KR20030026803A - 니트론 함유 셀레노 화합물, 이의 제조방법 및 치료적 용도 - Google Patents

니트론 함유 셀레노 화합물, 이의 제조방법 및 치료적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 니트론을 함유하는 신규한 셀레노 화합물, 그의 제조방법 및, 활성 산소(reactive oxygen species, ROS)에 의해 유발되는 각종 의학적 기능장애 및 질병, 특히, 뇌졸중(stroke), 파킨슨병(Parkinson's disease) 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 치료 및/또는 예방을 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물들은 참조 화합물과 비슷하거나 그보다 더 우수한 지질 과산화(lipid peroxidation, LPO) 저해 활성을 갖고 있다. 이들은 독성이 더 낮고 수용성이 더 높으면서도, 활성 산소(ROS)에 의한 대뇌 신경세포 사멸을 효과적으로 저해하며 허혈성 신경 퇴행에 맞서 신경보호 작용(neuroprotective effect)을 나타낸다.

Description

니트론 함유 셀레노 화합물, 이의 제조방법 및 치료적 용도{Seleno Compounds Containing Nitrone Moiety, Their Preparation and Their Therapeutic Uses}
하르만(Harman)이 제기한 노화의 활성 산소설(free-radical theory of ageing)에 따르면, 연속적인 산화 공격은 "산화적 스트레스(oxidative stress)" 상태, 즉, 산화촉진물(pro-oxidant)이 과다한 상태의, 보호 체계의 불균형을 일으킨다. 이러한 산화 공격은 복합 불포화 막지질, 단백질 및 핵산에서 특히 무수한 분자적 변형을 유발한다. 인간 및 동물 개체는 서로 협력적으로 작용하는 다양한 방어 메카니즘을 갖고 있다. 이러한 방어 기작은 효소계(superoxide dismutase, catalase 및 glutathione peroxidase) 또는 비효소계(유리 라디칼(free-radical) 활성의 생리적 조절을 가능하게 하는 vitamin E 및 C 등)에서 발견된다. 그러나, 노화가 진행됨에 따라, 특히 이러한 보호 기작에 관련된 효소들을 포함한 많은 효소들의 활성 감소로 보호 작용은 효력이 아주 없는 것은 아니지만 점차 감소된 효력을 갖는다. 결론적으로, 동맥경화(atherosclerosis), 백내장(cataract), 인슐린-비의존성 당뇨병(non-insulin-dependent diabetes), 암(cancer) 또는 만성 뇌신경퇴행성 질환(chronic neurodegenerative disorders)과 같은, 노화와 관련된 일부 질환들에 대한 많은 연구들은 그런 질환들이 "산화적 스트레스" 상태와 관련되어 있음을 증명해 왔다.
중추신경계는 산소 소비량이 많은 반면, 항산화 방어 시스템은 상대적으로 부족하며, 일부 대뇌부에서는 철 농도도 높기 때문에, "산화적 스트레스"에 특히 민감하다. 이 같은 점은 "산화적 스트레스"가 뇌졸중 등의 급성 중추신경계 장애 및 파킨슨병, 알츠하이머병 및 기저핵(basal ganglia) 퇴화 등의 뇌신경퇴행성 질환 뿐만 아니라, 대뇌 노화의 주요 병인 중 하나라는 사실을 뒷받침한다. 중추신경계 신경질환의 발생률은 세계적으로 증가 추세에 있으며, 특히 뇌졸중의 경우 심순환계 질환과 악성종양 다음으로 3대 사망원인을 차지하고 있다(참조: Parnetti, L. et al., Drug, 53:752(1997)).
산화적 스트레스로부터 뇌신경세포를 보호하는 항산화제로서는트로록스(Trolox) 등의 비타민 E 유도체(참조: J. Med. Chem., 38:453 (1995)), 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase, 이하 "GPx") 모방체(참조: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd., Annual Report (1999); WO 9808831; USP 5008394; J. Am. Chem. Soc., 119:2079-2083 (1997); Adv. Pharmacol., 38:229 (1996)), 과산소 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 모방체(참조: USP 5827880), 스핀 포착제(spin trapping agent)(참조: J. Med. Chem., 39:4988 (1996); USP 5475032) 등이 개발되고 있다.
GPx 모방체의 경우, GPx 활성 부위에서 중요한 기여를 하는 셀레노시스테인(selenocystein) 부위를 기본으로 합성된 화합물이다. 가장 대표적인 GPx 모방체인 엡셀렌(Ebselen)은 독성이 아주 적고 전임상(preclinical) 및 임상시험에서 좋은 결과를 보이고 있으며, 특히 뇌졸중 치료제로 관심이 커지고 있다. 그러나, 수용성이 너무 적어서 약물로서의 이용이 제한되어 진다.
스핀 포착제의 경우, 생체 내 유해한 유리 라디칼을 충분히 포획할 수 있으면 항산화제로의 개발이 가능하다. 이러한 스핀 포착제로는 α-페닐-N-t-부틸니트론(PBN)을 들 수 있으며, 현재 PBN의 다양한 유도체들이 개발되고 있다. 일반적으로, 니트론기는 화합물의 물에 대한 용해도를 증가시키나, 실험실적 조건(in vitro)에서 지질 과산화(lipid peroxidation) 저해 효과가 적으며, 생체 내(in vivo)에서는 뇌세포 보호능력도 우수하지 못하다는 문제점을 가지고 있다(참조: Fevig, Thomas L. et al., J. Med. Chem., 39:4988-4996 (1996)).
발명의 요약
이에, 본 발명자들은 전술한 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, GPx 모방체인 엡셀렌에 스핀 포착제인 니트론 부분을 도입하여 개발한 새로운 화합물이 우수한 수용성 및 낮은 독성을 가질 뿐만 아니라, 과산화효소(peroxidase) 기능과 라디칼 포획 기능을 동시에 가져, 저독성으로 뇌세포의 사멸을 효과적으로 예방 및 치유하는 항산화 활성을 나타내므로, 뇌세포의 사멸을 치료 및 예방하는데 있어서 효과적인 약물로서 사용 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 첫번째 목적은 GPx 모방체에 스핀 포착 부분을 도입한 새로운 형태의 항산화제를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기 항산화제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기 항산화제를 유효성분으로 포함하며, 활성 산소(ROS)에서 기인하는 각종 의학적 기능장애 및 질병, 특히, 뇌졸중, 파킨슨병 및 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방에 유용한 약리학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 전기 약리학적 조제물을 투여하는 단계를 포함하는, 항산화제를 필요로 하는 질환, 특히 급성 및 진행성 뇌신경퇴행성 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 니트론(nitrone)을 함유하는 신규한 셀레노 화합물, 그의 제조방법 및 전기 신규 화합물을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 니트론을 함유하는 신규한 셀레노 화합물, 그의 제조방법 및, 활성 산소(reactive oxygen species, ROS)에 의해 유발되는 각종 의학적 기능장애 및 질병, 특히, 뇌졸중(stroke), 파킨슨병(Parkinson's disease) 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 치료 및/또는 예방을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
상기 본 발명의 목적과 장점 및 기타 목적과 장점들은 이하의 도면과 상세한 설명에 의하여 보다 명백해질 것이다.
도 1은 비교물질인 엡셀렌과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 합성된 화합물과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 2에서 합성된 화합물과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 5에서 합성된 화합물과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 7에서 합성된 화합물과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 엡셀렌의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 1에서 합성된 화합물의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예 2에서 합성된 화합물의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 실시예 5에서 합성된 화합물의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 10은 실시예 7에서 합성된 화합물의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 11(A)는 허혈 후에 본 발명의 화합물을 처리한 경우에 있어서 세포 손상의 치유 정도를 나타내는 그래프이다.
도 11(B)는 허혈 후에 본 발명의 화합물을 처리한 경우에 있어서 세포 손상의 치유 정도를 나타내는 현미경 사진(photomicrograph)이다.
첫번째 실시태양으로, 본 발명은 과산화효소 활성 및 유리 라디칼 포획 활성의 이중 기능을 가진 하기 일반식 (I)의 신규한 항산화제를 제공한다:
(I)
상기 식에서,
R1및 R2는 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, C1~4알킬, C1~4알콕시, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 니트로이거나 또는 R1및 R2는 함께 메틸렌디옥시를 형성하고;
L은 페닐, C1~4알킬페닐, 또는, 푸라닐, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 티오페닐, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 벤조티아졸릴, 벤조이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 트리아지닐, 트리아졸릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 1 내지 4개의 질소, 산소 및/또는 황 헤테로원자를 가진 불포화 또는 포화 헤테로씨클릭기(이때, 헤테로씨클릭기는 할로겐, C1~2알킬, C1~4알콕시, C1~4알킬티오, 하이드록시, 메르캅토, 트리플루오로메틸, 니트로, 페닐, 니트릴, 카복시 또는 C1~4알콕시카보닐에 의해 1회 또는 2회 동일하거나 서로 다른 것으로 치환될 수 있다)이며; 및,
R3는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아랄킬, 아릴, 씨클로알킬 또는 씨클로알케닐이다.
이러한 맥락에서, 바람직한 화합물로는,
R1및 R2가 동일하거나 다른 것으로서, 서로 독립적으로, 수소, 플루오르, 염소, 브롬, 하이드록시, 메틸, 에틸, 메톡시, 트리플루오로메틸, 니트로 또는 메틸렌디옥시이고;
R3는 알킬, 치환된 알킬, 아랄킬, 아릴 및 씨클로알킬이며; 및,
L은 페닐, 메틸페닐, 에틸페닐, 또는, 푸라닐, 옥사졸릴, 티오페닐, 티아졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 벤조티아졸릴, 트리아지닐, 트리아졸릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 1 내지 4개의 질소, 산소 및/또는 황 헤테로원자를 가진 불포화 또는 포화 헤테로씨클릭기(이 때, 헤테로씨클릭기는 플루오르, 염소, 브롬, 메틸, 에틸, 부틸, 메톡시, 에톡시, 메틸메르캅토, 에틸메르캅토, 하이드록시, 메르캅토, 트리플루오로메틸, 니트로, 페닐, 니트릴, 카복시 또는 메톡시카보닐 및 에톡시카보닐에 의해 1회 또는 2회 동일하거나 서로 다른 것으로 치환될 수 있다)인 유도체이다.
보다 바람직한 화합물은,
R1및 R2가 동일하거나 다른 것으로서, 서로 독립적으로 수소, 플루오르, 염소, 메틸, 메톡시, 트리플루오로메틸, 니트로 또는 메틸렌디옥시이고;
L은 페닐, 메틸페닐, 에틸페닐, 또는, 푸라닐, 옥사졸릴, 티오페닐, 티아졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 벤조티아졸릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 1 내지 4개의 질소, 산소 및/또는 황 헤테로원자를 가진 불포화 또는 포화 헤테로씨클릭기(이때, 헤테로씨클릭기는 플루오르, 염소, 브롬, 메틸, 메톡시, 에톡시, 메틸메르캅토, 하이드록시, 메르캅토, 니트로, 페닐, 니트릴, 카복시 또는 메톡시카보닐 및 에톡시카보닐에 의해 1회 또는 2회 동일하거나 서로 다른 것으로 치환될 수 있다)이며; 및,
R3는 알킬 또는 씨클로알킬인 유도체이다.
본 발명의 화합물들은 비교물질인 S-PBN 및 엡셀렌과 비슷하거나 그보다 더 우수한 지질 과산화(lipid peroxidation, LPO) 저해 활성을 갖고 있다. 이들은 독성이 더 낮고 수용성이 더 높으면서도, 활성 산소에 의한 대뇌 신경 세포 사멸을 효과적으로 저해하며 허혈성 신경 퇴행(ischemic neuronal degeneration)에 대한 신경보호 작용(neuroprotective effect)을 나타낸다.
본 발명의 화합물, 특히, 하기 실시예 5에서 합성되는 화합물은 쥐(rat)에서 구강 투여시 LD50≥7,000 mg/kg 및, 복강조직내 투여시 ≥800 mg/kg로 독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 잇점 중 하나는 그 신규 화합물이 엡셀렌 등의 다른 어떤 알려진 항산화제보다도 훨씬 더 높은 수준으로 투여될 수 있다는 것이다(마우스(mouse)에서 얻은 엡셀렌의 LD50값은 구강 투여시 6,810 mg/kg 이상이었고, 복강조직내 투여시 740 mg/kg이상이었다. 유사하게, 쥐(rat)에서 수득한 엡셀렌의 LD50값은 구강 투여시 6,810 mg/kg 이상이었고, 복강조직내 투여시 580 mg/kg이상이었다). 따라서, 뇌졸중 또는 다른 외상 직후 본 신규 화합물을 많은 양 투여함으로써 산화에 의한 병변(oxidative damage)을 현저히 감소시킬 수 있다.
두번째 실시태양으로, 본 발명은 하기의 반응 경로에 나타나 있는 상기 식 (I)의 화합물의 제조방법을 제공한다:
"1"로 표기되어 있으며, 적절한 링커를 갖고 있고 아미노기가 보호된 알데히드와 알킬하이드록실아민(alkylhydroxylamines, R3NHOH)을 반응시켜 "2"로 표기된 니트론을 수득한 후, 이를 탈보호기 반응시켜 "3"으로 표기된 유리(free) 아민 니트론을 수득한다. 바람직하게는, 알킬하이드록실아민은 니트로알칸, 아연 및 아세트산을 한 반응기 내에서 반응시켜 생성된 것을 분리하지 않고 사용한다. 보호기의 제거시, 보호기가 삼차부톡시카보닐(tert-butoxycarbonyl)일 경우에는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로, 또는, 아세틸(acetyl)일 경우에는 LiOH를 사용하는 것이 바람직하다.
"3"으로 표기된 화합물의 유리 아민을 과량의 염기(base)나 유기 염기(organic base), 보다 바람직하게는 트리에틸아민의 존재하에서 o-클로로셀레노벤조일 클로라이드(o-chloroselenobenzoyl chlorides, "4"로 표기되어 있음)와 반응시켜, 식 (I)의 니트론 부분을 함유하는 셀레노 화합물을 제조한다.
세번째 실시태양으로, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 상기 식 (I)의 한 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 약학적으로 유효한 양으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
네번째 실시태양으로, 본 발명은 항산화제를 필요로 하는 질환, 특히 급성 및 진행성 뇌신경퇴행성 질환을 앓고 있는 개체에 전기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 그 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
앞서 언급했듯이, 본 발명의 화합물은 활성 산소에서 기인하는 다양한 영향들을 경감시키는 유효한 항산화제로 입증되었다. 이 화합물들은, 이에 국한되지는 않으나, 급성 중추신경계(CNS) 장애 및 뇌신경퇴행성 질환들을 포함한 광범위한 의학적 기능 장애 및 질병들을 치료 및/또는 예방하는 치료제로 유용하다.
조제약으로서 본 발명의 화합물은 일반적으로, 적어도 하나의 본 발명의 활성 화합물을 포함하고 약리학적 조제물에서 사용하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 운반체를 포함하는 약리학적 조성물의 형태로 투여된다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 실제로 투여되는 본 화합물의 양은, 대개는, 대상 질환, 선택된 투여 경로, 실제 투여되는 화합물, 나이, 체중 및 개별 환자의 반응, 증상의 심함 정도 등을 포함한 관련된 정황들을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 투여량은 1일 1회 또는 수회 투여로 10mg에서 500mg까지이다.
본 발명의 약학적 조성물은 구강, 직장, 경피, 피하, 정맥, 근육내 및 비강을 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 의도한 전달 경로에 따라 주사용 또는 경구용 조성물 중 하나로 조제되는 것이 바람직하다.
경구 투여용 조성물은 원액 유동성 희석액(bulk liquid dilutions) 또는 현탁액, 또는 원액 분말(bulk powders)의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 좀 더 일반적으로는, 정확한 투약을 용이하게 하기 위해 단위 투여량 형태로 제공된다. "단위 투여량 형태(unit dosage forms)"라는 용어는 환자 및 다른 포유동물에 투여할 한번의 투여량으로 적합한, 완전히 분리된 단위를 지칭하는데, 각 단위에는 원하는 치료적 효과를 내도록 계산되어 미리 결정된 양의 활성 물질이 적절한 약학적 부형제와 결합된 형태로 들어 있다. 일반적인 단위 투여량 형태는 액상 조성물이 미리 채워지고 측정되어 있는 앰풀(ampule) 또는 주사기, 또는 고체 조성물의 경우 환약(pill), 정제(tablet), 캡슐 등의 형태를 포함한다. 이러한 조성물에서 본 발명의 니트론 부분을 함유하는 셀레노 화합물은 보통 소수 성분이다(여러 운반체 또는 담체이자 원하는 투여 형태를 만드는 데 유용한 산(acid)을 처리하는 여타 잔여물을 포함한 전체 중량의 약 0.1 내지 50% 또는 바람직하게는 약 1 내지 40%).
경구 투여에 적합한 액상 형태에는 완충액, 현탁 및 분산제, 착색제, 향신료 등과 함께 적절한 수액성 또는 비수액성 운반체가 포함될 수 있다. 고형의 조제물에는, 예를 들면 다음의 성분들 또는 그와 유사한 성상의 화합물이 포함될 수 있다: 미세결정셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 트래거캔스 고무(gum tragacanth) 또는 젤라틴 등의 결합제; 전분 또는 유당(lactose) 등의 부형제; 알긴산(alginic acid), 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분 등의 분해제(disintegrating agent); 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate) 등의 윤활제; 교질성 이산화규소(colloidal silicon dioxide) 등의 활택제(glidant); 자당(sucrose) 또는 사카린(saccharin) 등의 감미제; 또는, 박하, 살리실산메틸(methyl salicylate) 또는 오렌지 향(orange flavoring) 등의 향신제.
주사용 조성물은 일반적으로 주사용 멸균 식염수나 PBS(phosphate-buffered saline) 또는 기타 당업계에 알려진 주사용 담체에 기초한다. 전기에서와 같이, 이런 조성물 내의 본 화합물은 일반적으로 소수 성분이며 보통 주사용 담체 등의 잔여물을 합친 중량의 약 0.05 내지 10%를 차지한다.
경구 투여용 또는 주사용 조성물에 대한 전기 성분들은 단지 대표적인 것들일 뿐이다. 기타의 물질 및 처리 방법 등은 레밍턴즈 파마슈티칼 사이언스(Remington's Pharmaceutical Sciences)에 개시되어 있다(참조: Part 8 of Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pa.).
본 발명의 화합물은 또한 서방형(sustained release form)으로 또는 서방성 약물전달시스템(sustained release drug delivery system)으로 투여될 수 있다. 대표적인 서방형 물질은 레밍턴즈 파마슈티칼 사이언스의 첨가 물질란에 개시되어있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1: 2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온
(8)의 합성
제 1 공정: 4-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐)아미노벤조니트릴 (2)의 합성
500mg(4.23mmol)의 4-아미노벤조니트릴 (1)과 1.90g(8.70mmol)의 디-t-부틸 디카보네이트(Boc2O)를 플라스크에 넣은 후 110℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응물을 상온으로 식힌 후 속성 컬럼 크로마토그래피(short flash column chromatography)(실리카, CH2Cl2:Hex:EtOAc = 10:10:1)을 통해 정제하여, 630mg(2.90mmol)의 백색 고체 화합물(2)를 68%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.7 Hz, 2H),
6.65 (br s, 1H), 1.53 (s, 9H).
제 2 공정: 4-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐)아미노벤즈알데히드 (3)의 합성
600mg(2.75mmol)의 니트릴(2)를 CH2Cl2(8mL)에 녹인 후, -78℃에서 8.3mL(8.3 mmol)의 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(DIBAL-H, 톨루엔 속의 1.0M 용액)을 2분여에 걸쳐 첨가하였다. 약 1시간 후 2mL의 MeOH를 천천히 가하였다. 반응물을 상온으로 올린 후, 디에틸 에테르와 0.5N HCl 용액을 가하고 유기층을 분리하였다. 수용액을 디에틸 에테르로 다시 한번 추출하고 결합된 유기층을 포화 NaHCO3용액으로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조한 후, 유기 용매를 감압하에서 제거하고 결과적인 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:Hex:EtOAc = 10:10:1 내지 10:10:2)를 통해 정제하여 백색 고체 화합물(3) 585mg(2.64mmol)을 96%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 9.89 (s, 1H), 7.83 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.53 (d, J =
8.6 Hz, 2H), 6.70 (br s, 1H), 1.55 (s, 9H).
제 3 공정: N-이소프로필-α-[4-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐아미노)페닐]니트
론 (5)의 합성
422mg(1.90mmol)의 화합물 3, 680mg(7.63mmol)의 2-니트로프로판 (4) 및 745mg(11.40mmol)의 아연을 95% 에탄올(8mL)이 담긴 플라스크에 가하고 0℃에서 교반하면서 0.87mL(15.20mmol)의 아세트산을 천천히 가하였다. 반응물을 상온으로 올린 후, 6시간 동안 교반하고 CH2Cl2를 가하고 셀라이트 패드(Celite pad)로 여과하고 감압하에서 농축하였다. 결과로서 생긴 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:EtOAc = 1:2)를 통해 정제하여 500mg(1.80mmol)의 백색 고체 화합물(5)를 95%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.21 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.9 Hz, 2H),
7.37 (s, 1H), 6.61 (br s, 1H), 4.19 (septet, J = 6.5 Hz,
1H), 1.52 (s, 9H), 1.50 (d, J = 6.5 Hz, 6H).
제 4 공정: N-이소프로필-α-(4-아미노페닐)니트론 (6)의 합성
320mg(1.15mmol)의 화합물 5를 CH2Cl2(10mL)에 녹이고, 0℃에서 트리플루오로아세트산 1mL를 천천히 가하였다. 반응물을 천천히 상온으로 올린 후 16시간 동안 교반하였다. 용액을 농축한 후, CH2Cl2및 포화 NaHCO3를 가하여 희석하였다. 여기에 NaCl을 가하여 용액을 포화 상태가 되게 하고 유기층을 분리하였다. 수층(aqueous layer)을 다시 CH2Cl2로 세번 추출한 후, 결합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조한 후, 감압하에서 농축하였다. 결과로서 생긴 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:EtOAc:MeOH = 5:5:1)를 통해 정제하여 132mg(0.74mmol)의 황색 고체 화합물 6을 64%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.12 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 6.68 (d, J =
7.0 Hz, 2H), 4.19 (septet, J = 6.5 Hz, 1H), 1.51 (d, J =
6.5 Hz, 6H);
13C NMR (CDCl3): δ 149.08, 132.69, 131.04, 121.39, 114.66, 67.13,
21.23.
제 5 공정: 2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온
(8)의 합성
75mg(0.42mmol)의 화합물 6과 1.0mL(7.17mmol)의 트리에틸아민을 포함하고 있는 CH2Cl2(3mL)의 용액에 CH2Cl2(1.5mL)에 녹인 200mg(0.79mmol)의 2-클로로카보닐-벤젠셀레네닐 클로라이드 (7)를 0℃에서 천천히 가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반한 후 반응물을 감압하에서 농축하고, 결과로서 생긴 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:EtOAc = 3:1, 0 내지 10% 메탄올 포함)를 통해 정제하여 83mg(0.23mmol)의 담황색 고체 화합물 8을 55%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3:CD3OD = 4:1): δ 8.33 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.08 (dd, J =
7.8 and 0.7 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.77
(dd, J = 8.8 and 1.9 Hz, 2H) 7.75 (t, J = 7.8 Hz, 1H),
7.60 (s, 1H), 7.48 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H),
4.28 (septet, J = 6.5 Hz, 1H), 1.52 (d, J = 6.5 Hz,
6H);
13C NMR (CDCl3:CD3OD = 4:1): δ 166.30, 141.11, 138.27, 133.14, 132.67,
129.92, 128.78, 127.86, 127.67, 126.40, 124.37, 124.21,
67.66, 20.44.
실시예 2: 2-[3-(N-이소프로필)니트로닐]페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온
(15)의 합성
제 1 공정: 에틸 3-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐) 아미노벤조에이트 (10)의 합
성
5.0g(30.27mmol)의 에틸 3-아미노벤조에이트 (9)와 17mL(0.12mol)의 트리에틸아민을 포함하고 있는 150mL의 1,4-디옥산/H2O(1:1 v/v)에 16.52g(75.67mmol)의 디-t-부틸 디카보네이트(Boc2O)를 가하고 상온에서 13시간 동안 교반하였다. 반응물에 물과 디에틸 에테르를 넣고 유기층을 분리한 후, 포화 NaCl 용액으로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조하였다. 그후, 감압하에서 여과하고 농축하여 결과로서 생긴 잔류물을 n-헥산으로 세척하여 정제함으로써 7.83g(29.5mmol)의 백색 고체 화합물 10을 98%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 7.90 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 7.71 (m, 2H), 7.36 (t, J =
7.9 Hz, 1H), 6.63 (br s, 1H), 4.37 (m, 2H), 1.52 (s,
9H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
제 2 공정: 3-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐)아미노벤질 알코올 (11) 의 합성
9.64g(36.34mmol)의 에틸 벤조에이트 10을 포함하고 있는 CH2Cl2(200mL)의 용액에 109mL의 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(DIBAL-H, 톨루엔 속의 1.0M 용액)를 -78℃에서 30분간 가하였다. 상온에서 3시간 동안 교반한 후, 30mL의 MeOH를 천천히 가하였다. 반응물을 상온으로 올린 후, 디에틸 에테르와 0.5N HCl 용액을 가하고 유기층을 분리하였다. 용액을 디에틸 에테르로 다시 한번 추출하였다. 결합된 유기층을 포화 NaHCO3용액으로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조한 후, 여과하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:Hex:EtOAc = 10:10:1 내지 10:10:2)로 정제하여 7.2g(32.3mmol)의 화합물 11을 89%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 7.42 (s, 1H), 7.24 (m, 2H), 7.0 (t, J = 6.9 Hz, 1H),
6.56 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 1.53 (s, 9H)
제 3 공정: 3-N-(1,1-디메틸에톡시-카보닐)아미노벤즈알데히드 (12)의 합성
5.63mL(64.50mmol)의 옥살릴 클로라이드를 포함하는 CH2Cl2(60mL)의 용액에 CH2Cl2(60mL)에 녹인 6.92mL(96.74mmol)의 DMSO 용액을 -78℃에서 천천히 가하였다. 10분 후에, 7.2g(32.3mmol)의 화합물 11를 포함하고 있는 CH2Cl2(60mL)을 천천히 가하고 30분간 교반한 후, 34mL의 TEA를 서서히 첨가하였다. 반응물을 상온으로 올린 후, CH2Cl2와 물을 가하고 유기층을 분리하여 포화 NaCl 용액으로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조한 후, 여과하고 농축하였다. 결과로서 생긴 고체를 n-헥산으로 정제하여 6.55g(29.60mmol)의 화합물 12를 92%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 9.99 (t, J = 3.4 Hz, 1H), 7.92 (t, 1H), 7.64 (d, 1H),
7.62 (d, 1H), 7.45 (t, 1H), 6.70 (s, 1H), 1.55 (s, 9H).
제 4 공정: N-이소프로필-α-[3-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐)아미노]페닐 니
트론 (13)의 합성
6.55g(29.6mmol)의 화합물 12, 6.65ml(74.03mmol)의 2-니트로프로판 (4) 및 6.78g(103.65mmol)의 아연을 95% 에탄올(100mL)이 담긴 둥근바닥 플라스크에 넣고 0℃로 냉각하였다. 교반하면서 11.9mL(207.9mmol)의 아세트산을 천천히 가하고, 온도를 상온으로 올린 후, 12시간 동안 교반하였다. CH2Cl2를 반응물에 가하고 셀라이트 패드로 여과한 후 감압하에서 농축하였다.잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:EtOAc = 1:2)로 정제하여 7.0g(21.3mmol)의 화합물 13(mp: 189~191℃)을 72%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.37 (s, 1H), 7.8 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.5 (d, J =
7.7 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.33 (t, J = 7.8 Hz, 1H),
6.60 (s, 1H), 4.19 (septet, J = 6.5 Hz, 1H), 1.53 (s,
9H), 1.48 (d, J = 6.5 Hz, 6H).
제 5 공정: N-이소프로필-α-3-아미노페닐 니트론 (14)의 합성
5.0g(17.96mmol)의 화합물 13을 포함하고 있는 CH2Cl2(200mL)의 용액에 20mL의 트리플루오로아세트산을 0℃에서 천천히 가하였다. 반응물을 상온으로 올린 후, 16시간 동안 교반하였다. 용액을 농축한 후, CH2Cl2및 포화 NaHCO3용액으로 희석하였다. 여기에 NaCl을 가하여 용액을 포화 상태가 되게 하고 유기층을 분리하였다. 수용액층을 CH2Cl2로 세번 추출한 후, 결합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:EtOAc:MeOH = 5:5:1)로 정제하여 2.1g(11.78mmol)의 황색 고체 화합물 14 (mp: 103~106℃)를 66%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.12 (t, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.16 (d, 2H), 6.74 (m,
1H), 4.18 (septet, J = 6.5 Hz, 1H), 3.74 (br s, 2H),
1.49 (d, J = 6.5 Hz, 6H);
13C NMR (CDCl3): δ 147.11, 132.80, 131.88, 129.52, 119.87, 117.38,
114.77, 68.10, 21.24.
제 6 공정: 2-[3-(N-이소프로필)니트로닐]페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온
(15)의 합성
50mg(0.28mmol)의 화합물 14 및 0.8mL(5.62mmol)의 트리에틸아민을 포함하고 있는 CH2Cl2(3mL)의 용액에 178mg(0.70mmol)의 2-클로로카보닐-벤젠셀레네닐 클로라이드 (7)를 포함하고 있는 CH2Cl2(1.5mL)를 0℃에서 천천히 가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반한 후, 반응물을 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:EtOAc = 3:1, 0 내지 10%의 메탄올 포함)로 정제하여 60mg(0.17mmol)의 담황색의 고체 화합물 15(mp: 94~98℃)를 60%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.65 (m, 1H), 8.09 (m, 2H), 7.81 (m, 1H), 7.66 (m,
2H) 7.37 (m, 3H), 4.23 (septet, J = 6.5 Hz, 1H), 1.52
(d, J = 6.5 Hz, 6H);
13C NMR (CDCl3): δ 166.23, 139.77, 138.18, 133.00, 132.21, 131.79,
129.69, 127.95, 127.12, 126.96, 126.90, 125.17, 124.30,
68.53, 67.48, 21.33.
실시예 3: 5-클로로-2-[3-(N-이소프로필)-니트로닐]페닐-1,2-벤지소셀레나졸
-3(2H)-온(17)의 합성
실시예 1에서 화합물 8을 수득하기 위해 개시된 방법과 유사한 방법으로, 290mg(1.01mmol)의 4-클로로-2-클로로카보닐벤젠셀레네닐 클로라이드 (16) 및 100mg(0.56mol)의 N-이소프로필-α-3-아미노페닐니트론 (14)로부터 40mg (0.10mmol)의 황색 고체 화합물 17을 18%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3:CD3OD = 4:1): δ 8.63 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 8.02 (d, J =
2.2 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.81 (dd, J =
7.9 및 2.3 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.61 (s,
1H), 7.61 (dd, J = 8.5 및 2.3 Hz, 1H), 7.53 (t, J = 7.9
Hz, 1H), 4.28 (septet, J = 6.5 Hz, 1H), 1.50 (d, J =
6.5 Hz, 6H)
13C NMR (CDCl3:CD3OD = 4:1): δ 166.30, 141.11, 138.27, 133.14, 132.67,
129.92, 128.77, 127.86, 127.67, 126.45, 124.37, 124.21,
67.66, 20.44.
실시예 4: 5-메틸-2-[3-(N-이소프로필)니트로닐]페닐-1,2-벤지소셀레나졸-
3(2H)-온 (19)의 합성
실시예 1에서 화합물 8을 수득하기 위해 개시된 방법과 유사한 방법으로, 380mg(1.40mmol)의 4-메틸-2-클로로카보닐벤젠셀레네닐 클로라이드 (18) 및 100mg (0.56mmol)의 N-이소프로필-α-3-아미노페닐니트론 (14)으로부터 40mg(0.20mmol)의 황색 고체 화합물 19 (mp: 197~201℃)를 30%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.60 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.90 (s, 1H),
7.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H) 7.56 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.44
(m, 3H), 4.23 (septet, J = 6.5 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H),
1.51 (d, J = 6.5 Hz, 6H);
13C NMR (CDCl3): δ 166.25,139.91, 137.07, 134.76, 134.39, 132.19,
131.78, 129.73, 129.71, 127.94, 127.09, 126.85, 125.14,
123.96, 68.51, 60.79, 21.41, 14.59.
실시예 5: 2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]티아졸-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-
3(2H)-온 (26)의 합성
제 1 공정: 에틸 2-N-(1,1-디메틸에톡시-카보닐)아미노티아졸-4-카복실레이
트 (21)의 합성
6.05g(35.13mmol)의 아미노티아졸 20 및 26.84g(0.12mmol)의 디-t-부틸 디카보네이트(Boc2O)를 플라스크에 넣고 110℃로 24시간 동안 가열하였다. 반응물을 상온으로 냉각한 후 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:Hex:EtOAc = 10:6:3)로 정제하여 7.13g(26.18mmol)의 백색 고체 화합물 21을 74.5%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.21 (br s, 1H), 7.78 (s, 1H), 4.38(q, J = 7.1 Hz,
2H), 1.54 (s, J = 7.1 Hz, 9H), 1.38 (t, 3H).
제 2 공정: (에스테르 21로부터) 2-N-(1,1-디메틸에톡시-카보닐)아미노티아
졸-4-카발데히드(22)의 합성
7.0g(25.71mmol)의 에틸 에스테르 21을 포함하고 있는 CH2Cl2(75mL)의 용액에 77mL의 디이소부틸알루미늄 하이드라이드 (DIBAL-H, 톨루엔 속의 1.0M 용액)를 -78℃에서 20분간 가하였다. 그 온도에서 3시간 동안 교반한 후, 30mL의 MeOH을 천천히 가하고 온도를 상온으로 올렸다. 디에틸 에테르 및 0.5N HCl 용액을 가하여 유기층을 분리한 후, 수용액층을 디에틸 에테르로 다시 한번 추출하였다. 결합된 유기층을 포화 NaHCO3용액으로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조한 후, 여과하고 감압하에서 농축하였다.잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:Hex:EtOAc = 10:6:3 내지 CH2Cl2:EtOAc = 1:1)로 정제하여 1.90g(8.32mmol, 수율 32.4%)의 고체 알데히드 22 및 3.5g(15.20mmol)의 액상 알코올 23을 59.0%의 수율로 수득하였다.
알데히드 22:
1H NMR (CDCl3): δ 9.88 (s, 1H), 8.83 (br s, 1H), 8.82 (s, 1H), 1.58 (s,
9H).
알코올 23:
1H NMR (CDCl3): δ 6.75 (s, 1H), 4.58 (s, 2H), 1.58 (s, 9H)
제 2-1 공정: (알코올 23으로부터) 2-N-(1,1-디메틸에톡시-카보닐)아미노티
아졸-4-카발데히드(22)의 합성
2.04g(8.597mmol)의 알코올 23을 포함하고 있는 CH2Cl2(50mL)에 302mg(0.86 mmol)의 TPAP(tetrapropylammonium perruthenate), 3.11g (26.547mmol)의 NMO(N-메틸모르폴린 N-옥사이드) 및 16g (2g/1mmol의 알코올)의 4Å 분자체를 첨가하고 상온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응물을 셀라이트 패드로 여과하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH2Cl2:Hex:EtOAc = 10:6:3)로 정제하여 950mg(4.0mmol)의 알데히드 22를 46.5%의 수율로 수득하였다.
제 3 공정: N-이소프로필-α-[2-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐)아미노티아졸-4-
일]니트론 (24)의 합성
2.22g(9.72mmol)의 화합물 22, 3.47g(33.65mmol)의 2-니트로프로판 (4) 및 2.54g(38.84mmol)의 아연을 95% 에탄올(50mL)이 담긴 둥근바닥 플라스크에 넣고 0℃로 냉각하였다. 교반하면서 여기에 4.67g(77.77mmol)의 아세트산을 천천히 가하였다. 반응물을 상온으로 올린 후, 6시간 동안 교반하였다. 반응물에 CH2Cl2를 가하고 셀라이트 패드로 여과한 후 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, Hex:EtOAc = 1:1)로 정제하여 2.51g(8.80mmol)의 화합물 24를 90.5%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.71 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 4.21 (septet, J = 6.6 Hz,
1H), 1.55 (s, 9H), 1.49 (d, J = 6.6 Hz, 6H).
제 4 공정: N-이소프로필-α-(2-아미노티아졸-4-일)니트론 (25)의 합성
2.44g(8.55mmol)의 화합물 24을 포함하고 있는 CH2Cl2(30mL)의 용액에 3.3mL의 트리플루오로아세트산을 0℃에서 천천히 가하였다. 반응물을 상온으로 올린 후, 16시간 동안 교반하였다. 용액을 농축한 후, CH2Cl2및 포화 NaHCO3용액으로 희석하였다. 여기에 NaCl을 가하여 용액을 포화 상태가 되게 하고 유기층을 분리하였다. 수용액층을 CH2Cl2로 세 번 추출한 후, 결합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압하에서 농축하였다.잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피 (실리카, CH2Cl2:EtOAc:MeOH = 5:5:1)로 정제하여 1.6g(8.46mmol)의 황색 고체 화합물 25를 99%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.38 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 5.61 (b, 2H), 4.16
(septet, J = 6.5 Hz, 1H), 1.46 (d, J = 6.5 Hz, 6H).
제 5 공정: 2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]티아졸-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-
3(2H)-온(26)의 합성
100mg(0.53mmol)의 화합물 25 및 0.74mL(5.29mmol)의 트리에틸아민을 포함하고 있는 CH2Cl2(15mL)의 용액에 220mg(0.866mmol)의 2-클로로카보닐-벤젠셀레네닐클로라이드 (7)가 포함되어 있는 CH2Cl2(5mL)를 0℃에서 천천히 가하였다. 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 재결정(MeOH/CH2Cl2) 하여 70mg(0.19mmol)의 담황색 고체 화합물 26을 37%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CD3OD): δ 8.82 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.05 (d, J = 7.8 Hz, 1H),
8.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.53
(t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.43 (septet, J = 6.8 Hz, 1H), 1.50
(d, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 6: 2-[4-(N-t-부틸)니트로닐]티아졸-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-
온의 합성
제 1 공정: N-t-부틸-α-[2-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐)아미노티아졸-4-일]
니트론(28)의 합성
2.0g(8.76mmol)의 화합물 22, 5.42g(52.57mmol)의 2-메틸-2-니트로프로판 (27) 및 2.86g(43.81mmol)의 아연을 95% 에탄올(50mL)이 담긴 둥근바닥 플라스크에 넣고 0℃로 냉각하였다. 교반하면서 4.21g(70.11mmol)의 아세트산을 천천히 가하고 온도를 상온으로 올린 후, 6시간 동안 교반하였다. CH2Cl2를 반응물에 가하고 셀라이트 패드로 여과한 후 감압하에서 농축하였다.잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, Hex:EtOAc = 1:1)로 정제하여 1.28g(4.28mmol)의 황색 고체 화합물 28을 49%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 9.9 (br s, 1H), 8.82 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 1.60 (s,
9H), 1.54 (s, 6H);
13C NMR (CDCl3): δ 159.54, 152.35, 141.53, 125.78, 117.31, 82.83,
70.33, 28.27, 28.21.
제 2 공정: N-t-부틸-α-(2-아미노티아졸-4-일)니트론 (29)의 합성
200mg(0.668mmol)의 화합물 28을 포함하고 있는 CH2Cl2(10mL)의 용액에 381mg의 트리플루오로아세트산을 0℃에서 천천히 가하고, 반응물을 상온으로 올린 후, 14시간 동안 교반하였다. 용액을 농축한 후, CH2Cl2및 포화 NaHCO3용액으로 희석하였다. 여기에 NaCl을 가하여 용액을 포화 상태가 되게 하고 유기층을 분리하였다. 수용액층을 CH2Cl2로 세번 추출한 후, 결합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압하에서 농축하였다.잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, EtOAc)로 정제하여 111mg(0.56mmol) 의 황색 고체 화합물 29를 83%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (MeOD): δ8.29 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 4.91 (s, 2H), 1.54 (s,
9H);
13C NMR (MeOD): δ168.76, 141.94, 127.57, 114.24, 70.23, 27.20.
제 3 공정: 2-[4-(N-t-부틸)니트로닐]티아졸-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)
-온(30)의 합성
100mg(0.50mmol)의 화합물 29 및 0.70mL(5.02mmol)의 트리에틸아민을 포함하고 있는 CH2Cl2(15mL)의 용액에 180mg(0.703mmol)의 2-클로로카보닐-벤젠셀레네닐 클로라이드 (7)가 포함되어 있는 CH2Cl2(5mL)을 0℃에서 가하였다. 상온에서 1시간 동안 교반한 후 반응물을 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, EtOAc:Hex = 1:1)로 정제하여 67mg(0.176mmol)의 담황색 고체 화합물 30을 35%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3:CD3OD = 10:1): δ 8.80 (s, 1H), 8.04 (d, J = 7.6 Hz, 1H),
7.91 (s, 1H), 7.60 (d, J = 7.86 Hz, 1H), 7.61 (t, J =
7.2 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 7.41 Hz, 1H), 1.56 (s, 9H);
13C NMR (CDCl3:CD3OD = 10:1): δ 165.38, 157.10, 140.74, 139.19, 133.71,
128.76, 127.05, 126.78, 124.72, 119.43, 70.54, 28.05.
실시예 7: 2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]벤질-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온
(37)의 합성
제 1 공정: 메틸 4-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐)아미노메틸벤조에이트(32)의
합성
500mg(2.48mmol)의 메틸 4-아미노메틸벤조에이트 HCl 염 (31)을 포함하고 있는 CH2Cl2(10mL)의 용액에 753mg(7.45mmol)의 TEA 및 568mg(2.60mmol)의 Boc2O가 포함되어 있는 CH2Cl2(1mL)를 0℃에서 가하였다. 30분 후, 반응물을 상온으로 올리고 4시간 동안 교반하였다. 그 후, CH2Cl2를 반응 용액에 가하고 0.1N HCl 용액으로 유기층을 세척하고 MgSO4로 건조한 후, 여과하고 감압하에서 농축하였다.잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, Hex:EtOAc = 1:1)로 정제하여 620mg의 화합물 32를 94%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 7.58 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 2H),
4.90 (br s, 1H), 4.37 (d, 2H), 3.91 (s, 3 H), 1.46 (s,
9H);
13C NMR (CDCl3): δ 167.02, 156015, 144042, 130.03, 129.23, 127.27,
79.91, 52.23, 44.43, 28.49
제 2 공정: 4-N-(1,1-디메틸에톡시-카보닐)아미노메틸벤질 알코올 (33)의 합
성
620mg(2.34mmol)의 에틸 벤조에이트 32을 포함하고 있는 CH2Cl2(15mL)의 용액에 7.01mL의 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(DIBAL-H, 톨루엔 속의 1.0M 용액)를 -78℃에서 30분동안 가하였다. 그 온도에서 3시간 동안 교반한 후, 3mL의 MeOH를 천천히 가하고 온도를 상온으로 올렸다. 디에틸 에테르 및 0.5N HCl 용액을 가하여 유기층을 분리한 후, 수용액층을 디에틸 에테르로 다시 한 번 추출하였다. 결합된 유기층을 포화 NaHCO3용액으로 세척하고 무수 Na2SO4으로 건조한 후, 여과하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, Hex:EtOAc = 2:1)로 정제하여 520mg (2.19mmol)의 화합물 33을 94%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 7.32 (m, 4H), 4.80 (br s, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.31 (m,
2H), 1.46 (s, 9H);
13C NMR (CDCl3): δ 156.6, 140.19, 138.30, 127.69, 127.33, 79.67, 64.95,
44.44, 28.49
제 3 공정: 4-N-(1,1-디메틸에톡시-카보닐)아미노메틸벤즈알데히드 (34)의
합성
0.48mL(5.48mmol)의 옥살릴 클로라이드를 포함하고 있는 CH2Cl2(2mL)의 용액에 0.63mL(8.76mmol)의 DMSO가 포함되어 있는 CH2Cl2(2mL)를 -78℃에서 천천히 가하였다. 15분 후, 520mg(2.19mmol)의 화합물 33을 포함하고 있는 CH2Cl2(3mL)을 천천히 적가하고 반응물을 30분간 교반하였다. 2.5mL의 TEA를 반응물에 천천히 적가한 후 온도를 상온으로 올렸다. 그 후, CH2Cl2및 H2O를 가하여 유기층을 분리하고, 그 유기층을 포화 NaCl 용액으로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조한 후, 여과하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, Hex:EtOAc = 2:1)로 정제하여 510mg(2.17mmol)의 화합물 34을 99%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 9.99 (s, 1H), 7.85 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.44 (d, J =
7.9 Hz, 2H), 4.95 (br s, 1H), 4.40 (d, 2H), 1.47 (s,
9H);
13C NMR (CDCl3): δ 191.95, 156.01, 146.37, 135.24, 129.93, 127.53,
79.57, 44.13, 28.28
제 4 공정: N-이소프로필-α-[4-N-(1,1-디메틸에톡시카보닐아미노)메틸페닐]
니트론 (35)의 합성
500mg(2.13mmol)의 화합물 34, 0.44mL(4.84mmol)의 2-니트로프로판 (4) 및 565mg(8.64mmol)의 아연을 95% 에탄올(10mL)이 담긴 둥근바닥 플라스크에 넣고 0℃로 냉각하였다. 교반하면서 0.83mL의 아세트산을 천천히 적가한 후, 온도를 상온으로 올리고 6시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응물에 CH2Cl2를 가하고 셀라이트 패드로 여과한 후, 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, Hex:EtOAc = 1:1)로 정제하여 540mg(1.85mmol)의 화합물 35를 87%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.21 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.42 (s, 1H), 7.32 (d, J =
8.2 Hz, 2H), 4.86 (br s, 1H), 4.33 (m, 2H), 4.23
(septet, J = 6.5 Hz, 1H), 1.50 (d, J = 6.5 Hz, 6H), 1.45
(s, 9H);
13C NMR (CDCl3): δ 156.00, 141.33, 131.80, 129.62, 128.78, 127.28,
79.42, 67.64, 44.36, 28.37, 20.83
제 5 공정: N-이소프로필-α-(4-아미노메틸-페닐)니트론 (36)의 합성
화합물 35를 200mg(0.68mmol) 포함하고 있는 CH2Cl2(3mL) 의 용액에 0.34mL의 트리플루오로아세트산을 0℃에서 천천히 적가한 후, 반응물을 상온으로 올리고 6시간 동안 교반하였다. 용액을 농축한 후, CH2Cl2및 포화 NaHCO3용액으로 희석하였다. 여기에 NaCl을 가하여 용액을 포화 상태가 되게 하고 유기층을 분리하였다. 수용액층을 CH2Cl2로 세번 추출한 후, 결합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, EtOAc:MeOH =9:1 내지 4:1)로 정제하여 130mg(0.68mmol)의 황색 고체 화합물 36을 99%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.34 (d, J =
8.4 Hz, 2H), 4.13 (septet, J = 6.54 Hz, 1H), 3.88 (s,
2H), 1.41 (d, J = 6.54 Hz, 6H);
13C NMR (CDCl3): δ 137.05, 135.89, 132.38, 130.98, 130.05, 68.80,
43.92, 20.90
제 6 공정: 2-[4-(N-이소프로필)-니트로닐]벤질-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-
온 (37)의 합성
80mg(0.42mmol)의 화합물 36 및 0.29mL(2.08mmol)의 트리에틸아민을 포함하고 있는 CH3CN(15mL) 및 EtOH(1mL)의 용액에 138mg(0.54mmol)의 2-클로로카보닐벤젠셀레네닐 클로라이드 (7)이 포함되어 있는 CH3CN(4mL)을 0℃에서 천천히 가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반한 후, 반응물을 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, EtOAc)로 정제하여 70mg(0.19mmol)의 담황색 고체 화합물 37을 45%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.24 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.04 (d, J = 7.9 Hz, 1H),
7.91 (s, 1H), 7.87 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 6.8
Hz, 1H), 7.45 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz,
2H), 4.95 (s, 2H), 4.34 (septet, J = 6.3 Hz, 1H), 1.36
(d, J = 6.3 Hz, 6H);
13C NMR (CDCl3): δ 140.12, 139.24, 131.99, 130.73, 129.20, 128.66,
128.06, 126.29, 125.79, 68.09, 48.21, 21.021
실시예 8: 7-니트로-2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]페닐-1,2-벤지소셀레나졸-
3(2H)-온(40)의 합성
제 1 공정: 2-메틸셀레노-3-니트로벤조산 (38)의 합성
500mg(2.0mmol)의 2-브로모-3-니트로벤조산을 포함하고 있는 무수 THF(15 mL)의 용액에 2.80mL(4.47mmol)의 n-BuLi(1.6 M soln. in Hex.)를 -78℃에서 천천히 적가하였다. 10분 후, 383mg(2.03mmol)의 디메틸 디셀레나이드가 포함되어 있는 THF(5mL)를 가하였다. 30분 후, 반응물을 상온으로 올리고 2시간 동안 추가로 교반한 후, 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 유기층을 1N HCl 용액으로 세척하고, MgSO4로 건조한 후, 감압하에서 농축하였다. 470mg의 정제되지 않은 잔류물을 추가적인 정제과정 없이 이를 다음 반응에 사용하였다.
1H NMR (CD3OD): δ 7.91 (d, J = 7.85 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.86 Hz, 1H),
7.56 (t, J = 7.85 Hz, 1H), 2.31 (s, 3H).
제 2 공정: 7-니트로-2-[4-(N-이소프로필)-니트로닐]페닐-1,2-벤지소셀레나
졸-3(2H)-온(40)의 합성
470mg의 정제되지 않은 산물 38을 4mL의 SOCl2와 함께 4시간 동안 환류(reflux)하였다. 남아있는 티오닐 클로라이드를 제거한 후, 정제되지 않은 산물 39를 CH2Cl2(10mL)에 용해시켰다. 이렇게 얻은 화합물 39의 용액 3mL에 100mg(0.56mmol)의 화합물 14와 0.568mg(5.61mmol)의 트리에틸아민을 포함하고 있는 CH2Cl2용액(15mL)을 0℃에서 서서히 적가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응물을 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 속성 컬럼 크로마토그래피(실리카, EtOAc)로 정제하여 121mg(0.30mmol)의 화합물 40을 53%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.79 (s, 1H), 8.61 (d, J = 8.07 Hz, 1H), 8.49 (d, J =
7.56 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 7.76 Hz, 1H), 7.87 (d, J =
8.10 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.71 Hz, 1H), 7.55 (s, 2H),
4.28 (septet, J = 6.63 Hz, 1H), 1.56 (d, J = 6.51 Hz,
6H);
13C NMR (CDCl3): δ 164.03, 142.11, 138.78, 136.52, 135.27, 132.16,
131.42, 131.25, 129.66, 127.95, 127.77, 127.08, 126.41,
124.16, 68.33, 21.05.
상기 실시예 1 내지 8에서 개시된 방법과 적절한 출발 물질 및 시약을 사용하여 하기의 니트론 함유 셀레노 화합물을 제조할 수 있다:
2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[2-(N-t-부틸)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
5-플루오로-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
5-클로로-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
5-브로모-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
5-메틸-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
5-메톡시-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
6-클로로-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
6-메틸-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
5-니트로-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온 ;
7-니트로-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
6,7-메틸렌디옥시-2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[3-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]-벤질-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]-페닐에틸-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]-피리딘-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[5-(N-이소프로필)니트로닐]-피리딘-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]-피리미딘-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[5-(N-이소프로필)니트로닐]-피리미딘-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[5-(N-이소프로필)니트로닐]-푸란-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[5-(N-이소프로필)니트로닐]-티오펜-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]-티아졸-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[4-(N-이소프로필)니트로닐]-옥사졸-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-1H-이미다졸-4-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[2-(N-이소프로필)니트로닐]-1-메틸-1H-이미다졸-4-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[5-(N-이소프로필)니트로닐]-1H-피롤-3-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[5-(N-이소프로필)니트로닐]-1-메틸-1H-피롤-3-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[6-(N-이소프로필)니트로닐]-벤조티아졸-2-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온;
2-[5-(N-이소프로필)니트로닐]-2H-[1,2,4]-트리아졸-3-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온; 및,
2-[5-(N-이소프로필)니트로닐]-2-메틸-2H-[1,2,4]-트리아졸-3-일-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온.
실시예 9: 수용성(water solubility) 조사
정확하게 측정된 양(보통 1mg)의 시험 화합물을 메탄올 1mL에 용해시켜서 표준 용액을 준비하였다. Beckman DU?7500 분광광도계(Spectrophotometer)로 각 화합물의 UV 흡광 최대치(absorption maximum)를 측정하였는데, 필요에 따라 MeOH로 용액을 희석하여 측정하였다.
그 후, 소량의 10mM 인산 완충액(pH 7.4)을 과량의 시험 화합물의 존재하에서 3시간 동안 마그네틱 바(magnetic bar)로 교반하여 각 화합물의 포화 용액을 준비하였다. 이 포화 용액을 Gelman 0.45μm 필터로 여과하여 고체 화합물을 제거하고, 이전에 측정된 흡광 최대치 파장의 UV를 주사하였다.
총 용해도는 다음의 식으로 결정되었다: C' = A'(C/A), 여기에서 C는 표준 용액의 농도(mg/mL); A는 표준 용액의 흡광도; A'는 포화 용액의 흡광도; C'는 포화 용액의 농도(mg/mL)(참조: Protein Sci., 7: 556-563, (1998))이다. 표 1에 그 결과가 요약되어 있다.
화합물 엡셀렌 실시예 1 실시예 2 실시예 5 실시예 7
첨가량(mg) 5.71 5.14 5.55 5.74 5.02
파장(측정치) 330nm 314 294 302 300
흡광도(측정치) 0.0284 0.6096 0.3584 0.1827 1.2276
희석율 1 1 10 10 1
A' 0.0284 0.6096 3.584 1.827 1.2276
A 0.6154 1.6807 1.2729 0.8082 0.8871
C(μM) 100 50 50 50 50
C'(μM)=A'(C/A) 4.615 18.135 140.781 113.029 69.192
C'(g/L = mg/mL) 0.001265 0.006516 0.050580 0.041403 0.025830
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 화합물들은 비교물질인 엡셀렌보다 훨씬 우수한 수용성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 10: 지질 과산화(lipid peroxidation) 저해 활성
본 발명의 화합물의 항산화 효과는 다층 리포좀(multilayer liposome)의 라디칼 연쇄 반응(radical chain reaction) 억제로 검사되었다.
리포좀은 다음과 같이 제조되었다: 상업적으로 구매가능한 대두 포스파티딜콜린(soybean phosphatidylcholine)(PC, Sigma Chemical Co., U.S.A.) 30mg을 에탄올 1mL에 용해시키고, 교반상태에서 에탄올/PC 용액 200㎕를 50mM NaCl(pH 7.0)이 포함된 10mM Tris 완충액 10mL에 첨가하였다.
화합물이 리포좀의 산화를 저해하는 능력은 다음과 같이 측정되었다: 튜브에 리포좀 400㎕를 첨가하고 시험 화합물(완충액 또는 에탄올에 용해된) 및 히스티딘-FeCl3(최종농도 167:33mM로)을 첨가하였다. FeCl2(질소가 제거된 물에서 제조된 최종농도 33mM의)을 첨가하여 산화를 일으키고, 반응물을 37℃에서 15분간 흔들어 주었다. 그후, 0.25N HCl 용액에 0.67% TBA(thiobarbituric acid): 10% 트리클로로아세트산 (2:1, v/v)이 첨가된 용액을 제조하고, 이 용액에 산화반응을 종결하는 t-부틸하이드록시톨루엔(BHT) 1.5%(v/v)을 첨가하여 제조한 용액 1 mL를 튜브에 첨가하였다. 그 부분표본(aliquot)들을 100℃에서 20분간 가열하였다. 얼음으로 냉각시킨 후, 튜브의 상층액 1mL에 1mL의 클로로포름을 가하고 튜브를 원심분리하였다. 532nm에서 원심분리로 수득한 상층액의 흡광도를 측정하였다(참조: 표 2).
저해제 농도(IC50)
실시예 1실시예 2실시예 5실시예 7S-PBN엡셀렌 81.1 μM111.0 μM1.2 μM246.5 μM25.0 μM148.3 μM
상기 표 2에서 보듯이, 본 발명의 화합물, 그 중에서도 특히 실시예 5에서 제조된 화합물은 비교 물질인 S-PBN 및 엡셀렌(현재 가장 기대되는 항산화제로서 임상 III 단계에 있다)보다도 우수한 LPO 저해 활성을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 11: 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase) 활성 측정
지시계(indicator system)로서 NADPH-글루타치온 환원효소(NADPH-glutathione reductase)계를 통해 형성된 GSSG의 환원으로 글루타치온 과산화효소 유사 활성을 측정하였다.
5mM EDTA를 함유하고 있는 50mM Tris-HCl(pH 7.6)(분석용 완충용액, assay buffer) 350㎕에 다음을 순서대로 첨가하였다:
1) 6.4mM의 환원된 글루타치온(GSH)을 함유하고 있는 분석용 완충용액 350 ㎕, 640mM의 NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide) 및 1.6 unit/mL의 이황화 글루타치온 환원효소(glutathione disulfide reductase)(GR)
2) 800mM의 시험 화합물이 용해된 DMSO 70㎕(즉, 각 화합물은 최종 농도 50mM로 검사되었다.)
3) DDW로 1/10,000배 희석하여 제조한 0.007% t-부틸 하이드로퍼옥시드 (hydroperoxide) 350㎕.
최종 반응 부피는 1120㎕이다.
25℃에서 반응을 진행시켰다. 340nm에서 흡광도의 감소를 3분간 측정함으로 글루타치온 과산화효소 활성을 조사하였다. 전기 활성 또는 초기 효소 속도(initial enzymatic rate)는 시간에 따른 흡광도 변화의 기울기에 비례한다.
검사된 화합물들의 산소 환원 촉매 활성은 NADPH 소모 속도와 일치한다.
글루타치온 과산화효소 활성 측정 결과는 하기 표 3에 나와 있다. 그 결과는 분(minute)당 소모된 NADPH의 나노몰수(n-moles)로 나타내었다.
화합물 속도A340/min(30~300sec) 속도/0.00622(nmol NADPH/min/mL) % 엡셀렌
엡셀렌 -0.118 18.97 100
실시예 1 -0.141 22.67 119.50
실시예 2 -0.125 20.10 105.96
실시예 5 -0.125 20.13 106.11
실시예 7 -0.084 13.50 71.17
표 3에서 보듯이, 본 발명에 개시된 일반식 (I)의 화합물은 글루타치온 및 이황화 글루타치온 환원효소의 존재하에서, 유기 하이드로퍼옥시드의 환원을 촉매한다. 따라서, 본 발명의 화합물이 현저하고 특이적인 글루타치온 과산화효소 활성을 가진다는 것을 알 수 있다.
실시예 12: 신경세포 보호 작용
실시예 12-1: 대뇌 피질 신경세포 배양
임신 14 내지 15일째의 태아 ICR(Institute Cancer Research, U.S.A.) 마우스로부터 신경 및 신경교 성분을 포함한 혼합 대뇌 피질세포 배양물을 제조하였다.간단히 말해, 해리된 대뇌 피질세포를 24-멀티웰 플레이트(Nunc, U.S.A.)당 2.5개 대뇌 반구의 비율로 앞서 제조된 신경교세포 단층(monolayer) 배양물위에 플레이팅하였다. 플레이팅 배지는 포도당(glucose)(최종농도 20mM)이 추가된 이글 배지(Eagle's minimal essential medium)(Earle's salts, 글루타민 없는 것 사용), 2mM 글루타민, 5% FBS(fetal bovine serum) 및 5% 마혈청(horse serum)으로 구성되었다. 플레이팅 5 내지 6일 후, 그 배지에 10mM 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside)를 첨가하여 비신경세포의 성장을 중지시켰다. 배양물을 37℃ 습기있는 CO2배양기에 두고 실험실적 조건하에서 10 내지 14일 후 실험에 사용하였다.
생후 1 내지 3일된 마우스의 대뇌 신피질로부터 신경교세포 피더 배양물(feeder culture)을 제조하였다. 5% FBS 및 10% 마혈청이 첨가된 플레이팅 배지내에서 해리된 대뇌 피질세포를 24-멀티웰 플레이트당 0.25개 대뇌 반구의 비율로 플레이팅하였다. 이러한 방법으로는 대부분의 신경세포가 생존하지 못하고 성상교세포(astrocyte)만이 생존하여 성상교세포로 풍부한 배양물이 된다. 신경교세포 배양물을 10 내지 30일 동안 전면생장시킨 후, 혼합 대뇌 피질 세포 배양물을 제조하는데 사용하였다.
실시예 12-2: Fe2+에 의하여 유도되는 대뇌 피질 신경세포 사멸 보호 작용
제1철(ferrous iron)을 정상 산소 압력을 가진(normoxic) 용액에 두면 자가산화하여 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 초과산화 음이온 자유라디칼 (superoxide anion free radical) 및 과산화수소의 형태로 활성 산소를 생산한다.
실시예 12-1에서 제조된 대뇌 피질 세포 배양물을 30mM FeCl2(Fe)에 24시간 동안 노출시켜서 신경세포 사멸을 유도하였다. 시험 화합물과 함께 또는 시험 화합물없이 37℃ 5% CO2배양기내에서 20mM 글루코스 및 38mM 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)이 첨가된 혈청없는 이글배지(MEM)하에서 24시간 동안 독소 노출을 실시하였다. 모든 화합물은 DMSO에 고농도로 용해된 다음, 독소 노출 배지에 첨가할 때 최종농도로 희석되었다.
세포 사멸 측정은 하기와 같은 방법으로 실시되었다:
모든 실험에서 먼저 위상차 현미경(phase-contrast microscope)으로 배양물을 검사함으로 전제적인 세포 손상을 평가하였다. 형태학적 평가(morphological assessment)는 보통 세포 사멸 과정이 대부분 완료되는 시점인 독소 노출 1일 후 수행하였다.
추가적으로, 손상되거나 파괴된 세포가 세포외액(extracellular fluid)으로 방출하는 LDH(lactate dehydrogenase) 활성을 측정함으로써 전체적인 신경세포 손상을 정량적으로 조사하였다. 독소를 첨가하지 않은 것만 제외하고 동일한 노출 과정을 겪은 배양 배지(sham wash controls)에서도 소량의 LDH는 항상 존재하였다. 각 실험에서 자매 샴 대조군(sister sham wash control)으로 결정된 이 기저량(background amount)은 독소 처리한 배양물에서 얻은 값에서 감산되었다.독소 노출로 일어난 LDH 유출의 절대치(absolute value)는 단일 평판배양(plating)의 자매 배양물들 내에서는 서로 상당히 일치하나, 서로 다른 평판배양의 배양물들 내에서는 다소 서로 차이가 있다. 이러한 변이성은 주로, 결과적인 신경세포 밀도(이것은 본래의 플래이팅 농도가 일정함에도 불구하고 다양한데, 이는 아마도 세포 표본 또는 혈청 특성에서의 작은 차이를 반영하는 것일 것이다)의 작용이다. 따라서, 자매 배양액에서 30mM FeCl2(Fe) 노출 24시간 후 각 LDH 값은 최대 신경세포 LDH 방출(=100)로 조정되었는데, 거기에서는 신경교세포 손상 없이 거의 완전한 신경세포 사멸이 일어난다. 100이상의 수치는 일반적으로 추가적인 대신경교세포(astroglial cell) 손상을 가리킨다.
도 1은 엡셀렌과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 합성된 화합물과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 2에서 합성된 화합물과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 5에서 합성된 화합물과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 7에서 합성된 화합물과 Fe2+독소를 함께 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1 내지 5에서 보듯이, 본 발명의 화합물들은 Fe2+독소에 의한 신경세포 사멸을 효과적으로 보호하는 것을 알 수 있었다.
실시예 13: 화합물의 신경세포에 대한 독성
시험 화합물의 농도를 달리하여 24시간 동안 노출시킨 후, LDH 분석법으로 실시예 12-1에서 제조한 대뇌 피질세포의 생존성(viability)을 정량화하였다. 24시간 독소 노출은 37℃ 5% CO2배양기내에서 20mM 글루코스 및 38mM 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)이 첨가된 혈청없는 이글배지(MEM)하에서 시행되었다. 모든 화합물을 DMSO에 고농도로 용해시킨 다음, 독소 노출 배지에 첨가할 때 최종농도로 희석하였다.
세포 사멸은 실시예 12-2에서와 같은 방법으로 측정되었다.
도 6은 엡셀렌의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 1에서 합성된 화합물의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예 2에서 합성된 화합물의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 실시예 5에서 합성된 화합물의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 10은 실시예 7에서 합성된 화합물의 처리 농도가 증가함에 따른 세포 손상의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 6 내지 10에서 보듯이, 본 발명의 화합물들은 엡셀렌보다 더 낮은 세포독성(cytotoxicity)을 나타냄을 알 수 있었는데, 이는 본 화합물들이 과량으로 안전하게 투여될 수 있음을 시사한다.
실시예 14: 허혈에 의한 세포 손상 방지(in vivo)
본 연구에서는 중량이 80-88g인 수컷 몽고 게르빌루스 쥐(Mongolian gerbils,Meriones unguiculatus)를 사용하였다. 허혈 손상시킨 후 30분 후에 쥐 각각에 운반체(vehicle), 엡셀렌 또는 다양한 시험 화합물들(10% DMSO에 60 mg/kg로 용해됨)을 구강 투여하였다. 각 그룹에 20마리씩을 할당하고, 33% 산소 및 67% 아산화질소 내에서 2.5% 이소플루란(isoflurane) 혼합물로 쥐들을 전신마취(general anesthesia)하였다. 목에서 복면 중앙선 절개(midline ventral incision)를 하였다. 총경동맥(common carotid artery) 둘 다를 분리해서 신경섬유(nerve fiber)를 제거하고 비외상성 동맥류 클립(nontraumatic aneurysm clip)을 사용하여 폐쇄하였다. 혈류가 완전히 차단되었는지는 검안경(ophthalmoscope)을 사용하여 안구의 중심동맥을 관찰함으로써 확인하였다. 총경동맥 폐쇄 5분후, 두 총경동맥에서 동맥류 클립을 제거하고 현미경으로 혈류 회복(재관류, reperfusion)을 직접적으로 관찰하였다. 샴 대조군(Sham-operated control)에도 총경동맥을 폐쇄하지 않은 것만 제외하고는 동일한 외과적 처치(surgical procedure)를 하였다. 외과적 처치 동안 및 처치 후 동물이 마취에서 완전히 회복될 때까지의 기간 동안 체온을 측정하고 37℃ ± 0.5℃로 유지시켰다. 지정된 재관류 시간(4일)에, 처치된 쥐 및 샴 쥐를 죽였다.
외과적 처치 후 4일째에 심장을 통해 쥐들에 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4) 및 이어서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)가 용해된 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.4)을 관류시킨 후, 뇌를 박리하여 4시간 동안 전기와 같은 고정액에서 고정하였다. 뇌조직을 30% 자당(sucrose)으로 하룻밤동안 침윤시켜 동결방지하였다. 그 후, 코노이(Cornoy) 용액으로 고정된 표본들을 크라이오스태트(cryostat) 상에서 30 ㎛ 절편들로 절단하고 순차적으로 크레실 바이올렛(Cresyl violet) 염료로 염색하였다.
각 쥐의 해마(hippocampus) 부위의 염색상을 애플스캐너(Applescanner)로 획득하였다. 아도브 포토샵 버전 2.4.1로 각 이미지 파일의 밝기와 명암을 단일하게 강화한 후, NIH 이미지 1.59 소프트웨어로 분석하였다. 정량화된 데이터로부터 획득한 모든 자료를 one-way ANOVA를 사용하여 분석하고 통계적 유의성(statisticalsignificance)을 결정하였다. 사후비교(post-hoc comparison)에는 Bonferroni's test가 사용되었다. 0.05 또는 0.01 이하의 P 값은 통계학적으로 유의미하다고 간주하였다.
도 11-a는 허혈 후에 본 발명의 화합물을 처리한 경우에 있어서 세포손상의 보호 정도를 나타내는 그래프이다.
도 11-b는 허혈 후에 본 발명의 화합물을 처리한 경우에 있어서 세포손상의 보호 정도를 나타내는 현미경사진이다.
결과적으로, 실시예 5에서 제조된 시험 화합물은 허혈성 신경 퇴행에 대하여 엡셀렌보다 우수한 신경보호 작용을 나타낸다. 실시예 5에서 합성된 화합물의 경우, 보호 효과는 그것으로 처치된 그룹내에서 61%였다. 엡셀렌으로 처치된 그룹에서 보호 효과는 59%였다.
요컨대, 본 발명자들은 실시예 5에서 제조된 화합물이 허혈과 관련된 질병의 치료제로서 잠재력있는 후보임을 제안한다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 니트론을 함유하는 신규한 셀레노 화합물, 그의 제조방법 및, 활성 산소에 의해 유발되는 각종 의학적 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 화합물들은 참조 화합물인 S-PBN 및 엡셀렌과 비슷하거나 그보다 더 우수한 지질 과산화(LPO) 저해 활성을 갖고 있다. 본 화합물들은 독성이 더 낮고 수용성이 더 높으면서도, 활성 산소에 의한 대뇌 신경세포 사멸을 효과적으로 저해하며 허혈성 신경 퇴행에 대해 신경보호 작용(neuroprotective effect)을 나타낸다.
이상에 기술된 내용으로부터, 본 발명의 조성물과 방법의 다양한 변형과 변화가 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 가능하다. 첨부된 청구항들의 범위내에서의 이러한 모든 변형은 본 발명에 귀속된다.

Claims (15)

  1. 하기 식(I)로 표시되는 니트론(nitrone) 부분을 갖고 있는 셀레노(seleno) 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염:
    (I)
    상기 식에서,
    R1및 R2는 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, C1~4-알킬, C1~4-
    알콕시, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 니트로이거나 또는 R1및 R2는 함께 메틸렌디옥시이고;
    L은 페닐, C1~4알킬페닐, 또는, 푸라닐, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 티오
    페닐, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴,
    티아디아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 벤
    조티아졸릴, 벤조이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 트리아지닐, 트
    리아졸릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 1 내지 4개의 질소, 산소 및/또는 황 헤테로원자를 가진 불포화 또는 포화 헤테로씨클릭기(이때, 헤테로씨클릭기는 할로겐, C1~2알킬, C1~4알콕시,C1~4알킬티오, 하이드록시, 메르캅토, 트리플루오로메틸, 니트로, 페닐, 니트릴, 카복시 또는 C1~4알콕시카보닐에 의해 1회 또
    는 2회 동일하거나 서로 다른 것으로 치환된다)이며; 및,
    R3는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아랄킬, 아릴, 씨클로알킬 또는 씨클로알케닐이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    R1및 R2는 수소, 플루오르, 염소, 브롬, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 하이드록시, 메톡시, 트리플루오로메틸 및 니트로로 구성된 그룹으로부터 선택되거나 또는 R1및 R2는 함께 메틸렌디옥시이고;
    L은 페닐, 벤질, 에틸페닐 및, 푸라닐, 옥사졸릴, 티오페닐, 티아졸
    릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 벤조티아졸릴,
    벤조트리아졸릴, 트리아졸릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는,
    1 내지 4개의 질소, 산소 및/또는 황 헤테로원자를 가진 불포화 또는 포화 헤테로씨클릭기(이 때, 헤테로씨클릭기는 플루오르, 염소, 브롬, 메틸, 에틸, 하이드록시, 메톡시, 에톡시, 메틸설파닐, 페닐설파닐, 트리플루오로메틸, 니트로, 페닐, 니트릴,카복시, 메톡시카보닐 또는 에톡시카보닐에 의해 1회 또는 2회 동일하거나 서로 다른 것으로 치환된다)로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 및,
    R3는 알킬, 치환된 알킬, 아랄킬, 아릴 및 씨클로알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    니트론(nitrone) 부분을 갖고 있는 셀레노 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 2항에 있어서,
    R1및 R2는 수소, 염소, 브롬, 메틸, 에틸, 하이드록시, 메톡시, 트리플루오로메틸 및 니트로로 구성된 그룹으로부터 선택되거나 또는 R1및 R2는 함께 메틸렌디옥시이고;
    L은 페닐, 벤질, 에틸페닐 및, 푸라닐, 옥사졸릴, 티오페닐, 티아졸
    릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피리딜, 피리미디닐로 구성된 그룹으
    로부터 선택되는,1 내지 4개의 질소, 산소 및/또는 황 헤테로원자를 가진 불포화 또는 포화 헤테로씨클릭기(이때, 헤테로씨클릭기는 염소, 메틸, 메톡시, 메틸설파닐, 페닐설파닐, 트리플루오로메틸, 니트로, 니트릴, 카복시, 메톡시카보닐 또는 에톡시카보닐에 의해 1회 또는 2회 동일하거나 서로 다른 것으로 치환된다)로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 및,
    R3는 알킬, 치환된 알킬 및 씨클로알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    니트론(nitrone) 부분을 갖고 있는 셀레노 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. (i) 적절한 링커(L)를 갖고 있고 아미노기가 보호된 알데히드와 알킬하이드록실아민(alkylhydroxylamines, R3NHOH)을 반응시켜 니트론을 수득하는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 수득한 화합물을 탈보호기 반응시켜 유리 아민 니트론을 생성하는 단계; 및,
    (iii) 단계 (ii)에서 수득한 화합물의 유리 아민을 과량의 염기(excess base)의 존재하에서 o-클로로셀레노벤조일 클로라이드(o-chloroselenobenzoyl chlorides)와 반응시켜 제 1항에서 정의된 식 (I)의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는
    제 1항에서 정의된 일반식(I)의 화합물의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    단계 (i)의 알킬하이드록실아민은 니트로알칸, 아연 및 아세트산을 한 반응기 내에서 반응시켜 생성된 것을 분리하지 않고 사용하는 것을 특징으로 하는
    제 1항에서 정의된 일반식(I)의 화합물의 제조방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    단계 (ii)는, 보호기가 삼차부톡시카보닐(tert-butoxycarbonyl)일 경우 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로, 또는, 보호기가 아세틸(acetyl)일 경우 LiOH를 사용하여 탈보호시키는 것을 특징으로 하는
    제 1항에서 정의된 일반식(I)의 화합물의 제조방법.
  7. 제 4항에 있어서,
    단계 (iii)의 염기는 유기 염기인 것을 특징으로 하는
    제 1항에서 정의된 일반식(I)의 화합물의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    유기 염기는 트리에틸아민인 것을 특징으로 하는
    제 1항에서 정의된 일반식(I)의 화합물의 제조방법.
  9. 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제(excipient)와 함께, 유효성분으로 제 1항에서 정의된 일반식(I)의 화합물을 유효한 양으로 포함하는, 항산화제로서 유용한 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    담체는 경구적 담체인 것을 특징으로 하는
    항산화제로서 유용한 약학적 조성물.
  11. 제 9항에 있어서,
    담체는 주사가능한 담체인 것을 특징으로 하는
    항산화제로서 유용한 약학적 조성물.
  12. 제 1항에서 정의된 일반식(I)의 화합물을 질환을 완화시키는 데 효과적인 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 항산화제를 필요로 하는 질환을 앓고 있는 개체(living body)를 치료하는 방법.
  13. 제 1항에서 정의된 일반식(I)의 화합물을 질환을 완화시키는 데 효과적인 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 급성 또는 진행성 뇌신경퇴행성 장애를 가진 개체를 치료하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    급성 또는 진행성 뇌신경퇴행성 장애는 뇌졸중(stroke), 파킨슨병 (Parkinson's disease) 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    급성 또는 진행성 뇌신경퇴행성 장애를 가진 개체를 치료하는 방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    개체는 뇌졸중의 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는
    급성 또는 진행성 뇌신경퇴행성 장애를 가진 개체를 치료하는 방법.
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