KR20030071162A - 표적-선택적 전사 보조활성인자 - Google Patents

표적-선택적 전사 보조활성인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 AP-1(activating protein-1) 및 ERs(estrogen receptors, 에스트로겐 수용체)에 선택적으로 작용하는 전사 보조활성인자 단백질인 CAPER(Coactivator of AP-1 and ERs), 전기 CAPER를 암호화하는 유전자 및 전기 CAPER와 AP-1 또는 ERs를 세포에서 동시발현시켜, 전기 세포 내 목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, CAPER는 SR 도메인과 RNA 인식 모티프를 포함하고, AP-1과 ERs에만 선택적으로 작용하여 전기 AP-1과 ERs에 의한 전사활성을 촉진시키는 기능을 하므로, 전사의 개시와 후전사적 변형(post-transcriptional modification) 사이의 과정에 관여할 것으로 예상되며, 궁극적으로는 핵수용체의 전사적 조절기작의 연구에 크게 기여할 것으로 기대되어진다.

Description

표적-선택적 전사 보조활성인자{A Target-Selective Transcriptional Coactivator}
본 발명은 표적-선택적 전사 보조활성인자에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 AP-1(activating protein-1) 및 ERs(estrogen receptors, 에스트로겐 수용체)에 선택적으로 작용하는 전사 보조활성인자 단백질인 CAPER(Coactivator of AP-1 and ERs), 전기 CAPER를 암호화하는 유전자 및 전기 CAPER와 AP-1 또는 ERs를 세포에서 동시발현시켜, 전기 세포 내 목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
활성화 단백질-1(activation protein-1, AP-1) 전사인자는 전사 조절과정과 연관된 초기반응 유전자(early response gene)로, AP-1 복합체는 Fos군(family)과 Jun군의 이종이량체(heterodimer)로 구성되며, 다양한 프로모터에 존재하는 보존 DNA 서열(TGAGTCA, AP-1 자리)에 결합한다. Fos와 Jun 군은 서열-특이적인 DNA-결합 이량체 단백질 중 bZIP(basic region-leucine zipper)군에 속하며, bZIP 도메인의 C-말단 부분은 양쪽친화성(amphipathic)이고, N-말단 부분은 두개의 긴 헬릭스로 구성되어 DNA-결합에 중요한 역할을 하게 된다.
핵 수용체군(nuclear receptor family)은 프로모터 내 특이적인 DNA 서열에 결합하는 리간드-의존적 전사 조절단백질이고, 슈퍼군(superfamily)은 스테로이드, T3 및 레티노이드 등의 다양한 작은 소수성 리간드에 대한 수용체 뿐만 아니라, 알려지지 않은 리간드에 대한 다수의 관련 단백질을 일컫는 오르판(orphan) 핵 수용체를 포함한다. 전기 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인의 C-말단은 리간드-의존적인 AF2(activation function 2)의 기능을 가지며, N-말단은 AF1의 기능을 갖는다. 특이적인 DNA-결합 활성을 갖지 않는 전사 보조조절인자(또는 보조인자)는 전사 조절에 있어서, 예를 들면, 염색질(chromatin) 구조의 리모델링(remodeling) 또는 전사 인자와 기본 전사기구(basal transcriptional apparatus) 구성분 사이의 어댑터 분자로서 작용하는 등의 필수적인 역할을 담당하며, 전사 보조조절인자 단백질에는 스테로이드 수용체 보조활성인자(coactivator)군(SRC-1), CREB-결합 단백질(CBP)/p300, 일반적인 보조활성인자를 활성화시키는 신호 보조인테그레이터-2(activating signal cointegrator-2, ASC-2) 및 그 밖의 다수의 단백질 등이 있다. 전사 보조조절인자의 실제적인 예로서, SRC-1과 그의 상동체인 ACTR은 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제(histone acetyltransferase, HAT) 활성을 가지고 있어 다른 HAT 단백질 P/CAF와 회합하고, 리간드가 결합되지 않은 레티노익 산 수용체(retinoic acid receptor, RAR)와 티로이드 호르몬 수용체(thyroid hormone receptor, TR)는 표적 유전자에 결합하여 RAR, TR(SMRT) 및 핵수용체보조억제자(nuclear receptor corepressor, N-CoR)의 매개자의 매개에 의해 전사를 억제시킨다. 다양한 히스톤 탈아세틸화 효소와 상호작용하는 억제 도메인을 가지는 SMRT 및 N-CoR은 길항제가 존재하는 조건에서만 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER) 및 프로게스테론 수용체와 상호작용한다. 이상의 다수 보조조절인자 단백질은 매우 다양한 핵 수용체 및 AP-1을 포함하는 전사 인자와 상호작용한다.
그러나, 최근 전기 보조조절인자 단백질과는 달리 보다 표적-선택적인 활성을 갖는 보조활성인자가 발견되었다. 표적-선택적인 보조활성인자에는 페록시좀 증식자에 의해 활성화되는 수용체 γ(PPARγ) 보조활성인자-1(PGC-1), ARA 160, Smad3, ARA 70 및 JAb1 등이 있다. PGC-1은 효모의 DNA 수선과 TFIIH의 조절자인 MMS19 및 p68 RNA 헬리카아제의 인간 상동체로, ERα와 프로티모신 α의 AF-1에 선택적인 보조활성인자로서, ER 억제자의 활성을 방해하여 ER의 활성을 선택적으로 증가시키는 기능을 한다. ARA 160은 전립선 암 세포에 존재하는 최초의 안드로겐 수용체 보조활성인자의 기능을 하고, 신경작용인자X1(neuronal interacting factor X1)이 핵 수용체의 하위체에 의해 전사를 억제하는 신경-선택적 보조억제자로 기능한다. Smad3는 전립선 암 세포에서 안드로겐 수용체에 의해 매개되는 전사 활성을 선택적으로 억제하는 한편, 핵에서 SRC-1군과 결합체를 형성함으로써 비타민 D 수용체의 리간드-유도성 전사활성(transactivation)에 선택적인 보조활성인자로서 기능한다. ARA 70은 PPARγ 및 안드로겐 수용체를 선택적으로 자극하고, c-Jun 및 JunD와는 상호작용하지만 JunB 또는 v-Jun과는 상호작용하지 않는 JAB1은 c-Jun 또는 JunD에 의한 전사활성을 선택적으로 강화시키는 작용을 한다.
전기 표적-선택적인 활성을 갖는 보조활성인자 중 PGC-1은 Ser-Arg이 많은 SR 도메인과 RNA 인식 모티프인 RRM을 포함한다. RRM은 리보뉴클레오단백질(RNP)-1 및 RNP-2의 고도로 보존된 두 개의 펩타이드 모티프로 구성되어 있으며, RNA 또는 단일가닥 DNA에 결합할 수 있고, hnRNP(human nuclear RNP) 및 SR 인자에서 발견되는 도메인과 상동성을 갖는다. hnRNP군은 대부분 RNA 대사와 관련되어 있고, 어떤 것들은 프로모터의 단일가닥 DNA 인핸서(enhancer) 서열에 결합하여 전사 활성을 갖기도 한다. SR 도메인과 RRM의 결합은 SR 절단(splicing) 인자의 활성에 매우 중요하며, 항시적 절단(constitutive splicing) 및 조절가능한 유도성 절단 모두에서 중요한 역할을 한다. SR 도메인과 RNA 인식 모티프를 포함하는 전기 PGC-1은 최근 mRNA의 절단을 매개하는 것으로 알려졌다. 또한, p68 RNA 헬리카아제는 ERα의 AF-1에 선택적인 전사 보조활성인자로 알려졌고, RNA 헬리카아제 A는 RNA 중합효소 II와 CREB-결합 단백질의 결합을 매개하는 것으로 알려졌으며, 신규의 전사 보조활성인자 p52는 전사 활성을 강화시키는 일반적인 전사 인자 및 전사 활성자 뿐만 아니라, in vivo 및 in vitro에서의 전-mRNA 절단을 조절하는 필수 절단 인자와 상호작용하는 것으로 알려졌다. 이와 같은 사실은 in vivo에서의 5'-캡핑, 절단 및 폴리아데닐화 같은 전사 후의 mRMA의 가공 및 전사 사이의 작용을 보조적으로 조절하는 새로운 단백질이 존재함을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 전사작용을 보조적으로 조절하는 새로운 단백질을 분리하고, 그를 특정하고자 예의 연구노력한 결과, 보조활성인자로 알려진 ASC-2와 상호작용하는 새로운 단백질인 CAPER(Coactivator of AP-1 and ERs)를 분리하고, 전기 CAPER의 서열을 분석하고 그의 기능적 상관성을 해명하였으며, 또한, 전기 CAPER가 AP-1과 ERs에만 선택적으로 작용하여 전사활성을 촉진할 수 있는 기능을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 표적 선택적인 전사 보조활성인자로 작용하는 단백질인 CAPER를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 CAPER를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 CAPER와 그의 표적인 AP-1 또는 ERs를 세포에서 동시발현시켜, 전기 세포 내 목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 CAPER 및 PGC-1의 보존 서열을 나타내는 그림이다.
도 1b는 CAPER 및 알려진 전사 보조활성인자들의 RRM 서열을 나타내는 그림이다.
도 2는 CAPER의 단편인 CAPER-N, MI, MII, C, △C1, △C2, △N1, △N2, MII-1 및 MII-2를 나타내는 그림이다.
도 3은 CAPER 및 그의 단편과 표지된 ASC2-4간의 결합을 나타내는 방사선 사진이다.
도 4는 ASC2-4와 LexA의 융합벡터 및 CAPER 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 B42 벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 CAPER-C와 B42의 융합벡터 및 ASC2-4 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 LexA 벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 c-Jun, 그의 단편인 Jun△1, Jun△2 및 Jun△3, c-Fos, 및 그의 단편인 Fos△1, Fos△2 및 Fos△3를 나타내는 그림이다.
도 6b는 CAPER-C와 LexA의 융합벡터 및 c-Jun, 그의 단편, c-Fos 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 B42 벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 B42 벡터 또는 Jun△3와 B42의 융합벡터 및 및 CAPER 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 LexA 벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 CAPER 또는 그의 단편과 LexA의 융합벡터 및 ERα와 B42의 융합벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 CAPER와 LexA의 융합벡터 및 ERα 또는 ERβ와 B42의 융합벡터 또는 CAPER와 B42의 융합벡터 및 AF2 코어 부분이 결핍된 ERα△AF2와 LexA의 융합벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 ERα 및 그의 단편을 나타내는 그림이다.
도 9는 CAPER-MII, CAPER-MII1 또는 CAPER-MII2와 LexA의 융합벡터 및 ERα 또는 그의 단편과 B42의 융합벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 LacZ 발현벡터, 리포터 유전자 Gal-Luc, Gal4 발현벡터 또는 CAPER나 그의 단편과 Gal4의 융합벡터를 CV-1 세포에 형질감염시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 LacZ 발현벡터, 100ng의 리포터 유전자 AP1-Luc 및 다양한 양의 c-Fos, CAPER 또는 ASC-2 발현벡터를 CV-1 세포에 형질감염시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11b는 LacZ 발현벡터, 리포터 유전자 ERE-Luc 또는 Gal4-Luc, CAPER의 발현벡터 및 ERα 또는 ERβ의 발현벡터를 CV-1 세포에 형질감염시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 전사 보조활성인자 단백질인 CAPER(coactivator of AP-1 and ERs)와 그를 암호화하는 유전자 및 전기 CAPER와 그의 표적인 AP-1(activating protein-1) 또는 ERs(estrogen receptors, 에스트로겐 수용체)를 세포에서 동시발현시켜, 전기 세포 내 목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법을 포함한다: 이때, AP-1은 c-Jun 군(family) 또는 c-Fos 군이고, ERs는 ERα 또는 ERβ이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: CAPER의 분리 및 서열분석
쥐의 간 cDNA 라이브러리를 이용하여 보조활성인자들을 활성화시키는 기능을 하는 ASC-2와 상호작용하는 단백질을 분리하고, 전기 단백질의 서열을 분석하였다: 쥐의 간 세포로부터 cDNA를 분리하고, pJG4-5를 이용하여 라이브러리를 작제한 다음, LexA-ASC2-4를 베이트(bait)로 하는 효모 투-하이브리드 시스템을 이용한 선별을 통해 ASC-2와 상호작용하는 단백질을 분리하고, 그의 기능성 특성 및 편재적인 발현 패턴에 근거하여 "CAPER(Coactivator of AP-1 and ERs)"로 명명한 후, 전기 CAPER의 아미노산 서열(서열번호 1)을 분석하고, 최근 PPARγ의 전사 보조활성인자로 알려진 PGC-1의 서열과 비교하였다. 도 1a는 CAPER 및 PGC-1의 보존 서열을 나타내는 그림이다. 도 1a에서 SR은 Ser-Arg이 많은 도메인, RRM은 RNA 인식 모티프, AD는 자가 전사활성 도메인을 나타낸다. 도 1a에서 보듯이, CAPER와 PGC-1은 직접적인 서열 상동성은 없지만, SR 도메인 및 RRM의 공통된 보존 서열을 포함하는 것을 확인할 수 있다. 도 1b는 CAPER 및 알려진 전사 보조활성인자들의 RRM 서열을 나타내는 그림이다. 알려진 전사 보조활성인자는 hnRNP A1, U1 snRNP A, CoAA, PGC-1, PRC 및 U2AF를 포함한다. 도 1b에서 보듯이, RNP-1 및 RNP-2의 서열은 전사 보조활성인자로 알려진 대부분의 단백질들뿐만 아니라, CAPER에서도 보존되어 있음을 확인할 수 있다. 따라서, CAPER가 SR 도메인 및 RRM을 포함하고 있고, SR 도메인과 RRM의 결합이 SR 절단(splicing)인자에게 있어 매우 중요한 것이라는 사실로부터, CAPER가 PGC-1처럼 RNA 절단에 관련되어 있거나 또는 mRNA 가공 및 전사에 관련되어 있을 것이라는 것을 예상할 수 있으며, 이것은 CAPER가 mRNA 절단인자와 함께 핵 반점(speckle) 내의 동일한 위치에서 분리되었다는 사실에 의해 뒷받침된다.
실시예 2: 재조합 벡터의 작제
CAPER(서열번호 2) 및 CAPER의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 작제하였다: CAPER 또는 CAPER의 단편인 CAPER-N, MI, MII, C, △C1, △C2, △N1, △N2, MII-1, MII-2, ASC2-4△1, ASC2-4△2 또는 ASC2-4△3(참조: 도 2 및 도 5)를 암호화하는 유전자를 LexA-융합벡터인 pEG202PL, B42-융합벡터인 pJG4-5, 포유류용 발현/in vitro 번역벡터인 pcDNA3 및 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST)-융합벡터인 pGEX4T-1의 EcoRI 및 XhoI 제한효소 자리에 삽입하였다. ERα-ABC, -ABCD, -EF, -D 또는 -DE(참조: 도 8)를 암호화하는 유전자를 pJG4-5의 EcoRI 및 XhoI 제한효소 자리에 삽입하였다. ERα또는 ERβ와 Gal4의 융합벡터;ERα△AF2, ASC2-4, ASC2-4a, ASC2-4b 또는 ASC2-4LR과 LexA의 융합벡터; ERα, ERβ, c-Jun, c-Fos, Jun△1, Jun△2, Jun△3, Fos△1, Fos△2 또는 Fos△3와 B42의 융합벡터; ERα또는 ERβ와 GST의 융합벡터, ERα, ASC-2, ASC2-4, c-Jun 또는 c-Fos를 위한 포유류용 발현/in vitro 번역 벡터; 수용체 작제물 ERE-Luc, AP1-Luc, Gal4-Luc 및 LexA-β-gal; 및, 형질감염 지시 작제물 pRSV-β-gal의 작제는 이(Lee) 등(참조: Mol. Endocrinol. 12, 1184-1192, 1998 및 J. Biol. Chem. 273, 16651-16654, 1998)의 방법에 따라 수행하였고, 전체 길이의 ERα를 암호화하는 유전자 단편을 효모 발현벡터 p425-Gal1의 HindIII 및 XhoI 제한효소자리에 삽입하였다.
실시예 3: CAPER와 ASC2-4간의 결합활성의 분석
CAPER와 ASC2-4간의 결합이 CAPER의 어느 부분에서 이루어지는지를 결정하였다: 전기 실시예 2에서 작제한 재조합 벡터 중 GST 융합벡터를 대장균에서 발현시키고, 발현된 산물을 글루타티온-세파로스-4B 비드(Amersham Pharmacia Biotech, USA)가 충진된 컬럼에 통과시켜 결합시킨 다음, TNT-결합된 전사-번역 시스템에 의해 실험실적 조건에서(in vitro) 발현되고, [35S]-메티오닌으로 표지된 ASC2-4 단백질을 가하고, 상업적인 매뉴얼(Promaga, USA)에 따라 배양하였다. 배양 후, 컬럼을 세척하고, 특이적으로 비드에 결합된 단백질을 40mM의 환원형 글루타티온/50mMTris(pH 8.0) 용액으로 용출하여, SDS-PAGE 및 방사선 사진으로 분석하였다. 도 3은 CAPER 및 그의 단편과 표지된 ASC2-4간의 결합을 나타내는 방사선 사진이다. 도 3에서 input, 20%는 컬럼에 가해진 표지물질의 약 20%에 해당하는 물질, GST/-는 CAPER 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하지 않은 GST 융합벡터, GST/CAPER은 CAPER를 암호화하는 유전자를 포함하는 GST 융합벡터, GST/CAPER-C는 CAPER-C를 암호화하는 유전자를 포함하는 GST 융합벡터를 각각 나타낸다. 도 3에서 보듯이, CAPER 및 CAPER-C는 ASC2-4와 결합하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4: ASC2-4와 CAPER 사이의 결합부위의 결정
ASC2-4와 CAPER 사이의 결합부위의 각 단백질에서의 위치를 결정하였다: CAPER가 ASC2-4와 결합하는 부위가 CAPER의 어느 부분에 위치하는지를 결정하기 위하여, ASC2-4와 LexA의 융합벡터 및 CAPER 또는 그의 단편(CAPER-N, -MI, -MII 및 -C)을 암호화하는 유전자를 포함하는 B42 벡터를 적절한 LacZ 리포터 유전자를 포함하는 효모에서 동시발현시키고, B42에 의한 결과를 LacZ 발현에 대해 상대적으로 계산하여 표준화시켰다. 효모에서 각 LexA 융합단백질은 전사적으로 불활성이다. 도 4는 ASC2-4와 LexA의 융합벡터 및 CAPER 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 B42 벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 오직 전체 길이의 CAPER와 CAPER-C만이 LexA의 활성을 증가시켰음을 확인할 수 있다. 따라서, CAPER와 CAPER-C만이 ASC2-4와 결합하고, ASC2-4와의 결합부위는 CAPER의 C-말단 부분과 관련되어 있다고 할 수 있다. 이 결과는 전기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, CAPER 또는 CAPER-C와 GST의 융합단백질은 실험실적 조건에서 번역된 ASC2-4와 결합한 반면, GST 단백질은 결합하지 않았던 결과와도 일치한다.
ASC2-4와 CAPER가 결합하는 부위가 ASC2-4의 어느 부분에 위치하는지를 결정하기 위하여, CAPER-C와 B42의 융합벡터 및 ASC2-4 또는 그의 단편(ASC2-4, -4a, -4b, -4△1, -4△2, -4△3 및 -4LR)을 암호화하는 유전자를 포함하는 LexA 벡터를 적절한 LacZ 리포터 유전자를 포함하는 효모에서 동시발현시켰다. 효모에서 각 LexA 융합단백질은 전사적으로 불활성이다. 도 5는 CAPER-C와 B42의 융합벡터 및 ASC2-4 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 LexA 벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 LXXLL은 수용체와 상호작용하는 것으로 알려진 ASC2-4의 모티프를 나타내고, +++은 배양 2일 후의 짙은 파랑색의 군락(colony), ++는 배양 2일 후의 엷은 파랑색의 군락, +는 배양 2일 이상 후의 엷은 파랑색의 군락, -는 흰색 군락을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, ASC2-4, -4△1, -4△2 및 -4△3만이 결합활성을 나타낸 것을 확인할 수 있다. 따라서, CAPER와 결합하는 부위는 ASC2-4의 N-말단 부분에 존재한다고 할 수 있다.
실시예 5: c-Jun 및 c-Fos에 대한 상호작용의 분석
전기 실시예 1의 결과에 의해 예상되는 바와 같이, CAPER가 실질적으로 전사보조조절인자로서 작용하는지를 확인하기 위하여, AP-1의 구성분인 c-Jun 및 C-Fos에 대한 CAPER의 상호작용을 분석하였다: 먼저, c-Jun 또는 c-Fos가 CAPER와 상호작용하는 부분이 c-Jun 또는 c-Fos의 어느 부분에 위치하는지를 결정하기 위하여, CAPER와 LexA의 융합벡터 및 c-Jun, 그의 단편(Jun△1, Jun△2 및 Jun△3), c-Fos 또는 그의 단편(Fos△1, Fos△2 및 Fos△3, 참조: 도 6a)을 암호화하는 유전자를 포함하는 B42 벡터를 적절한 LacZ 리포터 유전자를 포함하는 효모에서 동시발현시키고, B42에 의한 결과를 LacZ 발현에 대해 상대적으로 계산하여 표준화시켰다. 도 6b는 CAPER-C와 LexA의 융합벡터 및 c-Jun, 그의 단편, c-Fos 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 B42 벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6b에서 보듯이, CAPER는 c-Jun 및 Jun△3에 대해서만 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서, CAPER는 c-Jun의 C-말단 부분과 선택적으로 상호작용한다고 할 수 있다.
다음으로, CAPER가 c-Jun과 상호작용하는 부분이 CAPER의 어느 부분에 위치하는지를 결정하기 위하여, B42 벡터 또는 Jun△3와 B42의 융합벡터 및 CAPER 또는 그의 단편(CAPER-N, -MI, -MII 및 -C)을 암호화하는 유전자를 포함하는 LexA 벡터를 적절한 LacZ 리포터 유전자를 포함하는 효모에서 동시발현시키고, B42에 의한 결과를 LacZ 발현에 대해 상대적으로 계산하여 표준화시켰다. 도 6c는 B42 벡터 또는 Jun△3와 B42의 융합벡터 및 및 CAPER 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 LexA 벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6c에서 F는 CAPER를 나타내다. 도 6c에서 보듯이, Jun△3은 F 및 MII에 대해서만 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서, c-Jun은 CAPER의 MII 부분(아미노산 잔기 291 내지 400번)과 상호작용한다고 할 수 있다. 또한, CAPER 또는 CAPER-MII와 LexA의 융합단백질의 활성의 차이로 볼 때, 전체 길이의 CAPER는 CAPER-MII 부분 자체만의 활성에 비해 약간 감소된 활성을 갖는다고 할 수 있다.
이상의 결과는 CAPER-MII과 GST의 융합단백질과 [35S]-메티오닌으로 표지된 c-Jun 및 c-Fos를 이용하여 전기 실시예 3과 동일한 방법으로 분석하였을 때, CAPER가 c-Jun과만 활성을 나타낸 결과와도 일치한다.
실시예 6: ER에 대한 상호작용의 분석
CAPER가 실질적으로 전사 보조조절인자로서 작용하는지를 확인하기 위하여, 수용체인 ERα 및 ERβ에 대한 CAPER의 상호작용을 분석하였다: CAPER 또는 그의 단편과 LexA의 융합벡터 및 ERα또는 ERβ와 B42의 융합벡터 또는 CAPER와 B42의 융합벡터 및 AF2 코어 부분이 결핍된 ERα△AF2와 LexA의 융합벡터를 적절한 LacZ 리포터 유전자를 포함하는 효모에서 동시발현시켰다. 도 7a는 CAPER 또는 그의 단편과 LexA의 융합벡터 및 ERα와 B42의 융합벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7b는 CAPER와 LexA의 융합벡터 및 ERα 또는 ERβ와 B42의 융합벡터 또는 CAPER와 B42의 융합벡터 및 AF2 코어 부분이 결핍된 ERα△AF2와 LexA의 융합벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7a 및 도 7b에서 E2및 tam은 100nM의 E2및 타목시펜(tamoxifen)을 나타낸다. 도 7a 및 도 7b에서 보듯이, CAPER 및 CAPER-MII만이 ERα에 대해 E2-의존적인 방식으로 상호작용하고, E2-의존적인 상호작용은 AF2 코어 부분이 결핍된 ERα△AF2에 대해서도 유지되며, 야생형의 ERα와는 달리 ERα△AF2는 길항제인 타목시펜이 존재하는 조건에서도 CAPER와 상호작용하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 전체 길이의 CAPER는 E2가 존재하는 상태에서 ERα와 동시발현되는 경우를 제외하고는 전사적으로 불활성인 것을 확인할 수 있다. 전기 결과는 [35S]-메티오닌으로 표지된 CAPER 또는 CAPER-MII를 이용하여, 전기 실시예 3과 동일한 방법으로 분석하였을 때, CAPER 또는 CAPER-MII가 E2가 존재하는 조건에서만 ERα와 선택적으로 상호작용한다는 결과와도 일치한다.
CAPER-MII와 ERα가 서로 상호작용하는 부분이 어느 부분에 위치하는지를 결정하기 위하여, CAPER-MII, CAPER-MII1 또는 CAPER-MII2(참조: 도 2)와 LexA의 융합벡터 및 ERα 또는 그의 단편(ABC, ABCD, EF, D 및 DE, 참조: 도 8)과 B42의 융합벡터를 적절한 LacZ 리포터 유전자를 포함하는 효모에서 동시발현시키고, B42에 의한 결과를 LacZ 발현에 대해 상대적으로 계산하여 표준화시켰다. 도 8은 ERα 및 그의 단편을 나타내는 그림이다. 도 8에서 A 내지 F는 기능적인 모듈을 나타내며, 특히, C와 D는 DNA 및 리간드-결합 도메인을 나타낸다. 도 9는 CAPER-MII, CAPER-MII1 또는 CAPER-MII2와 LexA의 융합벡터 및 ERα 또는 그의 단편과 B42의융합벡터를 효모에서 동시발현시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 9에서 보듯이, CAPER-MII와 ERα, CAPER-MII와 ERα-EF 및 CAPER-MII2와 ERα 사이에서만 상호작용이 일어난 것을 확인할 수 있다. 따라서, CAPER과 ERα간의 상호작용은 CAPER-MII2 단편 및 ERα의 EF 도메인과 관련되어 있음을 알 수 있다.
실시예 7: CAPER의 자가 전사활성 도메인의 위치 결정
CAPER 또는 그의 단편과 Gal4의 융합벡터를 발현시켜, CAPER 내 존재하는 자가 전사활성 도메인의 위치를 결정하였다: CV-1 세포를 24-웰 플레이트에서 10% 챠콜-스트립트 혈청(charcoal-stripped serum)이 첨가된 배지를 이용하여 24시간 동안 배양하고, 100ng의 LacZ 발현벡터, 100ng의 리포터 유전자 Gal-Luc 및 Gal4 발현벡터 또는 CAPER나 그의 단편(CAPER-△C1, -△C2, -N, -△N1, -△N2, -C, -MII, -MII1 및 -MII2)과 Gal4의 융합벡터로 형질감염시켰다. 20시간 후, 세포를 세척하고, 10%의 챠콜-스트립트 FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 12시간 동안 재배양한 다음, 0.1μM 리간드로 자극시키거나 또는 그대로 방치하였다. 24시간 후, 세포를 회수하여 루시퍼라아제 활성을 측정하고, 결과를 LacZ 발현에 대하여 표준화시킨 다음, Gal4 융합벡터 단독의 결과에 대한 배수활성(fold-activation)으로 나타내었다. 도 10은 LacZ 발현벡터, 리포터 유전자 Gal-Luc, Gal4 발현벡터 또는 CAPER나 그의 단편과 Gal4의 융합벡터를 CV-1 세포에 형질감염시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 10에서 F는 전체 길이의 CAPER를 나타낸다. 도 10에서 보듯이, 전체 길이의 CAPER, CAPER-△C1, -△C2, -N, -△N1, -△N2, -C 또는 -MII2와 Gal4의 융합단백질은 Gal4 융합단백질 단독으로 발현된 것보다 낮은 수준으로 발현되고, CAPER-MII 및 CAPER-MII2와 Gal4의 융합단백질은 Gal4 융합단백질 단독으로 발현된 것보다 높은 수준으로 발현된 것을 확인할 수 있다. 따라서, 자가적이고 독립적인 전사활성 기능을 조절하는 도메인이 CAPER의 N-말단 및 C-말단 부분 모두에 존재한다고 할 수 있다.
실시예 8: CAPER의 표적-특이성 분석
AP-1 및 ERα 또는 ERβ에 대한 CAPER의 표적-특이성을 분석하였다: CV-1 세포를 전기 실시예 7과 동일한 방법으로 100ng의 LacZ 발현벡터, 100ng의 리포터 작제물 AP1-Luc 및 ERE-Luc 또는 Gal4-Luc, c-Fos, CAPER, ASC-2 또는 CAPER-MII2의 발현벡터로 형질감염시키고, 루시퍼라아제 활성을 측정한 다음, 결과를 LacZ 발현에 대하여 표준화시키고, 리포터 작제물 단독의 결과에 대한 배수활성(fold-activation)으로 나타내었다. 도 11a는 LacZ 발현벡터, 100ng의 리포터 유전자 AP1-Luc 및 다양한 양의 c-Fos, CAPER 또는 ASC-2 발현벡터를 CV-1 세포에 형질감염시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 11a에서 보듯이, 형질감염된 c-Fos, CAPER 또는 ASC-2 발현벡터의 양이 각각 증가함에 따라, 루시퍼라아제 활성도 증가하고, 특히, CAPER 발현벡터의 양이 증가함에 따라 가장 큰 차이의 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서, CAPER은 AP-1에 대해 선택적으로 활성을 갖는다고 할 수 있다.
CAPER와 ER의 E2-의존적인 상호작용을 확인하기 위하여, 전기와 동일한 방법으로 CV-1 세포를 100ng의 LacZ 발현벡터, 100ng의 리포터 유전자 ERE-Luc 또는 Gal4-Luc, CAPER의 발현벡터 및 50ng의 ERα 또는 ERβ의 발현벡터로 형질전환시킨 후, 루시퍼라아제 활성을 분석하였다. 도 11b는 LacZ 발현벡터, 리포터 유전자 ERE-Luc 또는 Gal4-Luc, CAPER의 발현벡터 및 ERα 또는 ERβ의 발현벡터를 CV-1 세포에 형질감염시킨 후의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 11b에서 보듯이, CAPER와 ERα 또는 ERβ간의 상호작용은 E2가 존재하는 조건에서만 일어나는 것을 확인할 수 있다. 따라서, ERE- 또는 Gal4-Luc 리포터와 CAPER의 CV-1 세포에서의 동시발현은 기본 활성에는 별다른 영향을 미치지 않고, E2-의존적으로 ERα 또는 ERβ에 선택적으로 활성을 갖는다고 할 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 AP-1(activating protein-1) 및 ERs(estrogen receptors, 에스트로겐 수용체)에 선택적으로 작용하는 전사 보조활성인자 단백질인 CAPER(Coactivator of AP-1 and ERs), 전기 CAPER를 암호화하는 유전자 및 전기 CAPER와 AP-1 또는 ERs를 세포에서 동시발현시켜, 전기 세포 내 목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, CAPER는 SR 도메인과 RNA 인식 모티프를 포함하고, AP-1과 ERs에만 선택적으로 작용하여 전기 AP-1과 ERs에 의한 전사활성을 촉진시키는 기능을 하므로, 전사의 개시와 후전사적 변형(post-transcriptional modification) 사이의 과정에 관여할 것으로 예상되며, 궁극적으로는 핵수용체의 전사적 조절기작의 연구에 크게 기여할 것으로 기대되어진다.

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내어지는 단백질 CAPER(coactivator of AP-1 and ERs).
  2. 제 1항의 CAPER를 암호화하며, 서열번호 2의 염기서열로 나타내어지는 유전자.
  3. 제 1항의 CAPER와 그의 표적인 AP-1(activating protein-1)을 세포에서 동시발현시켜, 전기 세포 내 목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    AP-1은 c-Jun 군(family) 또는 c-Fos 군인 것을 특징으로 하는
    목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법.
  5. 제 1항의 CAPER와 그의 표적인 ERs(estrogen receptors, 에스트로겐 수용체)를 세포에서 동시발현시켜, 전기 세포 내 목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    ERs는 ERα 또는 ERβ인 것을 특징으로 하는
    목적하는 유전자의 전사활성을 촉진시키는 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998003383A1 (de) * 1996-07-18 1998-01-29 Itt Manufacturing Enterprises, Inc. Verfahren zur verbesserung des regelverhaltens eines blockierschutzregelungssystems
KR20010014368A (ko) * 1997-06-30 2001-02-26 린다 에스. 스티븐슨 에스트로겐 반응 조절 능력에 대한 핵전사인자의 선별 방법

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Molecular Cloning and Characterization of CAPER, a Novel Coactivator of Activating Protein-1 and Estrogen Receptors The Journal of Biological Chemistry Vol.277 No.2 2002 1229-1234 전문 *
NCBI GeneBank Accession NO.NP573505 NCBI GeneBank Accession NO.NP573505 *
NCBI GeneBank Accession NO.NP909122 NCBI GeneBank Accession NO.NP909122 *

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