KR20030045230A - Polyacetylene group compounds, novel inhibitors of acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase and the process for preparing thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 활성 저해제인 신규 폴리아세틸렌계 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(Acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase) 활성을 저해하여 중성지방이 체내에 흡수되는 것과 간, 지방 세포, 근육 세포 등에서의 중성지방의 생합성을 저해하여 중성지방의 장기 내 축적을 억제함으로써 체중을 감소시켜 비만 치료에 효과적인 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 활성 저해제인 신규 폴리아세틸렌계 화합물과 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel polyacetylene-based compound which is an acyl coa: diacylglycerol acyltransferase activity inhibitor and a method for preparing the same, and more particularly, to an acyl coa: diacylglycerol acyltransferase. Acyl coay is effective in treating obesity by inhibiting activity and inhibiting the absorption of triglycerides into the body and inhibiting the biosynthesis of triglycerides in liver, fat cells, muscle cells, etc. The present invention relates to a novel polyacetylene-based compound which is a silglycerol acyl transferase inhibitor, and a preparation method thereof.
아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(Acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, 이하 DGAT라 칭함)는 글리세롤 3-포스페이트 경로의 마지막 과정을 촉매하는 효소로서 1,2-디아실글리세롤(sn-1,2-diacylglycerol)과 페티 아실 코에이를 기질로 사용하여 트리글리세라이드를 생성한다. 외부로부터 섭취된 중성지방은 췌장에서 분비된 리파제에 의해 지방산과 모노글리세라이드로 분해되어 장 상피세포를 통해 흡수된 후, DGAT에 의해 트리글리세라이드 중성지방으로 된다.Acyl co A: diacylglycerol acyltransferase (Acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase la, hereinafter referred to as DGAT) include 1,2-diacyl glycerol as the enzyme catalyzing the last step of the glycerol 3-phosphate pathway (sn -1,2- triglycerides are produced using diacylglycerol) and pettyacylcoei as substrates. Triglycerides ingested from the outside are broken down into fatty acids and monoglycerides by lipase secreted from the pancreas, absorbed through intestinal epithelial cells, and then triglyceride triglycerides by DGAT.
중성지방의 생합성은 글리세롤 3-포스페이트 경로(간과 지방조직)와 모노아실글리세롤 경로에 의해 소장의 장 상피세포에서 주로 이루어지며, 이들 생합성 과정에 작용하는 효소인 DGAT의 선택적 저해에 의한 중성지방 합성저해는 비만, 고 중성지방혈증 등과 같은 중성지방 대사이상에 의한 질병의 예방 및 치료에 효과적인 작용점으로 부상되고 있다.Biosynthesis of triglycerides is mainly performed in the intestinal epithelial cells of the small intestine by the glycerol 3-phosphate pathway (liver and adipose tissue) and monoacylglycerol pathway, and neutral lipid synthesis is inhibited by selective inhibition of DGAT, an enzyme that acts on these biosynthetic processes. Has emerged as an effective point of action for the prevention and treatment of diseases caused by triglyceride metabolism, such as obesity, hypertriglyceridemia.
간의 소포체에서 합성된 중성지방은 콜레스테롤, 인지질, 단백질(apo-100)과 결합하여 초저비중 리포단백질(VLDL)로 되어 혈액 내로 분비된다. 혈액 내로 들어온 키로마이크론과 VLDL은 혈관의 내피세포에 존재하는 리포단백질 리파아제에 의해 글리세롤과 지방산으로 분해되며 이때 생성된 지방산은 지방세포로 이동하여 페티 아실코에이로 활성화된 후 글리세롤 3-포스페이트 경로를 거쳐 중성지방으로 합성되어 저장된다.Triglycerides synthesized in the endoplasmic reticulum are combined with cholesterol, phospholipids and proteins (apo-100) to form very low specific lipoprotein (VLDL) and secreted into the blood. Chiromicrons and VLDL enter the blood and are broken down into glycerol and fatty acids by lipoprotein lipases present in endothelial cells of blood vessels. It is then synthesized and stored as triglycerides.
중성지방의 생합성과 에너지 저장 기능은 장관의 지방 흡수, 리포단백질 조립, 혈장 중성지방의 조절, 지방세포 내 지방 축적, 근육에서의 에너지 대사, 유즙 분비 등에 연관되어 중요한 생리적 기능을 담당하고 있다.Triglyceride biosynthesis and energy storage are important physiological functions associated with intestinal fat absorption, lipoprotein assembly, regulation of plasma triglycerides, fat accumulation in adipocytes, energy metabolism in muscles, and milk secretion.
그러나, 중성지방이 장기나 조직에 과도하게 축적이 일어나면 지방간, 비만, 고 중성지방혈증 등을 야기시켜 동맥경화, 당뇨, 대사이상 및 장기의 기능 저하 등의 심각한 질병을 유발한다. 당뇨병환자의 약 1/3에서 혈장 중성지방 농도가 증가되어 있다. 이는 혈당조절이 안된 당뇨병환자에서 두드러지지만 비교적 조절이 잘된 인슐린 비의존형(제 2형) 당뇨병에서도 인슐린 저항성이 심하면 고 중성지방혈증이 발생하는 경우가 있다. 비만증은 제 2형 당뇨병을 수반하며 비만증의 원인들이 매우 다양하기에 제 2형 당뇨병의 발병에 관여하는 기전도 매우 복잡하다. 비만증에서 관찰되는 가장 중요한 대사장애로 고 인슐린혈증과 인슐린저항성이 동반되는 현상이 있다. 이때 혈청 중성지방과 유리 지방산의 증가 및 고혈압도 잘 동반된다.However, excessive accumulation of triglycerides in organs or tissues causes fatty liver disease, obesity, hypertriglyceridemia and the like, and causes serious diseases such as arteriosclerosis, diabetes, metabolic abnormalities and deterioration of organ function. Plasma triglyceride levels are elevated in about one third of diabetics. This is noticeable in diabetic patients with poor glycemic control, but hypertriglyceridemia occurs when insulin resistance is severe even in relatively insulated insulin-dependent (type 2) diabetes. Obesity involves type 2 diabetes and the causes of obesity are so diverse that the mechanisms involved in the development of type 2 diabetes are very complex. The most important metabolic disorders observed in obesity include hyperinsulinemia and insulin resistance. The increase in serum triglycerides and free fatty acids and hypertension is also well accompanied.
이 DGAT는 생체의 지방세포, 분화된 3T3-L1 지방세포, 소장내의 장 상피세포, 유선, 골격근, 심근 등 여러 조직에서 발견되고 있으며, 식물, 미코박테리움속과 스트렙토미세스속 같은 미생물, 곰팡이나 곤충에서도 발견되고 있다.This DGAT is found in many tissues such as fat cells, differentiated 3T3-L1 adipocytes, intestinal epithelial cells in the small intestine, mammary gland, skeletal muscle, and myocardium.It is a plant, microorganism such as Mycobacterium and Streptomyces, fungi It is also found in insects.
DGAT는 지방세포 분화 시 효소활성이 증가하여 NIH3T3-L1 섬유아세포가 지방세포로 분화되는 동안 DGAT 유전자 발현과 효소활성이 현저히 증가됨을 알 수 있다. 이 효소는 중성지방 합성과 흡수에 관여하며 그 활성은 생체 대사조절 상태에 따라 조절된다. 예를 들어, 세포 내 유리 지방산의 농도가 증가하면 에너지 저장이 쉽게 도와주며 과도한 지방산에 의한 독성을 방어하기 위해 DGAT의 활성은 증가하게 된다. 세포 내 유리 지방산이 부족하면 인지질 합성을 위한 유리 지방산의 이용성을 유지하기 위해 활성이 감소된다. 또한, 이 효소는 인슐린과 아드레날린 등의 호르몬과 티로신키나제 등에 의해서도 조절을 받는 것으로 알려졌다.In DGAT, the enzyme activity was increased during adipocyte differentiation, and the expression of DGAT gene and enzyme activity were significantly increased during NIH3T3-L1 fibroblast differentiation into adipocytes. The enzyme is involved in triglyceride synthesis and absorption, and its activity is regulated by biomechanical control. For example, increasing the concentration of free fatty acids in cells facilitates energy storage and increases the activity of DGAT to defend against toxicity by excess fatty acids. Lack of free fatty acids in cells reduces activity to maintain the availability of free fatty acids for phospholipid synthesis. The enzyme is also known to be regulated by hormones such as insulin and adrenaline, tyrosine kinases and the like.
DGAT 효소는 1960년 닭의 간에서 처음으로 확인되었으며 막에 걸쳐있는 효소로 분리정제의 어려움으로 연구의 진전을 보지 못하다가, 1998년 포유류 유래 DGAT cDNA가 클로닝됨으로써 중성지방 생합성의 분자생물학적 연구의 기원을 이루게 되었다[Cases et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13018-13023, 1998].The DGAT enzyme was first identified in the liver of chickens in 1960, and it is a membrane-enzyme that has not progressed due to the difficulty of purification and purification. [Cases et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13018-13023, 1998].
최근 동정된 DGAT 유전자의 생체 내 기능을 밝히기 위해 Smith 등에 의해 만들어진 DGAT-결핍 쥐로부터 DGAT에 의한 선택적인 중성지방의 합성저해가 비만의 치료에 유용하다는 사실을 시사하는 보고가 있었다[Smith et al. Nature Genetics 25, 87-90, 2000].Recently, there have been reports suggesting that the inhibition of DGAT-selective triglyceride synthesis from DGAT-deficient mice made by Smith et al. To shed light on the in vivo function of the DGAT gene identified [Smith et al. Nature Genetics 25, 87-90, 2000].
DGAT-결핍 쥐는 정상적인 생존과 번식능을 보여주고 있었다. 정상 식이 동안 여전히 중성지방을 합성하고 정상적인 체지방을 유지하고 있는 결과로부터 중성지방은 DGAT의 경로와는 다른 경로에 의해 합성됨을 보여주었다. 흥미롭게도 이들은 고지방 식이에 대하여 정상 쥐는 40 ∼ 50%의 체중 증가를 보인 반면, DGAT-결핍 쥐는 정상 식이 때의 체중증가와 유사한 양상을 보임으로써 고지방 식에 대한 저항성을 보여주었다. 이는 대사율의 증가와 운동량의 증가에 따른 에너지 소비의 증가로 나타났으며 식이 섭취의 감소와는 무관한 것으로 밝혀졌다. 또한, 포도당, 인슐린, 유리 지방산의 혈장 내 농도는 정상 쥐과 유사했으나 DGAT-결핍 쥐의 경우, 인슐린의 감도가 증가하여 더 낮은 포도당과 인슐린의 농도를 나타내는 경향을 보였다.DGAT-deficient mice showed normal survival and reproduction. The results show that triglycerides are synthesized by a route different from that of DGAT, while still maintaining triglycerides and maintaining normal body fat during normal diet. Interestingly, they showed a 40-50% weight gain for high fat diets, while DGAT-deficient mice showed a similar pattern of weight gain for normal diets, indicating resistance to high fat diets. This resulted in an increase in energy consumption with increasing metabolic rate and exercise, and was found to be independent of the decrease in dietary intake. Plasma concentrations of glucose, insulin and free fatty acids were similar to those of normal rats, but DGAT-deficient mice showed increased sensitivity to insulin, indicating lower glucose and insulin concentrations.
현재 DGAT 효소저해제의 합성은 미진한 상태이며 천연물로부터 몇 종의 저해제가 보고되어 있는 실정이다. 대부분이 일본의 기타사토 연구소의 Omura 그룹에서 보고한 저해제로 로셀리핀스(roselipins)[Gliocladium roseumKF-1040, IC50; 15∼22 μM], 아미데프신스(amidepsines)[Humicolasp. FO-2942, IC50; 10∼50 μM], 크산토후몰스(xanthohumols)[Humulus lupulus, IC50; 50∼194 μM], 그외 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid), 2-브로모옥타노에이트(2-bromooctanoate)가 보고되어 있을 뿐이다[Tomoda et al. J. Antibiotics 52, 689-694, 1999, Tomoda et al. J. Antibiotics 48,937-941, 1995, Tabata et al. Phytochemistry 46, 683-687, 1997, Rustan et al. J. Lipid. Res. 29, 1417-1426, 1988].Currently, the synthesis of DGAT inhibitors is incomplete and several inhibitors have been reported from natural products. Most of the inhibitors reported by the Omura group of the Kitasato research institute in Japan were roselipins [ Gliocladium roseum KF-1040, IC 50 ; 15-22 μM], amiddefines (amidepsines) [ Humicola sp. FO-2942, IC 50 ; 10-50 μM], xanthohumols [ Humulus lupulus , IC 50 ; 50-194 μM], other eicosapentaenoic acid and 2-bromooctanoate have been reported [Tomoda et al. J. Antibiotics 52, 689-694, 1999, Tomoda et al. J. Antibiotics 48,937-941, 1995, Tabata et al. Phytochemistry 46, 683-687, 1997, Rustan et al. J. Lipid. Res. 29, 1417-1426, 1988.
이상의 결과로부터 DGAT 저해활성을 갖는 약물은 비만치료에 사용할 수 있다. 외부로부터 섭취된 중성지방은 췌장에서 분비된 리파제에 의해 지방산과 모노 글리세라이드로 분해되어 장 상피세포를 통해 흡수된 후, DGAT에 의해 중성지방으로 재합성되는데 DGAT의 활성을 억제하는 약물은 중성지방을 재합성하는 단계를 저해하여 지방의 흡수를 억제함으로써 체내로 유입되는 중성지방의 양을 감소시킬 수 있다. 또한, DGAT 저해제는 간, 지방세포, 근육세포 등에서의 중성지방의 생합성과 저장형 중성지방의 축적을 방지하고 이미 축적된 지방의 소비를 촉진시킴으로써 비만치료가 가능할 것으로 기대된다.From the above results, drugs with DGAT inhibitory activity can be used for the treatment of obesity. Triglycerides taken from the outside are broken down into fatty acids and monoglycerides by lipase secreted by the pancreas, absorbed through intestinal epithelial cells, and then resynthesized into triglycerides by DGAT. Drugs that inhibit DGAT activity are triglycerides. By inhibiting the step of resynthesis can inhibit the absorption of fat can reduce the amount of triglycerides introduced into the body. In addition, DGAT inhibitors are expected to be able to treat obesity by preventing the biosynthesis of triglycerides and accumulation of storage-type triglycerides in liver, adipocytes, muscle cells and the like, and by promoting the consumption of the already accumulated fat.
이에, 본 발명자들은 한국의 자생식물로부터 DGAT를 억제하는 활성물질을 탐색하는 과정에서 인삼을 탐색하였으며 이로부터 신규 폴리아세틸렌계 화합물을 발견할 수 있었다.Therefore, the present inventors searched for ginseng in the process of searching for an active substance that inhibits DGAT from Korean native plants, and found a new polyacetylene compound.
고려인삼은 고유의 중요한 천연자원으로서, 수 천년 전부터 영약 또는 선약으로 동양의학적으로는 물론 인류의 보건을 위해 오늘날까지 널리 사용되고 있는 한국의 대표적인 생약이다. 합성의약품의 부작용과 난치성 질병의 극복에 서양의학이 한계를 보임에 따라, 인삼을 비롯한 생약제에 대한 가치가 새롭게 부각되고있다.Korean ginseng is an important natural resource of its own, and is a representative herbal medicine of Korea, which has been widely used for thousands of years as an oriental medicine or a medicine for the health of mankind as well as for the health of mankind. As Western medicine has shown limitations in overcoming the side effects of synthetic drugs and intractable diseases, the value of herbal medicines including ginseng is emerging.
이에, 본 발명자들은 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로부터 추출한 DGAT 저해 활성이 있는 신규 폴리아세틸렌계 화합물을 분리 정제하여 그 구조를 결정하고, DGAT 저해활성을 나타내어 상기 화합물들이 비만 치료제로 이용할 수 있는 효능이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have isolated and purified a novel polyacetylene-based compound having a DGAT inhibitory activity extracted from Panax ginseng CA Meyer to determine its structure, exhibits a DGAT inhibitory activity and thus the compounds can be used as a therapeutic agent for obesity. By confirming that the present invention was completed, the present invention was completed.
따라서, 본 발명은 DGAT 저해 활성이 있는 신규 폴리아세틸렌계 화합물을 제공함에 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel polyacetylene-based compound having DGAT inhibitory activity.
또한, 본 발명은 인삼으로부터 DGAT 저해 활성이 있는 신규 폴리아세틸렌계 화합물을 제조하는 방법을 제공함에 또 다른 목적이 있다.It is another object of the present invention to provide a method for producing a novel polyacetylene compound having DGAT inhibitory activity from ginseng.
또한, 본 발명은 신규 폴리아세틸렌계 화합물을 유효성분으로 하는 비만억제제를 제공함에 또 다른 목적이 있다.Another object of the present invention is to provide an obesity inhibitor comprising the novel polyacetylene compound as an active ingredient.
도 1은 신규 폴리아세틸렌계 화합물인 파낙시논 A의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.Figure 1 shows the hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum of the novel polyacetylene-based panaxinone A.
도 2는 신규 폴리아세틸렌계 화합물인 파낙시논 A의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.Figure 2 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectra of the novel polyacetylene-based panaxinone A.
도 3은 신규 폴리아세틸렌계 화합물인 파낙시논 A의 수소-탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.Figure 3 shows the hydrogen-carbon nuclear magnetic resonance spectrum of the novel polyacetylene-based panaxinone A.
도 4는 신규 폴리아세틸렌계 화합물인 파낙시논 B의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.Figure 4 shows the hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum of the novel polyacetylene-based compound panaxinone B.
도 5는 신규 폴리아세틸렌계 화합물인 파낙시논 B의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.Figure 5 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum of the novel polyacetylene-based panaxinone B.
도 6은 신규 폴리아세틸렌계 화합물인 파낙시논 B의 수소-탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.Figure 6 shows the hydrogen-carbon nuclear magnetic resonance spectrum of the novel polyacetylene-based panaxinone B.
도 7은 신규 폴리아세틸렌계 화합물인 파낙시논 A와 파낙시논 B의 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT)에 대한 저해활성을 나타낸 그래프이다.Figure 7 is a graph showing the inhibitory activity of acyl coay: diacylglycerol acyltransferase (DGAT) of the novel polyacetylene-based compounds panaxinone A and panaxinone B.
본 발명은 DGAT 저해 활성이 있는 다음 화학식 1로 나타내어지는 신규 폴리아세틸렌계 화합물을 그 특징으로 한다.The present invention is characterized by a novel polyacetylene-based compound represented by the following formula (1) having DGAT inhibitory activity.
상기 화학식 1에서; R은 수소원자이거나 CH3O-를 나타낸다.In Chemical Formula 1; R is a hydrogen atom or represents CH 3 O-.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in more detail as follows.
본 발명은 DGAT 저해 활성이 있는 상기 화학식 1로 나타내어지는 신규 폴리아세틸렌계 화합물 및 이를 인삼으로부터 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel polyacetylene-based compound represented by the formula (1) having a DGAT inhibitory activity and a method for preparing the same from ginseng.
인삼을 세척 및 분쇄하고, 분쇄된 인삼을 알콜 용매, 바람직하게는 에탄올로 가온 추출한 후 농축하고, 농축물에 에틸아세테이트와 물을 가하여 층 분리시키고, 유기층 만을 분리하여 감압 농축하고, 농축액을 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 활성 분획을 얻는다. 상기와 같이 얻어진 활성 분획을 중압 크로마토그래피로 정제하고 최종적으로 고압 액상 컬럼크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 순수한 활성물질을 분리한다. 분리된 활성물질을 핵자기공명 분석 등을 통하여 구조분석을 한 결과, 상기 화학식 1로 결정되었다.Ginseng was washed and pulverized, and the pulverized ginseng was extracted by heating with an alcohol solvent, preferably ethanol, and concentrated. The mixture was separated by adding ethyl acetate and water to the concentrate, and the organic layer was separated and concentrated under reduced pressure. The concentrate was purified by silica gel chromatography. Photography is used to obtain the active fractions. The active fraction obtained as described above is purified by medium pressure chromatography and finally pure active material is separated using high pressure liquid column chromatography (HPLC). As a result of structural analysis of the separated active material through nuclear magnetic resonance analysis, it was determined by Chemical Formula 1.
또한, 본 발명에 따라 인삼으로부터 분리 정제된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 폴리아세틸렌계 화합물인 파낙시논 A와 파낙시논 B의 DGAT 저해활성을 측정한 결과, IC50은 9.0 ㎍/㎖과 32.0 ㎍/㎖로 나타났다.In addition, as a result of measuring the DGAT inhibitory activity of Panaxinone A and Panaxinone B, which are novel polyacetylene compounds represented by Formula 1, isolated and purified from ginseng according to the present invention, IC 50 was 9.0 µg / ml and 32.0. Μg / ml.
DGAT의 작용을 저해하는 이 화합물들은 장내에서 중성지방의 흡수를 저해하여 혈중 중성지방을 강하시키고 간, 지방 세포, 근육 세포 등에서의 중성지방의생합성을 감소시키는 작용을 하기 때문에, 비만치료제로 사용될 수 있다. 그리고, 인삼은 오랫동안 생약 및 식용으로 쓰여왔던 약재로서 이들로부터 추출 분리된 본 발명의 화합물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없을 것임을 예상할 수 있다.These compounds, which inhibit the action of DGAT, can inhibit the absorption of triglycerides in the intestine, thereby lowering triglycerides in blood and reducing the biosynthesis of triglycerides in liver, fat cells, muscle cells, etc. have. In addition, ginseng is a herb that has been used for a long time as a medicinal herb and food, it can be expected that the compounds of the present invention extracted from them also have no problems such as toxicity and side effects.
본 발명의 DGAT 저해제용 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 폴리아세틸렌계 물질을 유효성분으로 포함하고, 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진자가 용이하게 알 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용이 가능한 담체, 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제제형태는 오일 또는 수성매질중의 용액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition for a DGAT inhibitor of the present invention includes the polyacetylene-based material of Chemical Formula 1 as an active ingredient, and according to a method easily understood by those skilled in the art to which the present invention pertains, Formulated with acceptable carriers, excipients, can be prepared in unit dosage form, or incorporated into multi-dose containers. In this case, the formulation may be in the form of a solution or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersing or stabilizing agent.
본 발명에 따라 분리 정제된 화합물들을 함유하는 조성물의 투여방법은 경구투여 및 정맥투여가 바람직하고 그 유효량은 경구투영인 경우에는 보통 성인을 기준으로 1회에 50 ∼ 500 ㎎이 바람직하며 정맥투여인 경우에는 10 ∼ 100 ㎎이 바람직하다. 특정환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 그리고 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.According to the present invention, a method for administering a composition containing the purified compounds is preferably oral administration and intravenous administration, and when the effective amount is oral administration, 50 to 500 mg is preferred once per adult, and In this case, 10-100 mg is preferable. Dosage levels for specific patients may vary depending on gender, age, health condition, diet, time of administration, method of administration, and drug severity and disease severity.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.
실시예 1 : 인삼으로부터 신규 폴리아세틸렌계 화합물의 분리 및 정제Example 1 Isolation and Purification of New Polyacetylene Compounds from Ginseng
본 발명에 사용한 인삼은 4년 근 수삼으로 충청남도 금산의 약령시에서 구입하여 사용하였다. 구입한 4년 근 수삼을 잘 씻어서 녹즙기를 사용하여 분쇄하였다. 15 kg의 분쇄된 인삼에 15 L의 에탄올을 넣어 상온에서 24시간 침지한 후 교반하여 여과지를 이용하여 액상과 고체부분을 분리하였다. 액상을 모아서 감압 하에서 농축한 후 2 L의 에틸아세테이트를 넣어 교반하여 물 층과 유기용매 층으로 분리하고 3회 추출하여 유기 용매 층을 모아 감압 농축하였다. 물질을 추출하는 과정에서in vitroDGAT 활성시험 결과 유기용매 층에 DGAT의 억제 활성이 있었다. 이 유기용매 층을 감압하에 농축 건조하여 50 g의 황갈색 유성물질을 얻어 에탄올에 적당히 녹여 실리카겔[Merck, 상품명:9385]에 유성물질을 흡착 건조시킨 후 n-헥산에 에틸아세테이트의 섞임 비율을 증가 변화시켜(100 : 1부터 10 : 1로 변화) 흘려주면서 물질을 분리하였다. 같은 방법으로 2번의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 활성 분획을 얻고 중압 크로마토그래피로[n-헥산 : 클로로포름(90 : 10), 유속 : 5 ㎖/min, UV : 254 nm]로 정제하고 최종적으로 고압액상 컬럼크로마토그래피를 이용하여 순수한 활성물질 2종을 정제하였다. 이하 상기 2종의 DGAT 효소 저해활성물질을 화합물 1과 화합물 2라 한다. 이때 분리용 고압액상 컬럼크로마토그래피 컬럼으로는 YMC-J'sphere ODS-H80(250 ×20 mm)를 사용하였으며 활성물질들은 88% 에탄올과 12% 증류수인 혼합용매로 분당 7 ㎖로 용출시켰고, UV(254 nm)에서 검출하였다. 최종적으로 분리된 순수한 활성 물질을 화합물 1의 경우 500 ㎎, 화합물 2의 경우 200 ㎎의 수율로 얻었다.The ginseng used in the present invention was purchased from Yangnyeong-si, Geumsan, Chungcheongnam-do, Korea for four years. Fresh ginseng roots purchased were washed well and ground using a green juicer. 15 L of ethanol was added to 15 kg of ground ginseng and immersed at room temperature for 24 hours, followed by stirring to separate the liquid and solid parts using a filter paper. The combined liquid phases were concentrated under reduced pressure, 2 L of ethyl acetate was added, the mixture was stirred, separated into a water layer and an organic solvent layer, extracted three times, and the organic solvent layers were collected and concentrated under reduced pressure. In vitro DGAT activity test during the extraction process showed that DGAT was inhibited in the organic solvent layer. The organic solvent layer was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 50 g of a yellowish brown oily substance, which was dissolved in ethanol. The oily substance was dried by adsorption on silica gel [Merck, trade name: 9385], and the mixing ratio of ethyl acetate in n-hexane was increased. The material was separated by pouring (change from 100: 1 to 10: 1). In the same manner, the active fraction was obtained by two silica gel column chromatography, purified by medium pressure chromatography [n-hexane: chloroform (90: 10), flow rate: 5 ml / min, UV: 254 nm], and finally high pressure. Two pure active substances were purified using liquid column chromatography. Hereinafter, the two DGAT enzyme inhibitory substances are referred to as Compound 1 and Compound 2. At this time, YMC-J'sphere ODS-H80 (250 × 20 mm) was used as the high-pressure liquid phase chromatography column. The active substances were eluted at 7 ml / min with a mixed solvent of 88% ethanol and 12% distilled water. Detection at (254 nm). Finally, the pure active substance isolated was obtained in a yield of 500 mg for compound 1 and 200 mg for compound 2.
실시예 2: 분리정제된 활성물질의 구조분석Example 2 Structural Analysis of the Purified Active Substance
고압액상 컬럼크로마토그래피에 의해서 최종적으로 분리 정제된 화합물 1을 자외선-가시광선 분광기[시마주(Shimadzu)사, UV-265]를 이용하여 측정한 결과, 210, 240, 253, 266, 280 nm에서 최대흡수를 보였다. 최대 IR 흡광도는 비율 기록 적외선 분광기(Bio-Rad Digilab Division, FTS-80)로 측정하였다. 그 결과 컨쥬게이트 삼중 결합(conjugated triple bonds, (2235 cm-1))과 카보닐기(carbonyl group, (1644 cm-1))의 존재가 추정되었다.Compound 1, finally separated and purified by high-pressure liquid column chromatography, was measured using an ultraviolet-visible spectrometer (Shimadzu, UV-265), and the results were measured at 210, 240, 253, 266, and 280 nm. Maximum absorption was shown. Maximum IR absorbance was measured with a ratio recording infrared spectrometer (Bio-Rad Digilab Division, FTS-80). As a result, the presence of conjugated triple bonds (2235 cm -1 ) and carbonyl groups (1644 cm -1 ) was estimated.
VG70-SEQ 질량분석기를 이용하여 High resolution MS를 측정하여 [M+H]+가 261.1852로 측정되었고, 계산식에서 261.1855로 계산되었으므로 활성물질은 분자량 260과 분자식 C17H24O2로 결정하였다.The high resolution MS was measured using a VG70-SEQ mass spectrometer and [M + H] + was determined to be 261.1852 and calculated as 261.1855 in the formula, so the active material was determined to have a molecular weight of 260 and a molecular formula of C 17 H 24 O 2 .
핵자기공명 분석은 활성물질 시료 10 ㎎을 완전 건조하여 C6D6에 녹여 5 mm NMR 튜브에 넣고 바리안(Varian) 기종으로 분석하였으며, 수소 핵자기 공명 스펙트럼(1H-NMR)은 300 MHz로, 탄소 핵자기 공명 스펙트럼(13C-NMR)은 75 MHz로 측정하였다. 물질의 구조에는 수소가 24개, 탄소가 17개의 존재가 추정되었으며, DEPT(Distortionless enhancement by polarization transfer) 스펙트럼에서 2개의 메틸(methyl), 8개의 메틸렌(methylene), 2개의 옥시겐-베아링 메틴(oxygen-bearing metine), 4개의 컨쥬게이트 아세틸레닉(conjugated acetylenic)탄소, 1개의 카보닐(carbonyl) 탄소의 존재가 추정되었다. 수소 핵자기 공명의 고 자장영역(δ1.13 - 1.29)에서는 구조중의 메틸렌(methylene)들에 의하여 겹쳐진 신호들로 나타나 연결된 상태를 직접 결정할 수 없었다. 활성물질의 구조에서 δ 2.70 (1H, ddd,J=4.0, 5.7, 6.6 Hz) 와 δ 2.55 (1H, m)는 에폭시 프로톤(epoxy proton)의 존재, δ 2.17 (1H, dd,J=5.7, 18.0 Hz) 와 δ 1.92 (1H, dd,J=6.6, 18.0 Hz)는 메틸렌 프로톤(methylene proton)이 삼중결합과 에폭사이드(epoxide) 사이에 존재, δ 1.13 δ 1.29 는 12 메틸렌 프로톤(methylene proton)의 존재, δ 2.06 (2H, q,J=7.5 Hz)은 카보닐(carbonyl) 탄소와 컨쥬게이트 메틸렌(conjugated methylene) 수소 옆에 존재, δ 0.79 (3H, t,J=7.5 Hz, 1-H) 와 0.90 (3H, t,J=6.9 Hz, 17-H)는 터미널 메틸(terminal methyl)기가 존재하고 있음이 추정되었다. DEPT와 HMQC 스펙트럼으로 수소와 연결된 탄소의 형태와 위치를 부분적으로 추정하였고,1H-1H COSY(Correlated spectroscopy) 실험을 통하여 물질의 부분구조를 추정하였다.In nuclear magnetic resonance analysis, 10 mg of active substance sample was completely dried, dissolved in C 6 D 6, placed in a 5 mm NMR tube, and analyzed by Varian. Hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR) was 300 MHz. The carbon nuclear magnetic resonance spectrum ( 13 C-NMR) was measured at 75 MHz. The structure of the material is estimated to be 24 hydrogen and 17 carbon, and 2 methyl, 8 methylene and 2 oxygen-bearing methine in the distortionless enhancement by polarization transfer (DEPT) spectrum. The presence of oxygen-bearing metine, four conjugated acetylenic carbons and one carbonyl carbon was estimated. In the high magnetic field region (δ1.13-1.29) of hydrogen nuclear magnetic resonance, signals connected by methylene in the structure could not be directly determined. In the structure of the active material, δ 2.70 (1H, ddd, J = 4.0, 5.7, 6.6 Hz) and δ 2.55 (1H, m) are the presence of epoxy protons, δ 2.17 (1H, dd, J = 5.7, 18.0 Hz) and δ 1.92 (1H, dd, J = 6.6, 18.0 Hz) indicate that methylene proton is between triple bond and epoxide, δ 1.13 δ 1.29 is 12 methylene proton , Δ 2.06 (2H, q, J = 7.5 Hz) is present next to carbonyl carbon and conjugated methylene hydrogen, δ 0.79 (3H, t, J = 7.5 Hz, 1-H ) And 0.90 (3H, t, J = 6.9 Hz, 17-H) were estimated to contain terminal methyl groups. The DEPT and HMQC spectra were used to partially estimate the shape and location of carbon linked to hydrogen, and the substructure of the material was estimated by 1 H- 1 H COSY (Correlated spectroscopy) experiments.
본 발명의 활성물질의 수소 핵자기 공명에서 (300 MHz, C6D6): δ= 0.79 (3H, t,J=7.5 Hz, 1-H), 0.90 (3H, t,J=6.9 Hz, 17-H), 1.13-1.29 (12H, bm, 11-H 16-H), 1.92 (1H, dd,J=6.6, 18.0 Hz, 8-Ha), 2.06 (2H, q,J=7.5 Hz, 2-H), 2.17 (1H, dd,J=5.7, 18.0 Hz, 8-Hb), 2.55 (1H, m, 10-H), 2.70 (1H, ddd,J=4.0, 5.7, 6.6 Hz, 9-H)이 나타났으며, 탄소 핵자기 공명에서 (75 MHz, C6D6):d= 8.09 (q, C-1), 14.68 (q, C-17), 20.15 (t, C-8), 23.39 (t, C-16), 27.16 (t, C-11),28.11 (t, C-12), 29.91 (t, C-13), 30.02 (t, C-14), 32.48 (t, C-15), 39.11 (t, C-2), 53.91 (d, C-9), 56.69 (d, C-10), 66.41 (s, C-6), 74.00 (s, C-5), 74.81 (s, C-7), 85.37 (s, C-4), 186.40 (s, C-3)이 나타났으므로1H,13C, COSY, HMQC 스펙트럼을 종합적으로 분석하여 구조를 결정한 결과, 화합물 1의 구조는 상기 화학식 1에서 R이 수소원자인 것으로 결정하였고, 본 발명에서 분리된 신규 화합물 1을 파낙시논 A(panaxynone A)라고 명명하였다[도 1, 2 3]In hydrogen nuclear magnetic resonance of the active substance of the present invention (300 MHz, C 6 D 6 ): δ = 0.79 (3H, t, J = 7.5 Hz, 1-H), 0.90 (3H, t, J = 6.9 Hz, 17-H), 1.13-1.29 (12H, bm, 11-H 16-H), 1.92 (1H, dd, J = 6.6, 18.0 Hz, 8-Ha), 2.06 (2H, q, J = 7.5 Hz, 2-H), 2.17 (1H, dd, J = 5.7, 18.0 Hz, 8-Hb), 2.55 (1H, m, 10-H), 2.70 (1H, ddd, J = 4.0, 5.7, 6.6 Hz, 9 -H), and at carbon nuclear magnetic resonance (75 MHz, C 6 D 6 ): d = 8.09 (q, C-1), 14.68 (q, C-17), 20.15 (t, C-8 ), 23.39 (t, C-16), 27.16 (t, C-11), 28.11 (t, C-12), 29.91 (t, C-13), 30.02 (t, C-14), 32.48 (t , C-15), 39.11 (t, C-2), 53.91 (d, C-9), 56.69 (d, C-10), 66.41 (s, C-6), 74.00 (s, C-5) , 74.81 (s, C-7), 85.37 (s, C-4), and 186.40 (s, C-3) were found, resulting in a structure analysis by comprehensive analysis of the 1 H, 13 C, COSY, and HMQC spectra. , The structure of Compound 1 was determined that R in the formula (1) is a hydrogen atom, the novel compound 1 isolated in the present invention is named panaxynone A (panaxynone A) Was [1, 23]
또한, 화합물 2의 경우, 화합물 1과 매우 유사한 자외 분광광도를 보였으며 전형적인 폴리아세틸렌계 물질의 양상을 띠고 있었다. VG70-SEQ 질량분석기를 이용하여 FAB-MS를 측정하여 [M+H]+가 291로 측정되었고, 수소 핵자기 공명과 탄소 핵자기 공명으로부터 이 화합물은 분자량 290과 분자식 C18H26O3로 결정하였다.In addition, Compound 2 exhibited an ultraviolet spectrophotometer very similar to that of Compound 1, and exhibited a typical polyacetylene-based material. FAB-MS was measured using a VG70-SEQ mass spectrometer to measure [M + H] + to be 291. From hydrogen nuclear magnetic resonance and carbon nuclear magnetic resonance, the compound had a molecular weight of 290 and a molecular formula of C 18 H 26 O 3 . Decided.
핵자기 공명 분석은 활성물질 시료 10 ㎎을 완전 건조하여 C6D6에 녹여 5 mm NMR 튜브에 넣고 바리안(Varian) 기종으로 분석하였으며,1H-NMR은 300 MHz로,13C-NMR은 75 MHz로 측정하였다. 물질의 구조에는 수소가 26개, 탄소가 18개의 존재가 추정되었으며, DEPT 스펙트럼에서 1개의 메틸(methyl), 9개의 메틸렌(methylene), 2개의 옥시겐-베아링 메틴(oxygen-bearing metine), 4개의 컨쥬게이트 아세틸레닉(conjugated acetylenic) 탄소, 1개의 카보닐(carbonyl) 탄소, 1개의 메톡시(methoxy) 탄소의 존재가 추정되었다. 수소 핵자기 공명의 고 자장영역(δ1.13 - 1.29)에서는 구조중의 메틸렌(methylene)들에 의하여 겹쳐진 신호들로 나타나 연결된 상태를 직접 결정할 수 없었다. 활성물질의 구조에서 δ 2.68 (1H, m) 와 δ 2.53 (1H, m)은 에폭시 프로톤(epoxy proton)의 존재, δ 2.14 (1H, dd,J=5.4, 18.0 Hz)와 δ 1.87 (1H, dd,J=6.0, 18.0 Hz)은 메틸렌 프로톤(methylene proton)이 삼중결합과 에포시드(epoxide) 사이에 존재, δ 1.13 ∼ δ1.29는 12 메틸렌 프로톤(methylene proton)의 존재, δ 3.33 (2H, t,J=6.0 Hz)는 메톡실 그룹에 바로 붙어있는 1개의 메틸렌 존재, δ 2.38 (2H, t,J=6.0 Hz)는 1개의 메틸렌이 카보닐(carbonyl) 탄소와 컨쥬게이트 메틸렌(conjugated methylene) 수소 옆에 존재, δ0.90 (3H, t,J=6.9 Hz, 17-H)은 터미널 메틸(terminal methyl)기가 존재, δ2.96 (3H, s)은 1개의 메톡시가 구조내에 존재하고 있음이 추정되었다. DEPT와 HMQC 스펙트럼으로 수소와 연결된 탄소의 형태와 위치를 부분적으로 추정하였고,1H-1H COSY 실험을 통하여 물질의 부분구조를 추정하였다.In nuclear magnetic resonance analysis, 10 mg of the active substance sample was completely dried, dissolved in C 6 D 6, placed in a 5 mm NMR tube, and analyzed by Varian. 1 H-NMR was 300 MHz, and 13 C-NMR was Measured at 75 MHz. It is estimated that there are 26 hydrogens and 18 carbons in the structure of the material, 1 methyl, 9 methylene, 2 oxygen-bearing metine, 4 in the DEPT spectrum. The presence of two conjugated acetylenic carbons, one carbonyl carbon, and one methoxy carbon was estimated. In the high magnetic field region (δ1.13-1.29) of hydrogen nuclear magnetic resonance, signals connected by methylene in the structure could not be directly determined. In the structure of the active substance, δ 2.68 (1H, m) and δ 2.53 (1H, m) are the presence of epoxy protons, δ 2.14 (1H, dd, J = 5.4, 18.0 Hz) and δ 1.87 (1H, dd, J = 6.0, 18.0 Hz) is the presence of methylene proton between the triple bond and the epoxide, δ 1.13 to δ1.29 is the presence of 12 methylene proton, δ 3.33 (2H , t, J = 6.0 Hz) is the presence of one methylene directly attached to the methoxyl group, and δ 2.38 (2H, t, J = 6.0 Hz) is where one methylene is conjugated to carbonyl carbon and conjugated methylene methylene) is present next to hydrogen, δ0.90 (3H, t, J = 6.9 Hz, 17-H) has terminal methyl groups, δ2.96 (3H, s) has one methoxy group It was assumed to exist. The DEPT and HMQC spectra were used to partially estimate the shape and location of carbon linked to hydrogen, and the partial structure of the material was estimated by 1 H- 1 H COSY experiment.
본 발명의 활성물질의 수소 핵자기 공명에서 (300 MHz, C6D6): δ= 0.90 (3H, t,J=6.9 Hz, 17-H), 1.13 ∼ 1.29 (12H, bm, 11-H∼16-H), 1.87 (1H, dd,J=6.0, 18.0 Hz, 8-Ha), 2.14 (1H, dd,J=5.4, 18.0 Hz, 8-Hb), 2.38 (2H, t,J=6.0 Hz, 2-H), 2.53 (1H, m, 10-H), 2.68 (1H, m, 9-H), 3.33 (2H, t,J=6.0, 1-H), 2.96 (3H, s, 1-OCH3)이 나타났으며, 탄소 핵자기 공명에서 (75 MHz, C6D6): δ= 14.63 (q, C-17), 20.13 (t, C-8), 23.39 (t, C-16), 27.14 (t, C-11), 28.08 (t, C-12), 29.90 (t, C-13), 30.01 (t, C-14), 32.47 (t, C-15), 45.96 (t, C-2), 53.85 (d,C-9), 56.67 (d, C-10), 58.70 (q, 1-OCH3), 66.42 (s, C-6), 67.42 (t, C-1), 74.02 (s, C-5), 75.20 (s, C-7), 85.67 (s, C-4), 184.20 (s, C-3), 이 나타났으므로1H,13C, COSY, HMQC, HMBC 스펙트럼을 얻어 종합적으로 분석하여 구조를 결정한 결과 화합물 2의 구조는 상기 화학식 1에서 R이 CH3O-로 결정하였고, 본 발명에서 분리된 신규 화합물 2를 파낙시논 B(panaxynone B)라고 명명하였다[도 4, 5 및 6].In hydrogen nuclear magnetic resonance of the active substance of the present invention (300 MHz, C 6 D 6 ): δ = 0.90 (3H, t, J = 6.9 Hz, 17-H), 1.13-1.29 (12H, bm, 11-H -16-H), 1.87 (1H, dd, J = 6.0, 18.0 Hz, 8-Ha), 2.14 (1H, dd, J = 5.4, 18.0 Hz, 8-Hb), 2.38 (2H, t, J = 6.0 Hz, 2-H), 2.53 (1H, m, 10-H), 2.68 (1H, m, 9-H), 3.33 (2H, t, J = 6.0, 1-H), 2.96 (3H, s , 1-OCH 3 ), and at carbon nuclear magnetic resonance (75 MHz, C 6 D 6 ): δ = 14.63 (q, C-17), 20.13 (t, C-8), 23.39 (t, C-16), 27.14 (t, C-11), 28.08 (t, C-12), 29.90 (t, C-13), 30.01 (t, C-14), 32.47 (t, C-15), 45.96 (t, C-2), 53.85 (d, C-9), 56.67 (d, C-10), 58.70 (q, 1-O C H 3 ), 66.42 (s, C-6), 67.42 ( t, C-1), 74.02 (s, C-5), 75.20 (s, C-7), 85.67 (s, C-4), 184.20 (s, C-3), appeared 1 H, 13 C, COZY, HMQC, HMBC spectrum was obtained by the overall analysis to determine the structure of the compound 2 is R 3 in the formula 1 as CH 3 O-, the new compound 2 isolated in the present invention panaxinone It was named B (panaxynone B) (FIGS. 4, 5 and 6).
실시예 3: 파낙시논 A와 파낙시논 B의 DGAT 활성 검정Example 3: DGAT Activity Assay of Panaxinone A and Panaxinone B
효소원으로는 흰쥐(Male Sprague -Dawley rat, 250 ∼ 300 g)의 간을 분리하여 완충액 A(0.25 M sucrose, 1.0 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl. pH 7.4)로 세척하고 테프론봉의 유리균질기로 균질화하였다. 균질액을 14,000 ×g에서 4 ℃, 15분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액을 다시 100,000 ×g에서 4 ℃, 1 시간동안 원심분리하였다. DGAT가 포함된 마이크로솜의 분리를 위해 침전물에 버퍼 B(0.25 M sucrose, 10 mM Tris-HCl. pH 7.4)를 가하여 100,000 ×g에서 4 ℃, 1시간동안 다시 원심분리하여 생성된 침전물에 buffer B(4 ㎖)를 가해 용해시키고 표준물질로 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 Lowary 방법으로 단백질의 농도를 결정하였다. 용액은 10 ㎎/㎖의 농도로 희석하고 분주하여 -70 ℃에서 보관하여 사용하였다.As enzyme source, liver of male Sprague-Dawley rat (250-300 g) was isolated and washed with buffer A (0.25 M sucrose, 1.0 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl. PH 7.4) and Homogenized. The homogenate was centrifuged for 15 minutes at 4 ° C. at 14,000 × g to obtain a supernatant. This supernatant was further centrifuged at 100,000 xg for 4 hours at 4 占 폚. Buffer B (0.25 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) was added to the precipitate for the isolation of microsomes containing DGAT, and centrifuged again at 100,000 × g for 4 hours at 100,000 × g. (4 mL) was added to dissolve the protein concentration using a lowary method using bovine serum albumin as a standard. The solution was diluted to a concentration of 10 mg / mL, aliquoted and stored at -70 ° C for use.
DGAT 효소활성 측정은 다음과 같은 방법을 사용하였다. DGAT 효소원으로랫(rat)의 마이크로좀 단백질과 기질로서 1,2-디아실글리세롤과 [14C]팔미토일-코에이를 사용하여 생성된 [14C]트리아실글리세롤의 방사능의 양을 측정하였으며 그 과정을 간단히 기술하면 다음과 같다.DGAT enzyme activity was measured by the following method. Determination of the amount of radioactivity of [ 14 C] triacylglycerol produced using 1,2-diacylglycerol and [ 14 C] palmitoyl-coei as substrates for the microsomal protein of rats as a DGAT enzyme source The process is briefly described as follows.
반응액은 175 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 ㎕의 소의 혈청 알부민(10 ㎎/㎖), 8 mM의 MgCl2, 30 μM의 [14C]팔미토일 코에이(0.02 μCi, Amersham), 200 μM의 1,2-디올레오일 글리세롤을 포함하였다. 여기에 메탄올 또는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 시료액 10.0 ㎕을 가하고 100 ∼ 200 ㎍의 마이크로좀 단백질을 넣은 다음 25 ℃에서 10분간 반응시킨 후, 반응 종결액(2-프로판올 / 헵탄 / 물 = 80 / 20 / 2, v/v/v) 1.5 ㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 생성된 [14C]트리아실 글리세롤을 분리하기 위하여 1 ㎖의 헵탄과 0.5 ㎖의 H2O를 가하여 진탕한 후 상층액 1 ㎖을 취하고 여기에 2 ㎖의 알칼리성 에탄올 용액(에탄올 / 0.5 N 수산화 나트륨 / 물 = 50 / 10 / 40, v/v/v)을 가하여 진탕하였다. 상층액 0.65 ㎖을 취하여 LSC(liquid scintillation counter)로 방사능의 양을 측정하고 다음 수학식 1로 DGAT의 저해활성을 계산하였다.The reaction solution was 175 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 μl bovine serum albumin (10 mg / ml), 8 mM MgCl 2 , 30 μM of [ 14 C] palmitoyl coei (0.02 μCi, Amersham), 200 μM of 1,2-dioleoyl glycerol was included. To this, 10.0 μl of sample solution dissolved in methanol or dimethyl sulfoxide (DMSO) were added, 100-200 μg of microsome protein was added thereto, followed by reaction at 25 ° C. for 10 minutes, followed by reaction termination solution (2-propanol / heptane / water = 80/20/2, v / v / v) 1.5 ml was added to stop the reaction. To separate the resulting [ 14 C] triacyl glycerol, add 1 ml of heptane and 0.5 ml of H 2 O, shake, take 1 ml of the supernatant, and add 2 ml of alkaline ethanol solution (ethanol / 0.5 N sodium hydroxide). / Water = 50/10/40, v / v / v) and shaken. Taking 0.65 ml of the supernatant, the amount of radioactivity was measured by a liquid scintillation counter (LSC), and the inhibitory activity of DGAT was calculated by the following equation.
T : 효소반응액에 시료를 넣어 시험구의 cpm 값T: Put the sample in the enzyme reaction solution cpm value of the test
C : 효소반응액에 시료를 넣지 않은 대조구의 cpm 값C: cpm value of the control without the sample in the enzyme reaction solution
B : 효소원을 넣지 않고 시료를 넣은 대조구의 cpm 값B: cpm value of the control without the enzyme source
파낙시논 A와 파낙시논 B의 아실 코에이: 디아실글리세롤 아실 트란스퍼라제 저해율을 측정한 결과, 파낙시논 A는 DGAT의 활성을 50% 저해하는 농도, 즉 IC50가 9.0 ㎍/㎖로 측정되었고 활성물질의 분자량이 260이었으므로 IC50가 34.6 μM로 계산되었다. 파낙시논 B의 경우 32.0 ㎍/㎖로 측정되었고 활성물질의 분자량이 290이었으므로 IC50가 110.3 μM로 계산되었다[도 7].As a result of measuring the inhibition rate of acyl coei: diacylglycerol acyltransferase of panaxinone A and panaxinone B, panaxinone A was found to inhibit 50% of DGAT activity, i.e., 9.0 μg / ml of IC 50. IC 50 was calculated to be 34.6 μM because the molecular weight of the active material was 260. Panaxinone B was measured at 32.0 μg / ml and the molecular weight of the active material was 290, resulting in an IC 50 of 110.3 μM [FIG. 7].
실시예 4: 비만 억제 활성 확인Example 4: Confirming Obesity Inhibitory Activity
활성물질의 비만 관련in vivo활성을 검색하기 위하여 시험동물은 주문용 실험동물사료(제일사료)로 자유급여주문용 실험동물사료(제일사료)로 자유급여실험동물 사육장에서 ZDF (fa/fa, Hanlan, USA) 3주령 래트를 1주일간 순화검역을 실시한 실험동물로 건강하다고 인정된 개체만을 실험재료로 사용하였다. 4주령 rat의 평균중량은 123 ±2 g으로 사육환경은 일반적으로 실험동물 사육장의 배리어 시스템(barrier system) 환경규정(온도: 23 ±1 ℃, 습도: 55 ±5%, 환기회수: 15회/1시간, 조명시간: 점등 12시간/소등 12시간, 조도: 150 ∼ 300 lux, 암모니아 취기: 200 ppm 이하, 소음: 60 db 이하, 기류: 0.1 m 이하/초)을 적용하였으며 와이어 케이지(wire cage)[rat용, 410 ×220 ×200 mm]를 이용하여 케이지당 4마리를 수용하여 사육하였다. 급수는 121 ℃에서 20분간 고압증기 멸균된 탭워터(tab water)를, 사료는 멸균된 주문용 콜레스테롤 부가 실험동물사료[Oriental. Co .Ltd. Japan]로 자유 급여하였다.In order to detect the obesity-related in vivo activity of the active substance, the test animals were ZDF (fa / fa, Hanlan) in the free feed experimental animal feed as the free feed order experimental animal feed (first feed). , USA) Three-week-old rats were subjected to purified quarantine for one week, and only individuals that were considered healthy were used as experimental materials. The average weight of four-week-old rats is 123 ± 2 g, and the breeding environment is generally defined as a barrier system for laboratory animals (temperature: 23 ± 1 ℃, humidity: 55 ± 5%, ventilation frequency: 15 times / 1 hour, lighting time: 12 hours lighting / 12 hours off, illuminance: 150-300 lux, ammonia odor: 200 ppm or less, noise: 60 db or less, air flow: 0.1 m / sec), wire cage 4 rats per cage were raised using rats (410 x 220 x 200 mm). Feed water is autoclaved tap water for 20 minutes at 121 ℃, feed is sterilized on-demand cholesterol added experimental animal feed [Oriental. Co .Ltd. Japan].
한국 인삼으로부터 분리한 파낙시논 A의 비만억제에 활성 효과를 시험하기 위하여 시험 동물에 10 mg/kg/day로 활성물질을 투여하고 56일간 시험하였다. 주문용 콜레스테롤 부가 실험동물사료와 활성물질을 투여하다가 21일 이후부터 사료는 주문용 콜레스테롤 부가 실험동물사료에서 주문용 실험동물사료(제일사료)로 바꾸어 자유 급여하면서 활성물질을 10 mg/kg/day로 투여하며 실험동물의 체중을 측정하였다. 실험 공시험으로 활성물질은 투여하지 않은 동물군의 체중과, 주문용 콜레스테롤 부가 실험동물사료와 활성물질을 투여하다가 21일 이후부터 주문용 실험동물사료(제일사료)로 바꾸어 자유 급여하였고, 활성시험은 주문용 콜레스테롤 부가 실험동물사료를 투여하다가 21일 이후부터 사료는 주문용 콜레스테롤 부가 실험동물사료에서 주문용 실험동물사료(제일사료)로 바꾸어 자유 급여하면서 활성물질을 시험시작부터 계속하여 10 mg/kg/day로 투여하며 시험한 실험동물의 체중이다.In order to test the anti-obesity effect of panaxinone A isolated from Korean ginseng, the test substance was administered at 10 mg / kg / day and tested for 56 days. After 21 days of administration of supplementary cholesterol-added experimental animal feed and active substance, the feed was changed from the supplemental cholesterol-added experimental animal feed to custom-grade experimental animal feed (first feed) and freely fed 10 mg / kg / day. The body weight of the test animals was measured. In the experimental blank test, the body weight of the animals that did not receive the active substance, and the supplementary experimental animal feed and the active substance for order cholesterol were administered and changed to the ordered experimental animal feed (first feed) after 21 days. After 21 days of administration of the experimental cholesterol-added dietary animal feed, the feed was changed from the experimental cholesterol-added test animal feed to the experimental animal feed for the first order (first feed), while freely feeding the active substance from the beginning of the test 10 mg / kg The body weight of the test animals tested and administered at / day.
공시험 동물군의 체중과 비교하여 활성물질투여 동물군에서는 활성물질을 초기부터 계속하여 10 mg/kg/day로 투여하며 시험한 실험동물의 체중은 1주일간격의 비교결과에서 공시험과 비교하여 초기 1주 후부터 6.5%, 8.6%, 8.4%, 8.5%, 8.7%, 10.5%, 13%, 7.9% 정도 체중의 감소를 보였으며, 8주의 동물시험결과에서 체중의 감소는 보였으나 실험동물의 외견상 어떠한 독성의 징후도 나타나지 않았다.Administering Active Substances Compared to the Weight of the Blank Animals The animals were administered with 10 mg / kg / day of active substances from the beginning. After the week, weight loss was reduced by 6.5%, 8.6%, 8.4%, 8.5%, 8.7%, 10.5%, 13%, and 7.9%. No signs of toxicity were seen.
실시예 5: 고 중성지방혈증 치료 효과 확인Example 5: Confirmation of the treatment effect of hypertriglyceridemia
공시험 동물군과 비교하여 활성물질투여 동물군에서는 활성물질을 초기부터 계속하여 10 mg/kg/day로 투여하며 시험하였다. 8주 후의 동물시험의 혈액학적 시험결과에서 실험동물의 혈액중 중성지방의 양은 공시험에서는 중성지방이 87 ㎎/㎗ 이었고 활성물질투여 동물군에서는 70 ㎎/㎗로 중성지방이 19.5% 감소하였다. 8주의 동물시험결과에서 혈중의 중성지방과 체중의 감소는 보였으나 실험동물의 외견상 어떠한 독성의 징후도 나타나지 않았다.Administration of Active Substances Compared to the blank test animals, the actives were tested at an initial dose of 10 mg / kg / day. In the hematological test results of the animal test after 8 weeks, the amount of triglyceride in the blood of the experimental animals was 87 mg / dl in the blank test and 70 mg / dl in the animal group administered with the active substance, and 19.5% of the triglyceride was decreased. Eight weeks of animal testing showed a decrease in triglycerides and weight in the blood, but no signs of toxicity were observed in the experimental animals.
실시예 6: 분말제의 제조Example 6: Preparation of Powder
유효성분(인삼으로부터 추출한 폴리아세틸렌계 화합물), 옥수수 전분, 카르복시 셀룰로오스 등을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 상기 분말을 넣어 캡슐당 유효성분이 50 ∼ 100 ㎎ 충전되도록 캡슐제를 제조하였다.Powder was prepared by finely mixing the active ingredient (polyacetylene-based compound extracted from ginseng), corn starch, carboxy cellulose and the like. The powder was put in a hard capsule to prepare a capsule so that 50 to 100 mg of the active ingredient per capsule was filled.
실시예 7: 독성시험Example 7: Toxicity Test
본 발명의 파낙시논 A와 파낙시논 B에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.Toxicity experiments were performed on panaxinone A and panaxinone B of the present invention as follows.
파낙시논 A와 파낙시논 B 각각을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 100 ㎎/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.Panaxinone A and Panaxinone B were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), diluted with water, and then administered to the mice (10 per group) at 100 mg / kg, respectively, and observed for 7 days. There was no.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 인삼으로부터 DGAT 활성을 억제하는 신규 폴리아세틸렌계 화합물들을 분리, 정제하여 중성지방이 체내에 흡수되는 것과 간, 지방 세포, 근육 세포 등에서의 중성지방의 생합성을 저해하여 혈중 중성지방을 강하시키고 중성지방의 장기 내 축적을 억제함으로써 체중을 감소시켜 비만과 고 중성지방 혈증의 치료에 이용할 수 있는 효과가 있으므로 의약분야의 산업상 매우 유용하다.As described above, the present invention isolates and purifies novel polyacetylene-based compounds that inhibit DGAT activity from ginseng, thereby inhibiting the absorption of triglycerides into the body and the biosynthesis of triglycerides in liver, fat cells, muscle cells, etc. It is very useful in the field of medicine because it has the effect that can be used for the treatment of obesity and hypertriglyceridemia by reducing the weight of blood triglycerides and inhibiting the accumulation of triglycerides in the organs.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7244727B2 (en) | 2002-11-22 | 2007-07-17 | Japan Tobacco Inc. | Fused bicyclic nitrogen-containing heterocycles |
| US7300932B2 (en) | 2003-08-07 | 2007-11-27 | Japan Tobacco Inc. | Pyrrolo[1,2-b]pyridazine derivatives |
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