정하였다.

실시예 2

본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 세포 생존율 조사

본 발명의 항암 조성물이 세포의 성장과 생존에 미치는 영향을 조사하였다. 세포주로는 WI-38(사람 폐 섬유아세포, ATCC 번호: CCL-75), NIH:OVCAR-3(사람 난소 아데노암종, ATCC 번호: HTB-161) 및 SK-OV-3(사람 난소 아데노암종, 복수, ATCC 번호: HTB-77)세포를 첫 번째 실험군(도 1)으로 사용하였고, 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 293cell(사람 신장 상피세포, 아데노바이러스 5 DNA로 형질전환, ATCC 번호: CRL-1573), NIH3T3(마우스 근육 섬유아세포, ATCC 번호: CRL-1658), 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수), 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 MDA-MB-231(사람 유선 상피암 세포, ATCC 번호: HTB-26) 세포를 두 번째 실험군(도 2)으로 사용하였다.

상기 세포를 3×10³세포/well이 되도록 96-웰 평판에 넣은 다음 12시간 배양하였다. 배양 배지로는 열불활성화 FBS(fetal bovine serum, 소 태반 혈청) 10% (v/v), 스트렙토마이신 100μg/㎖, 페니실린 100U/㎖ 및 L-글루타민 100μg/㎖을 첨가한 DMEM(Life Technology, Inc., USA)를 사용하였다. 첫 번째 실험군에는 20배, 50배, 100배, 200배 및 400배 희석한 hSP를 첨가하였고, 두 번째 실험군에는 2.5%, 5%, 10% 농도의 hSP를 첨가하였다. 이를 37℃에서 이산화탄소 5% 및 산소95%가 공급되는 상태에서 24시간 동안 배양하였다.

세포 생존율은 공지된 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)2,5-디페닐-2H-테트라조리움 브로미딘)검정법으로 측정하였다(Hansen, M.B. et al., J. Immunol. Methods, 172, 203-210 (1989)). 20㎕ MTT 용액(PBS(phosphate buffered saline, 인산염 완충 염수)중 10㎎/㎖인 MTT)을 각각의 웰에 첨가하였고, 평판을 37℃에서 4시간 배양하였다. 배지를 제거한 후, DMSO(dimethyl sufoxide, 디메틸 설폭시드) 200㎕에 포마잔(formazan) 결정을 용해시켜 각각의 웰에 첨가하였다. 이를 10분 동안 실온에서 흔들어 혼합하고, Bio-Rad 모델 3550 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader, Richmond, CA)를 사용하여 540㎚에서 측정하였다. 이때, hSP를 처리하지 않은 DMEM-FBS와 MTT가 첨가된 웰을 대조군으로 사용하였다.

실험 결과, 첫 번째 실험군은 도 1에 나타낸 바와 같이 20배 내지 100배 희석한 hSP를 처리한 난소암 세포주 NIH:OVCAR-3(B) 및 SK-OV-3(C)의 경우에 세포 생존율이 감소하였다. 반면, 같은 농도와 조건으로 hSP를 처리한 WI-38(A) 세포주는 세포 생존율의 변화가 미세하였다. WI-38(A) 세포주의 생존율은 1:50으로 희석된 hSP를 처리하였을때 약 70∼75%였고, 반면에 OVCAR-3(B) 와 SK-OV-3(C)의 세포 생존율은 약 18∼22%였다.

두 번째 실험군은 도 2에 나타낸 바와 같이 2.5% 내지 5% hSP를 처리한 난소암 세포주 NIH:OVCAR-3, SK-OV-3의 경우에 세포 생존율이 최대 50% 정도 감소하였다. 반면, 같은 농도와 조건으로 hSP를 처리한 WI-38 세포주는 세포 생존율이 최대 30% 정도 감소하였다.

상기 결과에서, 1:20 내지 1:50의 희석비 또는 2.5 내지 5% hSP를 처리한 정상세포는 세포 생존율이 크게 감소하지 않았지만, 난소암 세포주의 경우 세포 생존율이 크게 감소함을 알 수 있었다.

실시예 3

본 발명의 항암 조성물 및 항암제 TAXOL, CISPLATIN 처리에 따른 세포 생존율 조사.

본 발명의 항암 조성물이 정상세포인 293cell 세포주의 성장과 생존에 미치는 영향을 조사하였다. 배양조건은 실시예 2와 동일하게 수행하였고 hSP농도는 2.5%, 5%, 10%로 첨가하였다. 그리고 MTT 검정측정은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.

실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 2.5% 내지 5% hSP를 처리한 239cell의 경우에 세포 생존율이 약 10 내지 50% 정도 감소하였다. 반면, 같은 농도와 조건으로 TAXOL을 처리한 293cell의 경우의 세포 생존율이 약 80% 정도 감소하였다. 한편 같은 농도와 조건으로 CISPLATIN을 처리한 293cell의 경우에 세포 생존율이 거의 변하지 않았다.

상기 결과에서, 2.5 내지 5% hSP를 처리한 정상세포와 같은 농도와 조건으로 기존 항암제인 TAXOL을 처리한 정상세포와 비교하여 볼 때, 2.5 내지 5% hSP를 처리한 정상세포에서 세포 생존율의 감소가 미세함을 알 수 있었다.

실시예 4

본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 DNA 분열의 유세포 측정

본 발명의 항암 조성물 처리가 세포 내 DNA 분열에 미치는 영향을 유세포 측정을 통해 분석하였다. WI-38, OVCAR-3 및 SK-OV-3 세포 2×10⁶에 본 발명의 항암 조성물을 처리하고 각각 6시간, 24시간 동안 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였으며 대조군은 hSP를 처리하지 않았다. 배양이 완료되면 세포를 회수하고 이를 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 그 다음 상기 세포를 4℃에서 24시간 동안 100% 에탄올로 투과시켜 고정하였다. 이를 PBS 500㎕에 현탁하고 37℃에서 30분간 RNase 20μg/㎖로 처리한 후 10분간 얼음으로 냉각시켰다. 상기와 같은 방법으로 분리한 DNA를 PI(Propidium Iodine)용액 50μg/㎕를 첨가하여 염색하고 DNA 분열을 유세포 측정기(Becton Dickinson FACS system)로 측정하였다. 이때, 프로피디움(propidium)형광은 냉각된 아르곤(argon) 이온 레이저 15㎽ 사용하여 발색시켰고, 발색되는 빛을 617 롱 패스 광학 필터를 사용하여 수집하였다. DNA 모델링은 모드피트(ModFit, Verity Software House, Topsham, Maine) 소프트웨어를 이용하였다.

실험 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 항암 조성물을 처리한 WI-38 세포의 세포 주기 분열시 G1(DNA 합성 준비시기)단계의 정점은 감소하는 반면에 G2(세포분열 준비시기)단계의 정점은 배양시간에 따라 점차 증가하였다. 이는 본 발명의 항암 조성물이 상기 세포의 성장과 분화에 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다. 한편, 본 발명의 항암 조성물을 처리한 OVCAR-3 와 SK-OV-3 세포의 경우에는 G1 단계가 정지되었다. 또한, 세포주기의 G0-G1 단계(sub-G1 부분)의 세포가 농축되었고 S(DNA 합성시기) 단계와 G2-M(유사분열)단계에서 유의적으로 세포가 감소되었으며 이로부터 세포 사멸이 유도되었음을 알 수 있었다.

실시예 5

본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 DNA 레더링 분석

상기 실시예 4의 세포 사멸 기작이 세포자살에 의한 것인지의 여부를 조사하기 위하여 DNA 레더링(laddering) 분석을 실시하였다. 먼저, WI-38, OVCAR-3 및 SK-OV-3 세포 2×10⁶에 본 발명의 항암 조성물을 처리한 다음 각각 6시간, 24시간 배양한 후 세포를 회수하고 세포의 DNA를 공지된 방법으로 다음과 같이 변형하여 추출하였다(Leszczynski, D. et al., Photochem. Photobiol., vol. 64, pp936-942, (1996)). 상기 세포 펠렛을 SDS(sodium-dodecyl-sulfate) 0.5%, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid ,에틸렌디아민 사초산) 2mM, 단백질가수분해효소(proteinase) K 100㎎/㎖ 및 트리스-염산 완충액 50mM(pH 8.0)으로 구성된 용해 완충액에 현탁하였다. 이를 55℃에서 3시간 배양하고, 배양액에 동량으로 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1)을 첨가하였다. 여기에 0.1 부피의 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)와 2.5 부피의 차가운 무수 에탄올(ethanol)을 첨가하여 DNA를 침전시키고 -20℃에서 하룻밤 보관하였다. 상기 DNA를 TE(1M 트리스-염산 완충액안에 0.5M EDTA를 첨가한 것, pH 8.0)에 용해시키고, 37℃에서 RNase A 100㎎/㎖를 첨가하여 1시간 배양하였다. 상기 시료를 브롬화 에티듐(ethidium bromide) 0.5μg/㎖가 포함된 아가로스(agarose) 겔(gel) 1.5%에서 60V로 1시간 동안 전기영동하고, 자외선(UV)에 노출시켰다.

실험 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, WI-38(레인 1, 5, 9), OVCAR-3(레인 3, 7, 11) 및 SK-OV-3(레인 4, 8, 12) 세포 모두 DNA 레더가 나타나지 않았다. 세포 자살은 뉴클레오솜(nucleosomes) 사이의 연결부위에서 DNA 분열에 따른 크기가 약 100bp 단편을 생성하도록 한다. 따라서, 상기와 같은 결과로 볼 때, 본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 암세포 사멸의 기작이 세포자살에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.

실시예 6

본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 DNA 방출에 의한 세포괴사 분석

상기 실시예 4의 세포 사멸 기작이 세포괴사에 의한 것인지의 여부를 조사하기 위해 DNA 방출정도를 측정하였다. DNA 방출은 세포 DNA 분열 효소-결합 면역흡착 검정킷트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 괴사된 세포로부터 배지로 방출되는 5'-브로모-2'-디옥시-우리딘(BrdU)으로 표지된 DNA를 측정하였다. 즉, 세포를 티미딘 유사체 BrdU를 첨가하여 배양함으로써 세포의 게놈 DNA에 병합되도록 하였다. 상기 세포를 BrdU 존재하에 본 발명의 항암 조성물을 첨가하고 24시간 배양하여,각기 다른 시간 간격으로 배양 상등액을 회수하였다. 이때, 사용한 세포 및 배양 방법은 상기 실시예 4와 동일하게 수행하였다. 한편, BrdU는 세포의 성장, 자살 또는 괴사에 어떠한 영향도 주지 않는다. DNA 단편을 플레이트(Nunc-immuno flat-bottom plate)에 결합된 항-DNA 항체를 사용하여 포획하였고, 항-BrdU 항체-과산화효소를 사용하여 검출하였다. 광도측정은 690nm를 표준으로 하여 450nm에서 수행하였다.

실험 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 본 발명의 항암 조성물을 처리한 WI-38(A) 세포에서는 DNA 방출을 검출할 수 없었으며 반면, OVCAR-3(B) 및 SK-OV-3(C) 세포의 경우에는 시간의 경과에 따라 DNA 방출이 점점 증가함을 알 수 있었다. 이로부터 본 발명의 항암 조성물 처리가 OVCAR-3(B) 및 SK-OV-3(C) 세포의 세포괴사를 유도함을 알 수 있었다.

실시예 7

본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 세포형태의 변화 측정

본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 세포형태의 변화를 세포의 DNA를 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 세포에 본 발명의 항암 조성물을 처리하여 배양하였다. 배양이 완료된 세포를 PBS로 세척하고, 이를 PBS에 재현탁하고 최종농도가 2μg/㎖ 되도록 DNA 염색액(Hoechst 33342)을 첨가하였다. 이를 암실에서 37℃로 30분간 배양하였다. 배양이 완료된 세포를PBS로 세척하고, 현미경(Olympus)으로 관찰한 후 AX70 TRF 포토오토메트 시스템(Olympus Optical Co., Ltd)으로 사진을 촬영하였다. 또한, 스케닝 공초점 현미경(λ_exc= 488㎚, λ_em= 522㎚; Bio-Rad, Richmond, CA)을 사용하여 핵의 응축, 막 수포의 형태 및 세포자살체의 이미지를 획득하였다.

실험 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 본 발명의 항암 조성물을 처리한 WI-38 세포에서는 형태적 변화가 나타나지 않았다. OVCAR-3 및 SK-OV-3 세포에서는 본 발명의 항암 조성물을 처리하지 않은 경우에는 건강한 핵을 관찰할 수 있었으나, 본 발명의 항암 조성물을 처리한 경우에는 세포괴사로 보여지는 핵의 형태적 변화를 관찰할 수 있었다. 이와 함께 염색질 응축, 분열 및 핵의 수축을 관찰할 수 있었다. 이러한 세포괴사는 스케닝 공초점 현미경을 사용한 경우에 더욱 뚜렷하게 관찰되었다. 응축된 염색질 덩어리의 가장자리가 불완전하게 나타났으며, 핵 주변으로 불규칙하게 흩어져 있는 형태가 관찰되었다. 세포질 변성과 원형질막의 파열에도 불구하고 세포의 전체외형은 유지되어 있었다.

실시예 8

종양이 유도된 마우스 모델에서 본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 영향

생체내에서의 본 발명의 항암 조성물의 영향을 조사하기 위하여 종양이 유도된 누드 마우스(BALB-c, Charles River Inc., Japan)를 사용하였다. 상기 마우스에 SK-OV-3 세포를 피하접종하여 암을 유발하였다. 즉, 마우스를 무균적 상태의특정 조건에서 순화시킨 다음 PBS 200㎕에 SK-OV-3 세포(3×10⁶)를 현탁하여 5마리의 마우스(자성, 4주령)의 등 부위를 두 부분으로 나누어 주사하였다. 양쪽 접종부위에서 종양이 지름 1㎝로 자라게 한 후, 한 부위에는 본 발명의 항암 조성물 200㎕를, 다른 부위에는 PBS를 동량으로 주사하였다. 24시간 후에, 마우스를 희생시키고 조직학 실험을 수행하기 위해 종양, 폐, 심장, 간 및 신장을 적출한 다음 10% 포르말린으로 고정하고 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin; H&E)으로 염색하였다.

실험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 종양이 유도된 마우스에 본 발명의 항암 조성물을 주사하면 종양 괴사가 일어남을 관찰하였다. 반면에 종양 부위 이외의 다른 조직에는 손상이 관찰되지 않았다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 hSP를 포함하는 항암 조성물을 난소암 세포주에 처리하여 세포 생존율, DNA 분열의 유세포 측정, DNA 레더링 분석, DNA 방출에 의한 세포괴사 분석, 세포형태의 변화 측정을 통해 정상세포에는 세포 사멸에 대한 영향을 보이지 않았지만 난소암 세포주에는 괴사를 유도하여 세포 사멸을 확인할 수 있었다. 또한 종양이 유도된 마우스 모델에서 본 발명의 항암 조성물 처리에 따른 영향을 통해서 종양 괴사를 관찰하였다. 본 발명에 의하면, hSP를 포함하는 항암 조성물이 암치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

Claims

활성 성분으로서 사람 정장을 약제학적으로 유효한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 함유함을 특징으로 하는 항암 조성물.
제1항에 있어서, 항암 대상이 폐암, 뇌암, 유방암, 대장암 또는 상피성 난소암인 조성물.
제2항에 있어서, 항암 대상이 상피성 난소암인 조성물.
제 1항에 있어서, 활성 성분의 약리학적으로 유효한 양이 0.001g 내지 10g인 조성물.
⒜ 획득한 사람 정액을 실온에서 10 내지 40분 동안 방치한 다음 8,000 내지 15,000g에서 5 내지 20분간 원심 분리하여 정자가 제거된 상청액을 새로운 시험관으로 이동하는 단계;

⒝ 디메틸 에테르를 첨가하여 정제한 후 지방산이 용해되도록 1 내지5분 동안 흔들어 혼합한 후, 이 혼합액을 원심 분리하여 두 층이 생기도록 분리하는 단계;

⒞ 분리된 지방 상청액을 제거한 나머지 용액을 끓는 수욕에서 10 내지 40분간 가열하여 정장의 효소 활성을 제거하는 단계 및 1:20 내지 1:100으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 이용하여 희석시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 4항에 따른 항암 조성물을 제조하는 방법.
약제학적 허용되는 담체 또는 희석제내의 사람 정장을 필수적으로 함유함을 특징으로 하는 경구 투여용 항암제.
약제학적 허용되는 희석제내의 사람 정장을 필수적으로 함유함을 특징으로 하는 비경구 주사용 항암제.