KR20020094255A

KR20020094255A - 활성형 재조합 인체 프로유로키나제의 정제 방법

Info

Publication number: KR20020094255A
Application number: KR1020010031867A
Authority: KR
Inventors: 고형곤; 문상범; 김기완; 이현수; 박주호; 문무상; 구본훈; 정광회
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2002-12-18
Also published as: KR100454891B1

Abstract

본 발명은 재조합 인체 프로유로키나제의 정제 방법에 관한 것으로서 단백질의 풀림과 재구성 방법을 사용하여 비활성 형태의 재조합 인체 프로유로키나제를 활성 형태로 변환시키고 농축 및 컬럼 조작으로 불순물을 제거하여 활성형의 순수한 재조합 인체 프로유로키나제를 다량 회수하는 방법에 관한 것이다.

Description

활성형 재조합 인체 프로유로키나제의 정제 방법{A method for purifying the active recombinant human prourokinase}

본 발명은 재조합 인체 프로유로키나제의 정제 방법에 관한 것으로서, 단백질의 풀림(unfolding)과 재구성(refolding) 방법을 사용하여 비활성 형태의 재조합인체 프로유로키나제를 활성 형태로 변환시키고 농축 및 컬럼 조작으로 불순물을 제거하여 활성형의 순수한 재조합 인체 프로유로키나제를 다량 회수하는 방법에 관한 것이다.

인체 프로유로키나제(PUK)는 411개의 아미노산과 12개의 이황화 결합에 의해 형성된 분자량 약 54,000 달톤의 단일 사슬 단백질로서 인체 유로키나제(UK)의 전구체(Proenzyme)이다. [참조: Wun, T.-C., L. Ossowski, and E. Reich. 1982. J. Biol. Chem. 257:7262-7268; Gurevich, V., R. Pannel, S. Louie, P. Kelley, R.L. Suddith, and R. Greenlee. 1984. J. Clin. Invest 73:1731-1739; Holmes, W.E., D.M. Pennica, M.Blaber, M.W. Rey, W.A. Guenzler, G.J. Steffens, and H.L. Heyneker. 1985. Bio-technology 3:923-929]

프로유로키나제는 플라스민 또는 칼리크레인(Kallikrein) 등에 의해서 아미노산 Lys158과 Ile159 사이의 펩티드 결합이 가수분해되어 [참조: Collen, D., and H.R. Lijnen. 1986. CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 4(3):249; Verstraete, M., and D. Collen. 1986. Blood 67(6):1529] 두 사슬 형태인 유로키나제로 활성화되고, 활성화된 유로키나제는 플라스미노겐을 활성형의 플라스민으로 전환시킨다. 활성형으로 전환된 플라스민은 혈관 내에서 응고된 혈전(Thrombus)의 피브린(Fibrin)을 용해시키는 작용을 한다. [참조: White, W.F. et al., 1966. Biochemistry 5:2166; Rakoczi, I., B. Wiman, and D. Collen. 1978. Biochim. Biophys. Acta 540:295; Robbins, K.C., L. Summaria, B. Hsieh, and R.S. Shah. 1967. J. Biol. Chem. 242:2333; Wiman, B. 1977. Eur. J. Biochem. 76:129]

일반적으로 대장균에서 발현된 재조합 단백질은 봉입체(inclusion body)를 형성한다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 봉입체를 회수하여 천연의 활성을 가질 수 있도록 단백질을 풀림(unfolding)하고 재구성(refolding)하는 과정을 거쳐야 하는데, 이때 사용되는 변성제는 요소(urea), 염화 구아니딘(guanidine hydrochloride), 나트륨 도데실 황산(sodium dodecyl sulfate) 등이 있고, 이황화 결합(disulfide bond)을 형성시키기 위하여 베타-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol), 글루타티온 (glutathione), 시스테인 (cysteine) 등 여러 종류의 산화 환원 시스템이나, 화학적인 조작 방법인 설포네이션 (sulfonation) 방법을 사용하기도 한다. 또한 생체와 유사한 시스템을 형성하여 단백질 재구성의 효율을 높이기 위해 다양한 첨가제들이 사용되고 있다.

따라서 한가지 단백질을 활성형의 천연 단백질로 재구성하기 위해서는 수십 가지에서 수백 가지의 조건을 실험해야 하므로 단백질 재구성은 시스템의 개발자에 따라 그 효율과 수율 면에서 많은 차이를 내게 된다.

프로유로키나제는 12개의 이황화 결합을 형성하고 3개의 자유 시스테인 잔기를 보유하고 있어서 이 단백질의 풀림 및 재구성은 아직도 어려운 문제로 남아있고, 수율을 높이기 위한 많은 연구 문헌들이 아직도 발표되고 있다.(참조 : Zhu H, Liu W., Xue YM, and Ma Z. 2000. Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao. 16(2):150-154; Orsini, G., Brandazza, A., Sarmientos, P., Molinari, A., Lansen, J., and Cauet, G.. 1991. Eur. J. Biochem. 195(3):691-697)

본 발명은 높은 pH에서 변성제로서 요소를 사용하고 설포네이션 방법으로 프로유로키나제 단백질을 풀림(unfolding) 시킨 후, 재구성(refolding)하여 높은 수율의 활성형 프로유로키나제를 회수하고 그 프로유로키나제를 고순도 정제하는 방법을 제공한다.

도 1은 재조합 인체 프로유로키나제의 정제 단계별로 비환원성 SDS- 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 사진이다.

레인 1: 마커(marker)

레인 2: 재구성 재조합 인체 프로유로키나제

레인 3: SP-세파로스(Sepharose) 용출액

레인 4: 겔 여과 용출액

도 2는 겔 여과 후 재조합 인체 프로유로키나제의 HPLC 크로마토그램 사진이다.

A: 겔 여과 완충용액의 HPLC 크로마토그램 결과,

B: 겔 여과 후 재조합 인체 프로유로키나제의 HPLC 크로마토그램 결과

본 발명은 대장균에서 발현된 재조합 인체 프로유로키나제(rh-PUK)를 요소로 전처리하고, 소듐 설파이트(sodium sulfite) 및 소듐 테트라티오네이트(sodium tetrathionate)로 술폰화반응시켜 재조합 인체 프로유로키나제의 풀림(unfolding)을 유도하는 단계;

상기 풀림된 재조합 인체 프로유로키나제를 산화환원제로서 산화 글루타티온 및 환원 글루타티온 혼합물 또는 시스테인 및 시스틴 혼합물과 첨가제로서 아르기닌 또는 라이신과 반응시켜 재조합 인체 프로유로키나제의 재구성(refolding)을 유도하는 단계; 및

재구성된 용액을 여과 농축하고, 요소를 포함한 인산나트륨 완충용액으로 전처리한 후, 강한 양이온 교환수지, 약한 음이온 교환수지 및 겔 여과법을 순서대로 수행하여 재조합 인체 프로유로키나제를 정제하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인체 프로유로키나제의 정제 방법을 제공한다.

본 발명에 사용된 시료는 대장균에서 유래한 재조합 인체 프로유로키나제(rh-PUK)이다. 대장균에서 발현된 rh-PUK 봉입체(inclusion body)를세포파쇄로 회수하고 풀림 및 재구성을 실시한다.

이하, 실시예를 참조로 본 발명을 구체적으로 설명한다.

실시예 1

rh-PUK는 이황화 결합 수와 자유 시스테인 잔기가 많은 구조적 특징 때문에 고 수율의 풀림 효과를 얻기 위하여 8 M 요소를 변성제로 사용하고 단백질을 화학적으로 설포네이션 시키는 방법을 사용한다. 설포네이션은 50-100 mM Tris-Cl pH 7.5-10.0 완충 용액에서 sodium sulfite : sodium tetrathionate 의 비율을 2:1로 첨가하고 4℃ 에서 천천히 저어주며 5-16 시간 동안 반응시킨다.

실시예 2

rh-PUK 재구성에는 완충 용액으로 50-100 mM 글라이신을 사용하고 산화환원 시스템은 산화 글루타티온:환원 글루타티온 구성 비율이 10:1 또는 10:2 또는 10:3인 혼합물이나, 시스테인:시스틴 구성 비율이 10:1 또는 10:2 또는 10:3인 혼합물을 사용하였다. 사용된 첨가제는 0.05M-0.5M 아르기닌 또는 라이신을 사용한다. 재구성시 사용된 rh-PUK 농도는 0.2-0.5 ㎎/㎖이고 이상의 구성물을 혼합하여 4℃ 에 2 ~ 4일 간 천천히 저어주며 반응시킨다.

단백질 재구성에 사용된 산화환원제의 몰수 비율별 효과

산화 글루타티온:환원 글루타티온 또는 시스테인:시스틴 몰수 비율	역가(IU/ml)
10:1	2769
10:2	2697
10:3	2469

하기 실시예 5에서 설명한 발색 기질을 사용한 프로유로키나제 표준품의 생물학적 역가 측정 방법으로 산화환원 시스템의 몰수 비율별 효과를 측정한 결과 10:1 의 몰수 비율에서 가장 높은 재구성 효과를 나타내므로 10:1 의 몰수 비율이 바람직한 조건임을 알 수 있다.

단백질 재구성에 사용된 염기성(basic) 아미노산(아르기닌 또는 라이신)의 농도별 효과

첨가제 몰수(M)	역가(IU/ml)
0	-
0.05	297
0.1	554
0.2	1940
0.3	2890
0.4	3083
0.5	5026

하기 실시예 5에서 설명한 발색 기질을 사용한 프로유로키나제 표준품의 생물학적 역가 측정 방법으로 단백질 재구성에 사용된 첨가제의 농도별 효과를 측정해 본 결과 0.5 M의 첨가제가 첨가되었을 때 가장 높은 재구성 효과를 나타내므로 0.5 M이 바람직한 조건임을 알 수 있다.

상기한 재구성 방법을 이용하여 재조합 인체 프로유로키나제를 재구성 했을 때 재구성 수율은 사용된 rh-PUK 봉입체의 약 27.5%-37.1%가 활성형으로 전환되는 것으로 측정된다.

실시예 3

재구성을 완료한 용액은 필터시스템(0.22㎛, Millipore)으로 필터하고 농축한 후 컬럼 작업이 용이하도록 액상을 1~2.5M 요소를 포함한 20-50mM 소듐 인산(sodium phosphate), pH 7.0-7.6 완충 용액으로 교환한다. 1-2.5M 요소는 시료를 컬럼에 주입하기 전에 시료 내에 존재하는 염의 농도를 감소시키는 과정에서 형성되는 침전 현상을 완화시키는 역할을 한다. 강한 양이온 교환 컬럼(SP-sepharose)을 1-2.5M 요소를 포함한 20-50mM 소듐 인산(sodium phosphate), pH 7.0-7.6 완충 용액으로 평형 시킨 후 준비된 시료를 강한 양이온 교환 컬럼(SP-sepharose)에 주입하고 20-50 mM sodium phosphate, pH 7.0-7.6 완충 용액에서 500 mM sodium chloride를 포함한 20-50 mM sodium phosphate, pH 7.0-7.6 완충 용액까지 10배 컬럼 부피만큼 직선 구배로 컬럼을 용출시킨다. 재조합 인체 프로유로키나제는 sodium chloride 농도가 약 120 mM 정도에서 용출된다.

실시예 4

실시예 3에서 획득한 시료를 농축한 후 Sephacryl S-200을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피 한다. Sephacryl S-200 컬럼은 20-100mM 나트륨 인산(sodium phosphate) 완충용액을 10-30㎝/시간의 속도로 3 컬럼 부피 이상 흘려서 평형 시킨 후 농축한 시료를 컬럼에 주입한다. 20-100mM 나트륨 인산(sodium phosphate) 완충용액을 10-30㎝/시간의 속도로 흘리며 재조합 인체 프로유로키나제를 분획한다. 분획하여 획득한 재조합 인체 프로유로키나제를 생물학적 역가 분석 방법과 분석용 역상 고압 액체 크로마토그래피법으로 분석한다.

실시예 5

상기 실시예 2 내지 4에서 수득한 재조합 유로키나제, SP-Sepharose 용출물 및 겔 여과 용출물을 비환원성 SDS-폴리아크릴아마이드 겔로 전기영동하여 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 겔 여과 용출액의 경우 하나의밴드로 검출되어 고순도로 정제되었음을 알 수 있다.

실시예 6

프로유로키나제의 생물학적 역가 분석은 F. Haverkate 와 P. Brakman의 피브린 플레이트 방법(참조 : Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 1; 151-159, edited by J. F. Davidson, M. M. Samama, and P. C. Desnoyers, Raven Press, New York, 1975)을 변형한 방법과 유로키나제의 발색 기질(Pefachrome^ⓡuPa, Pentapharm Pefa-5221)을 사용하여 0.1M Tris-Cl, pH 8.5, 0.15M 나트륨 클로라이드(sodium chloride) 완충용액에서 프로유로키나제 표준품의 역가 대비 405nm 흡광도 그래프를 구한 후(도 3) 시료의 역가를 측정하는 발색 측정법(참조 : D. C. Stemp et al., J. Biol. Chem., 261, 1267(1986))을 이용한다.

발색 기질을 사용한 프로유로키나제 표준품의 생물학적 역가 측정 예

역가(IU/ml)	A405nm
1000	1.126
500	1.124
250	0.695
125	0.331
62.5	0.155
31.25	0.064
15.63	0.031
0	0.000

실시예 7: 시료 분석용 역상 고압 액체 크로마토그래피법(RP-HPLC)

소량의 시료를 C4 RP-HPLC(Vydac 214TP54, 내경 4.6㎜ x 길이 25㎝, 입자크기 5㎛, 다공크기 300Å) 컬럼에 주입한 다음 10% 아세토나이트릴과 0.1%의 헵타플루오로부틸산에서 80% 아세토나이트릴과 0.1%의 헵타플루오로부틸산로 20배 컬럼부피만큼 직선 구배로 컬럼을 용출시키고 결과를 도 2a 및 2b에 도시하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이 20.814min에서 단일의 피크가 검출되었으며, 이는 재조합 프로유로키나제가 높은 순도로 정제되었음을 알 수 있다.

본 발명에 따라 프로유로키나제를 정제하면 상업적으로 이용할 수 있을 만큼 고 순도의 프로유로키나제를 효율적으로 분리할 수 있다.

Claims

재조합 인체 프로유로키나제의 정제 방법에 있어서,

대장균에서 발현된 봉입체(inclusion body) 형태의 재조합 인체 프로유로키나제(rh-PUK)를 세포 파쇄시킨 후, 요소로 처리하여 단백질을 변성시키고, 소듐 설파이트(sodium sulfite):소듐 테트라티오네이트(sodium tetrathionate)가 2:1로 첨가된 Tris-Cl(pH 7.5∼10.0) 완충용액에서 4℃에서 5∼16시간동안 술폰화반응시켜 재조합 인체 프로유로키나제의 풀림(unfolding)을 유도하는 단계;

글라이신 완충용액에 산화환원제로서 산화 글루타티온:환원 글루타티온이 10:1∼10:3으로 혼합된 혼합물 또는 시스테인:시스틴이 10:1∼10:3으로 혼합된 혼합물을 첨가하고, 첨가제로서 아르기닌 또는 라이신을 첨가하고, 상기 풀림된 재조합 인체 프로유로키나제를 혼합하여 4℃에서 2∼4일동안 반응시켜 재조합 인체 프로유로키나제의 재구성(refolding)을 유도하는 단계; 및

재구성된 용액을 여과하고 농축하고, 요소를 포함한 인산나트륨 완충용액(pH 7.0∼7.6)으로 전처리한 후, 강한 양이온 교환수지, 약한 음이온 교환수지 및 겔 여과법을 순서대로 수행하여 재조합 인체 프로유로키나제를 정제하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인체 프로유로키나제의 정제 방법.